CN102180974B - 一种结核杆菌融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种结核杆菌融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结核杆菌融合蛋白，是序列表中序列2的蛋白质，并提供了其制备方法和制备疫苗的应用。本发明所提供的构建并表达纯化去标签融合蛋白ESAT6-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(EAMM)，目的是建立针对结核杆菌的免疫应答，以提高疫苗保护效果。本发明所构造的融合蛋白EAMM和佐剂混合作为结核亚单位疫苗，诱导Th1型细胞免疫为主的免疫反应和体液免疫反应，具有较强的免疫原性并且有很好的抗结核保护效果。

Description

一种结核杆菌融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种结核杆菌融合蛋白和其制备方法，以及其在制备结核亚单位疫苗中的应用。
背景技术
结核杆菌是引起人类和动物结核病的病原菌，结核杆菌由于其独特的生物特性，如细胞壁厚、生长周期长、多为潜伏感染和易于耐药等特点使结核病药物治疗面临很大的困难。虽然在上世纪上半叶，已成功的研制出预防结核病的卡介苗(BCG)，以及治疗结核病的特效药物(如异烟肼，利福平等)，但到了上世纪末，结核病仍然是全球感染和传染病的第一“杀手”。而且随着艾滋病(HIV)在全球的肆虐，以及结核多重抗药菌株(multi-drug resistantstrains)的出现等诸多原因，使得治疗结核病的形势更加严峻。
目前研制成功的唯一的能够预防结核病的疫苗——卡介苗，虽然已在全球范围内广泛使用，但在近期研究中发现，其许多临床试验结果并不是十分有效，免疫预防效果不稳定，在全球范围的免疫保护力检测，由0-80％不等，并且对成人几乎无效，对已感染患者更是没有治疗作用，卡介苗并不是预防肺结核的理想疫苗，研究和开发新的结核疫苗势在必行！
现阶段研究结核病疫苗主要有以下几种：(1)重组BCG；(2)营养缺陷型结核杆菌减毒活疫苗；(3)结核亚单位疫苗。亚单位疫苗又有三种形式：蛋白质疫苗、DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗，其中蛋白质疫苗相对最为安全，易于被人们接受。
抗原选择和构建高免疫原性的结核疫苗是结核亚单位疫苗要解决的首要问题之一。过去二十多年的研究结果表明结核杆菌的保护性抗原主要存在于分泌蛋白和细胞壁中。人们相继从培养滤液中分离出了有免疫原性的蛋白质，如早期分泌抗原靶蛋白ESAT-6、主要分泌抗原Ag85B、以及Mtb8.4、Mtb32、TB10.4、MPT64和38kD蛋白(PstS-1)等。除了分泌性蛋白，一些胞壁蛋白也被证实是T细胞保护性抗原，如热休克蛋白HSP65、HSP70和Mtb39等。其中，分泌性抗原Ag85B和ESAT6被认为具有最好的免疫保护力。以往为了后期简便的纯化方法，往往构建成的融合蛋白带有各种标签(如His·Tag，GST·Tag，S·Tag等)，却未考虑所带有的标签是否会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的认可。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种结核杆菌融合蛋白，是序列表中序列2的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种上述的结核杆菌融合蛋白的编码基因。
所述融合蛋白的编码基因，是如下1)或2)的基因：
a)其核苷酸序列是序列表中的序列1；
b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。
含有上述融合蛋白的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为PET30a质粒。
含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
本发明的第三个目的是提供一种上述结核杆菌融合蛋白的制备方法，包括有以下步骤：
1)获得上述的结核杆菌融合蛋白的编码基因；
2)将步骤1)得到的结核杆菌融合蛋白的编码基因导入重组表达载体；
3)将步骤2)载体导入宿主细胞；
4)培养步骤3)得到的宿主细胞；
5)将步骤4)得到的宿主细胞进行处理得到上述结核杆菌融合蛋白并纯化和表达。
所述编码基因为序列1所示的核苷酸序列；所述重组表达载体为PET30a质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
本发明的第四个目的是提供一种上述结核杆菌融合蛋白在制备结核亚单位疫苗中的应用。
所述结核亚单位疫苗是将上述结核杆菌融合蛋白的PBS稀释液与DDA水溶液和TDM水溶液混合加热后制得的。
所述的结核杆菌融合蛋白为用PBS稀释至0.2ug/ul；所述DDA用注射用水配制成2.5mg/ml；所述TDM用注射用水配制成2.5mg/ml；所述加热为80℃水浴加热10分钟；所述结核亚单位疫苗中各组分的体积比为结核杆菌融合蛋白的PBS稀释液：DDA水溶液：TDM水溶液为2∶1∶1。
本发明所选用的结核杆菌抗原ESAT-6、Ag85B、Mpt64190-198、Mtb.8.4均有较强的免疫保护性，且分别主要表达于生长期。四个抗原主要特性如下：
(1)ESAT6是结核杆菌早期分泌性低分子量蛋白，具有良好的抗原刺激性，能诱导机体产生强烈T细胞免疫应答和释放高水平IFN-γ。
(2)Ag85b属于结核杆菌抗原85复合体家族成员.该家族是结核杆菌短期培养物的滤过蛋白质(short-term culture filtrates，ST-CF)中的主要分泌性蛋白质。实验证明Ag85B基因是重要的结核杆菌免疫保护性抗原.将其免疫小鼠，都获得了明显的特异性体液和细胞免疫反应.在用气雾攻击结核杆菌H37Rv毒株后，均获得了接近BCG的免疫保护力。
(3)Mpt64是结核杆菌的分泌性蛋白质，也是结核杆菌ST-CF中的主要成分，可以占到结核杆菌培养基上清滤过液中蛋白质总量的8％.相对分子质量24KDa，既能刺激细胞免疫反应，又能诱导体液免疫反应.在Mpt64蛋白的免疫原性表位中，我们选取了其(190～198)这段多肽为H--2D(b)限制性的CD8+T细胞表位。推测加入激活特异性的CD8+T细胞抗原成分可能提高疫苗的整体保护率。
(4)Mtb8.4抗原可以激活CD4+T细胞和CDS+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的免疫反应，在感染小鼠模型中可以诱导部分保护效果。
本发明所提供的构建并表达纯化去标签融合蛋白ESAT6-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(EAMM)，目的是建立针对结核杆菌的免疫应答，以提高疫苗保护效果。本发明所构造的融合蛋白EAMM和佐剂混合作为结核亚单位疫苗，诱导Th1型细胞免疫为主的免疫反应和体液免疫反应，具有较强的免疫原性并且有很好的抗结核保护效果。
附图说明
图1为pET-30a质粒图谱。
图2为在大肠杆菌BL21中表达纯化蛋白EAMM。
其中，1.EAMM上清，2.EAMM沉淀，3.纯化前的EAMM，4.未结合到DEAE柱上的EAMM蛋白，5.纯化得到的EAMM蛋白，6.BL21空菌沉淀，7.Marker。
图3ELISA检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞特异性抗原分泌IFN-γ浓度。
图4ELISA检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞特异性抗原分泌IL-17浓度。
图5ELISA检测免疫小鼠血清Ag85B特异性IgG1抗体水平。
图6ELISA检测免疫小鼠血清Ag85B特异性IgG2b抗体水平。
图7ELISA检测免疫小鼠血清Ag85B特异性IgG2c抗体水平。
图8ELISA检测免疫小鼠血清ESAT-6特异性IgG1抗体水平。
图9ELISA检测免疫小鼠血清ESAT-6特异性IgG2b抗体水平。
图10ELISA检测免疫小鼠血清ESAT-6特异性IgG2c抗体水平。
图11ELISPOT检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞特异性抗原分泌IL-17水平。
图12ELISPOT检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞特异性抗原分泌IFN-γ水平。
图13ELISA检测免疫小鼠血清Ag85B特异性IgG1抗体水平。
图14ELISA检测免疫小鼠血清Ag85B特异性IgG2b抗体水平。
图15ELISA检测免疫小鼠血清Ag85B特异性IgG2c抗体水平。
图16免疫小鼠攻毒后肺脏组织结核菌载量。
图17免疫小鼠攻毒后脾脏组织结核菌载量。
具体实施方式
构建一种新型去标签融合蛋白ESAT6-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(EAMM)，并将其与佐剂混合构建新型结核亚单位疫苗。
材料：
1、引物：
5’-端特异性引物ESAT-6F(5’-CGGCATATGACAGAGCAGCAGTGGAAT-3’)；
3’-端引物ESAT-6R(5’-TTGGAATTCTGCGAACATCCCAGTGAC-3’)。
2、ESAT--6基因、Ag85B、Mpt64的190-198位的氨基酸序列和Mtb8.4基因均查自GenBank。
3、Nde I和EcoR I酶、EcoR I和HindIII酶购自上海生物生工工程有限公司。
4、菌株DH5 pET28a-AMM的来源由兰州大学祝秉东副教授克隆构建成功并提供。
5、质粒提取试剂盒购自上海生物生工工程有限公司，胶回收试剂盒购自大连宝生物有限公司。
6、E.coli BL21菌体由复旦大学王洪海教授惠赠。
实施例1
一、融合蛋白EAMM的构建与表达纯化
融合蛋白ESAT6-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4就是将ESAT-6、Ag85B、Mpt64的190-198位的氨基酸序列以及Mtb8.4基因连接克隆构建大肠杆菌表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，纯化目的蛋白。
1.融合蛋白ESAT6-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(EAMM)的构建：
1)PCR扩增ESAT-6基因：由于ESAT-6基因后面要融合表达Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4，所以设计引物时把ESAT-6终止信号去掉，应用5’-端特异性引物ESAT-6F和3’-端引物ESAT-6R扩增ESAT-6片断。PCR反应条件如下：96℃预变性1分钟；98℃变性10秒，60℃复性15秒，72℃延伸30秒，30个循环。PCR产物经纯化后，用Nde I和EcoR I双酶切，克隆构建在质粒PET30a(+)中。
2)纯化得到Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4片段
培养实验室已有的菌株DH5 pET28a-AMM，用质粒提取试剂盒提取质粒pET28a-AMM，用EcoR I和HindIII双酶切pET28a-AMM后，用胶回收试剂盒进行胶回收得到纯化的AMM基因片段。
3)构建EAMM表达质粒：PCR产物经纯化后，ESAT-6片断被Nde I和EcoR I双酶切，构建入pET30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a ESAT-6。AMM融合基因片断克隆构建入质粒Pet30a ESAT-6中，构建质粒Pet30a ESAT6-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4，酶切及测序鉴定。
2.EAMM蛋白表达纯化
活化表达EAMM蛋白的E.coli BL21菌体，移入1升培养基中振荡培养2-3h至A600值为0.6～0.8；加入IPTG(0.5mM)37℃诱导振荡培养4h；4℃离心(以下没有特殊说明，均为4℃)12000rpm×10分钟收集细菌；细菌重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎细菌90分钟(200-300W，超声1sec停1sec)；12000rpm×10min离心收集EAMM包涵体，用8M尿素溶解。预先处理透析袋，配制复性液6M尿素，4M尿素，2M尿素，1M尿素，0M尿素，各5000ml，4℃下进行梯度透析复性。用0.45um滤器过滤复性后的蛋白，并测定蛋白浓度(mg/ml)，根据所选层析柱的载量，计算确定蛋白的上样量。用离子交换层析方法，选用弱阴离子交换柱DEAE(购自于GE Healthcare公司，型号为：HiTrap DEAE FF 1ml)进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得到的纯化物。将最终得到的蛋白纯化物，在PBS中进行透析后即可用。
二、EAMM免疫活性特征检测
1、实验材料：EAMM蛋白；AMM蛋白；Ag85B蛋白；ESAT-6蛋白；Mtb8.4蛋白；PPD蛋白均为兰州结核病研究中心制备。DDA和TDM购自于购自美国Sigma-Aldrich公司。
2、实验动物：雌性C57BL/6小鼠
3、实验动物分组：C57BL/6小鼠随机分为6组，每组10只
A.PBS
B.BCG
C.EAMM+DDA+TDM
D.AMM+DDA+TDM
E.Ag85B+DDA+TDM
F.ESAT-6+DDA+TDM
①制备疫苗：
将融合蛋白ESAT6-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(EAMM)用PBS稀释至10ug/50ul；将融合蛋白AMM用PBS稀释至10ug/50ul；将Ag85B蛋白用PBS稀释至10ug/50ul；ESAT-6蛋白用PBS稀释至10ug/50ul；DDA用注射用水配制成2.5mg/ml，80℃、10min水浴加热。TDM用注射用水配制成2.5mg/ml，80℃、10min水浴加热。取DDA和TDM溶液各50μl分别与等量100ul的EAMM蛋白、AMM蛋白、Ag85b蛋白或ESAT-6充分混匀，最后疫苗呈均一的乳油状。
②免疫动物：
分别在第1、3、6周用制备好的蛋白疫苗腹股沟皮下免疫动物(200μl/只)。
③免疫指标测定：
小鼠最后一次蛋白疫苗免疫6周后分别检测体液免疫和细胞免疫。
(1)体液免疫检测：取血清用ELISA法检测血清抗体表达水平。用ESAT-6(5μg/ml)，Ag85B蛋白(5μg/ml)，包被96孔板(100μl/well)4℃过夜。用PBST溶液300μl/well(兰州结核病研究中心配制)洗板，5次×5min/次。从1∶100开始至1∶12800，加入用PBS对倍稀释的血清样品，37℃放置1h。洗板后，加入200μl/well的1∶15000稀释的兔抗鼠IgG1，1∶10000稀释的IgG2b和1∶5000稀释的IgG2c.37℃放置1h。洗板后，加入100μl/well TMB显色液(兰州结核病研究中心配制)，室温避光反应15分钟显色后，加入50μl/well终止液(2M的H2SO4)终止反应；在450nm检测OD值。
(2)细胞免疫检测：细胞因子IFN-γ及IL-17的水平与结核病的保护性免疫反应相关。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞分别针对特异性抗原分泌IFN-γ和IL-17的水平。小鼠最后一次免疫6周后无菌分离脾脏，应用ELISA技术检测脾细胞受到ESAT-6蛋白(5μg/ml)，Ag85B蛋白，Mtb8.4蛋白(5μg/ml)，PPD蛋白(5μg/ml)刺激后IFN-γ及IL-17的分泌水平。
三、EAMM加强BCG免疫及保护效果检测
1.实验材料：卡介苗BCG；EAMM蛋白；AMM蛋白；Ag85B蛋白；ESAT-6蛋白；PPD蛋白；DDA、TDM。
2.实验动物：雌性C57BL/6小鼠
3.实验动物分组：C57BL/6小鼠随机分为4组，每组10只
A.PBS
B.BCG
C.BCG初免，EAMM亚单位疫苗加强免疫
D.BCG初免，AMM亚单位疫苗加强免疫
4.制备疫苗：
将融合蛋白ESAT6-Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(EAMM)用PBS稀释至10ug/50ul；将融合蛋白AMM用PBS稀释至10ug/50ul。取DDA和TDM溶液各50μl与等量100ul的EAMM蛋白、AMM蛋白充分混匀，最后疫苗呈均一的乳油状。
5.免疫动物：
第1周卡介苗(BCG)5*106CFU腹股沟皮下免疫动物一次，BCG初次免疫后分别在第12、14周用制备好的蛋白疫苗腹股沟皮下免疫动物(200μl/只)。
6.免疫指标检测：
小鼠最后一次蛋白疫苗免疫6周后分别检测体液免疫和细胞免疫。
(1)体液免疫检测：取血清用ELISA法检测血清抗体表达水平。用Ag85B蛋白(5μg/ml)，包被96孔板(100μl/well)4℃过夜。用PBST溶液300μl/well洗板5次×5min/次。从1∶100开始至1∶102400，加入对倍稀释的血清样品，37℃放置1h。洗板后，加入200μl/well的1∶15000稀释的兔抗鼠IgG1，1∶10000稀释的IgG2b和1∶5000稀释的IgG2c，37℃放置1h。洗板后，加入100μl/well TMB显色液，室温避光反应15分钟显色后，加入50μl/well终止液(2M的H2SO4)终止反应；在450nm检测OD值。
(2)细胞免疫检测：应用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)方法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞分别针对特异性抗原分泌IFN-γ和IL-17的细胞数。ELISPOT板预先用IFN-γ抗体和IL-17抗体包被过夜，无菌摘除小鼠脾脏，研磨后经200目尼龙网过滤，经淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。将分离的淋巴细胞加入到ELISPOT板(购自荷兰U-CyTech公司)中(5×106/孔，分别给予ESAT-6(8μg/ml)，Ag85B蛋白(5μg/ml)，PPD蛋白(10μg/ml)刺激。37℃、5％CO2条件下共同孵育45小时后，按ELISPOT操作说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色，分别进行斑点计数。
7.标准毒株攻击与指标观察实验：
结核杆菌毒力标准株H37Rv由武汉大学免疫学教研室提供。毒株攻击与指标观察实验均在武汉大学动物实验中心生物安全实验室(P3)进行。疫苗完成免疫10周后各组动物用H37Rv菌液5×105CFU尾静脉染毒。染毒后6周小鼠，解剖观察脾，肺大体变化。脾，肺一半作病理切片，并显微镜观察病理变化。组织切片做抗酸染色，观察组织中存在的结核杆菌。脾、肺称重，并作细菌定量培养计数。
实验结果：
1.将结核杆菌四种具有明显免疫保护力的抗原基因连接在一起，形成新的重组基因。选用成熟的ESAT-6蛋白的基因，Ag85B蛋白的基因与Mpt64抗原具CD8+T细胞表位的一段肽段，以及Mtb8.4蛋白的基因连接在一起，在大肠杆菌载体内进行克隆表达，纯化目的蛋白，成功纯化到了目的蛋白，纯度达到95％以上。
2.EAMM和Ag85B，ESAT-6免疫活性比较
特异性Ag85B，ESAT-6抗体水平的检测结果表明，融合蛋白EAMM所诱导的抗体水平高于单个Ag85B抗原，ESAT-6抗原免疫所诱导的水平。结果表明针对单个抗原Ag85B，ESAT-6刺激，EAMM和Ag85B，ESAT-6所诱导的细胞免疫水平(IFN-γ和IL-17分泌量)无明显差异，但EAMM融合了多个抗原表位，它在受到其它抗原(PPD，Mtb8.4)刺激时还可以分泌IFN-γ和IL-17细胞因子。因此，总的来讲，融合蛋白EAMM能诱导较Ag85B和ESAT-6更强的体液和细胞免疫反应，是一理想的候选亚单位疫苗。
3.检测结果表明：使用特异性抗原Ag85B，ESAT-6或PPD刺激后，EAMM疫苗组脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-17的水平比仅BCG免疫组的水平高。此结果表明了BCG初免，EAMM亚单位疫苗加强免疫可以诱导小鼠产生较强的Th1型细胞免疫反应。观察分别用Ag85B，ESAT-6抗原刺激后的IgG1，IgG2b，和IgG2c抗体水平，EAMM疫苗加强免疫组的均高于BCG免疫组。
4.攻毒后免疫小鼠组织的结核菌载量分析用来评价EAMM亚单位疫苗加强的保护效果。结果显示BCG初免，EAMM疫苗加强后的结核菌载量明显少于PBS组和仅BCG免疫组，表明清除结核分枝杆菌的能力较强，即对抗结核病的能力较强。从组织切片HE染色后显微镜观察结果得出，EAMM疫苗加强BCG后小鼠肺组织的病理损伤明显减轻，组织中结核菌几乎不见。
Figure ISA00000456241900021
Figure ISA00000456241900031
Figure ISA00000456241900051
Figure ISA00000456241900071

Claims (10)

1.一种结核杆菌融合蛋白，是序列表中序列2的蛋白质。
2.权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因，是如下的基因：其核苷酸序列是序列表中的序列1。
4.含有权利要求2或3所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为PET30a质粒。
5.含有权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
6.一种如权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括有以下步骤：
1）获得如权利要求2所述的结核杆菌融合蛋白的编码基因；
2）将步骤1）得到的结核杆菌融合蛋白的编码基因导入重组表达载体；
3）将步骤2）载体导入宿主细胞；
4）培养步骤3）得到的宿主细胞；
5）将步骤4）得到的宿主细胞进行处理得到如权利要求2所述的结核杆菌融合蛋白并纯化和表达。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述编码基因为序列1所示的核苷酸序列；所述重组表达载体为PET30a质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
8.一种如权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白在制备结核亚单位疫苗中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述结核亚单位疫苗是将如权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白的PBS稀释液与DDA水溶液和TDM水溶液混合加热后制得的。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：如权利要求1所述的结核杆菌融合蛋白为用PBS稀释至0.2ug/ul；所述DDA用注射用水配制成2.5 mg/ml；所述TDM用注射用水配制成2.5 mg/ml；所述加热为80℃水浴加热10分钟；所述结核亚单位疫苗中各组分的体积比为结核杆菌融合蛋白的PBS稀释液：DDA水溶液：TDM水溶液为2：1：1。
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