CN111035755B - 一种1型糖尿病疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种1型糖尿病疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。本发明将GAD65的190‑320位氨基酸序列及HSP60的437‑460位的P277肽通过辅助性Th通用表位及间隔子序列插入T7噬菌体DNA衣壳蛋白10B编码基因的3’端，使人GAD65的190‑320位氨基酸序列及HSP60的437‑460位的P277肽与T7 10B表达成融合蛋白，构建成为重组噬菌体GAD65190‑320+P277/T7，并进一步制备成疫苗。使用本发明疫苗免疫机体后，能诱导机体产生针对GAD65和277的特异性抗体，同时诱导机体产生免疫耐受，诱导产生Treg细胞，降低血糖，从而达到预防和治疗1型糖尿病的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种1型糖尿病疫苗及其制备方法。
背景技术
1型糖尿病(type 1diabetes mellitus，T1DM)又称为自身免疫性糖尿病，是由包括病毒感染、药物接触、遗传因素及自身免疫在内的各种原因引起的由激活的T淋巴细胞介导的一系列自身免疫反应所引起的选择性胰岛β细胞破坏甚至功能衰竭，导致体内胰岛素缺乏进行性加重以及慢性高血糖，依赖终身注射胰岛素控制血糖。自1921年Best和Banting发现胰岛素以来，皮下注射胰岛素一直是治疗T1DM的最主要手段。近年来随着胰岛素缓释泵技术及基因工程改造的长效胰岛素的广泛应用，T1DM患者的血糖较以往得到了更有效的控制。但由于通过此类方法产生的胰岛素释放不受血糖调控，或者血糖释放不符合生理节律等，患者的血糖往往波动较大，且容易引起低血糖晕厥。而且经济成本高、具有潜在的副作用，给患者带来了巨大的负担。治疗1型糖尿病的终极目标是抑制自身免疫性攻击并避免全身性副作用，同时促进胰岛再生和修复。但现有治疗方法，无论胰岛移植还是胰岛素，都无法实现这一目的。因此使用免疫手段调控自身免疫系统引发免疫耐受可成为预防并治疗1型糖尿病的创新手段。
GAD是谷氨酸代谢中γ-氨基丁酸的限速酶。谷氨酸脱羧酶(GAD65)是谷氨酸脱羧酶的异构体(65kD)由585个氨基酸残基组成，是T1DM中一个重要的自身抗原，超过65％的T1DM患者在确诊时体内有GAD65自身抗体。人体内出现GAD65抗体后有相当大一部分人最终会发展成T1DM。GAD65包含了许多不同的抗原表位，对自身免疫糖尿病的发生发展有着不同的影响，GAD206-220、GAD286-300、GAD290-309、GAD509-528、GAD524-543、GAD546-554抗原表位肽段或其特异性T细胞克隆能减轻自身免疫性胰岛炎，降低发病率，是预防1型糖尿病的保护性表位。近年来，无论是在动物模型还是人类的研究中，应用GAD65肽、GAD65蛋白对T1DM进行预防和治疗，均显示GAD65可以成功地诱导机体的免疫耐受，降低T1DM的发病率。重塑机体免疫系统对自身抗原的特异性免疫耐受是治疗1型糖尿病的最为理想的治疗策略，而诱导抗原特异性Tregs是T1DM疫苗研究成功的关键。
人热休克蛋白60(HSP60)是T1DM中胰岛β细胞的自身抗原之一，P277肽是位于HSP60上437～460位的一段特异性多肽，在T1DM的发病机制中发挥重要作用。基于P277开发的融合蛋白疫苗在NOD模型鼠中也显示了不错的预防T1DM的效果。但是现有的P277多肽是由人工合成的，其成本高、产量低，限制了大规模药效学的研究。同时研究也表明，患者需要长期持续的277治疗才能达到效果，一旦停药β细胞功能仍会继续发生损伤，而且单独免疫277诱导出的抗原特异性Treg细胞数量并不理想，这就使得P277必须通过其他的肽或表位联合表达来增强其作用，同时在一个低成本、高产量、相对安全的疫苗载体上表达。
然而目前处于临床研究的T1DM疫苗多为单抗原疫苗，而T1DM的自身抗体的表达水平不会一成不变，会受它们识别的抗原表位、自身抗原的水平、抗体表达的调控基因等多个因素的变化影响。50％～70％的T1DM在初诊时可存在自身抗体阳性，随着病程进展，阳性率会逐渐降低。因此，携带多个目标抗原或者是辅助抗原，拓宽疫苗的保护谱，是糖尿病疫苗优化设计的一种策略。
因此如何克服现有技术的不足是目前生物技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种1型糖尿病疫苗及其制备方法。使用本发明疫苗免疫机体后，能诱导机体产生针对GAD65和277的特异性抗体，同时诱导机体产生免疫耐受，诱导产生Treg细胞，降低血糖，从而达到预防和治疗1型糖尿病的目的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种1型糖尿病疫苗，活性成分包括重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7；
所述的重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7的构建方法包括如下步骤：
(1)间隔子氨基酸序列将人GAD65190-320氨基酸序列和人P277氨基酸序列间隔串联，并在N-端添加辅助性Th通用表位，构建成GAD65190-320+P277多表位序列；
(2)将GAD65190-320+P277多表位序列5’端引入EcoRI的酶切位点，3’端引入XhoI酶切位点，合成插入pGEM-T载体，构建重组质粒GAD65190-320+P277/T；
(3)将合成构建得到的质粒GAD65190-320+P277/T转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，克隆扩增，提取重组质粒GAD65190-320+P277/T；
(4)从重组质粒GAD65190-320+P277/T上用EcoRI和XhoI双酶切下目的片段，插入T7噬菌体载体多克隆位点的EcoRI和XhoI之间，使其位于T7 10B基因的3’端，使人GAD65190-320+P277表位与T7 10B表达成融合蛋白，构建成为重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7；
其中，间隔子氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，辅助性Th通用表位氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。人GAD65190-320氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。人P277氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
GAD65表位基因序列如SEQ ID NO.5所示。
人277表位基因序列如SEQ ID NO.6所示。
辅助性Th通用表位基因序列如SEQ ID NO.7所示。
间隔子基因序列分别如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.12所示。
GAD65190-320+P277多表位序列如SEQ ID NO.9所示
本发明GAD65190-320+P277多表位序列设计如表1所示，两个间隔子基因序列可以相同，也可以不同，优选左边的间隔子基因序列分别如SEQ ID NO.8，右边的间隔子基因序列分别如SEQ ID NO.12。
进一步，优选的是，步骤(3)中克隆扩增方法是：将合成构建得到的质粒GAD65190-320+P277/T转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，涂布LB固体培养基平板Ampr，37℃倒置培养过夜，挑取LB固体培养基平板Ampr中的单菌落至装有5ml LB液体培养基Ampr的试管中，于恒温摇床37℃，150rpm/min过夜培养，次日将该5ml菌液接种400ml LB液体培养基Ampr，于恒温摇床37℃，150rpm/min过夜培养，次日收获菌液，用质粒大量抽提试剂盒从克隆扩增收获的菌液中提取重组质粒GAD65190-320+P277/T。
进一步，优选的是，步骤(4)的具体方法为：
A、重组质粒GAD65190-320+P277/T用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，双酶切体系如下：
10×H buffer 30μl；
EcoR I 10μl；
XhoI 10μl；
重组质粒GAD65190-320+P277/T 250μl；
总体积300μl
37℃水浴60min，1％琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒回收目的片段；
B、将T7噬菌体载体用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，并回收酶切产物，T7噬菌体载体双酶切体系如下：
10×H Buffer 2μl；
EcoR I 1μl；
XhoI 1μl；
T7 Select 10-3b 5μl；
H2O 11μl；
总体积20μl；
37℃水浴60min，按DNA片段纯化的操作用小量胶回收试剂盒回收酶切产物；
C、GAD65190-320+P277片段与T7噬菌体载体的连接，GAD65190-320+P277/T重组质粒EcoRI和XhoI双酶切电泳后的胶回收所得的目的片段与T7噬菌体载体双酶切后，回收所得的酶切产物进行连接，其连接反应体系为：
T7噬菌体载体双酶切回收产物0.5μl；
GAD65190-320+P277/T重组质粒双酶切电泳后的胶回收产物2μl；
Solution I 2.5μl；
总体积5μl；
室温连接过夜，得重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7。
本发明第二方面提供上述构建方法构建得到的重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7。
本发明第三方面提供上述重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7在制备1型糖尿病疫苗中的应用。
本发明第四方面提供一种1型糖尿病疫苗的制备方法，采用上述构建方法构建得到的重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7进行制备。
进一步，优选的是，包括如下步骤：
将重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7在大肠杆菌株BLT5403中扩增后，按收获噬菌体，测定噬菌体的滴度，滴度按pfu/ml计数，调整噬菌体浓度为所需滴度，将甲醛按1∶4000体积比加入噬菌体中，用常规方法灭活，得1型糖尿病疫苗。
进一步，优选的是，具体制备方法是：
(1)将甘油冻存的E.coli BLT5403菌株在LB固体培养基平板ampr上划线接种，37℃过夜培养；
(2)从平板上挑取单菌落接种5ml LB培养基，37℃、150rpm振荡过夜；
(3)过夜培养的E.coli BLT5403菌液按1∶100比例分别接种5ml、500ml LB液体培养基ampr各一份，37℃、150rpm振荡培养至OD600＝0.6～0.8，时间为1～3h，得新鲜E.coliBLT5403菌液，存放于4℃备用；
(4)接种50μl(1011pfu/ml)GAD65190-320+P277/T7噬菌体种子至5ml OD600＝0.6～0.8的新鲜E.coli BLT5403菌液中，37℃、150rpm培养1～3h至菌液澄清并出现细丝状残片；
(5)将步骤(4)所得噬菌体液接种至步骤(3)得到的500ml OD600＝0.6～0.8的新鲜E.coli BLT5403菌液中，37℃、150rpm培养3h至菌液澄清并出现细丝状残片；
(6)所得噬菌体液4℃离心10000rpm，10min，取上清，加入固体NaCl使其终浓度为1M，振摇至溶解，4℃1h或4℃过夜；
(7)4℃，10000rpm离心10min，收集上清，向上清中加入PEG8000，振荡至完全溶解后，4℃过夜；PEG8000与上清的质量体积比1g/10mL；
(8)4℃，10000rpm离心30min，弃上清；
(9)所得沉淀物用10ml噬菌体稀释液剧烈抽提后，4℃、10000rpm离心15min，收集上清；
所述的噬菌体稀释液含有1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA；
(10)余下的沉淀物重复一次步骤(9)，合并收集的上清之后保存；
(11)测定噬菌体的滴度，滴度按pfu/ml计数，调整噬菌体浓度为所需滴度，将甲醛按1∶4000体积比加入噬菌体中，用常规方法灭活，得1型糖尿病疫苗。
表位的加工效率对多表位疫苗的免疫原性具有重要的影响，因而要对各独立表位进行修饰，为了保证各表位之间的独立性和能够有效呈递，在设计多表位时加入间隔子将大大提高呈递效率。本发明将GPGPG序列作为间隔子序列引入疫苗设计的有以下两个原因：(1)GPGPG会包裹表位的核心结合区；(2)β转角与富含G和P的区域有关，多表位中含有GPGPG序列可能有助于二级结构和三级结构的形成、促进表位呈递。这也是是糖尿病疫苗优化设计的另一种策略。
本发明利用T7噬菌体作为疫苗载体构建重组T7噬菌体多表位疫苗具有多种优势：(1)噬菌体作为表达产物的载体展示的是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应；(2)噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应；(3)由于噬菌体颗粒是由感染的细菌细胞分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产抗原用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价抗原；(4)纯化简单、花费少；(5)噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。(6)另外T7噬菌体已完成全序列分析，遗传背景清楚。它的复制周期短，胞质蛋白组装、操作和储存方便，克隆效率高，以及T7噬菌体对理化因素抵抗力强等特点也使得T7噬菌体展示系统优于其它的噬菌体展示系统。由于应用噬菌体展示技术研究基因工程抗原具有以上的优点，弥补了传统抗原和其它基因工程抗原产量不高、纯化复杂等缺陷，对新型疫苗的开发具有重要意义。
本发明提出：将GAD65的190-320位氨基酸序列及HSP60的437-460位的P277肽通过辅助性表位及间隔子序列插入T7噬菌体DNA衣壳蛋白10B编码基因的3’端，使人GAD65的190-320位氨基酸序列及HSP60的437-460位的P277肽与T7 10B表达成融合蛋白，构建成为重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7。这种构建方法的优势在于：(1)同时携带GAD65和HSP60的表位，拓宽了疫苗的保护谱；(2)加入辅助性表位有利于免疫细胞的活化；(3)加入间隔子有利于多表位中二级结构和三级结构的形成、促进表位呈递。(4)T7噬菌体是一个低成本、高产量、相对安全的疫苗载体。用该疫苗皮下免疫非肥胖型(NOD)小鼠，通过产生针对GAD65和P277的抗体，能够诱导免疫耐受，诱导Treg细胞的增殖，降低血糖，达到治疗1型糖尿病的目的。能克服现有疫苗免疫谱单一、治疗成本过高和不能很好的诱导Treg细胞的缺点，具有很广的应用前景。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
(1)与单价疫苗相比，同时携带GAD65和HSP60的表位，拓宽了疫苗的保护谱；
(2)加入辅助性表位有利于免疫细胞的活化；
(3)加入间隔子有利于多表位中二级结构和三级结构的形成、促进表位呈递；
(4)T7噬菌体是一个低成本、高产量、相对安全的疫苗载体。将重组噬菌体疫苗皮下免疫非肥胖糖尿病小鼠(NOD)，刺激产生针对GAD65和P277的特异性抗体，同时可激活体内调节性T细胞增殖从而诱导免疫耐受，并降低血糖水平，从而达到预防和治疗1型糖尿病的目的，改变传统药物治疗存在的诸多不足或问题。
(5)将本发明提供的疫苗皮下免疫治疗自发性1型糖尿病模型NOD(nonobesediabetic)小鼠(6-8周龄)。通过检测小鼠血糖发现，30周后经皮下免疫组的小鼠50％血糖仍保持正常水平，未有糖尿病病发；而未治疗组小鼠全部血糖升高，糖尿病病发；并且疫苗组能显著地诱导Treg细胞，提高糖耐量，可缓解1型糖尿病；本发明提供的1型糖尿病疫苗的制备方法简单，治疗操作简便易行，能克服现有疫苗免疫谱单一、治疗成本过高和不能很好的诱导Treg细胞的缺点，具有很广的应用前景。
附图说明
图1为复合表位疫苗的设计；
图2为小鼠糖尿病发病比例图；
图3为各组中调节性T细胞(Treg)比例。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
培养基配方：
上层琼脂：
用去离子水溶解后，调节pH至7.5，定容至1000ml，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20min后，分装成5ml/试管，4℃存放备用。
LB液体培养基：
细菌培养用胰化蛋白胨 10g/L
细菌培养用酵母提取物 5g/L
NaCl 10g/L
用去离子水溶解后，调节pH至7.5，定容至1000ml，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20min。
LB固体培养基:
用去离子水溶解后，调节pH至7.5，定容至1000ml，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20min。
利用间隔子GPGPG氨基酸序列将人GAD65190-320氨基酸序列GLAADWLTSTANTNMFTYEIAPVFVLLEYVTLKKMREIIGWPGGSGDGIFSPGGAISNMYAMMIARFKMFPEVKEKGMAALPRLIAFTSEHSHFSLKKGAAALGIGTDSVILIKCDERGKMIPSDLERRIL(包含四个抗原表位GAD206-220TYEIAPVFVLLEYVT，GAD217–236EYVTLKKMREIIGWPGGSGD，GAD286-300KKGAAALGIGTDSVI，GAD290- 309ALGIGTDSVILIKCDERGK)和人P277(437VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED460)间隔串联(含间隔子)，并在N-端添加辅助性Th通用表位(QYIKANSKFIGITEL)，构建成GAD65190-320+P277多表位序列(序列含540个碱基，180个氨基酸)，将GAD65190-320+P277多表位序列5’端引入EcoRI的酶切位点GAATTC，3’端引入XhoI酶切位点CTCGAG，将该序列送商业公司进行人工合成并插入pGEM-T载体，构建重组质粒GAD65190-320+P277/T。
2、将合成构建得到的质粒GAD65190-320+P277/T转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，克隆扩增，大量提取质粒GAD65190-320+P277/T；将合成构建得到的质粒GAD65190-320+P277/T转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，涂布LB固体培养基平板Ampr，37℃倒置培养过夜，挑取LB固体培养基平板Ampr中的单菌落至装有5ml LB液体培养基Ampr的试管中，于恒温摇床37℃，150rpm/min过夜培养，次日将该5ml菌液接种400ml LB液体培养基Ampr，于恒温摇床37℃，150rpm/min过夜培养，次日收获菌液，用质粒大量抽提试剂盒从克隆扩增收获的菌液中提取GAD65190-320+P277/T重组质粒。
3、大量提取的质粒GAD65190-320+P277/T双酶切：
10×H buffer 30μl；
EcoR I 10μl；
XhoI 10μl；
GAD65190-320+P277/T 250μl
总体积300μl；
37℃水浴60min，1％琼脂糖凝胶电泳、用小量胶回收试剂盒回收目的片段；
4、T7噬菌体载体的处理及准备：
将T7噬菌体载体用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，并回收酶切产物，T7噬菌体载体双酶切体系如下：
10×M Buffer 2μl；
10×H Buffer 2μl；
EcoR I 1μl；
XhoI 1μl；
T7 Select 10-3b 5μl；
H2O 11μl；
总体积20μl；
37℃水浴60min，按DNA片段纯化的操作用小量胶回收试剂盒回收酶切产物；
5、GAD65190-320+P277片段与T7噬菌体载体的连接，GAD65190-320+P277/T重组质粒EcoRI和XhoI双酶切电泳后的胶回收所得的目的片段与T7噬菌体载体双酶切后，回收所得的酶切产物进行连接，其连接反应体系为：
T7噬菌体载体双酶切回收产物0.5μl；
GAD65190-320+P277/T重组质粒双酶切电泳后的胶回收产物2μl；
Solution I 2.5μl；
总体积5μl；
室温连接过夜，得重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7。
6、GAD65190-320+P277/T7重组噬菌体的包装
利用T7 Select Packaging Kit试剂盒包装GAD65190-320+P277/T7重组噬菌体，包装体系为：
步骤5的连接产物5μl；
T7 Packaging Extracts 25μl；
总体积30μl；
室温包装2h后在反应体系中加入270μl LB液体培养基终止。
7、GAD65190-320+P277/T7包装产物的平板扩增
100μl GAD65190-320+P277/T7包装反应物与250μl于恒温摇床37℃，150rpm/min新鲜培养的BLT5403菌液(OD600＝0.6～0.8)混匀后，迅速与5ml融化后40℃温浴的上层琼脂混合均匀并铺平板，平板静置至上层琼脂凝固后，37℃过夜倒置培养至形成噬斑。
8、GAD65190-320+P277/T7重组噬菌体的PCR鉴定及扩增
(1)噬菌斑单克隆挑取
用高压灭菌的牙签从上层琼脂培养基上挑取独立的、边缘整齐的、圆形半透明单克隆噬菌斑，并在无菌EP管中用牙签捣碎，根据噬斑大小加入50～200μl 10mM EDTA(PH8.0)，4℃浸泡过夜，浸出液中含有重组噬菌体。
(2)重组噬菌体的PCR鉴定和测序鉴定
以噬菌体浸出液上清为模板，以T7-UP、T7-DOWN一对引物，对单个噬斑进行PCR鉴定。选出阳性克隆。T7-UP和T7-DOWN分别是T7 Select 10-3b多克隆位点上下游引物，用于重组噬菌体的鉴定：
T7-UP：5’-ggagctgtcgtattccagtc-3’；(SEQ ID NO.10)
T7-DOWN：5’-aacccctcaagacccgttta-3’。(SEQ ID NO.11)
PCR反应体系：
10×PCR Buffer(Mg2+Plus)1μl；
10mM dNTPs 1μl；
T7-UP(100μM)0.5μl；
T7-DOWN(100μM)0.5μl；
噬菌体浸出液1μl；
Taq 0.1μl；
H2O 5.9μl；
总体积10μl；
PCR反应过程：94℃10min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，30个循环；72℃10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，含有目的片段大小的为阳性。
将PCR鉴定选出的阳性重组噬菌体在E.coli BLT5403扩增后保存。
扩增方法：甘油冻存的E.coli BLT5403菌株用在LB固体培养基平板Ampr上划线接种，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落接种5ml LB液体培养基，37℃、150rpm振荡过夜；过夜培养E.coli BLT5403菌液按1∶100比例接种5ml LB液体培养基Ampr，37℃、150rpm振荡培养至OD600＝0.6～0.8成新鲜E.coli BLT5403菌液；将PCR鉴定选出的阳性重组噬菌斑浸出液接种至5ml新鲜E.coli BLT5403菌液37℃、150rpm培养1～3h至菌液澄清并出现细丝状残片；所得噬菌体液4℃离心10000rpm，10min，取上清-80℃或液氮中冻存作为种子。同时将PCR鉴定选出的阳性重组噬菌体用PCR鉴定的相同条件进行PCR扩增，将扩增所得产物进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，与pGEM-T载体连接后测序以鉴定GAD65190-320+P277/T7重组噬菌体插入基因的正确性。
9、GAD65190-320+P277/T7的大量制备及滴度测定
GAD65190-320+P277/T7的大量制备：
(1)将甘油冻存的E.coli BLT5403菌株在LB固体培养基平板Ampr上划线接种，37℃过夜培养；
(2)从平板上挑取单菌落接种5ml LB液体培养基，37℃、150rpm振荡过夜；
(3)过夜培养的E.coli BLT5403菌液按1∶100体积比分别接种5ml、500ml LB液体培养基ampr各一份，37℃、150rpm振荡培养至OD600＝0.6～0.8，时间为1～3h，得新鲜E.coli BLT5403菌液，存放于4℃备用；
(4)接种50μl(1011pfu/ml)GAD65190-320+P277/T7噬菌体种子至5ml新鲜E.coliBLT5403菌液，其D600＝0.6～0.8，37℃、150rpm培养1～3h至菌液澄清并出现细丝状残片；
(5)将所得5ml噬菌体液接种至500ml新鲜E.coli BLT5403菌液，其OD600＝0.6～0.8，37℃、150rpm培养3h至菌液澄清并出现细丝状残片；
(6)所得噬菌体液4℃离心10000rpm，10min，取上清，加入固体NaCl使其终浓度为1M，振摇至溶解，促进细菌碎片沉淀，4℃1h或4℃过夜；
(7)4℃，10000rpm离心10min，收集上清，向上清中加入PEG8000，振荡至完全溶解后，4℃过夜；PEG8000与上清的质量体积比1g/10mL；
(8)4℃，10000rpm离心30min，弃上清；
(9)所得沉淀物用10ml噬菌体稀释液(含1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)，剧烈抽提后，4℃、10000rpm离心15min，收集上清；
(10)余下的沉淀物重复一次(9)步骤，即用10ml噬菌体稀释液剧烈抽提后，4℃、10000rpm离心15min，收集上清，合并收集的上清之后保存。
噬菌体滴度测定：
取100μl待测噬菌体，用900μl LB液体培养基按10n倍比稀释；取100μl稀释液与250μl新鲜E.coli BLT5403菌液(OD600＝0.6～0.8)混匀后，迅速与5ml融化后40℃温浴的上层琼脂混合均匀并铺平板，平板静置至上层琼脂凝固后，37℃过夜培养至形成噬斑，计数。噬菌体滴度按pfu/ml记数，数值等于“噬斑数×稀释倍数×10”。例如：如果稀释倍数为106的平板上有50个噬斑，滴度为50×106×10＝5×108pfu/ml。
10、甲醛灭活GAD65190-320+P277/T7重组噬菌体
调整GAD65190-320+P277/T7重组噬菌体至所需滴度，将甲醛按1∶4000体积比加入噬菌体中，37℃、100rpm振荡72h，得重组噬菌体灭活液，即为1型糖尿病噬菌体疫苗。
所得1型糖尿病噬菌体疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫方案
用噬菌体展示人GAD65190-320+P277(疫苗组)，GAD65190-320(GAD65组)，P277(P277组)制成的疫苗皮下免疫6周龄、16-20g的清洁级NOD小鼠，109pfu/只/次，分别于第2周，第4周，第6周免疫三次，同时设立噬菌体空载体对照组及空白对照组，每组小鼠10只。
B、检测方法
1、分别于第三次免疫后第4、8、12、16周采集尾静脉血，分离血清，分别用GAD65、P277作为抗原包被板子，用间接ELISA法检测抗人GAD65、P277抗体。
2、免疫后观察小鼠至30周龄，每周自鼠尾静脉测量小鼠血糖；同时称量小鼠体重。
3、第三次免疫后第12周，将小鼠禁食8h后，尾静脉采血测定血清葡萄糖含量，作为基础对照(0min)，然后各组动物葡萄糖2g/kg灌胃，在此后的30、60、90和120min采血测定血清葡萄糖含量。
4、第30周时，处死小鼠，取小鼠脾脏，研磨分离出脾脏细胞，使用抗小鼠CD4-FITC(RM4-5)，抗小鼠CD25-APC(PC61.5)，抗小鼠Foxp3-PE(FJK-16s)标记脾脏细胞，随后用流式细胞计数仪检测Treg细胞。
C、实验结果
对所获得的实验数据以Graphpad prism5统计软件进行t检验，以P<0.05为差异的统计学意义。
(1)实验过程中各组小鼠均无死亡发生，活动正常，无腹泻，大便呈颗粒状、无稀便。第30周的时候，P277组、空载体组及空白对照组小鼠因1型糖尿病发病故而体重明显减轻(P<0.05)，说明P277单价疫苗对NOD小鼠的保护作用不理想，而GAD65190-320+P277和GAD65190-320疫苗对NOD小鼠有一定的保护作用。结果如表1所示。
表1.第30周时各组小鼠体重比较(n＝10)
| 分组 | 疫苗组 | GAD65组 | 277组 | 空载体组 | 空白组 |
| 体重(g) | 28.2±1.5 | 27.4±1.9 | 22.8±1.5* | 21.1±1.9* | 22.6±1.2* |
*P<0.05(与疫苗组和GAD65组相比)
(2)检测结果如表2和表3所示，结果表明，噬菌体展示的人GAD65190-320+P277/T7噬菌体(疫苗组)经皮下免疫NOD小鼠后，诱导了抗人GAD65和P277抗体的产生，并且抗体水平在第三次免疫后第12周时升至最高，分别达到1:1669±357和1:971±203，与空载体组及空白组相比，差异显著(P＜0.01)，16周开始下降。GAD65190-320/T7噬菌体(GAD65组)诱导了抗人GAD65抗体的产生，抗体水平在第三次免疫后第12周时升至最高，滴度达1:1464±391，16周开始下降，GAD65组抗体水平略低于GAD65190-320+P277组(疫苗组)，但无显著性差异；P277/T7噬菌体(277组)诱导了抗人277抗体的产生，抗体水平在第三次免疫后第12周时升至最高，滴度达1124±348，16周开始下降，P277组抗体水平略高于GAD65190-320+P277(疫苗组)，但无显著性差异。ELSIA实验说明GAD65190-320+P277/T7复合表位噬菌体疫苗能够很好的诱导出GAD65和277抗体，与单表位疫苗无差异。
表2抗人GAD65抗体水平
| 免疫前 | 4周 | 8周 | 12周 | 16周 | |
| 疫苗组 | 1:1.6±1 | 1:476±65 | 1:812±101 | 1:1669±357 | 1:1222±279 |
| GAD65组 | 1:2.2±1 | 1:513±44 | 1:824±283 | 1:1464±391 | 1:1139±483 |
| 277组 | 1:1.4±1 | 1:2.8±1.6 | 1:1.3±1 | 1:2.2±1.2 | 1:2.6±1.5 |
| 空载体组 | 1:2.1±2 | 1:3.1±1.3 | 1:3.7±2.1 | 1:4.1±2.8 | 1:2.6±1.7 |
| 空白组 | 1:1.8±1 | 1:2.2±1.5 | 1:5.2±1.8 | 1:2.9±1 | 1:3.2±2.5 |
表3抗人P277抗体水平
| 免疫前 | 4周 | 8周 | 12周 | 16周 | |
| 疫苗组 | 1:1.7±1 | 1:213±33 | 1:544±96 | 1:971±203 | 1:652±149 |
| GAD65组 | 1:2.8±2.1 | 1:2.1±1.4 | 1:2.3±1.6 | 1:1.6±1.6 | 1:2.5±1.7 |
| 277组 | 1:1.3±1 | 1:327±55 | 1:765±154 | 1:1124±348 | 1:721±258 |
| 空载体组 | 1:1.9±1.5 | 1:4.2±2.9 | 1:2.4±1.4 | 1:6.4±4.3 | 1:2.2±1.5 |
| 空白组 | 1:2.5±1 | 1:2.2±1.8 | 1:1.6±1.7 | 1:2.1±2 | 1:3.5±2.2 |
(3)各组疫苗经过皮下免疫治疗NOD小鼠，并对其进行血糖监控发现，疫苗组治疗小鼠糖尿病防治比例达50％，GAD65组有70％的小鼠发病，277组有80％的小鼠发病，而空白对照组及空载体对照组小鼠则全部发病。同时我们从发病时间也能看出，疫苗组的小鼠在第16周开始发病，而其他组小鼠均在10周或11周就开始发病，说明该1型糖尿病疫苗能延缓或阻止1型糖尿病的发病，同时也证明GAD65190-320+P277/T7复合表位噬菌体疫苗的效果优于单表位噬菌体疫苗。结果如图2所示。
(4)疫苗组小鼠经治疗后，从表4中可以看出，免疫组、GAD65组对葡萄糖灌胃具有较好的耐受性，与277组、空载体组和空白组相比有显著性差异(P＜0.05)。
表4.GAD65190-320+P277/T7噬菌体疫苗免疫对NOD小鼠葡萄糖耐量的影响
*疫苗组、GAD65组与277组、空白组、空载体组相比有显著性差异(P＜0.05)
(5)小鼠经免疫后，疫苗组、GAD65组小鼠脾脏CD4+CD25+Fxop3+Treg(调节性T细胞)细胞与其他组相比均发生增殖(P<0.05)，但复合表位疫苗GAD65190-320+P277/T7(疫苗组)的效果是单表位疫苗GAD65190-320/T7(GAD65组)的2倍。结果说明与单表位噬菌体疫苗相比GAD65190-320+P277/T7复合表位噬菌体疫苗能够显著地诱导NOD小鼠产生免疫耐受，有效地生成Treg细胞，而诱导出Treg细胞是利用自身抗原诱导机体重建对其的免疫耐受的关键因素之一。结果如图3所示。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 一种1型糖尿病疫苗及其制备方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Gly Pro Gly Pro Gly
1 5
<210> 2
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Gly Leu Ala Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe
1 5 10 15
Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu
20 25 30
Lys Lys Met Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp Gly
35 40 45
Ile Phe Ser Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile
50 55 60
Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro Glu Val Lys Glu Lys Gly Met Ala Ala
65 70 75 80
Leu Pro Arg Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His Phe Ser Leu
85 90 95
Lys Lys Gly Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu
100 105 110
Ile Lys Cys Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg
115 120 125
Arg Ile Leu
130
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Ala Leu Asp
1 5 10 15
Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp
20
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
<210> 5
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ggattagcag cagactggct gacatcaaca gcaaatacta acatgttcac ctatgaaatt 60
gctccagtat ttgtgctttt ggaatatgtc acactaaaga aaatgagaga aatcattggc 120
tggccagggg gctctggcga tgggatattt tctcccggtg gcgccatatc taacatgtat 180
gccatgatga tcgcacgctt taagatgttc ccagaagtca aggagaaagg aatggctgct 240
cttcccaggc tcattgcctt cacgtctgaa catagtcatt tttctctcaa gaagggagct 300
gcagccttag ggattggaac agacagcgtg attctgatta aatgtgatga gagagggaaa 360
atgattccat ctgatcttga aagaaggatt ctt 393
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gttctgggtg gtggtgttgc tctgctgcgc gttatcccgg ctctggactc cctgacccca 60
gctaacgaag at 72
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
caatacataa aagccaactc gaagttcata ggaataacgg aactc 45
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
ggtccgggtc ctggc 15
<210> 9
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
caatacataa aagccaactc gaagttcata ggaataacgg aactcggtcc gggtcctggc 60
ggattagcag cagactggct gacatcaaca gcaaatacta acatgttcac ctatgaaatt 120
gctccagtat ttgtgctttt ggaatatgtc acactaaaga aaatgagaga aatcattggc 180
tggccagggg gctctggcga tgggatattt tctcccggtg gcgccatatc taacatgtat 240
gccatgatga tcgcacgctt taagatgttc ccagaagtca aggagaaagg aatggctgct 300
cttcccaggc tcattgcctt cacgtctgaa catagtcatt tttctctcaa gaagggagct 360
gcagccttag ggattggaac agacagcgtg attctgatta aatgtgatga gagagggaaa 420
atgattccat ctgatcttga aagaaggatt cttggtccgg gtccgggtgt tctgggtggt 480
ggtgttgctc tgctgcgcgt tatcccggct ctggactccc tgaccccagc taacgaagat 540
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ggagctgtcg tattccagtc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
ggagctgtcg tattccagtc 20
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ggtccgggtc ctggt 15
Claims (8)
1.一种1型糖尿病疫苗，其特征在于，活性成分包括重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7；
所述的重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7的构建方法包括如下步骤：
（1）间隔子氨基酸序列将人GAD65190-320氨基酸序列和人P277氨基酸序列间隔串联，并在N-端添加辅助性Th通用表位，构建成GAD65190-320+P277多表位序列；
（2）将GAD65190-320+P277多表位序列5’端引入EcoRI的酶切位点，3’端引入XhoI酶切位点，合成插入pGEM-T载体，构建重组质粒GAD65190-320+P277/T；
（3）将合成构建得到的质粒GAD65190-320+P277/T转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，克隆扩增，提取重组质粒GAD65190-320+P277/T；
（4）从重组质粒GAD65190-320+P277/T上用EcoRI和XhoI双酶切下目的片段，插入T7噬菌体载体多克隆位点的EcoRI和XhoI之间，使其位于T7 10B 基因的3’端，使人GAD65190-320+P277表位与T7 10B表达成融合蛋白，构建成为重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7；
其中，间隔子氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，辅助性Th通用表位氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
2.根据权利要求1所述的1型糖尿病疫苗，其特征在于，步骤（3）中克隆扩增方法是：将合成构建得到的质粒GAD65190-320+P277/T转化大肠杆菌TOP10F’感受态细胞，涂布LB固体培养基平板Ampr，37℃倒置培养过夜，挑取LB固体培养基平板Ampr中的单菌落至装有5ml LB液体培养基Ampr的试管中，于恒温摇床37℃，150rpm/min 过夜培养，次日将该5ml菌液接种400ml LB液体培养基Ampr，于恒温摇床37℃，150rpm/min 过夜培养，次日收获菌液，用质粒大量抽提试剂盒从克隆扩增收获的菌液中提取重组质粒GAD65190-320+P277/T。
3.根据权利要求1所述的1型糖尿病疫苗，其特征在于，步骤（4）的具体方法为：
A、重组质粒GAD65190-320+P277/T 用限制性内切酶 EcoRI和XhoI进行双酶切，双酶切体系如下：
10×H buffer 30μl；
EcoR I 10μl；
XhoI 10μl；
重组质粒GAD65190-320+P277/T 250 μl；
总体积300μl
37℃水浴 60min，1％琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒回收目的片段；
B、将T7噬菌体载体用限制性内切酶EcoRI 和XhoI进行双酶切，并回收酶切产物，T7 噬菌体载体双酶切体系如下 ：
10×H Buffer 2μl；
EcoR I 1μl；
XhoI 1μl；
T7 Select 10-3b 5μl；
H2O 11μl；
总体积 20μl；
37℃水浴60min，按DNA片段纯化的操作用小量胶回收试剂盒回收酶切产物；
C、GAD65190-320+P277片段与 T7 噬菌体载体的连接，GAD65190-320+P277/T 重组质粒EcoRI和XhoI双酶切电泳后的胶回收所得的目的片段与T7噬菌体载体双酶切后，回收所得的酶切产物进行连接，其连接反应体系为 ：
T7 噬菌体载体双酶切回收产物 0.5μl；
GAD65190-320+P277/T重组质粒双酶切电泳后的胶回收产物 2μl；
Solution I 2.5μl；
总体积 5μl；
室温连接过夜，得重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7。
4.权利要求1~3中任意一项所述的构建方法构建得到的重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7。
5.权利要求4所述的重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7在制备1型糖尿病疫苗中的应用。
6.一种1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，采用权利要求1~3中任意一项所述的构建方法构建得到的重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7进行制备。
7.根据权利要求6所述的1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将重组噬菌体GAD65190-320+P277/T7在大肠杆菌株 BLT5403 中扩增后，按收获噬菌体，测定噬菌体的滴度，滴度按pfu/ml计数，调整噬菌体浓度为所需滴度，将甲醛按1∶4000体积比加入噬菌体中，用常规方法灭活，得1型糖尿病疫苗。
8.根据权利要求7所述的1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，具体制备方法是：
（1）将甘油冻存的 E.coli BLT5403 菌株在 LB 固体培养基平板 ampr上划线接种，37℃过夜培养；
（2）从平板上挑取单菌落接种 5ml LB培养基，37℃、150rpm振荡过夜；
（3）过夜培养的E.coli BLT5403 菌液按1∶100比例分别接种5ml、500ml LB 液体培养基ampr各一份，37℃、150rpm 振荡培养至OD600＝0.6～0.8，时间为1～3h，得新鲜E.coliBLT5403 菌液，存放于4℃备用；
（4）接种50μl 1011pfu/ml GAD65190-320+P277/T7 噬菌体种子至5ml OD600＝0.6～0.8的新鲜E.coli BLT5403菌液中，37℃、150rpm 培养1～3h至菌液澄清并出现细丝状残片；
（5）将步骤（4）所得噬菌体液接种至步骤（3）得到的500ml OD600＝0.6～0.8的新鲜E.coli BLT5403菌液中，37℃、150rpm 培养3h至菌液澄清并出现细丝状残片；
（6）所得噬菌体液4℃离心 10000rpm，10min，取上清，加入固体NaCl使其终浓度为1M，振摇至溶解，4℃ 1h 或4℃过夜；
（7）4℃，10000rpm 离心 10min，收集上清，向上清中加入PEG8000，振荡至完全溶解后，4℃过夜；PEG8000与上清的质量体积比1g/10mL；
（8）4℃，10000rpm 离心30min，弃上清；
（9）所得沉淀物用 10ml 噬菌体稀释液剧烈抽提后，4℃、10000rpm 离心15min，收集上清；
所述的噬菌体稀释液含有1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA；
（10）余下的沉淀物重复一次步骤（9），合并收集的上清之后保存；
（11）测定噬菌体的滴度，滴度按pfu/ml计数，调整噬菌体浓度为所需滴度，将甲醛按1∶4000体积比加入噬菌体中，用常规方法灭活，得1型糖尿病疫苗。
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