CN102154324B - 结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用 - Google Patents

结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用，将Mtb10.4和Hsp16.3基因进行PCR扩增并依次插入到克隆载体的多克隆位点中,构建重组载体；然后在大肠杆菌中表达；最后进行纯化得到融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3，该融合蛋白可在结核亚单位疫苗中应用。本发明的优点在于：该融合蛋白疫苗可诱导动物较强的细胞和体液免疫反应；通过动物攻毒实验表明，该疫苗在BCG免疫基础上，具有加强免疫作用，可提高和延长BCG的保护效果；且该疫苗无明显毒副作用。

Description

结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白，具体地说是一种结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，以及该融合蛋白在结核亚单位疫苗中的应用。
背景技术
结核病是全球传播范围最广、持续时间最久、危害最为严重的传染病。自上世纪80年代以来结核病死灰复燃，发病率和死亡率据各类传染病首位和第二位。据估计，每年有2百万人死于结核病感染；更为严重的是每年有大约20亿人处于结核分支杆菌感染的潜伏期，其中有5-10％潜伏期结转变成活动期结核。我国是结核病高负担的国家之一，发病率约达到全国总人口的1‰。由于细菌变异，部分结核病患者使用常规化学药物治疗不能治愈，持续排菌，对个人健康和公共卫生造成了极大的威胁。因此，研制和开发抗结核疫苗尤其是针对休眠期结核的疫苗是控制结核病的重要途径。
目前研制成功的唯一的结核病疫苗——卡介苗(BCG)，虽然已在全球范围内广泛使用，然而不同研究显示，BCG在不同人群中的保护性不稳定，尤其是对成人肺结核的保护效率介于0-80％不等。现阶段进行研究的结核病疫苗主要有以下几种：(1)重组BCG；(2)结核杆菌减毒活疫苗；(3)结核亚单位疫苗。其中结核亚单位疫苗包括蛋白疫苗、DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗三种形式，其中蛋白疫苗因成份明确、相对安全，更易于被人们接受。
大量研究表明，利用基因工程技术将具有不同优势的单个结核菌保护性抗原进行重组，可构建成具有较强免疫原性和更好保护效应的融合蛋白。因此，抗原选择是构建结核亚单位疫苗的首要步骤之一。
发明内容
本发明的目的在于构建并表达纯化融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3，针对结核分枝杆菌各生长期的免疫应答，尤其是对休眠状态细菌建立有效的免疫应答，并且提高单个抗原的保护效果；融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3(MH)和佐剂(DDA+TDM)混合作为结核亚单位疫苗，能诱导较强的Th1型细胞免疫为主的细胞免疫反应和体液免疫反应，具有较好的动物保护效果，作为后期临床研究尤其是针对休眠期结核的候选亚单位疫苗。
本发明所选用的结核杆菌抗原Mtb10.4、Hsp16.3均有较强的免疫保护性，分别主要表达于生长期和休眠期且具有不同的免疫优势。两抗原主要特性如下：(1)Mtb10.4：Mtb10.4抗原是结核分支杆菌早期分泌性蛋白，属于ESA T-6蛋白家族，该家族包括ESAT-6，CFP-10，TB10.4，TB10.3等蛋白。相关研究证明Mtb10.4抗原是重要的结核分枝杆菌免疫保护性抗原，是理想的构件结核疫苗的候选抗原。Mtb10.4抗原对BCG接种的健康者和结核分枝杆菌感染的患者均可诱导强烈的细胞及体液免疫反应，与ESAT-6抗原相比是更好的结核疫苗候选抗原。将其免疫小鼠，可获得明显的特异性体液和细胞免疫反应，此外小鼠在用气雾攻击结核杆菌H37Rv毒株后，可获得接近BCG的免疫保护效果。(2)Hsp16.3：是热休克蛋白(Hsp)的一种，在细菌休眠期和缺氧环境下高表达，对于结核菌在巨噬细胞内的持续存在起重要作用。Hsp16.3能够激起Th1型细胞反应，刺激高水平的IFN-γ的分泌。在健康的与肺结核密切接触的家人(80％)和医务工作者(90％)中，具有较高比例的HspX T细胞刺激活性，比例明显高于普通人群(50％)，提示Hsp16.3抗原具有免疫保护作用。
本发明的技术方案为：
结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法为：
首先，将Mtb10.4和Hsp16.3基因进行PCR扩增并依次插入到克隆载体的多克隆位点中，
构建重组载体；
然后将上述重组载体在大肠杆菌中表达融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3；
最后根据融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的分子量、电荷和亲和力进行纯化，通过纯化得到融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3。
所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建方法包括以下步骤：
(1)根据GenBank中H37Rv中的Mtb10.4和Hsp16.3的基因序列，设计引物；
(2)PCR扩增Mtb10.4基因：由于Mtb10.4基因后面要融合Hsp16.3，所以设计引物时把Mtb10.4终止信号去掉；以结核杆菌标准毒株DNA为模板，用5`端特异性引物Mtb10.4F和3`端引物Mtb10.4R扩增Mtb10.4全基因序列；
PCR反应条件：96℃预变性1min，98℃变性10s，54℃复性15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；PCR产物经胶回收试剂盒纯化进行纯化。
(3)构建重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)：用Nde I和Sac I双酶切纯化后Mtb10.4基因和质粒pET30a，在T4连接酶的作用下将两者进行连接，转化入E.Coli DH5α中，构建重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。
(4)PCR扩增Hsp16.3基因：以结核杆菌标准毒株DNA为模板，用Hsp16.3F和Hsp16.3R扩增Hsp16.3基因片段；
PCR反应条件：96℃预变性1min，98℃变性10s，55℃复性20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；PCR产物经胶回收试剂盒纯化；
(5)构建重组质粒Mtb10.4-Hspx-pET-30a(+)：用Sac I和HindIII双酶切纯化后Hspx基因和重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)，分别纯化后用T4连接酶进行连接，转化入E.ColiDH5α，克隆构建重组质粒Mtb10.4-Hspx-pET-30a(+)；PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。
所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的表达方法包括以下步骤：
(1)从以上EColi的pET30a-Mtb10.4-Hsp16.3(DH5α)提取重组质粒pET30a-Mtb10.4-Hsp16.3，转化入E.Coli BL21(DE3)中，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定(北京华大基因科技完成测序)，即为保存菌种pET30a-Mtb10.4-Hsp16.3(BL21)；
(2)活化表达MH蛋白的E.coli BL-21菌体，取1ml活化后菌体加入200mlLB培养基中震荡培养3h 10mim至OD 600nm达到～0.6；加入IPTG(1.0mmol/L)100ul；25℃诱导振荡培养12h；4℃10000rpm/min离心10min收集菌体；菌体重悬于PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O20mMol/L，Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，pH7.4)10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌1h(180～200W，超声4s停5s)；10000rpm/min离心20min后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；经SDS-PAGE电泳分析，与BL21空菌相比，分子量在26.7KD左右有明显的特异蛋白表达条带，以上清形式表达为主，沉淀中蛋白很少。
所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的纯化方法包括以下步骤：
(1)配制以下缓冲液：I液20mM PB(pH7.4)；II液20mM PB+1M NaCl(pH7.4)；III液20mM PB+2M NaCl(pH7.4)；缓冲液均用0.45um滤器过滤除菌；
(2)大量表达融合蛋白MH，收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎1h左右，4℃/10,000rpm离心10min，离心后收集含MH蛋白的上清；上清用0.45um滤器过滤除菌；
(3)第一步纯化：离子交换层析。选用强阴离子交换柱Q介质进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得初步纯化物；
(4)第二步纯化：疏水层析。经过离子交换层析初步纯化后的蛋白，加入等体积的III液，使蛋白含高盐上柱。选用Butyl HP柱进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得二步纯化物；
(5)第三步纯化：凝胶过滤层析。将经过离子交换层析和疏水层析两步纯化后的蛋白，选用superdex prep grade柱进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得最终纯化物；
(6)将最终得到的蛋白纯化物测定浓度之后即可使用。
上述结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3应用在结核亚单位疫苗中。
本发明的优点在于：本发明利用基因工程技术，成功构建、表达和纯化了不带有任何标签的结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-Ag85B，解决了融合蛋白所带有的标签会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的后续问题，并且通过利用不同的色谱分析方法使融合蛋白得到了有效的纯化，此蛋白可诱导较强的细胞和体液免疫应答并具有一定的动物保护效应，有望成为临床结核病预防和治疗的候选疫苗；该融合蛋白疫苗可诱导动物较强的细胞和体液免疫反应；通过动物攻毒实验表明，该疫苗在BCG免疫基础上，具有加强免疫作用，可提高和延长BCG的保护效果；且该疫苗无明显毒副作用。
附图说明
图1在大肠杆菌中表达纯化蛋白MH(Mr为26.7x103)(1.蛋白Maker，2.纯化前的MH，3.第一步纯化后的蛋白MH，4.第二步纯化后的蛋白MH，5.第三步步纯化后的蛋白)；
图2脾细胞分泌IFN-r水平(A：抗原Hsp16.3刺激脾细胞，B：PPD刺激脾细胞)；
图3结核抗原Hps6.3特异性抗体水平(A：抗体IgG1，B：抗体IgG2b)；
图4分泌IFN-r因子的脾细胞数量(A：细胞用Mtb10.4抗原的CD8T细胞表位刺激，B：细胞用Hxp6.3蛋白进行刺激，C：细胞用PPD进行刺激，*表示实验组与PBS、BCG组进行统计学分析时P值小于0.05)；
图5分泌IL-17因子的脾细胞数量(A：细胞用Mtb10.4抗原的CD8T细胞表位刺激，B：细胞用Hxp6.3蛋白进行刺激，*表示实验组与PBS、BCG组进行统计学分析时P值小于0.05)；
图6结核抗原Hps6.3特异性抗体水平(A：抗体IgG1，B：抗体IgG2b，C：抗体IgG2c)；
图7融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3对BCG初免动物的保护效果(结果用肺和脾的CFU数的对数表示，每组小鼠数量大于等于6只，数据用方差分析方法和SPSS13.0软件进行统计)。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
一、结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化
首先，将Mtb10.4和Hsp16.3基因进行PCR扩增并依次插入到克隆载体的多克隆位点中，构建重组载体；然后将上述重组载体在大肠杆菌中表达融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3；最后根据融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的分子量、电荷和亲和力进行纯化，通过纯化得到融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3，具体步骤如下：
1、融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3(MH)的构建：
(1)根据GenBank中H37Rv中的Mtb10.4(Rv0288，相对分子量Mr为10.4×10396AA)和Hsp16.3(Rv2301，相对分子量Mr为16.3×103，144AA)的基因序列，设计4对引物，分别为：
Mtb 10.4F  GTGCATATGTCGCAAATCATGTACAACTA(Nde I)
Mtb 10.4R  ATAGAGCTCGCCGCCCCATTT(Sac I)
Hspx F     ATAGAGCTCTTCGCAGTCACGAACGACGGGG
           TGATTATGGCCACCACCCTTC(Sac I)
Hspx R     ACAAAAGCTTTCAGTTGGTGGACCG(HindIII)
(2)PCR扩增Mtb10.4基因：由于Mtb10.4基因后面要融合Hsp16.3，所以设计引物时把Mtb10.4终止信号去掉，以结核杆菌标准毒株(H37Rv)DNA为模板，用5`端特异性引物Mtb10.4F和3`端引物Mtb10.4R扩增Mtb0.4全基因序列；PCR反应条件：96℃预变性1min，98℃变性10s，54℃复性15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；PCR产物经胶回收试剂盒纯化进行纯化。
(3)构建重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)：用Nde I和Sac I双酶切纯化后Mtb10.4基因和质粒pET30a，在T4连接酶的作用下将两者进行连接，转化入E.Coli DH5α中，构建重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。(见鉴定结果序列表)
(4)PCR扩增Hsp16.3基因：以结核杆菌标准毒株(H37Rv)DNA为模板，用Hsp16.3F和Hsp16.3R扩增Hsp16.3基因片段；PCR反应条件：96℃预变性1min，98℃变性10s，55℃复性20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经胶回收试剂盒纯化。
(5)构建重组质粒Mtb10.4-Hspx-pET-30a(+)：用Sac I和HindIII双酶切纯化后Hspx基因和重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)，分别纯化后用T4连接酶进行连接，转化入E.Co1iDH5α，克隆构建重组质粒Mtb10.4-Hspx-pET-30a(+)。PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。(见鉴定结果序列表)
2、MH蛋白(分子量为26.7x 103)的表达(见氨基酸序列表)
(1)从以上E.Coli中的pET30a-Mtb10.4-Hsp16.3(DH5α)提取重组质粒pET30a-Mtb10.4-Hsp16.3，转化入E.Coli BL21(DE3)中，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定(北京华大基因科技完成测序)，即为保存菌种pET30a-Mtb10.4-Hsp16.3(BL21)。
(2)活化表达MH蛋白的E.coli BL-21菌体，取1ml活化后菌体加入200mlLB培养基中震荡培养3h10mim至OD600nm达到约0.6；加入IPTG(1.0mmol/L)100ul；25℃诱导振荡培养12h；4℃10000rpm/min离心10min收集菌体；菌体重悬于PB缓冲液(Na2HPO4·12H2O20mMol/L，Na2HPO4·12H2O 20mMol/L，pH7.4)10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌1h(180～200W，超声4s停5s)；10000rpm/min离心20min后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；经SDS-PAGE电泳分析，与BL21空菌相比，分子量在26.7KD左右有明显的特异蛋白表达条带，以上清形式表达为主，沉淀中蛋白很少。(见蛋白表达结果序列表)。
3.MH蛋白(分子量为26.7×103)的纯化
(1)配制以下缓冲液：I液20mM PB(pH7.4)；II液20mM PB+1M NaCl(pH7.4)；III液20mM PB+2M NaCl(pH7.4)；缓冲液均用0.45um滤器过滤除菌；
(2)大量表达融合蛋白MH，收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎1h左右，4℃/10,000rpm离心10min，离心后收集含MH蛋白的上清；上清用0.45um滤器过滤除菌；
(3)第一步纯化：离子交换层析；选用季铵基交联琼脂糖高柱效介质(Q SepheroseHigh Performance)(注：强阴离子交换柱)进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析得初步纯化物；
(4)第二步纯化：疏水层析；经过离子交换层析初步纯化后的蛋白，加入等体积的III液，使蛋白含高盐上柱，选用丁基交联琼脂糖高柱效介质(Butyl SepheroseHigh Performance)进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析得二步纯化物；
(5)第三步纯化：凝胶过滤层析；将经过离子交换层析和疏水层析两步纯化后的蛋白，选用凝胶过滤介质Superdex 75pre grade(superdex为交联琼脂糖和葡萄糖的符合填料；分离范围为：3000～70000)进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析得最终纯化物；(纯化结果见附图1)
(6)将最终得到的蛋白纯化物测定浓度之后即可使用。
二、融合蛋白MH免疫活性检测方法
1实验材料：MH蛋白；Hsp16.4蛋白、己二酸二癸酯(DDA)、海藻糖二霉菌酸脂(TDM)；
卡介苗(BCG)、磷酸盐缓冲液(PBS)；
2实验动物：C57BL/6小鼠；
3实验动物分组(共四组)：
A：PBS；
B：BCG；
C：MH+DDA+TDM；
D：Hsp16.3+DDA+TDM；
4制备蛋白和佐剂混合疫苗：
将融合蛋白Mtb10.4-Hspx(MH)和Hsp16.3蛋白分别用用PBS稀释到0.2mg/ml；DDA和TDM用氯仿-甲醇溶液(氯仿∶甲醇＝9∶1)溶解，氮气吹干(使氯仿-甲醇溶液挥发完全)、用低温冷冻干燥仪将吹干后的薄膜过夜干燥成粉末状，PBS重悬粉末(DDA终浓度为5mg/ml，TDM终浓度为1mg/ml)，60℃水浴20分钟溶解粉末，冷却到室温待用。将溶解好的蛋白、DDA、TDM按2∶1∶1比例混合均匀即可使用。
5免疫动物：
第1周用制备好的混合疫苗(MH+DDA+TDM和Hsp16.3+DDA+TDM)腹股沟皮下免疫实验组动物一次(200μl/只)，同时免疫对照组PBS和BCG组(5×106CFU/只)；实验组动物初次免疫后分别在第3、6周用制备好的混合疫苗腹股沟皮下相同剂量加强免疫动物(200μl/只)。
6免疫指标测定方法
(1)细胞免疫检测
应用ELISA方法检测了免疫小鼠脾脏淋巴细胞分别针对特异性抗原分泌IFN-γ和IL-17的水平。小鼠末次免疫6W后无菌分离脾脏淋巴细胞，特异性抗原和脾细胞在24板中共同孵育68小时后，收集细胞培养上清，用ELISA计数检测脾脏淋巴细胞在Hsp16.3蛋白，PPD蛋白刺激后IFN-γ的表达。具体步骤：无菌摘除脾脏，研磨后经200目尼龙网过滤，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。将分离出的淋巴细胞加入到24孔细胞培养板中，终浓度为5×106，分别给予Hsp16.3蛋白(10ug/ml)，PPD蛋白(10ug/ml)刺激。在37℃、5％CO2条件下共同孵育68时后，收集细胞培养上清。将细胞培养上清加入到96孔ELISA板中，100ul/孔，按ELISA说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色、终止反应、酶标仪读板、根据标准曲线求的IFN-r的数值(pg/ml)。
结果显示：PBS、BCG、MH+DDA+TDM、H+DDA+TDM四组结果进行比较，重组MH蛋白与DDA和TDM佐剂结合组，在Hsp16.3蛋白，PPD蛋白刺激后，脾细胞分泌IFN-γ的水平明显高于PBS组和BCG组，具有明显统计学差异(P＜0.05)；与单个抗原H+DDA+TDM组相比无明显统计学差异(P＞0.05)，表明可产生相同水平的IFN-r。结果证明本发明的融合蛋白与佐剂DDA和TDM混合后可引起较强的细胞免疫反应，保留了单个抗原Hsp16.3的免疫原性。(结果见附图2-A、2-B)
(2)体液免疫反应
用ELISA法检测小鼠血清抗体表达水平。用Hsp16.3(5ug/ml)包被96孔板(100μl/well)4℃过夜；用PBST溶液300μl/well洗板5次×1min/次；从1∶100开始至1∶25600(IgG2b和IgG2c)或从1∶1600开始到1∶509600(IgG1)，加入对倍稀释的血清样品，37℃放置1h。洗板后，加入200μl/well的1∶15000稀释的兔抗鼠IgG1、1∶10000稀释的兔抗鼠IgG2b、1∶5000稀释的兔抗鼠IgG2c，37℃放置1h。洗板后，加入100μl/well TMB显色液，室温避光反应15分钟显色后，加入50μl/well终止液(2N的H2SO4)终止反应；在450nm检测OD值。
结果显示：PBS、BCG、MH+DDA+TDM、H+DDA+TDM四组结果进行比较，重组MH蛋白与DDA和TDM佐剂结合组，针对抗原Hps16.3所产生的特异性抗体IgG1、IgGb和IgGc的水平明显高于PBS、BCG和单个抗原H+DDA+TDM组。
此结果显示本发明的融合蛋白可刺激机体产生抗原Hsp16.3特异性抗体，具有较强的体液免疫反应，说明抗原融合后保留了原单个抗原Hsp16.3的免疫原性。(结果见附图3-A、3-B、3-C)
三、加强BCG效应及保护力评价
1实验材料：MH蛋白；己二酸二癸酯(DDA)、海藻糖二霉菌酸脂(TDM)；卡介苗(BCG)、磷酸盐缓冲液(PBS)；
2实验动物：C57BL/6小鼠；
3实验动物分组(共三组)：
A：PBS
B：BCG
C：BCG/MH+DDA+TDM
4制备疫苗：
将融合蛋白Mtb0.4-Hspx(MH)用PBS稀释到0.2mg/ml；DDA和TDM用氯仿-甲醇溶液(氯仿∶甲醇＝9∶1)溶解，氮气吹干(使氯仿-甲醇溶液挥发完全)、用低温冷冻干燥仪将吹干后的薄膜过夜干燥成粉末状，PBS重悬粉末(DDA终浓度为5mg/ml，TDM终浓度为1mg/ml)，60℃水浴20分钟溶解粉末，冷却到室温待用。将溶解好的蛋白、DDA、TDM按2∶1∶1比例混合均匀即可使用。
5免疫动物：
第1周卡介苗(BCG)5×106CFU腹股沟皮下免疫动物一次；卡介苗(BCG)初次免疫后分别在第12、14周用制备好的蛋白疫苗腹股沟皮下免疫动物(200μl/只)。
6、免疫指标测定方法
小鼠最后一次蛋白、苗免疫6周后分别进行细胞免疫和体液免疫检测。
(1)细胞免疫检测
应用ELISPOT方法检测了免疫小鼠脾脏淋巴细胞分别针对特异性抗原分泌IFN-γ和IL-17的水平。IFN-γ和IL-17的分泌水平与结核病的保护性免疫反应成正相。最后一次免疫小鼠6周后无菌分离脾脏淋巴细胞，应用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)技术检测脾脏淋巴细胞在Mtb10.4CD8+T cell抗原表位，Hsp16.3蛋白，PPD蛋白刺激后IFN-γ和IL-17的表达。
具体步骤：96孔板预先用IFN-γ抗体和IL-17抗体包被过夜，无菌摘除脾脏，研磨后经200目尼龙网过滤，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。将分离出的淋巴细胞加入96孔ELISPOT板中，终浓度为5×106/空，分别给予Mtb10.4CD8+T cell抗原表位(5ug/ml)，HSP16.3蛋白(10ug/ml)，PPD蛋白(10ug/ml)刺激。在37℃、5％CO2条件下共同孵育48小时后，按ELISPOT操作说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色，计数斑点数。
结果显示：PBS、BCG、BCG/MH+DDA+TDM三组结果进行比较重组MH蛋白与DDA和TDM佐剂结合组，在Mtb10.4CD8+T cell抗原表位，HSP16.3蛋白，PPD蛋白刺激后，脾细胞分泌IFN-γ和IL-17的水平明显高于PBS组和BCG组。结果证明本发明的融合蛋白与佐剂DDA和TDM混合后可引起较强的细胞免疫反应。(见附图4-A、4-B、4-C、附图5-A、5-B)
(2)体液免疫反应
用ELISA法检测小鼠血清抗体表达水平。用Hsp16.3(5ug/ml)包被96孔板(100μl/well)4℃过夜，用PBST溶液300μl/well洗板5次×1min/次，从1∶100开始至1∶25600(IgG2b和IgG2c)或从1∶1600开始到1∶509600(IgG1)，加入对倍稀释的血清样品，37℃放置1h。洗板后，加入200μl/well的1∶15000稀释的兔抗鼠IgG1、1∶10000稀释的兔抗鼠IgG2b、1∶5000稀释的兔抗鼠IgG2c，37℃放置1h。洗板后，加入100μl/well TMB显色液，室温避光反应15分钟显色后，加入50μl/well终止液(2N的H2SO4)终止反应；在450nm检测OD值。
结果显示：PBS、BCG、BCG/MH+DDA+TDM三组结果进行比较，重组MH蛋白与DDA和TDM佐剂结合组，Hps16.3所产生的特异性抗体IgG1、IgGb和IgGc的水平明显高于PBS和BCG组。此结果表明本发明的融合蛋白可刺激机体产生较强的体液免疫反应。(见附图6-A、6-B、6-C)
7、攻毒后免疫小鼠组织的结核菌载量
具体步骤：给每组小鼠攻击等量的结核菌毒株H37Rv后6周，解剖所有的小鼠，计算肺脏中结核菌的数量，用来评价本专利的融合蛋白MH的动物保护效果。
结果显示，在小鼠肺脏中，BCG/MH+DDA+TDM组的结核菌量明显少于PBS组(P＝0.00)和BCG组(P＝0.069)。(细菌载量结果见附图7)
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
基因Mtb0.4和Hsp16.3测序
Mtb10.4基因测序正确的序列：
ATGTCGCAAATCATGTACAACTACCCCGCGATGTTGGGTCACGCCGGGGATATGGCCGGA
TATGCCGGCACGCTGCAGAGCTTGGGTGCCGAGATCGCCGTGGAGCAGGCCGCGTTGCAG
AGTGCGTGGCAGGGCGATACCGGGATCACGTATCAGGCGTGGCAGGCACAGTGGAACCAG
GCCATGGAAGATTTGGTGCGGGCCTATCATGCGATGTCCAGCACCCATGAAGCCAACACC
ATGGCGATGATGGCCCGCGACACGGCCGAAGCCGCCAAATGGGGCGGC
 
Hsp16.3基因测序正确的序列
ATGGCCACCACCCTTCCCGTTCAGCGCCACCCGCGGTCCCTCTTCCCCGAGTTTTCTGAGCTGTTCGCGGCCTTCCCGTCATTCGCCGGACTCCGGCCCACCTTCGACACCCGGTTGATGCGGCTGGAAGACGAGATGAAAGAGGGGCGCTACGAGGTACGCGCGGAGCTTCCCGGGGTCGACCCCGACAAGGACGTCGACATTATGGTCCGCGATGGTCAGCTGACCATCAAGGCCGAGCGCACCGAGCAGAAGGACTTCGACGGTCGCTCGGAATTCGCGTACGGTTCCTTCGTTCGCACGGTGTCGCTGCCGGTAGGTGCTGACGAGGACGACATTAAGGCCACCTACGACAAGGGCATTCTTACTGTGTCGGTGGCGGTTTCGGAAGGGAAGCCAACCGAAAAGCACATTCAGATCCGGTCCACCAACTGA
 
MH蛋白氨基酸序列
sqimynypa mlghagdmag yagtlqslga eiaveqaalq sawqgdtgit yqawqaqwnq amedlvrayh amsstheant mammardtae aakwgg ra mattlpvqrh prslfpefse lfaafpsfag lrptfdtrlm rledemkegr yevraelpgvdpdkdvdimv rdgqltikae rteqkdfdgr sefaygsfvr tvslpvgade ddikatydkgiltvsvavse gkptekhiqi rstn
 

Claims (5)

1.结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10. 4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，其特征在于：
    首先，以结核杆菌标准毒株H37Rv DNA为模板，将Mtb10.4和Hsp16.3基因进行PCR扩增并依次插入到克隆载体的多克隆位点中，构建重组载体；
    然后将上述重组载体在大肠杆菌中表达融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3；
最后根据融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的分子量、电荷和亲和力进行纯化，通过纯化得到融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3；
其中，Mtb10.4和Hsp16.3基因为结核杆菌标准毒株H37Rv的Mtb10.4和Hsp16.3基因；
PCR扩增Mtb10.4全基因序列时所用的引物为：5＇特异性引物：GTGCATATGTCGCAAATCATGTACAACTA和3＇特异性引物：ATAGAGCTCGCCGCCCCATTT；PCR扩增Hsp16.3全基因序列时的引物为：5＇特异性引物：ATAGAGCTCTTCGCAGTCACGAACGACGGGG  TGATTATGGCCACCACCCTTC和3＇特异性引物：ACAAAAGCTTTCAGTTGGTGGACCG。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，其特征在于所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建方法包括以下步骤：
    (1)根据GenBank中结核杆菌标准毒株H37Rv的Mtb10.4和Hsp16.3的基因序列，设计引物；
    (2) PCR扩增Mtb10.4基因：以结核杆菌标准毒株H37Rv DNA为模板，用5＇端特异性引物Mtb10.4F和3＇端引物Mtb10.4R扩增Mtb10.4全基因序列；
PCR反应条件：96℃预变性1min，98℃变性10s，54℃复性15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；PCR产物经胶回收试剂盒纯化进行纯化；
其中，所述Mtb10.4F为GTGCATATGTCGCAAATCATGTACAACTA，所述Mtb10.4R为ATAGAGCTCGCCGCCCCATTT；
    (3)构建重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)：用Nde Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切纯化后的Mtb10.4基因和质粒pET30a，在T4连接酶的作用下将两者进行连接，转化入E．Coli DH5α中，构建重组质粒Mtb10. 4-pET-30a(+)，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定；
    (4) PCR扩增Hsp16.3基因：以结核杆菌标准毒株H37Rv DNA为模板，用Hsp16. 3F和Hsp16.3R扩增Hsp16.3基因片段；
PCR反应条件：96℃预变性1min，98℃变性10s，55℃复性20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；PCR产物经胶回收试剂盒纯化；
其中，所述Hsp16.3F为ATAGAGCTCTTCGCAGTCACGAACGACGGGG  TGATTATGGCCACCACCCTTC，所述Hsp16.3R为ACAAAAGCTTTCAGTTGGTGGACCG；
    (5)构建重组质粒Mtb10.4-Hsp16.3-pET-30a(+)：用Sac Ⅰ和HindⅢ双酶切纯化后Hsp16.3基因和重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)，分别纯化后用T4连接酶进行连接，转化入E．Coli DH5α，克隆构建重组质粒Mtb10.4-Hsp16.3-pET-30a(+)；PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。
3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10. 4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，其特征在于所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的表达方法包括以下步骤：
    (1)从 所述E．Coli DH5α中的Mtb10.4-Hsp16.3-pET-30a(+)提  取  重  组  质  粒Mtb10.4-Hsp16.3-pET-30a(+)，转化入E．Coli中，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定；
    (2)活化表达Mtb10.4-Hsp16.3蛋白的E．coli菌体，取活化后菌体加入培养基中震荡培养；诱导振荡培养，离心收集菌体；菌体重悬于缓冲液中，冰浴下超声破碎细菌，离心后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10. 4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，其特征在于所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的纯化方法包括以下步骤：
    (1)配制以下缓冲液：Ⅰ液20mM PB；Ⅱ液20mM PB+1M NaCl；Ⅲ液20mM PB+2M NaCl；缓冲液均用滤器过滤除菌；
    (2)大量表达融合蛋白 Mtb10.4-Hsp16.3，收集的菌体重悬于缓冲液中，冰浴下超声破碎，离心后收集含Mtb10.4-Hsp16.3蛋白的上清，上清用滤器过滤除菌；
    (3)第一步纯化离子交换层析：选用强阴离子交换柱Q介质进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得初步纯化物；
    (4)第二步纯化疏水层析：经过离子交换层析初步纯化后的蛋白，加入等体积的Ⅲ液，使蛋白含高盐上柱，选用Butyl HP柱进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得二步纯化物；
    (5)第三步纯化凝胶过滤层析：将经过离子交换层析和疏水层析两步纯化后的蛋白，选用superdex 75柱进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得最终纯化物；
    (6)将最终得到的蛋白纯化物测定浓度之后即可使用。
5.权利要求1-4之一所制备的结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3在制备结核亚单位疫苗中的应用。
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