ES2911752T3

ES2911752T3 - Anticuerpos contra CD40

Info

Publication number: ES2911752T3
Application number: ES16189342T
Authority: ES
Inventors: Gerald Zurawski; Jacques Banchereau; Anne-Laure Flamar; Monica Montes; Peter Klucar; Keiko Akagawa
Original assignee: Baylor Research Institute
Current assignee: Baylor Research Institute
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2030-03-04
Also published as: CN102770457A; TW201100097A; PT3091034T; TW201100096A; CN108373509A; TWI542358B; CN105837691A; DK3138854T3; US20150299329A1; US20210221904A1; DK3091034T3; BRPI1009458A2; EP3091034A1; CN105884903A; TWI505835B; CN102741295A; AU2010222929A1; AU2010222928A1; MX2011009439A; MX337397B

Abstract

Anticuerpo anti-CD40 que comprende a. por lo menos un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1L, CDR2L y CDR3L, presentando la CDR1L la secuencia de aminoácidos SASQGISNYLN, presentando la CDR2L la secuencia de aminoácidos YTSILHS y presentando la CDR3L la secuencia de aminoácidos QQFNKLPPT; y b. por lo menos un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1H, CDR2H y CDR3H, presentando la CDR1H la secuencia de aminoácidos GFTFSDYYMY, presentando la CDR2H la secuencia de aminoácidos YINSGGGSTYYPDTVKG, y presentando la CDR3H la secuencia de aminoácidos RGLPFHAMDY.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra CD40

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la inmunización, y más concretamente, a nuevas vacunas basadas en anti-CD40 contra el cáncer.

Técnica anterior

Sin limitar el alcance de la invención, sus antecedentes se describen en relación con la presentación de antígenos. Un ejemplo de vacunas y métodos para la presentación de antígenos se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 7.118.751, expedida a Ledbetter, et al., para vacunas de ADN que codifican un antígeno amino terminal conectado a un dominio carboxi-terminal que se une a CD40. Brevemente, se describen vacunas que se dirigen a uno o más antígenos para un receptor de la superficie celular para mejorar la respuesta inmunitaria humoral y celular específica del antígeno. Los antígenos unidos a un dominio que se une a un receptor de superficie celular se internalizan, portando antígenos a un compartimento intracelular donde los antígenos se digieren hasta péptidos y se cargan en moléculas del MHC. Las células T específicas para los antígenos peptídicos se activan, dando lugar a una respuesta inmunitaria mejorada. La vacuna puede comprender antígenos conectados a un dominio que se une a por lo menos un receptor o un plásmido de a Dn que codifica uno o varios antígenos conectados a un dominio que se une por lo menos a un receptor. Una realización preferida de la invención dirige el antígeno env de VIH-1 al receptor CD40, dando como resultado la liberación de antígeno a células positivas para CD40, y la activación selectiva del receptor CD40 en células que presentan antígenos env de VIH-1 a células T.

Otro ejemplo se encuentra en la solicitud de patente US n° 20080254026, presentada por Li, et al., para anticuerpos monoclonales anti-CD40 antagónicos y métodos para su uso. En resumen, se describen composiciones y métodos para su uso en terapia para el tratamiento de enfermedades mediadas por la estimulación de la señalización CD40 en células que expresan CD40. Los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 antagónico o fragmento de unión a antígeno del mismo a un paciente que lo necesite. El anticuerpo anti-CD40 antagónico o fragmento de unión a antígeno del mismo está libre de actividad agonística significativa, pero exhibe actividad antagónica cuando el anticuerpo se une a un antígeno CD40 en una célula que expresa CD40 humana. La actividad antagónica del anticuerpo anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe de manera beneficiosa la proliferación y/o diferenciación de células que expresan CD40 humano, tales como células B.

Otro ejemplo más se describe en la solicitud de patente US n° 20080241139, presentada por Delucia para una combinación coadyuvante que comprende un agonista de TLR microbiano, un agonista de CD40 o 4-1BB, y opcionalmente un antígeno y su uso para inducir un aumento sinérgico en la inmunidad celular. En resumen, se dice que esta aplicación ilustra combinaciones coadyuvantes que comprenden por lo menos un agonista de TLR microbiano tal como un virus completo, bacteria o levadura o porción de los mismos, tal como una membrana, un esferoplasto, un citoplasto o un fantasma, un agonista de CD40 o 4-1BB y opcionalmente un antígeno en donde los 3 radicales pueden estar separados o comprender el mismo microorganismo o virus recombinante. También se proporciona el uso de estos coadyuvantes inmunitarios para el tratamiento de diversas enfermedades crónicas tales como cánceres e infección por VIH.

La solicitud de patente US n° 20080199471, presentada por Bernett, et al., se refiere a anticuerpos CD40 optimizados y a métodos para su uso. En resumen, se dice que esta solicitud ilustra anticuerpos dirigidos a CD40, en donde los anticuerpos comprenden por lo menos una modificación relativa a un anticuerpo parental, en donde la modificación altera la afinidad hacia un FcyR o altera la función efectora en comparación con el anticuerpo parental. También se describen métodos de utilización de los anticuerpos de la invención.

Finalmente, la solicitud de patente US n° 20080181915, presentada por Tripp, et al., se refiere a un coadyuvante de ligando CD40 para el virus respiratorio sincitial. Brevemente, se dice que esta solicitud ilustra métodos y coadyuvantes para potenciar una respuesta inmunitaria a RSV en un anfitrión, en donde los métodos y los coadyuvantes comprenden una fuente de una proteína de unión a CD40. Preferiblemente, la proteína de unión a CD40 es CD40L y la fuente es un vector que comprende un promotor unido operativamente a una región codificadora de CD40L. La respuesta inmunitaria mejorada producida por los coadyuvantes y métodos de la presente invención incluye tanto una mayor expresión de citocinas Th1 como un aumento de producción de anticuerpos.

El documento 2004/120948 se refiere a anticuerpos para el CD40 humano. El documento WO 2007/130493 se refiere a adyuvantes sinérgicos que comprenden por lo menos un interferón de tipo I y por lo menos un agonista de CD40 y su utilización en el aumento de la eficacia de las vacunas.

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CD40 que comprende a. por lo menos un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^l) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1^l, CDR2^ly CDR3^l, presentando la CDR1^lla secuencia de aminoácidos SASQGISNYLN, presentando la CDR2^lla secuencia de aminoácidos YTSILHS y presentando la CDR3^lla secuencia de aminoácidos QQFNKLPPT; y b. por lo menos un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V^h) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1^h, CDR2^hy CDR3^h, presentando la CDR1^hla secuencia de aminoácidos GFTFSDYYMY, presentando la CDR2^hla secuencia de aminoácidos YINSGGGSTYYPDTVKG, y presentando la CDR3^hla secuencia de aminoácidos RGLPFHAMDY.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-CD40 de la invención que está humanizado y comprende una región variable de cadena pesada (V^h) y una región variable de cadena ligera (V^l) en el que las regiones marco de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera son de un anticuerpo humano de donante, ligado a uno o más moléculas efectoras, antígeno(s) y/o etiqueta(s) detectables.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de unión anti-CD40 de la invención o un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una línea celular de hibridoma depositada con la ATCC (número de acceso PTA-9854).

Es divulgada en la presente memoria una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x; Ab-(Ag-PL)x; Ab-(PL-Ag-PL)x; Ab-(Ag-PL-Ag)x; Ab-(PL-Ag)x-PL; o Ab-(Ag-PL)x-Ag; en donde Ab es un anticuerpo o un fragmento del mismo; en donde PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; en donde Ag es por lo menos un antígeno; y en donde x es un número entero de 1 a 20, presentando la proteína de fusión más estabilidad en disolución que la misma proteína de fusión sin el sitio de glicosilación. En otro aspecto de la divulgación, el PL es un concatámero peptídico. En otro aspecto de la divulgación, el -(PL-Ag)x, -(Ag-PL)x, -(PL-Ag-PL)x o -(Ag-PL-Ag)x se localizan en el extremo carboxi de la cadena pesada de Ab o fragmento del mismo. En otro aspecto, el Ag provoca una respuesta inmunitaria humoral y/o respuesta inmunitaria celular en un anfitrión. En un aspecto, el Ab comprende por lo menos la región variable de anti-CD40_12E12.3F3 (Núm. de Acceso ATCC PTA-9854), anti-CD40_12B4.2C10 (Núm. de Depósito HS446, Núm. de Acceso ATCC__) y anti-CD40_11B6 .1C3 (Núm. de Depósito HS440, Núm. de Acceso a Tc C __).

En un aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre enfermedades autoinmunitarias o trastornos asociados con antígenos implicados en una enfermedad autoinmunitaria seleccionados entre ácido glutámico descarboxilasa 65 (GAD 65), ADN nativo, proteína básica de mielina, proteína proteolipídica de mielina, componentes del receptor de acetilcolina, tiroglobulina, y el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSH). En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre antígenos de enfermedades infecciosas seleccionadas entre antígenos bacterianos, virales, parasitarios y fúngicos. En otro aspecto, x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19. En otro aspecto, la proteína de fusión comprende dos o más Ag de diferentes antígenos separados por por lo menos un PL. En otro aspecto, la proteína de fusión comprende dos o más Ag separados por por lo menos un PL que comprende una alanina y una serina. En otro aspecto, el Ab es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, o un ScFv.

En un aspecto de la divulgación, el Ab se une específicamente a un MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD43, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor Fcy, receptor de células T o lectina. En otro aspecto, el Ab es una IgA, IgD, IgE, IgG o IgM o uno de sus isotipos. En otro aspecto de la divulgación, el Ab es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En otro aspecto de la divulgación, el PL comprende una alanina y una serina. En otro aspecto de la divulgación, el PL se selecciona de: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEC ID N°: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEC ID N°: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°: 13); o TNGSITV AATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14).

En otra realización más de la presente divulgación es un vector de expresión de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende: un primer polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo o fragmento de la misma; y un segundo polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo o fragmento de la misma; en donde la proteína de fusión comprende la siguiente fórmula: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; en donde PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; en donde Ag es por lo menos un antígeno; y en donde x es un número entero de 1 a 20, teniendo la proteína de fusión más estabilidad en solución que la misma proteína de fusión sin el sitio de glicosilación. En un aspecto de la divulgación, el (PL-Ag)x o (Ag-PL)x se encuentran en el extremo carboxi de la cadena pesada de Ab o fragmento del mismo. En otro aspecto de la divulgación, el primer y el segundo polinucleótidos están en un único vector de expresión. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre antígenos de enfermedades infecciosas seleccionadas entre antígenos bacterianos, virales, parasitarios y fúngicos. En otro aspecto de la divulgación, x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, l 8 o 19. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende dos o más Ag de diferentes antígenos separados por por lo menos un PL. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende dos o más Ag separados por por lo menos un PL que comprende una alanina y una serina. En otro aspecto de la divulgación, el Ab es un fragmento de anticuerpo seleccionado entre Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, o un ScFv. En otro aspecto de la divulgación, el Ab se une específicamente a un MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, ^cD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD43, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTINA-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-Yy receptor de IL-2, ICAM-1, receptor Fcy, receptor de células T o lectina. En otro aspecto de la divulgación, el Ab es una IgA, IgD, IgE, IgG o IgM o isotipo del mismo. En otro aspecto de la divulgación, el Ab es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. El PL comprende una alanina y una serina y el PL se selecciona entre: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEC ID N°: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEC ID N°: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°: 13); o TNGSITV AATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14). En otro aspecto de la divulgación, el primer y el segundo polinucleótidos están aguas abajo de un promotor constitutivo.

Otra realización más de la presente divulgación es una proteína de fusión estable, secretable que comprende la fórmula: NH2-Ab-(PL-Ag)x-COOH o NH2-Ab-(Ag-PL)x-COOH; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; en donde PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; en donde Ag es por lo menos un antígeno inmunogénico; y en donde x es un número entero de 1 a 20, siendo la proteína de fusión estable y soluble en solución en comparación con una proteína Ab-Ag sola que no es soluble ni estable.

Otra realización de la descripción es un método para estabilizar péptidos antigénicos que comprende: incorporar uno o más péptidos antigénicos que son inestables o insolubles a una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión tiene la siguiente estructura: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; en donde PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; en donde Ag es por lo menos un antígeno; y en donde x es un número entero de 1 a 20, siendo la proteína de fusión estable y soluble en solución en donde el Ab-Ag no es soluble ni estable.

Otra realización más de la presente divulgación es una célula anfitriona que comprende un vector de expresión de ácido nucleico que comprende: un primer polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo; y un segundo polinucleótido que codifica una proteína de fusión de cadena pesada de anticuerpo, comprendiendo la proteína de fusión la siguiente fórmula: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; en donde PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; en donde Ag es por lo menos un antígeno; y en donde x es un número entero de 1 a 20, teniendo la proteína de fusión más estabilidad en solución que la proteína de fusión sin el sitio de glicosilación. En otra realización de la descripción, la célula anfitriona comprende un vector de expresión que produce una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x; Ab-(Ag-PL)x; Ab-(PL-Ag-PL)x; Ab-(Ag-PL-Ag)x; Ab-(PL-Ag)x-PL; o Ab-(Ag-PL)x-Ag; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; en donde PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; en donde Ag es por lo menos un antígeno; y en donde x es un número entero de 1 a 20, teniendo la proteína de fusión más estabilidad en solución que la misma proteína de fusión sin el sitio de glicosilación.

La presente divulgación también incluye una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo que tiene la fórmula que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x; Ab-(Ag-PL)x; Ab-(PL-Ag-PL)x; Ab-(Ag-PL-Ag)x; Ab(PL-Ag)x-PL; o Ab-(Ag-PL)x-Ag; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; en donde PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; en donde Ag es por lo menos un antígeno; y en donde x es un número entero de 1 a 20, teniendo la proteína de fusión más estabilidad en solución que la misma proteína de fusión sin el sitio de glicosilación.

Otra realización más de la presente divulgación es una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x-(PLy-Agz)n; o Ab-(Ag-PL)x-(PLy-Agz)n; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; en donde PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; en donde Ag es por lo menos un antígeno; y en donde x es un número entero de 1 a 20; en donde n es 0 a 19; y en donde y o z es de 0 a 10, en donde la proteína de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteína de fusión sin el sitio de glicosilación.

Otra realización de la descripción es una vacuna aislada y purificada que comprende: una cadena pesada seleccionada entre por lo menos una de los SEC ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 19, 20, 36, 37, 96, 97, 98, 99, 110, 111, 112, 118, 119, 134, 136, 138, 146 y 147 que se une específicamente a CD40; y una cadena ligera que se une específicamente a CD40. En un aspecto, el anticuerpo se define adicionalmente como un anticuerpo humanizado.

Otra realización más de la presente divulgación es una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x; Ab-(Ag-PL)x; Ab-(PL-Ag-PL)x; Ab-(Ag-PL-Ag)x; Ab-(PL-Ag)x-PL; o Ab-(Ag-PL)x-Ag; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; Ag es por lo menos un antígeno viral; y x es un número entero de 1 a 20. En un aspecto de la divulgación, la proteína de fusión tiene más estabilidad que el PL sin el sitio de glicosilación. En otro aspecto de la divulgación, el Ag comprende un péptido de un adenovirus, retrovirus, picornavirus, herpesvirus, rotavirus, hantavirus, coronavirus, togavirus, flavirvirus, rabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenavirus, reovirus, papilomavirus, parvovirus, poxvirus, hepadnavirus o virus espongiforme. En otro aspecto de la divulgación, el Ag comprende un péptido de por lo menos uno de los virus VIH, CMV, de la hepatitis A, B y C, de la influenza; del sarampión, de la polio, de la viruela, de la rubéola, sincitial respiratorio, del herpes simple, varicela zoster, de Epstein-Barr, de la encefalitis japonesa, de la rabia, de la gripe o del resfriado.

En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre: Nef (66-97): VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEC ID N°: 1); Nef (116-145): HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEC ID N°: 2); Gag p17 (17-35): EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEC ID N°: 3); Gag p17-p24 (253-284): NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEC ID N°: 4); o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEC ID N°: 5). En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene de 19 a 32 residuos. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) identificado en las proteínas Nef, Gag y Env de VIH-1 presentadas en el contexto de moléculas de clase I de MHC. En otro aspecto, el Ag se selecciona entre gp120, gp41, Gag, p17, p24, p2, p7, p1, p6, Tat, Rev, PR, RT, IN, Vif, Vpr, Vpx, Vpu y Nef de VIH. En otro aspecto de la divulgación, x Comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19. En otro aspecto de la divulgación, el Ag comprende péptidos víricos de diferentes antígenos separados por diferentes conectores peptídicos. En otro aspecto de la divulgación, el Ag está separado por por lo menos un Pl que comprende una alanina y una serina. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión se selecciona entre SEC ID N°: 21,22, 23, 24, 25, 26 o 36. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión se aísla de una célula que comprende un vector polinucleotídico que codifica la proteína de fusión, comprendiendo el vector polinucleotídico los SEC ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 36. En otro aspecto de la divulgación, el Ab comprende s Ec ID N°: 37 y 38.

En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión está aislada una célula que comprende un vector polinucleotídico que expresa la proteína de fusión y la porción Ab comprende los SEC ID N°: 39 y 40. En otro aspecto de la divulgación, Ag se selecciona entre por lo menos uno de los SEC ID NO: 52-56, 58 - 60, 61 - 69, 70 - 72, o 73 - 77. En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene de 17 a 60 residuos. En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 a 60 residuos de longitud. En otro aspecto de la divulgación, el Ag comprende por lo menos un lipopéptido. En otro aspecto de la divulgación, el Ag está en el extremo carboxi y comprende adicionalmente un grupo (Palm)-NH2 carboxi terminal. En otro aspecto de la divulgación, el PL se selecciona entre: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEC ID N°: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEC ID N°: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°: 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14). En otro aspecto de la divulgación, el PL comprende una alanina y una serina.

Otra realización de la presente divulgación es un vector de suministro de antígeno viral que comprende: una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo y uno o más péptidos virales en el extremo carboxi del anticuerpo anti-CD40, en donde cuando están presentes dos o más péptidos, los péptidos virales están separados por uno o más conectores peptídicos que comprenden por lo menos un sitio potencial de glicosilación. En otro aspecto de la divulgación, un vector de suministro de antígeno es un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo y dos o más péptidos virales en el extremo carboxi de la cadena ligera, de la cadena pesada o de las cadenas tanto ligera como pesada del anticuerpo anti-CD40, en donde dos o más péptidos virales están separados por uno o más conectores peptídicos que comprenden por lo menos un sitio potencial de glicosilación.

Otra realización más de la presente divulgación es un método para estabilizar péptidos virales que comprende: incorporar uno o más péptidos virales que son inestables o insolubles en una proteína de fusión con un anticuerpo, en donde el anticuerpo y los péptidos virales están separados por uno o más conectores peptídicos que comprenden uno o más sitios de glicosilación. Otra realización más de la divulgación es un método para mejorar las respuestas de células T que comprende: inmunizar un sujeto que necesita una vacunación con una cantidad eficaz de una vacuna que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; en donde Ab es un anticuerpo o un fragmento del mismo; PL es por lo menos un conector peptídico; que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; Ag es por lo menos un antígeno vírico; y x es un número entero de 1 a 20. En un aspecto de la divulgación, la proteína de fusión tiene más estabilidad en solución que una proteína de fusión idéntica sin el sitio de glicosilación. En otro aspecto de la divulgación, el por lo menos un antígeno viral comprende péptidos de adenovirus, retrovirus, picornavirus, herpesvirus, rotavirus, hantavirus, coronavirus, togavirus, flavirvirus, rabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenavirus, reovirus, papilomavirus, parvovirus, poxvirus, hepadnavirus, o virus espongiforme. En otro aspecto, el por lo menos un antígeno viral puede comprender péptidos de por lo menos uno de los virus VIH, CMV, de la hepatitis A, B y C, de la influenza; del sarampión, de la poliomielitis, de la viruela, de la rubéola; respiratorio sincitial, del herpes simple, de la varicela zoster, de Epstein-Barr, de la encefalitis japonesa, de la rabia, de la gripe o del resfriado.

En un aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre: Nef (66-97): VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEC ID N°: 1); Nef (116-145): HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEC ID N°: 2); Gag p17 (17-35): EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEC ID N°: 3); Gag p17-p24 (253-284): NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEC ID N°: 4); y/o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEC ID N°: 5). En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene de 19 a 32 residuos y se selecciona entre un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) identificado en las proteínas Nef, Gag y Env de VIH-1 presentadas en el contexto de moléculas de clase de MHC-I. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre gp120, gp41, gag, p17, p24, p2, p7, p1, p6, Tat, Rev, PR, RT, IN, Vif, Vpr, Vpx, Vpu y Nef de VIH. En otro aspecto de la divulgación, x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19. En otro aspecto de la divulgación, el Ag comprende dos o más antígenos virales de diferentes virus. En otro aspecto, PL comprende una alanina y una serina. En otro aspecto de la divulgación, la vacuna se selecciona entre los SEC ID N°: 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 36. En otro aspecto de la divulgación, el Ab comprende los SEC ID N°: 37 y 38. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre por lo menos uno de los SEC ID NO: 52-56, 58-6o, 61-69, 70-72 o 73-77. En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene de 17 a 60 residuos. En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 a 60 residuos. En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 a 60 residuos. En otro aspecto de la divulgación, el Ag comprende un lipopéptido. En otro aspecto, el Ag está en el extremo carboxi terminal y comprende un grupo (Palm)-NH2 terminal carboxi. En otro aspecto de la divulgación, el PL se selecciona entre: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEC ID N°: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEC ID N°: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°: 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14).

Otra realización más de la presente divulgación es un método para preparar células T productoras de IFNy específicas de péptidos de VIH que comprende: inmunizar un sujeto con una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40, o fragmento del mismo, con uno o más péptidos de VIH en el extremo carboxi terminal del anticuerpo; y aislar células mononucleares de sangre periférica del sujeto, en donde las células mononucleares periféricas aisladas se enriquecen en células T productoras de IFNy anti-VIH, en donde el anticuerpo anti-CD40 comprende los SEC ID N°: 37 y 38 o fragmentos de los mismos. En un aspecto de la divulgación, el sujeto es un paciente sospechoso de tener una infección por VIH. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos de VIH y los péptidos están separados por uno o más conectores peptídicos. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos de VIH y los péptidos están separados por uno o más de los conectores peptídicos que comprenden secuencias de glicosilación. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos de VIH y los péptidos están separados por uno o más conectores peptídicos que comprenden una alanina y una serina. En otro aspecto de la divulgación, los uno o más péptidos del VIH comprenden por lo menos un lipopéptido. Los uno o más péptidos del VIH pueden comprender un grupo (Palm)-NH2 carboxi terminal. En otro aspecto de la divulgación, los uno o más péptidos de VIH son de 19 a 32 aminoácidos de longitud y son seleccionados de entre los epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) identificados en las proteínas Nef, Gag y Env de VIH-1 en el contexto de diferentes moléculas del MHC de clase I. En otro aspecto de la divulgación, los uno o más péptidos de VIH son seleccionados de entre gp120, gp41, gag, p17, p24, p2, p7, p1, p6, Tat, Rev, PR, RT, IN, Vif, Vpr, Vpx, Vpu y Nef de VIH. En otro aspecto de la divulgación, los uno o más péptidos virales son seleccionados de entre por lo menos uno de: Nef (66 - 97): VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEC ID N°: 1); Nef (116-145): HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEC ID N°: 2); Gag p17 (17-35): EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEC ID N°: 3); Gag p17-p24 (253-284): NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEC ID N°: 4); y/o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEC ID N°: 5).

Otra realización más de la presente divulgación es una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40, o fragmento del mismo, con uno o más péptidos virales en el extremo carboxi del anticuerpo separados por un PL que comprende por lo menos una alanina y una serina. En un aspecto de la divulgación, los uno o más péptidos virales son péptidos de VIH. En otro aspecto de la divulgación, los uno o más péptidos virales son seleccionados de entre por lo menos uno de: Nef (66-97): VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEC ID N°: 1); Nef (116-145): HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEC ID N°: 2); Gag p17 (17-35): EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEC ID N°: 3); Gag p17-p24 (253-284): NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEC ID N°: 4); y/o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEC ID N°: 5).

La presente divulgación también incluye un método para preparar una proteína de fusión que comprende: insertar en un vector de expresión un constructo de ácido nucleico que comprende polinucleótidos que codifican una proteína que tiene la fórmula: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; Ag es por lo menos un antígeno viral; y x es un número entero de 1 a 20; y cultivar el vector en condiciones suficientes para permitir la expresión de la proteína de fusión. En un aspecto de la divulgación, la proteína de fusión tiene más estabilidad en solución que una proteína de fusión idéntica sin el sitio de glicosilación. En otro aspecto de la divulgación, el por lo menos un antígeno viral comprende péptidos de un adenovirus, retrovirus, picornavirus, herpesvirus, rotavirus, hantavirus, coronavirus, togavirus, flavirvirus, rabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenavirus, reovirus, papilomavirus, parvovirus, poxvirus, hepadnavirus o virus espongiforme. En otro aspecto de la divulgación, el por lo menos un antígeno viral comprende péptidos de por lo menos uno de VIH, CMV, hepatitis A, B y C, gripe; Sarampión, polio, viruela, rubéola, sincitial respiratorio, herpes simple, varicela zoster, Epstein-Barr, encefalitis japonesa, rabia, gripe o virus del resfriado. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión es la cadena ligera de Ab, la cadena pesada de Ab o ambas cadenas ligeras y pesadas de Ab. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre: Nef (66-97): VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEC ID N°: 1); Nef (116-145): HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEC ID N°: 2); Gag p17 (17-35): EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEC ID N°: 3); Gag p17-p24 (253-284): NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEC ID N°: 4); y/o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEC ID N°: 5).

Otra realización más de la presente divulgación incluye un método para expandir células T específicas de antígeno in vitro que comprende: aislar PBMC de un paciente de VIH; incubar las PBMC aisladas con una cantidad eficaz de una vacuna de péptido de VIH aCD40.LIpO5; expandir las PBMC en presencia de una cantidad eficaz de IL-2; recolectar las células; y evaluar la producción de citocinas por las células para determinar la presencia de células T específicas anti-VIH. Otra realización de la descripción es una célula T específica del antígeno de VIH preparada por el método que comprende: aislar PBMC de un paciente de VIH; incubar las PBMC aisladas con una cantidad eficaz de una vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5; expandir las PBMC en presencia de una cantidad eficaz de IL-2; recolectar las células; y evaluar la producción de citocinas por las células para determinar la presencia de células T específicas anti-VIH. Otra realización de la descripción es un método para preparar una vacuna terapéutica que comprende: cargar una célula dendrítica con aCD40.LIPO5, que comprende: aislar monocitos de pacientes de VIH; diferenciar los monocitos a células dendríticas con IFNa y GM-CSF; y exponer las células dendríticas diferenciadas a un péptido aCD40.LIPO5, en donde las células dendríticas cargadas son capaces de estimular células T específicas de péptidos de VIH autólogas in vitro.

La presente divulgación también incluye una vacuna terapéutica preparada por el método que comprende: cargar una célula dendrítica con aCD40.LIPO5, que comprende: aislar monocitos de pacientes de VIH; diferenciar los monocitos a células dendríticas con IFNa y GM-CSF; y exponer las células dendríticas diferenciadas a un aCD40.LIPO5, en donde las células dendríticas cargadas son capaces de estimular células T específicas de péptidos de VIH autólogas in vitro. Otra realización de la descripción es una vacuna terapéutica que comprende un polipéptido que comprende por lo menos uno de los SEC ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 36. Otra realización más de la descripción es una vacuna terapéutica que comprende una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x; Ab-(Ag-PL)x; Ab-(PL-Ag-PL)x; Ab-(Ag-PL-Ag)x; Ab-(PL-Ag)x-PL; o Ab-(Ag-PL)x-Ag; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; Ag es por lo menos un antígeno viral; y x es un número entero de 1 a 20.

Otra realización más de la presente divulgación incluye una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x; Ab-(Ag-PL)x; Ab-(PL-Ag-PL)x; Ab-(Ag-PL-Ag)x; Ab-(PL-Ag)x-PL; o Ab-(Ag-PL)x-Ag; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; Ag es por lo menos un antígeno canceroso; y x es un número entero de 1 a 20. En un aspecto de la divulgación, la proteína de fusión tiene más estabilidad en solución que la misma proteína de fusión sin el sitio de glicosilación. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre antígenos asociados a tumores seleccionados entre CEA, antígeno prostático específico (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 y 12, proteína relacionada con MUC (Mucina) gangliósidos GM2 y GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antígeno de melanoma), MARCOMART, ciclina B1, ciclina D, Pmel 17 (gp100), secuencia intrónica V de GnT-V (secuencia V del intrón de la N-acetilglucosaminiltransferasa V), psm Ca de próstata, antígeno prostático en suero (PSA), PRAME (antígeno de melanoma), p-catenina, MUM-1-B (producto génico mutado ubicuo de melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) 1, BAGE (antígeno del melanoma) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (antígeno nuclear del virus Epstein-Barr) 1-6, gp75, virus del papiloma humano (HPV) E6 y E7, p53, ), proteína relacionada con la resistencia en pulmón (LRP), Bcl-2 y Ki-67. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre antígenos asociados a tumores que comprenden antígenos de leucemias y linfomas, tumores neurológicos tales como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, tumores genitourinarios tales como cáncer de cuello uterino, útero, ovario, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer de pene, tumores óseos, tumores vasculares o cánceres de labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, recto, cáncer de próstata, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmones y bronquios, vejiga, riñón, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple y leucemia.

En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre por lo menos uno de:

MWVVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV (SEC ID N°: 74);

LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD (SEC ID N°: 75);

LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS (SEC ID N°: 76);

NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP (SEC ID N°:

77); o SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEC ID N°:78), y fragmentos de los mismos. En otro aspecto, el Ag se selecciona entre por lo menos uno de: IMDQVPFSV (SEC ID N°: 113); ITDQVPFSV (SEC ID N°: 114);

YLEPGPVTV (SEC ID N°: 115); YLEPGPVTA (SEC ID N°: 116); KTWGQYWQV (SEC ID N°: 117);

DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQD WLGV SRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDC WRGGQV SLK

VSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDG

GPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSY

VPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (SEC ID NO.: 122);

PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXWTHTYLEPGPVTAQWLQAAIPLTSC

GSSPVPAS (SEC ID NO.: 124);

GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEWGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAEST

GMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIWLSGTTAA (SEC ID NO.: 126);

QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSF

SVTLDIVQ (SEC ID N°: 128); y

GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQIL

KGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (SEC ID N°: 130), y fragmentos de los mismos.

MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY (SEC ID N°: 132); y DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK (SEC ID N°: 133). En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre por lo menos uno de:

MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (SEC ID N°: 141);

QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASK

MKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (SEC ID NO.: 142);

LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV (SEC ID N°: 143);

y

AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDP

KAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEC ID N°: 144), y fragmentos de los mismos. En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene de 19 a 32 aminoácidos de longitud. En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene de 17 a 60 aminoácidos de longitud y se selecciona entre un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) identificado en PSA o ciclina 1. En otro aspecto de la divulgación, x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19. En otro aspecto de la divulgación, el Ag comprende dos o más péptidos cancerosos de diferentes antígenos cancerosos separados por el PL. En otro aspecto de la divulgación, el Ag está separado por por lo menos un PL que comprende una alanina y una serina. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre los SEC ID N°: 74-78, 79-86, 87-92, 93-95, 113-117, 122-130, 132 133 y 141-144. En otro aspecto de la divulgación, el Ab comprende los SEC ID N°: 38 y 39. En otro aspecto de la divulgación, el Ab se expresa mediante un vector de expresión de ácido nucleico que comprende los SEC ID N°: 40 y 41. En otro aspecto de la divulgación, el PL se selecciona entre:

SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEC ID N°: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEC ID N°: 12);

TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°: 13); o

TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14). En otro aspecto de la divulgación, el PL comprende una alanina y una serina.

Otra realización más de la presente divulgación incluye un vector de suministro de antígeno que expresa un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo y dos o más péptidos cancerosos en el extremo carboxi de la cadena ligera, de la cadena pesada o de las cadenas tanto ligera como pesada del anticuerpo anti-CD40, en donde cuando están presentes dos o más péptidos cancerosos, los péptidos cancerosos están separados por uno o más conectores peptídicos que comprenden por lo menos un sitio de glicosilación. En un aspecto de la divulgación, los uno o más de los conectores peptídicos se seleccionan entre: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEC ID N°: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEC ID N°: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°: 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14).

Otra realización más de la presente divulgación incluye una proteína de fusión anti-CD40 que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo y uno o más péptidos cancerosos en el extremo carboxi del anticuerpo anti-CD40, en donde cuando están presentes dos o más péptidos cancerosos los péptidos cancerosos están separados por uno o más péptidos conectores que comprenden por lo menos un sitio de glicosilación. En un aspecto de la divulgación, el fragmento de anticuerpo se selecciona entre un fragmento Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, o ScFv. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre SEC ID N°: 74-78, 79-86, 87-92, 93-95, 1l3-117, 122-130, 132-133 y 141-144.

Otra realización más de la presente divulgación incluye un método para estabilizar péptidos cancerosos que comprende: incorporar uno o más péptidos cancerosos que son inestables o insolubles en una proteína de fusión con un anticuerpo, en donde el anticuerpo y los cancerosos están separados por uno o más conectores peptídicos que comprenden uno o más sitios de glicosilación. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos cancerosos y los péptidos cancerosos están separados por uno o más ligandos peptídicos. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos cancerosos y los péptidos cancerosos están separados por uno o más conectores peptídicos. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos cancerosos y los péptidos cancerosos están separados por uno o más conectores que comprenden una alanina y una serina. En otro aspecto de la divulgación, el péptido canceroso se selecciona entre antígenos asociados a tumores seleccionados entre CEA, antígeno prostático específico (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 y 12, proteína relacionada con MUC (Mucina) (MUC-1, m Uc -2, etc.), gangliósidos GM2 y GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antígeno de melanoma), MARCO-MART, ciclina B1, ciclina D, Pmel 17 (gp100), secuencia intrónica V de GnT-V (secuencia V del intrón de la N-acetilglucosaminiltransferasa V), psm Ca de próstata, antígeno prostático en suero (PSA), PRAME (antígeno de melanoma), p-catenina, MUM-1-B (producto génico mutado ubicuo de melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) 1, BAGE (antígeno del melanoma) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (antígeno nuclear del virus Epstein-Barr) 1-6, gp75, virus del papiloma humano (HPV) E6 y E7, p53, proteína relacionada con la resistencia en pulmón (LRP), Bcl-2 y Ki-67. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre antígenos asociados a tumores que comprenden antígenos de leucemias y linfomas, tumores neurológicos tales como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, tumores genitourinarios tales como cáncer de cuello uterino, útero, ovario, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer de pene, tumores óseos, tumores vasculares o cánceres de labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, recto, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmones y bronquios, vejiga, riñón, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple y leucemia.

MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV (SEC ID N°:

74);

LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD (SEC ID N°: 75);

LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS (SEC ID N°: 76);

NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP (SEC ID N°:

77); o SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEC ID N°: 78).

En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre por lo menos uno de: IMDQVPFSV (SEC ID N°: 113);

ITDQVPFSV (SEC ID N°: 114); YLEPGPVTV (SEC ID N°: 115); YLEPGPVTA (SEC ID N°: 116);

KTWGQYWQV (SEC ID N°: 117);

DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQD WLGV SRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDC WRGGQV SLK

VSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDG

GPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSY

VPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (SEC ID NO.: 122);

PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTW DFGDSSGTLISRAXW THTYLEPGPVTAQW LQAAIPLTSC

GSSPVPAS (SEC ID NO.: 124);

GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAEST

GMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIWLSGTTAA (SEC ID NO.: 126);

QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSF

SVTLDIYQ (SEC ID NO.: 128);

y

GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQIL

KGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (SEC ID NO.: 130),

y fragmentos de los mismos.

MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY (SEC ID N°: 132); y DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK (SEC ID N°: 133).

MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (SEC ID N°: 141);

QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASK

MKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (SEC ID NO.: 142);

LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV (SEC

ID NO.: 143);

y

AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDP

KAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEC ID N°: 144), y fragmentos de los mismos. En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene de 19 a 32 aminoácidos de longitud. En otro aspecto de la divulgación, el Ag tiene de 17 a 60 aminoácidos de longitud y se selecciona entre un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) identificado en PSA o ciclina 1. En otro aspecto de la divulgación, x comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende péptidos cancerosos de diferentes antígenos separados por diferentes conectores peptídicos. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión comprende dos o más péptidos cancerosos separados por uno o más conectores peptídicos que comprenden una alanina y una serina. En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo comprende los SEC ID N°: 38 y 39. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión se expresa mediante un vector de expresión de ácido nucleico que comprende los SEC ID N°: 40 y 41. En otro aspecto de la divulgación, el conector peptídico se selecciona entre:

TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°: 13); O TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14).

Otra realización más de la presente divulgación incluye un método para mejorar las respuestas de células T que comprende: inmunizar un sujeto que necesita vacunación con una cantidad eficaz de una vacuna que comprende una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40 o una porción del mismo y uno o más péptidos cancerosos conectados al extremo carboxi del anticuerpo anti-CD40. En otro aspecto de la divulgación, los péptidos cancerosos se seleccionan entre antígenos asociados a tumores seleccionados entre CEA, antígeno prostático específico (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 y 12, MUC (Mucina) MUC-1, MUC-2, etc.), gangliósidos GM2 y GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antígeno de melanoma), MARCO-MART, ciclina B1, ciclina D, Pmel 17(gp100), secuencia intrónica V de GnT-V (secuencia V del intrón de la N-acetilglucosaminiltransferasa V), psm Ca de próstata, antígeno prostático en suero (PSA), PRAME (antígeno de melanoma), p-catenina, MUM-1-B (producto génico mutado ubicuo de melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) 1, BAGE (antígeno del melanoma) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (antígeno nuclear del virus Epstein-Barr) 1-6, gp75, virus del papiloma humano (HPV) E6 y E7, p53, proteína relacionada con la resistencia en pulmón (LRP), Bcl-2 y Ki-67. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre antígenos asociados a tumores que comprenden antígenos de leucemias y linfomas, tumores neurológicos tales como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, tumores genitourinarios tales como cáncer de cuello uterino, útero, ovario, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer de pene, tumores óseos, tumores vasculares o cánceres de labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, recto, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmones y bronquios, vejiga, riñón, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple y leucemia.

Otra realización más de la presente divulgación incluye un método para preparar una proteína de fusión de antígeno anti-CD40 que comprende: expresar una proteína de fusión que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo en una célula anfitriona, comprendiendo la proteína de fusión uno o más péptidos cancerosos en el extremo carboxi del anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo, en donde cuando dos o más péptidos cancerosos están separados por uno o más conectores, por lo menos un conector que comprende un sitio de glicosilación; y aislar la proteína de fusión. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de fusión expresada en el anfitrión es aislada y purificada adicionalmente. En otro aspecto, el anfitrión es una célula eucariótica. En otro aspecto de la divulgación, los péptidos cancerosos se seleccionan entre antígenos asociados a tumores seleccionados entre CEA, antígeno prostático específico (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 y 12, MUC (Mucina) MUC-1, MUC-2, etc.), gangliósidos GM2 y GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antígeno de melanoma), MARCO-MART, ciclina B1, ciclina D, Pmel 17(gp100), secuencia intrónica V de GnT-V (secuencia V del intrón de la N-acetilglucosaminiltransferasa V), psm Ca de próstata, antígeno prostático en suero (PSA), PRAME (antígeno de melanoma), p-catenina, MUM-1-B (producto génico mutado ubicuo de melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) 1, BAGE (antígeno del melanoma) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (antígeno nuclear del virus Epstein-Barr) 1-6, gp75, virus del papiloma humano (HPV) E6 y E7, p53, proteína relacionada con la resistencia en pulmón (LRP), Bcl-2 y Ki-67. En otro aspecto de la divulgación, el Ag se selecciona entre antígenos asociados a tumores que comprenden antígenos de leucemias y linfomas, tumores neurológicos tales como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, tumores genitourinarios tales como cáncer de cuello uterino, útero, ovario, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer de pene, tumores óseos, tumores vasculares o cánceres de labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, recto, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmones y bronquios, vejiga, riñón, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple y leucemia. En otro aspecto de la divulgación, los péptidos cancerosos se seleccionan entre por lo menos uno de:

MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV (SEC ID N°:

74);

LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD (SEC ID N°: 75);

LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS (SEC ID N°: 76);

NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP (SEC ID N°:

77); O SLYTKWHYRKWIKDTIVANP (SEC ID N°: 78).

En otro aspecto de la divulgación, los péptidos cancerosos se seleccionan entre por lo menos uno de: IMDQVPFSV (SEC ID N°: 113); ITDQVPFSV (SEC ID N°: 114); YLEPGPVTV (SEC ID N°: 115); YLEPGPVTA (SEC ID N°: 116); KTWGQYWQV (SEC ID N°: 117);

DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGV SRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDC WRGGQV SLK

VSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDG

GPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSY

VPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ (SEC ID NO.: 122);

PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXWTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSC

GSSPVPAS (SEC ID NO.: 124);

GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEWGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAEST

GMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIWLSGTTAA (SEC ID NO.: 126);

QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSF

SVTLDIVQ (SEC ID NO.: 128);

y

GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQIL

KGGSGTYCLNVSLADTNSLAWSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (SEC ID NO.: 130),

y fragmentos de los mismos.

En otro aspecto de la divulgación, los péptidos cancerosos se seleccionan entre por lo menos uno de:

MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (SEC ID N°: 141);

QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASK

MKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (SEC ID NO.: 142);

LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV (SEC

ID NO.: 143);

y

AAGSWAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDP

KAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEC ID NO.: 144),

y fragmentos de los mismos.

Otra realización más de la presente divulgación incluye un método para expandir células T específicas de antígeno in vitro que comprende: aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente de cáncer; incubar las PBMC aisladas con una cantidad inmunogénica de una vacuna de aCD40-(PL-Ag)x o aCD40-(Ag-PL)x, en donde Ag es un antígeno asociado al tumor y x es un número entero de 1 a 20; expandir las PBMC en presencia de una cantidad eficaz de IL-2; recolectar las células; y evaluar la producción de citocinas por las células para determinar la presencia de células T específicas contra el cáncer.

Otra realización más de la presente divulgación incluye células T específicas de antígeno asociadas a tumores preparadas mediante el método que comprende: aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente de cáncer; incubar las PBMC aisladas con una cantidad inmunogénica de una vacuna de aCD40-(PL-Ag)x o aCD40-(Ag-PL)x, en donde Ag es un antígeno asociado al tumor y x es un número entero de 1 a 20; expandir las PBMC en presencia de una cantidad eficaz de IL-2; recolectar las células; y evaluar la producción de citocinas por las células para determinar la presencia de células T específicas de antígeno asociadas a tumores.

Otra realización más de la presente divulgación incluye una vacuna terapéutica que comprende una proteína de fusión que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x; Ab-(Ag-PL)x; Ab-(PL-Ag-PL)x; Ab-(Ag-PL-Ag)x; Ab-(PL-Ag)x-PL; o Ab-(Ag-PL)x-Ag; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; Ag es por lo menos un antígeno canceroso; y x es un número entero de 1 a 20.

Descripción de los dibujos

Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente invención, se hace referencia ahora a la descripción detallada de la invención junto con las figuras adjuntas y en las que:

La figura 1 muestra anticuerpos recombinantes purificados por afinidad con proteína A fusionados a diversos péptidos de VIH (calles 1 a 5) secretados a partir de células 293F transfectadas, analizados mediante SDS.PAGE reductora y tinción con azul brillante de Coomassie.

La figura 2 muestra anticuerpos recombinantes purificados por afinidad con proteína A fusionados a diversos péptidos de VIH (calles 1 y 2) secretados a partir de células 293F transfectadas, y a continuación analizados mediante SDS.PAGE reductora y tinción con azul brillante de Coomassie.

La figura 3 muestra anticuerpos recombinantes purificados por afinidad con proteína A fusionados a diversas cadenas peptídicas del VIH (calles 1 a 5) secretados a partir de células 293F transfectadas, y a continuación analizadas mediante SDS.PAGE reductora y tinción con azul brillante de Coomassie.

La figura 4 muestra anticuerpos recombinantes purificados por afinidad con proteína A fusionados a diversas cadenas peptídicas de VIH (calles 1 a 6) secretados a partir de células 293F transfectadas, y a continuación analizadas mediante SDS.PAGE reductora y tinción con azul brillante de Coomassie.

La figura 5 describe el protocolo utilizado in vitro para analizar la potencia del anticuerpo recombinante de fusión con el péptido de VIH aCD40.LIPO5 (rAb aCD40.LIPO5) para provocar la expansión de células T específicas del antígeno en el contexto de un cultivo de PBMC.

La figura 6A-C muestra la producción de IFN^yespecífico de péptidos de VIH en PBMC de pacientes de VIH incubadas con diversas concentraciones de vacuna de tipo cuentas en una cadena de péptidos anti-CD40.LIPO5. C es el grupo control, que no recibió ninguna vacuna, y define la respuesta inicial del cultivo a cada péptido.

La figura 7 es un compendio de respuestas de vacuna de péptidos aCD40.LIPO5 contra las 5 regiones de péptidos de 8 pacientes con VIH.

La figura 8A-C muestra que la vacuna de péptidos de VIH aCD40.LIPO5 provoca la expansión de células T específicas de péptidos de VIH capaces de secretar múltiples citocinas, una característica deseable en una vacuna. La figura 8A-C también muestra que la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 provoca respuestas específicas de péptidos gag253, nef66, nef116 y pol325 caracterizadas por la producción de múltiples citocinas (paciente A5).

La figura 9 muestra el protocolo para el ensayo de aCD40.LIPO5 para determinar su capacidad para dirigir la expansión de células T específicas de antígeno resultantes de la captación dirigida por DC y presentación de epítopos peptídicos sobre su complejo de MHC de superficie.

La figura 10A-B muestra la secreción de citocinas en respuesta a péptidos de VIH de cocultivos de células DC-T tratados con diversas dosis de vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 (paciente A10).

La figura 11A-B muestra las PBMC del paciente A4 tratado con la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 que provoca la expansión de células T específicas de antígeno con especificidad para la región gag253, pero no para las secuencias conectoras flexibles.

La figura 12A es la secuencia de la cadena pesada de la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 que muestra las regiones del conector flexible en negrita, secuencias de empalme subrayadas y regiones de péptido de VIH sombreadas en color gris. La figura 12A muestra las PBMC del paciente A3 tratado con la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 que provoca la expansión de células T específicas de antígeno con especificidades para las regiones gag253, nef66 y nef116, pero no para las secuencias conectoras flexibles. Las figuras 12B-1 y B-2 muestran respuestas de células T específicas de antígeno de VIH evocadas a partir de las PBMC del paciente de VIH A17, incubadas con 30 nM de tres vacunas dirigidas a DC de péptido HIV5 diferentes. La figura 12C-1 y C-2 es un estudio similar al de la figura 12B-1 y B-2, excepto que las PBMC son de un paciente de VIH diferente (A2). La figura 12D muestra 15 respuestas de péptidos de VIH diferentes [5 regiones de péptido muestreadas en 3 pacientes], se encontró que la vacuna de anti-CD40.HIV5pep fue superior a anti-DCIR.HIV5pep, anti-LOX-1.HIV5pep y sin mezcla de LIPO5 para producir una amplia gama de respuestas CD8+ y CD4+ específicas de péptidos de VIH.

La figura 13 muestra la internalización del mAb anti-CD40: IL-4DC. Los IL-4DC se trataron con 500 ng/ml de anti-CD40-Alexa 568.

La figura 14 muestra la proliferación de células T CD4 y CD8 por DC dirigidas con anti-CD40-HA1. Se cocultivaron IFNDC 5x10e3 cargadas con 2 pg/ml de anti-CD40-HA o Ig-HA1 de control con células T CD4+ o CD8+ autólogas marcadas con CFSE (2x10e5) durante 7 días. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8. La proliferación celular se sometió a ensayo midiendo la dilución de CFSE.

La figura 15 muestra una titulación de la proteína de fusión HA1 sobre la proliferación de CD4+ T. Las IFNDC (5K) cargadas con proteínas de fusión se cocultivaron con células T CD4+ marcadas con CFSE (200 K) durante 7 días.

La figura 16 muestra que las IFNDC dirigidas con anti-CD40-HA1 activan células T CD4+ específicas de HA1. Se reestimularon células T CD4+ con DC cargadas con 5 pM de los péptidos indicados, y a continuación se tiñó el IFNy intracelular.

La figura 17 muestra que las IFNDC dirigidas con anti-CD40-HA1 activan células T CD4+ específicas de HA1. Los linfocitos T CD4+ se reestimularon con DC cargadas con los péptidos indicados durante 36h, y a continuación se analizó el sobrenadante del cultivo para medir el IFNy.

La figura 18 muestra que el direccionamiento de CD40 da como resultado un cebado cruzado mejorado de células T CD8+ específicas de MART-1. Las IFNDC (5 K/pocillo) cargadas con proteínas de fusión fueron cocultivadas con células T CD8+ purificadas durante 10 días. Las células se tiñeron con anti-CD8 y tetrámero. Las células son de donantes sanos (HLA-A *020 1+).

La figura 19 muestra que el direccionamiento de CD40 da como resultado en el cebado cruzado mejorado de células T CD8+ específicas de MART-1 (compendio de 8 experimentos repetidos usando células de diferentes donantes sanos).

La figura 20 muestra que los CTL CD8+ inducidos con IFNDC dirigidas con anti-CD40-MART-1 son funcionales. Las células T CD8+ cocultivadas con IFNDC dirigidas con proteínas de fusión se mezclaron con células T2 cargadas con epítopo peptídico de 10 pM.

La figura 21 muestra que los CTL de CD8+ inducidos con IFNDC dirigidas con anti-CD40-Flu M1 son funcionales. Las células T CD8+ cocultivadas con IFNDC dirigidas con proteínas de fusión se mezclaron con células T2 cargadas con epítopo peptídico 1,0 nM.

La figura 22 muestra un esquema del protocolo para someter a ensayo la capacidad de una vacuna compuesta de anti-CD4012E12 unido a PSA (antígeno prostático específico) para provocar la expansión a partir de una población de células T no sometida a tratamiento previo. Las células T CD4+ específicas de PSA corresponden a una amplia gama de epítopos de PSA. En pocas palabras, las DC derivadas por cultivo con IFNa y GM-CSF de monocitos de un donante sano se incuban con la vacuna. Al día siguiente, las células se colocan en medio de nueva aportación y se añaden células T CD4+ puras del mismo donante. Varios días más tarde, se añaden péptidos de PSA y, después de cuatro horas, se determinan los niveles de IFN-gamma secretado en los sobrenadantes del cultivo.

La figura 23 muestra que muchos péptidos de PSA provocan potentes respuestas de producción de IFN-gamma que indican que los agentes anti-CD4012E12 y anti-CD40 similares pueden suministrar eficazmente antígeno a las DC, dando como resultado el cebado de respuestas inmunitarias contra múltiples epítopos del antígeno. La figura 24 muestra que las DC dirigidas con anti-CD40-PSA inducen respuestas de células T CD8+ específicas de PSA. Los IFNDC se dirigieron con 1 |jg de proteína de fusión mAb con PSA. Las células T CD8+ autólogas purificadas se cocultivaron durante 10 días. Las células se tiñeron con anti-CD8 y tetrámero de PSA (KLQCVDLHV). Las células son de un donante sano positivo para HLA-A*0201. Los resultados demuestran que el anti-CD40 suministra eficazmente PSA a las DC, lo que a su vez provoca la expansión de las células T C^d8+ específicas del PSA.

La figura 25 muestra un esquema (a la izquierda) y la producción de IFNy por células T de los agrupamientos de péptidos y control para el donante 2. Se cocultivaron IFNDC 5x103 cargadas con 2 jg/m l de anti-CD40-ciclina D1 con células T CD4+ autólogas purificadas (2 x 105) durante 8 días. Las células fueron reestimuladas a continuación con 5 pM de péptidos individuales derivados de Ciclina D1 durante 5 horas en presencia de brefeldina A. Las células se tiñeron para medir la expresión de IFNy intracelular.

La figura 26 muestra un barrido de péptidos y producción de IFNy por células T obtenidas de los agrupamientos de péptidos mostrados en la figura 25 y control para el Donante 2. Se cocultivaron IFNDC 5x103 cargadas con 2 pg/ml de anti-CD40-Ciclina D1 con células T CD4+ (2x105) autólogas purificadas durante 8 días. Las células fueron reestimuladas con 5 pM de péptidos individuales derivados de ciclina D1 durante 5 h en presencia de brefeldina A. Las células se tiñeron para medir la expresión intracelular de IFNy.

La figura 27 muestra la expresión y el diseño del constructo de anticuerpos peptídicos anti-CD40-MART-1. La figura 28 es un compendio de epítopos inmunodominantes CD4+ y CD8+ para MART-1.

La figura 29 muestra la expresión y el diseño del constructo de anticuerpos peptídicos anti-CD40-gp100. La figura 30 muestra el diseño de anticuerpos peptídicos anti-CD40-gp100 adicionales.

La figura 31 muestra la expresión y el diseño del constructo de anticuerpos peptídicos anti-CD40-gp100 adicionales.

La figura 32 es un compendio de epítopos inmunodominantes CD4+ y CD8+ para gp100.

La figura 33 muestra la expresión y el diseño del constructo de anticuerpos peptídicos anti-CD40-gp100 adicionales.

La figura 34A muestra que la ciclina B1 de longitud completa fusionada al extremo C de la cadena H del anticuerpo o a la cohesina no pueden ser secretadas a partir de células 293F de mamífero. La figura 34B muestra que la ciclina B1 de longitud completa fusionada con el extremo C de la cadena H de anticuerpo o a la cohesina no pueden ser secretadas a partir de células 293F de mamífero.

La figura 35 muestra la estrategia de segmentación de la ciclina B1 basándose en regiones de dominio estructural conocidas o previstas.

La figura 36 muestra que los segmentos de la ciclina D1 p1, p3 y p4, pero no p2, se expresan bien como fusiones directas al extremo C de la cadena H.

La figura 37 muestra los niveles de expresión relativos de diversos segmentos de ciclina D1 como fusiones directas al extremo C de cadena H en diversas combinaciones con secuencias conectoras flexibles.

La figura 38 muestra un compendio de varios constructos de segmentos de cadena H-ciclina D1 y su relativa capacidad de expresión como vacunas.

La figura 39 muestra que la ciclina D1 de longitud completa fusionada al extremo C de una cadena H del anticuerpo de diana de DC es muy escasamente expresada como un anticuerpo recombinante secretado.

Descripción de la invención

Aunque la preparación y el uso de diversas realizaciones de la presente invención se discuten en detalle más adelante, se debe apreciar que la presente invención proporciona muchos conceptos inventivos aplicables que pueden ser incorporados a una amplia variedad de contextos específicos. Las realizaciones específicas discutidas en la presente memoria son meramente ilustrativas de formas específicas de preparar y usar la invención y no delimitan el alcance de la invención.

Para facilitar la comprensión de esta invención, a continuación se definen una serie de términos. Los términos definidos en la presente memoria tienen los significados entendidos comúnmente por una persona con un conocimiento práctico normal en las áreas relevantes para la presente invención. No se desea que los términos tales como "un", "uno", "una", "el" y "la" se refieran sólo a una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la cual se puede usar un ejemplo específico con fines ilustrativos. La terminología de la presente invención se utiliza para describir realizaciones específicas de la invención, pero su uso no delimita la invención, excepto como se indica en las reivindicaciones.

La divulgación incluye también variantes y otra modificación de un anticuerpo (o "Ab") o fragmentos del mismo, p.ej., una proteína de fusión anti-CD40 (anticuerpo se usa indistintamente con el término inmunoglobulina). Según se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpos o fragmentos de los mismos", incluye anticuerpos completos o fragmentos de un anticuerpo, por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fc y Fv de cadena sencilla (ScFv) o cualquier fragmento biológicamente eficaz de una inmunoglobulina que se una específicamente a, por ejemplo, CD40. Los anticuerpos de origen humano o anticuerpos humanizados tienen una inmunogenicidad reducida en seres humanos o carecen de la misma y tienen un número menor o ningún epítopo inmunogénico en comparación con los anticuerpos no humanos. Los anticuerpos y sus fragmentos se seleccionarán generalmente para que tengan un nivel reducido o ninguna antigenicidad en seres humanos.

Según se utiliza en la presente memoria, los términos "Ag" o "antígeno" se refieren a una sustancia capaz de unirse a una región de unión a antígeno de una molécula de inmunoglobulina o de provocar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria mediada por células T mediante la presentación del antígeno en las proteínas celulares del antígeno mayor de histocompatibilidad (MHC). Según se utiliza en la presente memoria, "antígeno" incluye, pero no está limitado a, determinantes antigénicos, haptenos e inmunógenos que pueden ser péptidos, moléculas pequeñas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o combinaciones de los mismos. El experto en inmunología reconocerá que cuando se comentan los antígenos que se procesan para su presentación a células T, el término antígeno se refiere a aquellas porciones del antígeno (p.ej., un fragmento peptídico) que es un epítopo de células T presentado por el MHC al receptor de la célula T. Cuando se utiliza en el contexto de una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos B en forma de un anticuerpo que es específico para un "antígeno", la porción del antígeno que se une a las regiones determinantes de la complementariedad de los dominios variables del anticuerpo (ligero y pesado), la porción unida puede ser un epítopo lineal o tridimensional. En el contexto de la presente invención, el término antígeno se utiliza en ambos contextos, es decir, el anticuerpo es específico para un antígeno proteico (CD40), pero también porta uno o más epítopos peptídicos para la presentación por m Hc a linfocitos T. En ciertos casos, los antígenos administrados por la vacuna o proteína de fusión de la presente invención se internalizan y procesan por las células presentadoras de antígeno antes de su presentación, por ejemplo, mediante escisión de una o más porciones del anticuerpo o proteína de fusión.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "péptido antigénico" se refiere a la porción de un antígeno polipeptídico que es reconocido de forma específica por cualquiera de linfocitos B o linfocitos T. Los linfocitos B responden a determinantes antigénicos foráneos a través de producción de anticuerpos, mientras que los linfocitos T están mediados por inmunidad celular. Por lo tanto, los péptidos antigénicos son aquellas porciones de un antígeno que son reconocidas por anticuerpos, o en el contexto de un MHC, por receptores de linfocitos T.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "epítopo" se refiere a cualquier determinante proteico capaz de unirse a una inmunoglobulina o de ser presentado por una proteína del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (por ejemplo, Clase I o Clase II) a un receptor de linfocitos T. Por lo general, los determinantes epitópicos son péptidos cortos de 5-30 aminoácidos de longitud que se ajustan dentro de la ranura de la molécula del MHC que presenta ciertos grupos laterales de aminoácidos hacia el receptor de linfocitos T y tiene otros ciertos residuos en la ranura, por ejemplo, debido a características de carga específicas de la ranura, los grupos laterales del péptido y el receptor de linfocitos T. Por lo general, un anticuerpo se une de forma específica a un antígeno cuando la constante de disociación es 1 mM, 100 nM o incluso 10 nM.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "vector" se utiliza en dos contextos diferentes. Cuando el término "vector" se utiliza haciendo referencia a una vacuna, un vector se utiliza para describir una porción no antigénica que se utiliza para dirigir o entregar la porción antigénica de la vacuna. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmentos del mismo pueden estar unidos a o pueden formar una proteína de fusión con el antígeno que provoca la respuesta inmunológica. Para vacunas celulares, el vector para suministro y/o presentación del antígeno es la célula presentadora de antígeno, que es proporcionada por la célula que se carga con el antígeno. En ciertos casos, el propio vector celular puede también puede procesar y presentar el antígeno o antígenos a los linfocitos T y activar una respuesta inmunológica específica del antígeno. Cuando se utiliza en el contexto de los ácidos nucleicos, un "vector" se refiere a un constructo, que es capaz de entregar, y preferiblemente expresar, uno o más genes o secuencias de polinucleótidos de interés en una célula anfitriona. Algunos ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, tales como células productoras.

Las composiciones y métodos se pueden utilizar con una amplia variedad de péptidos y/o proteínas en los que el anticuerpo o fragmento del mismo y el conector peptídico o "PL" crean una proteína que es estable y/o soluble.

Según se utiliza en la presente memoria, las composiciones y métodos utilizan un vector de suministro de antígeno que comprende la fórmula: Ab-(PL-Ag)x o Ab-(Ag-PL)x; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento del mismo; PL es por lo menos un conector peptídico que comprende por lo menos un sitio de glicosilación; Ag es por lo menos un antígeno viral; y x es un número entero de 1 a 20.

Un ejemplo de un anticuerpo para su uso comprende por lo menos la región variable de anti-CD40_12E12.3F3 (Núm. de Acceso ATCC PTA-9854), anti-CD40_12B4.2C10 (Núm. de Depósito HS446, Núm. de Acceso ATCC __), y anti-CD40_11B6.1C3 (Núm. de Depósito HS440, Núm. de Acceso ATCC__).

Según se utiliza en la presente memoria, los términos "estable" e "inestable" cuando se refieren a proteínas se utilizan para describir un péptido o proteína que mantienen su estructura y/o actividad tridimensional (estable) o que pierden inmediatamente o con el tiempo su actividad estructura y/o actividad tridimensional (inestable). Según se utiliza en la presente memoria, el término "insoluble" se refiere a aquellas proteínas que cuando se producen en una célula (por ejemplo, una proteína recombinante expresada en una célula eucariota o procariota o in vitro) no son solubles en solución sin el uso de condiciones o agentes de desnaturalización (p.ej., agentes de desnaturalización por calor o agentes químicos, respectivamente). Se ha encontrado que el anticuerpo o fragmento del mismo y los conectores ilustrados en el presente documento convierten proteínas de fusión de anticuerpo con los péptidos de insolubles y/o inestables en proteínas que son estables y/o solubles. Otro ejemplo de estabilidad frente a inestabilidad es aquel en el que el dominio de la proteína con una conformación estable tiene una temperatura de fusión más elevada (Tf) que el dominio inestable de la proteína cuando se mide en la misma solución. Un dominio es estable con respecto a otro dominio cuando la diferencia en la Tf es por lo menos aproximadamente 2°C, más preferiblemente de aproximadamente 4°C, aún más preferiblemente de aproximadamente 7°C, todavía más preferiblemente de aproximadamente 10°C, incluso más preferiblemente de aproximadamente 15°C, aún más preferiblemente de aproximadamente 20°C, incluso aún más preferiblemente de aproximadamente 25°C, y lo más preferiblemente de aproximadamente 30°C, cuando se mide en la misma solución.

Según se utiliza en la presente memoria, "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refiere a una hebra de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en cualquiera de una forma de una sola hebra o de doble hebra (incluyendo análogos conocidos de nucleótidos naturales). Una secuencia de ácidos nucleicos de doble hebra incluirá la secuencia complementaria. La secuencia de polinucleótidos puede codificar dominios de región variable y/o constante de inmunoglobulina que se forman en una proteína de fusión con uno o más conectores. Se pueden modificar mediante ingeniería genética múltiples sitios de clonación (MCS) en las localizaciones en el extremo carboxi-terminal de las cadenas pesadas y/o ligeras de los anticuerpos para permitir una inserción en marco del péptido para su expresión entre los conectores. Según se utiliza en la presente memoria, la expresión "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido de origen genómico, ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos. En virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no se asocia con toda o una porción de un polinucleótido en el que los "polinucleótidos aislados" se encuentran en la naturaleza, (2 ) se conecta de forma operativa a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia de mayor tamaño. El experto en la materia reconocerá que para su diseño y puesta en marcha, un vector se puede manipular al nivel del ácido nucleico mediante el uso de mecanismos conocidos en la técnica, tales como los ilustrados en Current Protocols in Molecular Biology, 2007 de John Wiley and Sons. En resumen, las secuencias de ácidos nucleicos codificantes se pueden insertar utilizando reacción en cadena de la polimerasa, inserción enzimática de oligonucleótidos o fragmentos de reacción en cadena de la polimerasa en un vector, que puede ser un vector de expresión. Para facilitar la inserción de insertos en el extremo carboxi terminal de la cadena ligera del anticuerpo, la cadena pesada, o ambas, se puede modificar por ingeniería genética un sitio de clonación múltiple (MCS) en secuencia con las secuencias de anticuerpo.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no hace referencia a una longitud específica del producto; por lo tanto, los péptidos, los oligopéptidos, y las proteínas están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este término tampoco hace referencia ni excluye modificaciones postexpresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Dentro de la definición están incluidos, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural. El término "dominio" o "dominio del polipéptido" se refiere a la secuencia de un polipéptido que se pliega en una única región globular en su conformación nativa, y que pueden presentar propiedades de unión o funcionales separadas.

Un polipéptido o secuencia de aminoácidos "obtenido a partir de" una secuencia de ácidos nucleicos designada se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido codificado en la secuencia, o una porción del mismo en el que la porción consiste en por lo menos 3-5 aminoácidos, preferiblemente por lo menos 4-7 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 8-10 aminoácidos, e incluso más preferiblemente por lo menos 11-15 aminoácidos, o que se puede identificar de forma inmunológica con un polipéptido no codificado en la secuencia. Esta terminología también incluye un polipéptido expresado a partir de una secuencia de ácidos nucleicos designada.

Según se utiliza en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier material que cuando se combina con una proteína de fusión de inmunoglobulina (Ig) permite que la Ig 35 retenga actividad biológica y por lo general no es reactivo con el sistema inmunitario del sujeto. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vehículos farmacéuticos convencionales tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como las que están en forma de emulsión de aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Con la presente invención se pueden utilizar ciertos diluyentes, por ejemplo, para administración en aerosol o parenteral, que pueden ser solución salina tamponada con fosfato o solución salina normal (0,85 %).

La divulgación proporciona una molécula de unión a CD40 que comprende por lo menos un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^l) que comprende, en regiones hipervariables de secuencias CDR1^l, CDR2^ly CDR3^l, teniendo la región CDr 1^lla secuencia de aminoácidos SASQGISNYLN (SEC ID N°: 41), teniendo la región CDR2^lla secuencia de aminoácidos YTSILHS (SEC I D NO: 42) y teniendo la región CDR3^lla secuencia de aminoácidos QQFNKLPPT (SEC ID N°: 43) cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en el SEC ID N°.

37; y equivalentes directos de las mismas.

Por consiguiente la descripción proporciona una molécula de unión a CD40 que comprende un sitio de unión a antígeno que comprende por lo menos un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V^h) que comprende, en regiones hipervariables de secuencias CDR1^h, CDR2^hy CDR3^h, teniendo la región CDR1^hla secuencia de aminoácidos GFTFSDYYMY (SEC ID N°: 44), teniendo la región CDR2^hla secuencia de aminoácidos YINSGGGSTYYPDTVKG (SEC ID N°: 45), y teniendo la región CDR3^hla secuencia de aminoácidos RGLPFHAMDY (SEC ID N°: 46), cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en el SEC ID N°: 38; y equivalentes directos de las mismas.

En un aspecto la divulgación proporciona una molécula de unión a CD40 de un solo dominio que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina aislada que comprende un dominio variable de cadena pesada (V^l) como se ha definido anteriormente. En otro aspecto la invención proporciona una molécula de unión a CD40 de un solo dominio que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina aislada que comprende un dominio variable de cadena pesada (V^h) como se ha definido anteriormente.

En otro aspecto la divulgación también proporciona una molécula de unión a CD40 que comprende dominios variables tanto de cadena pesada (V^h) como de cadena ligera (V^l) en los que la molécula de unión a CD40 comprende por lo menos un sitio de unión a antígeno que comprende: a) un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V^l) que comprende, en regiones hipervariables de secuencias CDR1^l, CDR2^ly CDR3^l, teniendo la región CDR1^lla secuencia de aminoácidos SASQGISNYLN (SEC ID N°: 41), teniendo la región CDR2^lla secuencia de aminoácidos YTSILHS (SEC ID N°: 42), y teniendo la región CDR3^lla secuencia de aminoácidos QQFNKLPPT (SEC ID N°: 43), cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en el SEC ID N°: 1, y b) un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^h) que comprende, en regiones hipervariables de secuencias CDR1^h, CDR2^hy CDR3^h, teniendo la región c Dr 1h la secuencia de aminoácidos GfTFSDYYMY (SEC ID N°: 44), teniendo la región CDR2' la secuencia de aminoácidos YINSGGGSTYYPDTVKG (SEC ID N°: 45), y teniendo la región CDR3^hla secuencia de aminoácidos RGLPFHAMDY (SEC ID N°: 46), cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en el SEC ID N°: 38; y equivalentes directos de las mismas.

A menos que se indique de otro modo, en la presente memoria se describe cualquier cadena de polipéptidos que tenga una secuencia de aminoácidos que comience en el extremo N-terminal y que termine en el extremo C-terminal. Cuando el sitio de unión a antígeno comprende los dominios tanto V^hcomo V^l, éstos se pueden situar en la misma molécula de polipéptido o, preferiblemente, cada dominio puede estar en una cadena diferente, siendo el dominio V^hparte de una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma y siendo el dominio V^lparte 20 de una cadena ligera inmunoglobulina o fragmento de la misma.

Los ejemplos no limitantes de antígenos dirigidos por los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: marcador de superficie celular seleccionado entre MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, C^d2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, 2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTIN-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor Fcy, receptores de células T, lectinas u otros receptores de células inmunitarias. Los antígenos que están dirigidos por la porción de anticuerpo de la presente divulgación se expresan específicamente por células presentadoras de antígeno, por ejemplo, células dendríticas, células de Langerhans, macrófagos y células B.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "molécula de unión a CD40" se refiere a cualquier molécula capaz de unirse al antígeno CD40 ya sea sola o asociada con otras moléculas que tengan una o más de las CDR de V^ly V^hilustradas en la presente memoria, en algunos casos 2, 3, 4, 5, o las 6 CDR. La reacción de unión se puede mostrar mediante métodos convencionales (análisis cualitativos) que incluyen, por ejemplo, un bioanálisis para determinar, mediante bloqueo, la unión de otras moléculas a CD40 o cualquier tipo de análisis de unión o actividad (p.ej., activación, reducción o modulación de una respuesta inmunológica), con referencia a un ensayo de control negativo en el que se utiliza un anticuerpo de especificidad no relacionada pero del mismo isotipo, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD25 o anti-CD80.

La presente divulgación también se puede realizar en una cadena de anticuerpo individual que tenga los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo unidos de forma covalente mediante un conector peptídico que normalmente incluye de 10 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 15 a 25 aminoácidos. Por lo tanto, una estructura de este tipo no incluye la porción constante de las cadenas pesadas y ligeras y se cree que el espaciador peptídico pequeño debería ser menos antigénico que una porción constante completa.

Según se utiliza en la presente memoria, el término " anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que las regiones constantes de cadenas pesada o ligera o ambas son de origen humano mientras que los dominios variables de ambas cadenas pesada y ligera no son de origen humano (por ejemplo, ratón, hámster o rata) o de origen humano pero obtenidas a partir de un anticuerpo humano diferente.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a un anticuerpo en el que las regiones determinantes de la complementariedad hipervariables (CDR) se obtienen a partir de un anticuerpo donador, tal como un anticuerpo no humano (por ejemplo, ratón) o un anticuerpo humano diferente, mientras que todas o sustancialmente todas las otras partes de la inmunoglobulina (por ejemplo, las regiones conservadas de los dominios variables, es decir, regiones marco conservadas), se obtienen a partir de un anticuerpo aceptor (en el caso de un anticuerpo humanizado - un anticuerpo de origen humano). Un anticuerpo injertado con CDR puede incluir unos pocos aminoácidos de la secuencia donadora en las regiones marco conservadas, por ejemplo en las partes de las regiones marco conservadas adyacentes a las regiones hipervariables.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el que las regiones constantes y variables de las cadenas tanto pesadas como ligeras son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo e incluye anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de la porción variable y constante de inmunoglobulina de ratón, hámster o rata se han reemplazado por sus homólogos humanos, por ejemplo como se describe en términos generales en los documentos EP 0546073 B1, patente US n° 5.545.806, patente US n° 5.569.825, patente US n° 5.625.126, patente US n° 5.633.425, patente US n° 5.661.016, patente US n° 5.770.429, EP 0438474 B1 y EP 0 463151 B1.

La molécula de unión a CD40 de la invención puede ser un anticuerpo humanizado que comprende las CDR obtenidas a partir de los anticuerpos anti-CD40_12E12.3F3, anti-CD40_11B6.1C3, o anti-CD40_12B4.2C10. Un ejemplo de un anticuerpo quimérico incluye los dominios variables de las cadenas tanto pesada como ligera que son de origen humano, por ejemplo los dominios variables del anticuerpo anti-CD40_12E12.3F3 que forman parte del SEC ID N°: 148 y el SEC ID N°: 149, anti-CD40_12B4.2C10 en el SEC ID N°: 150 y el SEC ID N°: 151 o el SEC ID N°: 152, y/o anti-CD40 11B6.1C3, SEC ID N°: 153 y SEC ID N°: 154, o una combinación de los mismos. Los dominios de región constante preferiblemente también comprenden dominios de región constante humana adecuados, por ejemplo como se describe en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. A. et al, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health. Las secuencias de ácido nucleico se pueden encontrar, por ejemplo, en los SEC ID NO: 8 y 9.

Las regiones hipervariables se pueden asociar con cualquier tipo de regiones marco conservadas, p.ej., de origen humano. Las regiones marco conservadas adecuadas fueron descritas por Kabat E. A. Un marco de cadena pesada es un marco de cadena pesada, por ejemplo el de un anticuerpo anti-CD40_12E12.3F3 que son parte del SEC ID N°: 149; anti-CD40_12B4.2C10 - SEC ID N°: 151 o SEC ID N°: 152, y/o anti-CD40_11B6.1C3 - SEC ID N°: 154, o una combinación de los mismos, por ejemplo, regiones FR1^l, FR2^l, FR3^ly FR4^l. De manera similar, el SEC ID N° 148 muestra el marco de cadena pesada anti-CD40_12E12.3F3 (o los equivalentes para anti-CD40_12B4.2C10 y anti-CD40_11B6.1C3, SEC ID N°: 150 y 153, respectivamente) que incluye la secuencia de las regiones FR1^h, FR2^h, FR3^hy FR4^h. Las CDR pueden añadirse a un marco de anticuerpo humano, tales como las descritas en el documento 7.456.260, expedida a Rybak et al., que ilustran nuevas regiones marco de cadenas variables humanas y anticuerpos humanizados que comprenden las regiones marco, porciones relevantes y secuencias marco. Para llevar a cabo el injerto a un nivel genético, la presente divulgación también incluye las secuencias de ácido nucleico subyacentes para las regiones V^ly v^hasí como los anticuerpos completos y las versiones humanizadas de los mismos. Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente divulgación incluyen los SEC ID N°: 155 y 156, que son las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo anti-CD40, respectivamente, así como aquellas secuencias de ácido nucleico que incluyen el uso de codones variables para las mismas secuencias de aminoácidos y variaciones conservativas de las mismas con una identidad de secuencia de 85, 90, 95 o 100% a nivel de ácido nucleico o aminoácido. Del mismo modo, las CDR pueden tener una identidad de secuencia de 85, 90, 95 o 100% a nivel de ácido nucleico o aminoácido, individualmente, en grupos o 2, 3, 4 o 5 o todas en conjunto.

Los anticuerpos monoclonales generados contra una proteína encontrada de forma natural en todos los seres humanos por lo general se desarrollan en un sistema no humano, por ejemplo en ratones, y como tales son por lo general proteínas no humanas. Como una consecuencia directa de esto, un anticuerpo xenogénico tal como el producido con un hibridoma, cuando se administra a seres humanos, provoca una respuesta inmunitaria no deseable que está mediada predominantemente por la porción constante de la inmunoglobulina xenogénica. Algunos anticuerpos xenogénicos tienden a provocar una respuesta inmunológica en el anfitrión, limitando de ese modo el uso de anticuerpos de este tipo ya que no se pueden administrar durante un periodo de tiempo prolongado. Por lo tanto, es particularmente útil utilizar anticuerpos de una sola cadena, de un solo dominio, quiméricos, injertados con CDR, o especialmente humanos que es probable que provoquen una respuesta alogénica sustancial cuando se administran a seres humanos. La presente divulgación incluye anticuerpos con cambios mínimos en una secuencia de aminoácidos tal como deleción, adición o sustitución de uno, unos pocos o incluso varios aminoácidos que son simplemente formas alélicas de la proteína original que tiene sustancialmente propiedades idénticas.

La inhibición de la unión de CD40 a su receptor se puede someter a ensayo de forma conveniente en diversos análisis incluyendo análisis tales como los que se describen en lo sucesivo en la presente memoria en el texto. Por medio del término "hasta el mismo punto" se hace referencia las moléculas de referencia y las equivalentes que presentan, en una base estadística, curvas de inhibición de la unión a CD40 esencialmente idénticas en uno de los análisis mencionados anteriormente. Por ejemplo, el análisis utilizado puede ser un análisis de inhibición competitiva de unión a CD40 por las moléculas de unión de la invención.

Por lo general, el anticuerpo anti-CD40 humano de la descripción comprende por lo menos: (a) una cadena ligera que comprende un dominio variable que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la mostrada en el SEC ID N°: 1 comenzando por el aminoácido en la posición 1 y terminando por el aminoácido en la posición 107 y la porción constante de una cadena ligera humana; y (b) una cadena pesada que comprende un dominio variable que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la mostrada en el SEC ID N°.

2 y la porción constante de una cadena pesada humana. La porción constante de una cadena pesada humana puede ser del tipo ^y1, ^y2 , ^y3, ^y4, M, P2 , o 8 o £, preferiblemente del tipo ^y, mientras que la porción constante de una cadena ligera humana puede ser de tipo k o A (que incluye los subtipos A1, A2 y A3) pero es preferiblemente del tipo k. Las secuencias de aminoácidos de las posiciones generales de los dominios variables y constantes son bien conocidas en la técnica y por lo general siguen en la nomenclatura Kabat.

Una molécula de unión a CD40 de la invención se puede producir mediante técnicas de ADN recombinante. A la vista de esto, se deben construir una o más moléculas de ADN que codifican la molécula de unión, colocar en secuencias de control apropiadas y transferir a un organismo anfitrión adecuado para su expresión.

De una manera muy general, la divulgación proporciona: (i) moléculas de ADN que codifican una molécula de unión a CD40 de un solo dominio de la divulgación, una molécula de unión a CD40 de una sola cadena, una cadena pesada o ligera o fragmentos de las mismas de una molécula de unión a CD40 de la invención; y (ii) el uso de las moléculas de ADN de la descripción para la producción de una molécula de unión a CD40 de la invención mediante métodos recombinantes.

El presente estado de la técnica es tal que el trabajador experto en la materia puede sintetizar las moléculas de ADN de la descripción dada la información proporcionada en la presente memoria, es decir, las secuencias de aminoácidos de las regiones hipervariables y las secuencias de ADN que las codifican. Un método para la construcción de un gen de un dominio variable se describe por ejemplo en el documento EPA 239400. En resumen, se clona un gen que codifica un dominio variable de un MAb. Se determinan los segmentos de ADN que codifican el marco y las regiones hipervariables y los segmentos de ADN que codifican las regiones hipervariables se retiran de modo que los segmentos de ADN que codifican las regiones marco conservadas se fusionan junto con sitios de restricción adecuados en las uniones. Los sitios de restricción se pueden generar en las posiciones apropiadas mediante mutagénesis de la molécula de ADN mediante procedimientos convencionales. Se preparan algunos casetes de CDR sintéticos de doble hebra mediante síntesis de ADN de acuerdo con las secuencias proporcionadas en los SEC ID N°: 1 y 3 o 2 y 4 (secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos, respectivamente). Estos casetes a menudo se proporcionan con extremos cohesivos de modo que se pueden ligar en las uniones del marco.

No es necesario tener acceso al ARNm a partir de una línea celular de producción de hibridoma para obtener un constructo de ADN que codifica las moléculas de unión a CD40 de la invención. Por ejemplo, la solicitud de PCT WO 90/07861 da instrucciones completas para la producción de un anticuerpo mediante técnicas de ADN recombinante que solamente proporcionan información con respecto a la secuencia de nucleótidos de un gen. En resumen, el método comprende la síntesis de una serie de oligonucleótidos, su amplificación mediante el método de PCR, y su corte y empalme para proporcionar la secuencia de ADN deseada.

Los vectores de expresión que comprenden un promotor o genes adecuados que codifican porciones constantes de cadena pesada y ligera están disponibles al público. Por lo tanto, una vez que se prepara una molécula de ADN, ésta se puede transferir en forma conveniente en un vector de expresión apropiado. Las moléculas de ADN que codifican anticuerpos de una sola cadena también se pueden preparar mediante métodos convencionales, por ejemplo, como se describe en el documento WO 88/1649. A la vista de lo mencionado anteriormente, no es necesario depósito de hibridoma ni de línea celular para cumplir los criterios de suficiencia de descripción.

Por ejemplo, se preparan un primer y segundo constructo de ADN que se unen de forma específica a CD40. En resumen, un primer constructo de a Dn codifica una cadena ligera o fragmento de la misma y comprende a) una primera parte que codifica un dominio variable que comprende regiones marco conservadas e hipervariables de forma alternativa, estando las regiones hipervariables en la secuencia CDR1^l, CDR2^ly CDR3^lcuyas secuencias de aminoácidos se muestran en el SEC ID N°: 1; comenzando esta primera parte con un codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y terminando con un codón que codifica el último aminoácido del dominio, y b) una segunda parte que codifica una porción constante de cadena ligera o fragmento de la misma que comienza con un codón que codifica el primer aminoácido de la porción constante de la cadena pesada y termina con un codón que codifica el último aminoácido de la porción constante fragmento de la misma, seguido de un codón de parada.

La primera parte codifica un dominio variable que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEC ID N°: 1. Una segunda parte codifica la porción constante de una cadena pesada humana, más preferiblemente la porción constante de la cadena humana y1. Esta segunda parte puede ser un fragmento de ADN de origen genómico (que comprende intrones) o un fragmento de ADNc (sin intrones).

El segundo constructo de ADN codifica una cadena pesada o fragmento de la misma y comprende a) una primera parte que codifica un dominio variable que comprende alternativamente regiones marco e hipervariables; siendo las regiones hipervariables CDR1^hy opcionalmente CDR2^hy CDR3^h, cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en el SEC ID N°. 2; comenzando esta primera parte con un codón que codifica el primer aminoácido del dominio variable y terminando con un codón que codifica el último aminoácido del dominio variable, y b) una segunda parte que codifica una porción constante de cadena pesada o fragmento de la misma que comienza con un codón que codifica el primer aminoácido de la porción constante de la cadena ligera y termina con un cordón que codifica el último aminoácido de la porción constante o fragmento de la misma seguido de un codón de parada.

La primera parte codifica un dominio variable que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEC ID N°. 2. La primera parte tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en el SEC ID N°. 2 comenzando con el nucleótido en la posición 1 y terminando con el nucleótido en la posición 321. Asimismo, la segunda parte codifica preferiblemente la porción constante de una cadena ligera humana, más preferiblemente la porción constante de la cadena k humana.

La divulgación también incluye moléculas que se unen a CD40 en las que uno o más residuos de CDR1^l, CDR2^l, CDR3^l, CDR1^h, CDR2^ho c DR3^ho los marcos, por lo general solamente unos pocos (p.ej., FR1-4^lo ^h), se cambian a partir de los residuos mostrados en los SEC ID N°. 37 y SEC ID N°. 38; mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias de ADN correspondientes. La divulgación incluye las secuencias de ADN que codifican tales moléculas de unión a CD40 cambiadas. En particular la divulgación incluye una molécula de unión a CD40 en la que uno o más residuos de CDR1^l, CDR2^ly/o CDR3^lse han cambiado a partir de los residuos mostrados en el SEC ID N°. 37 y uno o más residuos de CDR1^h, CDR2^hy/o CDR3^hse han cambiado a partir de los residuos mostrados en el SEC ID N° 38.

Cada uno de los constructos de ADN se colocan bajo el control de secuencias de control adecuadas, en particular bajo el control de un promotor adecuado. Se puede utilizar cualquier tipo de promotor, con la condición de que se adapte al organismo anfitrión en el que los constructos de ADN se transferirán para su expresión. Sin embargo, si la expresión se va a producir en una célula de mamífero, se puede utilizar un promotor de gen de inmunoglobulina en linfocitos B. La primera y segunda partes pueden estar separadas por un intrón, y, se puede colocar un potenciador de forma conveniente en el intrón entre la primera y segunda partes. La presencia de tal potenciador que se transcribe, pero que no se traduce, puede ayudar en la transcripción eficaz. En realizaciones concretas de la descripción, el primer y segundo constructos de ADN comprenden el potenciador de, p.ej., un gen humano de cadena pesada.

El anticuerpo deseado se puede producir en un cultivo celular o en un animal transgénico. Un animal transgénico adecuado se puede obtener de acuerdo con métodos convencionales que incluyen microinyección en huevos del primer y segundo constructos de ADN colocados en secuencias de control adecuadas que transfieren los huevos preparados de este modo a hembras pseudopreñadas apropiadas y seleccionando una descendencia que expresa el anticuerpo deseado.

La divulgación también proporciona un vector de expresión capaz de replicarse en una línea de células procariotas o eucariotas, que comprende por lo menos uno de los constructos de ADN que se han descrito anteriormente. Cada vector de expresión que contiene un constructo de ADN se transfiere a continuación a un organismo anfitrión adecuado. Cuando los constructos de ADN se insertan por separado en dos vectores de expresión, estos se pueden transferir por separado, es decir un tipo de vector por célula, o se pueden cotransferir, siendo preferida ésta última posibilidad. Un organismo anfitrión adecuado puede ser una línea celular de bacteria, de levadura o de mamífero, siendo preferida esta última. Más preferiblemente, la línea de células de mamífero es de origen linfoide, p.ej., una célula B inmortalizada de mieloma, hibridoma o normal, que de forma conveniente no expresa ninguna cadena pesada o ligera de anticuerpo endógeno.

Cuando las cadenas de anticuerpo se producen en un cultivo celular, los constructos de ADN se deben insertar en primer lugar en cualquiera de un vector de expresión individual o bien en dos vectores de expresión separados pero compatibles, siendo preferida la última posibilidad. Para expresión en células de mamífero, se prefiere que la secuencia codificante de la molécula de unión a CD40 se integre en el ADN de la célula anfitriona dentro de un locus que permita o favorezca un nivel de alta expresión de la molécula de unión a CD40.

En un aspecto adicional de la divulgación se proporciona un procedimiento para el producto de una molécula de unión a CD40 que comprende: (i) cultivar un organismo que se transforma con un vector de expresión como se ha definido anteriormente; y (ii) recuperar la molécula de unión a CD40 del cultivo.

Se ha encontrado que el anticuerpo anti-CD40_12E12.3F3, antiCD40_12B4.2C10 y/o anti-CD40_11B6.1C3 parece que tiene especificidad de unión hacia CD40 humano. Por lo tanto, lo más sorprendente es que los anticuerpos para este epítopo, por ejemplo el anticuerpo anti-CD40_12E12.3F3, son capaces de suministrar antígeno de forma eficaz a células dendríticas (DC). Algunos anticuerpos, en particular anticuerpos quiméricos e injertados con CDR y especialmente anticuerpos humanos, que tienen especificidad de unión para el epítopo antigénico de CD40 humano maduro; y uso de tales anticuerpos para carga de antígeno de DC son novedosos.

Para utilizar el anticuerpo anti-CD40 de la presente invención para indicaciones de tratamiento, la dosificación apropiada variará, por supuesto, dependiendo, por ejemplo, del anticuerpo descrito en la presente memoria que se debe emplear, el anfitrión, el modo de administración y la naturaleza y la gravedad de la afección que se está tratando. Sin embargo, en el uso profiláctico, por lo general se encuentran algunos resultados satisfactorios a dosificaciones de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal, más usualmente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 mg por kilogramo de peso corporal. La frecuencia de la dosificación para usos profilácticos normalmente estará en el intervalo de aproximadamente una vez a la semana hasta aproximadamente una vez cada 3 meses, más usualmente en el intervalo de aproximadamente una vez cada 2 semanas hasta aproximadamente una vez cada 10 semanas, p.ej., una vez cada 4 a 8 semanas. El anticuerpo anti-CD40 de la presente invención se puede administrar por vía parenteral, por vía intravenosa, por ejemplo, en la vena antecubital u otra vena periférica, por vía intramuscular, o por vía subcutánea.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden preparar de una manera convencional, p.ej., en una forma liofilizada. Para administración inmediata, se disuelve en un vehículo acuoso adecuado, por ejemplo agua estéril para inyectables o solución salina fisiológica tamponada estéril. Si se considera deseable preparar una solución de un volumen mayor para administración por infusión en lugar de una inyección en bolo, es ventajoso incorporar albúmina de suero humano o la propia sangre heparinizada del paciente a la solución salina en el momento de la formulación. La presencia de un exceso de tal proteína fisiológicamente inerte previene la pérdida de anticuerpos por adsorción en las paredes del recipiente y los tubos utilizados con la solución de infusión. Si se utiliza albúmina, una concentración adecuada es de 0,5 a 4,5% en peso de la solución salina.

Una realización de la presente divulgación invención proporciona un producto inmunoconjugado que comprende un anticuerpo humanizado de la invención, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40 humanizado, conectado a una o más moléculas efectoras, antígenos y/o una o varias marcas detectables. Preferiblemente, la molécula efectora es una molécula terapéutica tal como, por ejemplo, uno o más péptidos que comprenden uno o más epítopos de linfocitos T, una toxina, una molécula pequeña, una citocina o una quimioquina, una enzima, o una radiomarca.

Las toxinas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, exotoxina de Pseudomonas o toxina de difteria. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, compuestos quimioterapéuticos tales como taxol, doxorrubicina, etopósido, y bleiomicina. Las citocinas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, e IL-12, IL-17, e IL-25. Algunas enzimas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, ARNsas, ADNsas, proteasas, quinasas, y caspasas. Algunos radioisótopos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, 32P e 125I.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "epítopo" se refiere a una molécula o sustancia capaz de estimular una respuesta inmunológica. En un ejemplo, algunos epítopos incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido y un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde la expresión del ácido nucleico en un polipéptido es capaz de estimular una respuesta inmunológica cuando el polipéptido se procesa y se presenta en una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Por lo general, algunos epítopos incluyen péptidos presentados en la superficie de células unidas de forma no covalente a la hendidura de unión del MHC de clase I o clase II, de modo que pueden interactuar con receptores de linfocitos T y las respectivas moléculas auxiliares de linfocitos T.

Procesamiento proteolítico de antígenos. Los epítopos que son presentados por el MHC en células de presentación de antígenos son péptidos que se pueden escindir o productos de péptidos de mayor tamaño o precursores de antígenos proteicos. Para los epítopos del MHC I, algunos antígenos proteicos a menudo se digieren con proteasomas residentes en la célula. La digestión proteasómica intracelular produce fragmentos de péptidos con una longitud de aproximadamente 3 a 23 aminoácidos que a continuación se cargan en la proteína del MHC. Algunas actividades proteolíticas adicionales dentro de la célula, o en el medio extracelular, pueden recortar y procesar estos fragmentos adicionalmente. El procesamiento de epítopos de la clase II del MHC por lo general se produce a través de proteasas intracelulares del compartimento lisosómico/endosómico. Los péptidos procesados previamente se pueden anclar al anticuerpo anti-CD40 (o fragmento del mismo) que dirige los péptidos contra aquellos de los que se busca un aumento de la respuesta inmunológica directamente a células de presentación de antígeno.

Para identificar epítopos potencialmente eficaces como compuestos inmunogénicos, algunas predicciones de la unión del MHC solo son útiles pero a menudo insuficientes. La presente divulgación incluye métodos para identificar de forma específica los epítopos dentro de antígenos que con mayor probabilidad conducirán a la respuesta inmunológica buscada para las fuentes específicas de células de presentación de antígenos y células T respondedoras.

La presente divulgación permite un análisis rápido y fácil para la identificación de los epítopos que con la mayor probabilidad van a producir la respuesta inmunológica deseada utilizando las células de presentación de antígenos del propio paciente y el repertorio de linfocitos T. Las composiciones y métodos de la presente divulgación se pueden aplicar a cualquier secuencia de proteínas, permitiendo que el usuario identifique los epítopos que son capaces de unirse al MHC y se presentan de forma apropiada a los linfocitos T que responderán al antígeno. Por consiguiente, la descripción no se limita a ninguna diana ni afección médica en particular, sino que en su lugar incluye un epítopo o epítopos del MHC de cualquier fuente útil.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "remodelado" se refiere a un marco de anticuerpo humanizado en el que los sitios de unión a antígeno o CDR obtenidos a partir de anticuerpos no humanos (p.ej., ratón, rata o hámster), se colocan en regiones marco (FR) conservadas estructurales de cadena pesada y ligera humanas, por ejemplo, en un polinucleótido de cadena ligera o de cadena pesada para "injertar" la especificidad del anticuerpo no humano a un marco humano. El vector o vectores de expresión de polinucleótido que expresan los anticuerpos remodelados pueden ser células de mamífero transfectadas para la expresión de anticuerpos humanos recombinantes que presentan la especificidad del antígeno del anticuerpo no humano y experimentarán modificaciones postraduccionales que aumentarán su expresión, estabilidad, su utilidad, o sus combinaciones.

Antígenos.

Los ejemplos de antígenos virales incluyen, pero no se limitan a, p.ej., VIH, VHC, CMV, adenovirus, retrovirus, picornavirus, etc. Un ejemplo no limitante de antígenos retrovirales tales como antígenos los retrovirales de los antígenos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tales como productos genéticos de los genes gag, pol, y env, la proteína Nef, transcriptasa inversa, y otros componentes de VIH; antígenos virales de la hepatitis tales como las proteínas S, M, y L del virus de la hepatitis B, el antígeno pre-S del virus de la hepatitis B, y otras hepatitis, por ejemplo, hepatitis A, B, y C, componentes virales tales como ARN viral de la hepatitis C; antígenos virales de la influenza tales como hemaglutinina y neuraminidasa y otros componentes virales de la influenza; antígenos virales del sarampión tales como la proteína de fusión del virus del sarampión y otros componentes del virus del sarampión; antígenos virales de la rubéola tales como las proteínas E1 y E2 y otros componentes del virus de la rubéola; antígenos de rotavirus, tales como VP7sc y otros componentes de rotavirus; antígenos de citomegalovirus tales como la glicoproteína B de la envoltura y otros componentes de antígenos de citomegalovirus; antígenos del virus sincitial respiratorio tales como la proteína de fusión de RSV, la proteína M2 y otros componentes antigénicos del virus sincitial respiratorio; antígenos virales del herpes simplex, tales como proteínas inmediatas tempranas, glicoproteína D, y otros componentes antigénicos del virus del herpes simplex; antígenos virales de la varicela zóster, tales como gpI de, gpII, y otros componentes antigénicos virales de la varicela zóster; antígenos virales de la encefalitis japonesa, tales como las proteínas E, M-E, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A, E al 80%, y otros componentes antigénicos virales de la encefalitis japonesa; antígenos virales de la rabia tales como la glicoproteína de la rabia y otros componentes antigénicos del virus de la rabia. Véase Fundamental Virology, Segunda Edición, eds. Fields, B. N. y Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991) para ejemplos adicionales de antígenos virales. El por lo menos un antígeno viral pueden ser péptidos de un adenovirus, retrovirus, picornavirus, virus del herpes, rotavirus, hantavirus, coronavirus, togavirus, flavirvirus, rhabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, buniavirus, arenavirus, reovirus, virus del papiloma, parvovirus, virus de la viruela, hepadnavirus, o virus espongiforme. En ciertos ejemplos específicos, no limitantes, el por lo menos un antígeno viral son péptidos obtenidos a partir de por lo menos uno de virus de VIH, CMV, hepatitis A, B, y C, influenza, sarampión, polio, viruela, rubeola; sincitial respiratorio, herpes simplex, varicela zóster, Epstein-Barr, encefalitis japonesa, rabia, gripe, y/o resfriado.

En un aspecto de la divulgación, los uno o más de los péptidos antigénicos se seleccionan entre por lo menos uno de: Nef (66-97): VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEC ID N°: 1); Nef (116-145):

HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEC ID N°: 2); Gag p17 (17-35): EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEC ID N°: 3); Gag p17-p24 (253 -284): NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEC ID N°: 4); o Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEC ID N°: 5). En un aspecto de la divulgación, los péptidos de proteína de fusión están separados por uno o más conectores seleccionados entre: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEC ID N°: 11); PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEC ID N°: 12); TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°: 13); o TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14).

Las dianas antigénicas que se pueden suministrar utilizando las vacunas de antígeno anti-CD40 de la presente invención incluyen genes que codifican antígenos tales como antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos o antígenos parasitarios. Algunos patógenos incluyen tripanosomas, tenias, lombrices, helmintos, malaria. Los marcadores tumorales, tales como el antígeno fetal o el antígeno prostático específico, se pueden dirigir de esta manera. Otros ejemplos incluyen: proteínas env de VIH y antígeno de superficie de la hepatitis B. La administración de un vector de acuerdo con la presente divulgación para fines de vacunación podría requerir que los antígenos asociados con el vector sean lo suficientemente no inmunogénicos como para permitir la expresión a largo plazo del transgén, para el que se podría desear una respuesta inmunológica intensa. En algunos casos, la vacunación de un individuo solamente puede ser necesaria con poca frecuencia, como cada año o cada dos años, y puede proporcionar protección inmunológica a largo plazo frente al agente infeccioso. Los ejemplos específicos de organismos, alérgenos y secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para su uso en vectores y por último, como antígenos se pueden encontrar en la patente US n° 6.541.011, en particular, las tablas que emparejan organismos y secuencias específicas que se pueden utilizar.

Algunos antígenos bacterianos para su uso con las vacunas de antígeno anti-CD40 descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, antígenos bacterianos, tales como toxina de Pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina, FIM2, FIM3, adenilato ciclasa y otros componentes antigénicos de bacterias de Pertussis; antígenos bacterianos de difteria, tales como toxina o toxoide de difteria y otros componentes antigénicos de bacterias de difteria; antígenos bacterianos del tétanos tales como toxina o toxoide del tétanos y otros componentes antigénicos de bacterias del tétanos; antígenos bacterianos de estreptococos, tales como proteínas M y otros componentes antigénicos de bacterias estreptocócicas; antígenos bacterianos de bacilos gramnegativos, tales como lipopolisacáridos y otros componentes antigénicos de bacterias gram-negativas, antígenos bacterianos de Mycobacterium tuberculosis, tales como ácido micólico, proteína 65 de choque térmico (HSP65), la proteína secretada principal de 30 kDa, antígeno 85A y otros componentes antigénicos de micobacterias; componentes antigénicos de bacterias de Helicobacter pylori; antígenos bacterianos neumocócicos como neumolisina, polisacáridos capsulares neumocócicos y otros componentes antigénicos de bacterias neumocócicas; antígenos bacterianos Haemophilus influenza tales como polisacáridos capsulares y otros componentes antigénicos de bacterias de Haemophilus influenza; antígenos bacterianos del ántrax tales como antígeno protector el ántrax y otros componentes antigénicos de bacterias del ántrax; antígenos bacterianos de Rickettsia tales como rompA y otros componentes antigénicos de bacterias de Rickettsia. Con los antígenos bacterianos descritos en la presente memoria también se incluye cualquier otro antígeno de bacteria, micobacteria, micoplasma, rickettsia, o clamidia. Algunos agentes patógenos parciales o completos también pueden ser: Haemophilus influenzae; Plasmodium falciparum; Neisseria meningitidis; Streptococcus pneumoniae; Neisseria gonorrhoeae; Salmonella de serotipo typhi; Shigella; Vibrio cholerae; Fiebre del Dengue; Encefalitis; Encefalitis japonesa; enfermedad de Lyme; Yersinia pestis; virus del Nilo occidental; fiebre amarilla; tularemia; hepatitis (vírica; bacteriana); RSV (virus sincitial respiratorio); HPIV 1 y HPIV 3; adenovirus; viruela; alergias y cánceres.

Los antígenos fúngicos para su uso con las composiciones y métodos de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, p.ej., componentes antigénicos del hongo Candida; antígenos fúngicos de Histoplasma tales como la proteína 60 de choque térmico (Hsp60) y otros componentes de antígeno fúngico de Histoplasma; antígenos fúngicos criptocócicos tales como polisacáridos capsulares y otros componentes de antígeno fúngico criptocócico; antígenos fúngicos de Coccidiodes tales como antígenos esferulares y otros componentes de antígeno fúngico de Coccidiodes; y antígenos fúngicos de tiña tales como tricofitina y otros componentes de antígeno fúngico de Coccidiodes.

Los ejemplos de protozoos y otros antígenos parasitarios incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, antígenos de Plasmodium falciparum tales como antígenos de superficie de merozoítos, antígenos de superficie de esporozoítos, antígenos de circumsporozoíto, antígenos de superficie de gametocitos/gametos, antígeno pf 155/RESA de estadio en sangre y otros componentes antigénicos de plasmodios; antígenos de toxoplasma tales como SAG-1, p30 y otros componentes antigénicos de toxoplasma; antígenos de esquistosomas tales como glutatión-S-transferasa, paramiosina, y otros componentes antigénicos de esquistosomas; antígeno principal de Leishmania y otros antígenos de Leishmania tales como gp63, lipofosfoglicano y su proteína asociada y otros componentes antigénicos de Leishmania; y antígenos de Trypanosoma cruzi tales como el antígeno de 75-77 kDa, el antígeno de 56 kDa y otros componentes antigénicos de tripanosomas.

El antígeno que se puede dirigir utilizando las vacunas de antígeno anti-CD40 de la divulgación por lo general se seleccionará basándose en una serie de factores, que incluyen: probabilidad de internalización, nivel de especificidad de células inmunológicas, tipo de célula inmunológica dirigida, nivel de maduración y/o activación de célula inmunológica y similares. En esta realización, los anticuerpos pueden ser anticuerpos mono- o biespecíficos que incluyen un dominio de unión anti-CD40 y un dominio de unión contra un segundo antígeno, p.ej., marcadores de superficie celular para células dendríticas tales como, MHC de clase I, MHC de clase II, B7-2, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR y/o dectina-1 y similares; aunque en algunos casos también con la ausencia de CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD56, y /o CD57. Algunos ejemplos de marcadores de superficie celular para células presentadoras de antígeno incluyen, pero no se limitan a, MHC de clase I, MHC de clase II, CD45, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de iL-2, receptor de ICAM-1 y/o Fcy. Algunos ejemplos de marcadores de superficie celular para linfocitos T incluyen, pero no se limitan a, CD3, CD4, CD8, CD 14, CD20, CD11b, CD16, CD45 y HLA-DR.

Los antígenos diana en superficies celulares para suministro incluyen los característicos de antígenos tumorales que por lo general se obtienen a partir de la superficie celular, citoplasma, núcleo, orgánulos y similares de células de tejido tumoral. Los ejemplos de dianas tumorales para la porción de anticuerpo de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cánceres hematológicos tales como leucemias y linfomas, tumores neurológicos tales como astrocitomas o glioblastomas, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, tales como cáncer gástrico o de colon, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, tumores genitourinarios tales cáncer de cuello uterino, útero, cáncer de ovario, cáncer vaginal, cáncer testicular, cáncer de próstata o cáncer de pene, tumores óseos, tumores vasculares, o cánceres del labio, nasofaringe, faringe y cavidad oral, esófago, recto, vesícula biliar, árbol biliar, laringe, pulmón y bronquios, vejiga, riñón, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple y leucemia.

Los ejemplos de antígenos que se pueden suministrar solos o combinados con células inmunológicas para la presentación de antígenos utilizando la presente invención incluyen proteínas tumorales, p.ej., oncogenes mutados; proteínas virales asociadas con tumores; y mucinas y glicolípidos tumorales. Los antígenos pueden ser proteínas virales asociadas con tumores que podrían ser las de las clases de virus indicados anteriormente. Ciertos antígenos pueden ser característicos de algunos tumores (siendo un subconjunto proteínas normalmente no expresadas por una célula precursora tumoral), o pueden ser una proteína que normalmente se expresa en una célula precursora tumoral, pero que tiene una característica de mutación de un tumor. Otros antígenos incluyen variante o variantes mutantes de la proteína normal que tiene una actividad o distribución subcelular alteradas, p.ej., mutaciones de genes que dan lugar a antígenos tumorales.

Los ejemplos no limitantes específicos de antígenos tumorales para su uso en una vacuna de proteína de fusión anti-CD40 incluyen, por ejemplo, CEA, antígeno prostático específico (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1 4, 6 y 12, M^uC (Mucina) (p.ej., MUC-1, MUC-2, etc.), gangliósidos G^m2 y GD2, ras, myc, tirosinasa, MART (antígeno de melanoma), Pmel 17(gp100), secuencia intrónica V de GnT-V (secuencia V del intrón de la N-acetilglucosaminiltransferasa V), psm Ca de próstata, PRAME (antígeno de melanoma), p-catenina, MUM-1-55 B (producto genético mutado ubicuo de melanoma), GAGE (antígeno de melanoma) 1, MAGE, BAGE (antígeno de melanoma) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), DAGE, 1-6 de EBNA ( antígeno nuclear del Virus de Epstein-Barr), gp75, E6 y E7 del virus del papiloma humano (HPV), p53, proteína de resistencia pulmonar (LRP), Bcl-2, Ki-67, ciclina B1, gp100, Survivina, y NYESO-1.

Además, la molécula inmunogénica puede ser un autoantígeno implicado en el inicio y/o propagación de una enfermedad autoinmunitaria, cuya patología se debe en gran parte a la actividad de algunos anticuerpos específicos para una molécula expresada por el órgano, tejido, o células diana pertinentes, p.ej., SLE o MG. En tales enfermedades, puede ser deseable dirigir una respuesta inmunológica mediada por anticuerpo en curso (es decir, una de tipo Th2) al autoantígeno relevante hacia una respuesta inmunitaria celular (es decir, una de tipo Th1). Como alternativa, puede ser deseable prevenir la aparición de o disminuir el nivel de una respuesta de Th2 al autoantígeno en un sujeto que no tiene, pero de que se sospecha que es susceptible a, la enfermedad autoinmunitaria relevante induciendo de forma profiláctica una respuesta de Th1 al autoantígeno apropiado. Algunos autoantígenos de interés incluyen, sin limitación: (a) con respecto a SLE, la proteína Smith, ribonucleoproteína RNP, y las proteínas SS-A y SS-B; y (b) con respecto a MG, el receptor de acetilcolina. Los ejemplos de otros antígenos diversos implicados en uno o más tipos de respuesta autoinmunitaria incluyen, por ejemplo, hormonas endógenas tales como hormona luteinizante, hormona estimulante folicular, testosterona, hormona de crecimiento, prolactina y otras hormonas.

En las composiciones y métodos de la divulgación se pueden utilizar algunos antígenos implicados en enfermedades autoinmunitarias, alergia y rechazo de injerto. Por ejemplo, en la presente invención se puede utilizar un antígeno implicado en una cualquiera o más de las siguientes enfermedades o trastornos autoinmunitarios: diabetes, diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriática), esclerosis múltiple, miastenia gravis, lupus sistémico eritematoso, tiroiditis autoinmune, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), psoriasis, síndrome de Sjogren, incluyendo queratoconjuntivitis seca secundaria al Síndrome de Sjogren, alopecia areata, respuestas alérgicas debidas a reacciones de picaduras de artrópodos, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, asma, asma alérgica, lupus eritematoso cutáneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, erupciones por fármacos, reacciones de reversión de la lepra, eritema nodoso leproso, uveítis autoinmunitaria, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida de audición neurosensorial progresiva bilateral idiopática, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos pura, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens-Johnson, esprúe idiopático, liquen plano, enfermedad de Crohn, oftalmopatía de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveítis posterior, y fibrosis pulmonar intersticial. Algunos ejemplos de antígenos implicados en las enfermedades autoinmunitarias incluyen ácido glutámico decarboxilasa 65 (GAD 65), ADN nativo, proteína básica de mielina, proteína proteolipídica de mielina, componentes del receptor de acetilcolina, tiroglobulina, y el receptor de la hormona estimulante de tiroides (TSH).

Algunos ejemplos de antígenos implicados en alergia incluyen antígenos de polen, tales como antígenos de polen de cedro japonés, antígenos de polen de ambrosía, antígenos de polen de césped inglés, antígenos obtenidos a partir de animales tales como antígenos de los ácaros del polvo y antígenos de felino, antígenos de histocompatibilidad, y penicilina y otros fármacos terapéuticos. Algunos ejemplos de antígenos implicados en el rechazo a injerto incluyen componentes antigénicos del injerto a trasplantar en el receptor del injerto, tales como corazón, pulmón, hígado, páncreas, riñón, y los componentes de injerto neuronal. El antígeno puede ser un ligando de péptido alterado útil en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.

Los expertos en la materia observarán que la secuencia de cualquier molécula efectora de proteína se puede alterar de una manera tal que no influye sustancialmente en las ventajas funcionales de la proteína efectora. Por ejemplo, por lo general se considera que glicina y alanina se pueden intercambiar al igual que el ácido aspártico y el ácido glutámico y la asparagina y la glutamina. Un experto en la materia reconocerá que muchas variaciones diferentes de secuencias efectoras codificarán efectores con aproximadamente la misma actividad que el efector nativo. La molécula efectora y el anticuerpo se pueden conjugar con medios químicos o con medios recombinantes como se ha descrito anteriormente. Algunas modificaciones químicas incluyen, por ejemplo, derivatización para la finalidad de unir la molécula efectora y el anticuerpo entre sí, ya sea directamente o a través de un compuesto de unión, por medio de métodos que se conocen bien en la técnica de química de proteínas. Con los anticuerpos humanizados de la presente divulgación se pueden utilizar medios de unión tanto covalentes como no covalentes.

El procedimiento para anclar una molécula efectora a un anticuerpo variará de acuerdo con la estructura química del radical que se debe anclar al anticuerpo. Por lo general, algunos polipéptidos contienen una diversidad de grupos funcionales; por ejemplo, grupos ácido carboxílico (COOH), amina libre (--NH2) o sulfhidrilo (--SH), que están disponibles para reacción con un grupo funcional adecuado en un anticuerpo para dar lugar a la unión de la molécula efectora. Como alternativa, el anticuerpo se puede derivatizar para su exposición o unión a grupos funcionales reactivos adicionales, p.ej., mediante unión de cualquiera de una serie de moléculas conectoras tales como las disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford Ill.

El conector es susceptible de formar enlaces covalentes tanto con el anticuerpo como con la molécula efectora. Los expertos en la materia conocen bien algunos conectores adecuados e incluyen, pero no se limitan a, conectores carbonados de cadena lineal o ramificada, conectores carbonados heterocíclicos, o conectores peptídicos. Cuando el anticuerpo y la molécula efectora son polipéptidos, los conectores se pueden unir a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (p.ej., a través de una unión con puente disulfuro a cisteína). Sin embargo, en una realización preferida, los conectores se unirán a los grupos amino y carboxilo del carbono alfa de los aminoácidos terminales.

En algunas circunstancias, es deseable liberar la molécula efectora del anticuerpo cuando el producto inmunoconjugado ha alcanzado su sitio diana. Por lo tanto, en estas circunstancias, algunos productos inmunoconjugados comprenderán uniones que se pueden escindir en la proximidad del sitio diana. La escisión del conector para liberar la molécula efectora del anticuerpo se puede provocar mediante actividad o condiciones enzimáticas a las que se somete el producto inmunoconjugado ya sea dentro de la célula diana o en la proximidad del sitio diana. Cuando el sitio diana es un tumor, se puede utilizar un conector que se pueda escindir en condiciones presentes en el sitio del tumor (por ejemplo, cuando se expone a enzimas asociadas con tumor o pH ácido).

Algunas modificaciones químicas ilustrativas de molécula efectora y el anticuerpo de la presente divulgación también incluyen derivatización con polietilenglicol (PEG) para prolongar el tiempo de permanencia en el sistema circulatorio y reducir la inmunogenicidad, de acuerdo con métodos bien conocidos (véase por ejemplo, Lisi, et al., Applied Biochem. 4:19 (1982); Beauchamp, et al., Anal Biochem. 131:25 (1982); y Goodson, et al., Bio/Technology 8:343 (1990)).

La presente divulgación proporciona vacunas para su uso en realizaciones de inmunización tanto activa como pasiva. Algunas composiciones inmunogénicas, que se proponen como adecuadas para su uso como una vacuna, se pueden preparar de una manera más fácil directamente a partir de péptidos estimulantes de linfocitos T inmunogénicos preparados de una manera desvelada en el presente documento. El material de vacunación se dializa ampliamente para retirar moléculas de peso molecular pequeño no deseadas y/o liofilizar para una formulación más fácil en un vehículo deseado. En cierta realización de la presente invención, las composiciones y métodos de la presente invención se utilizan para fabricar una vacuna celular, por ejemplo, la porción de unión a anti-CD40 de suministro de antígeno del anticuerpo se usa para dirigir el antígeno o antígenos a una célula de presentación de antígeno, que a continuación "carga" el antígeno en proteínas de MHC para su presentación. Por lo tanto, la vacuna celular es la célula de presentación de antígeno que se ha cargado utilizando las composiciones de la presente invención para generar células de presentación de antígeno cargadas con antígeno.

Cuando la vacuna es la propia proteína de unión anti-CD40, p.ej., un anticuerpo completo o fragmentos del mismo, estos "principios activos" se pueden preparar en vacunas utilizando métodos comprendidos en la técnica, p.ej., los documentos de patente US n° 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; y 4.578,770. Por lo general, tales vacunas se preparan como agentes inyectables, p.ej., como soluciones o suspensiones líquidas o formas sólidas adecuadas para su resuspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar. El principio inmunogénico activo a menudo se mezcla con excipientes, que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Algunos excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsión, agentes de tamponamiento del pH, o coadyuvantes, que aumentan la eficacia de las vacunas.

Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en tal cantidad que sea terapéuticamente eficaz e inmunogénica. La cantidad que se debe administrar depende del sujeto que se vaya a tratar, incluyendo, p.ej., la capacidad del sistema inmunitario del individuo para generar una respuesta inmunitaria. Algunas cantidades precisas de células o principio activo requeridas para su administración dependen del criterio del facultativo. Sin embargo, algunos intervalos de dosificación adecuados son del orden de unos pocos miles de células (hasta millones de células) para las vacunas celulares. Para las vacunas epitópicas o de suministro de epítopo convencionales, la vacuna puede tener en ese caso varios cientos de microgramos de principio activo por vacunación. Algunos regímenes adecuados para administración inicial y dosis de refuerzo también son variables, pero se simbolizan con una administración inicial seguida de inoculaciones u otras administraciones posteriores.

El modo de aplicación puede variar ampliamente, sin embargo, con mayor probabilidad ciertas realizaciones en la presente memoria se administrarán por vía intravenosa o en el sitio de un tumor o infección directamente. En cualquier caso, se puede aplicar cualquiera de los métodos convencionales para administración de una vacuna. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo con el tamaño del anfitrión.

En muchos casos, será deseable tener múltiples administraciones de la vacuna, p.ej., de cuatro a seis vacunaciones proporcionadas de forma semanal o cada dos semanas. Un régimen de vacunación normal a menudo se producirá a intervalos de dos a doce semanas o a intervalos de tres a seis semanas. Pueden ser deseables refuerzos periódicos a intervalos de 1-5 años, normalmente tres años, para mantener niveles protectores de la respuesta inmunitaria o después de una probabilidad de una remisión o nueva infección. El curso de la inmunización puede ir seguido de análisis para, p.ej., activación de linfocitos T, secreción de citocinas o incluso producción de anticuerpos, realizada lo más habitualmente in vitro. Estos análisis de la respuesta inmunitaria se conocen bien y se pueden encontrar en una gran diversidad de patentes y como se ilustra en la presente memoria.

La vacuna de la presente divulgación se puede proporcionar en una o más "dosis unitarias" dependiendo de si se utilizan los vectores de ácido nucleico, las proteínas purificadas finales, o la forma de vacuna final. Se define que la dosis unitaria contiene una cantidad determinada previamente de la composición terapéutica calculada para producir las respuestas deseadas en asociación con su administración, es decir, la ruta y el régimen de tratamiento apropiados. La cantidad que se debe administrar, y la ruta y formulación concretas, están dentro del conocimiento práctico de los expertos en las técnicas clínicas. El sujeto que se va a tratar también se puede evaluar, en particular, el estado del sistema inmunitario del sujeto y la protección deseada. La administración de una dosis unitaria en forma de una sola inyección no es necesaria pero puede incluir infusión continua durante un periodo de tiempo establecido. La dosis unitaria de la presente invención se puede describir de forma conveniente en términos de ADN/kg (o proteína/Kg) de peso corporal, administrándose intervalos entre aproximadamente 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,5, 1, 10, 50, 100, 1.000 o más mg/ADN o proteína/kg de peso corporal.

De forma análoga, la cantidad de vacuna de antígeno anti-CD40 suministrada puede variar de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 8,0 mg/kg de peso corporal. Por lo tanto, en realizaciones concretas, se pueden suministrar a un individuo in vivo 0,4 mg, 0,5 mg, 0,8 mg, 1,0 mg, 1,5 mg, 2,0 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 4,0 mg, 5,0 mg, 5,5 mg, 6,0 mg, 6,5 mg, 7,0 mg y 7,5 mg de la vacuna. La dosificación de la vacuna que se va a administrar depende en gran medida del peso y la condición física del sujeto que se está tratando así como de la vía de administración y la frecuencia del tratamiento. Una composición farmacéutica que incluye un polinucleótido desnudo unido previamente a un vector de suministro liposomal o viral se puede administrar en cantidades que varían de 1 |jg a 1 mg de polinucleótido con respecto a 1 jg-100 mg de proteína. Por lo tanto, algunas composiciones concretas pueden incluir entre aproximadamente 1 jg , 5 jg , 10 jg , 20 jg , 30 jg , 40 jg , 50 jg , 60 jg , 70 jg , 80 jg , 100 jg , 150 jg , 200 jg , 250 jg , 500 jg , 600 jg , 700 jg , 800 jg , 900 jg o 1.000 jg de polinucleótido o proteína que se une de forma independiente a 1 jg , 5 jg , 10 jg , 20 jg , 30 jg , 40 jg , 50 jg , 60 jg , 70 jg , 80 jg , 100 jg , 150 jg , 200 jg , 250 jg , 500 jg , 600 jg , 700 jg , 800 jg , 900 jg , 1 mg, 1.5 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg o 100 mg de vector.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden unir opcionalmente preforma covalente o no covalente a una marca detectable. Algunas marcas detectables para tal uso incluyen cualquier composición detectable con métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Algunas etiquetas útiles en la presente invención incluyen esferas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS), colorantes fluorescentes (p.ej., isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína fluorescente de color verde, y similares), radiomarcas (p.ej., 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P), enzimas (p.ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras usadas comúnmente en un ELISA), y marcas colorimétricas tales como oro coloidal o esferas de vidrio o plástico coloreadas (p.ej., poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

Los expertos en la materia conocen bien algunos métodos para detectar tales marcas. Por lo tanto, por ejemplo, algunas radiomarcas se pueden detectar utilizando película fotográfica o contadores de centelleo, algunos marcadores fluorescentes se pueden detectar utilizando un fotodetector para detectar iluminación emitida. Las etiquetas enzimáticas se detectan típicamente proporcionando la enzima con un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima en el sustrato, y las marcas colorimétricas se detectan simplemente visualizando la marca coloreada.

Las composiciones de anticuerpo y/o producto inmunoconjugado de la presente invención son particularmente útiles para administración parenteral, tal como administración intravenosa o administración a una cavidad corporal. Las composiciones para administración normalmente comprenderán una solución del anticuerpo y/o producto inmunoconjugado disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Se puede utilizar una diversidad de vehículos acuosos, p.ej., solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y por lo general libres de material no deseado. Estas composiciones se pueden esterilizar con técnicas de esterilización bien conocidas, convencionales. Estas composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables si fuera necesario para aproximar las condiciones fisiológicas tales como ajuste del pH y agentes de tamponamiento, agentes para ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico y similares. La concentración de proteína de fusión en estas formulaciones puede variar ampliamente, y se seleccionará principalmente basándose en volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo de administración en particular seleccionado y las necesidades del paciente.

Por lo tanto, una composición de producto inmunoconjugado farmacéutico habitual de la presente invención para administración intravenosa sería de aproximadamente 0,1 a 10 mg por paciente al día. Se pueden usar dosificaciones de 0,1 hasta aproximadamente 100 mg por paciente al día. Algunos métodos reales para preparar composiciones que se pueden administrar serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle en publicaciones tales como REMINGTON'S PHARMACEuTlCAL SCIENCE, 19a ED., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995).

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar para tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o por lo menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente. Una cantidad eficaz del compuesto es la que proporciona un alivio subjetivo de uno o varios síntomas o una mejora que se puede identificar de forma objetiva tal como lo indica el médico u otro observador cualificado.

Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones se administran dependiendo de la dosificación y la frecuencia según se requiera y de si son toleradas por el paciente. En cualquier caso, la composición debería proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de la presente invención para tratar de forma eficaz al paciente. Preferiblemente, la dosificación se administra una vez pero se puede aplicar de forma periódica hasta que se consigue un resultado terapéutico o hasta que los efectos secundarios garantizan la interrupción de la terapia. Por lo general, la dosis es suficiente para tratar o mejorar síntomas o signos de enfermedad sin producir toxicidad inaceptable al paciente.

Las formulaciones parenterales de liberación controlada de las composiciones de producto inmunoconjugado de la presente invención se pueden preparar como implantes, inyecciones oleosas, o como sistemas de partículas. Para una amplia visión de conjunto de sistemas de suministro de proteínas véase, Banga, A. J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc. Lancaster, Pa., (1995). Algunos sistemas de partículas incluyen microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas, y nanopartículas. Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica como un núcleo central. En las microesferas, el agente terapéutico se dispersa por toda la partícula. Las partículas, microesferas, y microcápsulas con un tamaño inferior a aproximadamente 1 pm por lo general se denominan nanopartículas, nanoesferas, y nanocápsulas, respectivamente. Los capilares tienen un diámetro de aproximadamente 5 pm de modo que solamente las nanopartículas se administran por vía intravenosa. Las micropartículas por lo general tienen un diámetro de aproximadamente 100 pm y se administran por vía subcutánea o por vía intramuscular.

Se pueden utilizar polímeros para liberación controlada por iones de composiciones de producto inmunoconjugado de la presente invención. En la técnica se conocen diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para su uso en la administración farmacológica controlada (Langer, R., Accounts Chem. Res. 26:537-542 (1993)). Por ejemplo, el copolímero en bloque, Poloxamer 407® existe como un líquido viscoso aunque móvil a bajas temperaturas pero forma un gel semisólido a temperatura corporal, la hidroxiapatita, que se ha usado como un microvehículo para liberación controlada de proteínas y/o liposomas, se puede utilizar para liberación controlada así como para el direccionamiento del fármaco en forma de cápsulas lipídicas. Se conocen numerosos sistemas adicionales para administración controlada de proteínas terapéuticas. Véanse, por ejemplo, los documentos de patente US n° 5,055,303, 5,188,837, 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 4,957,735 y 5,019,369, 5,055,303; 5,514,670; 5,413,797; 5,268,164; 5,004,697; 4,902,505; 5,506,206, 5,271,961; 5,254,342 y 5,534,496.

Entre los diversos usos de los anticuerpos de la descripción se incluyen una diversidad de patologías causadas por células humanas específicas. Por ejemplo, para el anti-CD40_12E12.3F3 humanizado (Núm. de Acceso en la ATCC PTA-9854), anti-CD40_12B4.2C10 (Núm. de Acceso en la ATCC___, Núm. de Presentación AB13-22.12B4.2C10 (HS446)), y anti-CD40_11B6.1C3 (Núm. de Acceso en la ATCC___, Núm. de Presentación AB13-22.11B6.1C3 (HS440)), anticuerpos desvelados en la presente memoria, una aplicación para anticuerpos es el tratamiento de células malignas que expresan CD40.

En otra realización, la descripción proporciona kits para el suministro de antígenos, p.ej., CD40 o un fragmento inmunorreactivo del mismo, conjugados o en forma de una proteína de fusión con uno o más epítopos de linfocitos T o linfocitos B. Una "muestra biológica", según se utiliza en la presente memoria, es una muestra de tejido o fluido biológico que contiene el antígeno. Tales muestras incluyen, pero no se limitan a, tejido de biopsia, sangre, y células sanguíneas (p.ej., glóbulos blancos). Preferiblemente, las células son linfocitos, p.ej., células dendríticas. Las muestras biológicas también incluyen secciones de tejidos, tales como secciones congeladas tomadas para fines histológicos. Una muestra biológica por lo general se obtiene de un organismo eucariota pluricelular, preferiblemente un mamífero tal como rata, ratón, vaca, perro, cobaya, o conejo, y más preferiblemente un primate, tal como un macaco, chimpancé, o ser humano. Los más preferiblemente, la muestra es de un ser humano. Los anticuerpos de la invención también se pueden utilizar in vivo, por ejemplo, como una herramienta de diagnóstico para obtención de imágenes in vivo.

Los kits comprenderán típicamente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un anticuerpo de la presente invención (o fragmento del mismo) con una o más porciones marco o sitios de clonación múltiple en el extremo carboxi terminal en el que se pueden insertar las secuencias codificantes para uno o más antígenos. El anticuerpo será un fragmento Fv anti-CD40 humanizado, tal como un fragmento de scFv o dsFv. Además los kits incluirán típicamente materiales con instrucciones que desvelan métodos para uso de un anticuerpo (p.ej., para su carga en células dendríticas antes de la inmunización con las células dendríticas, que pueden ser células dendríticas autólogas). Los kits también pueden incluir componentes adicionales para facilitar la aplicación concreta para la que se diseña el kit. Por lo tanto, por ejemplo, el kit puede contener adicionalmente métodos para detectar la marca (por ejemplo, sustratos enzimáticos para marcas enzimáticas, conjuntos de filtros para detectar marcas fluorescentes, marcas secundarias apropiadas tales como HRP anti-ratón de oveja, o similares). Los kits pueden incluir adicionalmente tampones u otros reactivos utilizados de forma rutinaria para la práctica de un método concreto. Tales kits y los contenidos apropiados son bien conocidos por los expertos en la materia.

En otro conjunto de usos, los productos inmunoconjugados dirigidos por anticuerpos de la invención pueden utilizarse para purgar células elegidas como diana de una población de células en un cultivo. Por ejemplo, si se prefiere una población específica de células T, los productos inmunoconjugados pueden utilizarse para enriquecer una población de células T que tienen el efecto opuesto de la respuesta inmunitaria en curso. Así, por ejemplo, las células cultivadas de un paciente que tiene un cáncer pueden ser purgadas de células cancerosas proporcionando al paciente células dendríticas que se cargaron con antígeno utilizando los anticuerpos como un radical diana para los antígenos que desencadenarán una respuesta inmunitaria contra el cáncer, virus u otro patógeno. Del mismo modo, los productos inmunoconjugados pueden utilizarse para aumentar la población de células T reguladoras o dirigir la respuesta inmunitaria hacia o lejos de una respuesta de células T citotóxicas o incluso dirigir una respuesta de células B.

Ejemplo 1: vacuna de péptidos de VIH anti-CD40

Se seleccionaron cinco secuencias de 19 a 32 aminoácidos de longitud de entre una multiplicidad de epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) identificados en las proteínas Nef, Gag y Env de VIH-1 en el contexto de diferentes moléculas del MHC de clase I. Se ha informado de que las respuestas de los CTL pueden ser inducidas eficazmente por vacunas lipopeptídicas en ratones, en primates y en seres humanos. Los cinco péptidos de VIH se modifican a continuación en la posición C-terminal por un grupo (Palm) -NH2 y las cinco secuencias de péptidos de VIH han sido descritas en la bibliografía científica [p. ej., Characterization of a multi-lipopeptides mixture used as an HIV-1 vaccine candidate (1999) Klinguer et al., Vaccine, Volumen 18, 259 - 267] y en una solicitud de patente [Cytotoxic T lymphocye-inducing lipopeptides and use as vaccines. Gras-Masse H. et al., Patente Núm. EP0491628 (24-06-1992); documento US 5871746 (16-02-1999)].

Una vacuna de VIH muy deseable estaría compuesta por anticuerpo antirreceptor de células dendríticas recombinante fusionado a los péptidos de VIH anteriores. La presente divulgación incluye composiciones y métodos para producir eficazmente proteínas y vacunas contra el VIH.

Las secuencias que se muestran a continuación son las secuencias de aminoácidos de los cinco péptidos de VIH seleccionados y las posiciones de aminoácidos dentro de cada proteína de VIH están entre paréntesis.

Nef (66-97) es: VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL (SEC ID N°: 1)

Nef (1166-145) es: HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL (SEC ID N°: 2)

Gag p17 (17-35) es: EKIRLRPGGKKKYKLKHIV (SEC ID N°: 3)

Gag p17-p24 (253-284) es: NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD (SEC ID N°: 4)

Pol 325-355 (RT 158-188) es: AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY (SEC ID N°: 5)

La siguiente secuencia es una proteína de fusión de cadena pesada (H) de hIGg4 - gag17 de VIH donde la región Gag p17 (17-35) se muestra en negrita. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti - DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-gag17] C655 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYYCARSSHYYGYGYGGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRYESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASE KIRLRPGGKKKYKLKHIVAS (SEC ID NO.: 6)

La siguiente secuencia es una proteína de fusión de cadena H -gag253 de VIH donde la región Gag p17-p24 (253 284) se muestra en negrita. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-gag253] C656 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSKS RLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYY CARSSHYY GY GY GGYFDVW GAGTTVTVSS AKTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGYEYHNAKTKPREEQFNSTYRVYSVLTVLHQDWLNGKEYK CKV SNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLT CL VKGF YP SDIAVE WE SNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASN PPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDAS (SEC ID NO.: 7)

La siguiente secuencia es una proteína de fusión de cadena H - nef116 de VIH, donde la región Nef (116-145) se muestra en negrita. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef116] C680 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFDVW GAGTTVTV S S AKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASH TQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLAS. (SEC ID NO.: 8)

La siguiente secuencia es una proteína de fusión de cadena H - nef66 de VIH donde la región de Nef (66-97) se muestra sombreada en negrita. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef66] C679 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFDVW GAGTTVTV S S AKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLD SDGSFFLY SRLT VDKSRW QEGNVF SCS VMHE ALHNH YT QKSL SL SLGKAS V GFPVTPQVPLRPMTYKAA VDLSHFLKEKGGLAS. (SEC ID NO.: 9)

La siguiente secuencia es una proteína de fusión de cadena H - pol158 de VIH donde la región Pol 325-355 (RT 158-188) se muestra en negrita. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-pol158] C667 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFDVW GAGTTVTV S S AKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV P S S SLGTKTYT CNVDHKP SNTKVDKRVESKY GPPCPPCP APEFEGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASAI FQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYAS. (SEC ID NO.: 10)

La figura 1 muestra los anticuerpos recombinantes purificados por afinidad con proteína A fusionados a diversos péptidos del VIH (calles 1 a 5) secretados a partir de células 293f transfectadas, analizados mediante SDS.PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie. Los vectores de expresión para las cadenas H fusionadas a diversas regiones codificantes de los péptidos de VIH del extremo C-terminal fueron cotransfectadas con el plásmido de la cadena ligera (L) correspondiente en células 293F transitorias durante tres días antes de recoger el sobrenadante para su posterior purificación. El número de células y la cantidad de ADN fueron constantes entre transfecciones. Puesto que se utilizó la matriz de afinidad de proteína A en exceso, el análisis de SDS.PAGE define tanto el rendimiento de producción como la integridad de la cadena H de los diversos constructos de vacuna. Las calles 1, 4 y 5 (calles superiores) muestran que las cadenas H fusionadas directamente a los péptidos gag17, nef66 y pol158 del VIH pueden ser bien secretadas. La calle 2 muestra que la cadena H fusionada directamente con el péptido gag253 de VIH se expresa escasamente. La calle 3 muestra que la cadena H fusionada directamente al péptido nef116 de VIH no se expresa en absoluto.

Sorprendentemente, se encontró que el uso de secuencias conectoras de regiones codificantes entre péptidos potencialmente glicosiladas mejora la secreción de proteínas de fusión de anticuerpos recombinantes intactospéptidos de VIH.

Las secuencias conectoras flexibles utilizadas derivan del precursor B del armazón de anclaje del celulosoma [Bacteroides cellulosolvens] y han sido descritas por los autores de la presente invención en la solicitud de patente US copendiente n° de serie 6l/081.234.

Las secuencias mostradas a continuación son las secuencias de 25 aminoácidos de longitud de las cuatro secuencias conectoras peptídicas seleccionadas. Las secuencias subrayadas son sitios de glicosilación ligados a N pronosticados.

Flexl es: SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEC ID N°: 11)

Flex2 es: PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEC ID N°: 12)

Flex3 es: TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°: 13)

Flex4 es: TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14)

Estas secuencias [los conectores mostrados en negritas y las regiones subrayadas obtenidas de la cohesión] derivan de los espaciadores entre dominios cohesina de la proteína bacteriana> gi|50656899|gb|AAT79550.1| precursor B del armazón de anclaje del celulosoma [Bacteroides cellulosolvens]:

MQSPRLKRKILSVILAVCYIISSFSIQFAATPQVNIIIGSAQGIPGSTVKVPINLQNVPEIGINNCDFTI KFDSDILDFNSVEAGDIVPLPVASFSSNNSKDIIKFLFSDATQGNMPINENGLFAVISFKIKDNAQK GISNIKVSSYGSFSGMSGKEMQSLSPTFFSGSIDVSDVSTSKLDVKVGNVEGIAGTEVNVPITFENV PDNGINNCNFTLSYDSNALEFLTTEAGNIIPLAIADYSSYRSMEGKIKFLFSDSSQGTRSIKNDGVF ANIKFKIKGNAIRDTYRIDLSELGSFSSKONNNLKSIATOFLSGSVNVKDIESSVSPTTSVHPTPTS VPPTPTKSSPGNKMKIOIGDVKANOGDTVIVPITFNEVPVMGVNNCNFTLAYDKNIMEFISADAG DIVTLPMANYSYNMPSDGLVKFLYNDQAQGAMSIKEDGTFANVKFKIKQSAAFGKYSVGIKAIG SISALSNSKLIPIESIFKDGSITVTNKPIVNIEIGKVKVKAGDKIKVPVEIKDIPSIGINNCNFTLKYNS NVLKYVSNEAGTIVPAPLANLSINKPDEGIIKLLFSDASQGGMPIKDNGIFVNLEFQAVNDANIGV YGLELDTIGAFSGISSAKMTSIEPQFNNGSIEIFNSAQTPVPSNTEVQTPTNTISVTPTNNSTPTNNS TPKPNPLYNLNVNIGEISGEAGGYIEVPIEFKNVPDFGINNCDFSVKYDKSIFEYVTYEAGSIVKDS IVNLACMENSGIINLLFNDATQSSSPIKNNGVFAKLKFKINSNAASGTYQINAEGYGKFSGNLNGK LTSINPIFENGIINIGNVTVKPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGTPTVTPIYWMNVLIGNMNAAIG EEVWPIEFKNVPPFGINNCDFKLVYDSNALELKKVEAGDIVPEPLANLSSNKSEGKIQFLFNDAS OGSMOIENGGVFAKITFKVKSTAASGIYNIRKDSVGSFSGLIDNKMTSIGPKFTDGSIWGTVTPT ATATPSAIVTTITPTATTKPIATPTIKGTPTATPMYWMNWIGKMNAEVGGEWVPIEFNNVPSF GINNCDFKLVYDATALELKNVEAGDIIKTPLANFSNNKSEEGKISFLFNDASQGSMQIENGGVFAK ITFKVKSTTATGVYDLRKDLVGSFSGLKDNKMTSIGAEFTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAT PTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPSVTIPTVTPTATATPSAATPTVTPTATATPSVTIPTVTPTVTA

TPSDTIPTVTPTATATPSAIVTTITPTATAKPIATPTIKGTPTATPMYWMNWIGKMNAEYGGEVY VPIEFKNVPSFGINNCDFKLVYDATALELKNVEAGDIIKTPLANFSNNKSEEGKISFLFNDASQGSM OIENGGVSAKITFKVKSTTAIGVYDIRKDLIGSFSGLKDSKMTSIGAEFTNGSITVATTAPTVTPTAT ATPSVTIPTVTPTATATPGTATPGTATPTATATPGAATPTETATPSVMIPTVTPTATATPTATATPT VKGTPTIKPVYKMNWIGRVNWAGEEVWPVEFKNIPAIGVNNCNFVLEYDANVLEVKKVDAG EIVPDALINFGSNNSDEGKVYFLFNDALQGRMQIANDGIFANITFKVKSSAAAGIYNIRKDSVGAF SGLVDKLVPISAEFTDGSISVESAKSTPTATATGTNVTPTVAATVTPTATPASTTPTATPTATSTVK GTPTATPLYSMNVIIGKVNAEASGEWVPVEFKDVPSIGINNCNFILEYDASALELDSAEAGEIVPV PLGNFSSNNKDEGKIYFLFSDGTQGRMQIVNDGIFAKIKFKVKSTASDGTYYIRKDSVGAFSGLIE KKIIKIGAEFTDGSITVRSLTPTPTVTPNVASPTPTKWAEPT SN QP AGPGPIT GTIPT ATTT AT ATPT KASVATATPTATPIWVEPTIVRPGYNKDADLAVFISSDKSRYEESSIITYSIEYKNIGKVNATNVKI AAQIPKFTKVYDAAKGAVKGSEIV WMIGNL AV GE SYTKEYKVKVD SLTKSEEYTDNT VTIS SDQ TVDIPENITTGNDDKSTIRVMLYSNRFTPGSHSSYILGYKDKTFKPKQNVTRAEVAAMFARIMGLT VKDGAKSSYKDVSNKHWALKYIEAVTKSGIFKGYKDSTFHPNAPITRAELSTVIFNYLHLNNIAPS KVHFTDINKHWAKNYIEEIYRFKLIQGY SDGSFKPNNNITRAEWTMFNRMLYRGPLKVKV GSFP DVSPKYWAYGDIEEASRNHKYTRDEKDGSEILIE (SEC ID NO.: 15).

La siguiente secuencia es una proteína de fusión de cadena pesada (H) - péptidos gag17-nef66-nef116 de VIH donde las secuencias de péptidos gag17, nef66, nef116 de VIH están en negrita. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-gag17-nef66-nef116] C694 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFD VW GAGTTVTV S S AKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASE KIRLRPGGKKKYKLKHIVASVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASHTQGYFP DWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLAS (SEC ID NO.: 16).

La siguiente secuencia es una proteína de fusión de cadena H - péptidos gag 17-nef116 de VIH donde las secuencias de los péptidos de gag 17 y nef166 [cursiva] están conectadas a través de un espaciador f1 [mostrado en negrita]. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-gag17-f1-nef116] C692 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTSSNQVFLKITIVDTADAATYY CARSSHYY GY GY GGYFDVWGAGTTVTVSS AKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDVSQEDPEVQFNWYYDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKY SNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQ YYTLPP S QEEMTKNQV SLT CLYKGF YP SDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS^ KfRLRPGGKKKYKLKHfVASSSXSPTTSXHPTPTSVPPTPTKSSPASHTQGYFPDMJNYTPGPGYRY PLTFGWLYKLAS (SEC ID NO.: 17).

La figura 2 muestra los anticuerpos recombinantes purificados por afinidad con proteína A fusionados a diversos péptidos de VIH (calles 1 y 2) secretados a partir de células 293F transfectadas, analizados a continuación mediante SDS.PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie. Los vectores de expresión para las cadenas H fusionadas a diversas regiones codificantes de los péptidos de VIH del extremo C terminal se cotransfectaron con el plásmido de la cadena L correspondiente en células 293F transitorias durante tres días antes de recoger el sobrenadante para su posterior purificación. Las calles 1 y 2 (calles superiores) muestran que las cadenas H fusionadas directamente a una cadena peptídica de HIV de gag17-nef66-nef116 pueden ser bien secretadas. También el producto de la cadena H que contiene una serie de péptidos de VIH de gag17 y nef116 separados por el espaciador flexible f1 (calle 2) también se expresa bien. Por lo tanto, el péptido nef116 de VIH, que no se expresa como un producto secretado cuando se fusiona directamente con la cadena H sola, puede ser bien expresado cuando se anexa en otros contextos de péptidos y series flexibles. Obsérvese que la cadena H fusionada directamente a gag17-f1-nef116 [82 residuos] migra más lentamente que la cadena H con gag17-nef66-nef116 [89 residuos], esto sugiere que el conector flexible f 1 está glicosilado, posiblemente potenciando también la producción del anticuerpo de fusión gag 17-f1 -nef116 secretado frente al anticuerpo de fusión gag 17-nef66-nef116.

La siguiente secuencia es una serie de cadena H - péptidos de VIH de la proteína de fusión gag17-gag253-nef66 donde cada secuencia del péptido de VIH [sombreada en cursiva] está separada por un espaciador entre péptidos f [mostrado en negrita]. En este caso, se insertó un conector de 27 aminoácidos de longitud flex-v1 (v1) [mostrado en negrita cursiva] derivado del precursor B del armazón de anclaje del celulosoma [regiones de Bacteroides cellulosolvens en negrita-curisiva-subrayado] entre el extremo C de la cadena H y la serie de péptidos de VIH-espaciadores flexibles. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef66] C711 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFD VW GAGTTVTV S S AKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV P S S SLGTKTYT CNVDHKP SNTKVDKRVESKY GPPCPPCP APEFEGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPE

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La siguiente secuencia es una cadena H - serie de péptidos de VIH de la proteína de fusión pol158-gag17-nef66-nef116-gag253 donde las secuencias peptídicas están sombreadas en gris. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti - DCIR_9E8_H - LV - hIgG4H - C - Pep - pol158 - gag17 - nef66 - nef116 - gag253] C713 es: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK

SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFD VW GAGTTVTV S S AKTKG

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LRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASNPPI

PVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDAS (SEC ID NO.: 19).

La figura 3 muestra anticuerpos recombinantes purificados por afinidad con proteína A fusionados a diversas series de péptidos de VIH (calles 1 a 5) secretados a partir de células 293F transfectadas, y después analizados por SDS.PAGE reductora y tinción con azul brillante de Coomassie. Los vectores de expresión para las cadenas H fusionadas a diversas regiones codificantes de los péptidos de VIH del extremo C terminal se cotransfectaron con el plásmido de la cadena L correspondiente en células 293F transitorias durante tres días antes de recoger el sobrenadante para su posterior purificación. Las calles 1,2 y 3 (bandas superiores) muestran que los 4 péptidos de VIH - espaciadores flexibles fusionados a la cadena H a través del conector flexible flex-v1 pueden ser bien secretados. Sin embargo, una serie de 4 péptidos de VIH fusionados directamente a la cadena H no se expresa en absoluto (calle 4, banda superior). Además, la calle 5 (banda superior) muestra que una serie de 5 péptidos de VIH fusionados directamente a la cadena H no se expresa en absoluto. Este resultado sugiere que ciertas combinaciones y contextos de conectores flexibles y secuencias codificantes de péptidos de VIH pueden mejorar la secreción de proteínas de fusión anticuerpo recombinante-péptido de VIH (calles 1,2 y 3).

La siguiente secuencia es para una cadena H - serie de péptidos VIH de la proteína de fusión gag17-gag253-nef66-nef116-pol158 donde cada secuencia de péptidos de VIH [sombreada en cursiva] está separada por un espaciador entre péptidos f [mostrado en negrita]. Se insertó el conector flexible flex-v1 (v1) [mostrado en negritacursiva] entre el extremo C-terminal de cadena H y la serie de péptidos de VIH-espaciadores flexibles. Los residuos AS subrayados son secuencias de unión.

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-hIgG4H-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158] C825 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGM GLSW IRQPSGKGLEW LAHIYW DDDKRYNPSLK

SRLTISKDTS SN Q VFLKITIYDT A D AATYY CARS SHYY GY GY GGYFD Y W GAGTTVTV S S A K TKG

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R K Q N PD IV IYQ YM D D L TAS. (SEC ID NO.: 20)

La figura 4 muestra los anticuerpos recombinantes purificados por afinidad con proteína A fusionados a diversas series de péptidos de VIH (calles 1 a 6) secretados a partir de células 293F transfectadas, analizados a continuación mediante SDS.PAGE reductora y tinción con azul brillante de Coomassie. Los vectores de expresión para las cadenas H fusionadas a diversas regiones codificantes de péptidos de VIH del extremo C terminal se cotransfectaron con el plásmido de la cadena L correspondiente en células 293F transitorias durante tres días antes de recoger el sobrenadante para su posterior purificación. Las calles 1, 3 y 5 (bandas superiores) muestran que la serie de 4 péptidos de VIH - espaciadores flexibles fusionados a la cadena H a través del conector flexible flex-v1 puede ser bien secretada. Las calles 2 y 6 (bandas superiores) muestran que la serie de 5 péptidos de VIH - espaciadores flexibles fusionados a la cadena H a través del conector flexible flex-v1 se expresa mal. Sin embargo, ciertas combinaciones y contextos de secuencias codificantes de péptidos de VIH potencian la secreción de proteínas de fusión de anticuerpo recombinante - péptido de VIH (calles 3 y 4). Por lo tanto, la cadena H fusionada a una serie de 5 péptidos de VIH - espaciadores flexibles a través del conector flexible flex-v1 se puede expresar bien cuando se adjunta en otros contextos de péptido y serie flexible (calle 4).

La presente divulgación incluye composiciones y métodos para secuencias conectoras de regiones codificantes entre péptidos potencialmente glicosiladas flexibles y combinaciones de tales regiones codificantes de péptidos de VIH que son particularmente favorables para la secreción eficaz de vacunas de fusión de anticuerpo antirreceptor de DC - péptido de VIH.

El uso de secuencias conectoras de dominio interestructural derivadas de bacterias degradadoras de celulosa como secuencias conectoras entre dominios preferidas en la modificación genética de proteínas, particularmente aquellas con sitios de glicosilación altamente predecibles. Las propiedades deseables de estas secuencias son i) flexibilidad inherente, facilitando de este modo la separación de dominios conectados que deberían ayudar en gran medida a su correcto plegamiento y al mantenimiento del acceso del receptor de células B a los epítopos antigénicos dependientes de la conformación; ii) glicosilación, ayudando de ese modo a la secreción y solubilidad de la proteína de fusión producida intacta, y también a la protección de las secuencias conectoras de las proteasas del medio de cultivo.

Ciertas combinaciones de regiones codificantes de péptidos de HIV favorecen la secreción y que las secuencias conectoras flexibles particulares insertadas entre las secuencias codificantes de péptidos de VIH también puedan ayudar a la secreción de vacunas de series de péptidos de VIH intactas - principios que también se pueden aplicar para resolver problemas similares para otros antígenos peptídicos preferidos.

Secuencias de ADN de las secuencias codificantes conectoras y de antígeno y preferidas. Los codones de las secuencias de unión y los codones de parada están en negrita:

[mAnti - DCIR_9E8_H - LV - hIgG4H - C - Pep - gag17] C655 es:

GCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCG TGGCTAGCTGA (SEC ID NO.: 21)

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef66] C679 es:

GCTAGTGTGGGCTTCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAAGGCCGC CGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTGGCTAGCTGA (SEC ID NO.: 22)

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-pol158] C667 es:

GCTAGTGCCATCTTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACC CCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGACCTGTACGCTAGCTGA (SEC ID NO.: 23)

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag253] C681 es:

GCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCA ACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTAACCCCCCCATCCCCGTGGGCGAGATCTA CAAGCGGTGGATCATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCAGCATCC TGGACGCTAGCTGA (SEC ID NO.: 24)

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-Flex-v1-Pep-gag17-nef116] C686 es:

GCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCA ACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAA GAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTGGCTAGTCACACCCAGGGCTACTTCCCCGACTGG CAGAACTACACCCCCGGCCCCGGCGTGCGGTACCCCCTGACCTTCGGCTGGCTGTACAAGCT GGCTAGCTGA (SEC ID NO.: 25)

GCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCGTGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCA ACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAA GAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGT GGCTAGTAGCAGCGT GAGCCCCACCACCAGCGT G CACCCCACCCCCACCAGCGTGCCCCCCACCCCCACCAAGAGCAGCCCCGCTAGTAACCCCCC CATCCCCGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATCATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGA TGTACAGCCCCACCAGCATCCTGGACGCTAGTCCCACCAGCACCCCCGCCGACAGCAGCACC ATCACCCCCACCGCCACCCCCACCGCCACCCCCACCATCAAGGGCGCTAGTCACACCCAGGG CTACTTCCCCGACTGGCAGAACTACACCCCCGGCCCCGGCGTGCGGTACCCCCTGACCTTCG GCTGGCTGTACAAGCTGGCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATC GTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGTGTGGGCTTCCCCGTGACCCC CCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAAGGCCGCCGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGG AGAAGGGCGGCCTGGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGT GACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGTGCCATCTTCCAGAGCAGCATGA CCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACCCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGAC GACCTGTACGCTAGCTGA. (SEC ID NO.: 26)

Secuencias de ADN de las secuencias codificantes conectoras y de antígeno preferidas. Los codones de las secuencias de unión están en negrita: Nef (66-97) es:

GCTAGTGTGGGCTTCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAAGGCCGC CGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTGGCTAGC (SEC ID NO.: 27)

Nef (116-145) es:

GCTAGTCACACCCAGGGCTACTTCCCCGACTGGCAGAACTACACCCCCGGCCCCGGCGTGCG GTACCCCCTGACCTTCGGCTGGCTGTACAAGCTGGCTAGC (SEC ID NO.: 28)

Gag p17 (17 -35) es:

GCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCG TGGCTAGC (SEC ID NO.: 29)

Gag p17 - p24 (253 -284) es:

GCTAGTAACCCCCCCATCCCCGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATCATCCTGGGCCTGAA CAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCAGCATCCTGGACGCTAGC (SEC ID NO.: 30)

Pol 325 - 355 (RT 158 - 188) es:

GCTAGTGCCATCTTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACC CCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGACCTGTACGCTAGC (SEC ID NO.: 31)

Flex1 es:

GCTAGTAGCAGCGTGAGCCCCACCACCAGCGTGCACCCCACCCCCACCAGCGTGCCCCCCAC CCCCACCAAGAGCAGCCCCGCTAGC (SEC ID NO.: 32)

Flex2 es:

GCTAGTCCCACCAGCACCCCCGCCGACAGCAGCACCATCACCCCCACCGCCACCCCCACCGC CACCCCCACCATCAAGGGCGCTAGC (SEC ID NO.: 33)

Flex3 es:

GCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCC CACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGC (SEC ID NO.: 34)

Flex4 es:

GCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGA

ACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGC (SEC ID NO.: 35)

La presente divulgación incluye composiciones y métodos para ensamblar constructos que codifican péptidos de VIH y secuencias conectoras flexibles. Los vectores de expresión de la cadena H típicamente tienen un sitio Nhe I [g|ctagc] añadido al codón del residuo C-terminal de la cadena H o [para vectores flex-v1] al codón C-terminal de la secuencia flex-v1. Las secuencias conectoras flexibles o las secuencias peptídicas del VIH tienen un sitio Spe I [a|ctagt] que precede al conector flexible N-terminal o al codón peptídico de VIH, un sitio Nhe I añadido al conector flexible C-terminal o codón peptídico de VIH, seguido de un codón TGA de parada, seguido de un sitio Eco RI, seguido de un sitio Not I. Este conector flexible o fragmentos Spe I - Not I del péptido de VIH se insertan en el vector de la cadena H preparado mediante digestión con Nhe I - Not I. Nhe I y Spe I son sitios compatibles, pero cuando se ligan [g|ctagt] ya no es un sitio Nhe I o Spe I. Por lo tanto, se pueden insertar conectores flexibles o fragmentos peptídicos de VIH adicionales en el nuevo intervalo Nhe I - Not I distal al conector flexible inicial o péptido de VIH. De este modo, se pueden añadir series de péptidos de VIH y/o regiones codificantes conectoras flexibles a la región codificante de la cadena H del vector de expresión.

Ejemplo 2. Vacuna de péptidos de VIH - biología de direccionamiento al antígeno in vitro

Ensayos con vacunas de péptidos de VIH anti-CD40.LIPO5 en pacientes con VIH in vitro. Para estudiar la capacidad anticuerpo recombinante de fusión de péptido de VIH aCD40.LIPO5 (rAb aCD40.LIPO5) para mediar la presentación de antígenos, se añadió el rAb de fusión a células sanguíneas de individuos infectados con VIH y se midió la producción de citoquinas en células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

La figura 5 describe el protocolo utilizado in vitro para analizar la potencia del anticuerpo recombinante de fusión de péptido de VIH aCD40.LIPO5 (rAb aCD40.LIPO5) para provocar la expansión de células T específicas de antígenos en el contexto de un cultivo de PBMC. Brevemente, las PBMC (2 x 106 células/ml) de la aféresis de los pacientes con VIH se incuban con un intervalo de dosis de vacuna del péptido de VIH aCD4o.LIPO5. El día 2, se añaden 100 U/ml de IL-2 al cultivo y a continuación el medio se renueva cada 2 días con 100 U/ml de IL-2. El día 10, las células expandidas se sensibilizan durante 48 horas con los péptidos largos individuales correspondientes a las 5 secuencias de péptidos de VIH incorporadas en el rAb de fusión de péptido de VIH aCD40.LIPO5. A continuación, los sobrenadantes del cultivo se recogen y se evalúan para determinar la producción de citoquinas (por las células T con especificidades del receptor de células T [TCR] para las secuencias peptídicas) utilizando el análisis de múltiples cuentas (Luminex). La producción de citoquinas específicas de antígeno detectada en dicho análisis, si depende de la presencia de la vacuna de péptido de VIH anti-CD40.LIPO5, refleja la absorción de la vacuna por las células presentadoras de antígenos [APC] en el cultivo, y el procesamiento [degradación proteolítica] y la presentación de péptidos en el MHC. Los complejos de antígeno-MHC son reconocidos por células T con TCR que reconocen solamente el complejo antígeno de VIH-MHC particular. En un paciente con VIH, es probable que tales células sean células T de memoria que se expandieron en el paciente en respuesta a la infección por el VIH.

Los epítopos de las 5 regiones de péptidos del VIH de la vacuna pueden ser presentados por las APC. El esquema de la figura 5 se utilizó para analizar la expansión in vitro de células T específicas de péptidos de VIH en respuesta a la vacuna de péptido anti-CD40.LIPO5. Los resultados de 7 individuos se muestran en la figura 6 e indican que el rAb de fusión de péptido de VIH aCD40.LIPO5 provocaba respuestas de IFNy específicas de péptidos de VIH en todos los pacientes estudiados. Así, el rAb de fusión de péptido de VIH a-CD40.LIPO5 permite que las DC presenten de forma cruzada por lo menos 1 o 2 péptidos diferentes de los 5 péptidos dentro de la vacuna a las células T de cada individuo. Sin embargo, el conjunto de péptidos de VIH que estimuló la producción de IFNy fue diferente para cada paciente, reflejando, lo más probablemente, diferentes grupos de células T de memoria para la especificidad de VIH.

La figura 6A-C muestra la producción de IFN^yespecífico de péptido de VIH en PBMC de pacientes con VIH incubadas con diversas concentraciones de vacuna de serie de péptidos anti-CD40.LIPO5. C es el grupo control, que no recibió ninguna vacuna, y define la respuesta inicial del cultivo a cada péptido.

La figura 7 es un resumen de respuestas de vacunas de péptidos aCD40.LIPO5 frente a las 5 regiones de péptidos de 8 pacientes con VIH. Los datos se basan en la producción de IFN^yespecífico de los péptidos. La figura 7 muestra las respuestas específicas de antígenos observadas en 8 pacientes con VIH. Los datos demuestran que todas las regiones de péptidos de VIH en la vacuna tienen la capacidad de ser procesadas y presentadas a células T - suponiendo la situación probable de que las respuestas a estos péptidos sólo se observen si están presentes las células portadoras de TCR apropiadas. Por lo tanto, cada paciente tiene un espectro característico de tales células.

La vacuna de péptido aCD40.LIPO5 puede provocar la proliferación de células T específicas de antígenos capaces de secretar un amplio espectro de citoquinas

La figura 8A-C muestra que la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 provoca la expansión de células T específicas de péptidos de VIH capaces de secretar múltiples citocinas, una característica deseable en una vacuna. En la figura 8A-C la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 provoca respuestas específicas de los péptidos gag253, nef66, nef116 y pol325 caracterizadas por la producción de citocinas múltiples. Este es el paciente A5.

Vacunación con péptido de VIH anti-CD40.LIPO5 de DC ex vivo.

La figura 9 muestra el protocolo para someter a ensayo la capacidad de la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 para dirigir la expansión de células T específicas de antígenos resultantes de la absorción dirigida por las DC y la presentación de epítopos peptídicos sobre su complejo de MHC de superficie. En resumen, los monocitos del paciente con VIH se diferencian en DC por cultivo durante 2 días con IFNa y GM-CSF. A continuación se añaden diferentes dosis de vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 o una mezcla de los 5 péptidos durante 18 h. Se añadieron células T autólogas al cocultivo (a una razón de 1:20) al día 3. Al día 5, se añaden 100 U/ml de IL-2 al cultivo y luego se renueva el medio cada 2 días con 100 U/ml de IL-2. El día 10, las células expandidas se vuelven a sensibilizar durante 48 horas con los péptidos largos individuales correspondientes a las 5 secuencias de péptidos de VIH incorporadas al rAb de fusión de péptidos de VIH aCD40.LIPO5. A continuación, los sobrenadantes de cultivo se recogen y se evalúan para determinar la producción de citoquinas utilizando Luminex.

La figura 10A-B muestra la secreción de citoquinas en respuesta a péptidos de VIH de cocultivos de DC-células T tratados con diversas dosis de vacuna del péptido de VIH aCD40.LIPO5. Este es el paciente A10. Los resultados en el paciente A10 mostrados en la figura 10A-B demuestran la expansión de células T específicas de antígenos correspondientes a epítopos dentro de las regiones de los péptidos de VIH gag17, gag253 y pol325. En la mayoría de los casos, hay concordancia de respuestas entre la vacuna del péptido de VIH aCD40.LIPO5 y la vacuna sin LIPO5 [mezcla de 5 péptidos de VIH no lipidados con secuencias correspondientes a las de la vacuna del péptido de VIH aCD40.LIPO5]. Así, la vacuna del péptido de VIH aCD40.LIPO5 funciona bien en este entorno in vitro donde las DC cultivadas procesan eficazmente y presentan los antígenos de VIH a las células T. Esto ilustra el uso de la vacuna del péptido de VIH aCD40.LIPO5 para la vacunación ex vivo, por medio de la cual las "DC vacunadas" serían crioconservadas para su futura reinyección en el mismo paciente.

Vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 - posible efecto inmunológico de las regiones conectoras flexibles. Es posible que las secuencias conectoras flexibles que se intercalan entre las secuencias peptídicas de VIH dentro de la vacuna de péptido de VH aCD40.LIPO5 contengan por sí mismas epítopos de células T. La figura 11A-B muestra que el paciente A4 no parece tener una agrupación significativa de células T de memoria con especificidades para las cinco secuencias conectoras flexibles dentro de la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5. En la figura 11A-B, las PBMC del paciente A4 tratadas con la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 provocan la expansión de células T específicas de antígenos con especificidad para la región gag253, pero no para las secuencias conectoras flexibles. Se utilizó el protocolo descrito en la figura 9, correspondiendo la secuencia de los péptidos largos conectores flexibles a las zonas en negrita, los péptidos de VIH están en negrita-cursiva, mostrado en la siguiente secuencia.

Secuencia de la cadena pesada de la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 que muestra regiones conectoras flexibles en negrita, secuencias de unión subrayadas y regiones del péptido de VIH sombreadas en negritacursiva.

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTS SN QVFLKITIYDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFD VW GAGTTVTV S S AKTKG PSYFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTYSWNSGALTSGYHTFPAYLQSSGLYSLSSYYTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCW VDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQ TPTNTISYTPTNNSTPTNNSNPKPNPASZAm.RPGGAAAF/ttA///FASSSVSPTTSYHPTPTSVP PTPTKSSPASVPP/PFG£/r/G?W//¿G¿V/GF/CV/FS7,7A/¿DASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIK GASH TQ G YF PD W QNYTPGPGVRYPL TFGW L FAZAST VTPT AT ATPS AIVTTITPT ATTKP AS VG F P V T P Q V P L R P M T Y K A A V D L SH F L K E K G G L A ST N G SIT Y A A T A P T Y T Y T X N A T P SA A A SA IF Q SS M T K ILE PF R K Q N PD IV IYQ YM D D L FAS. (SEC ID NO.:36).

En la figura 12A, las PBMC del paciente A3 tratadas con la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 provocan la expansión de células T específicas de antígenos con especificidades para las regiones gag253, nef66 y nef116, pero no para las secuencias conectoras flexibles. Se utilizó el protocolo descrito en la figura 1, correspondiendo la secuencia de los péptidos largos conectores flexibles a las zonas negritas mostradas en la figura 8.

Las figuras 12B-1 y B-2 muestran respuestas de células T específicas de antígenos de VIH provocadas a partir de PBMC del paciente con VIH, incubadas con 30 nM de tres vacunas diferentes que dirigen a DC el péptido HIV5. Las células se cultivaron durante 10 días con IL-2 y a continuación se estimularon con péptidos largos individuales correspondientes a las 5 secuencias de péptidos de VIH incluidas dentro de las vacunas que se dirigen a DC. Después de 1 hora, se añadió brefeldina A y la incubación continuó durante 5 horas más antes de la tinción para análisis FACS. Las gráficas FACS muestran tinción de IFN^yy CD8 sobre células T CD3+. Los círculos indican la expansión significativa provocada por la vacuna de células IFNy+ en comparación con PBMC cultivadas sin vacuna. Las células CD8- son células T CD4+. Los datos muestran que esta vacuna anti-CD40.HIV5pep provoca una fuerte expansión de células T CD8+ específicas de nef66 (N66) que no se observa con los otros vehículos de direccionamiento a DC.

Estos son datos basados en la serie de péptidos de VIH LIPO5. Por ejemplo, la cadena H anti-CD40 es anti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158] con la secuencia:

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTV KGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDT AMYY C ARRGLPFHAMDY W GQGT SVTV S S AKTKGP SV FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTP TNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASEKIRLRPGGKKKYKLKHIVASSSVSPTTSVHPTPTSVPPTPT KSSPASNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDASPTSTPADSSTITPTATPTATPTIKGASHTQ GYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASVGFPVTPQVP LRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASAIFQSSMTKILEPFR KQNPDIVIYQYMDDLYAS (SEC ID NO.: 37).

La figura 12C-1 y C-2 es un estudio similar al mostrado en la figura 12B-1 y B-2, excepto que las PBMC son de un paciente con VIH diferente (A2). Los datos muestran las respuestas de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígenos provocadas por anti-CD40.HIV5pep pero no las otras vacunas de direccionamiento a d C, o por una mezcla de los propios péptidos.

La figura 12D muestra que, basándose en el análisis de 15 respuestas de péptidos de VIH diferentes [5 regiones de péptidos muestreadas en 3 pacientes], la vacuna anti-CD40.HIV5pep es claramente superior a anti DCIR.HIV5pep, anti-LOX-1.HIV5pep y sin LIPO5 para provocar una amplia gama de respuestas de células T CD8+ y CD4+ específicas de péptidos de VIH.

La inmunogenicidad de las secuencias conectoras flexibles es motivo de preocupación para el diseño de vacunas de péptido de VIH aCD40.LIPO5. Los conjuntos de datos limitados mostrados anteriormente, la comprobación del recuerdo de células T con especificidades para los epítopos dentro de las secuencias conectoras flexibles, sugieren que el repertorio humano contra estas secuencias es variable. Asimismo, la capacidad de estas secuencias para cebar respuestas de novo no se ha sometido a ensayo. Se pueden someter a ensayo las respuestas a la vacuna de péptido de VIH aCD40.LIPO5 en monos. Si es necesario, se pueden identificar ciertos epítopos menos deseables dentro de estas regiones mediante una combinación de medios computacionales predictivos y exploraciones de estimulación de péptidos y, a continuación, se eliminan introduciendo cambios mutacionales que anulan la interacción TCR.

La molécula de unión a anti-CD40 incluye una cadena ligera que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEC ID N°: 38). La región variable de la cadena ligera del anticuerpo está subrayada y las CDR están en negrita (SEC ID N°: 42, 43 y 44, respectivamente).

MMSSAOFLGLLLLCFOGTRCDIOMTOTTSSLSASLGDRVTISCSASOGISNYLNWYOOKPDGTVK LLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCOOFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEC IDNO.:38).

La molécula de unión a anti-CD40 incluye una cadena pesada que tiene la secuencia siguiente. La región variable de la cadena ligera del anticuerpo está subrayada y las c Dr están en negrita (SEC ID N°: 45, 46 y 47, respectivamente).

MNLGLSLIFLVLVLKGVOCEVKLVESGGGLVOPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVROTPEKRL EWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLOMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMD YWGOGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW S YLTYLHQD WLNGKEYKCKY SNKGLP S SIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQY SLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGKAS (SEC IDNO.:39).

El ácido nucleico que codifica la cadena ligera puede comprender el SEC ID N°. La región variable de la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera del anticuerpo está subrayada y las CDR están en negrita.

AT GAT GT CCTCTGCT CAGTTCCTT GGT CTCCT GTT GCT CT GTTTT CAAGGT ACC AGAT GT G AT A TCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTT GCAGTGCAAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAA CTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAATTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACCATCGGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGC CACTTACTATTGTCAGCAGTTTAATAAGCTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTC GAGAT C AAACGAACT GT GGCT GC ACC ATCTGT CTT C AT CTTCC CGCC AT CT GAT GAGC AGTT G AAAT CT GGAACT GC CTCT GTT GT GT GC CT GCT GAAT AACTT CTAT CCC AGAGAGGCC AAAGT AC AGT GGAAGGT GGATAACGCC CT CC AAT CGGGT AACT C CC AGGAGAGT GT CACAGAGC AG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG AGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEC ID NO.: 40).

El ácido nucleico que codifica la cadena pesada puede comprender el SEC ID N°: 40. La región variable de la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada del anticuerpo está subrayada y las CDR están en negrita.

AT GAACTT GGGGCT C AGCTT GATTTT CCTT GTCCTT GTTTTAAAAGGT GTCCAGT GT GAAGT G

AAGCT GGT GGAGT CT GGGGGAGGCTTAGT GC AGCCT GGAGGGTCCCT GAAACT CTCCT GT GC AACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAG AGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACT GTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGA GCCGGCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCA TGCTATGGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGC CCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTG CCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACA CTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGAC CCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG ACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAC CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGA GC AGGT GGC AGGAGGGGAAT GT CTT CT CAT GCTCCGT GATGCAT G AGGCT CT GC AC AACC AC TACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA (SEC ID NO.: 41).

Un anticuerpo humanizado incluye la región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde las regiones marco de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera proceden de un anticuerpo humano donante, y en donde las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera tienen una identidad de por lo menos 80%, 90%, 95% o superior con la CDR1L que tiene la secuencia de aminoácidos SASQGISNYLN (SEC ID N°: 41), la Cd R2^lque tiene la secuencia de aminoácidos YTSILHS (SEC ID N°: 42) y la CDR3^lque tiene la secuencia de aminoácidos QQFNKLPPT (SEC ID N°: 43); y en donde las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada comprenden una identidad de por lo menos 80%, 90%, 95% o más con la CDR1H, CDR2Hy CDR3H, teniendo la CDR1Hla secuencia de aminoácidos GFTFSDYYMY (SEC ID N°: 45), teniendo la CDR2^hla secuencia de aminoácidos YINSGGGSTYYPDTVKG (SEC ID N°: 46), y teniendo la CDR3^hla secuencia de aminoácidos RGLPFHAMDY (SEC ID N°: 47). Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender un marco de VL que tiene una identidad de por lo menos 95% con el marco del SEC ID N°: 38 y un marco de VH que tiene una identidad de por lo menos 95% con el marco del SEC ID N°: 39. En otro aspecto de la divulgación, las secuencias CDR donantes son de ANTI-CD40_12E12.3F3 y adicionalmente, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se unes específicamente a CD40.

Ejemplo 3. Antígeno específico de próstata (PSA), Ciclina D1, MART-1, nucleoproteína viral de influenza (NP) y la subunidad HA1 de la hemaglutinina viral de influenza (H1N1, PR8) y escrutinio peptídico.

Internalización de mAb anti-CD40. Se incubaron 1x106 IL-4DC durante 1 h en hielo con 3 mg/ml de gammaglobulina humana en PBS que contenía BSA al 3% para bloquear la unión no específica. Las células se pulsaron durante 30 minutos sobre hielo con mAb anti-CD40 marcado con Alexa 568 (todos a una concentración final de 20 ng/ml en bloqueo no específico). Las células se lavaron a continuación y se dejó que se internalizaran los anticuerpos unidos a la superficie durante diferentes tiempos, entre 0 y 90 minutos, a 37°C. Después de la internalización, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo que contenía BSA al 1% y azida de sodio al 0,05% (PBA) y se fijaron en formaldehído libre de metanol al 1% enfriado con hielo (MFF) en p Bs durante la noche a 4°C. Las células se permeabilizaron en PBS al 3% de BSA que contenía saponina al 0,5% (PBAS) durante 20 minutos a 4°C, y se transfirieron a una placa de microtitulación de polipropileno de fondo redondo de 96 pocillos. Después de lavar dos veces con PBAS enfriado con hielo, las células se incubaron durante 1 h sobre hielo con 3 mg/ml de gammaglobulina humana en PBAS. Se diluyó BODIPY-faloidina en PBAS y se incubaron con células durante 1 hora en hielo. Las células se tiñeron adicionalmente con TOPRO-II, como un contratinción nuclear. Los portaobjetos se visualizaron en un microscopio confocal Leica SP1.

Células. Los anticuerpos monoclonales para la tinción de la superficie celular se adquirieron de BD Biosciences (CA). Se cultivaron monocitos (1x106/ml) de donantes sanos en medio Cellgenics (Francia) que contenía GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (50 ng/ml) o GM-CSF (100 ng/ml) e IFNa (500 unidades/ml) (R&D, CA). Para IFNDC, las células se alimentaron el día 1 con IFNa y GM-CSF. Para IL-4DC, se añadieron como suplemento las mismas cantidades de citoquinas a los medios el día uno y el día tres. Las PBMC se aislaron a partir de capas leucocitarias utilizando gradientes de Percoll® (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) mediante centrifugación en gradiente de densidad. Las células T CD4+ y CD8+ totales se purificaron utilizando kits StemCell (CA).

Péptidos. Se sintetizaron (mimotopos) péptidos 15 unidades (11 aminoácidos solapantes) para el antígeno específico de próstata (PSA), Ciclina D1, MART-1, nucleoproteína viral de influenza (NP) y subunidad HA1 de hemaglutinina viral de influenza (H1N1, PR8).

Cultivo simultáneo de DC y células T y expresiones de citoquinas. Se cultivaron simultáneamente 5 x 103 DC cargadas con proteínas de fusión recombinantes (anti-CD40-HA1, Ig-HA1 de control, anti-CD40-PSA, anti-CD40-Ciclina D1, anti-CD40-MART-1, anti-MARCO-MART-1 e Ig -MART-1 de control) con 2x105 células T CD4+ marcadas con CFSE durante 8 días. La proliferación se sometió a ensayo midiendo la dilución de CFSE después de la tinción de las células con anticuerpo anti-CD4 marcado con APC.

Para medir la expresión del IFNy intracelular, las células T CD4+ se reestimularon con 1-5 pM de los péptidos indicados durante 5 horas en presencia de Brefeldina A. En experimentos separados, las células T CD4+ fueron reestimuladas con los péptidos indicados durante 36 horas, y a continuación se midieron las citoquinas secretadas por las células T CD4+ por medio de Luminex.

Se cultivaron simultáneamente células T CD8+ con DC durante 10 días en presencia de 20 unidades/ml de IL-2 y 20 unidades/ml de IL-7. El día 10 del cultivo, las células T CD8+ se tiñeron con anti-CD8 y se indicaron los tetrámeros.

Análisis de CTL. El día 10 del cultivo, se realizó un análisis de liberación de 51Cr de 5 hora. Las células T2 se pulsaron con 51Cr primero y después se marcaron con epítopo HLA-A2 10 pM de MART-1 o epítopo de influenza viral M1 de influenza 1 nM. Se utilizaron células T2 sin péptido como control. Se calculó la media de las muestras triplicadas y se determinó el porcentaje de lisis específica utilizando la siguiente fórmula: porcentaje de lisis específica = 100 x (liberación de 51Cr experimental - liberación de 51Cr de control)/(liberación de 51Cr máxima -liberación de 51Cr de control). La liberación máxima se refiere a los recuentos de las dianas en Triton X-100 al 2,5%.

Preparación de mAb específicos para CD40 humano. Se produjeron las proteínas de fusión de ectodominio de receptor.hIgG (IgG1Fc humana) y AP (fosfatasa alcalina placentaria humana) para inmunizar ratones y escrutar los mAb, respectivamente. Se modificó genéticamente un vector de mamífero para proteínas de fusión de IgFc humana como se describe [J. Immunol. 163:1973-1983 (1999)]. El vector de expresión de mamífero para las proteínas de ectodominio del receptor.AP se generó mediante PCR para amplificar el ADNc para los residuos de AP 133-1581 (gb|BC009647|), mientras se añadía un sitio Xho I proximal en marco y un residuo de His 6C-terminal distal seguido de un codón de parada TGA y un sitio Not I. Este fragmento Xho I - Not I reemplazó la secuencia codificante de Fc de IgG humana en el vector de ectodominio.IgG anterior. Las proteínas de fusión se produjeron utilizando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 (Invitrogen, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante (1 mg de ADN plasmídico total con 1,3 ml de reactivo de 293Fectina/L de transfección). El ectodominio de receptor.hIgG se purificó por medio de 1 ml de cromatografía de afinidad con proteína A HiTrap (GE Healthcare, CA) eluida con glicina 0,1 M, pH 2,7. Las fracciones se neutralizaron con Tris 2 M, y a continuación se sometieron a diálisis frente a PBS.

Los mAb de ratón se generaron mediante tecnología convencional. Brevemente, se inmunizaron ratones BALB/c de seis semanas de edad i.p. con 20 pg de proteína de fusión de ectodominio de receptor.hIgGFc con coadyuvante Ribi, a continuación se reforzaron con 20 pg de antígeno diez días y quince días más tarde. Después de tres meses, los ratones fueron reforzados de nuevo tres días antes de extraer los bazos. De tres a cuatro días después de un refuerzo final, se recogieron los ganglios linfáticos de drenaje (LN). Las células B del bazo o las células de los LN se fusionaron con células SP2/O-Ag 14 (ATCC). Los sobrenadantes de hibridoma se escrutaron para analizar los mAb específicos para la proteína de fusión de ectodominio de receptor en comparación con el compañero de fusión solo, o con el ectodominio de receptor fusionado a fosfatasa alcalina [J. Immunol. 163:1973-1983 (1999)]. Los pocillos positivos se escrutaron a continuación con FACS utilizando células 293F transfectadas transitoriamente con plásmidos de expresión que codificaban los ADNc de receptor de longitud completa. Los hibridomas seleccionados se clonaron de una sola célula y se expandieron en matraces CELLine (Integra, CA). Los sobrenadantes de hibridoma se mezclaron con un volumen igual de glicina 1,5 M, NaCl 3 M, 1 x PBS, pH 7,8 (tampón de unión) y voltearon con resina MabSelect (GE Healthcare, CA) (800 pl/5 ml de sobrenadante). La resina se lavó con tampón de unión y se hizo eluir con glicina 0,1 M, pH 2,7. Después de la neutralización con Tris 2 M, los mAb se sometieron a diálisis frente a PBS.

Expresión y purificación de mAb recombinantes. Se preparó el RNA total a partir de células de hibridoma utilizando el kit RNeasy (Qiagen, CA) y se utilizó para la síntesis de ADNc y la PCR (kit SMART RACE, BD Biosciences) utilizando los cebadores 5' suministrados y los cebadores 3' específicos de genes (mIgGK, 5' ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc 3' (SEC ID N°: 48); mIgG2a, 5' ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt 3') (SEC ID N°: 49). Los productos de la PCR se clonaron entonces (kit pCR2.1 TA, Invitrogen) y se caracterizaron por secuenciación de ADN (MC Lab, CA). Utilizando las secuencias derivadas para los ADNc de la región variable (V) de cadena pesada (H) y ligera (L) de ratón, se utilizaron cebadores específicos para amplificar por PCR el péptido señal y las regiones V mientras se incorporaban sitios de restricción flanqueantes para la clonación en vectores de expresión que codificaban las regiones de IgGK o IgG4H humanas aguas abajo. El vector para la expresión de mVK-hIgK quimérico se construyó amplificando los residuos 401-731 (gi|63101937|) flanqueados por sitios Xho I y Not I e insertando esto en el intervalo Xho I - Not I de pIRES2-DsRed2 (Bd Biosciences). Se la utilizó PCR para amplificar la región Vk del mAb desde el codón iniciador, anexando un sitio Nhe I o Spe I, a continuación CACC, a la región codificante (p. ej., el residuo 126 de gi|76779294|), anexando un sitio distal Xho I. El fragmento de PCR se clonó a continuación en el intervalo Nhe I - No I del vector anterior. La secuencia de IgGK humana de control corresponde a gi|49257887| residuos 26-85 y gi|21669402| Residuos 67 - 709. El vector IgG4H humano de control corresponde a los residuos 12-1473 de gi|19684072| con las sustituciones S229P y L236E, que estabilizan un enlace disulfuro y anulan la interacción FcR residual [J. Immunol. 164:1925-1933 (2000)], y se insertan entre los sitios Bgl II y Not I de pIRES2-DsRed2 mientras se añade la secuencia 5' gctagctgattaattaa 3' en lugar del codón de parada. Se utilizó la PCR para amplificar la región VH del mAb desde el codón iniciador, anexando CACC a continuación un sitio Bgl II, a la región que codifica el residuo 473 de gi|19684072|. El fragmento de la PCR se clonó a continuación en el intervalo Bgl II - Apa I del vector anterior.

Expresión y purificación de la proteína de fusión HA1 de la Gripe. La secuencia codificante del antígeno HA1 de la gripe es una proteína CipA [Clostridium thermocellum] gi|479126| residuos 147-160 que preceden a la hemaglutinina [virus de la Influenza A (A/Puerto Rico/8/34 (H1N1))] gi|126599271| residuos 18-331 con un cambio de P321L y con 6 residuos His C-terminales insertados entre los sitios Nhe I y Not I de la cadena H para codificar proteínas de fusión anticuerpo recombinantes-HA1 (rAb.HA1). De forma similar, se codificaron proteínas de fusión de anticuerpo recombinante-PSA (rAb.PSA) insertando gi|34784812| residuos 101 a 832 del antígeno específico de próstata con la secuencia proximal GCTAGCGATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACAC CGACAACAACACTTCTAGCGC

(SEC ID N°.:50) (sitio Nhe I y espaciador CipA) y un sitio distal Not I en el mismo vector de la cadena H. Las proteínas de anticuerpo recombinantes se expresaron y purificaron como se ha descrito anteriormente para las proteínas de fusión de hFc. En algunos casos, la región codificante de rAb.antígeno y la región codificante de la cadena L correspondiente se transfirieron a vectores de UCOE de cetHS-puro separados (Millipore, CA). El uso de vectores UCOe en combinación con una línea de células de suspensión libre de suero preadaptada permitió la producción rápida de grandes cantidades de proteína [Cytotechnology 38, 43-46 (2002)]. Se sembraron células CHO-S cultivadas en CD-CHO con GlutaMAX y suplemento de medio HT (Invitrogen) a 5x105 ml 24h antes de la transfección en matraces Corning Ehrlenmyer de 500 ml y se incubaron en CO2 al 8% a 125 rpm. El día de la transfección, se añadieron 1,2 x 107 células con una viabilidad de por lo menos 95% a un volumen final de 30 ml en un matraz de 125 ml en CD-CHO con GlutaMAX. Se añadieron 48 pl de reactivo FreeStyle Max (Invitrogen) en 0,6 ml de OptiPRO SFM (Invitrogen) mezclando suavemente con 24 pg de vector de cadena ligera linealizado con Sce I y 24 pg de vector de cadena H linealizado con Sce I mezclados y se filtró en condiciones estériles en 0,6 ml de OptiPRO SFM. Después de 20 minutos, el complejo de ADN-lípido se añadió lentamente al matraz de cultivo de de CHO-S de 125 ml con agitación. Las células se incubaron 24 horas antes de añadir 30 ml de una solución de medio combinada de CD-CHO con CHO-M5 (Sigma, componente C0363 del kit CHO 1) que contenía 5 pg/ml de puromicina (A.G. Scientific, CA), 2xGlutaMAX y 0,25xPen/Strep (Invitrogen). Al día 2, se añadieron otros 5 pg/ml de puromicina directamente al cultivo y se dejó que la selección prosiguiera ~ 10-14 días mientras se hacía un seguimiento de la viabilidad celular a partir de los seis días después de la transfección. El recuento de células viables disminuyó y cuando la densidad de viables fue ~2-3x106/ml, las células se transfirieron a medio de selección de nueva aportación (CD CHO-S CHO M5 con 2X GlutaMAX, 0,25xPen/Strep, 10 pg/ml de Puromicina) a 1E6/ml. Las provisiones de partida de células congeladas se prepararon cuando la viabilidad alcanzó >90%. Las células se dividieron en medio de selección cuando la densidad celular excedió de 2 x 106/ml hasta que aumentó a escala a 4 x 250 ml en matraces de 500 ml. Se recogió el sobrenadante cuando la viabilidad celular cayó por debajo del 80% con una densidad celular final máxima de ~7x106/ml. Los niveles de endotoxina fueron inferiores a 0,2 unidades/ml.

Expresión y purificación de las proteínas M1 y MART-1 de Gripe. Se utilizó la PCR para amplificar el ORF del gen M1 de influenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1) mientras se incorporaba un sitio Nhe I distal al codón iniciador y un sitio Not I distal al codón de parada. El fragmento digerido se clonó en pET-28b (+) (Novagen), colocando el ORF de M1 en marco con una etiqueta His6, codificando así His.Proteína M1 de Gripe. Un derivado pET28b (+) que codifica un dominio de cohesina de 169 residuos N-terminal de C. thhermocellum (no publicado) insertado entre los sitios Nco I y Nhe I expresó Coh.Su. Para la expresión de CohesinFlex-hMART-1-PeptideA-His, se insertó la secuencia

GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAA GGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAG CGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCC G (SEC ID N°:51) (que codifica DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAG/G/LTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP (SEC ID N°:52) - los residuos en cursiva son el péptido restringido por HLA-A2 inmunodominante y los residuos subrayados que rodean al péptido son de MART-1) entre los sitios Nhe I y Xho I del vector anterior. Las proteínas se expresaron en la cepa BL21 (DE3) de E coli (Novagen) o T7 Express (NEB), desarrollada en LB a 37°C con selección para la resistencia a la kanamicina (40 |jg/ml) y agitación a 200 rondas/minuto hasta el crecimiento en fase semilogarítmica media cuando se añadieron 120 mg/l de IPTG. Después de tres horas, las células se cosecharon por centrifugación y se almacenaron a -80°C. Las células de E coli de cada fermentación de 1 L se resuspendieron en 30 ml de Tris 50 mM enfriado con hielo, EDTA 1 mM pH 8,0 (tampón B) con 0,1 ml de inhibidor de proteasa Cocktail II (Calbiochem, CA). Las células se sometieron a sonicación sobre hielo durante 2x5 min en el ajuste 18 (Fisher Sonic Dismembrator 60) con un período de reposo de 5 min y después se centrifugaron a 17.000 r.p.m. (Sorvall SA-600) durante 20 minutos a 4°C. Para la purificación de His.M1 de Gripe se hizo pasar la fracción de sobrenadante de lisado celular de 50 ml a través de 5 ml de cuentas de Q Sefarosa y se añadieron 6,5 ml de Tris 160 mM, imidazol 40 mM, NaCl 4 M pH 7,9 al flujo continuo de Q Sefarosa. Esto se cargó a 4 ml/min en una columna de HP quelante HiTrap de 5 ml cargada con Ni++. La proteína unida a la columna se lavó con NaPO4 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7,6 (tampón D), seguido de otro lavado con ^C O O N a 100 mM pH 4,0. La proteína unida se hizo eluir con HaCOONa 100 mM pH 4,0. Las fracciones pico se agruparon y cargaron a 4 ml/min en una columna HiTrap S HiTrap de 5 ml equilibrada con HaCOONa 100 mM pH 5,5, y se lavaron con el tampón de equilibrado, seguido de elución con un gradiente de NaCl 0 - 1 M en NaPO450 mM pH 5,5. Las fracciones pico que eluían a NaCl aproximadamente 500 mM se reunieron. Para la purificación de Coh.M1 de Gripe.His, se lisaron las células de 2 L de cultivo como anteriormente. Después de la centrifugación, se añadieron 2,5 ml de Triton X114 al sobrenadante con incubación en hielo durante 5 min. Después de una incubación adicional a 25°C durante 5 min, el sobrenadante se separó del Triton X114 después de la centrifugación a 25°C. La extracción se repitió y el sobrenadante se hizo pasar a través de 5 ml de cuentas de Q Sepharose y se añadieron 6,25 ml de Tris 160 mM, imidazol 40 mM, NaCl 4 M pH 7,9 al flujo continuo de Q Sefarosa. La proteína se purificó a continuación mediante cromatografía quelante Ni++ como se ha descrito anteriormente y se hizo eluir con imidazol 0-500 mM en tampón D.

La figura 13 muestra la internalización del mAb anti-CD40:IL-4DC. Las IL-DC se trataron con 500 ng/ml de anti-CD40-Alexa 568.

La figura 14 muestra la proliferación de células T CD4 y CD8 por DC dirigidas con anti-CD40-HA1. Se cultivaron simultáneamente 5x10a IFNDC cargadas con 2 pg/ml de anti-CD40-HA o Ig-HA1 de control con células T CD4+ o CD8+ autólogas marcadas con CFSE (2x105) durante 7 días. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8. La proliferación celular se sometió a ensayo midiendo la dilución de CFSE.

La figura 15 muestra una titulación de la proteína de fusión de HA1 sobre la proliferación de células T CD4+. Las IFNDC (5K) cargadas con proteínas de fusión se cultivaron simultáneamente con células T CD4+ marcadas con CFSE (200 K) durante 7 días.

La figura 16 muestra que las IFNDC dirigidas con anti-CD40-HA1 activan células T CD4+ específicas de HA1. Las células T CD4+ se reestimularon con DC cargadas con 5 pM de los péptidos indicados, y a continuación se tiñó el IFNy intracelular.

La figura 17 muestra que las IFNDC dirigidas con anti-CD40-HA1 activan las células T CD4+ específicas de HA1. Las células T CD4+ se reestimularon con DC cargadas con los péptidos indicados durante 36 h, y después se analizó el sobrenadante del cultivo para medir el IFNy.

La figura 18 muestra que el direccionamiento de CD40 da como resultado un aumento del cebado cruzado de células T CD8+ específicas de MART-1. Las IFNDC (5 K/pocillo) cargadas con proteínas de fusión fueron cultivadas simultáneamente con células T CD8+ purificadas durante 10 días. Las células se tiñeron con anti-CD8 y tetrámero. Las células son de donantes sanos (HLA-A *0201+).

La figura 19 muestra que el direccionamiento de CD40 da como resultado un mejor cebado cruzado de células T CD8+ específicas de MART-1 (resumen de 8 experimentos repetidos utilizando células de diferentes donantes sanos).

La figura 20 muestra que los CTL CD8+ inducidos con IFNDC dirigidas con anti-CD40-MART-1 son funcionales. Se mezclaron células T CD8+ cultivadas simultáneamente con IFNDC dirigidas con proteínas de fusión, con células T2 cargadas con epítopo peptídico 10 pM.

La figura 21 muestra que los CTL CD8+ inducidos con IFNDC dirigidas con anti-CD40-M1 de Gripe son funcionales. Se mezclaron células T CD8+ cultivadas simultáneamente con IFNDC dirigidas con proteínas de fusión, con células T2 cargadas con epítopo peptídico 1,0 nM.

La figura 22 muestra un esquema del protocolo para someter a ensayo la capacidad de una vacuna compuesta de anti-CD4012E12 unido a PSA (antígeno específico de próstata) para provocar la expansión a partir de una población de células T no sometida a tratamiento previo. Células T CD4+ específicas de PSA que corresponden a una amplia matriz de epítopos de PSA. En pocas palabras, las DC obtenidas por cultivo con IFNa y GMCSF de monocitos de un donante sano se incuban con la vacuna. Al día siguiente, las células se colocan en medio de nueva aportación y se añaden células T CD4+ puras del mismo donante. Varios días más tarde, se añaden péptidos PSA y, después de cuatro horas, se determinan los niveles de IFN gamma secretado en los sobrenadantes del cultivo.

La figura 23 muestra que muchos péptidos PSA provocan potentes respuestas de producción de IFN-gamma que indican que los agentes anti-CD4012E12 y anti-CD40 similares pueden suministrar eficazmente antígeno a las Dc , dando como resultado el cebado de respuestas inmunitarias contra múltiples epítopos del antígeno. Mapeo de péptidos de antígenos PSA. Se cultivaron simultáneamente 5x103 IFNDC cargadas con 2 pg/ml de anti-CD40-PSA con células T CD4+ autólogas purificadas (2x105) durante 8 días. Las células fueron reestimuladas con 5 pM de péptidos individuales derivados de PSA durante 36 h. La cantidad de IFNy se midió mediante Luminex. Las células son de donantes sanos.

La figura 24 muestra que las DC dirigidas con anti-CD40-PSA inducen respuestas de células T CD8+ específicas de PSA. Las IFNDC fueron dirigidas con 1 |jg de proteína de fusión de mAb con PSA. Las células T CD8+ autólogas purificadas se cultivaron simultáneamente durante 10 días. Las células se tiñeron con anti-CD8 y tetrámero de PSA (KLQCVDLHV). Las células son de un donante sano HLA-A*0201 positivo. Los resultados demuestran que el anti-CD40 suministra eficazmente PSA a las DC, lo que a su vez provoca la expansión de las células T CD8+ específicas de PSA. En pocas palabras, se cultivaron simultáneamente 5x103 IFNDC cargadas con 2 pg/ml de anti-CD40-PSA con células T CD8+ autólogas purificadas (2x105) durante 10 días. Las células se tiñeron a continuación con tetrámero. Las células son de un donante sano HLA-0*201 positivo.

La figura 25 muestra un esquema (izquierda) y la producción de IFNy por células T de los agrupamientos de péptidos y control para el donante 2. Se cultivaron simultáneamente 5 x l03 IFNDC cargadas con 2 pg/ml de anticD40-ciclina D1 con células T CD4+ autólogas purificadas (2x105) durante 8 días. Las células se reestimularon con 5 pM de péptidos individuales derivados de ciclina D1 durante 5 horas en presencia de brefeldina A. Las células se tiñeron para medir la expresión intracelular de IFNy.

La figura 26 muestra un barrido de péptidos y producción de IFNy por células T obtenidas de los agrupamientos de péptidos mostrados en la figura 25 y el control para el donante 2. Se cultivaron simultáneamente 5x1o3 IFNDC cargadas con 2 jg/m l de anti-CD40-ciclina D1 con células T CD4+ autólogas purificadas (2x105) durante 8 días. Las células fueron reestimuladas con 5 pM de péptidos individuales derivados de ciclina D1 durante 5 horas en presencia de brefeldina A. Las células se tiñeron para medir la expresión intracelular de IFNy.

En conclusión, el suministro de antígenos a las DC, las células presentadoras de antígenos más potentes, a través de CD40 es una manera eficaz de inducir y activar la inmunidad mediada por células T CD4+ y CD8+ específica del antígeno. De este modo, las vacunas hechas de mAb anti-CD40 inducirán una potente inmunidad contra el cáncer y las infecciones.

Información del péptido:

Secuencias de HA1:

MKANLLVLLCALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCR (SEC ID N°.:53) LKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELRE (SEC ID N°.:54) QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNS (SEC ID N°.:55) YVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQA (SEC ID N°.:56)

GRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLG (SEC ID N°.:57)

AINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSI (SEC ID N°.:58)

Secuencias de péptidos de la figura 17

Péptido 22: SSFERFEIFPKESSWPN (SEC ID N°.:59)

Péptido 45: GNLIAPWYAFALSRGFG (SEC ID N°.:60)

Péptido 46: WYAFALSRGFGSGIITS (SEC ID N°:61)

Secuencias NP:

MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNS (SEC ID N°:62)

LTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIW (SEC ID N°.:63)

RQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAG (SEC ID N°:64)

AAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMD (SEC ID N°.:65)

QVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVG (SEC ID N°.:66)

IDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLST (SEC ID N°:67)

RGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPF (SEC ID N°.:68)

DRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFD (SEC ID N°:69)

MSNEGSYFFGDNAEEYDN (SEC ID N°.:70)

Secuencias de péptidos de la figura 23

Péptido 22: GKWVRELVLYDKEEIRR (SEC ID N°:71)

Péptido 33: RTGMDPRMCSLMQGSTL (SEC ID N°.:72)

Péptido 46: MCNILKGKFQTAAQKAM (SEC ID N°:73)

Secuencia del antígeno prostético específico (PSA)

MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV (SEC ID N°.:74)

LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD (SEC ID N°.:75)

LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS (SEC ID N°.:76)

NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP (SEC ID N°.:77)

SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP (SEC ID N°:78)

Secuencias de péptidos de la figura 23

Péptido 1: APLILSRIVGGWECE (SEC ID N°:79)

Péptido 4: ECEKHSQPWQVLVAS (SEC ID N°.:80)

Péptido 25: GDDSSHDLMLLRLSE (SEC ID N° :81)

Péptido 26: SHDLMLLRLSEPAEL (SEC ID N°.:82)

Péptido 49: SGDSGGPLVCNGVLQ (SEC ID N°.:83)

Péptido 54: GSEPCALPERPSLYT (SEC ID N°:84)

Péptido 56: ERPSLYTVVHYRKW (SEC ID N°.:85)

Péptido 58: VVHYRKWIKDTIVAN (SEC ID N°.:86)

Secuencia de ciclina D1

MRSYRFSDYLHMSVSFSNDMDLFCGEDSGVFSGESTVDFSSSEVDSWPGDSIACFIEDER (SEC ID N°.:87)

HFVPGHDYLSRFQTRSLDASAREDSVAWILKVQAYYNFQPLTAYLAVNYMDRFLYARRLP (SEC ID N°.:88)

ETSGWPMQLLAVACLSLAAKMEEILVPSLFDFQVAGVKYLFEAKTIKRMELLVLSVLDWR (SEC ID N°.:89)

LRSVTPFDFISFFAYKIDPSGTFLGFFISHATEIILSNIKEASFLEYWPSSIAAAAILCV (SEC ID N°.:90)

ANELPSLSSVVNPHESPETWCDGLSKEKIVRCYRLMKAMAIENNRLNTPKVIAKLRVSVR (SEC ID N°.:91)

ASSTLTRPSDESSFSSSSPCKRRKLSGYSWVGDETSTSN (SEC ID N°.:92)

Secuencias de péptidos de la figura 26.

Péptido 7: DRVLRAMLKAEETCA (SEC ID N°.:93)

Péptido 8: RAMLKAEETCAPSVS (SEC ID N°.:94)

Péptido 10: TCAPSVSYFKCVQKE (SEC ID N°.:95)

Antígeno MART-1. MART-1 es un antígeno de diferenciación melanocítica asociado al tumor. La vacunación con antígeno MART-1 puede estimular una respuesta de células T citotóxicas del anfitrión contra células tumorales que expresan el antígeno de diferenciación melanocítica, dando como resultado la lisis de las células tumorales.

La figura 27 muestra la expresión y el diseño del constructo de anticuerpos peptídicos anti-CD40-MART-1. La figura 28 es un resumen de los epítopos inmunodominantes CD4+ y CD8+ para M^aRT-1. Las figuras 27 y 28 muestran el uso de la tecnología de conectores flexibles para permitir la expresión satisfactoria de anticuerpos de direccionamiento antirreceptor de DC recombinantes fusionados a partes significativas (~ 2/3) de MART-1 humano. El anticuerpo recombinante fusionado en el extremo C de la cadena H a la región codificante de MART-1 completa no es secretado en absoluto a partir de células de mamífero de producción [no mostradas]. El aducto Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1 es particularmente bien expresado y es una realización preferida de una vacuna de direccionamiento a MART-1, como es el aducto Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1-f3-Pep-2 que tiene una carga máxima de epítopos MART-1. La diapositiva 2 de la presentación en powerpoint de MART-1 muestra que estos aductos se pueden unir satisfactoriamente a múltiples vehículos de receptor anti-DC.

La siguiente secuencia es una cadena H - serie de péptidos H-hMART-1 de la proteína de fusión de pep3-pep1-pep2 donde cada secuencia de péptidos hMART1 [cursiva-negrita] está separada por un espaciador entre péptidos f [mostrado en negrita]. En este caso, se insertó un conector de 27 aminoácidos de longitud flex-v1 (v1) [cursiva] derivado del precursor B del armazón de anclaje celulosómico [Bacteroides cellulosolvens descrito en la descripción de la invención de la vacuna gag-nef] entre el extremo C terminal de la cadena H y la serie de péptidos de hMART1 - espaciadores flexibles. Los residuos de AS subrayados son secuencias de unión.

[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1] C981 es:

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTV KGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDT AMYY C ARRGLPFHAMDY W GQGT SVTV S S AKTKGP S V FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT

CVW DVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSYMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASgEP TNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGFDHRDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPA YEKLSAEQSPPPYSP ASYSGS\YXAAY APYXYPYXSAYPSAAASMPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGfLTV/ LGAS (SEC ID NO.:96)

[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1-f3-Pep-2] C978 es:

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTV KGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSV FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS^rP TNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGFDHRDSKVSLQEKNCEPWPNAPPAYEKLSAEQSPPPYSP ASTNGSITXAATAPTXTPTX1SATPSAAASMPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGLGLLTVI LGASTXTPTATATPSA1XTT1TPTATTKPASXLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALT RRCPQEG AS (SEC ID NO.:97)

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1] C1012 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GG YFD VW GAGTTVTV S S AKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDYSQEDPEVQFNWYVDGYEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS0 TPTNTIS VTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGFDHRDSK VSL QEKNCEP VVPNA PPA YEKLSA EQSPPP ES'

[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1-f3-Pep-2] C1013 es:

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFD VW GAGTTVTV S S AKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVYVDVSQPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK V SNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKN QY SLT CLVKGF YP SDIA VE WE SN GQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQ7P TNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASGFDHRDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPA YEKLSAEQSPPPYSP ASTNGSiTXAATAPTXTPTXNATPSAAASMPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAA GIGIL TVI

L GAST VTPT AT ATPS AIVTTITPT ATTKPAS VLLLIGCWYCRRRNGYRALAIDKSLHVGTQCAL T RRCPQEGAS (SEC ID NO.:99)

Secuencia de ADN de MART-1:

Constructos de MART-1 con 3 péptidos, los sitios de inicio/parada están subrayados, el péptido 1 está en negrita, el péptido 2 es negrita-cursiva y el péptido 3 está en negrita subrayado:

AACACCGACAACAACAGATGATCTGGATGCAGCTAGTGGGTTTGATCATCGGGACAGCAA A G TG TCTC TTC AAGAGAAAAACTGTGAACCTGTGGTTCCCAATGCTCCACCTGCTTATG AGAAACTCTCTGCAGAACAGTCACCACCACCTTATTCACCTGCTAGTACCAACGGCAGCA TCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCC GCTAGT/1 TGCCAA GA GAA GA TGCTCA CTTCA TCTA TGGTTA CCCCAA GAA GGGGCA CGGCCA C TCTTA CA CCA CGGCTGAA GA GGCCGCTGGGA TCGGCA TCCTGA CA GTGA TCCTGGGA GCTAGT ACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGC CACCACCAAGCCCGCTAGTG TCTTACTGCTCA TCG G CTG TTG G TATTG TA GA A G ACG AA A TGGATACAGAGCCTTGATGGATAAAAGTCTTCATGTTGGCACTCAATGTGCCTTAACAA GAAGATGCCCACAAGAAGGGtgaGCGGCCGCATCGAAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCT AGAGTCGACCTGCAGGCATGC (SEC ID NO.: 100)

El péptido 3 está en negrita seguido de la secuencia de aminoácidos Flex-4, subrayada.

GFDHRDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEQSPPPYSPASTNGSITVAATAPTVTPT (SEC ID N°: 101)

El péptido 1 está en negrita seguido de la secuencia de aminoácidos Flex-3, subrayada.

VNATPSAAASMPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILGASTVTPTATATP (SEC ID N°.:102)

El péptido 3 está en negrita.

SAIVTTITPTATTKPASVLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEG (SEC ID N°.:103)

MART1-péptido 3, la porción en cursiva es el epítopo inmunodominante CD4+.

GFDHRDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEQSPPPYSP (SEC ID N°.:104)

Flex-4

ASTNGSITV AATAPTVTPTVNATPSAAAS (SEC ID N°.: 105)

MART1-péptido 1, la porción en cursiva es el epítopo inmunodominante CD4+ y la porción subrayada en cursiva es el epítopo inmunodominante CD8+

MPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILG (SEC ID N°.: 106)

Flex-3: ASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPAS (SEC ID N°.:107)

MARTI -péptido 2 la parte en cursiva es el epítopo inmunodominante CD4+.

VLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEG (SEC ID N°.:108)

Constructos MART1 con dos péptidos:

El péptido 3 es negrita-cursiva-subrayado, flex-4 está en negrita y el péptido 1 es negrita-cursiva-subrayado:

G F D H R D SK V SL Q E K N C E P V V P N A P P A Y E K L SA E Q SP P P Y SP A ST N G S\T \A A T A P T \T P T \N A T P

SAAASM PREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAA GIGIL TVIL GA S (SEC ID NO : 109)

Secuencia de proteína: C978. rAB-cetHS-puro [manti-CD4_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3 (negrita-cursiva subrayado)-f4 (negrita)-Pep-1 (negrita-cursiva)-f3 (cursiva)-Pep-2 (negrita-subrayado)]

MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRL EWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDY WGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVT C V W D V SQEDPEV QFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFN ST YRVY S VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTOKSLSLSLGKASOTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASG/YY/RDYACYCDE/CYCg/W

PNAPPAYEKLSAEOSPPPYSPASTNGSITVAA TAPTVTPTVNA TPSAAASM PREDAHFIYGYPKKG H GHSYTTAEEAA GIGIL TVIL GASTVTPTA TA TPSAÍVTTITPTA T T K P A S V L L U G C W Y C RRRNGY RALMDKSLHVGTOCALTRRCPOEGAS (SEC ID NO.: 110)

Secuencia de proteína: C981. rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3 (negrita-cursiva subrayado)-f4-(negrita)-Pep-1]negrita-subrayado)

MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRL EWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDY WGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVT C V W D V SQEDPEV QFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFN ST YRVY S VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTOKSLSLSLGKASOTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASG/Y)//R¿)YACY¿GE/CyC£7W

PNAPPA FEÁXY/IEOYPPPKS'PASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAASMPREDAHFIYGYPK

KGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILGAS (SEC ID NO : 111)

Antígeno GP100. El antígeno GP100 es un antígeno asociado al melanoma. Cuando se administra en una formulación de vacuna, el antígeno gp100 puede estimular una respuesta inmunitaria restringida a HLA-A2.1 de células T citotóxicas contra tumores que expresan este antígeno, lo que puede dar como resultado una reducción en el tamaño del tumor.

La región codificante del ectodominio de GP 100 fusionada a la región codificante de la cadena H del anticuerpo recombinante no es en absoluto secretada por células de mamíferos de producción [no mostradas]. La secuencia total se muestra a continuación: los residuos en cursiva son la secuencia líder y el dominio transmembrana, los péptidos están en cursiva negrita y el dominio transmembrana está subrayado en cursiva.

MDL VLKRCLLHLA VIGALLA KGATKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRG GQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDD ACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWtfTÍFGeiTFeFLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHR RGSRSYVPLAHSSSAFT/J.D0FRFSFSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLS YTWDFGDSSGTLISRALWTHTYLJE'RGRF7’AQWLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGHRPTAEAPNTT AGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEYMGTT LAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLG PLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLP KEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAWSTQLIMP GOEAGLGO VPLIVGILL VLMA VVLA SE/YRRRLMKODFS VPOLPFIS S SH WLRLPRIF C SCPIGEN SPLL SGQQV (SEC ID NO.: 112)

Las secuencias de péptidos restringidos por HLA-A0201 conocidos son: GP100 M: 209-217 (2M): IMDQVPFSV (SEC ID N°.:113); 209-217 WT: ITDQVPFSV (SEC ID N°.:114) GP100 M: 280-288 (9V): YLEPGPVTV (SEC ID N°.:115) 280-288 WT: YLEPGPVTA (SEC ID N°:116) GP100 WT: 154-162: KTWGQYWQV (SEC ID N°.: 117)

Las figuras 29-33 muestran los aductos de gp100 que se expresaron satisfactoriamente como vacunas de direccionamiento antirreceptor de DC secretado. Estos emplearon secuencias conectoras flexibles y la fragmentación y el barajado de la región codificante del ectodominio gp100. Se describen las realizaciones preferidas de los aductos de la vacuna de gp100.

La figura 29 muestra la expresión y el diseño de constructos de anticuerpos anti-CD40-péptido de gp100. La figura 30 muestra el diseño de anticuerpos anti-CD40-péptidos de gp100 adicionales. La figura 31 muestra la expresión y el diseño de constructos de anticuerpos anti-CD40-péptidos de gp100 adicionales. La figura 32 es un resumen de los epítopos inmunodominantes CD4+ y CD8+ para gp100. La figura 33 muestra la expresión y el diseño de constructos para anticuerpos anti-CD40-péptidos de gp100 adicionales.

rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-hgp100-Pep-1-f4-Pep-3-f3-Pep-4-f4-Pep-5-f3-Pep-2] C1285, los péptidos están en negrita-cursiva, los conectores flexibles están en negrita y los residuos AS subrayados son las secuencias de unión:

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTV KGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSV FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVW DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK V SNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKN QV SLT CLVKGF YP SDIA VE WE SN GQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDJJ EPA TPTTPVTTPTTTKVPRNQD WLGVSRQLRTKA WNRQL Y PE WTEA QRLDCWRGGQ VSLKVSN DGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGP CPSGS WSQKRSFVYVWKTWGQ YWQ VL GGPVSGLSIGTGRAML GTHTME VTVYHRRGSQSYVPL AHSSS4FT1TDQVPFSVSVSQLR4LDGGYKHFLRYQASTNGS\TYAATAPTVTPTVNATPSAAAS GTTDGHRPTTE4 PNTTA GQ VPTTE VVGTTPGQA PTAEPSGTTS VQ VPTTE VISTAPVQMPTA EST GMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAASTYTPTATATPSAIYTTITP TATTKPASQVTTTE WVE TTARELPIPEPE GPDASSIMSTESITGSL GPLLD GTA TLRL VKRQVPLD CVL YR YGSFSVTLDIVOASTN GSIT VAATAPT VTPT VNATPSAAAS GIESAEIL O A VPSGE GDAFE LTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSL A WSTQLIVPGILL TGQEA GL GOASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPASPL TFALQLHDPSGY

L4 EADLS YTWDFGDSSGTLISRA L VVTHTYLEPGP VTA Q VVLQ44IPL TSCGSSP ERAS (SEC ID NO.:118)

rAB-cetHS-puro[hlgG4H-C-Flex-hgp100-Pep-1-f4-Pep-3-f3-Pep-4-f4-Pep-5-f3-Pep-2] C 1286:

RLQLQESGPGLLKPSVTLSLTCTVSGDSVASSSYYWGWVRQPPGKGLEWIGTINFSGNMYYSPSL RSRVTMSADMSENSFYLKLDSVTAADTAVYYCAAGHLVMGFGAHWGQGKLVSVSPASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKC KV SNKGLP S SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKN QV SLT CLVKGF YP SDIA VE WE SN GQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVF SC S VMHEALHNH YT QKSL SL SLGKASD T TEPATPTTPVTTPTTTKVPRYQDWLGVSRQLRTKA WNRQLYPEWTE4QRLDCWRGGQVSLKVSN DGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGP CPSGS WSQKRSFVYVWKTWGQ YWQ VL GGPVSGLSIGTGRAML GTHTME VTVYHRRGSQSYVPL

4HSSS4FTITDQVPFSVSVSQLR4LDGGNKH FLRNQAYYSGSXTY AAT APTYTPTYSATPSAAAS GTTDGHRPTTE4 PNTTA GQ VPTTE VVGTTPGQA PT4 EPSGTTS VQ VPTTE VISTAPVQMPTA EST GMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIWLSGTTAAASTVTPTATATPSAIVTTYPP T AYYKPASQVTTTEWVETT4RELPIPEPEGPD4SSIMSTESITGSLGPLLDGT4 TLRL VKRQVPLD

CVL YR YGSFSVTLDIVOASTN GSIT VAATAPT VTPT VNATP SAAAS GIESAEIL O A VPSGE GDAFE L TVSCQGGLPKEA CMEISSPGCQPPA QRL CQPVLPSPA CQL VLHQILKGGSGTYCLNVSLAD TNSL A WSTQLIVPGILL TGQEA GL GQ AS T VTPT AT ATPS AIVTTITPT ATTKPASPL TFALQLHDPSGY LAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAL WTHTYLEPGPVTAQWLQAAIPL TSCGSSPVP AS (SEC ID

NO.: 119)

gp100: - Secuencia de ácido nucleico. Péptido 1 subrayado, péptido 2-cursiva, péptido 3-negrita, péptido 4-negrita-subrayado, péptido 5 negrita-cursiva.

GATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAAAAGTAC CCAGAAACCAGGACTGGCTTGGTGTCTCAAGGCAACTCAGAACCAAAGCCTGGAACAGGCA GCT GT ATCC AGAGT GGAC AGAAGCCCAGAGACTT GACT GCT GGAGAGGT GGT C AAGT GT CCC TCAAGGTCAGTAATGATGGGCCTACACTGATTGGTGCAAATGCCTCCTTCTCTATTGCCTTGA ACTTCCCTGGAAGCCAAAAGGTATTGCCAGATGGGCAGGTTATCTGGGTCAACAATACCATC ATCAATGGGAGCCAGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGGAAACTGACGATGCCT GC AT CTTCCCT GAT GGT GGACCTT GCCC AT CT GGCT CTT GGT CT C AGAAGAGAAGCTTT GTTT ATGTCTGGAAGACCTGGGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGGGGGCCCAGTGTCTGGGCTGAGC ATT GGGACAGGC AGGGC AAT GCT GGGCACACACACC AT GGAAGT GACT GT CT ACC AT CGCCG GGGATCCCAGAGCTATGTGCCTCTTGCTCATTCCAGCTCAGCCTTCACCATTACTGACCAGGT GCCTTTCTCCGTGAGCGTGTCCCAGTTGCGGGCCTTGGATGGAGGGAACAAGCACTTCCTGA GAAATCAGGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCC ACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGT GGCACCACAGATGGGCACAGGCCAACTGCA

GAGGCCCCTAA CA CCA CA GCTGGCCAA GTGCCTA CTA CA GAA GTTGTGGGTA CTA CA CCTGGTCA G GCGCCAA CTGCA GAGCCCTCTGGAA CCA CA TCTGTGCAGGTGCCAA CCA CTGAA GTCA TAA GCA CT GCA CCTGTGCA GA TGCCAA CTGCA GA GA GCA CA GGTA TGA CA CCTGA GAAGGTGCCA GTTTCA GA GGTCA TGGGTA CCA CA CTGGCA GA GA TGTCAA CTCCA GA GGCT A CAGGTA TGA CA CCTGCA GA GG TA TCAA TTGTGGTGCTTTCTGGAA CCA CA GCTGCAGCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCC ACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGTCAGGT AACAACTACAGAGTGGGTGGAGACCACAGCTAGAGAGCTACCTATCCCTGAGCCTGAA GGTCCAGATGCCAGCTCAATCATGTCTACGGAAAGTATTACAGGTTCCCTGGGCCCCCT GCTGGATGGTACAGCCACCTTAAGGCTGGTGAAGAGACAAGTCCCCCTGGATTGTGTT CTGTATCGATATGGTTCCTTTTCCGTCACCCTGGACATTGTCCAGGCTAGTACCAACGGC AGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGC CGCCGCTAGTGGTATTGAAAGTGCCGAGATCCTGCAGGCTGTGCCGTCCGGTGAGGGG GATGCATTTGAGCTGACTGTGTCCTGCCAAGGCGGGCTGCCCAAGGAAGCCTGCATGG AGATCTCATCGCCAGGGTGCCAGCCCCCTGCCCAGCGGCTGTGCCAGCCTGTGCTACC CAGCCCAGCCTGCCAGCTGGTTCTGCACCAGATACTGAAGGGTGGCTCGGGGACATAC T GCCTCAAT GT GTCTCTGGCTGATACCAAC AGCCTGGCAGT GGT CAGCACCCAGCTTAT CGT GCCTGGGATTCTTCTCAC AGGT CAAGAAGCAGGCCTTGGGCAGTAAGCTAGTACCG TGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACC ACCAAGCCCGCTAGT CCTCTGACCTTTGCCCTCCA GCTCCA TGA CCCTA GTGGCTA TCTGGCTG AA GCTGA CCTCTCCTA CA CCTGGGA CTTTGGA GA CA GTA GTGGAA CCC TGA TCTCTCGGGCA CY TGTGGTCA CTCA TA CTT A CCTGGA GCCTGGCCCA GTCA CTGCCCA GGTGGTCCTGCA GGCTGC CATTCCTCTCACCTCCTGTGGCTCCTCCCCAGTTCCAGCTAGC TGA (SEC ID NO.: 120)

GP 100-péptido 1 - Secuencia de ácido nucleico.

GATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACAAAAGTAC CC AGAAACCAGGACT GGCTT GGT GTCT C AAGGC AACT CAGAACC AAAGCCT GGAAC AGGC A GCT GT ATCC AGAGT GGAC AGAAGCCCAGAGACTT GACT GCT GGAGAGGT GGT C AAGT GTCCC TCAAGGTCAGTAATGATGGGCCTACACTGATTGGTGCAAATGCCTCCTTCTCTATTGCCTTGA ACTTCCCTGGAAGCCAAAAGGTATTGCCAGATGGGCAGGTTATCTGGGTCAACAATACCATC ATCAATGGGAGCCAGGTGTGGGGAGGACAGCCAGTGTATCCCCAGGAAACTGACGATGCCT GC AT CTTCCCT GAT GGT GGACCTT GCCC AT CT GGCT CTT GGT CT C AGAAGAGAAGCTTT GTTT ATGTCTGGAAGACCTGGGGCCAATACTGGCAAGTTCTAGGGGGCCCAGTGTCTGGGCTGAGC ATT GGGACAGGC AGGGC AAT GCT GGGCACACACACC AT GGAAGT GACT GT CT ACC AT CGCCG GGGATCCCAGAGCTATGTGCCTCTTGCTCATTCCAGCTCAGCCTTCACCATTACTGACCAGGT GCCTTTCTCCGTGAGCGTGTCCCAGTTGCGGGCCTTGGATGGAGGGAACAAGCACTTCCTGA GAAATCAG (SEC ID N 0.:121)

Secuencia de proteína:

DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLK VSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDG GPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSY YPLAHSSSAFTITDQVPFSVSYSQLRALDGGNKHFLRNQ (SEC ID NO.: 122)

GP 100 - péptido 3 GGCACCACAGATGGGCACAGGCCAACTGCAGAGGCCCCTAACACCACAGCTGGCCAAGTGC CTACTACAGAAGTTGTGGGTACTACACCTGGTCAGGCGCCAACTGCAGAGCCCTCTGGAACC ACATCTGT GCAGGT GCCAACCACT GAAGT CATAAGCACTGCACCTGTGCAGAT GCCAACT GC AGAGAGCACAGGTATGACACCTGAGAAGGTGCCAGTTTCAGAGGTCATGGGTACCACACTG GCAGAGATGTCAACTCCAGAGGCTACAGGTATGACACCTGCAGAGGTATCAATTGTGGTGCT TTCTGGAACCACAGCTGCA (SEC ID NO.: 123)

Secuencia de proteína:

GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEWGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAEST GMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIWLSGTTAA (SEC ID NO.: 124)

G100 - péptido 4:

CAGGTAACAACTACAGAGTGGGTGGAGACCACAGCTAGAGAGCTACCTATCCCTGAGCCTG AAGGTCCAGATGCCAGCTCAATCATGTCTACGGAAAGTATTACAGGTTCCCTGGGCCCCCTG CTGGATGGTACAGCCACCTTAAGGCTGGTGAAGAGACAAGTCCCCCTGGATTGTGTTCTGTA TCGATATGGTTCCTTTTCCGTCACCCTGGACATTGTCCAG (SEC ID NO.: 125)

Secuencia de proteína:

QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSF SVTLDIVQ (SEC IDNO.:126)

GP 100 - péptido 5

GGTATTGAAAGTGCCGAGATCCTGCAGGCTGTGCCGTCCGGTGAGGGGGATGCATTTGAGCT GACTGTGTCCTGCCAAGGCGGGCTGCCCAAGGAAGCCTGCATGGAGATCTCATCGCCAGGGT GCCAGCCCCCTGCCCAGCGGCTGTGCCAGCCTGTGCTACCCAGCCCAGCCTGCCAGCTGGTT CTGCACCAGATACTGAAGGGTGGCTCGGGGACATACTGCCTCAATGTGTCTCTGGCTGATAC C AAC AGCCT GGC AGT GGT C AGCACCC AGCTT ATCGT GCCT GGGATT CTTCT C AC AGGT C AAG AAGCAGGCCTTGGGCAG (SEC ID NO.: 127)

Secuencia de proteína:

GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQIL KGGSGTYCLNVSLADTNSLAWSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ (SEC ID NO.: 128)

GP 100 - péptido 2 CCTCTGACCTTTGCCCTCCAGCTCCATGACCCTAGTGGCTATCTGGCTGAAGCTGACCTCTCC TACACCTGGGACTTTGGAGACAGTAGTGGAACCCTGATCTCTCGGGCACYTGTGGTCACTCA TACTTACCTGGAGCCTGGCCCAGTCACTGCCCAGGTGGTCCTGCAGGCTGCCATTCCTCTCAC CTCCTGTGGCTCCTCCCCAGTTCCAGCTAGC (SEC ID NO.: 129)

Secuencia de proteína:

PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTW DFGDSSGTLISRAXW THTYLEPGPVTAQW LQAAIPLTSC GSSPVPAS (SEC ID NO.:130)

Antígeno ciclina B1. La ciclina B1, también conocida como CCNB1, es un gen humano que codifica una proteína reguladora implicada en la mitosis. La ciclina B1 forma complejos con p34(cdc2) para formar el factor de promotor de la maduración (MPF). Se conocen dos transcritos alternativos que son el resultado de sitios de iniciación de la transcripción alternativos. Un primer transcrito codifica un transcrito expresado constitutivamente. El segundo transcrito es un transcrito regulado por el ciclo celular expresado predominantemente durante la fase G2/M.

La figura 34A muestra que la ciclina B1 de longitud completa fusionada al extremo C de la cadena H del anticuerpo o a la cohesina no pueden ser secretadas a partir de células 293F de mamífero. La figura 34B muestra que la ciclina B1 de longitud completa fusionada al extremo C-terminal de la cadena H del anticuerpo o a la cohesina no pueden ser secretadas a partir de células 293F de mamífero.

Los datos son de ELISA anti-Fc humano y anticohesina en diluciones seriadas de sobrenadantes de transfección. Las proteínas rAb.ciclina B1 y Coh.ciclina B1 se expresan escasamente como productos secretados a partir de células de mamífero.

La siguiente secuencia de aminoácidos es la ciclina B1 humana. Dos regiones de péptidos que se sabe que contienen epítopos de células T se destacan en negrita-subrayado y en cursiva-subrayado.

MALRVTRN SKINAENKAKINM AGAKRVPTAP AAT SKPGLRPRT ALGDIGNKV SEQLQ AKMPMK KEAKP S AT GKVIDKKLP KPLEKVPML VP VP V SEP VPEPEPEPEPEP VKEEKLSPEPILVDTASP SPM ETSGCAPAEEDLCQAFSDVILAYNDVDAEDGADPNLCSEYVKDIYAYLRQLEEEQAVRPKYLLG REVT GNMRAILID WL V O V OMKFRLLOETMYMT V SIIDRFMONN C VPKKMLOLV GVT AMFIA

SKYEEM YW EIGDFAFVTDNTYTKH OIROM EM KILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEOH

7X A jnX M E7m Z)Y DMVHFPPSOIAAGAFCLALKILDNGEWTPTLOHYLSYTEESLLPVMOHLAK NWMVNQGLTKHMTVKNKYATSKHAKISTLPQLNSALVQDLAKAVAKVHHHHHH (SEC ID NO.:131)

Péptido-1 MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY (SEC ID N°.:132) Péptido-2 DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK (SEC ID N°.: 133)

La figura 35 muestra un resumen de los niveles de expresión relativos de las vacunas de ciclina B1 prototipo secretadas de células 293F de mamífero transfectadas. Las secuencias conectoras flexibles facilitan la secreción.

C1189 rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1 (negrita)-hCiclinaB1-Péptido-2 (cursiva)-Péptido-1 (negrita-cursiva)-f4 [conectores AS-subrayado]

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTV KGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSV FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRYESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTP TNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASG WL VQ VQMKFRLLQETMYMTVSUDRFMQNNCVPKKASME MKfLRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDYASTNDSlTy AAT APT\TP

TVNATPSAAAS (SEC ID NO.: 134)

Más arriba se encuentra la secuencia de la cadena H secretada madura para una forma de vacuna anti-CD4012E12-ciclina B1. Los residuos AS son de los sitios de restricción de la unión. La secuencia codificante de ADN se muestra a continuación, y ésta incluye el péptido señal.

AT GAACTT GGGGCT C AGCTT GATTTTCCTT GTCCTT GTTTT AAAAGGT GTCCAGT GT GAAGT G AAGCT GGT GGAGT CT GGGGGAGGCTTAGT GC AGCCCGGAGGGT CC CT GAAACT CTCCTGT GC AACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAG GCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAA AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGG CTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTAT GGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCG TCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCA CCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAG GTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC AGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGG T GGCAGGAGGGGAAT GT CTTCT C AT GCT CCGT GAT GC AT GAGGCT CT GC AC AACC ACTAC AC ACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCG TGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGT GACT GGCTAGTACAGGTT C AAAT GAAATT C AGGTT GTT GC AGGAGACCAT GT AC AT GACT GT CTCCATTATTGATCGGTTCATGCAGAATAATTGTGTGCCCAAGAAGGCTAGTATGGAAATGA AGATTCTAAGAGCTTTAAACTTTGGTCTGGGTCGGCCTCTACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAG CATCTAAGATTGGAGAGGTTGATGTCGAGCAACATACTTTGGCCAAATACCTGATGGAACTA ACTATGTTGGACTATGCTAGTACCAACGACAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGT GACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGCTGA (SEC IDNO.:135)

C1143 rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1 (negrita) -hCidinaB1-Péptido-2 (cursiva) -f3 (negrita)] [conectores AS-subrayados].

EYKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTY KGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYY CARRGLPFHAMDY W GQGT SVT V S SAKTKGP S V FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVW DVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE

n n y k t t p p v l d s d g s f f l y s r l t v d k s r w q e g n v f s c s v m h e a l h n h y t q k s l s l s l g k a s q t p TNTISYTPTNNSTPTNNSNPKPNPASD WL VQ VQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKKASTV TPTATATPSAIVTTITPTATTKPAS (SEC ID NO : 136)

AT GAACTT GGGGCT C AGCTT GATTTTCCTT GTCCTT GTTTTAAAAGGT GTCCAGT GT GAAGT G AAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGC AACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAG GCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAA AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGG CTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTAT GGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCG TCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCA CCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAG GTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC AGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGG T GGCAGGAGGGGAAT GT CTTCT C AT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CT GCACAACC ACTAC AC ACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCG TGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGT GACT GGCTAGTACAGGTT C AAAT GAAATT C AGGTT GTT GC AGGAGACCAT GTAC AT GACT GT CTCCATTATTGATCGGTTCATGCAGAATAATTGTGTGCCCAAGAAGGCTAGTACCGTGACCCC CACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGC CCGCTAGCTGA (SEC ID NO.: 137)

C911 rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1 (negrita) -hCidinaB1-Péptido-1 (cursiva)-f4 (negrita)] EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYYPDTV KGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSV FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSS SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVYVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK V SNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKN QY SLT CLVKGF YP SDIA VE WE SN GQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTYDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQTP TNTISVTYTN'NSTYTN'NSNYKP'NPASMEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKY ¿/l/FFTA/LDFASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS (SEC ID NO.: 138)

C911 rAB-cetHS-puro[manti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1 (negrita)-hCiclinaB1-Péptido-1 (cursiva)-f4 (negrita)] secuencia de ácido nucleico.

AT GAACTT GGGGCT C AGCTT GATTTT CCTTGTCCTT GTTTTAAAAGGT GT CC AGT GT GAAGT G AAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGC AACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAG GCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAA AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGG CTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTAT GGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCG TCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCA CCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAG GTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC AGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGG T GGCAGGAGGGGAAT GT CTTCT C AT GCT CCGT GAT GC AT GAGGCT CT GC AC AACC ACTAC AC ACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGTCAGACCCCCACCAACACCATCAGCG TGACCCCCACCAACAACAGCACCCCCACCAACAACAGCAACCCCAAGCCCAACCCCGCTAGT AT GGAAAT GAAGATT CTAAGAGCTTTAAACTTT GGT CT GGGTCGGCCT CTACCTTT GC ACTT C CTTCGGAGAGCATCTAAGATTGGAGAGGTTGATGTCGAGCAACATACTTTGGCCAAATACCT GATGGAACTAACTATGTTGGACTATGCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCG CCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGCTGA (SEC ID NO.:139)

Antígeno ciclina de tipo D. Las ciclinas de tipo D se expresan predominantemente en la fase G1 del ciclo celular. El patrón de expresión de la ciclina D1 se ha estudiado extensamente en ciertos tipos de cáncer incluyendo el linfoma y el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Aproximadamente 30 por ciento de los carcinomas de mama son positivos para ciclina D1. La expresión en exceso de la ciclina D1 es ahora un criterio bien establecido para el diagnóstico del linfoma de células del manto, un linfoma maligno, no Hodgkin, que se caracteriza por una única translocación cromosómica t(11; 14).

Ciclina D1 - péptido 1-negrita, péptido 2-negrita-subrayado, péptido-3 cursiva, péptido 4-subrayado.

MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCVOKEVLPSMRKIVA TWMLEVCEEOKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTA E K L C lY T D m iR P E E L L O M E L L LVNKLKlVNLAAMTPHDFÍEHFLSKMPEAFFNKOffRKHAOTFVAL

CA TD VK FÍSNPPSM LA A G S V V A A V O G LN LR S P N N F LS Y Y R LT R F LS R VIK. C D P D C LR A C O E OIE A L LESSLROAOONMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEC ID NO.: 140)

Pep-1

MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV (SEC ID N°.: 141)

Pep-2

QKE VLP SMRKIVAT WMLEV CEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFL SLEP VKKSRLQLLGAT CMF V

ASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL (SEC ID NO.: 142)

Pep-3

LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV (SEC ID N°.:143) Pep-4 AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNM DP

KAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEC ID NO.: 144)

Secuencia Flex-4

TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEC ID N°: 14)

Secuencia Flex-3

TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEC ID N°.: 13)

Flex-var1

QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP (SEC ID N°: 145)

La figura 35 muestra la estrategia de segmentación de Ciclina B1 basada en regiones de dominios estructurales conocidas o pronosticadas.

La figura 36 muestra que los segmentos de la ciclina D1 p1, p3 y p4, pero no p2, se expresan bien como fusiones directas al extremo C de la cadena H. Éstas son transfecciones transitorias de los vectores de la cadena H cotransfectados con el vector de expresión de la cadena L en células 293F y los sobrenadantes se recogen después de 48-72 horas de expresión. Los segmentos de ciclina D1 p3 p4 unidos entre sí al extremo C de la cadena H también se expresan bien, pero otras diversas combinaciones, con y sin segmentos flexibles intercalados no se expresan o se expresan muy mal.

La figura 37 muestra los niveles de expresión relativos de diversos segmentos de ciclina D1 como fusiones directas al extremo C de la cadena H en diversas combinaciones con secuencias conectoras flexibles. Éstas son transfecciones transitorias de los vectores de la cadena H cotransfectados con el vector de expresión de la cadena L en células 293F y los sobrenadantes se recogen después de 48-72 horas de expresión. Los segmentos de Ciclina D1 p2 p3 p4 f4 unidos entre sí al extremo C de la cadena H también se expresan suficientemente para la producción de la vacuna.

Más abajo se muestran las secuencias de proteínas de fusión de la cadena H anti-DCIR 9E8-ciclina D1.

1082 es rAB-pIRES2[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1(negrita)-hCiclinaD1-Pep-1 (cursiva)-f4 (negrita)- ]

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK

SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFD VW GAGTTVTV S S AKTKG

PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TV

PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE

VTCW VDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYK

CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVF SC S VMHEALHNH YT QKSL SLSLGKASQ

TPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS/V//://(_Y¿CC/: KFT//?/?.-! YPDANLLNDRVLRAMLKAEETCA

ES'FSTFACFASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS (SEC ID NO.:146)

C1086 es rAB-pIRES2[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1 (negrita) -hCiclinaD1-Pep-2-(negrita)-Pep-3 (negrita-subrayado)-Pep-4 (cursiva)-f4) (negrita)]

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLK SRLTISKDTS SN QVFLKITIVDTADAATYY CARS SHYY GY GY GGYFD VW GAGTTVTV S S AKTKG PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASQ TPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPASQKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAM NYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELLL VNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKOIIRKHAOTFVALCATDVKFISNPPSMVA4 GSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEE EEEEEEVDLACTPTDVRDFD/ASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS (SEC ID NO.: 147)

La figura 38 muestra un resumen de varios constructos de segmentos de cadena H-ciclina D1 y su relativa capacidad de expresión como vacunas.

La figura 39 anterior muestra que la ciclina D1 de longitud completa fusionada al extremo C de una cadena H del anticuerpo de direccionamiento a DC es expresada muy escasamente como un anticuerpo recombinante secretado.

anti-CD40_12E12.3F3

anti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C - la región subrayada muestra la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena pesada:

MNLGLSLIFLYLYLKGVOCEYKLVESGGGLYOPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWYROTPEKRL EWVAYINSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLOMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDY WGOGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSV FLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCW VDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW S VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGKAS (SEC ID NO.: 148)

anti-CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C - la región subrayada muestra la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena ligera MMSSAOFLGLLLLCFOGTRCDIOMTOTTSSLSASLGDRVTISCSASOGISNYLNWYOOKPDGTVK LLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCOOFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAP

SVFIFPP SDEQLKSGTASW CLLNNFYPREAKV QWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTY SLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC-(SEC ID NO.: 149)

anti-CD40 12B4.2C10

anti-CD40_12B4.2C10 cadena pesada:

MEWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVLHWVKQKPGQG LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGYPAYSGY AMDYWGOGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAOTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSG VHTFPAVLQKGEFV (SEC ID No.: 150)

anti-CD40_12B4.2C10 cadena ligera:

MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVK LLIYYTSRLHSGVPSRF SGSGSGTDY SLTISNLEQEDIATYF CHHGNTLP WTF GGGTKLEIKRADA APTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMS STLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID No.: 151)

anti-CD40_12B4.2C10 cadena ligera - clon alternativo (17K6)

MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYRYQQKPGSSPKP WIYGTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPLTFGAGTKLELKRADA APTV SIFPP S SEQLT SGGAS W CFLNNF YPKDINVKWKIDGSERQN GVLN S WTDQDSKDSTY SMS STLTLTKDE YERHN S YT CEATHKT ST SPIVKSFNRNEC (SEC ID No.: 152)

anti-CD40_11B6.1C3

anti-CD40_11B6.1 C3 cadena pesada:

MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHVKSL EWIGRINPYNGATSYNQNFKDKASLTVDKSSSTAYMELHSLTSEDSAVYYCAREDYVYWGQGT TLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQK GEFV (SEC ID No.: 153)

anti-CD40_11B6.1C3 cadena ligera:

MKLPVRLLVLMFWIPASSSDWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPG QSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFALKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDST YSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEC ID No.: 154)

[anti-CD40_12E12.3F3_K-V-hlgGK-C] - la región subrayada muestra la secuencia de la región V de la cadena ligera

AT GAT GTCCT CT GCT C AGTT CCTT GGT CTCCTGTTGCTCT GTTTT C AAGGTACC AGAT GT GATA TCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTT GCAGTGCAAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACT GTT AAACTCCT GAT CT ATTAC AC AT C AATTTT AC ACT C AGGAGTCCC AT CAAGGTT CAGT GGC AGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACCATCGGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCAC TT ACT ATT GT C AGC AGTTT AAT AAGCTT CCT C CGACGTTCGGT GGAGGC ACC AAACT CGAGAT CAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATC TGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAA CACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTT CAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEC ID NO.: 155)

[anti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C] - la región subrayada muestra la secuencia de la región V de la cadena pesada:

A T GAACTT GGGGCT C AGCTT GATTTTCCTT GTCCTT GTTTTAAAAGGT GTCCAGT GT GAAGT G AAGCT GGT GGAGT CT GGGGGAGGCTTAGT GC AGCCT GGAGGGTCCCT GAAACT CTCCTGT GC AACCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAG GCTGGAGTGGGTCGCATACATTAATTCTGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGTAA AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGG CTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACGGGGGTTACCGTTCCATGCTAT GGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCG TCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCA CCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAG GTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC AGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGG T GGCAGGAGGGGAAT GTCTTCT C AT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CT GC AC AACC ACTAC AC ACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA (SEC ID NO.: 156)

anti-CD40_12B4.2C10_H-V-hIgG4H-C cadena pesada

A T GGAAT GGAGTT GGATATTT CT CTTT CTTCT GT C AGGAACT GC AGGT GTCC ACT CT GAGGT C C AGCT GC AGCAGT CT GGACCT GAGCT GGT AAAGCCT GGGGCTT C AGT GAAGAT GTCCT GC AA GGCTT CT GGATACAC ATT C ACT GACTAT GTTTT GCACT GGGT GAAAC AGAAGCCT GGGC AGG GCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTC AAAGGC AAGGCC AC ACT GACTT C AGAC AAATCCTCCAGC AC AGCCT AC AT GGAGCT C AGC A GCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGGGCTATCCGGCCTACTCTGGGT ATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGC CCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGG CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTG CCCAGCACCTGAGTTCGAAGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACA CTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGAC CCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG ACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAC CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGA GC AGGT GGC AGGAGGGGAAT GT CTTCT C AT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CT GC AC AACC AC TACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAGCTAGCTGA (SEC ID NO.: 157)

anti-CD40_12B4.2C10_K-V-hIgGK-C (variante 1) cadena ligera ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGG GGACAAATT GTTCT C ACCC AGT CT CC AGCAATCCT GTCT GC AT CTCC AGGGGAGAAGGT C AC CATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACAGGTACCAGCAGAAGCCAGGAT CCTCACCCAAACCCTGGATTTATGGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCA GT GGC AGT GGAT CT GGGACCT CTTATT CTCT C AC AAT C AGC AGCAT GGAGGCT GAAGAT GCT GCCACTTATTACTGCCAGCAATATCATAGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTC

GAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGT ACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG AGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEC ID NO.: 158)

anti-CD40_12B4.2C10_K-V-hIgGK-C (variante 2) cadena ligera

ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATA TCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTT GC AGGGC AAGT C AGGAC ATTAGC AATTATTTAAACT GGT AT C AGC AGAAAC C AGAT GGAACT GTT AAACTCCT GAT CT ACT AC AC AT C AAGATTACACT CAGGAGT CC C AT C AAGGTT C AGT GG CAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCA CTTACTTTTGCCATCATGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTCGAGA T C AAACGAACT GT GGCT GC ACCAT CTGTCTT CAT CTTCCCGCC AT CT GAT GAGCAGTT GAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAA CACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTT CAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEC ID NO.: 159)

cadena pesada anti-CD40_11B6.1C3_H-V-hIgG4H-C

AT GGGAT GGAGCT GGAT CTTTCT CTTT CTCCT GT CAGGAACT GCAGGT GT CCTCTCT GAGGT C C AGCT GC AACAGT CT GGACCT GAGCT GGT GAAGCCT GGGGCTT C AGT GAAGATATCCT GC AA GGCTT CT GGTT ACT C ATT C ACT GGCT ACTAC AT GCACT GGGT GAAGC AAAGCCAT GTAAAGA GCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGCTACTAGCTACAACCAGAATTTCA AGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCACAGC CT GAC AT CT GAGGACT CT GC AGT CT ATTACT GT GC AAGAGAGGACTACGT CTACT GGGGCC A AGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGC CCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAAGG GGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCC T GAGGT CACGT GCGT GGT GGT GGACGT GAGC C AGGAAGACCCCGAGGT CC AGTT CAACT GGT ACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAG CACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCA AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCG ACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAAT GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCC CT GT CT CT GGGTAAAGCTAGCT GA (SEC ID NO.: 160)

anti-CD40_11B6.1C3_K-V-hIgGK-C cadena ligera

AT GAAGTT GCCT GTT AGGCT GTT GGT GCT GAT GTT CT GGATTCCT GCTTCC AGC AGT GAT GTT

GTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGC AGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAA GCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGA C AGGTT C AGT GGCAGT GGAT C AGGGACAGATTTCGCACT CAAGAT C AGTAGAGT GGAGGCT G AGGAT CT GGGAGTTT ATTT CT GCT CT CAAAGTACACAT GTT C CGT GGACGTTCGGT GGAGGC A CCAAGCTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATG AGC AGTT GAAAT CT GGAACT GCCT CT GTT GT GT GCCT GCT GAAT AACTT CTAT CCC AGAGAGG CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCAC AGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCA GACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGT CACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEC ID NO:161)

Se contempla que cualquier realización discutida en esta memoria descriptiva se puede implementar con respecto a cualquier método, kit, reactivo o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones de la invención se pueden utilizar para lograr los métodos de la invención.

Se comprenderá que realizaciones particulares descritas en la presente memoria se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención.

El uso de la palabra "un", "una" o "uno" cuando se utiliza junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es compatible con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que sólo se refiere a alternativas o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción apoya una definición que se refiere sólo a alternativas e "y/o". A lo largo de esta solicitud, el término" aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente del error para el dispositivo, el método que se está empleando para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos del estudio.

Según se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, tal como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contienen") no excluyen elementos adicionales, elementos enumerados o etapas de métodos.

El término "o combinaciones de los mismos" según se utiliza en la presente memoria se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los artículos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, se pretende que "A, B, C o combinaciones de los mismos" incluya por lo menos uno de: A, B, C, AB, a C, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente las combinaciones que contienen repeticiones de uno o más artículos o términos, tales como b B, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBbAa A, CABABB, etcétera. El experto en la materia entenderá que normalmente no hay límite en el número de artículos o términos en ninguna combinación, a menos que resulte evidente a partir del contexto.

Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados en la presente memoria se pueden fabricar y ejecutar sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo anti-CD40 que comprende

a. por lo menos un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^l) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1^l, CDR2^ly CDR3^l, presentando la CDR1^lla secuencia de aminoácidos SASQGISNYLN, presentando la CDR2^lla secuencia de aminoácidos YTSILHS y presentando la CDR3^lla secuencia de aminoácidos QQFNKLPPT; y

b. por lo menos un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (V^h) que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1^h, CDR2^hy CDR3^h, presentando la CDR1^hla secuencia de aminoácidos GFTFSDYYMY, presentando la CDR2^hla secuencia de aminoácidos YINSGGGSTYYPDTVKG, y presentando la c DR3^hla secuencia de aminoácidos RGLPFHAMDY.

2. Anticuerpo anti-CD40 según la reivindicación 1 que está humanizado y comprende una región variable de cadena pesada (V^h) y una región variable de cadena ligera (V^l) en el que las regiones marco de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera son de un anticuerpo humano de donante, en el que la cadena ligera comprende una CDR1^lque presenta la secuencia de aminoácidos SASQGISNYLN, una CDR2^lque presenta la secuencia de aminoácidos YTSILHS y una CDR3^lque presenta la secuencia de aminoácidos QQFNKLPPT; y en el que la cadena pesada comprende una CDR1^hque presenta la secuencia de aminoácidos GFTFSDYYMY, una c Dr 2^hque presenta la secuencia de aminoácidos YINSGGGSTYYPDTVKG, y una CDR3^hque presenta la secuencia de aminoácidos RGLPFHAMDY.

3. Anticuerpo humanizado según la reivindicación 2, que comprende un marco de VL que presenta una identidad de por lo menos 95% respecto al marco de SEC ID n°: 38 y un marco de VH que presenta una identidad de por lo menos 95% respecto al marco de SEC ID n°: 39.

4. Anticuerpo humanizado según la reivindicación 2 o 3, que presenta unas secuencias donantes de anti-CD40_12E12.3F3, en el que el anticuerpo anti-CD40_12E12.3F3 presenta unas cadenas ligera y pesada de SEC ID n°: 148 y SEC ID n°: 149.

5. Inmunoconjugado que comprende un anticuerpo humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 ligado a uno o más moléculas efectoras, antígeno(s) y/o marcador(es) detectable(s).

6. Secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de unión anti-CD40 o el anticuerpo humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores o vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico.

7. Línea celular de hibridoma depositada con el n° de acceso de ATCC PTA-9854.