MX2011009439A - Vacunas con especificidad de objetivo hacia celula presentadora de antigeno. - Google Patents

Vacunas con especificidad de objetivo hacia celula presentadora de antigeno.

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MX2011009439A
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Gerard Zurawski
Monica Montes
Yves Levy
Anne-Laure Flamar
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Baylor Res Inst
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Abstract

La presente invención incluye métodos y composiciones para la expresión, secreción y uso de novedosas composiciones para ser utilizadas a manera de, por ejemplo, vacunas y vectores de administración de antígeno para administrar antígenos a las células presentadoras del antígeno. En una modalidad, el vector es un anticuerpo anti-CD40 o alguno de sus fragmentos, y uno o más péptidos antigénicos unidos al anticuerpo anti-CD40 o sus fragmentos, incluyendo anticuerpos humanizados.

Description

VACUNAS CON ESPECIFICIDAD DE OBJETIVO HACIA CELULA PRESENTADORA DE ANTIGENO Campo técnico de la Invención La presente invención se relaciona en términos generales, al campo de la inmunización, y más particularmente, a novedosas vacunas basadas en anti-CD40.
Antecedentes de la Invención Sin limitar el alcance de la invención, sus antecedentes se describen en relación con la presentación de antigeno. Un ejemplo de vacunas y métodos para la presentación de antigeno se muestra en la Patente de EE.UU. No. 7,118,751, otorgada a Ledbetter, et al., para vacunas de ADN que codifican para un antigeno amino terminal unido a un dominio de terminal carboxi que liga a CD40. Brevemente, las vacunas . se muestran apuntando con especificidad de objetivo a uno o más antigenos de un receptor de superficie celular para mejorar la respuesta inmunitaria humoral y celular especifica para el antigeno. El (los) antigeno (s) unido (s) a un dominio que se une con un receptor de superficie celular es interiorizado, transportando el antigeno (s) en un compartimento intracelular donde el antigeno (s) es digerido a péptidos y cargado en moléculas de CPH (MHC, por sus siglas en inglés) (Complejo Principal de Histocompatibilidad) . Los linfocitos T específicos para los antigenos peptídicos son activados, dando como resultado a una respuesta inmunitaria potenciada. La vacuna puede comprender el antigeno (s) unido a un dominio que liga al menos un receptor o un plásmido de ÁDN codificación del antígeno (s) unido a un dominio que liga al menos un receptor. Una modalidad preferida de la invención apunta con especificidad de objetivo VIH - 1 del antígeno al receptor CD40, dando como resultado la administración del antígeno a células positivas CD40, y activación selectiva del receptor CD40 en células que presentan VIH-I env antígenos a linfocitos T.
Otro ejemplo se encuentra en la Solicitud de Patente estadounidense núm. 20080254026, presentado por Li, et al., para anticuerpos monoclónicos de antagonista anti-CD40 y métodos para su uso. Brevemente, las composiciones y métodos se describen para usarlos en la terapia para tratar enfermedades regulado por el estímulo de CD40 que hace señas en la CD40-expresión de células se proporcionan. Los métodos comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CD40 antagonista o fragmento de unión al antígeno de lo mismo a un paciente que lo necesita. El anticuerpo anti-CD40 antagonista o el fragmento de unión al antígeno de lo mismo están libre de la actividad de agonista significativa, pero muestran la actividad antagonista cuando el anticuerpo liga un antígeno CD40 en una CD40-expresión de humano de la célula. La actividad antagonista del anticuerpo anti-CD40 o fragmento de unión al antígeno de lo mismo beneficiosamente inhibe la proliferación y/o la diferenciación de la CD40-expresión de humano de células, como linfocitos B.
Aún otro ejemplo se muestra en la Solicitud de Patente estadounidense núm. 20080241139, presentado por Delucia para una combinación de adyuvante que comprende un agonista TLR microbiano, un CD40 o agonista 4-IBB, y opcionalmente un antigeno y el uso de lo mismo para inducir una potenciación sinérgica en la inmunidad celular. Brevemente, se menciona que esta solicitud muestra combinaciones de adyuvante que comprenden al menos un agonista TLR microbiano tal en conjunto virus, bacteria o levadura o porción de lo mismo tal membrana, esferoblasto, citoplasto, o fantasma, un CD40 o agonista 4-IBB y opcionalmente un antigeno donde 3 porciones pueden ser separadas o comprender el mismo microorganismo recombinante o virus se describen. El uso de estos adyuvantes inmunitarios para el tratamiento de diversas enfermedades crónicas, como cánceres e infección de VIH se proporciona también .
La Solicitud de Patente estadounidense núm. 20080199471, presentado por Bernett, et al., concierne a anticuerpos CD40 optimizados y métodos de usar el mismo. Brevemente, se menciona que esta solicitud muestra anticuerpos que apuntan con especificidad de objetivo CD40, donde los anticuerpos comprenden al menos una modificación con relación a un anticuerpo parental, donde la modificación altera la afinidad a un FcyR o altera la función efectora comparado con el anticuerpo parental. También descrito son métodos dé usar los anticuerpos de la invención.
Finalmente, Solicitud de Patente estadounidense núm. 20080181915, archivo por Tripp, et al., concierne a un adyuvante de ligando CD40 para el virus sincitial respiratorio. Brevemente, se menciona que esta solicitud muestra métodos y adyuvantes para potenciar una respuesta inmunitaria a RSV en un hospedero, donde los métodos y los adyuvantes comprenden una fuente de una proteina de unión CD40. Preferentemente, la proteina de unión CD40 es CD40L y la fuente es un vector que comprende a un promotor funci nalmente unido a una región codificadora CD40L. La respuesta inmunitaria potenciada producida por los adyuvantes y los métodos de la invención actual incluye tanto la expresión aumentada de citocinas de Thl como la producción aumentada del anticuerpo.
Breve Descripción de la Invención En una modalidad, la presente invención es una proteina de fusión que comprende la fórmula: Anticuerpo (Ab) - Ligador peptidico (PL) - Antigeno (Ag)x, Ab- ( PL-Ag) x; Ab- (Ag-PL) x; Ab- (PL-Ag-PL) x; Ab- (Ag-PL-Ag) x; Ab- ( PL-Ag) x-PL; or Ab- (Ag-PL)x-Ag; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteina de fusión sin el sitio de glucosilación. En un aspecto, Ag se selecciona a partir de un antigeno viral, un antigeno tumoral, un antigeno de enfermedad in-fectocontagiosa, un antigeno autoinmunitario, una toxina o combinaciones de lo mismo. En otro aspecto, Ag es un concatémero peptidico. En otro aspecto, el PL es un concatémero peptidico. En otro aspecto, el - ( PL Ag) x, (Ag-PL) x, - (PL-Ag-PL) x, o - (Ag PL Ag) los x se ubican en el terminal carboxi de la cadena pesada de Ab o fragmento de lo mismo. En otro aspecto, Ag provoca como respuesta una respuesta inmunitaria humoral y/o respuesta inmunitaria celular en un hospedero. En un aspecto, Ab comprende al menos la región variable de anti-CD 0-12E12.3F3 (Número de acceso de ATCC PTA-9854), anti-CD40-12B4.2C10 (Presentación de Depósito núm. HS446, Número de acceso de ATCC) , y anti-CD40 11B6.1C3 (Presentación de Depósito núm. HS440, Número de acceso de ATCC) .
En un aspecto, Ag se selecciona a partir de enfermedades o trastornos autoinmunitarias asociadas con antigenos implicados en la enfermedad autoinmunitaria seleccionada del ácido glutámico descarboxilasa 65 (GAD 65) , ADN de origen natural, proteina básica mielinica, proteina proteolipidica mielinica, componentes de receptor de acetilcolina, tiroglobulina, y la hormona estimulante de la tiroides (TSH) receptor. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de antigenos de enfermedad infectocontagiosa seleccionados de antigenos bacterianos, virales, parasitarios, y fúngicos. En otro aspecto, x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19. En otro aspecto, la proteina de fusión comprende dos o más Ags de diferentes antigenos separados por al menos un PL. En otro aspecto, la proteina de fusión comprende dos o más Ags separados por al menos un PL que comprende una alanina y serina. En otro aspecto, Ab es un fragmento de anticuerpo seleccionado de Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fe, o ScFv.
En un aspecto, Ab se une específicamente a un CPH tipo I (CPH tipo I), CPH Tipo II (CPH tipo II), CD1, CD2 , CD3 , CD4, CD8, CD1 Ib, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerin, DECTIN-I, B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, receptor de linfocito T, o lectina. En otro aspecto, Ab es IgA, IgD, IgE, IgG o IgM o isotipo de lo mismo. En otro aspecto, Ab es un anticuerpo de humano o un anticuerpo humanizado. En otro aspecto, el PL comprende una alanina y serina. En otro aspecto, el PL se selecciona a partir de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO. : 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO. : 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO.: 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO.: 14) .
Aún otra modalidad de la presente invención es un vector de expresión de ácido nucleico que codifica para una proteina de fusión que comprende: un primer polinucleót ido que codifica para una cadena ligera de anticuerpo o fragmento de lo mismo; y un segundo polinucleótido que codifica para una cadena pesada de anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde la proteina de fusión comprende la fórmula que sigue: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteina de fusión sin el sitio de glucosilación. En un aspecto,. (PL-Ag)x or (Ag-PL)x se ubican en el terminal carboxi de la cadena pesada de Ab o fragmento de lo mismo. En otro aspecto, el primer y segundo polinucleótido está en un vector de expresión individual. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de antigenos de enfermedad infectocontagiosa seleccionados de antigenos bacterianos, virales, parasitarios, y fúngicos. En otro aspecto, . x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19. En otro aspecto, la proteina de fusión comprende dos o más Ags de diferentes antigenos separados por al menos un PL. En otro aspecto, la proteina de fusión comprende dos o más Ags separados por al menos un PL que comprende una alanina y serina. En otro aspecto, Ab es un fragmento de anticuerpo seleccionado de Fv, Fab, Fab 1 , F(ab')2, Fe, o ScFv. En otro aspecto, Ab se une específicamente un CPH tipo I, CPH tipo II, CDl, CD2, CD3, CD4, CD8, CDl Ib, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43., CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, C RF-56, DCIR, corriente continua - ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerin, DECTIN-I, B7 - 1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor IL-2, ICAM-I, receptor de Fcy, receptor de linfocito T, o lectina. En otro aspecto, Ab es IgA, IgD, IgE, IgG o IgM o isotipo de lo mismo. En otro aspecto, Ab es un anticuerpo de humano o un anticuerpo humanizado. En otro aspecto, el PL es comprende una alanina y serina y/o el PL se selecciona a partir de: S SVSPTTS VHPTPTSVPPTPTKS SP (SEQ ID NO. : 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO.: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO.: 13); o TNGS ITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO.: 14) . En otro aspecto, los primeros y segundos polinucleótidos son en dirección 3' de un promotor constitutivo.
Aún otra modalidad de la presente invención es una proteina de fusión estable, secretable que comprende la fórmula: NH2-Ab- ( PL-Ag) x-COOH o NH2-Ab- (Ag-PL) x-COOH; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno inmunogénico; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteina de fusión es estable y soluble en la solución comparado con una proteina Ab-Ag por si sola que no es soluble o estable.
Otra modalidad es un método para estabilizar péptidos antigénicos que comprenden: la incorporación de uno o más péptidos antigénicos que son inestables o insolubles en una proteina de fusión, donde la proteina de fusión tiene la estructura que sigue: Ab- (PL-Ag) x o Ab- (Ag-PL) x; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteina de fusión es estable y soluble en la solución donde el Ab-Ag no es soluble o estable .
Aún otra modalidad de la presente invención es una célula hospedera que comprende un vector de expresión de ácido nucleico que comprende: un primer polinucleótido que codifica para una cadena ligera de anticuerpo; y un segundo polinucleótido que codifica para una proteina de fusión de cadena pesada de anticuerpo, la proteina de fusión que comprende la fórmula que sigue: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteina de fusión tiene más estabilidad es la solución que la proteina de fusión sin el sitio de glucosilación. En otra modalidad, la célula hospedera comprende un vector de expresión que produce una proteina de fusión que comprende la fórmula: Ab- (PL-Ag) ; Ab-(Ag-PL)x; Ab- ( PL-Ag-PL) x; Ab- (Ag-PL-Ag) x; Ab- (PL-Ag) x-PL; o Ab-(Ag-PL)x Ag-; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteina de fusión sin el sitio de glucosilación.
La presente invención también incluye una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo que tiene la fórmula que comprende la fórmula: Ab- (PL-Ag) x; Ab-(Ag-PL)x; Ab- (.PL-Ag-PL) x; Ab- (Ag-PL-Ag) ; Ab- (PL-Ag) x-PL; o Ab-(Ag-PL)x Ag-; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteina de fusión sin el sitio de glucosilación.
Aún otra modalidad de la presente invención es una proteina de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag) x- (CAPA-AGZ) n; o Ab- (Ag-PL) x- ( PLy-Agz ) n; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20; donde n es 0 a 19; y donde y o z es 0 a 10, donde la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteina de fusión sin el sitio de glucosilación .
Otra modalidad es una vacuna aislada y purificada que comprende: una cadena pesada seleccionada de al menos un de SEQ ID NOS.: 6, 7, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 19, 20, 36, 37, 96, 97, 98, 99, 110, 111, 112, 118, 119, 134, 136, 138, 146, y 147 que se une específicamente a CD40; y una cadena ligera que se une específicamente a CD40. En un aspecto, el anticuerpo es definido adicionalmente como un anticuerpo humanizado .
Aún otra modalidad de la presente invención es una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag) x; Ab- (Ag-PL) ; Ab- ( PL-Ag-PL) x; Ab- (Ag-PL-Ag) x; Ab- ( PL-Ag) -PL; o Ab-(Ag-PL)x Ag-; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; Ag es al menos un antigeno viral; y x es un número entero de 1 a 20. En un aspecto, la proteina de fusión tiene más estabilidad es la solución que el PL sin el sitio de glucosilación. En otro aspecto, Ag comprende un péptido de un- adenovirus, retrovirus, picornavirus , herpesvirus, rotaviruses, hantaviruses , coronavirus, togavirus, flavirvirus, rabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenavirus, reovirus, papilomavirus , parvovirus, poXvirus, hepadnavirus , o virus espongiforme. En otro aspecto, Ag comprende un péptido de al menos un de VIH, CMV, hepatitis A, B, y C, influenza; sarampión, polio, viruela, rubéola, respiratoria sincitial, herpes simple, varicella zoster, Epstein-Barr , encefalitis japonesa, rabia, gripe, o virus del resfriado .
En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de: Nef (66-97) : VGFPVTPQVPLRP TYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO . : 1 ) ; Nef (116-145) : HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEQ ID NO . : 2 ) ; Gag pl7 (17-35) : EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO.: 3); Gag pl7-p24 (253-284) : NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEQ ID NO.: 4); o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFR QNPDIVIYQYMDDLY (SEQ ID NO.: 5) . En otro aspecto, Ag tiene 19 a 32 residuos. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de un linfocito T citotóxico (CTL) epitopo identificado en VIH-I Nef, Gag y proteínas de Env presentadas en el contexto de moléculas de CPH TIPO I.
En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de VIH gpl20, gp41, Gag, pi 7, p24, p2, p7, pi, p6, Tat, Rev, PR, RT, IN, Vif, Vpr, Vpx, Vpu y Nef. En otro aspecto, x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19.
En otro aspecto, Ag comprende péptidos de virus de diferentes antígenos separados por diferentes ligadores peptídicos. En otro aspecto, Ag se separa por al menos un PL que comprende una alanina y serina. En otro aspecto, la proteína de fusión se selecciona a partir de SEQ ID NOS.: 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 36. En otro aspecto, la proteína de fusión es aislada de una célula que comprende un vector polinucleotídico que codifica para la proteína de fusión, el vector polinucleotídico que comprende SEQ ID NOS.: 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 36.
En otro aspecto, Ab comprende SEQ ID NOS.: 37 y 38. En otro aspecto, la proteína de fusión es aislada de una célula que comprende un vector polinucleotídico que expresa para la proteína de fusión y la porción de Ab comprende SEQ ID NOS.: 39 y 40. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de SEQ ID NOS.: 52-56, 58-60, 61-69, 70-72, o 73-77. * En otro aspecto, Ag es 17 a 60 residuos. En otro aspecto, Ag tiene 8 años, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 a 60 residuos de longitud.
En otro aspecto, Ag comprende al menos un lipopéptido. En otro aspecto, Ag está en el terminal carboxi y comprende además un terminal carboxi (Palm)-NH2 grupo. En otro aspecto, el PL se selecciona a partir de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO. : 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO. : 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO.: 13); o TNGS ITVAATAPTVTP VNATPSAA (SEQ ID NO.: 14) . En otro aspecto, el PL comprénde una alanina y serina. Otra modalidad es la presente invención es un vector de administración de antigeno viral que comprende: una proteina de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento péptidos virales de lo mismo y uno o más en el terminal carboxi del anticuerpo anti-CD40, donde cuando dos o más péptidos virales se encuentran los péptidos virales se separa por uno o más ligadores peptidicos que comprenden al menos un sitio de glucosilación potencial. En otro aspecto, un vector de administración de antigeno es un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de lo mismo y dos o más péptidos virales en el terminal carboxi de la cadena ligera, la cadena pesada o tanto la luz como cadenas pesadas del anticuerpo anti-CD40, donde cuando dos o más péptidos virales se separan por uno o más ligadores peptidicos que comprenden al menos un sitio de glucosilación potencial.
Aún otra modalidad de la presente invención es un método para estabilizar péptidos virales que comprenden: la incorporación de uno o más péptidos virales que son inestables o insolubles en una proteina de fusión con un anticuerpo,, donde el anticuerpo y los péptidos virales se separa por uno o más ligadores peptidicos que comprenden uno o más sitios de glucosilación . Aún otra modalidad es un método de potenciar respuestas de linfocito T que comprenden: la inmunización de un paciente en la necesidad de la vacunación con una cantidad efectiva de una vacuna que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x o Ab- (Ag-PL) x; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; Ag es al menos un antígeno viral; y x es un número entero de 1 a 20. En un aspecto, la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que una proteina de fusión idéntica sin el sitio de glucosilación. En otro aspecto, el al menos un antigeno viral comprende péptidos de adenovirus, retrovirus, picornavirus , herpesvirus, rotaviruses, hantaviruses, coronavirus, togavirus, flavirvirus, rhabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus , bunyavirus, arenavirus, reovirus, papilomavirus, parvovirus, poxvirus, hepadnavirus , o virus espongiforme. En otro aspecto, el al menos un antigeno viral comprende péptidos de al menos un de VIH, CMV, hepatitis A, B, y C, influenza; sarampión, polio, viruela, rubéola; respiratorio sincitial, herpes simple, varicella zoster, Epstein-Barr , encefalitis japonesa, rabia, gripe, o virus del resfriado.
En un aspecto, Ag se selecciona a partir de: Nef (66-97) : VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO. : 1); Nef (116-145) : HTQGYFPDWOJNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEQ ID NO.: 2); Gag pl7 (17-35) : EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO. : 3); Gag pl7-p24 (253-284) : NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEQ ID NO.: 4); y/o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEQ ID NO.: 5). En otro aspecto, Ag es 19 a 32 residuos y se selecciona a partir de un linfocito T citotóxico (CTL) epitopo identificado en VIH-I Nef, Gag y proteínas de Env presentadas en el contexto de moléculas de CPH TIPO I. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de VIH gpl20, gp41, Gag, pi 7, p24, p2, p7, pi, p6, Tat, Rev, PR, RT, IN, Vif, Vpr, Vpx, Vpu y Nef. En otro aspecto, x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19.
En otro aspecto, Ag comprende dos o más antígenos virales de diferentes virus. En otro aspecto, PL comprende una alanina y serina. En otro aspecto, la vacuna se selecciona a partir de SEQ ID NOS.: 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 36. En otro aspecto, Ab comprende SEQ ID NOS.: 37 y 38. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de SEQ ID NOS. : 52-56, 58-60, 61-69, 70-72, o 73 - 77. En otro aspecto, Ag es 17 a 60 residuos. En otro aspecto, Ag tiene 8 años, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 a 60 residuos de longitud. En otro aspecto, Ag tiene. 8 años, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 a 60 residuos de longitud. En otro aspecto, Ag comprende un lipopéptido.
En otro aspecto, Ag está en el terminal carboxi y comprende un terminal carboxi (Palm)-NH2 grupo. En otro aspecto, el PL se selecciona a partir de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP ( SEQ ID NO.: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO. : 12)'; TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. : 13) ; o TNGS.ITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO. : 14) . Aún otra modalidad de la presente invención es VIH de método de elaboración de IFN especifico para el péptido ? producir linfocitos T que comprenden: la inmunización de un paciente con una proteina de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40, o fragmento de lo mismo, con uno o más péptidos de VIH en el terminal carboxi del anticuerpo; y aislando la sangre periférica células mononucleares del paciente, donde las células mononucleares periféricas aisladas son enriquecidas para anti-VIH IFN ? producir linfocitos T, donde el anticuerpo anti-CD40 comprende SEQ ID NOS. : 37 y 38 o fragmentos de lo mismo. En un aspecto, el paciente es un paciente sospechado de tener una infección de VIH. En otro aspecto, la proteina de fusión comprende dos o más péptidos de VIH y los péptidos se separan por uno o más ligadores peptidicos. En otro aspecto, la proteina de fusión comprende dos o más péptidos de VIH y los péptidos se separan por uno o más ligadores peptidicos comprenden secuencias de glucosilación . En otro aspecto, la proteina de fusión comprende dos o más péptidos de VIH y los péptidos se separan por uno o más ligadores peptidicos que comprenden una alanina y serina. En otro aspecto, uno o más los péptidos de VIH comprenden al menos un lipopéptido.
En otro aspecto, uno o más los péptidos de VIH comprenden un terminal carboxi (Palm)-NH2 grupo. En otro aspecto, uno o más los péptidos de VIH son 19-al 32 aminoácido de longitud y se seleccionan a partir de un linfocito T citotóxico (CTL) epitopos identificados en VIH-I Nef, Gag y proteínas de Env en el contexto de diferentes moléculas de CPH TIPO I. En otro aspecto, uno o más los péptidos de VIH se seleccionan a partir de VIH gpl20,. gp41, Gag, pi 7, p24, p2, p7, pi, p6, Tat, Rev, PR, RT, IN, Vif, Vpr, Vpx, Vpu y Nef. En otro aspecto, los péptidos uno o más virales se seleccionan a partir de al menos un de: Nef (66-97) : VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO. : 1); Nef (116-145) : HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEQ ID NO.: 2) ; Gag pl7 (17-35) : EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO. : 3); Gag pl7-p24 (253-284) : PPI PVGEIYKRWI ILGLNKIVRMYSPTSILD (SEQ ID NO.: 4); y/o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEQ ID NO. : 5).
Aún otra modalidad de la presente invención es una proteina de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40, o fragmento de lo mismo, con uno o más péptidos virales en el terminal carboxi del anticuerpo separado por un PL que comprende al menos una alanina y una serina. En un aspecto, los péptidos uno o más virales son péptidos de VIH. En otro aspecto, los péptidos uno o más virales se seleccionan a partir de al menos un de: Nef (66-97) : VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO.: 1); Nef (116-145) :' HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEQ ID NO.: 2); Gag pl7 (17-35) : EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO.: 3); Gag pl7-p24 (253-284) : NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEQ ID NO.: 4); y/o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQY DDLY (SEQ ID NO.: 5) .
La presente invención también incluye un método de elaboración de una proteina de fusión que comprende: insertar en un vector de expresión un constructo de ácido nucleico que comprende polinucleótidos que codifican para una proteina que tiene la fórmula: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; Ag es al menos un antigeno viral; y x es un número entero de 1 a 20; y cultivar el vector bajo condiciones suficientes para permitir expresión de la proteina de fusión. En un aspecto, la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que una proteina de fusión idéntica sin el sitio de glucosilación . En otro aspecto, el al menos un antigeno viral comprende péptidos de un adenovirus, retrovirus, picornavirus , herpesvirus, rotaviruses, hantaviruses , coronavirus, togavirus, flavirvirus, rhabdovirus, paramixovirus , ortomixovirus , bunyavirus, arenavirus, reovirus, papilomavirus , parvovirus, poxvirus, hepadnavirus, o virus espongiforme. En otro aspecto, el al menos un antigeno viral comprende péptidos de al menos un de VIH, C V, hepatitis A, B, y C, influenza; sarampión, polio, viruela, rubéola, respiratoria sincitial, herpes simple, varicella zoster, Epstein-Barr, encefalitis japonesa, rabia, gripe, o virus del resfriado. En otro aspecto, la proteina de fusión es la cadena ligera de Ab, la cadena pesada de Ab o tanto luz de Ab como cadenas pesadas. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de: Nef (66-97) : VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO.: 1); Nef (116-145) : HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFG LYKL (SEQ ID NO.: 2); Gag pl7 (17-35) : EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO.: 3); Gag pl7-p24 (253-284) : NPPIPVGEIYKR I ILGLNKIVR YSPTSILD (SEQ ID NO. : 4); y/o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQY DDLY (SEQ ID NO. : 5) .
Aún otra modalidad de la presente invención incluye un método de multiplicarse linfocitos T específicos para el antígeno in vitro que comprenden: aislamiento de PBMCs de un paciente de VIH; incubar el PBMCs aislado con una cantidad efectiva de una vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5; multiplicarse el PBMCs en la presencia de una cantidad efectiva de IL-2; la cosecha de las células; y la evaluación' de la producción de citocina por las células para determinar la presencia de anti-VIH linfocitos T específicos. Otra modalidad es VIH linfocitos T específicos para el antígeno elaborados por el método que comprende: aislamiento de PBMCs de un paciente de VIH; incubar el PBMCs aislado con una cantidad efectiva de una vacuna de péptido de VIH de aCD40. LIP05 ; multiplicarse el PBMCs en la presencia de una cantidad efectiva de IL-2; la cosecha de las células; y la evaluación de la producción de citocina por las células para determinar la presencia de anti-VIH linfocitos T específicos. Otra modalidad es método de elaboración de una vacuna terapéutica que comprende: la carga de una célula dendrítica con la vacuna de péptido de VIH de OÍCD40.LIPO5 que comprende: aislamiento de monocitos de paciente de VIH; la diferenciación de los monocitos en células dendríticas con IFNa y GM-CSF; y exponiendo las células dendríticas diferenciadas a un péptido de VIH de aCD40.LIPO5, donde las células dendríticas cargadas tienen capacidad de estimular el péptido de VIH autólogo linfocitos T específicos in vitro.
La presente invención también incluye una vacuna-terapéutica elaborada por - el método que comprende: la carga de una célula dendrítica con la vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 que comprende: aislamiento de monocitos de paciente de VIH; la diferenciación de los monocitos en células dendriticas con IFN y GM-CSF; y exponiendo las células dendriticas diferenciadas a un péptido . de VIH de OÍCD40. LIP05 , donde las células dendriticas cargadas tienen capacidad de estimular el péptido de VIH autólogo linfocitos T específicos in vitro. Otra modalidad es una vacuna terapéutica que comprende un polipéptido que comprende al menos uno de SEQ ID NOS.: 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 36. Aún otra modalidad es una vacuna terapéutica que comprende una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab- (PL-Ag) x; Ab- (Ag-PL)x; Ab- ( PL-Ag-PL) x ; Ab-(Ag-PL-Ag ) x; Ab- ( PL-Ag) x-PL; o Ab-(Ag-PL)x Ag-; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; PL es al menos un ligador peptídico que comprende al menos un sitio de glucosilación; Ag es al menos un antígeno viral; y x es un número entero de 1 a 20.
Aún otra modalidad, de la presente invención incluye una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab- (PL-Ag) x; Ab-(Ag-PL)x; Ab- (PL-Ag-PL) x; Ab- (Ag-PL-Ag) x; Ab- ( PL-Ag) x-PL; o Ab-(Ag-PL)x Ag-; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; PL es al menos un ligador peptídico que comprende al menos un sitio de glucosilación; Ag es al menos un antigeno de cáncer; y x es un número entero de 1 a 20. En un aspecto, la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteina de fusión sin el sitio de glucosilación .
En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de antigenos asociados al tumor seleccionados de CEA, antigeno especifico a próstata (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 y 12, proteina MUC-relacionada (Mucina) (MUC-I, MUC-2, etc.) GM2 y gangliósidos GD2 , ras, myc, tirosinasa, MART (antigeno de melanoma) , MARCO- ART, ciclina Bl, ciclina D, Pmel 17 (gplOO) , intrón de GnT-V V secuencia (Intrón V de secuencia V de la N-acetilglucoaminiltransferasa) , Próstata Ca psm, antigeno de suero de próstata (PSA), PRAME (antigeno de melanoma) , ß-catenina, MUM-I-B (melanoma producto de gen mutado ubicuo) , GAGE (antigeno de melanoma) 1, BAGE (antigeno de melanoma) 2-10, C-ERB2 (Her2/neu) , EBNA (Epstein- Barr Virus antigeno nuclear) 1-6, gp75, virus de papiloma de humano (HPV) E6 y E7, p53, proteina de resistencia pulmonar (LRP) , Bcl-2, y Ki-67. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de antigenos asociados al tumor que comprenden antigenos de leucemias y linfomas, tumores neurológicos , como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer pancreático, tumores genitourinarios tal cerviz, útero, cáncer ovárico, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer del pene, tumores óseos, tumores vasculares, o cánceres del labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, recto, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmón y bronquio, vejiga, riñon, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple y leucemia.
En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de: MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGG ECEKHSQP WQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV (SEQ ID NO.: 74); LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDD SSHD (SEQ ID NO. : 75) ; LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDL HVIS (SEQ ID NO. :76) ; NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCAL PERP (SEQ ID NO. : 77) ; o SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID NO:78), y fragmentos, de lo mismo. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de: IMDQVPFSV (SEQ ID NO.: 113); ITDQVPFSV (SEQ ID NO. : 114); YLEPGPVTV (SEQ ID NO. : 115); YLEPGPVTA (SEQ ID NO. : 116); KT GQY QV (SEQ ID NO.: 117); DTTEP ATPTTP VTTPTTTKVPRNQD WLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSL KVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDA CIFP DGGPCPSGSWSQKRSFVYV KTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGS QSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (SEQ ID NO.-.122); PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYT DFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVL QAAIPLTS CGSSPVPAS (SEQ ID N0..124); GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAP VQMPTAES TGMTPEKVPVSEV GTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA (SEQ ID NO. : 126) ; QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSI-GPLLDGTATLRLVKRQVP LDCVLYRYG SFSVTLDIVQ (SEQ ID NO.: 128); y GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPS PACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (SEQ ID NO. : 130) , y fragmentos de lo mismo.
, En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de: ME KILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY ( SEQ ID NO. : 132); y DWLVQVQ KFRLLQETMY TVSI I DRFMQNNCVPKK (SEQ ID NO.: 133) . En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de: MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (SEQ ID NO. : 141); QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGA TCMFVAS KMKETIPLTAEKLCIY DNSIRPEELLQ ELL (SEQ ID NO.: 142); LVNKLKWNLAA TPHDFIEHFLSKMPEAEENKQI IRKHAQTFVALCATD VKFISNPPSMV (SEQ ID NO. : 143); y AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSL RQAQQNM DPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEQ ID NO.: 144), y fragmentos de lo mismo. En otro aspecto, Ag es 19 a 32 aminoácidos de longitud. En otro aspecto, Ag es 17 a 60 aminoácidos de longitud y se selecciona a partir de un linfocito T citotóxico (CTL) epitopo identificado en PSA o ciclina 1. En otro aspecto, x comprende 1, 2 , 3, 4, 5, 6„, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19. En otro aspecto, Ag comprende dos o más péptidos de cáncer de diferentes antigenos de cáncer separados por el PL. En otro aspecto, Ag se separa por al menos un PL que comprende una alanina y serina. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de SEQ ID NOS.: 74-78, 79-86, 87-92, 93-95, 113-117, 122-130, 132-133, y 141-144. En otro aspecto, Ab comprende SEQ ID NOS.: 38 y 39. En otro aspecto, Ab se expresa por un vector de expresión de ácido nucleico que comprende , SEQ ID NOS.: 40 y 41. En otro aspecto, el PL se selecciona a partir de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO.: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO. : 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO.: 13); o TNGS ITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO.: 14) . En otro aspecto, el PL comprende una alanina y serina.
Aún otra modalidad de la presente invención incluye un vector de administración de antigeno que expresa para un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de lo mismo y dos o más péptidos de cáncer en el terminal carboxi de la cadena ligera, la cadena pesada o tanto la luz como cadenas pesadas del anticuerpo anti-CD40, donde cuando dos o más péptidos de cáncer se encuentran, los péptidos de cáncer se separan por uno o más ligadores peptídicos que comprenden al menos un sitio de glucosilación. En un aspecto, uno o más los ligadores peptídicos se seleccionan a .partir de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO.: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO. : 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO.: 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO.: 14) .
Aún otra modalidad de la presente invención incluye una proteína de fusión anti-CD40 que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento péptidos de cáncer de lo mismo y uno o más en el terminal carboxi del anticuerpo anti-CD40, donde cuando dos o más péptidos de cáncer se encuentran los péptidos de cáncer se separan por péptidos uno o más ligadores que comprenden al menos un sitio de glucosilación. En un aspecto, el fragmento de anticuerpo se selecciona a partir de un fragmento de Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fe, o ScFv. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de SEQ ID NOS.: 74-78, 79-86, 87-92, 93-95, 113-117, 122-130, 132-133, y 141-144. Aún otra modalidad de la presente invención incluye un método para estabilizar péptidos de cáncer que comprenden: incorporando uno o más péptidos de cáncer que son inestables o insolubles en una proteina de fusión con un anticuerpo, donde el anticuerpo y los péptidos de cáncer se separan por uno o más ligadores peptidicos que comprenden uno o más sitios de glucosilación . En otro aspecto, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos de cáncer y los péptidos de cáncer se separan por uno o más ligadores peptidicos. En otro aspecto, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos de cáncer y los péptidos se separan por uno o más ligadores peptidicos. En otro aspecto, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos de cáncer y los péptidos se separan por uno o más ligadores que comprenden una alanina y serina. En otro aspecto, el péptido de cáncer se selecciona a partir de antígenos asociados al tumor seleccionados de CEA, antígeno específico a' próstata (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 y 12, proteína MUC-relacionada (Mucina) (MUC-I, MUC-2, etc.) GM2 y gangliósidos GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antígeno de melanoma) , MARCO-MART, ciclina Bl, ciclina D, Pmel 17 (gplOO), intrón de GnT-V V secuencia (Intrón V de secuencia V de la N-acetilglucoaminiltransferasa ) , Próstata Ca psm, antígeno de suero de próstata (PSA), PRAME (antígeno de melanoma) , ß-catenina, MUM-I-B (melanoma producto de gen mutado ubicuo) , GAGE (antígeno de melanoma) 1, BAGE (antígeno de melanoma) 2-10, C-ERB2 (Her2/neu) , EBNA (Epstein- Barr Virus antígeno nuclear) 1-6, gp75, virus de papiloma de humano (HPV) E6 y E7, p53, proteina de resistencia pulmonar (LRP) , Bcl-2, y Ki-67. En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de antigenos asociados al tumor que comprenden antigenos de leucemias y linfomas, tumores neurológicos , como astrocitomas o glioblastomas , melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer pancreático, tumores genitourinarios tal cerviz, útero, cáncer ovárico, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer del pene, tumores óseos, tumores vasculares, o cánceres del labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, recto, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmón y bronquio, vejiga, riñon, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple y leucemia.
En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de : MWVPVV-FLTLS VTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQP QVLVASRGRAVCGGVLVHPQ WV (SEQ ID NO.:74); LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDD SSHD (SEQ ID NO. :75) ; LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDL HVIS (SEQ ID NO. : 76) ; NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCAL PERP (SEQ ID NO.:77); o SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID NO.:78) .
En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de: IMDQVPFSV (SEQ ID NO. : 113); ITDQVPFSV (SEQ ID NO.: 114); YLEPGPVTV (SEQ ID NO.: 115); YLEPGPVTA (SEQ ID NO.: 116); KTWGQY QV (SEQ ID NO.: 117); DTTEP ATPTTP VTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSL KVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDA CIFP DGGPCPSGS SQKRSFVYVWKTWGQY QVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGS QSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (SEQ ID NO.: 122); PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIP LTS CGSSPVPAS (SEQ ID NO. : 124); GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAP VQMPTAES TGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA (SEQ ID NO.: 126); QVTTTEWVETTARELPI PEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVL YRYG SFSVTLDIVQ (SEQ ID NO.: 128); y - GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPS PACQLVLHQI LKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (SEQ ID NO. : 130) , y fragmentos de lo mismo.
En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de: MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY (SEQ ID NO.: 132); y DWLVQVQ KFRLLQET Y TVS I I DRFMQNNCVPKK (SEQ ID NO. : 133) .
En otro aspecto, Ag se selecciona a partir de al menos un de: EHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (SEQ ID NO. : 141); QKEVLPSMRKIVAT MLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFV AS KMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (SEQ ID NO.: 142); LV KLK NLAA TPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATD VKFISNPPSMV (SEQ ID NO.: 143); y AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSL RQAQQNM DPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEQ ID NO.: 144), y fragmentos de lo mismo. En otro aspecto, Ag es 19 a 32 aminoácidos de longitud. En otro aspecto, Ag es 17 a 60 aminoácidos de longitud y se selecciona a partir de un linfocito T citotóxico (CTL) epitopo identificado en PSA o ciclina 1. En otro aspecto, x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19. En otro aspecto, la proteina de fusión comprende péptidos de cáncer de diferentes antigenos separados por diferentes ligadores peptidicos. En otro aspecto, la proteina de fusión comprende dos o más péptidos de cáncer separados por uno o más ligadores peptidicos que comprenden una alanina y serina. En otro aspecto, el anticuerpo comprende SEQ ID NOS.: 38 y 39. En otro aspecto, la proteina de fusión se expresa por un vector de exprésión de ácido nucleico que comprende SEQ ID NOS.: 40 y 41. En otro aspecto, el ligador peptidico se selecciona a partir de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO. : 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO. : 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. : 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO. : 14).. Aún otra modalidad de la presente invención incluye un método de potenciar respuestas de linfocito T que comprenden: la inmunización de un paciente en la necesidad de la vacunación con una cantidad efectiva de una vacuna que comprende una proteina de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40 o porción péptidos de cáncer de lo mismo y uno o más unidos al terminal carboxi del anticuerpo anti-CD40. En otro aspecto, los péptidos de cáncer se seleccionan a partir de antigenos asociados al tumor seleccionados de CEA, antigeno especifico a próstata (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 y 12, MUC ( ucina) (p.ej, UC-I, MUC-2, etc.) GM2 y gangliósidos GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antigeno de melanoma) , ARCO- ART, ciclina Bl, ciclina D, Pmel 17 (gplOO), intrón de GnT-V V secuencia (Intrón V de secuencia V de la N-acet ilglucoaminiltransferasa) , Próstata Ca psm, antigeno de suero de próstata (PSA) , PRAME (antigeno de melanoma) , ß-catenina, MUM-I-B (melanoma de producto de gen mutado ubicuo), GAGE (antigeno de melanoma) 1, BAGE (antigeno de melanoma) 2-10, C-ERB2 (Her2/neu) , EBNA (Antigeno nuclear del virus Epstein-Barr ) 1-6, gp75, virus de papiloma de humano (HPV) E6 y E7, p53, proteina de resistencia pulmonar (LRP) , Bcl-2, y Ki-67. En otro aspecto, los péptidos de cáncer se seleccionan a partir de antigenos asociados al tumor que comprenden antigenos de leucemias y linfomas, tumores neurológicos , como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer pancreático, tumores genitourinarios tal cerviz, útero, cáncer ovárico, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer del pene, tumores óseos, tumores vasculares, o cánceres del labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, recto, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmón y bronquio, vejiga, riñon, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple y leucemia. Aún otra modalidad de la presente invención incluye un método de elaboración de una proteína de fusión de antígeno anti-CD40 que comprende: expresando para una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40 ó fragmento de lo mismo en una célula 'hospedera, la proteína de fusión que comprende uno o más péptidos de cáncer en el terminal carboxi del anticuerpo anti-CD40 o fragmento de lo mismo, donde cuando dos o más péptidos de cáncer se separan por uno o más ligadores, al menos un ligador que comprende un sitio de glucosilación; y aislamiento de la proteína de fusión. En otro aspecto, la proteína de fusión expresada para en el hospedero es aislada adicionalmente y purificada. En otro aspecto, el hospedero es una célula eucariótica. En otro aspecto, los péptidos de cáncer se seleccionan a partir de antigenos asociados al tumor seleccionados de CEA, antígeno especifico a próstata (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, AGE 1-4, 6 y 12, proteina MUC-relacionada (Mucina) ( UC-I, MUC-2, etc.) GM2 y gangliósidos GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antigeno de melanoma), ARCO-MART, ciclina Bl, ciclina D, Pmel 17 (gplOO) , intrón de GnT-V V secuencia (Intrón V de secuencia V de la N-acetilglucoaminiltransferasa) , Próstata Ca psm, antigeno de suero de próstata (PSA) , PRAME (antigeno de melanoma) , ß-catenina, MUM-I-B (melanoma producto de gen mutado ubicuo) , GAGE (antigeno de melanoma) 1, BAGE (antigeno de melanoma) 2-10, C-ERB2 (Her2/neu) , EBNA (Antígeno nuclear del virus Epstein-Barr) 1-6, gp75, virus de papiloma de humano (HPV) E6 y E7, p53, proteína de resistencia pulmonar (LRP) , Bcl-2, y Ki-67. En otro aspecto, los péptidos de cáncer se seleccionan a partir de antígenos asociados al tumor que comprenden antígenos de leucemias y linfomas, tumores neurológicos, como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer pancreático, tumores genitourinarios tal cerviz, útero, cáncer ovárico, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer del pene, tumores óseos, tumores vasculares, o cánceres del labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, recto, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmón y bronquio, vejiga, riñon, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin,, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple y leucemia. En otro aspecto, los péptidos de cáncer se seleccionan a partir de al menos un de: WVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVH PQWV (SEQ ID NO. :74) ; LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDD SSHD (SEQ ID NO. :75) ; LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDL HVIS (SEQ ID NO. : 76) ; NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCAL PERP (SEQ ID NO.:77); o SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID NO . : 78 ) .
En otro aspecto, los péptidos de cáncer se seleccionan a partir de al menos un de: IMDQVPFSV (SEQ ID NO. : 113); ITDQVPFSV (SEQ ID NO.: 114); YLEPGPVTV (SEQ ID NO.: 115); YLEPGPVTA (SEQ ID NO. : 116); KTWGQYWQV (SEQ ID NO.: 117); DTTEP ATPTTP VTTPTTTKVPRNQD WLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSL KVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDA CIFP DGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKT GQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGS QSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (SEQ ID NO. :122); PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVL QAAIPLTS CGSSPVPAS (SEQ ID N0..124); GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAP VQMPTAES TGM PEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATG TPAEVSIVVLSGTTAA (SEQ ID NO. : 126) ; QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVP LDCVLYRYGSFSVTLDIVQ (SEQ ID NO.: 128); y GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEAC EISSPGCQPPAQRLCQPVLPS PACQLVLHQI LKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (SEQ ID NO. : 130), y fragmentos de lo mismo.
En otro aspecto, los péptidos de cáncer se seleccionan a partir de al menos un de: MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYL ELTMLDY (SEQ ID NO.: 132); y DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVS I I DRFMQNNCVPKK (SEQ ID NO. : 133) .
En otro aspecto, los péptidos de cáncer se seleccionan a partir de al menos un de: EHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (SEQ ID NO. : 141) ; QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGA TC FVAS KMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (SEQ ID NO. : 142); LVNKLKWNLAA TPHDFIEHFLSKMPEAEENKQI IRKHAQTFVALCATDVKFIS P PSMV (SEQ ID NO. : 143); y AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSL RQ AQQNM DPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEQ ID NO.: 144), y fragmentos de lo mismo.
Aún otra modalidad de la presente invención incluye un método de multiplicarse linfocitos T específicos para el antígeno in vitro que comprende: aislamiento de sangre periférica células mononucleares (PBMCs) de un enfermo de cáncer; incubando el PBMCs aislado con una cantidad inmunogénica de un o¡CD40- ( PL-Ag) x o vacuna de OÍCD 0- (Ag-PL) x, donde Ag es un antígeno asociado al tumor y x es un número entero 1 a 20; multiplicarse el PBMCs en la presencia de una cantidad efectiva de IL-2; la cosecha de las células; y la evaluación de la producción de citocina por las células para determinar la presencia de linfocitos T específicos anticancerígenos .
Aún otra modalidad de la presente invención incluye unos linfocitos T específicos para el antígeno asociado al tumor elaborados por el método que comprende: aislamiento de sangre periférica células mononucleares (PBMCs) de un enfermo de cáncer; incubando el PBMCs aislado con una cantidad inmunogénica de un aCD40- ( PL-Ag) x o vacuna de o¡CD40- (Ag-PL) x, donde Ag es un antígeno asociado al tumor y x es un número entero 1 a 20; multiplicarse el PBMCs en la presencia de una cantidad efectiva de IL-2; la cosecha de las células; y la evaluación de la producción de citocina por las células para determinar la presencia de linfocitos T específicos para el antígeno asociado al- tumor. Aún otra modalidad de la presente invención incluye una vacuna terapéutica que comprende una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x; Ab- (Ag-PL)x; Ab- ( PL-Ag-PL) x; Ab- (Ag-PL-Ag) x; Ab- (PL-Ag) x-PL; o Ab-(Ag-PL)x Ag-; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; PL es al menos un ligador peptídico que comprende al menos un sitio de glucosilación; Ag es al menos un antígeno de cáncer; y x es un número entero de 1 a 20.
Breve Descripción de las Figuras Para una comprensión más completa de las características y las ventajas de la presente invención, se hace ahora referencia a la descripción detallada de la invención junto con las figuras acompañantes, donde: La Figura 1 muestra anticuerpos recombinantes de afinidad de proteína A fusionados a diversos péptidos de VIH (divisiones 1 a 5) secretado del transfectado 293F células, analizadas reduciendo SDS.PAGE y tinción Azul Brillante Coomassie.
La Figura 2 muestra la afinidad de proteína A de anticuerpos recombinantes purificados fusionados a diversos péptidos de VIH ( Divisiones¦ 1 y 2) secretado del transfectado 293F células, luego analizadas reduciendo SDS.PAGE y tinción Azul Brillante Coomassie.
La Figura 3 muestra la afinidad de proteina A de anticuerpos recombinantes purificados fusionados a diversas series de péptido de VIH (Divisiones 1 a 5) secretado del transfectado 293F células, luego analizadas reduciendo SDS.PAGE y tinción Azul Brillante Coomassie.
La Figura 4 muestra la afinidad de proteina A de anticuerpos recombinantes purificados fusionados a diversas series de péptido de VIH (Divisiones 1 a 6) secretado del transfectado 293F células, luego analizadas reduciendo SDS.PAGE y tinción Azul Brillante Coomassie.
La Figura 5 describe el protocolo usado in vitro para realizar ensayos de evaluación la potencia del anticuerpo recombinante de fusión de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 (aCD40.LIPO5 rAb) para provocan como respuesta la extensión de linfocitos T específicos para el antígeno en el contexto de un cultivo de PBMC .
La Figura 6A-C muestra a VIH la producción de I FND específica para el péptido en PBMCs de pacientes de VIH incubados con diversas concentraciones de vacuna de serie de péptido de anti-CD40. LIP05. El C es el grupo control, que no recibió ninguna vacuna, y define respuesta basal del cultivo a cada péptido.
La Figura 7 es resumen de respuestas de vacuna de péptido de OÍC D40.L I PO5 contra las 5 regiones peptídicas de 8 pacientes de VIH.
La Figura 8A-C muestra que el CD40. La vacuna de péptido de VIH de LIP05 provoca como respuesta la extensión de VIH linfocitos T específicos para el péptido capaces de secretar múltiples citocinas - una característica deseable en una vacuna. La Figura 8A-C también muestra que el CD40. La vacuna de péptido de VIH de LIP05 provoca como respuesta gag253, nef66, nefll6 y respuestas específicas para el péptido pol325 caracterizadas por la producción de múltiples citocinas (el paciente A5) .
La Figura 9 muestra el protocolo para analizar la vacuna de péptido de VIH de aCD40. LIP05 de su capacidad de dirigir la extensión de linfocitos T específicos para el antígeno que resultan a . partir de la absorción apuntada con especificidad de objetivo por corrientes continuas y presentación de epítopos peptídicos en su complejo de complejo principal de histocompatibilidad de superficie.
La Figura 10A-B muestra la secreción de citocina en respuesta a péptidos de VIH de cocultivos de célula de DC-T sometidos a tratamiento con diversas dosis de vacuna de péptido de VIH de «CD40.LIPO5 (el paciente A10) .
La Figura 11 muestra que PB Cs del paciente A4 sometido a tratamiento con la vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 provoca como respuesta la extensión de linfocitos T específicos para el antígeno con la especificidad a la región gag253, pero no a las secuencias de unión flexibles.
La Figura 12A es la secuencia de cadena pesada de vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 mostrando regiones ligadoras flexibles en el en negritas,, uniendo a secuencias subrayadas y regiones de péptido de VIH protegidas contra en el gris.
La Figura 12A muestra que PBMCs del paciente A3 sometido a tratamiento con la vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 provoca como respuesta la extensión de linfocitos T específicos para el antigeno con especificidades al gag253, nef66, y regiones nefll6, pero no a las secuencias de unión flexibles.
La Figura 12B-1-2 muestra a VIH respuestas de linfocito T específicas para el antígeno evocadas del paciente de VIH A17 PBMCs incubado con 30 nM de tres diferentes vacunas de acción selectiva de corriente continua peptídicas HIV5.
Las Figuras 12C-1 y c-2 son un estudio similar a esto muestran en la Figura 12B-1 y b-2, salvo que el PBMCs es de un diferente paciente de VIH (A2) .
La Figura 12D muestra 15 diferentes respuestas de péptido de VIH [5 regiones peptídicas muestreadas en 3 pacientes], se descubre esto la vacuna de anti-CD40. HIV5pep es superior a antiDCIR. HIV5pep, anti-LOX-1. HIV5pep y non-LIP05 mezclan para provocar como respuesta un amplio intervalo de VIH peptidespecific CD8+ y CD4+ T respuestas.
La Figura 13 muestra la incorporación de anti-CD40 mAb: IL-4DC. IL-4 DCs se someten a tratamiento con 500 ng/ml de anti-CD40-Alexa 568.
La Figura 14 muestra CD4 y proliferación de linfocito T CD8 por corrientes continuas apuntadas con especificidad de objetivo con anti-CD40-HAl . 5xl0e3 IFNDCs cargados de 2 ug/ml de anti-CD40-HA o Ig-HAl de control son co-cultivados con CD4+ autólogo CFSE-marcado o linfocitos T de CD8+ (2xl0e5) durante 7 días. Las células son teñidas luego luego con anti-CD4 o anticuerpos Anti-CD8. Proliferación celular se analiza cuantificando la CFSE-dilución.
La Figura 15 muestra una titulación de la proteina de fusión HA1 en' el CD4+ T proliferación. Los IFNDCs (5K) cargado por proteínas de fusión son co-cultivados con linfocitos T de CD4+ marcados con CFSE (200K) durante 7 días.
La Figura 16 muestra que IFNDCs apuntados con especificidad de objetivo con anti-CD 0-HA1 activan linfocitos T de CD4+ específicos para HA1. los linfocitos T de CD4+ son estimulados de nuevo con corrientes continuas cargadas de 5uM de péptidos indicados, y IFND luego intracelular es teñido.
La Figura 17 muestra que IFNDCs apuntados con especificidad de objetivo con anti-CD40-HAl activan linfocitos T de CD4+ Específicos para HA1. los linfocitos T de CD4+ son estimulados de nuevo con corrientes continuas cargadas de péptidos indicados para el 36to, y luego el sobrenadante del cultivo se analiza para cuantificar IFND.
La Figura 18 muestra que target ingCD40 da como resultado el cebar reticulado potenciado del MART-1 linfocitos T de CD8 + específicos. Los IFNDCs (5K/well) cargado por proteínas de fusión son co-cultivados con linfocitos T de CD8+ purificados durante 10 días. Las células son teñidas con anti-CD8 y tetrámero. Las células son de donantes sanos (HLA-A*0201 +) .
La Figura 19 muestra que targetingCD40 da como resultado el cebar reticulado potenciado del MART-1 linfocitos T de CD8+ específicos (Resumen de experimentos 8-repetidos usando células de diferentes donantes sanos) .
La Figura 20 muestra el CD8+ CTL inducidos con IFNDCs apuntado con especificidad de objetivo con anti-CD40 -MART-1 son funcionales, los linfocitos T de CD8+ co-cultivados con IFNDCs apuntado con especificidad de objetivo con proteínas de fusión se mezclan con células T2 cargadas de 10 epítopo peptídico uM.
La Figura 21 muestra el CD8+ CTL inducidos con IFNDCs apuntado con especificidad de objetivo con anti-CD40-Fluml son funcionales, los linfocitos T de CD8+ co-cultivados con IFNDCs apuntado con especificidad de. objetivp con proteínas de fusión se mezclan con células T2 cargadas de 1.0 epítopo peptídico nM.
La Figura 22 muestra un contorno del protocolo para analizar la capacidad una vacuna compuesta de anti-CD4012E12 unido al PSA (antigeno especifico a próstata) para provoca como respuesta la extensión de una población de linfocito T nal've. Linfocitos T de CD4+ PSA-especificos correspondiente a una amplia gama de epitopos PSA. Brevemente, las corrientes continuas derivadas por el cultivo con el IFNa y GM-CSF de monocitos de un donante sano se incuban con la vacuna. Al día siguiente, las células se colocan en el medio recién preparado y los linfocitos T de CD4+ puros del mismo donante se agregan. Varios días más tarde, los péptidos de PSA se agregan y, después de que cuatro horas, los niveles gamma-IFN secretados en los sobrenadantes del cultivo se determinan.
La Figura 23 muestra que muchos péptidos PSA provocan potentes respuestas de producción de gamma-IFN que indican que anti-CD4012E12 y los agentes anti-CD40 similares pueden administrar eficazmente el antigeno a corrientes continuas, dando como resultado cebar de respuestas inmunitarias contra múltiples epitopos del antigeno.
La Figura 24 muestra que las corrientes continuas apuntadas con especificidad de objetivo con anti-CD40-PSA inducen respuestas de linfocito T de CD8+ PSA-especificas . Los IFNDCs son apuntados con especificidad de objetivo con 1 ug mAb proteina de fusión con PSA. Los linfocitos T de CD8+ autólogos purificados son co-cultivados durante 10 días. Las células son teñidas con anti-CD8 y PSA (KLQCVDLHV) tetrámero. Las células son de un donante sano HLA-A*0201 seguro. Los resultados demuestran que anti-CD40 con eficacia administran PSA a las corrientes continuas, que por su parte provocan como respuesta la extensión de linfocitos T de CD8+ PSA-específieos .
Figura 25 un Esquema de Reacción (mantenido) y la producción IFNy por linfocitos T de los grupos de péptidos y control para Donante 2. 5xl0e3 IFNDCs cargados de 2 ug/ml de anti-CD40-Cyclin DI son co-cultivados con linfocitos T de CD4+ autólogos purificados (2xl0e5) durante 8 días. Las células son estimuladas de nuevo luego con con 5 uM de péptidos individuales derivados de CyclinD 1 para el 5to en la presencia de Brefeldin A. Cells. son teñidos para cuantificar la expresión IFNy intracelular .
La Figura 26 muestra que un péptido explora e IFN ? producción por linfocitos T obtenidos de los grupos de péptidos mostrados en la Figura 25 y controla para el Donante 2. 5xl0e3 IFNDCs cargados de 2 ug/ml de anti-CD40-Cyclin Di son co-cultivados con linfocitos T de CD4+ autólogos purificados (2xl0e5) durante 8 días. Las células son re estimuladas luego con 5 uM de péptidos individuales derivados de CyclinD 1 para el 5to en la presencia de. Brefeldin A. Cells son teñidos para cuantificar IFN intracelular ? expresión.
La Figura 27 muestra la expresión y diseño de constructo para anticuerpos peptidicos anti-CD40-MART-l .
La Figura 28 es resumende epitopos inmunodominantes del CD4 + y CD8+ para el MART-I.
La Figura 29 muestra la expresión y diseño de constructo para anticuerpos peptidicos anti-CD40-gpl00.
La Figura 30 muestra el diseño para anti-CD40-gp adicional 100 anticuerpos peptidicos.
La Figura 31 muestra la expresión y diseño de constructo para anti-CD40-gp adicional 100 anticuerpos peptidicos.
La Figura 32 es un resumende epitopos inmunodominantes del CD4 + y CD8+ para gplOO.
La Figura 33 muestra la expresión y diseño de constructo para anti-CD40-gp adicional 100 anticuerpos peptidicos.
La Figura 34A muestra que la Ciclina de cadena completa Bl fusionado al extremo C-terminus de anticuerpo H cadena o de cohesión deja de ser secretada del de mamífero 293F células.
La Figura 34B muestra que la Ciclina de cadena completa Bl fusionado al extremo C-terminus de anticuerpo H cadena o de cohesión deja de ser secretada del de mamífero 293F células.
La Figura 35 muestra a Ciclina la estrategia de segmentación de Bl basada en regiones de dominio estructurales conocidas o pronosticadas.
La Figura 36 muestra que la Ciclina pi de segmentos de DI, p3, y p4, pero no p2 expresa para el pocilio como fusiones directas al extremo C-terminus de cadena H.
La Figura 37 muestra los niveles de expresión relativos de diversa Ciclina segmentos de DI como fusiones directas al extremo C-terminus de cadena H en diversas combinaciones con secuencias de unión flexibles.
La Figura 38 muestra resumen de diversa ciclina de la cadena ' H constructos de segmento de DI y su facilidad de expresión relativa como vacunas.
La Figura 39 muestra que la Ciclina de cadena completa DI fusionado al extremo C-terminus de un anticuerpo de acción selectiva de corriente continua H cadena es muy mal expresada para como un anticuerpo recombinante secretado.
Descripción Detallada de la Invención Mientras la elaboración y uso de diversas modalidades de la presente invención se menciona detalladamente a continuación, debe valorarse que la presente invención proporciona varios conceptos inventivos aplicables que pueden ser representados en una amplia variedad de contextos específicos. Las modalidades específicas mencionadas aquí son simplemente, ilustrativas de modos específicos de elaborar y usar la invención y no delimitan el alcance de la invención. Para facilitar la comprensión de esta invención, varios términos se definen a continuación. Los términos definidos aquí tienen significados como comúnmente entendido por una persona de la habilidad común en las áreas relevantes para la presente invención. Los términos, como "el a", un y ser no conceptualizado para referirse a sólo una entidad singular, pero incluir la clase general de la cual un ejemplo especifico se puede usar para la ilustración. La terminología aquí se utiliza describen modalidades específicas de la invención, pero su uso no delimita la invención, excepto como detallado en las reivindicaciones.
La invención también incluye variantes y otra modificación de un anticuerpo (o "Ab" ) de fragmentos de lo mismo, p.ej, proteína de fusión de anti-CD40 (el anticuerpo se usa de modo indistinto con el término " inmunoglobulina" ) . Como se utiliza aquí, el término "anticuerpos o fragmentos de lo mismo, " incluye anticuerpos completos o fragmentos de un anticuerpo, p.ej, Fv, Fab, Fab' , F(ab')2, Fe, y fragmentos de Fv monocatenarios (ScFv) o cualquier fragmento biológicamente efectivo de unas inmunoglobulinas que se une específicamente, p.ej, CD40. Los anticuerpos del origen de humano o los anticuerpos humanizados han disminuido o ninguna inmunogenicidad en humanos y tienen una cantidad inferior o ningunos epítopos inmunogénicos comparado con anticuerpos no humanos. Los anticuerpos y sus fragmentos se seleccionarán generalmente para tener un nivel reducido o ninguna antigenicidad en humanos,.
Como se utiliza aquí, los términos "Ag" o "antígeno" se refieren a una sustancia capaz de la unión a una región de unión de antigeno de una molécula de inmunoglobulina o de provocar como respuesta una respuesta inmunitaria, p.ej, una T-cél-ula - respuesta inmunitaria regulada por la presentación del antigeno en Major Histocompatibility Antigen (complejo principal de histocompatibilidad) proteínas celulares. Como se utiliza aquí, "el antígeno" incluye, entre otras cosas, determinantes antigénicas, haptenos, e inmunógenos que pueden ser péptidos, moléculas pequeñas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o combinaciones de lo mismo. El inmunólogo experto reconocerá que al mencionar de antígenos que se procesan para la presentación a linfocitos T, el término "antígeno" se refiere a aquellas porciones del antígeno (p.ej, un fragmento peptídico) que es un epítopo de linfocito T presentado por el complejo principal de histocompatibilidad al receptor de linfocito T. Cuando usado en el contexto de un linfocito B respuesta inmunitaria regulada en forma de un anticuerpo que es específico para un "antígeno", la porción del antígeno que se une con las regiones determinantes de complementariedad de los dominios variables del anticuerpo (luz y pesado) la porción unida puede ser un epítopo lineal o tridimensional. En el contexto de la presente invención, el término el antígeno se usa en ambos contextos, es decir el anticuerpo es específico para un antígeno protéico (CD40), pero también transporta uno o más epítopos peptídicos para la presentación por el complejo principal de histocompatibilidad a linfocitos T. En ciertos casos, los antigenos administrados por la vacuna o la proteína de fusión de la presente invención son interiorizados y procesados por células presentadoras de antígeno antes de 'la presentación, p.ej, por la escisión de uno o más porciones del anticuerpo o proteina de fusión.
Como se utiliza aquí, el término "péptido antigénico" se refiere a aquella porción de un antígeno polipeptídico que es reconocido específicamente por linfocitos B o por linfocitos T. Los linfocitos B responden a determinantes antigénicas ajenas vía lado a lado producción de anticuerpo, mientras que los linfocitos T son la inmunidad celular mediata. Así, los péptidos antigénicos son aquellas partes de un antígeno que son reconocidas por anticuerpos, o en el contexto de un complejo principal de histocompatibilidad, por receptores de linfocito T.
Como se utiliza aquí, el término "epítopo" se refiere a cualquier determinante protéico capaz de la unión específica a una inmunoglobulina o de presentarse por una proteína del Complejo Principal de Histocompatibilidad (CPH) (p.ej, la Clase I o la Clase II) a un receptor de linfocito T. Los determinantes epitópicos son péptidos generalmente cortos 5-30 aminoácidos de longitud que el ajuste dentro del surco de la molécula de complejo principal de histocompatibilidad que presenta ciertos grupos laterales aminoacidicos hacia el receptor de linfocito T y tiene ciertos otros residuos en el surco, p.ej, debido a características de carga específicas del surco, los grupos laterales peptídicos y el receptor de linfocito T. En términos generales, iln anticuerpo se une de manera específica a un antígeno cuando la constante de disociación es 1 mM, 100 nM o incluso 10 nM.
Como se utiliza aquí, el término "vector" se usa en dos diferentes contextos. Al usar el término "vector" en cuanto a una vacuna, un vector se utiliza describen una porción no antigénica que se utiliza directa o administre la porción antigénica de la vacuna. Por ejemplo, un anticuerpo o los fragmentos de lo mismo pueden unirse con. o formar una proteína de fusión con el antígeno que provoca como respuesta la respuesta inmunitaria. Para vacunas celulares, el vector para administración y/o presentación del antígeno es la célula presentadora de antígeno, que se administra por la célula que se carga con el antígeno. En ciertos casos, el vector celular sí mismo también puede procesar y presentar el antígeno (s) a linfocitos T y activar una respuesta inmunitaria específica para el antígeno. Cuando usado en el contexto de ácidos nucleicos, un "vector" se refiere un constructo que tiene capacidad de administración, y preferentemente expresión, uno o más genes o secuencias polinucleotídicas de interés en una célula hospedera. Los ejemplos de vectores incluyen, entre otras cosas, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucarióticas, como células de productor.
Las composiciones y métodos de la presente invención pueden usarse con una amplia variedad de péptidos y/o proteina donde el anticuerpo o el fragmento de lo mismo y el ligador peptidico o "PL" forman una proteina que es estable y/o soluble.
Como se utiliza aquí, las composiciones y métodos usan un vector de administración de antigeno que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x o Ab- (Ag-PL) x; donde Ab es un anticuerpo. o fragmento de lo mismo; PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; Ag es al menos un antigeno viral; y x es un número entero de 1 a 20. Un ejemplo de un anticuerpo para el uso con la presente invención comprende al menos la región variable de anti-CD40-12E12.3F3 (Número de acceso de ATCC PTA-9854), anti-CD40-12B4.2C10 (Depósito núm. HS446, Número de acceso de ATCC), y anti-CD40-l 1B6.1C3 (Depósito núm. HS440, Número de acceso de ATCC) .
Como se utiliza aquí, los términos "cuadra" y "inestable" cuando la referencia a proteínas se utiliza describen un péptido o proteina que mantiene su estructura tridimensional y/o actividad (cuadra) o esto pierde inmediatamente o con el tiempo su estructura tridimensional y/o actividad (inestable) . Como se utiliza aquí, el término "insoluble" se refiere a aquellas proteínas que cuando producido en una célula (p.ej, una proteína de recombinante expresada para en una célula eucariótica o procariótica o in vitro) no son solubles en la solución ausente el uso de desnaturalizar afecciones o agentes (p.ej, caliéntese o denaturants químico, respectivamente) . El anticuerpo o el fragmento de lo mismo y los ligadores mostrados aquí se descubren para convertir proteínas de fusión de anticuerpo con los péptidos de insoluble y/o inestable en proteínas que son estables y/o solubles. Otro ejemplo de la estabilidad contra la inestabilidad es cuando el dominio de la proteína con una conformación estable tiene una temperatura de fusión más elevada (Tm) que el dominio inestable de la proteína cuando cuantificado en la misma solución. Un dominio es estable comparado con otro dominio cuando la diferencia en la Tm es al menos aproximadamente 2 0 C, más preferentemente aproximadamente 4 ° C, todavía más preferentemente aproximadamente 7 ° C, aún más preferentemente aproximadamente 10 0 C, incluso más preferentemente aproximadamente 15 ° C, todavía más preferentemente aproximadamente 20 ° C, incluso todavía más preferentemente aproximadamente 25 ° C, y con mayor preferencia aproximadamente 30 ° C, cuando cuantificado en la misma solución.
Como se utiliza aquí, "polinucleotido" o "ácido nucleico" se refieren a una hebra de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en un single - o en forma bicatenaria (incluyendo análogos conocidos de nucleótidos naturales) . Una secuencia nucleoacidica bicatenaria incluirá la secuencia complementaria. La secuencia polinucleotidica puede codificar para variable y/o dominios de región constante de la inmunoglobulina que se forman en una proteina de fusión con uno o más ligadores. Para el uso con la presente invención, múltiples sitios de clonación (MCS) pueden manipularse genéticamente en las ubicaciones en el extremo carboxi terminal del pesado y/o las cadenas ligeras de los anticuerpos para permiten para en - la inserción de marco del péptido para la expresión entre los ligadores. Como se utiliza aqui, el término "aislado de polinucleotido" se refiere a un polinucleotido de genómico, ADNc, u origen sintético o alguna combinación de lo mismo. En virtud de su origen el "polinucleotido aislado" (1) no se asocia con todos o una porción de un polinucleotido donde los "polinucleótidos aislados" se encuentran en la naturaleza, (2) se liga funcionalmente a un polinucleotido al cual no es unido en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. El técnico experto reconocerá que diseñar y poner en práctica un vector que tienen la fórmula Ab-(PL-Ag)x o Ab- (Ag-PL) , puede manipularse en el nivel de ácido nucleico usando métodos conocidos en la técnica, como los mostrados en Protocolos Actuales en la Biología molecular, 2007 por John Wiley e Hijos, porciones relevantes incluidas aquí por referencia. Brevemente, Ab, Ag y PL la codificación de secuencias nucleoacídicas puede insertarse usando la reacción en cadena de la polimerasa, la inserción enzimática de oligonucleótidos o fragmentos de reacción en cadena de la polimerasa en un vector, que puede ser un vector de expresión. Para facilitar la inserción de (PL Ag) x o (Ag-PL) x en el terminal carboxi de la cadena ligera de anticuerpo, la cadena pesada, o ambos, múltiple sitio de clonación ( CS) puede manipularse genéticamente en la secuencia con las secuencias de anticuerpo.
Como se utiliza aquí, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; así, los péptidos, los oligopéptidos, y las proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Este término también no se refiere a o excluye modificaciones de expresión postales del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones , acetilaciones, fosforilaciones y ' lo similar. Incluido dentro de la definición son, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales,' etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, asi como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como artificialmente ocurrir. El término "dominio", o "dominio polipeptidico" se refiere a aquella secuencia de un polipéptido que se dobla en una región globular individual en su conformación de origen natural, y esto puede mostrar propiedades de unión o funcionales individuales.
Un polipéptido o la secuencia aminoacidica "derivada de" una secuencia nucleoacidica designada se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia aminoacidica idéntica a aquel de un polipéptido codificado en la secuencia, o una porción de lo mismo donde la porción comprende al menos 3-5 aminoácidos, preferentemente al menos 4-7 aminoácidos, más preferentemente al menos 8-10 aminoácidos, e incluso más preferentemente al menos 11-15 aminoácidos, o .que es inmunológicamente ide tificable con un polipéptido codificado en la secuencia. Esta terminología también incluye un polipéptido expresado para de una secuencia nucleoacidica designada .
Como se utiliza aquí, "el portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier material que al combinarse con una inmunoglobulina (Ig) la proteína de fusión de la presente invención permite que Ig mantenga la actividad biológica y es generalmente el no reactivo con el sistema inmunitario del paciente. Los ejemplos incluyen, entre otras cosas, a portadores farmacéuticos convencionales, como una solución de solución salina amortiguada con fosfato, agua, emulsiones, como una emulsión oleosa/hidrica , y los diversos tipos de los agentes humectantes. Los ciertos diluyentes se pueden usar con la presente invención, p.ej, para aerosol o administración parenteral, que puede ser la solución salina amortiguada con fosfato o solución salina (del 0.85 %) normal.
La invención proporciona una molécula de unión CD40 que comprende al menos un dominio variable de cadena ligera de. inmunoglobulina (VL) que comprende en la CDR de regiones hipervariables de secuencia 1L, CDR2L y CDR3L, el CDR1L que tiene la secuencia aminoacidica SASQGISNYLN (SEQ ID N0.:41) el CDR2L que tiene la secuencia aminoacidica YTSILHS (SEQ ID NO.:42) y el CDR3L que tiene la secuencia aminoacidica QQFNKLPPT (SEQ ID NO. : 3) las secuencias aminoacidicas de que se muestran en el SEQ ID NO. 37; y equivalente directo de lo mismo.
En consecuencia la invención proporciona una molécula de unión CD40. que comprende un sitio de unión al antigeno (parátopo) que comprende al menos un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) que comprende en regiones hipervariables de secuencia CDRln, CDR2H y CDR3H, el CDRln que tiene la secuencia aminoacidica GFTFSDYYMY (SEQ ID NO.: 44), el CDR2H que tiene la secuencia aminoacidica YINSGGGSTYYPDTVKG (SEQ ID NO.: 5), y el CDR3H que tiene la secuencia aminoacidica RGLPFHAMDY (SEQ ID NO.: 46), las secuencias aminoacidicas de que se muestran en el SEQ ID NO. 38; y equivalentes directos de lo mismo.
En un aspecto la invención proporciona un dominio individual molécula de unión de CD40 que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina aislada que comprende un dominio variable de cadena pesada (VL) como definido mayor a. En otro aspecto la invención proporciona un dominio individual molécula de unión de CD40 que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina aislada que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) como definido mayor a.
En otro aspecto la invención también proporciona una molécula de unión CD40 que comprende tanto pesado (VH) como cadena ligera (VL) dominios variables donde la molécula de unión CD40 comprende al menos un sitio de unión al antigeno (parátopo) que comprende: el a) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VL) que comprende en regiones hipervariables de secuencia CDRlL, CDR2L y CDR3L, el CDR1L que tiene la secuencia aminoacidica SASQGISNYLN (SEQ ID NO.: 41), el CDR2L que tiene la secuencia aminoacidica YTSILHS (SEQ ID NO.:42), y el CDR3L que tiene la secuencia aminoacidica QQFNKLPPT (SEQ ID NO.: 3), las secuencias aminoacidicas de que se muestran en SEQ ID. Núm. 1, y b) un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VH) que comprende en regiones hipervariables de secuencia CDRln, CDR2H y CDR3H, el CDRln que tiene la secuencia aminoacidica GFTFSDYY Y (SEQ ID NO.: 4), el CDR2 ' que tienen la secuencia aminoacidica YINSGGGSTYYPDTVKG (SEQ ID NO. : :45), y el CDR3n que tiene la secuencia aminoacidica RGLPFHAMDY (SEQ ID NO.:46), las secuencias aminoacidicas de que se muestran en el SEQ ID NO. 38; y equivalentes directos de lo mismo.
Al menos que se indique otra cosa, cualquier cadena polipeptidica es aquí descrita como tener una secuencia aminoacidica que comienza en el extremo N-terminal y se termina en el extremo C-terminal. Cuando el- sitio de unión al antigeno (parátopo) comprende a ambos los dominios VH y VL, éstos pueden ubicarse en la misma molécula polipeptidica o, preferentemente, cada dominio puede estar en una diferente cadena, el dominio VH es la parte de una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de lo mismo y el VL es la parte de una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento de lo mismo.
No - limitar ejemplos para antigenos apuntados con especificidad de objetivo por los anticuerpos de la presente invención incluyen, entre otras cosas: marcador de superficie celular seleccionado de CPH tipo I, CPH tipo II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD1 Ib, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerin, DECTIN-I, B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor IL-2, ICAM-I, receptor de Fcy, receptores de linfocito T, lectinas, u otros receptores celulares inmunitarios . En un ejemplo especifico, los antigenos que son apuntados con especificidad de objetivo por la porción de anticuerpo de la presente invención son específicamente expresados para por células presentadoras de antígeno, p.ej, células dendríticas, células de Langerhans, macrofagos, y linfocitos B.
Como se utiliza aquí, el término "molécula de unión de CD40" se refiere a cualquier molécula capaz de la unión al antígeno CD40 por sí solo o asociado con otras moléculas que tienen uno o más las CDR de VL y VH mostradas aquí, en algunos casos 2, 3, 4, 5, o 6 CDR. La reacción de unión puede mostrarse por métodos convencionales (ensayos cualitativos) incluyendo, por ejemplo, un bioensayo para determinar bloqueando la unión de otras moléculas a CD40 o cualquier clase de unión o ensayos de actividad (p.ej, activación, reducción o modulación de una respuesta inmunitaria) , en cuanto a un control negativo prueba donde un anticuerpo de la especificidad no relacionada -pero del mismo isotipo, . p . ej , un anti-CD25 o anticuerpo Anti-CD80, se usa.
La presente invención también puede elaborarse en un anticuerpo monocatenario que tiene los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo covalentemente unido por un ligador peptidico por lo general incluyendo de 10 a 30 aminoácidos, preferentemente de 15 a 25 aminoácidos. Por lo tanto, tal estructura no incluye la parte constante de las cadenas pesadas y ligeras y se piensa esto el pequeño separador peptidico debería ser menos antigénico que una parte constante completa. * Como se utiliza aquí, el término "quimérico de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo donde las regiones constantes dé pesado o cadenas ligeras o ambos son del origen de humano mientras los- dominios variables de ambas cadenas pesadas y ligeras son del no humano (p.ej, ratón, hámster o rata) el origen o del origen de humano, pero derivado de un diferente anticuerpo de humano.
Como se utiliza aquí, el término ''Injertado con una región determinante de complementariedad de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo donde las regiones determinantes de complementariedad hipervariables (COR) se derivan de un anticuerpo de donante, tal como un no humano (p.ej, ratón) anticuerpo o un diferente anticuerpo de humano, mientras todos o sustancialmente todas las otras partes de la inmunoglobulina (p.ej, las regiones conservadas de los dominios variables, es decir, regiones base) , se derivan de un anticuerpo de aceptador (en caso de un anticuerpo humanizado - un anticuerpo del origen de humano) . Un anticuerpo injertado con una región determinante de complementariedad puede incluir unos aminoácidos de la secuencia de donante en las regiones base, por ejemplo en las partes de las regiones base adyacentes a las regiones hipervariables .
Como se utiliza aquí, el término "de humano de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo donde la constante y regiones variables de ambos que las cadenas pesadas y ligeras son todo origen de humano, o sustancialmente idéntico a secuencias del origen de humano, no necesariamente del mismo anticuerpo e incluye anticuerpos producidos por ratones donde el ratón, hámster o inmunoglobulina de rata los genes de parte variables y constantes han sido sustituidos por sus equivalentes de humano, p.ej como se describe en términos generales en EP 0546073 Bl, Patente Estadounidense Número 5 545 806, Patente Estadounidense Número 5 569 825, Patente Estadounidense Número 5 625 126, Patente Estadounidense Número 5 633 425, Patente Estadounidense Número 5 661 016, Patente Estadounidense Número 5 770 429, EP 0 438474 Bl y EP 0 463151 Bl, porciones relevantes incluidas aqui por referencia .
La molécula de unión CD40 de la invención puede ser un anticuerpo humanizado que comprende las CDR obtenidas del anti-CD40-12E12.3F3, el anti-CD40 11B6.1C3, o el anti-CD40 12B4.2C10 anticuerpos. Un ejemplo de un anticuerpo quimérico incluye los dominios variables de ambas cadenas pesadas y ligeras son del origen de humano, por ejemplo aquellos dominios variables del anti-CD40 12E12.3F3 anticuerpo que son la parte del SEQ ID NO.: 148 y SEQ ID NO.: 149, anti-CD40 12B4.2C10 en SEQ ID NO.: 150 y SEQ ID NO.: 151 o SEQ ID NO.: 152, y/o anti-CD40 11B6.1C3, SEQ ID NO. : 153 y SEQ ID NO.: 154, o combinación de lo mismo. Los dominios de región constante preferentemente también comprenden dominios de región constante de humano adecuados, por ejemplo como se describe en "Secuencias de Proteínas del Interés Inmunológico" , Kabat E. A. y Ministerio de Sanidad Al-, estadounidense y Servicios sociales, Servicio de Salud pública, Instituto Nacional de la Salud. Las secuencias nucleoacídicas pueden encontrarse en, p.ej, SEQ ID NOS.: 8 y 9.
Las regiones hipervariables pueden asociarse con cualquier clase de regiones base, p.ej, del origen de humano. Las regiones base adecuadas se describen E. A. Kabat un marco de cadena pesada es un marco de cadena pesada, por ejemplo aquel del anticuerpo anti-CD 0-12E12.3F3 que son la parte del SEQ ID NO. : 149; anti-CD40-12B4.2C10 - SEQ ID NO.: 151 o SEQ ID NO. : 152, y/o anti-CD40-l 1B6.1C3 - SEQ ID NO.: 154, o combinación de lo mismo, p.ej, FR1L, FR2L, FR3L y regiones FR4L. En una manera similar, SEQ ID NO. 148 muestra el anti-CD40-12E12.3F3 (o los equivalentes para anti-CD40-12.B4.2C10 y anti-CD40 11B6.1C3, SEQ ID NOS.: 150 y 153, respectivamente) marco de cadena pesada que . incluye la secuencia de FRln, FR2H, FR3H y regiones FR4H. Las CDR pueden agregarse a un marco de anticuerpo de humano, como los descritos en 7 456 260, otorgado a Rybak, et al. Que muestran nuevas regiones base de cadena variables de humano y anticuerpos humanizados que comprenden las regiones base, porciones relevantes y secuencias de marco incluidas aquí por referencia. Para llevar a cabo el engraftment a un nivel genético, la presente invención también incluye las secuencias nucleoacidicas subyacentes para las regiones de VL Y VH asi como los anticuerpos completos y las versiones humanizadas de lo mismo. Las secuencias nucleoacidicas de la presente invención incluyen SEQ ID NOS.: 155 y 156, que son la luz de anticuerpo anti-CD40 y las cadenas pesadas, respectivamente, asi como aquellas secuencias nucleoacidicas que incluyen uso de codón variable para las mismas secuencias aminoacidicas y variaciones conservadoras de lo mismo que tienen 85, 90, 95 o identidad de secuencia del 100 % en el nivel nucleico o aminoacidico . Igualmente, las CDR pueden tener 85, 90, 95 o identidad de secuencia del 100 % en el nivel nucleico o aminoacidico, individualmente, en grupos o 2, 3, 4 o 5 o todos conjuntamente.
Los anticuerpos monoclónicos sensibilizados contra una proteina naturalmente descubierta en todos los humanos son por lo común desarrollados en un no - el sistema de humano p.ej en ratones, y como tal es proteínas por lo común no humanas. Como una consecuencia directa de esto, un anticuerpo xenogénico como producido por un hibridoma, cuando administrado a humanos, provoca como respuesta una respuesta inmunitaria indeseable que es predominantemente regulada por la- parte constante de la inmunoglobulina xenogénica. Los anticuerpos de Xenogeneic tienden · para provocan como respuesta una respuesta inmunitaria hospedera, así limitando el uso de tales anticuerpos como éstos no puede administrarse sobre un período prolongado de período de tiempo. Por lo tanto, es particularmente útil usar la cadena individual, el dominio individual, los anticuerpos quiméricos, injertados con una región determinante de complementariedad, o sobre todo de humano que no son probables para provocan como respuesta respuesta allogenic considerable cuando administrado a humanos. La presente invención incluye anticuerpos con cambios menores de una secuencia aminoacídica, como eliminación, adición o substitución de uno, unos cuantos o incluso varios aminoácidos que son formas simplemente alélicas de la proteína original que tienen propiedades sustancialmente idénticas.
La inhibición de la unión de CD40 a su receptor puede ser convenientemente analizada en diversos ensayos que incluyen tales ensayos se describen a continuación en el texto. Por el término "al mismo grado" se supone a que la referencia y las moléculas equivalentes muestran, en una base estadística, curvas de inhibición de unión CD40 esencialmente idénticas en uno de los ensayos referidos mayor a. Por ejemplo, el ensayo usado puede ser un ensayo de la inhibición competitiva de la unión de CD40 por las moléculas de unión de la invención.
En términos generales, el anticuerpo de humano anti-CD40 comprende al menos: (a) una cadena ligera que comprende un dominio variable que tiene una secuencia aminoacídica sustancialmente idéntica a esto mostrado en el SEQ ID NO. I comienzo con el aminoácido en posición 1 y terminarse con el aminoácido en posición 107 y la parte constante de una cadena ligera de humano; y (b) una cadena pesada que comprende un dominio variable que tiene una secuencia aminoacídica sustancialmente idéntica a esto mostrado en el SEQ ID NO. 2 y la parte constante de una cadena pesada de humano. La parte constante de una cadena pesada de humano puede ser del ??, ?2, ?3, ?4, µ, ?2, o d o tipo de ?, preferentemente del ? -tipo, mientras que la parte constante de una cadena ligera de humano puede ser del K o tipo de ? (que incluye los ??, ?2 y ?3 subtipos) pero es preferentemente del tipo de K. Las secuencias aminoacídicas de las ubicaciones generales de la variable y dominios constantes son conocidas en la técnica y generalmente siguen la nomenclatura de abat.
Una molécula de unión' CD40 de la invención puede producirse por métodos de ADN recombinante . En vista de esto, las uno o más Moléculas de ADN que codifican para la molécula de unión deben construirse, colocadas bajo secuencias de control adecuadas y transferido en un organismo hospedero adecuado para la expresión.
En una manera muy general, allí son en consecuencia proporcionados: (i) Moléculas de ADN que codifican para un dominio individual molécula de unión de CD40 de la invención, una molécula de unión de CD40 monocatenaria de la invención, un pesado o cadena ligera o fragmentos de lo mismo de una molécula de unión CD40 de la invención; y (ii) el uso de las Moléculas de ADN de la invención para la producción de una molécula de unión CD40 de la invención por métodos de recombinante.
El estado actual de la técnica es tal que el trabajador calificado en la técnica puede sintetizar las Moléculas de ADN de la invención determinada la información proporcionada aquí, es decir, las secuencias aminoacidicas de las regiones hipérvariables y las secuencias de ADN que los codifican para. Un método para construir un gen de dominio variable es por ejemplo descrito en EPA 239400, porciones relevantes incluidas aquí por referencia. Brevemente, un gen que codifica para un dominio variable de un MAb es clonado. Los segmentos de ADN que codifican para el marco y regiones hipervariables se determinan y los segmentos de ADN que codifican para las regiones hipervariables se eliminan de modo que los segmentos de ADN que codifican para las regiones base sean fusionados conjuntamente con sitios de restricción adecuados en las uniones. Los sitios de restricción pueden generarse en las posiciones adecuadas por la mutagénesis de la Molécula de ADN por procedimientos ordinarios. Los casetes de CDR sintéticos bicatenarios se preparan por la síntesis de ADN según las secuencias proporcionadas en el SEQ ID NO. 1 y 3 o 2 y 4 (aminoácido y secuencias nucléoacídicas , respectivamente). "Estos casetes a menudo son proveídos de extremos pegajosos de modo que éstos puedan ligarse en las uniones del marco.
No es necesario tener el acceso al ARNm de una líneá * celular de hibridoma productora a fin de obtener un constructo de ADN que codifica para las moléculas de unión CD40 de la invención. Por ejemplo, la solicitud de PCT WO 90/07861 proporciona instrucciones completas para la producción de un anticuerpo por métodos de ADN recombinante información determinada sólo escrita en cuanto a la secuencia nucleotídica del gen, porciones relevantes incluidas aquí por referencia. Brevemente, el método comprende la síntesis dé varios oligonucleótidos, su amplificación por el método de PCR, y su empalme para proporcionar la secuencia de ADN deseada.
Los vectores de expresión que comprenden a un promotor adecuado o genes que codifican para la cadena pesada y ligera partes constantes son disponibles al público. Así, una vez que una Molécula de ADN de la invención se prepara puede ser convenientemente transferido en un vector de expresión adecuado. Las moléculas de ADN que codifican para anticuerpos monocatenarios también . pueden prepararse por métodos convencionales, por ejemplo, como se describe en WO 88/1649. En vista de lo anterior, el ningún depósito de línea celular o hibridoma es necesario para cumplir con los criterios de suficiencia de la descripción: Por ejemplo, los primeros y segundos constructos de ADN se elaboran lo que se une específicamente a CD40. Brevemente, un primer constructo de ADN codifica para una cadena ligera o fragmento de lo mismo y comprende a) una primera parte que codifica para un dominio variable que comprende alternativamente marco y regiones hipervariables , las regiones hipervariables están en la secuencia CDR1L, CDR2L y CDR3L las secuencias aminoacídicas de que se muestran en el SEQ ID NO. 1; esta primera parte que comienza con un codón que codifica para el primer aminoácido del dominio variable y se termina con un codón que codifica para el último aminoácido del dominio variable, y b) una segunda parte que codifica para una cadena ligera parte constante o fragmento de lo mismo que comienza con un codón que codifica para el primer aminoácido de la parte constante de la cadena pesada y extremos con un codón que codifica para el último aminoácido de la parte constante o fragmento de lo mismo, seguido de un codón finalizador.
La primera parte codifica para un dominio variable que tiene una secuencia aminoacidica sustancialmente idéntica a la secuencia aminoacidica como se muestra en el SEQ ID NO. 1. Una segunda parte codifica para la parte constante de una cadena pesada de humano, más preferentemente la parte constante de la cadena ?? de humano. Esta segunda parte puede ser un fragmento de ADN del origen genómico (que comprende intrones) o un fragmento de ADNc (sin intrones) .
El segundo constructo de ADN codifica para una cadena pesada o fragmento de lo mismo y comprende a) una primera parte que codifica para un dominio variable que comprende alternativamente marco y regiones hipervariables; las regiones hipervariables son CDRln y opcionalmente CDR2H y CDR3H, las secuencias aminoacidicas de que se muestran en el SEQ ID NO. 2; esta primera parte que comienza con un codón que codifica para el primer aminoácido del dominio variable y. se termina con un codón que codifica para el último aminoácido del dominio variable, y b) una segunda parte que codifica para una cadena pesada parte constante o fragmento de lo mismo que comienza con un codón que codifica para el primer' aminoácido de la parte constante de la cadena ligera y extremos con un codón que codifica para el último aminoácido de la parte constante o fragmento de lo mismo seguido de un codón finalizador.
La primera parte codifica para un dominio variable que tiene una secuencia aminoacidica sustancialmente idéntica a la secuencia aminoacidica como se muestra en el SEQ ID NO. 2. La primera parte tiene la secuencia nucleotidica como se muestra en el SEQ ID NO. 2 comienzo con el nucleótido en posición 1 y terminarse con el nucleótido en posición 321. También preferentemente la segunda parte codifica para la parte constante de una cadena ligera de humano, más preferentemente la parte constante de la cadena de humano K.
La invención también incluye moléculas de unión CD40 donde uno o más de los residuos de CDR1L, CDR2L, CDR3L, CDRln, CDR2H o CDR3H o los marcos, por lo común sólo unos cuantos (p.ej. FR1-4L o H) , se cambian de los residuos mostrados en el SEQ ID NO. 37 y SEQ ID NO. 38/ por, p.ej, sitio mutagénesis dirigida de las secuencias de ADN correspondientes. La invención incluye las secuencias de ADN que codifican para tales moléculas de unión CD40 cambiadas. Particularmente la invención incluye unas moléculas de unión CD40 los donde uno o más residuos de CDR1 L, CDR2L y/o CDR3L se han cambiado de los residuos mostrados en el SEQ ID NO. 37 y uno o más residuos de CDRln, CDR2H y/o CDR3H se han cambiado de los residuos mostrados en el SEQ ID NO. 38.
Cada uno de los constructos de ADN se coloca bajo el control de secuencias de control adecuadas, particularmente bajo el control de un promotor adecuado. Cualquier clase del promotor se puede usar, a condición de que ella se adapte al organismo hospedero donde los constructos de ADN se transferirán para la expresión. Sin embargo, si la expresión es que ocurren en una célula de mamífero, un promotor de gen de inmunoglobulina se puede usar en linfocitos B. Las primeras y segundas partes pueden separarse por un intrón, y, un potenciador puede ser convenientemente ubicado en el intrón entre las primeras y segundas partes. La presencia de tal potenciador que es transcrito, pero no traducido, puede asistir en la transcripción eficiente. Particularmente las modalidades los primeros y segundos constructos. de ADN comprenden el potenciador de, p.ej, un gen de humano de cadena pesada.
El anticuerpo deseado puede producirse en un cultivo celular o en un animal transgénico. Un animal transgénico adecuado puede obtenerse según métodos convencionales que incluyen la inyección micro en huevos los primeros y segundos constructos de ADN colocados bajo secuencias de control adecuadas que se trasladan el tan huevos preparados en el sexo femenino pseudoembarazado adecuado y seleccionan un descendiente que expresa para el anticuerpo deseado.
La invención también proporciona un vector de expresión capaz de replicarse en una linea celular procariótica o eucariótica, que comprende al menos uno de los constructos de ADN anteriormente descritos. Cada vector de expresión que contiene un constructo de ADN es transferido luego en un organismo hospedero adecuado. Cuando los constructos de ADN son por separado insertados en dos vectores de expresión, éstos pueden transferirse por separado, es decir un tipo del vector por célula, o co-transferido, esta última posibilidad se prefiere. Un organismo hospedero adecuado puede ser una bacteria, una levadura o una linea de célula de mamífero, este éste se prefiere. Más preferentemente, la línea de célula de mamífero es del origen linfoide, p.ej, una mieloma, el hibridoma o un normal inmortalizaron la célula B-, que convenientemente no expresa para ningún anticuerpo endógeno pesado o cadena ligera.
Cuando las cadenas de anticuerpo se producen en un cultivo celular, los constructos de ADN deben insertarse primero en un vector de expresión individual o en dos vectores de expresión separados pero compatibles, la última posibilidad se prefiere. Ya que la expresión en células de mamífero se prefiere esto la secuencia codificadora de la molécula de unión CD40 está integrada en el ADN de célula hospedera dentro de un locus que permite o favorece la expresión de alto nivel de la molécula de unión CD40.
En un aspecto adicional de la invención se proporciona un proceso para el producto de una molécula de unión CD40 que comprende: (i) cultivar un organismo que es transformado con un vector de expresión como definido mayor a; y (ii) recuperación de la molécula de unión CD40 del cultivo.
De acuerdo con la presente invención se descubre esto el anti-CD40-12E12.3F3, anti-CD40 12B4.2C10 y/o anti-CD40 11B6.1C3 el anticuerpo parece tener la especificidad de unión para el epitopo antigénico de CD40 de humano. Es por lo tanto el más sorprendente que los anticuerpos a este epitopo, p.ej el anticuerpo anti-CD40-12E12.3F3 , tienen capacidad de administrar el antigeno eficazmente en células dendriticas (corrientes continuas) . Los anticuerpos, anticuerpos particularmente quiméricos e injertados con una región determinante de complementariedad y anticuerpos sobre todo de humano, que tienen la especificidad de unión para el epitopo antigénico de CD40 de humano maduro; y el uso de tales anticuerpos para la carga de antigeno de corriente continua es novedoso y se incluye dentro del alcance de la presente invención.
Para usar el anticuerpo anti-CD40 de la .presente invención para indicaciones de tratamiento, la dosis adecuada variará, por supuesto, según, por ejemplo, el anticuerpo descrito aquí para emplearse, el hospedero, el modo de administración y la naturaleza y la gravedad de la afección que se somete a tratamiento. Sin embargo, en el uso profiláctico, los resultados satisfactorios son generalmente descubiertos a dosis de aproximadamente 0.05mg hasta aproximadamente peso corporal de 10 mg. por kilogramo más por lo general de aproximadamente 0. Img hasta aproximadamente peso corporal' de 5 mg. por kilogramo. La frecuencia de dosificación para usos profilácticos estará normalmente en el intervalo de aproximadamente una vez por semana hasta aproximadamente una vez cada 3 meses, más por lo general en el intervalo de aproximadamente una vez cada 2 semanas hasta aproximadamente una vez cada 10 semanas, p.ej, una vez cada 4 a 8 semanas. El anticuerpo anti-CD40 del presente puede administrarse parenteralmente, intravenosamente, p.ej, en el antecubital u otra vena periférica, intramuscularmente, o subcutáneamente.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser elaboradas en la manera convencional, p.ej, en forma liofilizada. Para la administración inmediata esto se disuelve en un portador acuoso adecuado, por ejemplo agua estéril para la inyección o solución salina fisiológica amortiguada estéril. Si esto se considera ' deseable para constituir una solución del volumen mayor para la administración por la infusión más bien como una inyección en bolo, es ventajoso incorporar la albúmina sérica humana o la propia sangre heparinizada del paciente en solución salina en el periodo de tiempo de formulación. La presencia de un exceso de tal proteína fisiológicamente inerte previene la pérdida del anticuerpo por la adsorción en las paredes del recipiente y tubería usada con la solución de infusión. Si la albúmina se usa, una concentración adecuada abarca desde 0.5 al 4.5 % en peso de la solución salina.
Una modalidad de la presente invención proporciona un immunoconjugate que comprende un anticuerpo humanizado de la invención, p.ej, un anticuerpo anti-CD40 humanizado, unido a uno o más moléculas efectoras, antígeno (s) y/o un marcador (es) detectable. Preferentemente, la molécula efectora es una molécula terapéutica tal como, por ejemplo, uno o más péptidos que comprenden uno o más epítopos de linfocito T, una toxina, una molécula pequeña, una citocina o una quimocina, una enzima, o un radiomarcador .
Las toxinas ejemplificantes' incluyen, entre otras cosas, Pseudomonas exotoxin o toxina de difteria. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, entre otras cosas, compuestos quimioterapéuticos, como taxol, doxorubicina, etoposide, ' y bleiomycin. Las citocinas ejemplificantes incluyen, entre otras cosas, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, e IL-12, IL-17, e IL-25. Las enzimas ejemplificantes incluyen, entre otras cosas, ARNasa, ADNasas, proteasas, cinasas, y caspasas. Los radioisótopos ejemplificantes incluyen, entre otras cosas, 32P y 1251.
Como se utiliza aquí, el término "epitopo" se refiere a una molécula o sustancia capaz de estimular una respuesta inmunitaria. En un ejemplo, los epitopos incluyen entre otras cosas un polipéptido y un ácido nucleico que codifica para un polipéptido, donde la expresión del ácido nucleico en un polipéptido tiene capacidad de estimular una respuesta inmunitaria cuando el polipéptido se procesa y presentado en Major Histocompatibility Complex (complejo principal de histocompatibilidad) molécula. En términos generales, los epitopos incluyen péptidos presentados en la superficie de células no covalentemente unidas al surco de unión del complejo principal de histocompatibilidad de Clase II o Clase I, tal que éstos pueden interactuar con receptores de linfocito T y las moléculas de accesorio de linfocito T respectivas.
Procesamiento proteolitico de Antigenos. Los epitopos que se muestran por el complejo principal de histocompatibilidad en células presentadoras de antigeno son péptidos de escisión o productos de precursores de antigeno de péptido o proteina mayores. Para el complejo principal de histocompatibilidad I epitopos, los antigenos protéicos a menudo son digeridos por el residente proteasomes en la célula. La digestión proteasomal intracelular produce fragmentos peptidicos de aproximadamente 3 a 23 aminoácidos de longitud que son cargados luego en la proteina de complejo principal de histocompatibilidad. Las actividades proteoliticas adicionales dentro de la célula, o en el entorno extracelular , pueden recortar y procesar estos fragmentos adicionalmente . El procesamiento de epitopos de CPH tipo II generalmente ocurre via lado a lado proteasas intracelulares del compartimento lysosomal/endosomal . La presente invención incluye, en una modalidad, péptidos preprocesados que se fijan al anticuerpo anti-CD40 (o fragmento de lo mismo) que dirige los péptidos contra los cuales una respuesta inmunitaria potenciada es buscada directamente células presentadoras de antigeno.
Para ' identificar epitopos potencialmente efectivos como compuestos inmunogénicos, las predicciones de la unión de complejo principal de histocompatibilidad por si solo son útiles, pero a menudo insuficiente. La presente invención incluye métodos para identificar específicamente los epitopos dentro de antígenos con la mayor probabilidad para dar como resultado a la respuesta inmunitaria buscada las fuentes específicas de linfocitos T de paciente con respuesta al tratamiento y células presentadoras de antígeno.
La presente invención permite un ensayo rápido y fácil la identificación de aquellos epitopos que con la mayor probabilidad producirán la respuesta inmunitaria deseada usando propias células presentadoras de antígeno del paciente y repertorio de linfocito T. Las composiciones y métodos de la presente invención son aplicables a cualquier secuencia protéica, permitiendo al usuario identificar los epitopos que tienen capacidad de la unión al complejo principal de histocompatibilidad 'y son correctamente presentados a linfocitos T que responderán al antígeno. En consecuencia, la invención no es limitada con ninguna enfermedad o con especificidad de objetivo particular, pero en cambio abarca y epitopo (s) de complejo principal de histocompatibilidad de cualquier fuente útil.
Como se utiliza aquí, el término "chapeado" se refiere a un marco de anticuerpo humanizado en el cual los sitios de unión al antigeno (parátopos) o las CDR obtenidas de anticuerpos no humanos (p.ej, ratón, rata o hámster), se colocan en la cadena pesada y ligera de humano regiones base estructurales conservadas (FRs), por ejemplo, en una cadena ligera o polinucleótido de cadena pesada para "injertar" la especificidad del anticuerpo no humano en un marco de humano. El vector de expresión polinucleotidico o los vectores que expresan para los anticuerpos chapeados pueden ser células de mamífero transíectadas para la expresión de anticuerpos de humano de recombinante que muestran la especificidad de antígeno del anticuerpo no humano y experimentarán a modificaciones posttranslational que potenciarán su expresión, estabilidad, solubilidad, o combinaciones de lo mismo.
Antígenos Los ejemplos de antigenos virales para el uso con la-presente invención incluyen, entre otras cosas, p.ej, VIH, HCV, CMV, adenovirus, retrovirus, picornavirus , etc. Ejemplo no limitante de antigenos retroviricos, como antigenos retroviricos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) antigenos, como productos génicos de la mordaza, pol, y genes env, la proteina de Nef, transcriptasa inversa, y otros componentes de VIH; hepatitis antigenos virales, como el S, M, y proteínas L de hepatitis B virus, el antígeno pre-S de hepatitis B virus, y otra hepatitis, p.ej, hepatitis A, B, y C, componentes virales, como hepatitis C ARN viral; influenza antígenos virales, como hemaglutinina y neuraminidasa y otra influenza componentes virales; sarampión antígenos virales, como la proteína de fusión de virus de sarampión y otros componentes de virus de sarampión; rubéola antígenos virales, como proteínas el-y E2 y otros componentes de virus de rubéola; antígenos de rotaviral, como VP7sc y otros componentes rotaviral; antígenos de cytomegaloviral, como glucoproteína de envoltura B y otros componentes de antígeno cytomegaloviral; antígenos virales sincitiales respiratorios, como la proteína de fusión RSV, la proteína M2 y otros componentes de antígeno virales sincitiales respiratorios; herpes simple antígenos virales tal como inmediato temprano proteínas, glucoproteína D, y otro herpes simple componentes de antígeno virales; varicella zoster antígenos virales, como gpl, gpll, y otro varicella zoster componentes de antígeno virales; encefalitis japonesa antígenos virales, como proteínas E, -E, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A, el 80 % E, y otra encefalitis japonesa componentes de antígeno virales; rabia antígenos virales, como glucoproteína de rabia, nucleoproteina de rabia y otra rabia componentes de antígeno virales. Ver Virología Fundamental, Segunda Edición, Campos de editores, B. N. y Knipe, D. M. (Prensa de Cuervo, Nueva York, 1991) para ejemplos adicionales de antígenos virales. El al menos un antígeno viral puede ser péptidos de un adenovirus, retrovirus, picornavirus, herpesvirus, rotaviruses, hantaviruses , coronavirus, togavirus, flavirvirus, rhabdovirus, paramixovirus , ortomixovirus, bunyavirus, arenavirus, reovirus, papilomavirus, parvovirus, poxvirus, hepadnavirus, o virus espongiforme. En ciertos ejemplos específicos, no limitantes, el al menos un antígeno viral es péptidos obtenidos de al menos un de VIH, C V, hepatitis A, B, y C, influenza, sarampión, polio, viruela, rubéola; respiratorio sincitial, herpes simple, varicella zoster, Epstein-Barr, encefalitis japonesa, rabia, gripe, y/o virus del resfriado.
En un aspecto, uno o más de los péptidos antigénicos se seleccionan a partir de al menos un de: Nef (66-97): VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO.: 1); Nef (116-145) : HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEQ ID NO.: 2); Gag pl7 (17-35) : EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO.: 3) ; Gag pl7-p24 (253-284) : NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEQ ID NO. : 4); o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEQ ID NO. : 5) . En un aspecto, los péptidos de proteina de fusión se separan por uno o más ligadores seleccionados de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO. : 11) ; PTSTP ADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO. : 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. : 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO. : 14) .
Los objetivos antigénicos que pueden administrarse usando las vacunas de antigeno anti-CD40 de la presente invención incluyen genes que codifican para antigenos, como antigenos virales, antigenos bacterianos, antigenos fúngicos o antigenos parasitarios. Los patógenos incluyen trypanosomes , tenias, roundworms, helmintos, malaria. Los marcadores tumorales, como antigeno fetal o antigeno especifico a próstata, pueden ser apuntados con especificidad de objetivo en esta manera. Otros ejemplos incluyen: VIH env proteínas y hepatitis B antígeno de superficie. La administración de un vector según la presente invención con objetivos de vacunación requeriría que los antígenos asociados por el vector sean suficientemente no inmunogénicos para permitir la expresión a largo plazo del transgen, para el cual una respuesta inmunitaria potente seria deseada. En algunos casos, la vacunación de un paciente sólo puede requerirse con poca frecuencia, tal como cada año o bienalmente, y proporcionar la protección immunologic a largo plazo contra el agente infeccioso. Los ejemplos específicos de organismos, alérgenos y nucleico y secuencias de amino para usarlos en vectores y por último como antígenos con la presente invención pueden encontrarse en la Patente de EE.UU. No. 6 541 011, porciones relevantes incluidas aquí por referencia, en particular, las tablas que igualan organismos y secuencias específicas que se pueden usar con la presente invención .
Los antígenos bacterianos para el uso con las vacunas de antígeno anti-CD40 descritas aquí incluyen, entre otras cosas, p.ej, antígenos bacterianos, como toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactin, FIM2, FIM3, adenilato ciclasa y otros componentes de antígeno bacterianos pertussis; diptheria antígenos bacterianos, como toxina de diptheria o toxoide y otros componentes de antígeno bacterianos diptheria; tétanos antígenos bacterianos, como toxina ,de tétanos o toxoide y otro tétanos componentes de antígeno bacterianos; streptococcal antígenos bacterianos, como M de proteínas y otros componentes de antígeno bacterianos streptococcal; bacilos gram-negativos antígenos bacterianos, como lipopolisacáridos y otro gramo componentes de antígeno bacterianos negativos, tuberculosis de Mycobacterium antigenos bacterianos, como ácido de mycolic, proteina de choque térmico 65 (HSP65) , los 30 mayores de kDa proteina secretada, antigeno 85A y otros componentes de antigeno mycobacterial; piloros de Helicobacter componentes de antigeno bacterianos; pneumococcal antigenos bacterianos, como pneumolysin, pneumococcal polisacáridos capsulares y otros componentes de antigeno bacterianos pneumococcal; influenza de haemophilus antigenos bacterianos, como polisacáridos capsulares y otra influenza haemophilus componentes de antígeno bacterianos; ántrax antígenos bacterianos, como ántrax antígeno protector y otro ántrax componentes -de antígeno bacterianos; rickettsiae antígenos bacterianos, como rompA y otro componente de antígeno bacteriano rickettsiae. También incluido con los antígenos bacterianos descritos aquí está cualquiera otro bacteriano, mycobacterial, mycoplasmal, rickettsial, o antígenos chlamydial. Los patógenos parciales o completos también pueden ser: influenza de haemophilus; Plasmodium falciparum; neisseria meningitidis ; estreptococo pneumoniae; neisseria gonorrhoeae; serotipo de salmonela typhi; shigella; vibrio cholerae; Fiebre de Dengue; Encephalitides; Encefalitis japonesa; enfermedad de lyme; Yersinia pestis; virus de Nilo de Oeste; fiebre amarilla; tularemia; hepatitis (viral; bacteriano); RSV (virus sincitial respiratorio); HPIV 1 y HPIV 3; adenovirus; pequeña viruela; alergias y cánceres.
Los antigenos fúngicos para el uso con composiciones y métodos de la invención incluyen, entre otras cosas, p.ej, Candida componentes de antigeno fúngicos; histoplasma antigenos fúngicos, como proteina de choque térmico 60 (HSP60) y otros componentes de antigeno fúngicos histoplasma; cryptococcal antigenos fúngicos, como polisacáridos capsulares y otros componentes de antigeno fúngicos cryptococcal; coccidiodes antigenos fúngicos, como antigenos de spherule y otros componentes dé antigeno fúngicos coccidiodes; y tinea antigenos fúngicos, como trichophytin y otros componentes de antigeno fúngicos coccidiodes.
Los ejemplos de protozoal y otros antigenos parasitarios incluyen, entre otras, cosas, p.ej, antigenos de Plasmodium falciparum, como antigenos de superficie de merozoite, sporozoite antigenos de superficie, circumsporozoite antigenos, gametocyte/antigenos de superficie de gameto, J antigeno de etapa de la sangre pf 155/RESA y otros componentes de antigeno plasmodial; antigenos de toxoplasma, como COMBA-I, p30 y otros componentes de antigeno toxoplasmal; antigenos de schistosomae, 'como glutatión-S-transferasa, paramyosin, y otros componentes de antigeno schistosomal ; los leishmania especializan y otros antigenos leishmaniae, como el gp63, lipophosphoglycan y su proteína asociada y otros componentes de antígeno leishmanial; y trypanosoma cruzi antígenos, como el 75-77 antígeno kDa, el 56 antígeno kDa y otros componentes de antígeno trypanosomal.
El antígeno que puede ser apuntado con especificidad de objetivo usando las vacunas de antígeno anti-CD40 de la presente invención se seleccionará' generalmente con base en una cantidad de factores, incluyendo: la probabilidad de la incorporación, nivel de la especificidad celular inmunitaria, tipo de la célula inmunitaria apuntada con especificidad de objetivo, nivel de madurez celular inmunitaria y/o- activación y lo similar. En esta modalidad, los anticuerpos pueden ser mono - o anticuerpos biespecíficos que incluyen un dominio de unión anti-CD40 y un dominio de unión contra un segundo antígeno, p.ej, marcadores de superficie celular para células dendríticas tal como, CPH tipo I, CPH tipo II, B7-2, CD 18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR y/o Dectin'-l y lo similar; mientras en algunos casos también tiene la ausencia de CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD56, y/o CD57. Los ejemplos de marcadores de superficie celular para células presentadoras de antígeno incluyen, entre otras cosas, el CPH tipo I, el CPH tipo II, CD45,¦ B7-1, B7-2, el receptor de IFN-? y el receptor IL-2, ICAM-I y/o el receptor de Fcy. Los ejemplos de marcadores de superficie celular para linfocitos T incluyen, entre otras cosas, CD3, CD4, CD8, CD 14, CD20, CD1 Ib, CD16, CD45 y HLA-DOCTOR .
Los antigenos con especificidad de objetivo en superficies celulares para la administración incluyen los característicos , de antígenos tumorales por lo común se derivarán de la superficie celular, citoplasma, núcleo, organelos y lo similar de células del tejido tumoral. Los ejemplos de objetivos tumorales para la porción de anticuerpo de la presente invención incluyen, entre otras cosas, cánceres hematológicos, como leucemias y linfomas, tumores neurológicos , como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales tal como gástricos o cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer pancreático, tumores genitourinarios tal cerviz, útero, cáncer ovárico, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer del pene, tumores óseos, tumores vasculares, o cánceres del labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, recto, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmón y bronquio, vejiga, riñon, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple y leucemia.
Los ejemplos de antígenos que pueden administrarse por sí solo o combinados a células inmunitarias para · la presentación de antígeno usando la presente invención incluyen proteínas tumorales, p.ej, mutó oncogenes; proteínas virales asociadas con tumores; y mucina tumoral y glycolipids. Los antígenos pueden ser proteínas virales asociadas con tumores sería aquellos de las clases de virus observados mayor a. Los ciertos antígenos pueden ser característicos de tumores (un subconjunto que son proteínas no por lo general expresadas para por una célula precursora tumoral), o puede ser una proteína que es normalmente expresada para en una célula precursora tumoral, pero que tiene una característica de mutación de tumor. Otros antígenos incluyen la variante (s) de mutante de la proteína normal que tiene una actividad alterada o distribución subcelular, p.ej, mutaciones de genes dar origen a antígenos tumorales.
Los ejemplos no limitantes específicos de antígenos tumorales para usarlos en una vacuna protéica anti-CD40-fusion incluyen, p.ej, CEA, antígeno específico a próstata (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 y 12, MUC (Mucina) (p.ej, MUC-I, MUC-2, etc.), GM2 y gangliósidos GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antígeno de melanoma) , Pmel 17 (gplOO), intrón de GnT-V V secuencia (Intrón V de secuencia V de la N-acetilglucoaminiltransferasa) , . Próstata Ca psm, PRAME (antígeno de melanoma) , ß - catenin, MUM-I-B (melanoma producto de gen mutado ubicuo) , GAGE (antígeno de melanoma) 1, MAGE, BAGE (antígeno de melanoma) 2-10, C-ERB2 (Her2/neu) , DAGE, EBNA (Antigeno nuclear del virus Epstein-Barr ) 1-6, gp75, virus de papiloma de humano (HPV) E6 y E7, p53, proteina de resistencia pulmonar (LRP) , Bcl-2, Ki-67, Ciclina Bl gplOO, Survivin, y NYESO-I Además, . la molécula inmunogénica puede ser un autoantigeno implicado en la iniciación y/o la propagación de una enfermedad aütoinmunitaria, la patología de que es en gran parte debido a la actividad de anticuerpos específicos para una molécula expresada para por el órgano objetivo relevante, tejido, o células, p.ej, SLE ormg. En tales enfermedades, esto puede ser deseable para dirigir un en curso regulado por el anticuerpo (es decir, un Th2-tipo) respuesta inmunitaria al autoantigeno relevante hacia un celular (es decir, un Thl-tipo) respuesta inmunitaria. Alternativamente, esto puede ser deseable para prevenir el inicio de o disminuir el nivel de respuesta Th2 al autoantigeno en un paciente que no hace tiene, pero quién se sospecha de ser susceptible a, la enfermedad aütoinmunitaria relevante induciendo profilácticamente respuesta de Thl al autoantigeno adecuado. Los autoantígenos de interés incluyen, entre otras cosas: (a) con respecto a SLE, la proteína de Smith, ribonucleoproteína de RNP, y el SS-A y proteínas SS-B; y (b) con respeto tomg, el receptor de acetilcolina . Los ejemplos de otros antígenos diversos implicados- en uno o más tipos de respuesta aütoinmunitaria incluyen,, p.ej, hormonas endógenas, como hormona luteinizante, hormona estimulante folicular, testosterona, hormona del crecimiento, prolactina, y otras hormonas.
Los antigenos implicados en enfermedades autoinmunitarias, alergia, y rechazo de injerto pueden usarse en las composiciones y métodos de la invención. Por ejemplo, un antigeno implicado en cualquiera o más de las enfermedades o trastornos autoinmunitarias que siguen puede usarse en la presente invención: la diabetes, la diabetes mellitus, la artritis (incluyendo la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, la osteoartritis , la artritis psoriatica) , esclerosis múltiple, miastenia grave, lupus sistémico erythematosis , tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo la dermatitis a'tópica y la dermatitis eczematous), psoriasis, Síndrome de Sjogren, incluyendo queratoconjuntivitis sicca secundario al Síndrome de Sjogren, alopecia areata,- respuestas alérgicas debido a artrópodo muerden reacciones, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerativa, asma, asma alérgica, lupus eritematoso cutáneo, escleroderma, vaginitis, proctitis, erupciones de fármaco, reacciones de reversión de lepra, ertitema nodosa leprosum, uveitis autoinmunitaria, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, sensorineural progresivo bilateral idiopático audiencia de la pérdida, anemia aplástica, anemia eritrocítica pura, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens-Johnson, sprue idiopático, liquen planus, la enfermedad de Crohn, Tumbas ophthalmopathy, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis fibrosis pulmonar posterior, e intersticial. Los ejemplos de antígenos implicados en la enfermedad autoinmunitaria incluyen el ácido glutámico descarboxilasa 65 (GAD 65) , ADN de origen natural, proteína básica mielínica, proteína proteolipídica mielínica, componentes de receptor de acetilcolina, tiroglobulina, y la hormona estimulante de la tiroides (TSH) receptor.
Los ejemplos de antígenos implicados en la alergia incluyen antígenos de polen, como antígenos de polen de cedro japoneses, antígenos de polen de ambrosía, antígenos de polen de hierba de centeno, animal antígenos derivados, como antígenos de ácaro de polvo y antígenos felinos, histocompatiblity antígenos, y penicilina y otros fármacos terapéuticos. ' Los ejemplos de antígenos implicados en el rechazo de injerto incluyen componentes antigénicos del injerto para ser trasplantado en el receptor de injerto, como corazón, pulmón, hígado, páncreas, riñon, y componentes de injerto de los nervios. El antígeno puede ser un ligando peptídico alterado útil en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.
Esto se valorará por expertos en la técnica que la secuencia de cualquier molécula efectora protéica puede ser alterada en una manera que no afecta sustancialmente las ventajas funcionales de la proteina efector. Por ejemplo, se considera por lo común que glicina y la alanina es intercambiable como son el ácido aspártico y el ácido glutámico y la asparagina y glutamina. El experto en la técnica reconocerá que muchas diferentes variaciones de secuencias efectores codificarán para efectores con aproximadamente la misma actividad que el natural efector. La molécula efectora y el anticuerpo pueden ser conjugados por el químico o por medios de recombinante como se describe anteriormente. Las modificaciones químicas incluyen, por ejemplo, derivitization para la unión de la molécula efectora y el anticuerpo entre sí, directamente o a través de un compuesto conectador, por métodos que son conocidos en la técnica de la química protéica. Tanto los medios de unión covalentes como no covalentes se pueden usar con los anticuerpos humanizados de la presente invención.
El procedimiento de unir una molécula efectora a un anticuerpo variará según la estructura química de la porción para fijarse al anticuerpo. Los polipéptidos por lo común contienen una variedad de grupos funcionales; p.ej, ácido carboxílico (COOH) , amina libre (-NH2) o sulfhidrilo (-SH) grupos, que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en un anticuerpo para dar como resultado la unión de la molécula efectora. Alternativamente, el anticuerpo puede ser derivatizado para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales, p.ej, por la unión de cualquiera de varias moléculas ligadores, . como los disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford 111.
El ligador tiene capacidad de enlaces covalentes que forman tanto al anticuerpo como a la molécula efectora. Los ligadores adecuados son conocidos a expertos en la técnica e incluyen, entre otras cosas, ligadores de carbono de cadena recta o ramificada, ligadores de carbono heterociclicos, o ligadores peptidicos. Donde el anticuerpo y la molécula efectora son polipéptidos, los ligadores pueden unirse a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (p.ej, a través de un enlace disulfuro a la cisteina) . Sin embargo, en una modalidad preferida, los ligadores se unirán a amino de carbono alfa y los grupos carboxilo de los aminoácidos terminales.
En algunas circunstancias, se desea para liberar la molécula efectora del anticuerpo cuando el immunoconjugate ha alcanzado su sitio con especificidad de objetivo. Por lo tanto, en estas circunstancias, el immunoconj ugates comprenderá enlaces que son escindibles en los alrededores del sitio con especificidad de objetivo. La escisión del ligador para liberar la molécula efectora del anticuerpo puede ser indicada por actividad enzimática o afecciones a las cuales el immunoconjugate se somete dentro la célula con especificidad de objetivo o en los alrededores del sitio con especificidad de objetivo. Cuando el sitio con especificidad de objetivo es tumor, un ligador que es escindible bajo condiciones presenta con el sitio tumoral (p.ej al ser expuesto a enzimas asociadas por tumor o pH ácido) se pueden usar.
Las modificaciones químicas ejemplificantes de la molécula efectora y el anticuerpo de la presente invención también incluyen derivitization con el polietilenglicol (PEG) para extender el período de tiempo de la residencia en el sistema circulatorio y reducir inmunogenicidad, según conocidos métodos (Ver por ejemplo, Lisi, et al., Biochem aplicado. 4: 19 (1982); Beauchamp, et al., Biochem anal. 131:25 (1982); y Goodson, et al., Bio / Tecnología 8:343 (1990) ) .
La presente invención contempla vacunas para usarlos tanto en modalidades de inmunización activas como en pasivas. Las composiciones inmunogénicas, propuestas para ser adecuadas para el uso como una vacuna, pueden prepararse el más fácilmente directamente del linfocito T inmunogénico péptidos estimulantes preparados en una manera descrita aquí. El material de vacunación final se dializa exhaustivamente para eliminar pequeñas moléculas de peso molecular indeseadas y/o liofilizado para la formulación más lista en un vehículo deseado. En la cierta modalidad .de la presente invención, las composiciones y métodos de la presente invención se utilizan elaboran una vacuna celular, p.ej, la porción de unión de anti-CD40 que administra el antígeno del anticuerpo se utiliza directa el antígeno (s) a una célula presentadora de antígeno, que luego "carga" el antígeno en proteínas de complejo principal de histocompatibilidad para la presentación. La vacuna celular es, por lo tanto, la célula presentadora de antígeno que se ha cargado usando las composiciones de la presente invención para generar células presentadoras de antígeno cargadas por el antígeno.
Cuando la vacuna es la proteína de unión anti-CD40 sí mismo, p.ej, un anticuerpo completo o fragmentos de lo mismo, luego estos "ingredientes activos" pueden elaborarse en vacunas usando métodos entendidos en la técnica, p.ej, Patentes Estadounidenses Núms. 4 608 251; 4 601 903; 4 599 231; 4 599 230; y 4.578,770, porciones relevantes incluidas aquí por referencia. Por lo común, tales vacunas se preparan como productos inyectables, p.ej, como soluciones o suspensiones líquidas o formas sólidas adecuadas para la nueva suspensión en el líquido antes de la inyección. La preparación también puede ser emulsionada. El ingrediente inmunogénico activo a menudo es mezclado con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, el agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o lo similar y combinaciones de lo mismo. Además, de ser deseado, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, como humectación o agentes emulsionantes, agentes amortiguadores de pH, o adyuvantes que potencian la eficacia de las vacunas.
Las vacunas se administran en una manera compatible con la formulación de dosis, y en tal cantidad como será terapéuticamente efectivo e inmunogénico . La cantidad para administrarse depende del sujeto para someterse a tratamiento, incluyendo, p.ej, la capacidad del sistema inmunitario del paciente de generar una respuesta inmunitaria. Las cantidades precisas de células o ingrediente activo requerido para administrarse dependen del juicio del practicante. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuados son del orden de unos miles de células (a millones de células) para vacunas celulares. Para epitopo convencional o vacunas de administración de epitopo luego la vacuna puede ser el ingrediente activo de vario cientos de microgramos por vacunación. Los regímenes adecuados para administración inicial y tiros de elevador de voltaje también son la' variable, pero son tipificados por una administración inicial seguida de inoculaciones subsecuentes u otras administraciones.
La manera de solicitud puede variar extensamente, sin embargo, las ciertas modalidades aquí se administrarán con la mayor probabilidad intravenosamente o con el sitio de tumor o infección directamente. No obstante, cualquier de los métodos convencionales para la administración de una vacuna es aplicable. La dosis de la vacuna dependerá de la ruta de administración y variará según el tamaño del hospedero.
En muchos casos, esto será deseable para tener múltiples administraciones de la vacuna, p.ej, cuatro a seis vacunaciones semanal proporcionado o cada dos semanas. Una posologia de vacunación normal a menudo ocurrirá en intervalos de dos a doce semana o de intervalos de tres a seis semana. Los elevadores de voltaje periódicos a intervalos de 1-5 años, por lo general tres años, pueden ser deseables donde se mantienen niveles protectores de la respuesta inmunitaria o mediante una probabilidad de una remisión o nueva infección. El curso de la inmunización puede examinarse con más detalle por ensayos para, p.ej, la activación de linfocito T, secreción de citocina o producción de anticuerpo ni siquiera, el más comúnmente llevaba a cabo in vitro. Estos ensayos de respuesta inmunitaria son conocidos y pueden encontrarse en una amplia variedad de patentes y como mostrado aquí.
La vacuna de la presente invención puede proporcionarse en uno o más "dosis unitarias" según si los vectores de ácido nucleico se usan, las proteínas purificadas finales, o forma de vacuna final se usa. La dosis unitaria se define como conteniendo una cantidad predeterminada de la composición terapéutica calculada para producir respuestas deseadas conjuntamente con su administración, es decir, la ruta adecuada y programa de tratamiento. La cantidad para administrarse, y la ruta particular y formulación, se incluye dentro de la habilidad de aquellos en las técnicas clínicas. El sujeto para someterse a tratamiento también puede ser evaluado, en particular, el estado del sistema inmunitario del paciente y la protección deseada. Una dosis unitaria no tiene que administrarse como una inyección individual, pero puede incluir la infusión continua durante un período de tiempo de conjunto. La dosis unitaria de la presente invención puede describirse convenientemente en términos de ADN/kg (o proteína/ g) peso corporal, con intervalos entre aproximadamente 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.5, 1, 10, 50, 100, 1 000 o más mg./ADNS o peso corporal de proteína/kg se administra.
Igualmente, la cantidad de vacuna de antígeno anti-CD40 administrada puede variar de aproximadamente 0.2 peso corporal hasta aproximadamente de 8.0 mg./kgs. Así, particularmente las modalidades, 0.4mg, 0.5mg, 0.8mg, 1.0 mg . , 1.5 mg . , 2.0 mg . , 2.5 mg . , 3.0 mg . , 4.0 mg . , 5.0 mg . , 5.5 mg., 6.0 mg., 6.5 mg., 7.0 mg. y 7.5 mg. de la vacuna pueden administrarse a un paciente in vivo. La dosis de vacuna para administrarse depende en alto grado del peso y el estado físico, del paciente que se somete a tratamiento así como la ruta de administración y la frecuencia de tratamiento. Una composición farmacéutica que incluye un polinucleótido desnudo · preunido en un vector de administración liposomal o viral puede administrarse en cantidades abarcar desde lig al polinucleótido de 1 mg. a liq a la proteína de 100 mg. Así, las composiciones particulares pueden incluir entre aproximadamente lxg, 5µg, 10 g, 20µ?, 30µg, 40µ?, 50µ?, 60]ig, 70 9, 80µg, 100 g, 150µ?, 200µ?, 250µg, 500µ?, 600µg, 00µg, 800µg, 900µ? o 1, 000µg polinucleótido o proteína que es ligada indistintamente a lpg, 5µg, ??µ^, 20µg, 3.0 g, 40µg 50µg, 60µg, 70 g, 80µg, 100 g, 150µ?, 200µ9, 250µ?, 500µ?, 600pg, 700µ , 800µg, 900µg, 1 mg., 1.5 mg. , 5 mg., 10 mg., 20 mg., 30 mg. , 40 mg., 50 mg., 60 mg., 70 mg., 80 mg., vector de 90 mg. o de 100 mg.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser opcionalmente de manera covalente o no covalente unido a un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados para tal uso incluyen cualquier composición detectable por espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, immunochemical , métodos eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (p.ej, DYNABEADS ®) , tintes fluorescentes (p.ej, isotiocianato de fluoresceina, Texas rojo, rodamina, proteína verde fluorescente, y lo similar), radiomarcadores (p.ej, 3H, 1251, 35, 14C, o 32P) , enzimas (p.ej, peroxidasa de rábano de caballo, fosfatasa alcalina y otros comúnmente usados en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) , y marcadores colorimétricos tal como coloidales de oro o colorearon de cristal o plástico (p.ej poliestireno, polipropileno, látex, etc . ) perlas .
Los métodos de detectar tales marcadores son conocidos a expertos en la técnica. -Así, por ejemplo, los radiomarcadores pueden detectarse usando película fotográfica o mostradores de centelleo, los marcadores fluorescentes pueden detectarse usando un fotodetector para detectar la iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos son por lo común detectados proveyendo la enzima con un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima en el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan visualizando simplemente el marcador coloreado.
El anticuerpo y/o las composiciones immunoconj ugate de esta invención son particularmente útiles para la administración parenteral, como administración intravenosa o administración en una cavidad de cuerpo. Las composiciones para la administración comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo y/o immunoconj ugate disuelto en un portador farmacéuticamente aceptable, preferentemente un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos puede usarse, p.ej, solución salina amortiguada y lo similar. Estas soluciones' son estériles y generalmente sin la materia indeseable. Estas composiciones pueden ser esterilizadas por métodos de esterilización convencionales, bien conocidos. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tan requeridas para acercarse estados fisiológicos, como la regulación de pH y agentes amortiguadores, agentes de regulación de toxicidad y lo similar, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y lo similar. La concentración de proteina de fusión en estas formulaciones puede variar extensamente, y se seleccionará principalmente con base en volúmenes fluidos, viscosidades, peso corporal y lo similar de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado y las necesidades del paciente .
Asi, una composición immunoconj ugate farmacéutica común de la presente invención para la administración intravenosa seria de aproximadamente 0.1 a 10 mg. por paciente por dia. Las dosis de 0.1 hasta aproximadamente 100 mg. por paciente por dia se pueden usar. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables se conocerán o evidente para los expertos en la técnica y se describen más detalladamente en tales publicaciones como CIENCIA FARMACÉUTICA DEL REMINGTON, 19no editor, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania (1995) .
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse para tratamientos terapéuticos. En solicitudes terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que padece de una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o detener al menos parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para llevar a cabo esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva." Las cantidades efectivas para este uso dependerán mediante la gravedad de la enfermedad y el estado general de la salud del paciente. Una cantidad efectiva del compuesto es esto que proporciona el alivio subjetivo de un síntoma (s) o una mejora objetivamente identificable como observado por el clínico u otro observador calificado.
Las administraciones en forma individual o múltiple de las composiciones se administran según la dosis y frecuencia como requerido y tolerado por el paciente. Pase lo que pase, la composición debería proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de esta invención para tratar con eficacia al paciente. Preferentemente, la dosis se administra una vez, pero puede aplicarse periódicamente hasta un resultado terapéutico se logra o hasta que los efectos secundarios garanticen la interrupción de la terapia. En términos generales, la dosis es suficiente para tratar o mejorar síntomas o señales de la enfermedad sin producir la toxicidad inaceptable al paciente.
La liberación controlada las formulaciones parenterales de las composiciones immunoconjugate de la presente invención puede elaborarse como implantes, inyecciones oleosas, o como sistemas particulados. Ya que una amplia descripción general de sistemas de administración protéicos, ver: Banga, A. J. , THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION , PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., (1995) incorporado aquí por referencia. Los sistemas particulados incluyen microesferas , micropartículas , microcápsulas, nanocápsulas, nanospheres, y nanopartícul'as . Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica como un núcleo central. En microesferas e'l terapéutico es dispersado durante todo la partícula. Las partículas, las microesferas , y las microcápsulas más pequeñas que sobre ?µp? son generalmente referidas como nanopartículas, nanospheres, y nanocápsulas, respectivamente. Los tubos capilares tienen un diámetro de aproximadamente 5µp? de modo que sólo las nanopartículas se administren intravenosamente. Las micropartículas están por lo común alrededor ???µp? en el diámetro y se administran subcutáneamente o intramuscularmente .
Los polímeros pueden usarse para la liberación controlada del ión de composiciones immunoconjugate de la presente invención. Diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para usarlos en la administración del fármaco controlada se conocen · en la técnica (Langer, R. , Cuentas Chem.' Res. 26:537-542 (1993)). Por ejemplo, el copolímero en bloque, poloxámero 407 ® existen como un viscoso líquido aún móvil a bajas temperaturas, pero forman un gel semisólido a temperatura corporal, la hidroxiapatita se ha usado como un microportador para la liberación controlada de proteínas, y/o los liposomas se pueden usar para liberación controlada así como 'acción . selectiva de fármaco del lípido - fármaco encapsulado. Los diversos sistemas adicionales para la administración controlada de proteínas terapéuticas se conocen. Ver, p.ej, Patentes de EE.UU. Números 5 055 303, 5 188 837, 4 235 871, 4 501 728, 4 837 028 4 957 735 y 5 019 369, 5 055 303; 5 514 670; 5 413 797; 5 268 164; 5 004 697; 4 902 505; 5 506 206, 5 271 961; 5 254 342 y 5 534 496, porciones relevantes de cada uno de las cuales se incorporan aquí por referencia.
Entre diversos usos del immunoconjugates de la invención se incluyen una variedad de afecciones de enfermedad causadas por células humanas específicas que pueden ser eliminadas por la acción tóxica de la proteína de fusión. Por ejemplo, para anti-CD40-12E12.3F3 humanizado (Número de acceso de ATCC PTA-9854), anti-CD40-12B4.2C10 (Número de acceso de ATCC, Presentación núm. AB13-22.12B4.2C10 (HS446)), y anti-CD40 11B6.1C3 (Número de acceso de ATCC, Presentación núm. AB13-22.11B6.1C3 (HS440) ) , anticuerpos descritos aquí, una solicitud preferida para immunocon ugates es el tratamiento de células de neoplasia maligna que expresan para CD40.
En otra modalidad, esta invención proporciona kits a la administración de antigenos, p.ej, CD40 o un fragmento immunoreactive de lo mismo, conjugado o en forma de una proteína de fusión con uno o ' más linfocito T o epítopos de linfocito B. Una "muestra biológica" como se utiliza aquí es una muestra de tejido biológico o líquido que contiene el antígeno. Tales muestras incluyen, entre otras cosas, el tejido de biopsia, sangre, y células de la sangre (p.ej, leucocitos) . Preferentemente, las células son linfocitos, p.ej, células dendríticas. Las muestras biológicas ( también incluyen secciones de tejidos, como secciones congeladas incorporadas con objetivos histológicos. Una muestra biológica es por lo común obtenida · de un eucariote multicelular, preferentemente un mamífero, como rata, ratón, vaca, perro, cobayo, o conejo, y más preferentemente un primate, como un macaco, chimpancé, o humano. Con mayor preferencia, la muestra abarca desde un humano. Los anticuerpos de la invención también pueden usarse in vivo, por ejemplo, como una herramienta de diagnóstico para formación de imágenes in vivo.
Los kits comprenderán por lo común una secuencia nucleoacidica que codifica para un anticuerpo de la presente invención (o fragmento de lo mismo) con uno o más porciones de marco o múltiples sitios de clonación en el extremo carboxi terminal hacia donde las secuencias codificadoras para una o más los antigenos pueden insertarse. En algunas modalidades, el anticuerpo será un fragmento de Fv anti-CD40 humanizado, como un scFv o fragmento dsFv. Además los kits incluirán por lo común métodos de revelación de materiales educacionales del uso de un anticuerpo de la presente invención (p.ej para cargar en células dendriticas antes de la inmunización con las células dendriticas, que pueden ser células dendriticas autólogas) . Los kits también pueden incluir componentes adicionales para facilitar la solicitud particular para la cual el kit es diseñado. Asi, por ejemplo, el kit puede contener además métodos de detectar el marcador (p.ej. sustratos enzimáticos para marcadores enzimáticos, filtre conjuntos para detectar marcadores fluorescentes, marcadores secundarios adecuados, como oveja anti-mouse-HRP, o lo similar) . Los kits pueden incluir además amortiguadores y otros reactivos rutinariamente usados para la práctica de un método particular. Tales kits y contenidos adecuados son conocidos a expertos en la técnica.
En otro conjunto de usos para la invención, immunoconjugates apuntado con especificidad de objetivo por anticuerpos de la invención poderse usar para purgar células apuntadas con especificidad de objetivo de una población de células en un cultivo. Por ejemplo, si una población especifica de linfocitos T se prefiere, el immunoconjugates de la presente invención se puede usar para enriquecer a una población de linfocitos T que tienen el efecto contrario de la respuesta inmunitaria en curso. Asi, por ejemplo, las células cultivadas de un paciente que tienen cáncer puede ser purgado de células cancerígenas proveyendo al ¦ paciente con células dendríticas que son el antígeno cargado usando los anticuerpos de la invención como una porción de acción selectiva para los antigenos que activarán una respuesta inmunitaria contra cáncer, virus u otro patógeno. Igualmente, los immunoconjugates poderse usar para aumentar a la población de linfocitos T reguladores o activan la respuesta inmunitaria hacia o lejos de respuesta de linfocito T citotóxica o impulso ni siquiera respuesta de linfocito B.
Ejemplo 1: vacuna de péptidos VIH anti-CD40- Cinco 19-a largas secuencias de 32 aminoácidos se seleccionan a partir de una multiplicidad del linfocito T citotóxico (CTL) epítopos identificados en VIH-I Nef, Gag y proteínas de Env en el contexto de diferentes moléculas de CPH TIPO I. Se ha incluido en un informe respuestas CTL puede ser inducido eficazmente por vacunas de lipopéptido en ratones, en primates, y en humanos. Los cinco péptidos de VIH son modificados luego en la posición C-terrainal por (Palma) -NH2 grupo y las cinco secuencias de péptido de VIH han sido el pocilio descrito en la literatura científica [p.ej, Caracterización de una mezcla de multilipopéptidos usada como un candidato de vacuna de VIH-I (1999) Klinguer et al., Vacuna, el Tomo 18, 259-267] y en una solicitud de patente [Lipopéptidos citotóxicos que inducen el linfocito T y uso como vacunas. Gras-Masse H. et al., patente núm. EP0491628 (1992-06-24); EE.UU 5871746 (1999-02-16)] .
Una vacuna de VIH muy deseable estaría compuesto por el recombinante anticuerpo de receptor celular antidendrítico fusionado a los péptidos de VIH anteriores. La presente invención incluye composiciones y métodos para producir eficazmente vacunas de VIH y proteínas.
Las secuencias mostradas a continuación son las secuencias aminoacídicas de los cinco péptidos de VIH seleccionados y las posiciones aminoacídicas dentro de cada proteína de VIH son entre paréntesis.
Nef (66-97) es: VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEQ ID NO . : 1 ) .
Nef (116-145) es: HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEQ ID NO. : 2) .
EL Gag pl7 (17-35) es: EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEQ ID NO. : 3) .
EL Gag pl7-p24 (253-284) es: NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEQ ID NO. : 4) .
•Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEQ ID NO.: 5) La secuencia a continuación es una cadena pesada hIgG4 (H) - mordaza de VIH 17 proteina de fusión donde el Gag pl7 (17-35) región se muestra en el en negritas. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias. [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Pep-gagl7] C655 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWL AHIYWDDDKRYNPSL KSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFD VWGAGTTVTVSSAKT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVAS. (SEQ ID NO.: 6) La secuencia a continuación es una cadena H - VIH gag253 proteina de fusión donde el Gag pl7-p24 (253 - 284) región se muestra en el en negritas. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias. [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Pep-gag253] C656 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWL AHIY DDDKRYNPSL KSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFD VWGAGTTVTVSSAKT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL · VKD YFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDAS (SEQ ID NO.: 7) .
La secuencia a continuación es una cadena H - VIH nefl 16 proteina de fusión donde Nef (?16-145) región se muestra en el en negritas. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias . [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef1 16] C680 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWL AHIYWDDDKRYNPSL KSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFD VWGAGTTVTVSSAKT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD , YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV HEALHNHYTQKSL SL SLGKASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLAS (SEQ ID NO.: 8) La secuencia a continuación es una cadena H - VIH nef66 proteina de fusión donde Nef (66-97) región se muestra protegido contra en el en negritas. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias. [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef66] C679 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWL AHIYWDDDKRY PSL KSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSA KT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD YFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL -¦i SL SLGKASVGFPVTPOVPLRP TYKAAVDLSHFLKEKGGLAS. (SEQ ID NO. : 9) La secuencia a continuación es una cadena H - VIH poll58 proteina de fusión donde Pol 325-355 (RT 158 - 188) región se muestra en el en negritas. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias. [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Pep-poll58] C667 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLS IRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY NPSL KSRLTISKDTSSNQVFLKITIVOTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFD VWGAGTTVTVSSAKT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL ¦ SL SLGKASAIFQSS TKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS (SEQ ID NO.: 10) La Figura 1 muestra la afinidad de proteina A de anticuerpos recombinantes purificados fusionados a diversos péptidos de VIH (divisiones 1 a 5) secretado del transfectado 293F células, analizadas reduciendo SDS. PÁGINA y tinción Azul Brillante Coomassie. Los vectores de expresión para las cadenas H fusionadas a diversas regiones codificadoras de péptidos de VIH C-terminales son co-transfectados con la cadena ligera que hace juego (L) el plásmido en el transitorio 293F células durante tres días antes de recolectar el sobrenadante para la purificación subsecuente. La cantidad celular y la cantidad de ADN son constantes entre transfecciones . Ya que la matriz de afinidad de proteina A se usa en el exceso, el análisis SDS.PAGE define tanto la producción de producción como la integridad de cadena H de diversos constructos de vacuna. Las divisiones 1, 4 y 5 (bandas superiores) muestran que las cadenas H fusionadas directamente a VIH tienen náuseas 17, nef66 y los péptidos poll58 pueden ser secretados por el pocilio. La división 2 muestra que la cadena H fusionada directamente a VIH gag253 péptido expresa, para mal. La división 3 muestra que la cadena H fusionada directamente a VIH nef 116 péptido es no expresada en absoluto.
Sorprendentemente, se descubre esto el uso de secuencias de unión de región codificadora interpeptidicas potencialmente glucosiladas flexibles mejora la secreción de proteínas de fusión de péptidos de VIH del ANTICUERPO RECOMBINANTE intactas.
Las secuencias de unión flexibles usadas se derivan de cellulosomal que ancla scaffoldin B precursor [Bacteroides cellulosolvens ] y se han descrito por los presentes inventores en Número de Serie de Solicitud de Patente de E.U. co-pendiente 61/081,234, porciones relevantes incluidas aquí por referencia.
Las secuencias mostradas a continuación son las largas secuencias de 25 aminoácidos de las cuatro secuencias de ligador peptidico seleccionadas. Las secuencias subrayadas se pronostican sitios de glucosilación ligados a N.
Flexl es: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID- NO. : 11) Flex2 es: PTSTP ADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO.: 12) Flex3 es: TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. : 13) Flex4 es: TNGSITV AATAPTVTPTVNATP SAA (SEQ ID NO.: 14) Estas secuencias [los ligadores muestran en regiones negritas y subrayadas obtenidas de la cohesión] se derivan de los separadores de dominio inter-cohesin de la proteina bacteriana> gi | 50656899 | g IAAT79550.1 cellulosomal anclando scaffoldin B precursor [Bacteroides cellulosolvens ] : MQSPRLKRKILSVILAVCYIISSFSIQFAATPQVNIIIGSAQGIPGSTVKVPINLQNVPEI G yNNCDFT IKFDSDILDFNSVEAGDIVPLPVASFSSNNSKDnKFLFSDATQGNMPTNENGLFAVISFKI KDNAQ KGISNIKVSSYGSFSG SGKEMQSLSPTFFSGSIDVSDVSTSKLDVKVGNVEGIAGTEVNV PITFE NVPDNGrNNCNFTLSYDSNALEFLTTEAGNnPLAIADYSSYRS EGKIKFLF(SDSSQGTRS IKND GVFANIKFKIKGNAIRDTYRIDLSELGSFSSKONNNLKSIATOFLSGSVNVKDIESSVSPT TSVHP TPTSVPPTPTKSSPGNKMKIOIGDVKANOGDTVIVPITFNEVPVMGVNNCNFTLAYDKNIM EFI SADAGDIVTLP ANYSYNMPSDGLVKFLYNDQAQGAMSIKEDGTFANVKFKIKQSAAFGKY S VGIKAIGSISALSNSKLIPIESIFKDGSITVTNKPIVNIEIGKVKVKAGDKIKVP VEIKDIPSIGINNCN FTLKYNSNVLKYVSNEAGTIVPAPLANLSINKPDEGIIKLLFSDASQGGMPIKDNGIFVNL EFQA VNDANIGVYGLELDTIGAFSGISSAKMTSIEPOFNNGSIEIFNSAO PVPSNTEVQTPTNT ISVTP TNNSTPTNNSTPKPNPLYNLNVNIGEISGEAGGVIEVPIEFKNVPDFGINNCDFSVKYDKS IFEY VTYEAGSIVKDSIVNLACMENSGnNLLFNDATQSSSPIKNNGVFAKLKFKrNSNAASGTYQ G??? GYGKFSGNLNGKLTSrNPIFENGITNIGNVTVKPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGTPT VTPIY WMNVLIGNMNAAIGEEVVVPIEFKNVPPFGrNNCDFKLVYDSNALELKKVEAGDIVPEPLA NLS SNKSEGKIQFLFNDASQGSMQIENGGVFAKITFKVKSTAASGIYNIRKDSVGSFSGLIDNK MTSIG PKFTDGSIVVGTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPIATPTIKGTPTATPMYWtlNVVIGKM NAE VGGEVVVPIEFNNVPSFGrNNCDFKLVYDATALELKNVEAGDnKTPLANFSNNKSEEGKIS FLF NDASOGSMOIENGGVFAKITFKVKSTTATGVYDLRKDLVGSFSGLKDNKMTSIGAEFTNGS IT VAATAPTVTPTVNATPSAATPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATP SAATP TV PTATATPSVTIPTVTPTVTATPSD IPTVTPTATATPSAIVTTI PTATAKPIATPTI KGTPTATP MYWMNVVIGKMNAEVGGEVVVPIEFKNVPSFGrNNCDFKLVYD ATALELKNVEAGDIIKTPLA NFSNNKSEEGKISFLFNDASQGSMQIENGGVSAKITFKVKSTTAIGVYDIRKDLIGSFSGL KDSK MTSIGAEFTNGSITVATTAPTVTPTATATPSVTI PTVTPTATATPGTATPGTATPTATATP GAATP TETATPSVMIPTVTPTATATPTATATPTVKGTPTIKPVYKMN VIGRVNVVAGEEWVPVE FKN IP AIGVNNCNFVLEYD ANVLEVKKVDAGEIVPD ALINFGSN SDEGKVYFLF D ALQGRMQIA NDGIFANITFKVKSSAAAGIYNIRKDSVGAFSGLVDKLVPISAEFTDGSISVESAKSTPTA TATGT NVTPTVAATVTPTATPASTTPTATPTATSTVKGTPTATPLYSMNVIIGKVNAEASGEVVVP ¦ VEFK DVPSIGINNCNFILEYDASALELDSAEAGEIVP VPLGNFSSNNKDEGKIYFLFSDGTQGRMQIVN DGIFAKIKFKVKSTASDGTYYIRKDSVGAFSGLIEKKIIKIGAEFTDGSITVRSLTPTPTV TPNVAS PTPTKVVAEPTSNQPAGPGPITGTIPTATTTATATPTKASVATATPTATPIVVVEPTIVRP GYNKD ADLAVFISSDKSRYEESSIITYSIEYKNIGKVNATNVKIAAQIPKFTKVYDAAKGAVKGSE IV MI GNLAVGESYTKEYKVKVDSLTKSEEYTDNTVTISSDQTVDIPENITTGNDDKSTIRVMLYS NRFT PGSHSSYILGYKDKTFKPKQNVTRAEVAAMFARIMGLTVKDGAKSSYKDVSNKHWALKYIE A VTKSGIFKGYKDSTFHPNAPITRAELSTVIFNYLHLNNIAPSKVHFTDINKH AKNYIEEI YRFKL IQGYSDGSFKPNNNITRAEVVTMINR LYRGPLKVKVGSFPDVSPKYWAYGDIEEASRNHK YT RDEKDGSEILIE (SEQ ID NO.: 15) .
La secuencia a continuación es una cadena pesada (H) -VIH gagl7-nef66-nef1 16 proteína de fusión de péptidos donde la mordaza de VIH 17, nef66r nefl 16 secuencias peptídicas es negrita. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias. [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-gagl7-nef66-nef1 16] C694 es : QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWL AHIYWDDDKRYNPSL KSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSA KT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSN GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASVGFPVTPOVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLA SHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLAS (SEQ ID NO. : 16) .
La secuencia a continuación es una cadena H - VIH gagl7-nefl 16 proteina de fusión de péptidos donde la mordaza de VIH 17 y nefl 16 secuencias peptidicas [cursiva] se une vía lado a lado un separador fl [mostrado en el en negritas] . Los subrayados COMO residuos unen a secuencias. [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-gagl7-f1-nefl 16] C692 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWL AHIYWDDDKRYNPSL KSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFD V GAGTTVTVSSAKT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD L N GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSyHPTPTSVPPTPTKSSPASHTQGYFP DWQNY TPGPGVRYPLTFG LYKLAS (SEQ ID NO.: 17).
La Figura 2 muestra la afinidad de proteina A de anticuerpos recombinantes purificados fusionados a diversos péptidos de VIH (Divisiones 1 y 2) secretado del transfectado 293F células, luego analizadas reduciendo SDS.PAGE y tinción Azul Brillante Coomassie. Los vectores de expresión para las cadenas H fusionadas a diversas regiones codificadoras de péptidos de VIH C-terminales son co-transfectados con la correspondencia L el plásmido de cadena en el transitorio 293F células durante tres días antes de recolectar el sobrenadante para la purificación subsecuente. Las divisiones 1 y 2 (bandas superiores) muestran que las cadenas H fusionadas directamente a una serie de péptido de VIH de gagl7-nef66-nef1 16 pueden ser el pocilio - secretado. También el producto de cadena H que contiene una serie de péptido de VIH de la mordaza 17 y nefl 1 ó separado por el separador flexible f 1 (Corrimiento proteinico 2) también es el pocilio expresado para. Asi VIH nef 116 péptido, que es no expresado como un producto secretado cuando directamente fusionado a la cadena H por si solo, puede ser expresado para al pocilio cuando añadido en ciertos otros contextos de serie peptidicos y flexibles. Observar que la cadena H fusionada directamente a gagl7-f1-nef1 16 [82 residuos] emigran más lentos que la cadena H con gagl7-nef66-nef1 16 [89 residuos] esto sugiere que el ligador flexible fl está glucosilado, posiblemente también potenciando la producción de la mordaza secretada 17-fl-nefl 16 anticuerpo de fusión contra gagl7-nef66-nefl 16 anticuerpo de fusión.
La secuencia a continuación es una cadena H - serie de péptidos de VIH de la proteina de fusión gagl7-gag253-nef66 donde cada secuencia de péptido de VIH [protegido contra en la cursiva] se separa por un separador interpeptidico f [mostrado en el en negritas] . En este caso, un largo flex-vi (vi) ligador de 27 aminoácidos [mostrado en negritas y cursivas] derivado de cellulosomal que ancla scaffoldin B precursor [regiones de Bacteroides cellulosolvens en la cursiva negrita - subrayado] se inserta entre el extremo C-terminus de cadena H y la serie de separadores flexible por los péptidos de VIH. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias . [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-Pep-gagl7-fl-gag253-f2-nef66] C711 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWL AHIYWDDDKRYNPSL KSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFD VWGAGTTVTVSSAKT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD YFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASOTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSySF TTSVH PTPTSyPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPAOSST ITPTATPT ATPTIKGASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLAS (SEQ ID NO. : 18) .
La secuencia a continuación es una cadena H - serie de péptidos de VIH de la proteina de fusión 16-gag253 poll58-gagl7-nef66-nef1 donde las secuencias peptídicas son protegidas contra en el gris. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias. [mAnti-DCIR- 9E8-H-LV-hlgG4H-C-Pep-poll 58 -gagl7-nef66-nef116-gag253] C713 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLS IRQPSGKGLEWL AHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFD VWGAGTTVTVSSAKT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL ' VKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD L N GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASAIFOSS TKILEPFRKONPDrVIYOYMDDLYASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASV GFPVTPQVPLRP TYKAAVDLSHFLKEKGGLASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGW LYKLASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDAS (SEQ ID NO.: 19).
La Figura 3 muestra la afinidad de proteina A de anticuerpos recombinantes ' purificados fusionados a diversas series de péptido de VIH (Divisiones 1 a 5) secretado del transfectado 293F células, luego analizadas reduciendo SDS.PAGE y tinción Azul Brillante Coomassie. Los vectores de expresión para las cadenas H- fusionadas a diversas regiones codificadoras de péptidos de VIH C-terminales son co-transfectados con la correspondencia L el plásmido de cadena en el transitorio 293F células durante tres días antes de recolectar el sobrenadante para la purificación subsecuente. Las divisiones 1, 2 y 3 (bandas superiores) muestran que los 4 separadores flexibles por los péptidos de VIH fusionados a la cadena H vía lado a lado el ligador flexible dobla-vl puede ser secretado por el pocilio. Sin embargo, una serie de 4 péptidos de VIH fusionados directamente a la cadena H es no expresada en absoluto (División 4, banda superior) . También, la división 5 (banda superior) muestra que una serie de 5 péptidos de VIH fusionados directamente a la cadena H es no expresada en absoluto. Este resultado sugiere que las ciertas combinaciones y los contextos de ligadores flexibles y secuencias codificadoras de péptido de VIH pueden potenciar la secreción de proteínas de fusión de péptido de VIH del ANTICUERPO RECO BINANTE (Divisiones 1, 2 y 3) .
La secuencia a continuación es para una cadena H - serie de péptidos de VIH de gagl7-gag253-nef66-nef1 16-??1 58 proteina de fusión donde cada secuencia de péptido de VIH [protegido contra en la cursiva] se separa por un ínter -separador peptidico f [mostrado en el en negritas] . El ligador flexible, el flex-vl (vi), [mostrado en -negritas y cursivas] se insertan entre el extremo C-terminus de cadena H y la serie de separadores flexible por los péptidos de VIH. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias. [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-hIgG4H-Flex-vl-Pep-gagl7-fl-gag253-f2-nefl 16-f3-nef66-f4-poll58] C825 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLS IRQPSGKGLEWL AHIYWDDDKRYNPSL KSRLTI'SKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSA KT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV HEALHNHYTQKSL SL SLGKASOTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSySP TTSyU PTPTSYPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKR IILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPAOSST ITPTATPT AYPYIKGASHTQGYFPD WQNYTPGPG VR YPLTFG LYKL ASTVTPTATATPSAIVTTITPTATT KPAS VGFP VTPQ VPLRPMTYKAA R0LSHFLGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAA SAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS- (SEQ ID NO. : 20) La Figura 4 muestra la afinidad de proteina A de anticuerpos recombinantes purificados fusionados a diversas series peptidicas ??? (Divisiones 1 a 6) secretado del transfectado 293F células, luego analizadas reduciendo SDS.PAGE y tinción Azul Brillante Coomassie. Los vectores de expresión para las cadenas H fusionadas a diversas regiones codificadoras de péptidos ??? C-terminales son co-transíectados con la correspondencia L el plásmido de cadena en el transitorio 293F células durante tres días antes de recolectar el sobrenadante para la purificación subsecuente. Las divisiones 1, 3 y 5 (bandas superiores) muestran que la serie de 4 separadores flexibles por los péptidos ??? fusionados a la cadena H via lado a lado el ligador flexible dobla-vl puede ser secretado por el pocilio. Las divisiones 2 y 6 (bandas superiores) muestran que la serie de 5 péptidos ??? - separadores flexibles fusionados a la cadena H via lado a lado el ligador flexible dobla-vl expresos mal. Sin embargo las ciertas combinaciones y los contextos de secuencias codificadoras de péptido de VIH potencian la secreción de proteínas de fusión de péptido de VIH del ANTICUERPO RECOMBINANTE (Divisiones 3 y 4) . Así H cadena fusionada a una serie de 5 péptidos de VIH - los separadores flexibles vía lado a lado que el ligador flexible dobla-vl pueden ser expresados para al pocilio cuando añadido en ciertos otros contextos de serie peptídicos y flexibles (Corrimiento proteínico 4 ) .
La presente invención incluye composiciones y métodos para secuencias. de unión de región codificadora interpept ídicas potencialmente glucosiladas flexibles y combinaciones de tales regiones codificadoras de péptido de VIH que son particularmente favorables a la secreción eficiente de vacunas de fusión de péptido de VIH del ANTICUERPO de receptor de anticorriente continua de recombinante .
El uso de secuencias de unión de dominio interestructurales derivadas de bacterias que se degradan la celulosa como secuencias de unión de interdominio preferidas en ingeniería protéica - particularmente aquellos' con sitios de glucosilación muy pronosticados. Las propiedades deseables de estas secuencias son la flexibilidad inherente i), así facilitando la separación de dominios unidos que deberían ayudar enormemente a su plegado correcto y mantener el acceso de receptor de linfocito B a epítopos de antígeno estructuralmente dependientes; ii) glucosilación, asi ayudando a secreción y solubilidad de la proteina de fusión producida intacta, y también protegiendo de las secuencias de unión de proteasas de medio de cultivo.
Las ciertas combinaciones de regiones codificadoras de péptido de VIH favorecen la secreción y que las secuencias de unión flexibles particulares insertadas entre las secuencias codificadoras de péptido de VIH también pueden ayudar a la secreción de vacunas de serie de péptido de VIH intactas -principios que también pueden aplicarse para solucionar cuestiones similares para otros antigenos peptidicos preferidos .
[0211] Secuencias de ADN de ligador preferido y secuencias codificadoras de antigeno. La unión a codones de secuencia y codones finalizadores está en el en negritas: [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Pep-gagl7] C655 es: ¦ GCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCA CAT CGTGGCTAGCTGA (SEQ ID NO.: 21) [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef66] el C679 es: GCTAGTGTGGGCTTCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAA GGCCG CCGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTGGCTAGCTGA (SEQ ID NO. : 22) [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Pep-poll58] C667 es: GCTAGTGCCATCTTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCA GAAC CCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGACCTGTACGCTAGCTGA ( SEQ ID NO. : 23) [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-Pep-gag253] C681 es: GCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCC CACC AACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTAACCCCCCCATCCCCGTGGGCGAGATC TACAAGCGGTGGATCATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCAGCA TCCTGGACGCTAGCTGA (SEQ ID NO. : 24) [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-Flex-v 16 17-nefl de 1 mordaza de la Energía] C686 es: GCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCC CACC AACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGC AAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTGGCTAGTCACACCCAGGGCTACTTCCCCGAC TGGCAGAACTACACCCCCGGCCCCGGCGTGCGGTACCCCCTGACCTTCGGCTGGCTGTACA AGCTGGCTAGCTGA (SEQ ID NO.: 25) [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-hIgG4H-Flex-vl-Pep-gagl7-fl-gag253-f2-nefl ?ß-?-nef66-f -poll58] C825 es: GCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCC CACC AACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGC AAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTGGCTAGTAGCAGCGTGAGCCCCACCACCAGC GTGCACCCCACCCCCACCAGCGTGCCCCCCACCCCCACCAAGAGCAGCCCCGCTAGTAAC CCCCCCATCCCCGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATCATCCTGGGCCTGAACAAGATCG TGCGGATGTACAGCCCCACCAGCATCCTGGACGCTAGTCCCACCAGCACCCCCGCCGACA GCAGCACCATCACCCCCACCGCCACCCCCACCGCCACCCCCACCATCAAGGGCGCTAGTC ACACCCAGGGCTACTTCCCCGACTGGCAGAACTACACCCCCGGCCCCGGCGTGCGGTACCC CCTGACCTTCGGCTGGCTGTACAAGCTGGCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACC CCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGTGTGGGCT TCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAAGGCCGCCGTGGACCTGAG CCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTGGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGC CACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGTGCCATC TTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACCCCGACATCGTGA TCTACCAGTACATGGACGACCTGTACGCTAGCTGA. (SEQ ID O.: 26) Secuencias de ADN de ligador preferido y secuencias codificadoras de antigeno. Los codones de secuencia que se unen están en el en negritas: Nef .(66-97) es: GCTAGTGTGGGCTTCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAA GGCCG CCGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTGGCTAGC (SEQ ID NO. : 27) .
Nef (116-145) es: GCTAGTCACACCCAGGGCTACTTCCCCGACTGGCAGAACTACACCCCCGGCCCCGG CGTGC GGTACCCCCTGACCTTCGGCTGGCTGTACAAGCTGGCTAGC ( SEQ ID NO. : 28) .
ELGag pl7 (17-35) es: GCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCA CATCGTGGCTAGC (SEQ ID NO. : 29) .
ELGag pl7-p24 (253-284) es: GCTAGTAACCCCCCCATCCCCGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATCATCCTGGG CCTGA ACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCAGCATCCTGGACGCTAGC (SEQ ID NO.: 30) .
Pol 325-355 (RT 158-188) es: GCTAGTGCCATCTTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCA GAAC CCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGACCTGTACGCTAGC (SEQ ID NO. : 31) .
Flexl es : GCTAGTAGCAGCGTGAGCCCCACCACCAGCGTGCACCCCACCCCCACCAGCGTGCC CCCC ACCCCCACCAAGAGCAGCCCCGCTAGC (SEQ ID NO . : 32) .
Flex2 es: GCTAGTCCCACCAGCACCCCCGCCGACAGCAGCACCATCACCCCCACCGCCACCCC CACC GCCACCCCCACCATCAAGGGCGCTAGC ( SEQIDNO . : 33) .
Flex3 es: GCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCC CCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGC (SEQ ID NO . : 34) .
Flex4 es : GCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCAC CGTG AACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGC (SEQ ID NO.: 35) .
La presente invención incluye composiciones y métodos para ensamblar constructos que codifican para péptidos de VIH y secuencias de unión Flexibles. Los vectores de expresión de cadena H por lo común tienen un Nhe que sitúo [glctagc] anexado a la cadena H que codón de residuo C-terminal, o [para doblan - vi vectores] al codón C-terminal de la secuencia doblar-vl . Las secuencias de unión flexibles o las secuencias de péptido de VIH tienen un Spe que sitúo [a|ctagt] que precede al ligador flexible N-terminal o codón de péptido de VIH, un Nhe que sitúo añadido al ligador flexible terminal C-o codón de péptido de VIH, seguido de un codón finalizador TGA, seguido de un Eco RI sitio, seguido de un No sitúo. Tal ligador flexible o péptido de VIH Spe I - No el fragmentos I se insertan en el vector de cadena H preparado con Nhe I - No yo digestión. El Nhe I y Spe soy sitios compatibles, pero cuando ligado [glctagt] ya no es un Nhe I o Spe que sitúo. Asi Spe adicional I - No yo ligador flexible o fragmentos de péptido de VIH puede insertarse en nuevo Nhe I - No yo intervalo distal al ligador flexible inicial o péptido de VIH. De esta manera, las series de péptido de VIH y/o regiones codificadoras ligadores flexibles pueden ser añadidas al vector de expresión H región codificadora de cadena.
Ejemplo 2. Vacuna de péptidos de VIH - biología in vitro que apunta con especificidad de objetivo el antígeno La vacuna de péptidos de VIH de anti-CD40. LIP05 analiza en pacientes de VIH in vitro. Para estudiar la capacidad del anticuerpo recombinante de fusión de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 (aCD40.LIPO5 rAb) para regular la presentación de antígeno, la fusión rAb se agrega a células de la sangre de pacientes infectados por VIH y producción de citocina cuantificada forman la sangre periférica células mononucleares (PBMCs) .
La Figura 5 describe, el protocolo usado in vitro para realizar ensayos de evaluación la potencia del anticuerpo recombinante de fusión de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 (aCD40.LIPO5 rAb) para provocan como respuesta la extensión del antigeno - linfocitos T específicos en el contexto de un cultivo de PBMC. Brevemente, PBMCs (2x106 células/ml) de apheresis de pacientes de VIH se incuba con un intervalo de dosis de vacuna de péptido de VIH de aCD40. LIP05. Durante el dia 2, 100 U/ml IL-2 se agregan al cultivo y luego, los medios es refrescado cada 2 días con 100 U/ml IL-2. Durante el día 10, las células multiplicadas son desafiadas para 48 h con los largos péptidos individuales correspondiente a las 5 secuencias de péptido de VIH incluidas en la fusión de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 rAb. Luego, los sobrenadantes del cultivo son recolectados y evaluados para la producción de citocina (por los linfocitos T con el receptor de linfocito T [TCR] especificidades para secuencias peptídicas) usando el ensayo de perlas de multiplexor (Luminex) . La producción de citocina específica para el antígeno detectada en' tal ensayo, si esto depende de la presencia de la vacuna de péptido de VIH de anti-CD40. LIP05 , refleja la absorción de vacuna por células presentadoras de antígeno [APC] en el cultivo, y procesando [degradación proteolítica] y la presentación de péptidos en el complejo principal de histocompatibilidad. Los complejos de complejo principal de histocompatibilidad del antígeno son reconocidos por linfocitos T con TCR que sólo reconocen el complejo de complejo principal de histocompatibilidad del antigeno de VIH particular. En un paciente de VIH, tales células probablemente serán linfocitos T de memoria que se ampliaron en el paciente en respuesta a la infección de VIH.
Los epitopos de 5 regiones de péptido de VIH de la vacuna pueden presentarse por APCs. El Esquema de Reacción en la Figura 5 se utiliza realizan ensayos de evaluación la extensión in vitro del péptido de VIH - linfocitos T específicos en respuesta a la vacuna de péptido de anti-CD40.LIPO5. Los resultados a partir de 7 pacientes se muestran en la Figura 6 e indican que la fusión de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 rAb VIH provocado como respuesta respuestas IFNy específicas para el péptido en todos los pacientes estudiados. Así, el OÍ-CD40. La fusión de péptido de VIH de LIP05 rAb permite corrientes continuas que al presente reticulado al menos 1 o 2 diferentes péptidos de los 5 péptidos dentro de la vacuna a los linfocitos T de cada paciente. Sin embargo, el conjunto de péptidos de VIH que estimularon IFN ? producción es diferente para cada paciente - con la mayor probabilidad reflejo de diferentes grupos de linfocitos T de memoria para la especificidad de VIH.
La Figura 6A-C muestra a VIH la producción de IFND especifica para el péptido en PBMCs de pacientes de VIH incubados con diversas concentraciones de vacuna de serie de péptido de anti-CD40. LIP05. El C es el grupo control, que no recibió ninguna vacuna, y define respuesta basal del cultivo a cada péptido.
La Figura 7 es resumen de respuestas de vacuna de péptido de aCD40.LIPO5 contra las 5 regiones peptidicas de 8 pacientes de VIH. Los datos se basan en la producción de IFND especifica para el péptido. La Figura 7 muestra que respuestas especificas para el antigeno observadas en 8 pacientes de VIH. Los datos demuestran que todas las regiones de péptido de VIH en la vacuna tienen la capacidad de procesarse y presentado a linfocitos T - asumir la situación probable que respuestas a estos péptidos sólo se observarán si las células adecuadas que TCR-llevan se encuentran. Así, cada paciente tiene un espectro característico de tales células.
La vacuna de péptido de OÍC D40.L I PO5 puede evocar la proliferación de linfocitos T específicos para el antígeno capaces de secretar un amplio espectro de citocinas.
La Figura 8 muestra que la vacuna de péptido de VIH de ' aCD40.LIPO5 provoca como respuesta la extensión del péptido de VIH - linfocitos T específicos capaces de secretar múltiples citocinas - una característica deseable en una vacuna. En la Figura 8 vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 provoca como respuesta gag253, nef66, nefl 16 y respuestas específicas para el péptido po!325 caracterizadas por la producción de múltiples citocinas. Esto es el paciente A5.
Vacunación de péptido de VI H de anti-CD40. LIP05 de corrientes continuas ex vivo.
La Figura 9 muestra el protocolo para analizar la vacuna de péptido de VIH de OÍCD40.L I PO5 de su capacidad de dirigir la extensión de linfocitos T específicos para el antígeno que resultan a partir de la absorción apuntada con especificidad de objetivo por corrientes continuas y presentación de epítopos peptídicos en su complejo de complejo principal de histocompatibilidad de superficie. Brevemente, los monocitos de paciente de VIH son diferenciados en corrientes continuas por el cultivo durante 2 días con el. IFNa y GM-CSF. Las diferentes dosis vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 o' una mezcla de los 5 péptidos se agregan posteriormente para 18 h. Los linfocitos T autólogos se agregan al co-cultivo (a una proporción de 1:20) durante el día 3. Durante el día 5, 100U/ml de IL-2 se agregan al cultivo y luego, los medios es refrescado cada 2 días con 100U/ml de IL-2. Durante el día 10, las células multiplicadas son desafiadas de nuevo para 48 h con los largos péptidos individuales correspondiente a las 5 secuencias de péptido de VIH incluidas en la fusión de péptido de VIH de OÍC D40.L I PO5 rAb . Luego, los sobrenadantes del cultivo son recolectados y evaluados para la producción de citocina usando Luminex.
Las Figuras 10A-B muestran la secreción de citocina en respuesta a péptidos de VIH de cocultivos de célula de DC-T sometidos a tratamiento con diversas dosis de vacuna de péptido de VIH de aCD40. LIP05.· Esto es el paciente A10. Los resultados en el paciente A10 mostrado en la Figura 10A-B demuestran la extensión de linfocitos T específicos para el antígeno correspondiente a epítopos dentro del gagl7, gag253, y regiones de péptido de VIH pol325. En la mayor parte de casos, hay concordancia de respuestas entre vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 y vacuna non-LIP05 [la mezcla de 5 péptidos de VIH no lipidados con secuencias correspondiente a aquellos en la vacuna de péptido de VIH de CD40. LIP05] . Así, el pocilio de funciones de vacuna de péptido de VIH de CD40.LIPO5 en esto ponerse in vitro donde corrientes continuas cultivadas con eficacia proceso y presente los antígenos de VIH a linfocitos T. Esto ejemplifica' el uso de la vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 para la vacunación ex vivo, por lo cual las corrientes continuas vacunadas serían crioconservadas para la futura nueva inyección en el mismo paciente.
Vacuna de péptido de VIH de OÍCD40.L I PO5 - posible efecto inmunitario de las regiones ligadoras flexibles. Es posible que las secuencias de unión flexibles que esparcen las secuencias de péptido de VIH dentro de la vacuna de péptido de VIH de OÍCD40.LIPO5 ellos mismos contengan epitopos de linfocito T. La Figura 11 muestra que el paciente A4 no parece tener un grupo significativo de linfocitos T de memoria con especificidades a las cinco secuencias de unión flexibles dentro de la vacuna de péptido de VIH de CD40.LIPO5. En la Figura 11, PBMCs del paciente A4 sometido a tratamiento con la vacuna de péptido de VIH de CD40.LIPO5 provoca como respuesta la extensión de linfocitos T específicos para el antígeno con la especificidad a la región gag253, pero no a las secuencias de uñión flexibles. El protocolo describe en la Figura 9 se usa, con los largos péptidos ligadores flexibles correspondientes en la secuencia á las áreas negritas, los péptidos de VIH están en negritas y cursivas, mostradas en la secuencia a continuación.
La secuencia de cadena pesada de vacuna de péptido de VIH de OÍCD4'0. LIP05 mostrando regiones ligadoras flexibles en secuencias negritas, que se unen subrayadas y regiones de péptido de VIH protegidas contra en negritas y cursivas.
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRY NPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVT VSSAKT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKD TLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSNKGLPSSIEK ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASQTPT TISVTPT STPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSP TTSV HPTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSS TITPTA TPTATPTIKGASHTQGYFPD QNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLAS VTPTATATPSAIVTTI P TATTKPASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLAST GSITVAATAPTVTPTVN A TPSAAASAIFQSSM KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS . (SEQ ID NO.:36).
En la Figura 12A, el PBMCs del paciente A3 sometido a tratamiento con la vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 provoca como respuesta la extensión de linfocitos T específicos para el antígeno con especificidades al gag253,' nef66, y nefl 1 ó regiones, pero no a las secuencias de unión flexibles. El protocolo descrito en la Figura 1 se usa, con los largos péptidos ligadores flexibles correspondientes en la secuencia a las áreas negritas se muestra en la Figura 8. La Figura 12B muestra a VIH respuestas de linfocito T específicas para el antígeno evocadas del paciente de VIH A17 PBMCs incubado con 30 nM de tres diferentes vacunas de acción selectiva de corriente continua peptidicas HIV5. Las células son cultivadas durante 10 días con IL-2 y luego estimuladas con largos péptidos individuales correspondiente a las 5 secuencias de péptido de VIH abarcadas dentro de las vacunas que apuntan con especificidad de objetivo la corriente continua. Después de 1 hr brefeldin A es adicionado e incubación continuada para 5 horas adicionales antes de teñir para el análisis FACS. El FACS gráfica muestran IFN ? y CD8 que tiñe en CD3 + linfocitos T. Los circuios indican la extensión evocada por la vacuna significativa de IFN ? + células comparado con células de PBMCs cultivado sin la vacuna. Las células de CD8- son linfocitos T de CD4+. Los datos muestran que que la vacuna de anti-CD 0. HIV5pep evoca una extensión potente de nef66 (N66) - linfocitos T de CD8+ específicos que no es observado con los otros vehículos de acción selectiva de corriente continua. Éstos son datos basados en la serie de péptido de VIH LIP05. Por ejemplo el anti-CD40 H cadena es anti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-Pep-gagl7-fl-gag253-f2-nef1 16-f3-nef66-f4-poll58 ] con la secuencia: EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYP D TVKGRFTISRDNAKNTLYLQ SRLKSEDTAMYYCARRGLPFHA D YWGQGTSVTVSSAKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSS VT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE TKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSP TTSVH PTPTSVPPTPTKSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSST ITPTATPT ATPTIKGASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPT ATTK PASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSA AAS AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS (SEQ ID NO.: 37).
Las Figuras '12C-1 y c-2 son un estudio similar a esto muestran en la Figura 12B, salvo que el PBMCs es de un diferente paciente de VIH (A2) . Los datos muestran el CD4+ especifico para el antigeno y respuestas de linfocito T de CD8+ evocadas por el anti-CD40. HIV5pep, pero no las otras vacunas que apuntan con especificidad de objetivo la corriente continua, o por una mezcla de los péptidos ellos mismos .
La Figura 12D muestra que, con base en el análisis de 15 diferentes respuestas de péptidó de VIH [5 regiones peptidicas muestreadas en 3 pacientes] , la vacuna de anti-CD40.HIV5pep es claramente superior a ant i-DCIR . HIV5pep, anti-LOX-1. HIV5pep y un non-LIP05 mezclan para provocar como respuesta un amplio intervalo de VIH respuestas de CD8+ y CD4+ T específicas para el péptido.
Inmunogenicidad de las secuencias de unión flexibles es de la preocupación por el CD40. Diseño dé vacuna de péptido de VIH de LIP05. Los conjuntos de datos limitados mostrados mayor a, analizando la memoria de linfocitos T con especificidades para epítopos dentro de las secuencias de unión flexibles, sugieren que el repertorio de humano contra estas secuencias es variable. También, la capacidad de estas secuencias de cebar respuestas de novo es no analizada. Respuestas a la vacuna de péptido de VIH de aCD40.LIPO5 en monos pueden analizarse usando la presente invención. Si es necesario, los ciertos epítopos deseables menores dentro de estas regiones poderse identificar por una combinación de medios computacionales proféticos y estímulo peptídico exploran, N y luego eliminado al introducirse los cambios mutacionales que revocan la interacción TCR.
La molécula de unión anti-CD40 incluye una cadena ligera que tiene la secuencia aminoacídica que sigue (SEQ ID NO. 38) . La región variable de la cadena ligera de anticuerpo es subrayada y las CDR son en negritas (SEQ ID NOS.: 42, 43 y 44, respectivamente) .
MMSSAOFLGLLLLCFOGTRCDIOMTOTTSSLSASLGDRVTISCSASOGISNYLNWY ??? PDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCOOFNKLPPTFGG GTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALOSGNSOESVTE ODS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO. : 38) .
La molécula de unión anti-CD40 incluye una cadena pesada que tiene la secuencia que sigue. La región variable de la cadena ligera de anticuerpo es subrayada y las CDR son en negritas (SEQ ID NOS.: 45, 46 y 47, respectivamente).
MNLGLSLIFLVLVLKGVOCEVKLVESGGGLVOPGGSLKLSCATSGFTFSDYY YWVR OTPEKRLE VAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLOMSRLKSEDTAMYYCARR GLPFHAMDYWGOGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NS GALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID NO.: 39).
En un aspecto el ácido nucleico que codifica para la cadena ligera comprende el SEQ ID NO. La región variable de la secuencia nucleoacidica de cadena ligera de anticuerpo es subrayada y las CDR son en negritas.
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGAT GTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTAGGAGACAGAGTCAC CATCAGTTGCAGTGCAAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAAC CAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAATTTTACACTCAGGAGTCCCATC AAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACCATCGGCAACCTGGAACCT GAAGATATTGCCACTTACTATTGTCAGCAGTTTAATAAGCTTCCTCCGACGTTCGGTGGA GGCACCAAACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCC C AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTG AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO.: 40) .
En un aspecto el ácido nucleico que codifica para la cadena pesada comprende el SEQ ID NO.:40. La región variable de la secuencia nucleoacidica de cadena pesada de anticuerpo es subrayada y las CDR son en negritas.
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGT GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTC TCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACT CCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTA TCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTA CCTGCAAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGG GTTACCGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGC CAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACC TGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATAT GGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC TGGGTAAAGCTAGCTGA (SEQ ID NO. : 41) .
Un anticuerpo humanizado' incluye la región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) , donde las regiones base de la cadena pesada y regiones variables de cadena ligera son de un anticuerpo de humano de donante, y donde las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR) tienen al menos el 80 %, el 90 %, el 95 % o identidad más elevada a CDR1L que tiene la secuencia aminoacidica SASQGISNYLN (SEQ ID NO.:41), el CDR2L tiene la secuencia aminoacidica YTSILHS (SEQ ID NO.:42) y el CDR3L tiene la secuencia aminoacidica QQFNKLPPT (SEQ ID NO.:43); y donde las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada comprenden al menos el 80 %, el 90 %, el 95 % o identidad más elevada al CDRln, CDR2H y CDR3H, el CDRln tiene la secuencia aminoacidica GFTFSDYYMY (SEQ ID NO.: 45), el CDR2H tiene la secuencia aminoacidica YINSGGGSTYYPDTVKG (SEQ ID NO.:46), y el CDR3H tiene la secuencia aminoacidica RGLPFHAMDY (SEQ ID NO.:47). Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender un marco VL que tiene la identidad de al menos el 95 % al marco de SEQ ID NO.: 38 y un marco VH que tiene la identidad de al menos el 95 % al marco del SEQ ID NO.: 39. En otro aspecto, las secuencias de CDR de donante son de ANTI-CD40 12E12.3F3 y adicionalmente, donde el anticuerpo o el fragmento de lo mismo se unen de manera especifica a CD40.
Ejemplo 3. Antigeno especifico de próstata (PSA), Ciclina DI, MART-I, influenza nucleoproteina viral (NP) y subunidad HA1 de influenza hemaglutinina viral (H1N1, PR8) y tamiz peptidico.
Incorporación de anti-CD40 mAb. Los 1x106 IL-4DCS se incuban para 1 h en hielo con 3 globulina gamma de humano mg/ml en PBS que contiene BSA del 3 % para bloquear la no unión específica. Las células son pulsadas durante 30 minutos en hielo con Alexa 568 marcó anti-CD40 mAb (todos a 20 concentración final ng/ml en el bloque no específico) . Las células son lavadas luego y permitidas interiorizar, la superficie anticuerpos unidos durante diferentes periodos de tiempo, entre 0 y 90 · minutos, a 37°C. Incorporación que sigue, las células se lavan dos veces con PBS helado que contiene BSA del 1 % y azida de sodio del 0.05 % (PBA) y fijado en formaldehido sin metanol del 1 % helado (MFF) en PBS durante la noche a 4°C. Las células son permeablized en BSA del 3 % PBS que contiene la saponina del 0.5 % (PBAS) durante 20 minutos a 4°C, y transferido a una placa de microtitulación de polipropileno de parte inferior redonda de 96 pocilios. Después de lavarse dos veces con PBAS helado, las células se incuban para 1 h en hielo con 3 globulina gamma de humano mg/ml en PBAS. BODIPY - faloidina diluida en PBAS e incubado con células durante 1 hora en hielo. Las células son teñidas adicionalmente con TOPRO-II, como una contramancha nuclear. Los portaobjetos son procesados gráficamente en un Leica SPl microscopio confocal.
Células. Los anticuerpos monoclonicos para la tinción de superficie celular son adquiridos de BD Biosciences (CA) . Los monocitos (1 xl06/ml) de donantes sanos son cultivados en medios de Cellgenics (Francia) que contiene GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (50 ng/ml) o GM-CSF (100 ng/ml) y IFNa (500 Unidades/ml) (R&D, CA) . Para IFNDCs, las células se alimentan durante el dia 1 con el IFNa y GM-CSF. Para IL-4DCs, las mismas cantidades de citocinas son complementadas en los medios durante el día un y día tres. PBMCs es aislado de capas de Buffy usando Percoll ™ gradientes (GE la Asistencia médica, Buckinghamshire, el Reino Unido) por centrifugación de gradiente de densidad. Dar un total el CD4+ y los linfocitos T de CD8+ se purifican usando kits de StemCell (CA) .
Péptidos. 15-mers (11 traslapo aminoacídico) para el antígeno específico de próstata (PSA), Ciclina DI, MART-I, influenza nucleoproteina viral (NP) y subunidad HA1 de la influenza hemaglutinina viral (H1N1, PR8), se sintetizan (Mimotopes) .
Corrientes continuas y cocultivo de linfocito T y expresiones de citocina. 5x103 las corrientes continuas cargadas de proteínas de fusión de recombinante (anti-CD40-HA1 , Ig-HAl de control, anti-CD40-PSA, anti-CD40-Cyclin DI, anti-CD40-MART-l, anti-MARCO-MART-1, e Ig-MART-I de control) son co-cultivadas con 2x105 linfocitos T de CD4+ Marcados con CFSE durante 8 días. La proliferación se analiza cuantificando la dilución de CFSE después de células tinciones de con el anticuerpo Anti-CD4 marcado con APC.
Para cuantificar la expresión de IFN intracelular ?, los linfocitos T de CD4+ son estimulados de nuevo con 1-5 uM de péptidos indicados para el 5to en la presencia de Brefeldin A. En experimentos separados, los linfocitos T de CD4+ son estimulados de nuevo con péptidos indicados para el 36to, y luego las citocinas secretadas por linfocitos T de CD4+ se cuantifican por Luminex.
Los linfocitos T de CD8+ son co-cultivados con corrientes continuas durante 10 días en la presencia de 20 IL-2 unidades/mis y 20 unidades/ml de IL-I. Durante el día 10 del cultivo, los linfocitos T de CD8+ son teñidos con anti-CD8 y tetrámeros indicados.
Ensayo de CTL. Durante el día 10 del cultivo, un 5to 51Cr el ensayo de liberación se lleva a cabo. Células de T2 pulsadas con 51Cr primero y luego marcado por 10 uM HLA-A2 epitopo de ART-I o 1 epitopo nM de influenza MI viral. Las células de T2 sin el péptido se usan como el control. La media de muestras triplicadas se calcula, y el- porcentaje de la lisis especifica se determina mediante la utilización de la fórmula que sigue: el porcentaje de la lisis especifica = 100 x (experimental 51Cr liberación - controlan 51Cr liberación) / (máximo 51Cr liberación - control 51Cr liberación) . La liberación máxima se refiere a cuentas de objetivos en el Tritón del 2.5 % X-100.
Preparación de mAbs especifico para CD40 de humano. El receptor ectodomain . hlgG (el humano IgGIFc) y AP (fosfatasa alcalina placentaria de humano) proteínas de fusión se produce para inmunizar ratones y detectar mAbs, respectivamente. Un vector de mamífero para proteínas de fusión de humano IgFc se manipula genéticamente como se describe [J. Immunol. 163: 1973-1983 (1999)] . El vector de expresión de mamífero para ectodominio de receptor. Las proteínas de AP se generan usando el PCR para amplificar el ADNc para AP reside 133-1581 (gb|BC009647 |) al adicionar un sitio de Xho I en el marco proximal y un 6C-terminal distal Sus residuos seguidos de un codón finalizador TGA y No sitúo. Este Xho I - No el fragmento I, sustituido el IgG de humano secuencia codificadora de Fe en el vector de ectodomain . IgG anterior. Las proteínas de fusión se producen usando FreeStyle ™ 293 Sistema de expresión (Invitrogen, California) según el protocolo del fabricante (ADN plásmido total de 1 mg. con 1.3ml 293Fectin reactivo/L de la transíección) . El receptor ectodomain . hlgG se purifica por lml cromatografía de afinidad de proteína A de HiTrap (GE la Asistencia médica, California) eluido con glicina de 0.1 m, pH 2.7. Las fracciones son neutralizadas con 2M Tris, y luego dializadas contra PBS .
El ratón mAbs se genera con la tecnología convencional. Brevemente, los ratones BALB/c de seis semanas son inmunizados i.p. con 20^g del receptor ectodomain . hlgGFc proteína de fusión con el adyuvante . de Ribi, luego incrementaron con 20\ig antígeno diez días y quince días más tarde. Después de tres meses, los ratones son incrementados nuevamente tres días antes de incorporar los bazos. Tres a cuatro días después de un empuje final, los nodos de linfa de vaciado (LN) son recolectados. Los linfocitos B de bazo o células LN son fusionados con SP2/0-Ag 14 células (ÁTCC) . Los sobrenadantes de hibridoma son detectados para analizar mAbs especifico para la proteina de fusión de ectodominio de receptor comparado con el colaborador de fusión por si solo, o al ectodominio de receptor fusionado a la fosfatasa alcalina [J. Immunol. 163: 1973-1983 (1999)]. Los pocilios positivos son detectados luego en FACS usando 293F células transitoriamente transíectadas con plásmidos de expresión que codifican para ADNces de receptor de cadena completa. Los hibridomas seleccionados son la célula individual clonada y multiplicada en matraces CELLine (Integra, California) . Los sobrenadantes de hibridoma se mezclan con un volumen igual de glicina de 1.5 m, 3 M NaCl, Ix PBS, pH 7.8 (amortiguador de unión) y giraron con la resina de MabSelect (GE la Asistencia médica, California) (800µ1/5??1 sobrenadante). La resina se lava con el amortiguador de unión y eluido con glicina de 0.1 m, pH 2.7. Neutralización que sigue con 2 M Tris, los mAbs se dializan contra PBS.
Expresión y purificación de recombinante mAbs. ARN total se prepara de células de hibridoma usando el kit de RNeasy I (Qiagen, California) y usado para la síntesis de ADNc y el PCR (S ART RACE kit, BD Biosciences) usando suministró 5' cebadores y 3' cebadores específicos génicos (mlgG ?, 5 ' ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3 ' (SEQ ID NO.:48); mIgG2a, 5 ' ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt 3 ' ) (SEQ ID NO.:49) . Los productos de PCR son clonados luego (pCR2.1 TA kit, Invitrogen) y caracterizados por la secuenciación de ADN (Laboratorio de MC, California) . Usando las secuencias derivadas para el ratón pesado (H) y variable 'de cadena ligera (L) (V) - ADNces de región, los cebadores específicos se utilizan para amplificar mediante PCR el péptido de señalización y V-regiones al incorporar flanquear sitios de restricción para clonarse en vectores de expresión que codifican para el IgG de humano en dirección 3' ? o regiones IgG4H. El vector para la expresión de mV quimérico ?-hlg ? es construido amplificando residuos 401-731 (gi 163101937 |) flanqueado del Xho I y No yo sitios e insertando esto en el Xho I - No yo intervalo de pIRES2-DsRed2 (BD Biosciences) . El PCR se utiliza amplifican la región VK de mAb del codón de iniciador, añadiendo un Nhe I o Spe sitúo luego CACC, a la codificación de región (p.ej, residuo 126 de gil 76779294 |), añadiendo un sitio de Xho I distal. El fragmento de PCR es clonado luego en el Nhe I - No yo intervalo del vector anterior. El IgG de humano de control ? secuencia corresponde a gil 49257887 | residuos 26-85 y gi 121669402 | residuos 67-709. El vector de humano de control IgG4H corresponde a residuos 12-1473 de gil 19684072 | con S229P y substituciones L236E, que estabilizan una unión disulfuro y revocan la interacción de FcR residual [J. Immunol . 164: 1925-1933 (2000)], insertado -entre Bgl II y No yo sitios de pIRES2-DsRed2 al adicionar la secuencia 5 ' gctagctgattaattaa 3' en vez del codón finalizador. El PCR se utiliza amplifican el raAb VH región del codón de iniciador, añadiendo CACC luego Bgl II sitio, al residuo de codificación de región 473 de gil 19684072 | . El fragmento de PCR es clonado luego en Bgl II - Apa I intervalo del vector anterior.
Expresión y purificación de Gripe proteína de fusión de HAl . La Gripe secuencia codificadora de antígeno de HA1 es una proteína de CipA [Clostridium, thermocellum] gi | 479126 | residuos 147-160 hemaglutinina precedente ¦ [El virus de influenza A (A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) ) ] gil 126599271 | residuos 18-331 con un cambio de P321L y con 6 C-terminal Sus residuos se inserta entre el vector de cadena H Nhe I y No yo sitios para codificar para proteínas de fusión de anticuerpo-recombinante-HAl (rAb. HAl) . De forma similar, . proteínas de fusión de anticuerpo-recombinante-PSA (rAb. PSA) se codifican por insertar gil 34784812 | residuos de antígeno específico a próstata 101-832 con la secuencia proximal: GCTAGCGATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAC TTCTAGCGC (SEQ ID NOT:50) (Yo sitúan y separador de CipA) y un distal No sitúo en el mismo vector de cadena H. Las proteínas de anticuerpo recombinante se expresan y purificado como se describe anteriormente para proteínas de fusión hFc.
En algunos casos la región codificadora de antigeno rAb. y la región codificadora de cadena L correspondiente se transfieren para separar cetHS-puro UCOE vectores (Millipore, California) . El uso de vectores UCOE combinados con una, linea celular de suspensión libre sérica p'readaptada permitida rápida producción de grandes cantidades de proteina [Cytotechnology 38, 43-46 (2002).] Las células de CHO-S cultivadas en el CD-CHO con GlutaMAX y suplemento de medios HT (Invitrogen) se siembran a 5xl05ml 24to antes de la transfección en 500ml Salando matraces de Ehrlenmyer e incubado en C02 del 8 % a 125 revoluciones por minuto. Durante el día de transfección, 1.2x107 células con la viabilidad al menos el 95 % se agrega a un volumen final de 30ml en un 125ml matraz en el CD - CHO con GlutaMAX. 48µ1 de FreeStyle el reactivo de Max (Invitrogen) en 0.6ml de OptiPRO SFM (Invitrogen) se agrega con el mezclado suave a 2 g de Ver el vector de cadena ligera I-linearizado y 24 g. Ver que el vector de cadena H I-linearizado se mezcla y filtrado asépticamente en 0.6ml de OptiPRO SFM. Después de 20 minutos, el ADN - el complejo lipidico se agrega lentamente al 125ml matraz de cultivo de CHO-S con el arremolinamiento . Las células se incuban 24tas antes de añadir 30ml de una solución de medios combinada del CD-CHO con CH0-M5 (Sigma, el componente de C0363 de CHO Kit 1) conteniendo 5 g/ml de la puromicina (A.G. Científico, California), 2xGlütaMAX y 0.25xPen/Strep (Invitrogen) . A día 2, otro 5µ?/?t?1 de la puromicina se agrega directamente al cultivo y la selección se deja siguen en 10-14 días mientras seguir la viabilidad celular a partir de seis días contabiliza la transíección . La cuenta celular viable disminuida y cuando la densidad viable es ~2-3xl06/ml, las células se transfiere al medio selectivo recientemente preparado (CD CHO-S + CHO 5 con 2X GlutaMAX, 0.25xPen/Strep, 10 g/ml Puromicina) a lE6/ml. Las reservas celulares congeladas se preparan cuando viabilidad alcanzada> el 90 %. Las células se dividen en el medio selectivo cuando densidad celular 2?106/??1 excedido hasta no trepado a 4x250ml en 500ml matraces. El sobrenadante es recolectado cuando viabilidad celular el 80 % disminuido por debajo de con una densidad celular final máxima ~7xl06/ml. Los niveles de endotoxina son menor que 0.2 unidades /mi.
Expresión y purificación de recombinante Fluml y proteínas de MART-I. El PCR se utiliza amplifican el ORF de Influenza A/Puerto Rico/8 /34/ ount Sinai (H1N1) mi gen al incorporar un Nhe que sitúo distal al codón de iniciador y un No sitúo distal al codón finalizador. El fragmento digerido es clonado en el . ANIMAL-DOMÉSTICO-28B ( + ) (Novagen) , colocando theml ORF en el marco con un marcador de His6, así codificando para Su. Proteína de Fluml. Un pET28b (+) derivado que codifica para un 169 residuo N-terminal cohesin dominio de C. thermocellum (inédito) insertado entre el Neo I y Nhe yo sitios Coh expresado para. Su. Para expresión de Cohesin-Flex-hMART-1 - PeptideA-su, la secuencia: GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGA AGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCA AGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGC GGCCG (SEQ ID NO.: 51) (codificando para DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTT AELJG/G/L ?? LGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP (SEQ ID NO.: :52) - los residuos puestos en bastardilla son el péptido HLA-A2-restricted inmunodominante y los residuos subrayados que rodean el péptido son del MART-I) se inserta entre el Nhe I y sitios de Xho I del vector anterior. Las proteínas se expresan en la cepa de E. coli BL21 (DE3) (Novagen) o Expreso de T7 (NEB) , cultivado en la libra a 37°C con la selección para la resistencia de kanaraicina (40µg/ml) y agitación a 200 rondas /minuto al mediados del crecimiento de fase de log cuando 120 mg/L IPTG se agregan. Después de tres horas, las células son recolectadas por centrifugación y almacenadas a-8O0C. Las células de E. coli de cada 1 fermentación L son suspendidas de nuevo en 30ml 50 mM helados Tris, pH de EDTA de 1 mm 8.0 (amortigüe B) con 0. lml del Cóctel de inhibidor de proteasa II (Calbiochem, California) . Las células son sometidas a ultrasonido en hielo 2x 5 minutos que a se ponen 18 (Pescador Dismembrator sónico 60) con un 5 periodo de resto de minuto y luego hechas girar a 17 000 r.p.m. (Sorvall SA-600) durante 20 minutos a 4°C. Para Su. Purificación de Fluml el 50ml la fracción de sobrenadante de producto de la lisis celular se hace pasar a través de 5ml Q perlas de Sefarosa y 6.25ml 160 mM Tris, imidazol de 40 mm, 4 M el pH de NaCl 7.9 se agrega a la Sefarosa Q fluye a través de. Esto se carga a 4 ml/min en un 5ml HiTrap que quela la columna de CV cargada con de Ni ++. La proteina ligada a la columna se lava con NaPO/t de 20 mm, pH de NaCl de 300 mm 7.6 (amortigüe D) seguido de otro lavado con el pH de H3C00Na de 100 mm 4.0. La proteina unida se eluye con el pH de H3CO0Na de 100 mm 4.0. Las fracciones máximas son combinadas y cargadas a 4 ml/min en un 5ml HiTrap S columna equilibrada con el pH de H3COONa de 100 mm 5.5, y lavaron con el amortiguador de equilibrio seguido de la elución con un gradiente de 0-1 M NaCl en el pH de NaP04 de 50 mm 5.5. Alcanzar su punto máximo las fracciones que eluyen NaCl a de aproximadamente 500 mm son combinadas. Para Coh. Gripe MI. Su purificación, las células de 2 L del cultivo son Usadas como mayor que.. Después de centrifugación, 2.5ml del Tritón XI 14 se agrega al sobrenadante con la incubación en hielo para 5 minutos. Después de la incubación adicional a 25°C durante 5 minutos, el sobrenadante se separa del Tritón XI 14 siguiente centrifugación a 25°C. La extracción se repite y el sobrenadante se hace pasar a través de 5ml de perlas de Sefarosa Q y 6.25ml 160 mM Tris, imidazol de 40 mm, 4 M el pH de NaCl 7.9 se agrega a la Sefarosa Q fluye a través de. La proteina es purificada mediante luego Ni ++ cromatografía quelante como se describe anteriormente y eluido con imidazol de 0-500 inm en el amortiguador D.
La Figura 13 muestra la incorporación de anti-CD40 mAb:IL-4DC. IL-4DCs se someten a tratamiento con 500 ng/ml de anti-CD40-Alexa 568.
La Figura 14 muestra CD4 y proliferación de linfocito T CD8 por corrientes continuas apuntadas con especificidad de objetivo con anti-CD40-HAl . 5xl0e3 IFNDCs cargados de 2 ug/ml de anti-CD40-HA o Ig-HAl de control son co-cultivados con CFSE-CD4+ autólogo marcado o linfocitos T de CD8+ (2xl0e5) durante 7 días. Las células son teñidas luego luego con anti-CD4 o anticuerpos Anti-CD8. Proliferación celular se analiza cuarttificando la CFSE-dilución . La Figura 15 muestra una titulación de la proteína de fusión HA1 en el CD4+ T proliferación. Los IFNDCs (5K) cargado por proteínas de fusión son co-cultivados con linfocitos T de CD4+ Marcados con CFSE (200K) durante 7 días.
La Figura 16 muestra que IFNDCs apuntados con especificidad de ¦ objetivo con anti-CD40-HAl activan linfocitos T de CD4+ HAl-específieos . los linfocitos T de CD4+ son estimulados de nuevo con corrientes continuas cargadas de 5 uM de péptidos indicados, e IFNy luego intracelular es teñido. La Figura 17 muestra que IFNDCs apuntados con especificidad de objetivo con anti-CD40-HAl activan linfocitos T de CD4+ HAl-especificos . los linfocitos T de CD4+ son estimulados de nuevo con corrientes continuas cargadas de péptidos indicados para el 36to, y luego el sobrenadante del cultivo se analiza para cuantificar IFNy.
La Figura 18 muestra que la acción selectiva .CD40 da como resultado el cebar reticulado potenciado del ART-1 linfocitos T de CD8+ específicos. Los IFNDCs (5K/ ell) cargado por proteínas de fusión son co-cultivados con linfocitos T de CD8+ purificados durante 10 días. Las células son teñidas con anti-CD8 y tetrámero. Las células son de donantes sanos (HLA-A*0201 +) .
La Figura 19 muestra la acción selectiva CD40 da como resultado el cebar reticulado potenciado del MART-I linfocitos T de CD8+ específicos (Resumen de experimentos 8-repetidos usando células de diferentes donantes sanos) .
La Figura 20 muestra el CD8+ CTL inducidos con IFNDCs apuntado con especificidad de objetivo con antÍ-CD40-MART-1 son funcionales, los linfocitos T de CD8+ co-cultivados con IFNDCs apuntado con especificidad de objetivo con proteínas de fusión se mezclan con células T2 cargadas de 10 epítopo peptídico uM.
La Figura 21 muestra el CD8+ CTL inducidos con IFNDCs apuntado con especificidad de objetivo con anti-CD40-Fluml son funcionales, los linfocitos T de CD8+ co-cultivados con IFND'Cs apuntado con especificidad de objetivo con proteínas de fusión se mezclan con células T2 cargadas de 1.0 epitopo peptidico nM.
La Figura 22 muestra un contorno del protocolo para analizar la capacidad una vacuna compuesta de anti-CD4012E12 unido al PSA (antígeno específico a próstata) para provoca como respuesta la extensión de una población de linfocito T nal' e. Linfocitos T de CD4+ PSA-específieos correspondiente a una amplia gama de epítopos . PSA. Brevemente, las corrientes continuas derivadas por el cultivo con el IFNa y GM-CSF de monocitos de un donante sano se incuban con la vacuna. Al día siguiente, las células se colocan en el medio recién preparado y los linfocitos T de CD4+ puros del mismo donante se agregan. Varios días más tarde, los péptidos de PSA se agregan y, después de gue cuatro horas, los niveles gamma-IFN secretados en los sobrenadantes del cultivo se determinan.
La Figura 23 muestra que muchos péptidos PSA provocan potentes respuestas de producción de gamma-IFN que indican que anti-C.D4012E12 y los agentes anti-CD40 similares pueden administrar eficazmente el antígeno a corrientes continuas, dando como resultado cebar de respuestas inmunitarias contra múltiples epítopos del antígeno. Corresponderse peptídico de antígenos PSA. 5xl0e3 IFNDCs cargados de 2 ug/ml de anti-CD40-PSA son co-cultivados con linfocitos T de CD4+ autólogos purificados (2xl0e5) durante 8 días. Las células son estimuladas de nuevo luego con 5 uM de péptidos individuales derivados de PSA para el 36to. La cantidad de IFN ? se cuantifica por Luminex. Las células son de donantes sanos.
La Figura 24 muestra que las corrientes continuas apuntadas con especificidad de objetivo con anti-CD40-PSA inducen respuestas de linfocito T de CD8+ PSA-especificas . IFNDCs son apuntados con especificidad de objetivo con 1 ug mAb proteina de fusión con PSA. Los linfocitos T de CD8+ autólogos purificados son co-cultivados durante 10 días. Las células son teñidas con anti-CD8 y PSA (KLQCVDLHV) tetrámero. Las células son de un donante sano HLA-A*0201 seguro. Los resultados demuestran que anti-CD40 con eficacia administran PSA a las corrientes continuas, que por su parte provocan como respuesta la extensión de linfocitos T de CD8+ PSA-especificos . Brevemente, 5xl0e3 IFNDCs cargados de 2 ug/ml de anti-CD40-PSA son co-cultivados con linfocitos T de CD8+ autólogos purificados (2xl0e5) durante 10 días. Las células son teñidas luego con el tetrámero. Las células son del donante sano HLA-0*201 seguro.
Figura 25 un Esquema de Reacción (mantenido) y el IFN ? producción por linfocitos T de los grupos de péptidos y control para Donante 2. 5xl0e3 IFNDCs cargados de 2 ug/ml de anti-CD40-Cyclin DI son co-cultivados con linfocitos T de CD4+ autólogos purificados (2xl0e5) durante 8 días. Las células son estimuladas de nuevo luego con con 5 uM de péptidos individuales derivados · de CyclinD 1 para el 5to en la presencia de Brefeldin A. Cells son teñidos para cuantificar IFN intracelular ? expresión.
La Figura 26 muestra qu un péptido explora e IFN ? producción por linfocitos T obtenidos de los grupos de péptidos mostrados en la Figura 25 y controla para el Donante 2. 5xl0e3 IFNDCs cargados de 2 ug/ml de anti-CD40-Cyclin DI son co-cultivados con linfocitos T de CD4+ autólogos purificados (2xl0e5) durante 8 días. Las células son estimuladas de nuevo luego con con . 5 u de péptidos individuales derivados de CyclinD 1 para el 5to en la presencia de Brefeldin A. Cells son teñidos para cuantificar IFN intracelular ? expresión.
Para concluir, administrando antigenos a corrientes continuas, las células presentadoras de antigeno más potentes, vía lado a lado CD40 es un modo eficiente de inducir y activar el antigeno especifico tanto CD4 + como CD8+ inmunidad regulada por el linfocito T. Asi, las vacunas elaboradas de anti-CD40 mAb inducirán la potente inmunidad contra cáncer e infecciones.
Información peptidica: secuencias de HA1 : KANLLVLLCALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNG K LCR (SEQ ID NO. : 53) .
LKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYE ELRE (SEQ ID NO. : 54) .
QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLL WLTEKEGSYPKL NS (SEQ ID NO.:55).
YVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKV RD QA (SEQ ID NO. : 56) .
GRMNYY TLLKPGDTiiFEANGNLiAPMYAF ALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLG (SEQ ID NO.:57).
ArNSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSI (SEQ ID NO. : 58) .
Secuencias de péptidos en Figura 17 Péptido 22: SSFERFEIFPKESSWPN (SEQ ID NO.:59) Péptido 45: GNLIAPWYAFALSRGFG (SEQ ID NO.:60) Péptido 46: YAFALSRGFGSGIITS (SEQ ID NO.: 61) Secuencias de NP: MASQGTKRSYEQ ETDGERQNATEIRASVGK IGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRL IQ NS (SEQ ID NO. : 62) L IERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEI RRI W (SEQ ID NO. : 63) RQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPR CSLMQGSTLPRRS GAAG (SEQ ID NO. : 64 ) AAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGR TRIAYERMCNILKGKFQTAAQK AMMD (SEQ ID NO. : 65) QVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGY SLV G (SEQ ID NO. : 66) IDPFRLLQNSQVYSLIRPNENP AHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLS T (SEQ' ID NO.:67) RGVQIASNEN ETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQR NLPF (SEQ ID NO. : 68) DRTTIMAAFNGNTEGRTSD RTEI IRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIV PSFD (SEQ ID NO. : 69)
[0291] MSNEGSYFFGDNAEEYDN (SEQ ID NO.:70) Secuencias de péptidos en Figura 23 Péptido 22: GKWVRELVLYDKEEIRR (SEQ ID NO.:71) Péptido 33: RTGMDPR CSLMQGSTL (SEQ ID NO.:72) Péptido 46: MCNILKGKFQTAAQKAM (SEQ ID NO.:73) Antigeno especifico a próstata (PSA) secuencia MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVH P QWV (SEQ ID NO. :74) LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDD SSH D (SEQ ID NO. :75) LMLLRLSEPAELTDAVKV DLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDL HVI S (SEQ ID NO. : 76) NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCAL P ERP (SEQ ID NO. :77) SLYT VVHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID NO.:78) Secuencias de péptidos en Figura 23 Péptido 1: APLILSRIVGGWECE (SEQ ID NO.: 79) Péptido 4:ECEKHSQPWQ VLVAS (SEQ ID NO.: 80) Péptido 25 : GDDSSHDLMLLRLSE (SEQ ID NO.:81) Péptido 26: SHDLMLLRLSEPAEL (SEQ ID NO. : 82) Péptido 49: SGDSGGPLVCNGVLQ (SEQ ID NO. : 83) Péptido 54: GSEPCALPERPSLYT (SEQ ID NO. : 84) Péptido 56: ERPSLYTKVVHYRKW (SEQ ID NO. : 85) Péptido 58: VVHYR WIKDTIVAN (SEQ ID NO. : 86) Ciclina secuencia de DI MRSYRFSDYLHMSVSFSNDMDLFCGEDSGVFSGESTVDFSSSEVDSWPGDSIACFI EDE R (SEQ ID NO. : 87) HFVPGHDYLSRFQTRSLDASAREDSVAWILKVQAYYNFQPLTAYLAVNYMDRFLYA R RLP (SEQ ID NO. : 88) ¦ ETSGWPMQLLAVACLSLAAKMEEILVPSLFDFQVAGVKYLFEAKTIKRMELLVLSV LD WR (SEQ ID NO. : 89) LRSVTPFDFISFFAYKIDPSGTFLGFFISHATEIILSNIKEASFLEYWPSSIAAAA ILCV (SEQ ID NO. : 90) ANELPSLSSVVNPHESPETWCDGLSKEKIVRCYRLMKAMAIENNRLNTPKVIAKLR VSV R (SEQ ID NO. : 91) ASSTLTRPSDESSFSSSSPCKRRKLSGYSWVGDETSTSN (SEQ ID NO.: 92) Secuencias de péptidos en Figura 26.
Péptido 7: DRVLRAMLKAEETCA (SEQ ID NO.:93) Péptido 8: RAMLKAEETCAPSVS (SEQ ID NO.: 94) Péptido 10: TCAPSVSYFKCVQKE (SEQ ID NO.:95) Antigeno de MART-I. EL MART-I es un antigeno de diferenciación melanocytic asociado por tumor. La vacunación con el MART-1 antigeno puede estimular respuesta de linfocito T citotóxica hospedera contra células tumorales que expresan para el antígeno de diferenciación melanocytic, dando como resultado lisis de célula tumoral.
La Figura 27 muestra la expresión y diseño de constructo para anticuerpos peptidicos anti-CD40-MART-l . La Figura 28 es resumende epitopos inmunodominantes del CQ4+ y CD8+ para el MART-I. Las Figuras 27 y 28 muestran el uso de la tecnología ligador flexible para permitir la expresión exitosa de anticuerpos de acción selectiva- de receptor de anticorriente continua de recombinante fusionados a partes (-2/3) significativas del MART-I de humano. El anticuerpo recombinante fusionado en el extremo C-terminus de cadena H al MART completo-1 región codificadora es en absoluto secretado de células de mamífero de producción [no se muestra] . . El aducto Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f -Pep-l es particularmente el pocilio expresado para y es el que la modalidad preferida de un MART - vacuna de 1 acción selectiva, como es el aducto Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f -Pep-l-f3-Pep-2 que alberga una carga máxima de epitopos de MART-I. Deslizar 2 del MART-1 presentación powerpoint muestra que estos aductos pueden ser exitosamente añadidos a múltiples vehículos de receptor de anticorriente continua.
La secuencia a continuación es una cadena H - hMART-1 serie de péptidos de la proteína de fusión pep3-pepl-pep2 donde cada secuencia peptídica hMART-1 [negritas y cursivas] se separa por un separador interpeptidico f [mostrado en el en negritas]. En este caso, un largo flex-vl(vl) ligador de 27 aminoácidos [cursiva! derivada de cellulosomal que ancla scaffoldin B precursor [Bacteroides cellulosolvens-descrito en la descripción de invención de vacuna de mordaza-nef] se inserta entre el extremo C-terminus de cadena H y la serie de espacios flexible por los péptidos hMART-1. Los subrayados COMO residuos unen a secuencias. [manti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-h ART-l-Pep-3-f4-Pep-l] C981 es: EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMY VRQTPEKRLEWVAYINSGGG ST YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSS A KTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP KDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD W LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE TKNQVSLTCLVKGFYP SDIA VE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK S LSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGFDHRDSKVSLQEKNCEPWPNAP PAYE KLSAEOSPPPYSPASTNGSITyAATAPTyTPTyNATPSAAAS PREDAHFIYGYPKKGHGH SY TTAEEAAGIGILTVILGAS (SEQ ID NO.:96) [manti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f4-Pep-l-f3-Pep-2] C978 es : EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGG ST YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSS A KTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP KDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD W LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIA VE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV HEALHNHYTQK S LSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGFDHRDSKVSLQEKNCEP PNAP PAYE KLSAEOSPPPYSPASTNGSITAATAPTTPT NATPSAAASMPREDAHFIYGYPKKGHGHSY TTAEEAAGIGILTVILGASVVTATPSAiTTITPTATTKPASVLLLIGC YCRRRNGYRAL DKSLHVGTQCALTRRCPQEGAS (SEQ ID NO.:97) [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hMART-l-Pep-3-f4-Pep-1] C1012 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIY D DDK RYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVT VSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLF PPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NH YTOKSLSLSLGKASOTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGFDHRDSKVSLOEKNCEP WPNA PPAYEKLSAEQSPPPYSPASTNGSI yAATAPTyTPTyNATPSAAAS PREDAHFIYGYPK KGH GHSYTTAEEAAGIGILTVILGAS (SEQ ID NO. : 98) . [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-h ART-l-Pep-3-f -Pep-1 - Y-Pep-2] C1013 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWD DDK RYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVT VSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLF PPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLH Q DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN.VFSCSVMHEALHNHY TQ KSLSLSLGKASOTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGFDHRDSKVSLOEKNCEPWPN APPA YEKLSAEQSPPPYSPASTNGSITyAATAPTyTPTyNATPSAAASMPREDAHFIYGYPKKGH GH SYTTAEEAA GIGIL JF/LGASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPAS VLLLIGCWYCRRRNGYR ALMD SLHVGTQCALTRRCPQEGAS (SEQ ID NO.: 99) .
Secuencia de ADN de ART-I: MART-1 constructos con 3 péptidos, los sitios de Inicio/finalización son subrayados, el péptido 1 es . en negritas, 2 peptidicos es negritas y cursivas - y el péptido 3 es subrayado del modo en negritas: AACACCGACAACAACAGATGATCTGGATGCAGCTAGTGGGTTTGATCATCGGGACA GCA AAGTGTCTCTTCAAGAGAAAAACTGTGAACCTGTGGTTCCCAATGCTCCACCTGCTTA TGAGAAACTCTCTGCAGAACAGTCACCACCACCTTATTCACCTGCTAGTACCAACGGCA GCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGC CGCCGCTAGT A TGCCAA GA GAA GA TGCTCA CTTCA TCTA TGGTTA CCCCAA GAA GGGGCA CG GCCA CTCTTA CA CCA CGGCTGAA GA GGCCGCTGGGA TCGGCA TCCTGA CA GTGA TCCTGGGA.
GCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCAT CACCC CCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGTGTCTTACTGCTCATCGGCTGTTGGTATTGTAGA AGACGAAATGGATACAGAGCCTTGATGGATAAAAGTCTTCATGTTGGCACTCAATGTG CCTTAACAAGAAGATGCCCACAAGAAGGGtgaGCGGCCGCATCGAAGAGCTCGGTACCCG GGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC (SEQ ID NO. : 100) El péptido 3 es en negritas seguido de Doblar 4 secuencia aminoacidica - subrayado.
GFDHRDSKVSLOEKNCEPWPNAPPAYEKLSAEOSPPPYSP ASTNGSITVAATAPTVTPT (SEQ ID NO. : 101).
El péptido 1 es en negritas seguido de Doblar 3 secuencia aminoacidica - subrayado.
VNATPSAAASMPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILGASTVTPTA TATP (SEQ ID NO. : 102) El péptido 3 es en negritas.
SAIVT ITPTATTKPASVLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQGALTRRCPQE G (SEQ ID NO. : 103) MART-1 - Péptido 3, la porción puesta en bastardilla es el CD4+ epítopo inmunodominante. GFOHKDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEQSFFFYSF (SEQ ID NO.: 104).
Doblar 4 ASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS (SEQ ID NO.: 105) .
MART-1 - Péptido 1 la porción puesta en bastardilla es el CD4+ epitopo inmunodominante y el subrayado - la porción puesta en bastardilla es el CD8+ epitopo inmunodominante: MPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILG (SEQ ID NO. : 106) Doblan 3: ASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPAS (SEQ ID NO. : 107) .
EL ART-1 - Péptido 2 - la porción puesta en bastardilla es el CD4 + epitopo inmunodominante . VLLUGCWtCKBJWGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEG (SEQ ID NO.: 108) .
MART-1 constructos con dos péptidos: El péptido 3 es subrayado por las negritas y cursivas, doble 4 es en negritas y 1 Peptidico es subrayado por las negritas y cursivas: GFDHRDSKVSLOEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEOSPPPYSPAS ??GS?VAAYAPYV'YP'YVNA TPSAAASMPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILGAS (SEQ ID NO: 109) Secuencia protéica: C978. rAB-cetHS-puro [manti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl - hMART-l-Pep-3-f (subrayado por las negritas y cursivas) (en negritas) - Energia-1 (negritas y cursivas) - ß (cursiva j -Pep-2 (en negritas subrayado) ] : MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYY Y V RQTPEKR LEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHA M DYWGQGTSVTVSSAK KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KN QVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR QEGNV FSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGFFSX OEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEOSPPPYSPASTNGSITyAATAPTyTPTyNATPSAAAS P RE DAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAA GIGIL TVIL GASTVTPTA TA TPSAIVTTITPTA TTKPASVLI ?? G CWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEGAS (SEQ ID NO: 110) .
Secuencia protéica: C981. rAB-cetHS-puro [manti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl - hMART-l-Pep-3-f4- (subrayado por las negritas y cursivas) (en negritas) - Energia-1] (subrayado del modo en negritas) : NLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPE KR LEWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHA M DYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV D YFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQF NS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSC SVMHEALHNHYTOKSLSLSLGKASOTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGF/?ff1? Z75JFSX 0EKNCEPVVPNAPPAYEKLSAE0SPPPYSPASTNGS1T AATAPTyTPTyNATPSAAASMPKE DAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILGAS (SEQ ID NO: 111) El Antigeno de GPIOO. El antígeno de GPIOO es un-antigeno asociado por el melanoma. Cuando administrado en una formulación de vacuna, gplOO antigeno puede estimular un linfocito T citotóxico HLA-respuesta inmunitaria A2.1-restringida contra tumores que expresan para este antigeno, que puede dar como resultado una reducción del tamaño tumoral .
La región codificadora de ectodominio de GPIOO fusionada al anticuerpo recombinante H región codificadora de cadena es en absoluto secretada por células de mamífero de producción [no se muestra] . La secuencia total se muestra, a continuación - los residuos de cursiva son la secuencia líder y el dominio transmembranal , los péptidos están en negritas y cursivas y el dominio transmembranal es subrayado por la cursiva.
MDL VLKRCLLHLA VIGALLA FGJTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRL DCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVI VNNTIINGSQVWGGQ PV YPQETDD ACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWATrPFGgGGPVSGLSIGTGRAMLGTHT EVTVYHRRGSRSYVPLAHSSSAFTm) IgFPFSlFSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDP SGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRALVVTHTFLFPGPFrQVVLQAAIPLTSCGSSPVPGT TD GHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAEST G T PEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEP EGP DASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQ AVPSG EGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYC ' LNV SLADTNSLAVVSTOLIMPGOEAGLGO VPLIVGILLVLMA FFLJSL/YRRRLMKODFSVPOLPHSSS H LRLPRIFCSCPIGENSPLLSGQQV (SEQ ID NO. : 112) .
HLA-A0201 conocidos secuencias de péptidos restringidas son: GPIOO : 209-217 (2M) : IMDQVPFSV (SEQ ID NO. : 113); 209- 217 PESO: ITDQVPFSV (SEQ ID NO.: 114) GPIOO M: 280-288 (9V) : YLEPGPVTV (SEQ ID NO.: 115) 280-288 PESO: YLEPGPVTA (SEQ ID NO. : 116) PESO de GPIOO: 154 - 162: KT GQYWQV (SEQ ID NO.: 117) .
Las Figuras 29-33 muestran los aductos gplOO que son exitosamente expresados para como vacunas de acción selectiva de receptor de anticorriente continua secretadas. Éstos emplearon el uso de las secuencias de unión flexibles y fragmentación y arrastre de la región codificadora de ectodominio gplOO. Las modalidades preferidas de aductos de vacuna gplOO se describen.
La Figura 29 muestra la expresión y diseño de constructo para anti-CD40-gp 100 anticuerpos peptidicos. La Figura 30 muestra el diseño para anticuerpos peptidicos anti-CD 0-gpl00 adicionales. La Figura 31 muestra la expresión y diseño de constructo para anticuerpos peptidicos anti-CD40-gpl00 adicionales. La Figura 32 es resumende epitopos inmunodominantes del CD4+ y CD8+ para gplOO. La Figura 33 muestra la expresión y diseño de constructo para anti-CD40-gp adicional 100 anticuerpos peptidicos. rAB-cetHS-puro [manti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-C-Flex-hgplOO-Pep-l-f4-Pep-3-f3 - Pep-4-f4-Pep-5-f3-Pep-2 ] C1285, los péptidos son negritas y cursivas, los ligadores flexibles son negritos y el subrayado YA QUE los residuos unen a secuencias : EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMY VRQTPEKRLEWVAYINSGGGST YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDY GQGTSVTVSS A KTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVS NSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP KDTL MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD W LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIA VE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK S .
LSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQD LGVSRQLRTFCAWNRQLYPEWTEAQRL DC WRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPV YPQ ETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVW TWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTME V TVYHRRGSOSYVPLAHSSSAFTITDOVPFSVSVSOLRALDGGNKHFLRNOASTNGS ITyAATAP TyTPTyNATPSAAASGTTDGHRPTTEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQV PT TEVISTAPVQMPTAESTG TPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA AST yTPT A ATPSAYVTTITPT ' ATTKP ASOVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLG PLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQASTNGSITyAATAPTyTPTyNATPS AAA SGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQ LVLH QILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAWSTQLIVPGILLTGQEAGLGQASTyTPT A ATPSATVTTIT PTATTKPASW. TFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAL VVTHTYLEPGPVTA Q VV LQAAI PLTSCGSSPVPAS (SEQ ID NO . : 118). rAB-cetHS-puro [hIgG4H-C-Flex-hgpl00-Pep-l-f4-Pep-3-y- Pep-4-f -Pep-5-y-Pep-2] C1286: RLQLQESGPGLLKPSVTLSLTCTVSGDSVASSSYYWG VRQPPGKGLEWIGTINFSGN MYYSPSLRSRVTMSADMSENSFYLKLDSVTAADTAVYYCAAGHLV GFGAHWGQGKLVSVS PASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLH Q DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TQ KSLSLSLGKASDTTEPA TPTTPVTTPTTTKVPRNQD LGVSRQLR TKA WNRQL YPE WTEA QRL DC RGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQ PVY PQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYV KTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHT M EVTVYHRRGSOSYVPLAHSSSAFTITDOVPFSVSVSOLRALDGGNKHFLRNOASTNGSITY AAT APTYTPTYNATPSAAASGTTDGHRPTTEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSV QV PTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTT AAA STVTPT A ATPSAIVTTITPT ATTKP ASQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSL GPLLDGTA TLRL VKROVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVOASTNGSITYAATAPTYTPTYNATPSAA ASGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPAC QLVL HQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQASTYTPTATATPSAR VTTI TPTATTKPASPLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRALVVTHTYLEPGPVT AQV VLQAAIPLTSCGSSPVPAS (SEQ ID NO.: 119) . gplOO: - Secuencia nucleoacidica . Péptido 1 - subrayado, 4-bold-underlined 3-en negritas, pept dico de 2 cursivas, peptidico peptidico, Péptido 5 negritas y cursivas.
GATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAAAAGTA CCCAGAAACCAGGACTGGCTTGGTGTCTCAAGGCAACTCAGAACCAAAGCCTGGAACAGG CAGCTGTATCCAGAGTGGACAGAAGCCCAGAGACTTGACTGCTGGAGAGGTGGTCAAGTG TCCCTCAAGGTCAGTAATGATGGGCCTACACTGATTGGTGCAAATGCCTCCTTCTCTATTG C CTTGAACTTCCCTGGAAGCCAAAAGGTATTGCCAGATGGGCAGGTTATCTGGGTCA ACAAT ACCATCATCAATGGGAGCCAGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGGAAACTGAC GATGCCTGCATCTTCCCTGATGGTGGACCTTGCCCATCTGGCTCTTGGTCTCAGAAGAGAA G CTTTGTTTATGTCTGGAAGACCTGGGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGGGGGCCCAGTGTCT GGGCTGAGCATTGGGACAGGCAGGGCAATGCTGGGCACACACACCATGGAAGTGACTGTC TACCATCGCCGGGGATCCCAGAGCTATGTGCCTCTTGCTCATTCCAGCTCAGCCTTCACCA T TACTGACCAGGTGCCTTTCTCCGTGAGCGTGTCCCAGTTGCGGGCCTTGGATGGAGGGAAC AAGCACTTCCTGAGAAATCAGGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCC CCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGTGGC CCA CA GA TGG GCACA GGCCAA CTGCA GA GGCCCCTAA CA CCA CA GCTGGCCAA GTGCCTA CTA CA GAA GTTGTG GGTA CTA CA CCTGGTCA GGCGCCAA CTGCA GA GCCCTCTGGAA CCA CA TCTGTGCA GGTGCCAA CCA CTGAA GTCA TAA GCA CTGCA CCTGTGCA GA TGCCAA CTGCA GA GA GCACAGGTA TGA CA CCT GA GAA GGTGCCA GTTTCA GA GGTCA ' TGGGTA CCA CA CTGGCA GA GA TGTCAA CTCCA GA GGCTA CA GGTA TGA CA CCTGCA GA GGTA TCAA TTGTGGTGCTTTCTGGAA CCA CA GCTGCAGCTAGTACC GTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCA CCACCAAGCCCGCTAGTCAGGTAACAACTACAGAGTGGGTGGAGACCACAGCTAGAGA GCTACCTATCCCTGAGCCTGAAGGTCCAGATGCCAGCTCAATCATGTCTACGGAAAGT ATTACAGGTTCCCTGGGCCCCCTGCTGGATGGTACAGCCACCTTAAGGCTGGTGAAG AGACAAGTCCCCCTGGATTGTGTTCTGTATCGATATGGTTCCTTTTCCGTCACCCTGG ACATTGTCCAGGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGA CCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGTGGTATTGAAAGTGCCGAGATCC TGCAGGCTGTGCCGTCCGGTGAGGGGGATGCATTTGAGCTGACTGTGTCCTGCCAAG GCGGGCTGCCCAAGGAAGCCTGCATGGAGATCTCATCGCCAGGGTGCCAGCCCCCTG CCCAGCGGCTGTGCCAGCCTGTGCTACCCAGCCCAGCCTGCCAGCTGGTTCTGCACC AGATACTGAAGGGTGGCTCGGGGACATACTGCCTCAATGTGTCTCTGGCTGATACCA ACAGCCTGGCAGTGGTCAGCACCCAGCTTATCGTGCCTGGGATTCTTCTCACAGGTCA AGAAGCAGGCCTTGGGCAGTAAGCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCA GCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGTCC YCTGACCTTT GCCCTCCA GCTCCA TGA CCCTA GTGGCTA TCTGGCTGAA GCTGA CCTCTCCTA CA CCTGGGA CTTTGGA GA CA GTA GTGGAA CCCTGA TCTCTCGGGCA C YTGTGGTCA CTCA TA CTTA CCTGGA GCCTGGCCCA GTCA CTGCCCA GGTGGTCCTGCA GGCTGCCA TTCCTCTCA CCTCCTGTGGCT CCTCCCCAGTTCCA GCTAGC TGA (SEQ ID NO.: 120) .
GPlOO-péptido 1 - Secuencia nucleoacídica .
GATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAA AAGTACCCAGAAACCAGGACTGGCTTGGTGTCTCAAGGCAACTCAGAACCAAAGCCTGGA ACAGGCAGCTGTATCCAGAGTGGACAGAAGCCCAGAGACTTGACTGCTGGAGAGGT GGTC AAGTGTCCCTCAAGGTCAGTAATGATGGGCCTACACTGATTGGTGCAAATGCCTCC TTCTCT ATTGCCTTGAACTTCCCTGGAAGCCAAAAGGTATTGCCAGATGGGCAGGTTATCTGGGTCA ACAATACCATCATCAATGGGAGCCAGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGGAAA CTGACGATGCCTGCATCTTCCCTGATGGTGGACCTTGCCCATCTGGCTCTTGGTCTCAGAA G AGAAGCTTTGTTTATGTCTGGAAGACCTGGGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGGGGGCCCAG TGTCTGGGCTGAGCATTGGGACAGGCAGGGCAATGCTGGGCACACACACCATGGAAGTGA CTGTCTACCATCGCCGGGGATCCCAGAGCTATGTGCCTCTTGCTCATTCCAGCTCAGCCTT C ACCATTACTGACCAGGTGCCTTTCTCCGTGAGCGTGTCCCAGTTGCGGGCCTTGGATGGAG GGAACAAGCACTTCCTGAGAAATCAG (SEQ ID'NO. : 121).
Secuencia protéica: DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKA NRQLYPEWTEAQRLDC RGGQVS L KVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDA CIFP DGGPCPSGS SQKRSFVYV KT GQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGS QSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (SEQ ID NO.: 122).
GPlOO-péptido 3 GGCACCACAGATGGGCACAGGCCAACTGCAGAGGCCCCTAACACCACAGCTGGCC AAGTGCCTACTACAGAAGTTGTGGGTACTACACCTGGTCAGGCGCCAACTGCAGAGCCCTC TGGAACCACATCTGTGCAGGTGCCAACCACTGAAGTCATAAGCACTGCACCTGTGCAGATG CCAACTGCAGAGAGCACAGGTATGACACCTGAGAAGGTGCCAGTTTCAGAGGTCATGGGT ACCACACTGGCAGAGATGTCAACTCCAGAGGCTACAGGTATGACACCTGCAGAGGTATCA ATTGTGGTGCTTTCTGGAACCACAGCTGCA (SEQ ID NO. : 123) .
Secuencia protéica: GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAP VQM PTAESTG T EKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA (SEQ ID NO.: 124) GPlOO-péptido 4: CAGGTAACAACTACAGAGTGGGTGGAGACCACAGCTAGAGAGCTACCTATCCCTGA GCCTGAAGGTCCAGATGCCAGCTCAATCATGTCTACGGAAAGTATTACAGGTTCCCTGGGC CCCCTGCTGGATGGTACAGCCACCTTAAGGCTGGTGAAGAGACAAGTCCCCCTGGATTGTG TTCTGTATCGATATGGTTCCTTTTCCGTCACCCTGGACATTGTCCAG (SEQ ID NO.: 125) .
Secuencia protéica: QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVP LDCVL YRYGSFSVTLDIVQ (SEQ ID NO. : 126) .
GPlOO-péptido 5 GGTATTGAAAGTGCCGAGATCCTGCAGGCTGTGCCGTCCGGTGAGGGGGATGCATT TGAGCTGACTGTGTCCTGCCAAGGCGGGCTGCCCAAGGAAGCCTGCATGGAGATCTCATCG CCAGGGTGCCAGCCCCCTGCCCAGCGGCTGTGCCAGCCTGTGCTACCCAGCCCAGCCTGCC AGCTGGTTCTGCACCAGATACTGAAGGGTGGCTCGGGGACATACTGCCTCAATGTGTCTCT GGCTGATACCAACAGCCTGGCAGTGGTCAGCACCCAGCTTATCGTGCCTGGGATTCTTCTC ACAGGTCAAGAAGCAGGCCTTGGGCAG (SEQ ID NO. : 12.7) .
Secuencia protéica: GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPS PACQ LVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (SEQ ID NO. : 128) .
GPlOO-péptido 2 CCTCTGACCTTTGCCCTCCAGCTCCATGACCCTAGTGGCTATCTGGCTGAAGCTGA C CTCTCCTACACCTGGGACTTTGGAGACAGTAGTGGAACCCTGATCTCTCGGGCACYTGTGG TCACTCATACTTACCTGGAGCCTGGCCCAGTCACTGCCCAGGTGGTCCTGCAGGCTGCCAT T CCTCTCACCTCCTGTGGCTCCTCCCCAGTTCCAGCTAGC (SEQ ID NO.: 129) .
Secuencia protéica: PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVL QAAIPLTS CGSSPVPAS (SEQ ID NO. : 130) Ciclina Antigeno de 'Bl. Bl de ciclina, también conocido como CCNB1, es un gen de humano que codifica para una proteina reguladora implicada en mitósis. Ciclina B 1 complejos con p34 (cdc2) para formar la maduración promoción de factor (MPF) . Dos transcritos 'alternativos se conocen lo que es el resultado de sitios de iniciación de transcripción alternativos. Un primer transcrito codifica para un transcrito constitutivamente expresado para. El segundo transcrito es una célula transcrito regulado por el ciclo expresado para predominantemente durante la fase G2/M.
Las Figuras 34A y 34B muestran que la Ciclina de cadena completa Bl fusionado al extremo C-terminus de anticuerpo H cadena o de cohesión deja de ser secretada del de mamífero 293F células. Los datos son el anti-Fc de humano y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas anti-cohesin en diluciones en serie de sobrenadantes de transfección . rAb. Ciclina Bl y Coh. La ciclina proteínas de Bl es mal expresada para como productos secretados de células de mamífero.
La secuencia aminoacídica que sigue es la ciclina de humano Bl . Dos regiones peptídicas conocidas contener epítopos de linfocito T son destacadas en subrayado del modo en negritas y subrayado por la cursiva.
MALRVTRNSKINAENKAKINMAGAKRVPTAPAATSKPGLRPRTALGDIGNKVSEQL QA KMPMKKEAKPSATGKVIDKKLPKPLEKVPMLVPVPVSEPVPEPEPEPEPEPVKEEKLSPEP ILVD . TASPSPMETSGCAP AEEDLCQAFSDVILA VND VD AEDGADPNLCSEYVKDIYAYLRQLEEEQA VRPKYLLGREVTGNMRAILIDWLVQVQMKFRLLQETMY TVSIIDRFMQNNCVPKKMLOL VGVTAMFIASKYEEMYPPEIG0FAFVT0NTYTKHOIROMEMKILRALNFGLGRPLP LHFLRRA SKIGEVDVEOHTLAKYLMET LDYDMVHFPPSOIAAGAFCLALKIL0NGEWTPTL0 HYLSYTE ESLLPVMQHLAKNVVMVNQGLTKHMTVKNKYATSKHAKISTLPQLNSALVQDLAKAVAKVH HHHHH (SEQ ID NO. : 131) Péptido 1: ME KILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY (SEQ ID-NO. : 132) Péptido 2 DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK (SEQ ID NO. : 133) La Figura 35 muestra resumen de niveles de expresión relativos de la Ciclina de prototipo vacunas de Bl secretadas del transfectado de mamífero 293F células. Las secuencias de unión flexibles facilitan la secreción.
Cl 189 rAB-cetHS-puro [manti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl Péptido-hCyclinBl- (en negritas) 2 (cursiva) Péptido-l (en negritas - cursiva) -f4 (en negritas)] [COMO ligadores - subrayado] : EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAY y SGGGSTYYPD TVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMD YWGQGTSVTVSSAKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEK ISfAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS WL VQ VQ KFRLLQETMYMTVS I I DRFMQ NNCVPKKASME QLRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDYASY NV S ITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS (SEQ ID NO.: 134) ' Mayor a es la secuencia de la cadena H secretada madura para una forma de vacuna de Bl anti-CD4012E12-cyclin. El YA QUE los residuos son de unir a sitios de restricción. La secuencia codificadora de ADN se muestra a continuación, y esto incluye el péptido de señalización.
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAG T GAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGT GCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGA A GAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACT GTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGA GCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCA TGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGC CCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGT AGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCC CACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCT AGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAAC AACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGACTGGCTAGTACAGGTTCAAATGAAATTCA GGTTGTTGCAGGAGACCATGTACATGACTGTCTCCATTATTGATCGGTTCATGCAGAATAA T TGTGTGCCCAAGAAGGCTAGTATGGAAATGAAGATTCTAAGAGCTTTAAACTTTGGTCTGG GTCGGCCTCTACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGGAGAGGTTGATGTCGA GCAACATACTTTGGCCAAATACCTGATGGAACTAACTATGTTGGACTATGCTAGTACCAAC GACAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCA GCGCCGCCGCTAGCTGA (SEQ ID NO.: 135) Cl 143 rAB-cetHS-puro [manti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-¦ C-Flex-vl Péptido-hCyclinBl- (en negritas) 2 (cursiva) -f3 (en negritas) ] [COMO ligadores - subrayado] .
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGG STYYPD TVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMD YWGQGTSVTVSSAKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSL'SSVVT VPSSS.LGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS AKGQPREPQVYTLPPSQEE TKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SL SLGKASQTPTNTTPTNNSTPTNNSNPKPNPASz) WL VQ VQMKFRLLQETMYMTVSI I DRFMQ NNCVPKKASYYYVYA Y ATPSAIVTTITPTATTKPAS (SEQ ID NO.: 136) Mayor a es la secuencia de la cadena H secretada madura para una forma de vacuna de Bl anti-CD4012E12-cyclin . El YA QUE los residuos son de unir a sitios de restricción. La secuencia codificadora de ADN se muestra a continuación, y esto incluye el péptido de señalización.
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTG TGAAGT GAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGT GCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGA A GAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACT GTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGA GCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCA TGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGC CCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCC CACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCT AGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAAC AACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGACTGGCTAGTACAGGTTCAAATGAAATTCA GGTTGTTGCAGGAGACCATGTACATGACTGTCTCCATTATTGATCGGTTCATGCAGAATAA T TGTGTGCCCAAGAAGGCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCG TGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGCTGA (SEQ ID NO.: 137) C911 rAB-cetHS-puro [manti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl Péptido-hCyclinBl- (en negritas) - 1 (cursiva) -f4 (en negritas) ] EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGG STYYPD TVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHA D YWGQGTSVTVSSAKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEY CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSL SLGFASQTPTNTISyTPTNNSTPTNNSNPKPNPASMEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRAS KIGE VDVEQHTLAKYLMELTMLDYASTNGSYiyAATAPTyTPT\NATPSAAAS (SEQ ID NO. : 138) C911 rAB-cetHS-puro [manti-CD40-12E12.3F3-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl Péptido-hCyclinBl- (en negritas) - 1 (cursiva) -f (en negritas)] secuencia nucleoacidica .
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTG TGAAGT GAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGT GCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGA A GAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACT GTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGA GCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCA TGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGC CCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCC CACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC CTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCT AGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAAC AACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTATGGAAATGAAGATTCTAAGAGCTTTAAACT TTGGTCTGGGTCGGCCTCTACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGGAGAGGT T GATGTCGAGCAACATACTTTGGCCAAATACCTGATGGAACTAACTATGTTGGACTATGCTA .
GTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGC CACCCCCAGCGCCGCCGCTAGCTGA (SEQ ID NO.: 139).
Antigeno de Ciclina de D-tipo. Las ciclinas de D-tipo son predominantemente expresadas para en la fase de Gl del ciclo celular. El modelo de expresión de ciclina D 1 ha sido exhaustivamente estudiado en ciertos tipos de cáncer que incluyen el linfoma y el cáncer pulmonar de células no pequeñas. Aproximadamente el 30 por ciento de carcinomas de pecho es la Ciclina positivo de DI. La sobreexpresión de la Ciclina DI es ahora un criterio bien establecido para el diagnóstico de Linfoma de células del manto, un de neoplasia maligna, linfoma no de Hodgkin que se caracteriza por un desplazamiento cromosómico exclusivo t (1 1; 14).
Ciclina DI - Péptido 1 2 negritos, Peptídicos subrayados del modo en negritas, Péptido 3 cursiva, Péptido 4 subrayado.
MEHOLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCVOKEVLPS MRKIVATWMLEVCEEOKCEEEVFPLA NYLDRFLSLEPVKKSRLOLLGATCMFVASK KEYIPLYAEKLCTY ?? NSIRPEELLOMELLLVNKLKJVNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKOII RKHAOTFVALCATDVKFISNPPS VAAGSVVAAVOGLNLRSFN FLSYYKLTRFLSKVIKC OFOC LPVACOEOIEALLESSLRO AOONMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTD VRD VDI FSEO ID NO. : 140) .
Energía 1: MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRA LKAEETCAPSVSYFKCV (SEQ ID NO. : 141) .
Energía 2 QKEVLPSMRKIVAT MLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGA TCMFVAS KMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (SEQ ID NO.: 142).
Energía 3 LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSK PEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNP PSMV (SEQ ID NO. : 143) .
Energía 4 AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQ NM DPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEQ ID NO. : 144).
Doblar 4 secuencia TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO.: 14) Doblar 3 secuencia TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. : 13) . ' Doblar-vari QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP (SEQ ID NO.: 145) La Figura 35 muestra a Ciclina la estrategia de segmentación de Bl basada en regiones de dominio estructurales conocidas o pronosticadas.
La Figura 36 muestra que la Ciclina pi de segmentos de Di, p3, y p4, pero no p2 expresa para el pocilio como fusiones directas al extremo C-terminus de cadena H. Éstos son transfecciones transitorias de los vectores de cadena H co-transfectados con el vector de expresión de cadena L en 293F células, y los sobrenadantes recolectados después de 48-72 horas de' la expresión. La Ciclina DI p3+p4 segmentos unidos conjuntamente en el extremo C-terminus de cadena H también expresa para el pocilio, pero diversas otras combinaciones, con y sin el esparcido doblan segmentos no expresan para, o expresan para muy mal.
La Figura 37 muestra los niveles de expresión relativos de diversa Ciclina segmentos de DI como fusiones directas al extremo C-terminus de cadena H en diversas combinaciones con secuencias de unión flexibles. Éstos son transíecciones transitorias de los vectores de cadena H co-transfectados con el vector de expresión de cadena L en 293F células y los sobrenadantes recolectados después de 48-72 horas de la expresión. La Ciclina DI p2+p3+p4+f4 segmentos unidos conjuntamente en el extremo C-terminus de cadena H también expresa para el pocilio bastante para la producción de vacuna.
Las secuencias de anti-DCIR útil 9E8 - Ciclina proteínas de fusión de cadena de D1H son menor. 1082 es rAB-pIRES2 [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hCyclinDl-Pep-1 (en negritas) (cursiva) -f4 (en negritas)-] QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLE LAHIYWD DDK RYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVT VSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLF PPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GF YPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH H ' YTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP ASMEHQLLCCEVETIRRAYPDANL LNDR VLRAMLKAEETCAPSVSYFKCVASTNGSITyAATAPTyTPTyNATPSAAAS fSEO ID núm.. : 146) -C1086 es rAB-pIRES2 [mAnti-DCIR-9E8-H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-hCyclinD (en negritas) l-Pep-2-Pep-3 (en negritas ) -Pep-4 (subrayado del modo en negritas) (cursiva) -f ) (en negritas) ] .
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLS WIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDK RYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFL ITIVDTAD AATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVT VSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVS NSGALTSGVHTFP AVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLF PPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NH YTQKSLSLSLGKASQTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASQKEVLPS RKIVATW LE V CEEQKCEEEVFPLAMÑYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIY TDNSIRPEELLOMELLL VNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSK PEAEENKOI IRKHAOTFVA LCATD VKFISNPPSMVA4 GSVVAA VQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSR VIKCDPDCLRACQEQIEAL LESSLROAOONMDP KAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDIASTNGSITyAATAP TVTPTVNATP SAAAS- (SEQ ID NO. : 147) La Figura 38 muestra resumen de diversa ciclina de la cadena H constructos de segmento de DI y su facilidad de expresión relativa como vacunas.
La Figura 39 anterior muestra que la Ciclina de cadena completa Di fusionado al extremo C-terminus de un anticuerpo de acción selectiva de corriente continua H cadena es muy mal expresada para como un anticuerpo recombinante secretado. anti-CD40-12E12.3F3 anti-CD40-12E12.3F3-H-V-hIgG4H-C - la región subrayada muestra a la Cadena pesada V secuencia aminoacidica de región: MNLGLSLIFLVLVLKGVOCEVKLVESGGGLVOPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWV RO TPEKRLEWVA YrNSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLO SRLKSEDTA YYCARRGLP FHAMDYWGOG SVTFVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GA LTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP RE EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID NO.: 148) anti-CD40-12El2.3F3-K-V-hIgGK-C - la región subrayada muestra a la Cadena ligera V secuencia aminoacidica de región MMSSAOFLGLLLLCFOGTRCDIOMTOTTSSLSASLGDRVTISCSASOGISNYLNWY OOK PDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCOOFNKLPPTFGG GTKLEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SK DSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC- ( SEQ ID NO. : 149) anti-CD40-12B4.2C10 Cadena pesada de anti-CD40-12B .2C10 : MEWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVLHWV K QKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTA Y ELSSLTSEDSAVYYCARGYP AYSGYAMD Y GQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWN SGSLSSGVHTFPAVLQKGEFV (SEQ ID NO.: 150) .
Cadena ligera de anti-CD 0-12B .2C10 : MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQ TQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWY QQK PDGTVKLLIYY.TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATY CHHGNTLPWTFGG GTKL EIKRAD AAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVK KIDGSERQNGVLNSWTDQDS KDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO. : 151) Cadena ligera de anti-CD40-12B4.2C10 - clon alternativo (17K6) .
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAILSASPGEKVT TCSASSSVSYMYR YQQK PGSSPKPWIYGTSNLASGVP ARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPLTFGAGTKL ELKRAD AAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDS KDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO.: 152) anti-CD40 11B6.1C3 anti-CD40-l 1B6.1C3 Cadena pesada: GWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWV K QSHVKSLEWIGRINP YNGATSYNQNFKDKASLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCAREDY VYWGOGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAOTNS VTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSS GV HTFPAVLQKGEFV (SEQ ID NO.: 153) anti-CD40-l 1B6.1C3 Cadena ligera: MKLPVRLLVLMF IPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTY LHW YLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFALKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPW TFG GGTKLEIKRAD AAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSW TDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO.: 154) [anti-CD40-12E12.3F3-K-V-hIgGK-C] - la región subrayada muestra a la Cadena ligera V secuencia de región ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAG AT GTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTAGGAGACAGAGTCAC CATCAGTTGCAGTGCAAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCA GATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAATTTTACACTCAGGAGTCCCATCAA G GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACCATCGGCAACCTGGAACCTGAA GATATTGCCACTTACTATTGTCAGCAGTTTAATAAGCTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCA C CAAACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT G AGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGA GGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO.: 155) [anti-CD40-12E12.3F3-H-V-hIgG4H-C] - la región subrayada muestra a la Cadena pesada V secuencia de región: ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTG T GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTC TCCTGTGCAACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTC C AGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCA GACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGC AAATGAGCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTAC CGTTCCATGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAAC GAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCC GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTC C CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACG TAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCC CATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC GTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAG CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT AAAGCTAGCTGA (SEQ ID NO. : 156) cadena pesada de anti-CD40-12B4.2C10-H-V-hIgG4H-C ATGGAATGGAGTTGGATATTTCTCTTTCTTCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTC T GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGT CCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATGTTTTGCACTGGGTGAAACAGAAGCC TGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAAT GAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATG GAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGGGCTATCCGG CCTACTCTGGGTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGC CAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACT CTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACC TGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATAT GGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC TGGGTAAAGCTAGCTGA (SEQ ID NO. : 157) anti-CD40-12B4.2C10-K-V-hIgGK-C (1 variante) cadena ligera ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAAT G TCCAGGGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGA AGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACAGGTACCAGCAGAA GCCAGGATCCTCACCCAAACCCTGGATTTATGGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCT GCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGG CTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAATATCATAGTTACCCGCTCACGTTCGGTGC T GGGACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAT CTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCC C AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG AGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTG AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO.: 158) . anti-CD40-12B .2C10-K-V-hIgGK-C (2 Variantes) cadena ligera: ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAG AT GTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCAC CATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCA GATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAA GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGA AGATATTGCCACTTACTTTTGCCATCATGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGC A CCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTG TCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCA AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO . : 159) anti-CD40-l 1B6. lC3-H-V-hIgG4H-C cadena pesada: ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTC T GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATAT CCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGAAGCAAAGCCA TGTAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGCTACTAGCTACAAC CAGAATTTCAAGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGG AGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGACTACGT CTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTC TTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTG A CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCA GCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCC CGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCC ATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCG T GGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG CACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA ( SEQ ID NO. : 160) anti-CD40-l 1B6. lC3-K-V-hIgGK-C cadena ligera: ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAG T GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA T CTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTAC C TGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTT TCTGG GGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCGCACTCAAGATCAGTAG AGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACG TTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCT TCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAA C TTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACT CCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCC TGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO:161) Se contempla que cualquier modalidad mencionada en esta especificación puede ponerse en práctica con respecto a cualquier método, kit, reactivo, o composición de la invención, y viceversa. Más aún, composiciones de la invención poderse usar para lograr métodos de la invención.
Se entenderá que las modalidades particulares descritas aquí se muestran por vía de la ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención pueden emplearse en diversas modalidades sin apartarse del alcance de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de averiguar usando no más que experimentación rutinaria, diversos equivalentes con los procedimientos específicos descritos aquí. Tales equivalentes se consideran para incluirse dentro del alcance de esta invención y son recubiertos por las reivindicaciones.
Todas las publicaciones y las solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de habilidad de los expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y las solicitudes de patente se incorporan aquí como referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente son específicamente e individualmente indicadas para incorporarse por referencia.
El uso de la palabra "a" o cuando usado junto con el término "que comprender" en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "un", pero esto también es consistente con el significado de "uno o más," "al menos un," y "uno o más que uno." El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza la media "y/o" a menos que explícitamente no indicado referirse a alternativas sólo o las alternativas es mutuamente exclusiva, aunque la descripción apoye una definición que se refiere a sólo alternativas y "y/o." Durante todo esta solicitud, el término "sobre" se utiliza indican que un valor incluye la variación inherente del error para el dispositivo, el método se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los pacientes de estudio.
Usado como en esta especificación y reivindicación (ones) , las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tales que "comprenden" y "comprenden") ", que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tales que "tienen" y "tienen") ", incluyendo" (y cualquier forma del incluyendo, tal que "incluye" y "incluye") o "conteniendo" (y cualquier forma de contener, tales que "contiene" y "contiene") son globales o sin límites determinados y no excluyen elementos adicionales, no mencionados o etapas de método.
El término "o las combinaciones de lo mismo como se utiliza aquí se refieren a todas las permutaciones y las combinaciones de los artículos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, "A, B, C, o combinaciones de lo mismo pretende incluyen al menos un de: A, B, C, AB, corriente alterna, A.C., o ABECÉ, y si el orden es importante en un contexto particular, también British Airways, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, o TAXI. Seguir con este ejemplo, expresamente incluido es combinaciones que contienen repeticiones de uno o más articulo o término, como BB, AAA, B, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, etcétera. El técnico experto entenderá que por lo común no hay ningún limite en la cantidad de artículos o términos en cualquier combinación, a menos que otra cosa evidente del contexto.
Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicaron aquí puede elaborarse y ejecutado sin la experimentación excesiva, en vista de la presente descripción. Mientras las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente a expertos en la técnica que las variaciones pueden aplicarse a las composiciones y/o métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito aquí sin apartarse del 'concepto, espíritu y alcance de la invención. Se considera que todos tales sustitutos similares y las modificaciones evidente para los expertos en la técnica se incluyen dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como definido por las reivindicaciones anexadas.

Claims (57)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab- (PL-Ag) x; Ab- (Ag-PL) x; Ab- ( PL-Ag-PL) x; Ab- (Ag-PL-Ag) ; Ab- (PL-Ag) -PL; o Ab- (Ag-PL) Ag-; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptídico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antígeno; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteína de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteína de fusión sin el sitio de glucosilación.
2. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde Ag se selecciona a partir de un antígeno viral, un antígeno tumoral, un antígeno de enfermedad infectocontagiosa, un antígeno autoinmunitario, una toxina o combinaciones de lo mismo.
3. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde al menos una de Ag o el PL es un concatémero peptídico.
4. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde - (PL-Ag) x, - (Ag-PL) x, - ( PL-Ag-PL) x, o - (Ag-PL-Ag) x se ubica en el terminal carboxi de la cadena pesada de Ab o fragmento de lo mismo.
5. La proteina de fusión según la reivindicación 0, donde Ag provoca como respuesta al menos una respuesta inmunitaria humoral o celular en un hospedero.
6. La proteina de fusión según la reivindicación 0, donde Ab es un anticuerpo anti-CD40.
7. La proteina de' fusión' según la reivindicación 0, donde Ab comprende al menos la región variable del anticuerpo anti-CD40_12E12.3F3 (Número de acceso de ATCC PTA-9854), anti-CD40_12B4.2C10 (No. de Presentación ATCC HS446), y anti-CD40_11B6.1C3 (No. de Presentación ATCC HS440) .
8. La proteina de fusión según la reivindicación 0, donde Ab comprende al menos un dominio variable que tiene 90, 95 99 o el 100 % de la identidad de secuencia con un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NOS.: 148, 150 y 153 o unos dominios variables de cadena ligera de SEQ ID NOS. : 149, 151, 152 o 154, o ambos.
9. La proteina de fusión según la reivindicación 0, donde Ag se selecciona a partir de enfermedades o trastornos autoinmunitarias asociadas con antigenos implicados en la enfermedad autoinmunitaria seleccionada del ácido glutámico descarboxilasa 65 (GAD 65) , ADN de origen natural, proteina básica mielinica, proteina proteolipidica mielinica, componentes de receptor de acetilcolina, tiroglobulina , y el receptor de hormona estimulante de la tiroides (TSH) .
10. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde Ag se selecciona a partir de antígenos de enfermedad infectocontagiosa seleccionados de antígenos bacterianos, virales, parasitarios, y fúngicos.
11. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19.
12. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde la proteína de fusión comprende dos o más Ags de diferentes antígenos separados por al menos un PL.
13. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde la proteína de fusión comprende dos o más Ags separados por al menos un PL que comprende una alanina y serina.
14. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde Ab es un fragmento de anticuerpo seleccionado de Fv, Fab, Fab' , F(ab')2, Fe, o ScFv.
15. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde Ab se une específicamente un CPH tipo I, CPH tipo II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CDllb, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTIN-1, B7.-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor IL-2, ICAM-1, receptor de Fe, receptor de linfocito T, o lectina.
16. La proteína de fusión según la reivindicación 0, donde Ab es IgA, IgD, IgE, IgG o IgM o isotipo de lo mismo.
17. La proteina de fusión según la reivindicación 0, donde Ab es un anticuerpo de humano o un anticuerpo humanizado.
18. La proteina de fusión según la reivindicación 0, donde el PL comprende una alanina y serina.
19. La proteina de fusión según la reivindicación 0, donde el PL se selecciona a partir de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO.: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO.: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO.: 13); o ¦ TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO.: 14).
20. Un vector de expresión de ácido nucleico que codifica para una proteina de fusión que comprende: un primer polinucleótido que codifica para una cadena-ligera de anticuerpo o fragmento de lo mismo; y un segundo polinucleótido que codifica para una cadena pesada de anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde la proteina de fusión comprende la fórmula que sigue: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un numero entero de 1 a 20, la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteina de fusión sin el sitio de glucosilación.
21. El vector según la reivindicación 20, donde (PL-Ag) x or (Ag-PL)x se ubican en el terminal carboxi de la cadena pesada de Ab o fragmento de lo mismo.
22. El vector según la reivindicación 20, donde el primer y segundo polinucleótido está en un vector de expresión individual.
23. El vector según la reivindicación 20, donde Ag se selecciona a partir de antigenos de enfermedad infectocontagiosa seleccionados de antigenos bacterianos, virales, parasitarios, y fúngicos.
24. El vector según la reivindicación 20, donde x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19.
25. El vector según la reivindicación 20, donde la proteina de fusión comprende dos o más Ags de diferentes antigenos separados por al menos un PL.
26. El vector según la reivindicación 20, donde la proteina de fusión comprende dos o más Ags separados por al menos en PL que comprende una alanina y serina.
27. El vector según la reivindicación 20, donde Ab es un fragmento de anticuerpo seleccionado de Fv, Fab, Fab' , F(ab')2, Fe, o ScFv.
28. El vector según la reivindicación 20, donde Ab se une específicamente un CPH tipo I, CPH tipo II, CD1, CD2, CD3, CD4 , CD8, CDllb, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTIN-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-? y receptor IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, receptor de linfocito T, o lectina.
29. El vector según la reivindicación 20, donde Ab es IgA, IgD, IgE, IgG o Ig p isotipo de lo mismo.
30. El vector según la reivindicación 20, donde Ab es un anticuerpo de humano o un anticuerpo humanizado.
31. El vector según la reivindicación 20, donde el PL comprende una alanina y serina.
32. El vector según · la reivindicación 20, donde el PL se selecciona a partir de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO.: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO.: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO. : 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO. : 14).
33. ' El vector según la reivindicación 20, donde los primeros y segundos polinucleótidos son en dirección 3' de un promotor constitutivo.
34. Una proteína de fusión estable, secretable que comprende la fórmula: NH2-Ab- (PL-Ag) -COOH o NH2-Ab- (Ag-PL) x-COOH; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno inmunogénico; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteina de fusión es ' estable y soluble en la solución comparado con una proteina Ab-Ag por si sola que no es soluble o estable.
35. Un método para estabilizar péptidos añtigénicos, que comprende la etapa de incorporar uno o más péptidos añtigénicos que son inestables o insolubles en una proteina de fusión, donde la proteina de fusión tiene la estructura que sigue: Ab- ( PL-Ag) x o Ab- (Ag-PL) ; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20, la proteina de fusión es estable y soluble en la solución donde el Ab-Ag no es soluble o estable..
36. El método según la reivindicación 35, donde Ag se selecciona a partir de un antigeno viral, un antigeno tumoral, un antigeno de enfermedad infectocontagiosa, un antigeno autoinmunitario, una toxina o combinaciones de lo mismo .
37. El método según la reivindicación 35, donde -(PL-Ag)x, -(Ag-PL)x, - ( PL-Ag-PL) x, o -(Ag-PL-Ag)x se ubica en el terminal carboxi de la cadena pesada de Ab o fragmento de lo mismo.
38. El método según la reivindicación 35, donde Ag provoca como respuesta una respuesta inmunitaria humoral en un hospedero.
39. El método según la reivindicación 35, donde Ag provoca como respuesta una respuesta inmunitaria celular en un hospedero.
40. El método según la reivindicación 35, donde Ag se selecciona a partir de enfermedades o trastornos autoinmunitarias que comprenden antigenos implicados en la enfermedad autoinmunitaria seleccionada del ácido glutámico descarboxilasa 65 (GAD 65) , ADN de origen natural, proteina básica mielinica, proteina proteolipidica mielinica, componentes de receptor de acetilcolina, tiroglobulina, y el receptor de hormona estimulante de la tiroides (TSH) .
41. El método según la reivindicación 35, donde Ag se selecciona a partir de antigenos de enfermedad infectocontagiosa seleccionados de antigenos bacterianos, virales, parasitarios, y fúngicos.
42. El método según la reivindicación 35, donde x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19.
43. El método según la reivindicación 35, donde la proteina de fusión comprende dos o más Ags de diferentes antigenos separados por al menos un PL.
44. El método según la reivindicación 35, donde la proteina de fusión comprende dos o más Ags separados por al menos en PL que comprende una alanina y serina.
45. El método según la reivindicación 35, donde Ab es un fragmento de anticuerpo seleccionado de Fv, Fab, Fab' , F(ab' ) 2, Fe, o ScFv.
46. El método según la reivindicación 35, donde Ab es un anticuerpo anti-CD40.
47. El método según la reivindicación 35, donde Ab comprende al menos la región variable del anticuerpo anti-CD40_12E12.3F3 (Número de acceso de ATCC PTA-9854), anti-CD40_12B4.2C10 (No. de Presentación ATCC HS446), y anti-CD40_11B6.1C3 (No. de Presentación ATCC HS440) .
48. El método según la reivindicación 35, donde el PL se selecciona a partir de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP ( SEQ ID NO.: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO.: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO.: 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO.: 14) .
49. El método según la reivindicación 35, donde Ab se une específicamente un CPH tipo I, CPH tipo II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CDllb, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de mañosa, Langerina, DECTIN-1, B7-1, B7-2, receptor IFN-a y receptor IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy, receptor de linfocito T, o lectina.
50. El método según la reivindicación 35, donde Ab es IgA, IgD, IgE, IgG o IgM o isotipo de lo mismo.
51. El método según la reivindicación 35, donde Ab es un anticuerpo de humano o un anticuerpo humanizado.
52. Una célula hospedera que comprende un vector de expresión de ácido nucleico que comprende: un primer polinucleótido que codifica para una cadena ligera de anticuerpo; y un segundo polinucleótido que codifica para una proteina de fusión de cadena pesada de anticuerpo, la proteina de fusión comprende la fórmula que sigue: Ab-(PL-Ag)x o Ab- (Ag-PL) ; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20, la' proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que la proteina de fusión sin el sitio de glucosilación.
53. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 0.
54. Una proteina de fusión que comprende la fórmula: Ab- (PL-Ag) - (PLy-Agz) n; o Ab- (Ag-PL) x- (PLy-Agz) n; donde Ab es un anticuerpo o fragmento de lo mismo; donde PL es al menos un ligador peptidico que comprende al menos un sitio de glucosilación; donde Ag es al menos un antigeno; y donde x es un número entero de 1 a 20; donde n es 0 a 19; y donde y o z es 0 a 10, donde la proteina de fusión tiene más estabilidad en solución que la. misma proteina de fusión sin el sitio de glucosilación.
55. Una vacuna aislada y purificada que comprende: una cadena pesada seleccionada de al menos un de SEQ ID NOS.: 6, 7, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 19, 20, 36, 37, 96, 97, 98, 99, 110, 111, 112, 118, 119, 134, 136, 138, 146 y 147, que se une específicamente a CD40; y una cadena ligera que se une específicamente a CD40.
56. El anticuerpo según la reivindicación 55, donde el anticuerpo es definido adicionalmente como un anticuerpo humanizado .
57.
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