KR20090114430A - 항원-제시 세포 상에서 발현된 ｄｃｉｒ에 대한 항원 표적화에 기초한 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편 (이때 상기 항원은 상기 항체-항원 복합체와 접촉한 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시된다)을 사용하여, 항원 제시의 효과를 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
항체, 항원, DCIR, 표적화, 백신, 항원 제시 세포, 수지상 세포

Description

항원-제시 세포 상에서 발현된 ＤＣＩＲ에 대한 항원 표적화에 기초한 백신{Vaccines based on targeting antigen to DCIR expressed on antigen-presenting cells}
본 발명은 백신 접종 분야, 보다 상세히 항원-제시 세포 상에서 발현된 DCIR에 대한 항원 표적화에 기초한 백신에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 2007년 2월 2일 출원된 미국 임시 출원 제60/888,032호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 임시 출원은 본원에 참조로 그 전문이 인용된다.
연방정부의 자금에 의한 연구에 대한 진술
본 발명은 NIH에 의해 재정된 약정 제1U19AI057234-0100003호 하에 미국 정부 지원으로 완성되었다. 미국 정부는 본 발명 중에 일정 권리를 가진다.
본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 이의 배경기술은 항원 제시와 관련하 여 기술된다.
수지상 세포 (DC)-표적화에 기초한 사람 백신은 마우스 모델에서의 압도적인 연구에 의존하는 새로운 개념이다. 본 개념에 의하면, 특정 DC 수용체로 유도되는 항체에 의해 DC로 운반된, 소량의 비교적 약한 항원이 강력하고 광범위한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 사람을 위한 그러한 백신을 개발하기 위하여는, 정확하게 어떠한 DC 수용체가 이러한 항원-표적화 적용에 사용되어야 하는지에 대하여 보다 많은 이해를 필요로 한다. 이는, 마우스와 사람의 면역 체계가 항상 정확하게 일치하는 것이 아니며, 또한 모든 잠재적인 DC 수용체가 이러한 백신 적용을 위하여 면밀하게 조사된 것도 아니기 때문이다.
따라서, 시험관내 시험에서 다양한 항-사람 DC 수용체를 표적화하는 연구가 개시되었으며, 예를 들어 DC는 HLA 제I형 및 제II형 분자와 관련하여, 만노즈-수용체 활성화된 T 세포에 대한 사람 mAb에 융합된 흑색종 항원 pmel17과 표적화되었다 (참조 문헌: Ramakrishna, Treml et al. 2004). 또한, 사람화된 항-DC-SIGN mAb를 통한 DC에 대한 모델 항원 KLH의 표적화는 항원-특이적 초기 (naive) 및 용량-절감 (dose-sparing) 회상 T 세포 (recall T cell) 반응들을 효과적으로 유도하였다 (참조 문헌: Tacken, de Vries et al. 2005). 만노즈 수용체 및 DC-SIGN 이외에, 사람 DC는 항원 포획에 관여하는 것으로 알려진 다른 수용체를 발현한다. 이들 중 대부분은 C-형 렉틴(lectin) 수용체 (CLR), 예를 들어 LOX-1, DEC205, DC-ASGPR, Langerin, DCIR, BDCA-2, DECTIN-1, 및 CLEC-6이다. 이들 CLR은 DC의 별개의 서브세트(subset)에 의해 상이하게 발현되고, 이들의 발현은 DC의 성숙 상태에 따라 달 라질 수 있다 (참조 문헌: Figdor, van Kooyk et al. 2002; Geijtenbeek, van Vliet et al. 2004).
DC 서브세트는 별개의 면역 반응을 자극하므로, 차별적으로 발현된 수용체를 통한 이들 서브세트에 대한 항원 표적화는 상이한 면역 반응을 일으켜야 한다 (참조 문헌: Shortman and Liu 2002). 게다가, 동일한 DC 서브세트의 상이한 수용체가 항원을 별개의 프로세싱 경로로 유도할 수 있다 (참조 문헌: Trombetta and Mellman 2005). 마지막으로, 이들 수용체들의 일부는 본질적으로 활성화되지 않으며 (예: DEC205) (참조 문헌: Bonifaz, Bonnyay et al. 2004), 다른 일부는 활성화될 수 있거나 (예: LOX-1) (참조 문헌: Delneste, Magistrelli et al. 2002) 완전히 연구되지 않았다. 항원 섭취를 동반하는 DC-활성화의 중요성은 공지되지 않았다. 그러나, 이것이 이롭다면, mAb 표적화를 통한 DC-활성화는 백신 표적화의 공식화를 간단하게 할 것이다.
발명의 개요
이들 고려할 상황하에서, 본원의 발명자들은, CD4+ 및 CD8+ T 세포 초기(naive) 및 회상 (recall) 반응을 시험관내에서 상세히 연구함으로써, 목적하는 면역 결과를 위해 가장 적당한 사람 DC-표적화 수용체를 규정하기 위하여 체계적인 비교가 시급히 필요하다는 것을 인정하였다. 본 출원은 특정 DC 수용체, 즉 수지상 세포 억제 수용체 (DCIR)의 특별하고 예기치 못한 특징을 기재하고 있으며, DCIR이 예방 및 치료적 백신접종을 위해 사람 DC에 대해 항원을 표적화하는 목적에 이상적인 수용체임을 보여준다.
본 발명은, 항원에 대해 강력하고 광범위한 면역 반응을 일으킬 목적으로, 항원을 항원-제시 세포로 특이적으로 표적화 (전달)하는 백신을 제조하고 사용하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 상기 목적은 일차적으로, 항원이 유래되는 제제 (병원체 또는 암)에 대한 예방적 또는 치료적 면역 반응을 일으키는 것이다.
보다 상세히, 본 발명은 제어된 모듈식 구조체, 활성화 단백질 또는 다른 항체 중에 하나 이상의 항원을 운반하는 단일 재조합 항체 (mAb)에 특이적인 표적을 고안하고 제조하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 본 발명의 모듈식 rAb 운반체는, 예를 들어 (사람 수지상 세포 내화 (internalizing) 수용체에 대한 하나의 1차 재조합 항체를 통해) 다중 항원 및/또는 항원과 활성화 사이토카인을 수지상 세포 (DC)로 표적화하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 2개의 상이한 재조합 mAb를 제어되고 규정된 방식으로 말단-대-말단으로 연결하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 표적화된 제제가 부착되어 항원-제제 복합체를 형성하는 DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편 (여기서, 상기 제제는 예를 들어, 상기 항체-제제 복합체와 접촉되어진 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시된다)을 분리하고 정제함으로써, 항원 제시의 효과를 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 일 양태로, 항원 제시 세포는 수지상 세포이고, DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편은 Coherin/Dockerin 쌍의 절반에 결합된다. DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 Coherin/Dockerin 쌍의 절반에 결합될 수 있고, 항원은 Coherin/Dockerin 쌍의 상보적 절반에 결합에 결합하여 복합체를 형성한다. 상기 제제의 비-제한적인 예 로는 하나 이상의 펩타이드, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 이의 조합물이 포함된다.
상기 제제는 인터루킨, 전환 성장 인자 (TGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 상피 성장 인자 (EGF), 결합 조직 활성화 펩타이드 (CTAP), 골원성 인자 및 이러한 성장 인자의 생물학적 활성 유사체, 단편 및 유도체, B/T-세포 분화 인자, B/T-세포 성장 인자, 분열유발성 사이토카인, 화학주성 사이토카인, 콜로니 자극 인자, 혈관형성 인자, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 등, 렙틴, 미오스타틴, 대식세포 자극 단백질, 혈소판-유래된 성장 인자, TNF-α, TNF-β, NGF, CD40L, CD137L/4-1BBL, 사람 림프독소-β, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-1α, IL1-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, 에리트로포이에틴, 엔도스타틴 (endostatin), 안지오스타틴 (angiostatin), VEGF, 전환 성장 인자 (TGF) 슈퍼유전자 계열 (베타 전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3)을 포함); 골 형태형성 단백질 (예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); 헤파린-결합 성장 인자 (섬유모세포 성장 인자 (FGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF)); 인히빈 (Inhibin) (예를 들어, 인히빈 A, 인히빈 B); 성장 분화 인자 (예를 들어, GDF-1); 및 액티빈 (Activin) (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB)로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인일 수 있다. 또 다른 양태로, 상기 제제는 세균, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 암 단백질인 항원을 포함한다.
본 발명은 또한, 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편 (여기서, 상기 항원은 당해 항체-항원 복합체와 접촉되어진 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시된다)을 결합시킴을 포함하여, 수지상 세포에 의한 항원 제시의 효과를 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 또 다른 양태는, 예방적 또는 치료적 면역 반응을 일으킬 목적으로, 항원을 항원-제시 세포로 전달하기 위한, DCIR로 유도된 항체 또는 다른 특이적 결합 분자의 용도이다. 또 다른 양태는, 피부를 통한 백신접종을 위한, DCIR에 특이적인 항원-표적화 시약의 용도이거나, 백신접종을 위한, 공동-투여되거나 결합된 애주번트와 함께, DCIR에 특이적인 항원-표적화 시약의 용도, 또는 재조합 항원-항체 융합 단백질로서 발현될 수 있는 특이적 항원의 항원-표적화 (백신접종) 목적을 위한 용도이다.
또 다른 양태는, 환자의 수지상 세포를 분리하고; 당해 수지상 세포를 활성화량의 항-DCIR 항체 또는 이의 단편 및 항원에 노출시켜 항원-적재된 활성화된 수지상 세포를 형성하고; 당해 항원-적재된 활성화된 수지상 세포를 환자에게 재도입함으로써, 수지상 세포의 효과를 증가시키는 방법을 포함한다. 상기 항원은 세균, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 암 단백질일 수 있다. 본 발명은 또한, 포유동물 세포로부터 분비된 항-DCIR 면역글로불린 또는 이의 일부 및 상기 면역글로불린에 결합된 항원을 포함한다. 면역글로불린은 cohesin/dockerin 도메인의 절반에 결합되거나, 또는 모듈식 rAb 운반체와 복합체를 형성하는 항원에 결합된 cohesin/dockerin 결합 쌍의 상보적 절반을 포함하거나, 항원과의 융합 단백질인 cohesin/dockerin 결합 쌍의 상보적 절반을 포함할 수 있다. 상기 항원 특이적 도 메인은 전체 길이의 항체, 항체의 가변성 영역 도메인, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편, Fv 단편, 및 Fabc 단편 및/또는 Fc 도메인 일부를 포함하는 Fab 단편일 수 있다. 항-DCIR 면역글로불린은, 방사성 동위원소, 금속, 효소, 보툴린, 파상풍, 리신 (ricin), 콜레라, 디프테리아, 아플라톡신, 퍼프린겐 (perfringen) 독소, 미코톡신 (mycotoxin), 시가 독소 (shigatoxin), 포도구균 장독소 (staphylococcal enterotoxin) B, T2, 세귀톡신 (seguitoxin), 색시톡신 (saxitoxin), 아브린 (abrin), 시아노기노신 (cyanoginosin), 알파톡신 (alphatoxin), 테트로도톡신 (tetrodotoxin), 아코노톡신 (aconotoxin), 뱀 독 및 거미 독으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 독소에 결합될 수 있다. 상기 항원은 면역글로불린과의 융합 단백질이거나, 또는 화학적으로 공유결합되거나 되지 않을 수 있다.
또 다른 양태는 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편 (여기서, 항원은 상기 항체-항원 복합체와 접촉되어진 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시된다)을 함유하는 백신이다.
본 발명의 신규 항체는 새로운 조직 분포 정보를 알려줄 수 있다. 이들의 특이적 친화성에 기인하여, 본 발명의 항-DCIR 항체가 원숭이 DCIR에 결합하며, Flu m1-특이적 CD8 세포를 생체내 (in vivo) [hu-mouse]에서 증대시키기 위한 항-DCIR-Flu m1 표적화, 및 생체외 (ex vivo) 사람 피부 세포의 시험관내 표적화를 사용하는데 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 게다가, DCIR에 대한 탄수화물 리간드의 복합체가 항원 전달을 위한 항-DCIR 제제의 대용물로서 사용될 수있다는 것이 밝혀 졌다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, DCIR에 특이적으로 결합하는 Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3(Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-Sp12를 포함하는 글리칸의 적어도 일부에 결합하는 항원성 T 세포 에피토프 펩타이드를 포함하는 T 세포 항원이다. 글리칸 (및 이의 유도체)는 DCIR 결합을 차단하기 위하여 단독으로 또는 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점의 보다 완전한 이해를 위하여, 이하에서는, 발명의 상세한 설명과 함께, 첨부된 도면을 참조한다.
도 1A 내지 1F는, 전부는 아니지만 다수의 하이브리도마 상청액이, 대조군에 비해, MCP-1의 특이적 생성을 유도하였음을 보여준다. 즉, mAb 4C7, 9E8, 19E3, 1G3, 10A5, 29G10, 3C2, 3G2, 24A5, 30F3, 12E2, 5F9, 2F11, 24E7,31A6, 6A11,2 9E9, 2H8, 30D9, 6C8, 35F1, 3F12를 추가의 특성규명을 위하여 선택하였다.
도 2는 플레이트에 결합된 DCIR과 mAb의 고 친화성 상호작용을 ELISA에 의해 보여준다.
도 3은 FACS에서 사용하기 위한 고 친화성 항체의 결합을 보여준다.
도 4는 DCIR이 사람 피부로부터 직접 분리된 3개의 사람 DC 아유형에서 발현된다는 것을 보여준다.
도 5는 사람 편도선 내의 배중심을 둘러싼 세포 집단의 DCIR-특이적 염색을 보여준다.
도 6은 DCIR에 대한 가교결합된-Flu M1 단백질 및 mAb의 예를 보여준다.
도 7은 항-DCIR_2C9 mAb에 대한 Coh.Flu M1의 가교결합을 보여준다.
도 8은 항-DCIR mAb에 가교결합된 Flu M1이, mAb에 결합되지 않은 Flu M1 단백질 보다 더 효율적으로 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포의 증대를 유도한다는 것을 보여준다.
도 9는 항-DCIR mAb에 가교결합된 Flu M1이, Int-DC 보다 더 효율적으로 LC를 통하여 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포의 증대를 유도한다는 것을 보여준다.
도 10은 293 세포에 공동-형질감염되고 배양 상청액으로의 rAb의 분비에 대해 항-사람 FC ELISA에 의해 분석된, 수많은 상이한 항-DCIR mAb에 상응하는 키메라 마우스-사람 rAb를 암호화하는 H+L 쇄 벡터를 보여준다.
도 11은 항-DCIR.Doc rAb에 결합된 Coh.Flu M1이 GM/IL-15 사람 DC에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다.
도 12는 항-DC-SIGN/L.Doc 또는 항-DCIR.Doc rAb에 결합된 Coh.Flu M1이 GM-CSF/IL-4 사람 DC에 결합하여 이 속에 내화된다는 것을 보여준다.
도 13은 항-DCIR.Doc:Coh.Flu 복합체가 다른 [항-DC 수용체 rAbs.Doc:Coh.Flu M1] 복합체 보다 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포를 증대시키는데 더 효율적이라는 것을 보여준다.
도 14는 1일 동안 투여된 항-DCIR.Doc:Coh.Flu 복합체가 다른 [항-DC 수용체 rAbs.Doc:Coh.Flu M1] 복합체 보다 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포를 증대시키는데 더 효율적이라는 것을 보여준다.
도 15는 rAb H 쇄의 C-말단에 융합체로서 발현된 다양한 항원은 rAb.항원의 분비에 대해 고유의 효과를 가짐을 보여준다.
도 16은 항-DCIR.Flu HA5 rAb가 가변 영역의 특성에 따라 다양한 효율로 분비된다는 것을 보여준다.
도 17은 항-DCIR mAb가 HIV 항원-특이적 CD8+ 세포의 초회감작 (priming)을 증진시킨다는 것을 보여준다.
도 18은 항-DCIR mAb가 HIV 항원-특이적 CD8+ 세포의 초회감작 (priming)을 증진시킨다는 것을 보여준다.
도 19는 사람 상피 층에서의 DCIR 분포의 면역조직화학 분석을 보여준다.
도 20A 내지 20D는 DCIR 항원에 대한 모노클로날 항체, 구체적으로 DCIR에 대한 친화성을 보여준다.
도 21은 붉은털 원숭이 (Rhesus macaque)에 대한 항-DCIR mAb의 교차-반응성을 보여준다.
도 22는 특이적 글리칸 구조물에 대한 DCIR 외부도메인 (ectodomain)의 결합을 보여준다.
도 23A 내지 23C는 DCIR이 모든 혈액 DC 서브세트에 대한 광범위한 표적임을 보여준다.
도 24는 DCIR-FluM1로 백신접종하면, FluM1 특이적 회상 CD8+ T 세포 면역이 발생할 수 있음을 보여준다.
본 발명의 다양한 양태의 제조 및 사용이 이후 상세히 설명되겠지만, 이는 본 발명이 광범위하게 다양한 구체적 형태로 구체화될 수 있는 다수의 적용가능한 발명의 개념을 제공하기 위한 것으로 보아야 할 것이다. 본원에 설명된 구체적 양태는 본 발명을 제조하고 사용하는 구체적 방법을 단지 예시하는 것이지, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
본 발명의 이해를 쉽게 하기 위하여, 다수의 용어가 아래에 정의된다. 본원에 정의된 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 부정관사 또는 정관사와 같은 용어는 단수 대상만을 가리키는 것이 아니며, 일반적 부류를 포함하는 것이며, 이의 구체적 예가 설명을 위하여 사용될 수 있다. 본원의 용어들은 본 발명의 구체적 양태를 기술하는데 사용되지만, 청구범위에 기재된 것을 제외하고, 이들의 사용이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
수지상 세포 (DC)는 항원-특이적 면역성을 조절하는데 주요 역할을 하는 항원-제시 세포이다 [참조 문헌: (Mellman and Steinman 2001), (Banchereau, Briere et al. 2000), (Cella, Sallusto et al. 1997)]. DC는 항원을 포획하고, 이들을 펩타이드로 프로세싱하며, 이들을 T 세포에 제시한다. 따라서, DC에 직접 항원을 전달하는 것이 백신을 개량하기 위한 중요 분야이다. 이러한 일례는, 나중에 환자에게 재-투여되는 자가 DC의 생체내 항원-적재를 이용하는 DC-기본 백신이다 [참조 문헌: (Banchereau, Schuler-Thurner et al. 2001), (Steinman and Dhodapkar 2001)]. 백신 효능을 개선하기 위한 또 다른 전략은 내화 DC-특이적 수용체에 대한 항체에 접합된 항원의 DC에 대한 특이적 표적화이다. 백신접종을 위한 표적화 DC의 잠재력은 주요 마우스 연구에서 강조되었다. 난알부빈 (OVA)에 결합된 항-LOX-1 mAb를 이용한 생체내 표적화는, MHC 제I형 경로를 향한 외인성 항원 교차-제시를 통해, 보호적 CD8+ T 세포를 유도하였다 (참조 문헌: Delneste, Magistrelli et al. 2002). 또한, 항-DEC205 mAb에 접합된 OVA는, CD40L 성숙 자극제와 함께, 생체내 DC에 의한 MHC 제I형-제한된 제시를 증진시키고, 효과기 기억 (effector memory) CD8+ T 세포의 내구성 있는 형성을 유도한다 (참조 문헌: Bonifaz, Bonnyay et al. 2004). 이들 연구는 둘 모두 매우 효과적인 용량-절감 (즉, 매우 적은 항원 용량에서 강한 면역 반응)을 보여주었고, 다른 유형의 OVA 면역화에서 통상적으로 보는 것보다 더욱 광범위한 반응을 암시하였다. DEC205를 통한 DC로의 HIV gag 항원의 표적화에 관한 최근의 연구가 이들 개념을 임상적으로 관련 있는 항원으로까지 확장시켰으며, DC로의 항원 표적화의 능력, 즉 매우 효과적인 용량-절감, 단일 백신접종으로의 보호 반응, 및 CD8 및 CD4 두 구획 모두에서의 항원-특이적 T 세포의 증대를 확인하였다 (참조 문헌: Trumpfheller, Finke et al. 2006).
본 발명은, 다중 항원 또는 단백질 (1차 mAb로부터 독립적으로 조작되고, 발현되고, 정제됨)을 제어된 다변성 방식으로, 하나의 단일 1차 재조합 mAb로 복합체함을 제공한다. 현재, 하나의 1차 mAb에 상이한 단백질들 (각각 개별적으로 조작되어 스트렙타비딘에 연결됨)의 첨가를 고려한 부위-특이적 바이오티닐화 부위를 조작하는 방법이 있다. 그러나, 본 발명은, 개별적으로 조작된 단백질들의, 고정된 등몰비 및 위치로, 다중 조합물에 1차 mAb를 첨가하는 것을 고려한다.
본원에 사용된 용어 "모듈식 rAb 운반체"는, 다양한 항원, 활성화 단백질 또는 다른 항체를 단일 재조합 모노클로날 항체 (mAb)에 제어된 모듈식으로 첨가하도록 조작되어진, 재조합 항체 시스템을 기술하는데 사용된다. rAb는 표준 하이브리도마 기법, 재조합 항체 디스플레이, 사람화 모노클로날 항체 등을 사용하여 제조된 모노클로날 항체일 수 있다. 모듈식 rAb 운반체는, 예를 들어, 다중 항원 및/또는 항원 및 활성화 사이토카인을 수지상 세포 (DC)로 표적화 (내화 수용체, 예컨대 사람 수지상 세포 수용체에 대한 하나의 1차 재조합 항체를 통해)하는데 사용될 수 있다. 모듈식 rAb 운반체는 또한 두 개의 상이한 재조합 mAb를 제어된 정해진 방식으로 말단-대-말단으로 연결하는데 사용될 수 있다.
"모듈식 rAb 운반체"의 항원 결합 부분은 하나 이상의 가변 도메인, 하나 이상의 제1 불변 도메인, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편 및 Fv 단편, 및 Fabc 단편 및/또는 Fc 도메인의 일부를 가진 Fab 단편일 수 있으며, 동족의 모듈식 결합 부분이 이의 아미노산 서열에 첨가되고/되거나 결합된다. 모듈식 rAb 운반체에 사용되는 항체는 임의의 동형 (isotype), 부류, 아류이거나 임의 공급원 (동물 및/또는 재조합체)로부터 유래할 수 있다.
비-제한적인 예로, 모듈식 rAb 운반체는, 조작된 재조합 mAb와 관련하여 특이적이고 한정된 단백질 복합체를 제조하기 위하여, 하나 이상의 모듈식 cohesin-dockerin 단백질 도메인을 갖도록 조작된다. 상기 mAb는 당해 mAb의 항원 결합 도메인으로부터 하나 이상의 모듈식 cohesin-dockerin 단백질 도메인 카복시를 포함하는 융합 단백질의 부분이다. cohesin-dockerin 단백질 도메인은, 예를 들어 화학적 가교제 및/또는 디설파이드 결합을 사용하여, 해독후 부착될 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "항원"은, 당해 항원의 수용자에서 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 개시시킬 수 있는 분자를 말한다. 항원은 본 발명과 두 가지 상이한 방식으로 사용될 수 있다: rAb의 항체 또는 다른 항원 인식 도메인에 대한 표적으로서 사용되거나, 또는 모듈식 rAb 운반체에 대한 dockerin/cohesin-분자 상보체의 일부로서 rAb에 의해 세포 또는 표적으로/속으로 운반되는 분자로서 사용된다. 항원은 통상적으로, 백신접종이 유리한 치료일 수 있는 질환을 일으키는 제제이다. 항원이 MHC 상에 제시될 때, 당해 펩타이드는 종종 약 8개 내지 약 25개의 아미노산이다. 항원은, 예를 들어 단순한 중간 대사물질, 당류, 지질 및 호르몬뿐만 아니라, 복합 탄수화물, 인지질, 핵산 및 단백질과 같은 거대분자를 포함하는 모든 유형의 생물학적 분자를 포함한다. 항원의 통상의 범주는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원, 원생동물 항원 및 기타 기생충 항원, 종양 항원, 자가면역 질환, 알레르기 및 이식 거부증과 관련된 항원, 및 기타 다양한 항원을 포함한다.
모듈식 rAb 운반체는 다수의 활성제, 예를 들어 항생제, 항감염제, 항바이러스제, 항종양제, 해열제, 진통제, 소염제, 골다공증 치료제, 효소, 사이토카인, 항응고제, 다당류, 콜라겐, 세포, 및 전술한 활성제의 2 이상의 조합물을 운반할 수 있다. 본 발명을 사용하여 전달할 수 있는 항생제의 예로는, 제한 없이, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 페니실린, 세팔로스포린, 설폰아미드 약제, 클로르암페니콜 나트륨 석시네이트, 에리트로마이신, 반코마이신, 린코마이신, 클린다마이신, 니스타틴, 암포테리신 B, 아만티딘, 이독수리딘 (idoxuridine), p-아미노 살리실산, 이소니아지드 (isoniazid), 리팜핀 (rifampin), 안티노마이신 D (antinomycin D), 미트라마이신 (mithramycin), 다우노마이신 (daunomycin), 아드리아마이신 (adriamycin), 블레오마이신 (bleomycin), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 프로카르바진 (procarbazine), 이미다졸 카복스아미드 (imidazole carboxamide) 등이 포함된다.
본 발명을 사용하여 전달할 수 있는 항종양 제제의 예로는, 제한 없이, 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (Daunorubicin), 탁솔 (taxol), 메토트렉세이트 (methotrexate) 등이 포함된다. 해열제 및 진통제의 예로는 아스피린, 모트린 (Motrin)®, 이부프로펜(Ibuprofen)®, 나프로신 (naprosyn), 아세트아미노펜 등이 포함된다.
본 발명을 사용하여 전달할 수 있는 소염제의 예로는, 제한 없이, NSAIDS, 아스피린, 스테로이드, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 프레드니솔론 (prednisolone), 디클로페낙 (Diclofenac) Na 등이 포함된다.
본 발명을 사용하여 전달할 수 있는 골다공증 치료제 및 골 및 골격에 작용하는 기타 인자의 예로는, 제한 없이, 칼슘, 알렌드로네이트, 골 GLa 펩타이드, 부갑상선 호르몬 및 이의 활성 단편, 히스톤 H4-관련 골 형성 및 증식 펩타이드 및 이의 돌연변이, 유도체 및 유사체가 포함된다.
본 발명을 사용하여 전달할 수 있는 효소 및 효소 조인자의 예로는, 제한 없이, 판크레아제, L-아스파라기나제, 하이알루로니다제 (hyaluronidase), 키모트립신, 트립신, tPA, 스트렙토키나제, 우로키나제 (urokinase), 판크레아틴, 콜라게나제, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 플라스미노겐, 스트렙토키나제, 아데닐 사이클라제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (SOD) 등이 포함된다.
본 발명을 사용하여 전달할 수 있는 사이토카인의 예로는, 제한 없이, 인터류킨, 전환 성장 인자 (TGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 상피 성장 인자 (EGF), 결합조직 활성화 펩타이드 (CTAP), 골원성 인자, 및 이러한 성장 인자의 생물학적 활성 유사체, 단편 및 유도체가 포함된다. 사이토카인은 B/T-세포 분화 인자, B/T-세포 성장 인자, 분열유발성 사이토카인, 화학주성 인자, 콜로니 자극 인자, 혈관형성 인자, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 등, 렙틴, 미오스타틴, 대식세포 자극 단백질, 혈소판-유래된 성장 인자, TNF-α, TNF-β, NGF, CD40L, CD137L/4-1BBL, 사람 림프독소-β, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-1α, IL1- β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, 에리트로포이에틴, 엔도스타틴, 안지오스타틴, VEGF 또는 이의 임의의 단편 또는 조합물이 포함된다. 다른 사이토카인에는 베타 전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3)를 포함하는 전환 성장 인자 (TGF) 슈퍼유전자 계열; 골 형태형성 단백질 (예: BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); 헤파린-결합 성장 인자 (예: 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF)); 인히빈 (예: 인히빈 A, 인히빈 B); 성장 분화 인자 (예: GDF-1); 및 액티빈 (예: 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB)의 일원이 포함된다.
본 발명을 사용하여 전달할 수 있는 성장 인자의 예로는, 제한 없이, 천연 또는 자연 공급원, 예를 들어 포유동물 세포로부터 분리될 수 있거나, 또는 예를 들어 재조합 DNA 기법 또는 다양한 화학 공정에 의해 합성적으로 제조될 수 있는 성장 인자가 포함된다. 추가로, 이들 인자의 유사체, 단편 또는 유도체가, 이들이 천연 분자의 생물학적 활성의 적어도 일부를 나타낸다면, 사용될 수 있다. 예를 들면, 유사체는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 다른 유전자 조작 기법에 의해 변형된 유전자의 발현에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 의해 전달될 수 있는 항응고제의 예로는, 제한 없이, 와파린, 헤파린, 히루딘 등이 포함된다. 본 발명을 사용하여 전달할 수 있는 면역 체계에 작용하는 인자의 예로는, 제한 없이, 염증 및 악성 신생물 (neoplasm)을 제어하는 인자, 및 감염성 미생물, 예컨대 화학주성 펩타이드 및 브라디키닌 (bradykinin)을 공격하는 인자가 포함된다.
바이러스 항원의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예컨대, 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 항원, 예를 들어, gag, pol 및 env 유전자의 유전자 산물, Nef 단백질, 역전사효소 및 다른 HIV 성분으로부터의 레트로바이러스 항원; B형 간염 바이러스의 S, M, 및 L 단백질, B형 간염 바이러스의 프리(pre)-S 항원, 및 다른 간염 (예: A형, B형 및 C형 간염)의 바이러스 성분 (예: C형 간염 바이러스 RNA)와 같은 간염 바이러스 항원; 헤마글루티닌 (hemagglutinin)과 뉴라미다제 (neuraminidase) 및 기타 인플루엔자 바이러스 성분과 같은 인플엔자 바이러스 항원; 및 홍역 바이러스 융합 단백질 및 기타 홍역 바이러스 성분과 같은 홍역 바이러스 항원; 단백질 E1 및 E2 및 기타 풍진 바이러스 성분과 같은 풍진 바이러스 항원; VP7sc 및 기타 로타바이러스 성분과 같은 로타바이러스 항원; 외피 당단백질 B 및 기타 사이토메갈로바이러스 항원 성분과 같은 사이토메갈로바이러스 항원; RSV 융합 단백질, M2 단백질 및 기타 호흡기 합포체 바이러스 항원 성분과 같은 호흡기 합포체 바이러스 항원; 즉시 초기 단백질, 당단백질 D 및 기타 단순포진 바이러스 항원 성분과 같은 단순포진 바이러스 항원; gpI, gpII 및 기타 수두대상포진바이러스 항원 성분과 같은 수두대상포진바이러스 항원; 단백질 E, M-E, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A, 80% E 및 기타 일본 뇌염 바이러스 항원 성분과 같은 일본 뇌염 바이러스 항원; 광견병 당단백질, 광견병 핵단백질 및 기타 광견병 바이러스 항원 성분과 같은 광견병 바이러스 항원이 포함된다. 바이러스 항원의 추가적 예에 관하여는 문헌 [Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)]을 참조한다.
본 발명의 rAb-DC/DC-항원 백신을 사용하여 전달할 수 있는 항원성 표적으로는 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원 또는 기생충 항원과 같은 항원을 암호화하는 유전자가 포함된다. 바이러스로는 피코르나바이러스 (picornavirus), 코로나바이러스, 토가바이러스, 플라비르바이러스 (flavirvirus), 라브도바이러스 (rhabdovirus), 파라믹소바이러스 (paramyxovirus), 오르토믹소바이러스 (orthomyxovirus), 부니야바이러스 (bunyavirus), 아레나바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스, 파필로마바이러스, 파르보바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스 (hepadnavirus) 및 해면상 바이러스 (spongiform)가 포함된다. 다른 바이러스 표적으로는 인플루엔자, 단순포진 바이러스 1 및 2, 홍역, 뎅기열, 두창 (smallpox), 폴리오 또는 HIV가 포함된다. 병원체로는 트리파모소마, 촌충, 회충, 연충, 말라리아가 포함된다. 태아 항원 또는 전립선 특이적 항원과 같은 종양 마커가 이러한 방법으로 표적화될 수 있다. 다른 예로는 HIV env 단백질 및 B형 간염 표면 항원이 포함된다. 백신접종 목적으로 본 발명에 따른 벡터를 투여하려면, 벡터-연관된 항원이 강한 면역 반응이 요구되는 전이유전자 (transgene)의 장기간의 발현이 가능하도록 충분히 비-면역원성일 것이 필요하다. 일부 경우에는, 개체의 백신접종이 단지 드물게, 예를 들어 1년 마다 또는 2년 마다 요구될 수 있고, 감염성 제제에 대해 장기간의 면역학적 보호를 제공한다. 벡터 중에, 그리고 궁극적으로 본 발명과 함께 항원으로서 사용하기 위한 생물체, 알레르기 항원, 핵산 서열, 아미노산 서열의 구체적 예는 미국 특허 제6,541,011호에서 찾아 볼 수 있고, 관련 부분은 본원에 참조로, 특히 본 발명과 함께 사용될 수 있는 특정 서열과 생물체를 매치시키는 표가 인용된다.
본원에 기재된 rAb 백신과 함께 사용되는 세균 항원으로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 백일해 독소, 선형 헤마글루티닌, 퍼택틴 (pertactin), FIM2, FIM3, 아데닐레이트 사이클라제 및 기타 백일해 세균 항원 성분과 같은 세균 항원; 디프테리아 독소 또는 톡소이드 및 다른 디프테리아 세균성 항원 성분과 같은 디프테리아 세균 항원; 파상풍 독소 또는 톡소이드 및 기타 파상풍 세균 항원 성분과 같은 파상풍 세균 항원; M 단백질 및 기타 연쇄구균 세균 항원 성분과 같은 연쇄구균 세균 항원; 지질다당류 및 기타 그람-음성 세균 항원 성분과 같은 그람-음성 간상 세균 항원; 미콜산, 열 쇽 단백질 65 (HSP65), 30 kDa 주요 분비 단백질, 항원 85A 및 기타 미코박테리아 항원 성분과 같은 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 항원; 헬리코벡터 필로리 세균 항원 성분; 뉴몰리신 (pneumolysin), 폐렴구균 피막 다당류 및 기타 폐렴구균 세균 항원 성분과 같은 폐렴구균 세균 항원; 피막 다당류 및 기타 헤모필루스 인플루엔자 세균 항원 성분과 같은 헤모필루스 인플루엔자 세균 항원; 탄저 보호 항원 및 기타 탄저균 항원 성분과 같은 탄저균 항원; rompA 및 기타 리케차 세균 항원 성분과 같은 리케차 세균 항원이 포함된다. 본원에 기재된 세균 항원에는 임의의 다른 세균, 미코박테리아, 미코플라즈마, 리케차 또는 클라미디아 항원이 포함된다. 부분 또는 전체 병원체는 또한, 헤모필루스 인플루엔자; 열대열원충 (Plasmodium falciparum); 수막염균 (neisseria meningitidis); 폐렴연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae); 임균 (neisseria gonorrhoeae); 살모넬라 혈청형 티피 (salmonella serotype typhi); 시겔라 (shigella), 콜레라균 (vibrio cholerae); 뎅기열; 뇌염군; 일본 뇌염; 라임 질환; 페스트균 (Yersinia pestis); 웨스트 나일 바이러스 (west nile virus); 황열; 야토병; 간염 (바이러스성; 세균성); RSV (호흡기 합포체 바이러스); HPIV 1 및 HPIV 3; 아데노바이러스; 두창 (small pox); 알레르기 및 암일 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용되는 진균 항원으로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 칸디다 진균 항원 성분; 열 쇽 단백질 60 (HSP60) 및 기타 히트토플라스마 진균 성분과 같은 히스토플라스마 진균 항원; 피막 다량류 및 기타 크립토코쿠스 (cryptococcal) 진균 항원 성분과 같은 크립토코쿠스 진균 항원; 소구 항원 및 기타 콕시디오드 (coccidiode) 진균 항원 성분과 같은 콕시디오드 진균 항원; 및 트리코피틴 및 기타 백선 (tinea) 진균 항원 성분과 같은 백선 진균 항원이 포함된다.
원생동물 및 기타 기생충 항원의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 메로조이트 (merozoite) 표면 항원, 포자소체 (sporozoite) 표면 항원, 환상포자소체 (circumsporozoite) 항원, 생식세포/생식자 표면 항원; 혈액-단계 항원 pf 155/RESA 및 기타 플라스모디아 (plasmodial) 항원 성분과 같은 열대열원충 (Plasmodium falciparum) 항원; SAG-1, p30 및 기타 톡소플라스마 항원 성분과 같은 톡소플라스마 항원; 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 파라미오신 및 기타 주혈흡충 (schistosomal) 항원 성분과 같은 주혈흡충 항원; gp63, 리포포스포글리칸 및 이의 관련 단백질 및 기타 리슈만편모충 (leishmania) 항원 성분과 같은 리슈만편모충 주요 항원 및 기타 리슈만편모충 항원; 및 75-77 kDa 항원, 56 kDa 항원 및 기타 파동편모충 (trypanosoma) 성분과 같은 트리파노소마 크루지 (trypanosoma cruzi) 항원이 포함된다.
본 발명의 rAb를 사용하여 표적화할 수 있는 항원은, 일반적으로, 수많은 인자, 예를 들어 내화 가능성, 면역 세포 특이성의 수준, 표적화된 면역 세포의 유형, 면역 세포 성숙 및/또는 활성화의 수준 등을 토대로 하여 선택될 수 있다. 수지상 세포에 대한 세포 표면 마커의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, MHC 제I형, MHC 제II형, B7-2, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR 및/또는 ASPGR 등이 포함되며, 한편 어떤 경우에는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD56, 및/또는 CD57이 부존재한다. 항원 제시 세포에 대한 세포 표면 마커의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, MHC 제I형, MHC 제II형, CD40, CD45, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1 및/또는 Fcγ 수용체가 포함된다. T 세포에 대한 세포 표면 마커의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, CD3, CD4, CD8, CD 14, CD20, CD11b, CD16, CD45 및 HLA-DR이 포함된다.
전달을 위한 세포 표면 상의 표적 항원으로는, 종양 항원의 특징적인, 전형적으로 종양 조직의 세포 표면, 세포질, 핵, 소기관 등으로부터 유래되는 것들이 포함된다. 본 발명의 항체 부분에 대한 종양 표적의 예로는, 제한 없이, 백혈병 및 림프종과 같은 혈액학적 암, 성상세포종 또는 교모세포종과 같은 신경학적 종양, 흑색종, 유방암, 폐암, 두경부 암, 위장관 종양 (예: 위암 또는 결장 암), 간암, 췌장암, 비뇨생식기 종양 (예: 자궁경부, 자궁, 난소 암, 질암, 고환암, 전립선암 또는 음경암), 골 종양, 혈관 종양, 또는 입술, 비인강, 인두, 구강, 식도, 직장, 담낭, 담도계, 후두, 폐와 기관지, 방광, 신장, 뇌와 신경계의 다른 부분, 및 갑상선의 암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병이 포함된다.
본 발명을 사용하여 항원 제시를 위해 면역 세포로 단독으로 함께 전달될 수 있는 항원의 예로는 종양 단백질, 예를 들어 돌연변이된 발암유전자; 종양과 관련된 바이러스 단백질; 및 종양 뮤신 및 당지질이 포함된다. 항원은 종양과 관련된 바이러스 단백질일 수 있으며, 이는 위에 기재된 바이러스의 부류 기원의 것들일 것이다. 특정 항원은 종양의 특징 (종양 전구 세포에 의해 통상적으로 발현되지 않는 단백질인 서브세트)을 갖거나, 또는 종양 전구 세포에서 통상적으로 발현되지만, 종양의 성숙 특징을 갖는 단백질일 수 있다. 다른 항원은 변형된 활성 또는 세포하 분포, 예를 들어 종양 항원을 발생시키는 유전자의 돌연변이를 갖는 정상 단백질의 돌연변이 변이체(들)을 포함한다.
종양 항원의 비-제한적인 구체적 예로는 CEA, 전립선 특이적 항원 (PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 및 12, MUC (뮤신(Mucin)) (예: MUC-1, MUC-2 등), GM2 및 GD2 강글리오시드 (ganglioside), ras, myc, 티로시나제, MART (흑색종 항원), Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열 (N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라제 V 인트론 V 서열), 전립선 Ca psm, PRAME (흑색종 항원), β-카테닌, MUM-1-B (흑색종 편재 돌연변이된 유전자 산물), GAGE (흑색종 항원) 1, BAGE (흑색종 항원) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (Epstein-Barr 바이러스 핵 항원) 1-6, gp75, 사람 유두종(papilloma) 바이러스 (HPV) E6 및 E7, p53, 폐 내성 단백질 (LRP), Bcl-2 및 Ki-67이 포함된다. 추가로, 면역원성 분자는, 병인이 관련 표적 기관, 조직 또는 세포에 의해 발현되는 분자, 예를 들어 SLE 또는 MG에 특이적인 항체의 활성에 주로 기인하는 자가면역 질환의 개시 및/또는 전파와 관련 있는 자가항원일 수 있다. 이러한 질환에서, 관련 자가항원에 대한 진행중인 항체-매개된 (즉, Th2-형) 면역 반응을 세포 (즉, Th1-형) 면역 반응으로 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로, 적당한 자가항원에 대해 Th1 반응을 예방학적으로 유도함으로써, 관련 자가면역 질환이 없으나 이에 걸리기 쉬운 것으로 의심되는 피험자에게서 자가항원에 대한 Th2 반응의 발생을 방지하거나 Th2 반응의 수준을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 목적하는 자가항원으로는, 제한 없이, (a) SLE에 대하여는, 스미쓰 (Smith) 단백질, RNP 리보핵단백질, 및 SS-A 및 SS-B 단백질; 그리고 (b) MG에 대하여는, 아세틸콜린 수용체가 포함된다. 자가면역 반응의 하나 이상의 유형에 관련된 기타 다양한 항원의 예로는, 예컨대 황체형성 호르몬, 여포 자극 호르몬, 테스토스테론, 성장 호르몬, 프로락틴 (prolactin) 및 기타 호르몬과 같은 내인성 호르몬이 포함된다.
자가면역 질환, 알레르기 및 이식 거부증에 관련된 항원은 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 아래의 임의의 자가면역 질환 또는 장애의 하나 이상과 관련된 항원은 본 발명에 사용될 수 있다: 당뇨병, 진성 당뇨병, 관절염 (예: 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선 관절염), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반 루프스, 자가면역 갑상선염, 피부염 (예: 아토피성 피부염 및 습진성 피부염), 건선, 쇼그렌 증후군 (예: 쇼그렌 증후군에 부수적인 건조각막결막염), 원형 탈모증, 절지동물 물림 반응으로 인한 알레르기 반응, 크론병, 아프타성 궤양, 홍채염, 결막염, 각막결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 홍반성 루프스, 공피증, 질염, 직장염, 약물 발진, 나병 반전 반응 (leprosy reversal reaction), 나성 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 괴사 출혈 뇌병증, 특발성 양쪽 진행성 감각신경난청, 재생불량빈혈, 진정 적혈구계 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성 활성 간염, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루 (idiopathic sprue), 편평 태선, 크론병, 그레이브스 눈병증, 사르코이드증, 원발 담증성 경화증, 후방 포도막염 및 간질성 폐 섬유증. 자가면역 질환에 관련된 항원의 예로는 글루탐산 데카복실라제 65 (GAD 65), 천연 DNA, 미엘린 (myelin) 염기성 단백질, 미엘린 단백질지질(proteolipid) 단백질, 아세틸콜린 수용체 성분, 티로글로불린 및 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 수용체가 포함된다. 알레르기에 관련된 항원의 예로는 화분 항원, 예를 들어 일본 삼목 (cedar) 화분 항원, 돼지풀 (ragweed) 화분 항원, 독보리 (rye grass) 화분 항원, 먼지 진드기 항원 및 고양이 항원과 같은 동물-유래된 항원, 조직적합 항원, 및 페니실린 및 기타 치료 약물이 포함된다. 이식 거부증에 관련된 항원에는 이식편 수용자에게 이식될 이식편, 예를 들어 심장, 폐, 간, 췌장, 신장, 및 신경 이식 성분의 항원성 성분이 포함된다. 항원은 자가면역 질환을 표적화하는데 유용한 변형된 펩타이드 리간드일 수 있다.
본원에 사용된 "에피토프"란 용어는 병원체 DNA 또는 RNA에 의해 암호화된 다수의 임의의 병원체 폴리펩타이드 내에 존재하는 에피토프와 유사한 1차, 2차 또는 3차 구조체를 포함하는 펩타이드 또는 단백질 항원을 말한다. 유사성의 정도는 일반적으로, 상기와 같은 폴리펩타이드에 대해 유도된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 상기 펩타이드 또는 단백질 항원에 결합하거나, 반응하거나, 또는 인식할 수 있는 정도일 것이다. 다양한 면역분석 방법, 예를 들어 당업자에게 모두 공지된 웨스턴 블롯팅 (Western blotting), ELISA, RIA 등이 상기와 같은 항체와 함께 사용될 수 있다. 백신에 사용하기에 적합한 병원체 에피토프 및/또는 이의 기능적 등가물의 동정은 본 발명의 일부이다. 일단 분리되고 동정되면, 쉽게 기능적 등가물을 수득할 수 있다. 예를 들면, 친수성을 토대로 한 아미노산 서열로부터 에피토프의 동정 및 제조를 교시하는, 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제4,554,101호에 기재된 Hopp의 방법을 사용할 수 있다. 여러 다른 논문에 기재된 방법 및 그에 기초한 소프트웨어 프로그램이 또한 에피토프 코어 서열을 동정하는데 사용될 수 있다 (참조 문헌: Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; 미국 특허 제4,554,101호). 이후, 이들 "에피토프 코어 서열"의 아미노산 서열은 펩타이드 합성 또는 재조합 기법을 적용하여 쉽게 펩타이드 내로 도입될 수 있다.
활성 성분으로서 본 발명의 항원을 암호화하는 핵산을 포함하는 백신 조성물 제제는 액체 용액제 또는 현탁액제와 같은 주사제로서 제조될 수 있고; 또한, 적용 전에 액체인 용액 중에 또는 현탁액 중에 용해시키기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 당해 제제는 리포좀 내에서 유화되고, 캡슐화될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 종종, 약제학적으로 허용되고 활성 성분에 적합한 담체와 함께 혼합될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 담체"란 용어는, 그것이 투여된 피험자에게서 알레르기 반응 또는 기타 불리한 효과를 일으키지 않는 담체를 말한다. 적당한 약제학적으로 허용되는 담체로는, 예를 들어, 하나 이상의 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 또는 이들의 배합물이 포함된다. 추가로, 원한다면, 백신은 소량의 보조 물질, 예를 들면, 습윤제, 유화제, pH 완충제 및/또는 백신의 효과를 증진시키는 애주번트를 함유할 수 있다. 효과적인 애주번트의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, MTP-PE 및 RIBI (세균으로부터 추출된 3개의 성분을 함유), 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트, 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 유제 중의 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS)이 포함된다. 애주번트의 다른 예로는 DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드), 프로인트 (Freund) 완전 및 불완전 애주번트, 및 QuilA가 포함된다. 추가로, 면역 조절 물질, 예를 들면 림포카인 (예: IFN-γ, IL-2 및 IL-12) 또는 합성 IFN-γ 유도인자, 예를 들어 폴리 I:C가 본원에 기재된 애주번트와 함께 사용될 수 있다.
약제학적 제품은, 본원에 기재된 혈장 지단백질 상에 존재하는 아포지방단백질 (apolipoprotein)의 특정 DNA-결합 부위에 결합하는 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일 또는 다중 복사체를 가진 나상 (naked) 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 생물학적 활성 펩타이드, 안티센스 RNA 또는 리보자임을 암호화할 수 있고, 생리학적으로 허용되는 투여형으로 제공될 것이다. 본 발명으로부터 제조될 수 있는 또 다른 약제학적 제품은, 환자의 혈액 또는 다른 공급원으로부터 본원에 기재된 방법에 따라 분리된 고도로 정제된 혈장 지단백질 분획물, 및 혈장 지단백질 상에 존재하는 아포지방단백질의 특정 DNA-결합 부위에 결합하는 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일 또는 다중 복사체를 함유하고, 상기 정제된 지단백질 분획물에 사전결합된 폴리뉴클레오타이드를 생리학적으로 허용되는 투여가능한 형태로 포함할 수 있다.
또 다른 약제학적 제품은, 특정 DNA-결합 모티프의 단일 또는 다중 복사체를 함유하는 재조합 아포지방단백질 단편을 함유하고, 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일 또는 다중 복사체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드에 사전결합된, 고도로 정제된 혈장 지단백질 분획물을 생리학적으로 허용되는 투여가능한 형태로 포함할 수 있다. 또 다른 약제학적 제품은, 특정 DNA-결합 모티프의 단일 또는 다중 복사체를 함유하는 재조합 아포지방단백질 단편을 함유하고, 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일 또는 다중 복사체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드에 사전결합된, 고도로 정제된 혈장 지단백질 분획물을 생리학적으로 허용되는 투여가능한 형태로 포함할 수 있다.
투여되는 용량은 치료될 피험자의 체중 및 신체 상태뿐만 아니라, 투여 경로 및 치료 횟수에 따라 크게 달라진다. 고도로 정제된 지단백질 분획물에 사전결합된 나상 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 폴리뉴클레오타이드 1 μg 내지 1 mg 및 단백질 1 μg 내지 100 mg 범위의 양으로 투여될 수 있다.
환자에게의 rAb 및 rAb 복합체의 투여는, 경우에 따라, 벡터의 독성을 참작하여, 화학치료제 투여에 관한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 필요에 따라, 치료 사이클이 반복될 것이 예상된다. 또한, 다양한 표준 치료법뿐만 아니라, 외과 시술이 상기된 유전자 치료와 병용될 수 있다고 생각된다.
유전자 치료의 임상 적용이 고려되는 경우에, 의도된 적용에 적당한 약제학적 조성물로서 복합체를 제조하는 것이 필요할 것이다. 일반적으로, 이는 발열원뿐만 아니라, 사람 또는 동물에 해로울 수 있는 모든 다른 불순물이 실질적으로 부재하는 약제학적 조성물을 제조할 것을 요구할 것이다. 또한, 당해 복합체를 안정화시키고, 당해 복합체가 표적 세포에 의해 섭취될 수 있도록 적당한 염 및 완충제를 사용하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 수성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질 중에 용해되거나 분산된 유효량의 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 접종물로서 칭해질 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 제제가 활성 물질과 부적합한 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물 중에 이의 사용이 고려된다. 또한, 보조적 활성 성분이 당해 조성물 중에 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전형적인 약제학적 제제를 포함할 수 있다. 분산액이 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 중에 및 오일 중에 제조될 수 있다. 통상의 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위하여 보존제를 함유한다.
질환 상태. 치료될 특정 질환에 따라, 본 발명에 따른 치료학적 조성물은, 최대 (또는 어떤 경우에 최소) 면역 반응을 위해 항원을 특정 부위에 최대로 전달하기 위하여, 표적 조직이 그 통상의 경로를 통해 이용될 수 있는 한, 임의의 통상의 경로를 통해 투여될 것이다. 투여는 일반적으로, 동소의 (orthotopic) 피내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 이루어질 것이다. 투여를 위한 다른 부위는 구(口), 비(鼻), 협측 (buccal), 직장, 질 또는 국소 부위를 포함한다. 국소 투여는 피부암의 치료에 특히 이로울 것이다. 이러한 조성물은 통상적으로, 생리학적으로 허용되는 담체, 완충제 또는 기타 부형제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물로서 투여될 것이다.
본 발명의 백신 또는 치료 조성물은 주사에 의해 비경구로, 예를 들어 피하고 또는 근육내로 투여될 수 있다. 다른 방식의 투여에 적합한 또 다른 제형으로는 좌제, 및 어떤 경우에는, 경구용 제형, 또는 에어로졸의 전달에 적합한 제형이 포함된다. 경구용 제형의 경우에, 애주번트를 이용한 T-세포 서브세트의 조작, 항원 패키징, 또는 다양한 제형에의 개개의 사이토카인의 첨가에 의해, 최적 면역 반응을 가진 개선된 경구용 백신이 생성된다. 좌제의 경우에, 전통적인 결합제 및 담체에는, 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세리드가 포함될 수 있으며; 이러한 좌제는 활성 성분을 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1%-2%의 범위로 함유하는 혼합물로부터 생성될 수 있다. 경구용 제형은 예를 들면 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 통상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액제, 현탁액제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방성 제형 또는 산제의 형태를 취하고, 활성 성분 10%-95%, 바람직하게는 25-70%을 함유한다.
본 발명의 핵산을 암호화하는 항원은, 중성 또는 염 형태의 백신 또는 치료 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는, (펩타이드의 유리 아미노 그룹과 형성되고), 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 말레산 등과 같은 유기산과 형성되는 산 부가염이 포함된다. 유리 카복실 그룹과 형성된 염은 또한 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제이철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
백신 또는 치료 조성물은 예방적 및/또는 치료학적으로 효과적인 용량의 투여 제형에 적합한 방식으로 투여된다. 투여될 양은 치료될 피험자, 예를 들어 항체를 합성할 수 있는 피험자의 면역 체계의 능력, 및 목적하는 예방 또는 치료의 정도에 따라 결정된다. 적합한 용량 범위는 백신접종 당 활성 성분이 대략 수백 마이크로그램, 즉 약 0.1 mg 내지 1000 mg, 예를 들어 약 1 mg 내지 300 mg, 바람직하게는 약 10 mg 내지 50 mg인 범위이다. 최초 투여 및 추가 투여 (booster shot)에 적합한 요법은 다양할 수 있으나, 최초 투여 및 순차적인 후속 접종 또는 다른 투여에 의해 전형화된다. 투여에 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 담당 의사의 판단에 따라 결정되며, 각 피험자에게 특유하다. 본 발명의 핵산 분자 또는 융합 폴리펩타이드의 치료학적 유효량이 특히 투여 스케줄, 투여된 항원의 단위 투여량, 당해 핵산 분자 또는 융합 폴리펩타이드가 다른 치료제와 함께 투여되는지의 여부, 수용자의 면역 상태 및 건강 상태, 특정 핵산 분자 또는 융합 폴리펩타이드의 치료 활성에 따라 결정될 것이라는 것은 당업자에게 명백하다.
당해 조성물은 단일 투여 스케줄 또는 다중 투여 스케줄로 제공될 수 있다. 다중 투여 스케줄은 백신접종의 1차 과정이 예를 들어 1 내지 10회의 별개의 투여를 포함할 수 있고, 이어서, 면역 반응을 유지하고/하거나 강화하는데 요구되는 후속 시간 간격으로 나머지 투여, 예를 들면 1 내지 4개월 간격으로 2차 투여, 및 필요한 경우, 수개월 후 후속 투여하는 것이다. 1 내지 5년, 통상적으로 3년의 간격의 주기적 추가투여가 목적하는 수준의 보호 면역을 유지하는데 바람직하다. 면역화의 과정 후, ESAT6 또는 ST-CF와 공동-배양된 말초혈 림프구 (PBL)의 시험관내 증식 분석 및 초회감작된 림프구로부터 방출된 IFN-γ의 수준 측정을 수행할 수 있다. 상기 분석은 통상의 표지, 예를 들어 방사선핵종, 효소, 형광성 표지 등을 사용하여 수행될 수 있다. 이들 기법은 당업자에게 공지되었으며, 관련 부분이 참조로 인용된 미국 특허 제3,791,932호, 제4,174,384호 및 제3,949,064호에서 찾아볼 수 있다.
모듈식 rAb 운반체 및/또는 접합된 rAb 운반체-(cohesion/dockerin 및/또는 dockerin-cohesin)-항원 복합체 (rAb-DC/DC-항원 백신)은, 핵산 벡터가 사용되는지, 최종 정제된 단백질이 사용되는지, 또는 최종 백신 형태가 사용되는지의 여부에 따라, 하나 이상의 "단위 용량"으로 제공될 수 있다. 단위 용량은 치료 조성물의 투여, 즉 적당한 경로 및 치료 요법과 관련하여 목적하는 반응을 일으킬 것으로 계산된, 치료 조성물의 예정된 양을 함유하는 것으로 정의된다. 투여될 양 및 특정 경로 및 제형은 임상 분야의 숙련가의 기술에 속한다. 또한, 치료될 피험자는, 특히 피험자의 면역 체계의 상태 및 목적하는 보호의 관점에서 평가될 수 있다. 단위 용량은 단일 주사로 투여될 필요는 없으나, 정해진 기간에 걸친 계속적 주입을 포함할 수 있다. 본 발명의 단위 용량은 통상적으로 DNA/kg (또는 단백질/Kg) 체중의 단위로 기재될 수 있으며, 약 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.5, 1, 10, 50, 100, 1,000 또는 이상 mg/DNA 또는 단백질/kg 체중의 범위가 투여된다. 마찬가지로, 전달된 rAb-DC/DC-항원 백신의 양은 약 0.2 내지 약 8.0 mg/kg 체중의 범위 내에서 다를 수 있다. 따라서, 특정 양태의 경우에, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.8 mg, 1.0 mg, 1.5 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 4.0 mg, 5.0 mg, 5.5 mg, 6.0 mg, 6.5 mg, 7.0 mg 및 7.5 mg의 백신이 생체내에서 개체에 전달될 수 있다. 투여될 rAb-DC/DC-항원 백신의 용량은 치료될 피험자의 체중 및 신체 상태뿐만 아니라, 투여 경로 및 치료 횟수에 따라 크게 달라질 수 있다. 리포좀의 또는 바이러스의 전달 벡터에 사전결합된 나상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 1 μg 내지 1 mg의 폴리뉴클레오타이드 대 1 μg 내지 100 mg의 단백질의 범위의 양으로 투여될 수 있다. 따라서, 특정 조성물은, 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 100 μg, 150 μg, 200 μg, 250 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg, 1 mg, 1.5 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg 또는 100 mg의 벡터에 독립적으로 결합된, 약 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg, 60 μg, 70 μg, 80 μg, 100 μg, 150 μg, 200 μg, 250 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 900 μg 또는 1,000 μg의 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명을, Flu 항원이 표적화된 수지상 세포에 의한 사람 Flu-특이적 T 세포의 면역 자극을 측정하는 시험관내 세포 시스템에서 시험하였다. 본원에 제시된 결과는, 상기 시스템에서 그 자체로는 비효과적인 항원의 용량에서 상기 항원-특이적 세포의 특이적 증대를 입증한다.
본 발명은, 모듈식 rAb 운반체, 즉 예를 들면, 리신 (Ricin), 탄저 독소 및 포도구균 (Staphylococcus) B 장독소로부터 유래된 보호적 항원과 복합체를 형성한 재조합 사람화 mAb (특정 사람 수지상 세포 수용체에 대해 유도됨)를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 대한 잠재적 시장은 모든 군인의 백신접종이며, 이들 제제와 관련된 모든 생물위협에 반응하여 대집단 중심에 투여하기 위하여 보존된 저장백신이다. 본 발명은, 일반적으로 사람 및 동물 모두에 사용하기 위한 백신의 고안에 대해 폭넓게 적용된다. 관심 업계로는 약제 및 생명공학 업계가 포함된다.
일반적 방법 - 제한 및 DNA 변형 효소는 NEB로부터 구입하였다. 플라스미드 및 DNA 단편 정제는 Qiagen 제품을 사용하여 수행하였다. SDS-PAGE를 Simply Blue (Invitrogen)로 염색된 4-12% Bis-Tris 겔을 통해 수행하였다. 크로마토그래피 칼럼 및 수지는 GE Healthcare로부터 구입하였다. 플라스미드 작제물을 DNA 서열분석 (MCLAB)에 의해 확인하였다. DNA 프라이머는 Operon 또는 Midland Certified Reagent Company로부터 구입하였다. 서열 분석은 시퀀처(Sequencher) (Gene Codes)를 사용하여 수행하였다. ProtParam 기구 (2005)에 의해 예측된 계산된 흡광 계수에 기초한 단백질 농도는 UV 흡수 (NanoDrop ND-1000)에 의해 측정하였다. 서열은, 본원에 참조로 인용된 서열목록의 서열번호 1 내지 39로 제공되며, 이는 항-DCIR mAb 중쇄 (서열번호 1 내지 17) 및 경쇄 시그날 펩타이드 및 가변 영역 서열 (서열번호 18 내지 39)의 정렬이다. 예견된 N-말단 시그날 펩타이드 영역, 변이체 간의 서열 차이점 또는 밀접하게 관련된 서열 간의 서열 차이점은 시퀀처(Sequencher)를 사용하여 측정하였다.
Cohesin-Flex-hMART-1-펩타이드A-6xHis 단백질의 Cohesin 도메인에 대한 C-말단 연장의 서열. 펩타이드 내의 면역우세 펩타이드 서열에는 밑줄이 그어졌으며, 면역우세 펩타이드와 경계를 이루는 굵은 글자체의 잔기는 당해 항원 서열에 고유한 것이다. C-말단 His 태그는 Ni++ 친화성 크로마토그래피를 통한 정제를 용이하게 한다. C186 Cohesin-Flex-hMART-1-펩타이드 A-6xHis: ASDTTEARHPPVTTPTTDRRKGTTAE ELAGIGILTV ILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRPLEHHHHHH (서열번호 40).
항원 발현 작제물 - PCR을 사용하여 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1) M1 단백질의 ORF를 증폭시키면서, Nhe I 부위는 개시 코돈의 원거리에 삽입하고 Not I 부위는 종결 코돈의 원거리에 삽입하였다. 분해된 단편들을 pET-28b(+) (Novagen) 내로 클로닝하여, M1 ORF를 His6 태그와 프레임이 유지되게 배치시켜, His.Flu M1 단백질을 암호화하도록 하였다. 상기 Flu M1 ORF를, Nco I 부위 원거리의 N-말단 단백질 G 전구체 B2 도메인 잔기 298-352 (gi|124267|)에 이어, GGSGGSGGSLD (서열번호 41)을 암호화하는 링커 잔기를 유사한 벡터 속에 배치하였다. 이 벡터는 Q246E 치환이 있는 ProG.Flu M1 단백질을 발현하였다. Nco I과 Nhe I 부위 사이에 삽입된, 씨.써모셀룸 (C. thermocellum)기원의 N-말단 169 잔기 cohesin 도메인을 암호화하는 pET28b (+) 유도체는 Coh.His를 발현하였다. Coh.Flu M1.His의 발현을 위하여, Flu M1 ORF을 상기 유도체의 Nhe I과 Xho I 부위의 사이에 삽입하였다. Coh.PEP.His 발현 작제물을, 이들이 요구된 서열을 암호화하는 합성 DNA를 이용하는 점을 제외하고는, 유사하게 제조하였다. 당해 단백질은, 카나마이신 내성 (40 μg/ml)로 선별하고, 120 mg/L IPTG를 첨가하였을 때 중간 대수 성장기까지 200 회/분으로 진탕시키면서, 37℃에서 성장시킨 이.콜리 (E. coli) 균주 BL21 (DE3) (Novagen) 또는 T7 Express (NEB)에서 발현되었다. 3 시간 후, 세포를 원심분리로 수거하고, -80℃에서 보관하였다. 개시 코돈 대신 Sal I 부위를 삽입하고 벡터 Xho I 부위에 삽입하기 위한 말단 Xho I 부위를 첨가함으로써, ProG 및 Cohesin 절편은 상기 AP 융합 분비 벡터 중의 외부도메인 (ectodomain) 절편을 대체하였다. 외부도메인 절편을 삭제함으로써 "공 (empty)' AP 벡터가 제조되었다. 각각, 이들 작제물은 ProG.AP, Coh.AP 및 AP의 분비를 지시하였다.
재조합 단백질의 발현 및 정제 - 각 1 L 발현액으로부터의 이.콜리 세포를 30 ml 빙냉의 0.1 M NaPO4 pH 7.4 (완충제 A, ProG.Flu M1의 경우), 또는 0.1 ml의 프로테아제 억제제 Cocktail II (Calbiochem)를 함유하는, 50 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0 (모든 다른 단백질의 경우, 완충제 B) 중에 현탁하였다. 세포를 세팅 18 (Fisher Sonic Dismembrator 60)에서 2 x 5 분간 얼음 위에서 초음파처리하고, 5 분간 휴식 시간을 가진 다음, 4℃에서 20분간 17,000 r.p.m. (Sorvall SA-600)으로 회전시켰다. ProG.Flu M1의 경우에, 완충제 A로 평형화된 5 ml Q 세파로스 (Sepharose)를 통해 통과시킨 다음, 5 ml hIgG 비드를 Q 유동-통과물(flow-through)에 첨가하고, 4℃에서 1 시간 동안 혼합하며 항온배양하였다. 비드-결합된 단백질을 50ml 냉 PBS로 세척하고, 2 x 10 ml 0.1 M 글리신 pH 2.7로 용출시켰다. 수집된 용출물을 0.1 M MES pH 5.0 완충제로 pH 5로 만들고, 50 mM MES pH 5.0 (완충제 C)로 평형화시킨 1 ml HiTrap S 칼럼에서 전개시켰다. 칼럼-결합된 단백질을 완충제 C로 세밀히 세척하고, 완충제 C 중의 0 - 1 M NaCl 구배로 용출시켰다. 피크 분획물을 수집하였다. His.Flu M1 정제를 위해, 50 ml 세포 용해물 상청액 분획물을 5 ml Q 세파로스 비드를 통해 통과시키고, 6.25 ml 160 mM Tris, 40 mM 이미다졸, 4 M NaCl pH 7.9를 Q 세파로스 유동 통과물에 첨가하였다. 이를, Ni++로 하전된 5 ml HiTrap 킬레이팅 HP 칼럼 상에 4 ml/분으로 충전하였다. 칼럼-결합된 단백질을 20 mM NaPO4, 300 mM NaCl pH 7.6 (완충제 D)로 세척한 다음, 100 mM H3COONa pH 4.0으로 또다시 세척하였다. 결합된 단백질을 100 mM 내지 1 M H3COONa pH 4.0의 구배로 용출시켰다. 피크 분획물을 수집하고, 100 mM H3COONa pH 4.0으로 평형화된 5 ml HiTrap S 칼럼 상에 4 ml/분으로 충전시키고, 평형 완충제로 세척한 다음, 50 mM NaPO4 pH 7.5로 또다시 세척하였다. 결합된 단백질을 50 mM NaPO4 pH 7.5 중의 0 - 1 M NaCl의 구배로 용출시켰다. 약 500 mM NaCl에서 용출되는 피크 분획물을 수집하였다. His.Flu M1의 제제는, 아마도 C-말단 부분이 소실된, 전체길이가 아닌 생성물을 다양한 양으로 함유하였다. Coh.Flu M1.His 정제를 위하여, 2 L의 배양액으로부터의 세포를 완충제 B를 사용하는 점을 제외하고는, 상기한 바와 같이 초음파처리하였다. 원심분리 후, 2.5 ml의 Triton X114를 상청액에 첨가하고, 빙상에서 5분간 항원배양하였다. 추가로 5분간 25℃에서 항온배양한 후, 25℃에서 원심분리한 다음, 상청액을 Triton X114로부터 분리하였다. 추출을 반복하고, 상청액을 5ml의 Q 세파로스 비드를 통해 통과시키고, 6.25 ml 160 mM Tris, 40 mM 이미다졸, 4 M NaCl pH 7.9를 Q 세파로스 유동 통과물에 첨가하였다. 이어서, 단백질을 상기한 바와 같은 Ni++ 킬레이팅 크로마토그래피로 정제하고, 완충제 D 중의 0-500 mM 이미다졸로 용출시켰다.
키메라 마우스/사람 mAb의 cDNA 클로닝 및 발현 - 전체 RNA를 하이브리도마 세포 (RNeasy 키트, Qiagen)로부터 제조하고, cDNA 합성에 사용하고, 공급된 5' 프라이머 및 유전자 특이적 3' 프라이머를 사용하여 PCR (SMART RACE 키트, BD Biosciences)를 수행하였다:
mIgGκ, 5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3’;(서열번호 42)
mIgGλ, 5’ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc3’;(서열번호 43)
mIgG1, 5’gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3’;(서열번호 44)
mIgG2a, 5' ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3’;(서열번호 45), 및
mIgG2b, 5' ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3' (서열번호 46).
PCR 생성물을 클로닝하고 (pCR2.1 TA kit, Invitrogen), DNA 서열분석으로 특성을 규명하였다. 마우스 H 및 L 쇄 V-영역 cDNA에 대하여 유래된 서열을 사용하면서, 특정 프라이머를 사용하여 시그날 펩타이드 및 V-영역을 PCR 증폭하며, 이때 하류의 사람 IgGκ 또는 IgG4H 영역을 암호화하는 발현 벡터 속에 클로닝하기 위한 플랭킹 제한 부위를 도입하였다. 키메라 mVκ-hIgκ의 발현을 위한 벡터를, Xho I과 Not I 부위로 플랭킹된 잔기 401-731 (gi|63101937|)를 증폭시키고, 이를 pIRES2-DsRed2 (BD Biosciences)의 Xho I - Not I 사이 속에 삽입시키는 방법으로 제조하였다. PCR를 사용하여 개시 코돈으로부터 mAb Vk 영역을 증폭시키고, Nhe I 또는 Spe I 부위에 이어 CACC를 예를 들어 gi|76779294|의 잔기 126를 암호화하는 영역에 추가시키고, Xho I 부위를 추가시켰다. 이어서, PCR 단편을 상기 벡터의 Nhe I - Not I 사이 속에 클로닝하였다. mSLAM 리더를 사용하는 키메라 mVκ-hIgκ용 벡터를 하기 서열
5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag 3'(서열번호: 47)을 상기 벡터의 Nhe I - Xho I 사이 속에 삽입시켜 제조하였다. PCR을 사용하여, 예측된 성숙 N-말단 코돈 (SignalP 3.0 서버를 사용하여 정의함)(Bendtsen, Nielsen et al. 2004)과 (상기 정의한 바와 같은) mVκ 영역의 말단 간의 사이를 증폭시키고, 이때 5' tcgtacgga 3'를 추가하였다. Bsi WI 및 Xho I로 분해된 단편을 상기 벡터의 상응하는 부위에 삽입하였다. 대조군 hIgκ 서열은 gi|49257887| 잔기 26-85 및 gi|21669402| 잔기 67-709에 상응한다. 대조군 hIgG4H 벡터는, 디설파이드 결합 및 폐기 (abrogate) 잔기의 FcR 결합 (Reddy, Kinney et al. 2000)을 안정화시키는 S229P 및 L236E 치환을 보유하며, pIRES2-DsRed2 벡터 Bgl II 및 Not I 부위 사이에 삽입되고, 종결 코돈 대신에 서열 5' gctagctgattaattaa 3' 첨가한 gi|19684072|의 잔기 12-1473에 상응한다. PCR을 사용하여 개시 코돈으로부터 mAb VH 영역을 증폭시키고, CACC에 이어 Bgl II 부위를 gi|19684072|의 잔기 473을 암호화하는 영역에 추가한다. 이어서, PCR 단편을 상기 단편의 Bgl II - Apa I 사이에 클로닝하였다. mSLAM 리더를 사용하는 키메라 mVH-hIgG4용 벡터는, 서열
5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc 3’ (서열번호: 48)을 상기 벡터의 Nhe I - Apa I 사이에 삽입하여 제조하였다. PCR을 사용하여, 예측된 성숙 N-말단 코돈과 mVκ 영역의 말단 간의 사이를 증폭시키고, 5' tcgtacgga 3'을 추가하였다. Bsi WI 및 Apa I로 분해된 단편을 상기 벡터의 상응하는 부위 속에 삽입하였다.
종결 코돈 다음에 근거리 Nhe I 부위 및 원거리 Not I에 의해 플랭킹된 서열을 암호화하는 다양한 항원을 H 쇄 벡터의 Nhe I - Pac I - Not I 사이 속에 삽입하였다. Flu HA1-1은, 근거리 서열 5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa 3' (서열번호 49) (Nhe I 부위에 이어, cipA cohesin-cohesin 링커 잔기를 암호화하는 서열이 따름) 및 원거리 서열 5'caccatcaccatcaccattgagcggccgc 3' (서열번호 50) (His6, 종결 코돈 및 Not I 부위를 암호화함)를 가진 인플루엔자 A 바이러스 (A/Puerto Rico/8/34(H1N1)) 헤마글루티닌 gi|21693168| 잔기 82-1025 (C982T 치환 포함)에 의해 암호화되었다. Flu HA5-1은, Flu HA1-1과 동일한 서열에 의해 결합된, gi|50296052| 인플루엔자 A 바이러스 (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) 헤마글루티닌 잔기 49-990에 의해 암호화되었다. Doc는 근거리 Nhe I 및 원거리 Not I 부위를 가진 gi|40671| celD 잔기 1923-2150에 의해 암호화되었다. PSA는, 근거리 서열 5' gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaacaccgacaacaacacttctagcgc 3' (서열번호 51) (Nhe I 부위 및 cipA 스페이서) 및 원거리 Not I 부위를 가진 gi|34784812| 전립선 특이적 항원 잔기 101-832에 의해 암호화되었다. Flu M1-PEP는 5'gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcgaacgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggccgc 3'(서열번호 52)에 의해 암호화되었다. 상기 및 다른 모든 펩타이드-암호화 서열은, Nhe I 및 Not I-제한된 H 쇄 벡터, 또는 Nhe I - Xho I-제한된 Coh.His 벡터 속으로 클로닝하는데 적합한 말단을 가진 상보적 합성 DNA 단편의 혼합물을 통해 생성되었다. 바람직한 사람 코돈은, 제한 부위가 도입될 필요가 있거나 CipA 스페이서 서열 중에 있는 경우를 제외하고는, 항상 사용되었다.
rAb 발현 작제물의 생성 수준을, 각각의 L-쇄 및 H-쇄 작제물 약 2.5 μg을 사용하여 상기한 프로토콜에 따라 5 ml의 일시적 형질감염물 중에서 시험하였다. 상청액을 항-hIgG ELISA (AffiniPure 염소 항-사람 IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch)에 의해 분석하였다. 이러한 프로토콜의 시험 중에, 분비된 rAb의 생성은, 각 DNA 농도의 약 2배를 넘는 경우 (즉, 당해 시스템이 DNA 포화된 경우), H 쇄 및 L 쇄 벡터 농도와 무관하였다.
CD34-DC의 생성 - 5일 동안 재조합체 G-CSF (Neupogen) 10 U/kg/일을 피하로 투여받은 건강한 정상 제공자 말초혈액으로부터 CD34+ HPC를 집결시켜 수집하였다. CD34+-HPC는 CEPRATE SC 줄기 세포 농도 시스템 (ISOLEX)를 사용하여 수득하였다. CD34-DC는, 5% 자가 혈청, 50 μM 2-β-머캅토에탄올, 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 사이토카인; GM-CSF (50 ng/ml; Immunex Corp.), FLT3-L (100 ng/ml; R&D), 및 TNF-α (10 ng/ml; R&D)가 보충된 이셀(Yssel) 배지 (Irvine Scientific, CA)에서 0.5 x 106/ml의 농도로 배양시킴으로써, 생성되었다. 세포를, 배양 5일째에, 사이토카인이 보충된 신선한 배지로 옮기고, 9일째에 수거하였다.
CD34-DC의 분류 - 배양 9일째에 CD34-유래된 DC를 수거하고, 항-CD1a FITC (Biosource International) 및 항-CD14 PE (BD Biosciences)으로 염색하였다. CD1a+CD14--LC 및 CD1a-CD14+-intDC를 FACS VantageTM (BD Biosciences)로 분류하였다. 순도는 통상적으로 95-99%였다.
자가 CD8+ T 세포의 정제 - 자가 CD8+ T 세포를, CD14, CD19, CD16, CD56 및 CD4 비드에 의한 고갈 후, CD8 자기 비드 (Miltenyi)를 사용하여 동일한 제공자로부터 수득된 PBMC로부터 양성 선별하였다. 일부 실험에서는, 기억 CD8+ T 세포가 CD8+CCR7-CD45RA-로 분류되었다.
CD34-DC 서브세트에 의한 Flu M1 단백질의 CD8+ T 세포로의 교차 제시 (cross-presentation) - HLA-A2 제공자로부터 유래된 벌크 (bulk) 또는 분류된 CD34+DC 서브세트, CD1a+ LC 또는 CD14+ IntDCs (5 x 104 세포/ml)를, 10% 열-불활성화된 수집된 AB 사람 혈청, 10 U/ml IL-7 (R&D), 및 항-DC 항체에 가교결합된 Flu M1의 감소 용량이 보충된 이쎌 (Yssel) 배지 중에서, 정제된 자가 CD8+ T 세포 (1 x 106 세포/ml)와 함께 배양하였다. CD40L를 24 시간 후에 배양물에 첨가하고, IL-2를 3일 후에 첨가하였다. 교차 제시 효율은, 특이적 Flu M1, HLA-A201/pMI, 피코에리트린 (phycoerythrin)-접합된 iTAg MHC 4량체 (Beckman Coulter)을 사용하여, 항원-특이적 CD8+ T 세포 증식 수준을 분석하여, 8 또는 10일 후에 평가하였다.
항-사람 DCIR 모노클로날 항체의 개발 - 수용체 외부도메인.hIgG (사람 IgG1Fc) 및 HRP (서양고추냉이 퍼옥시다제) 융합 단백질을, 마우스의 면역화 및 mAb의 스크리닝을 위하여, 각각 생성하였다. hDCIR 외부도메인.IgG에 대한 발현 작제물은 이미 기술되었고 (Bates, Fournier et al. 1999), 마우스 SLAM (mSLAM) 시그날 펩타이드를 사용하여 분비를 유도하였다 (Bendtsen, Nielsen et al. 2004). hDCIR 외부도메인.AP를 위한 발현 벡터는, PCR을 사용하여 AP 잔기 133-1581 (gb|BC009647|)를 증폭시키고, 근거리, 프레임-유지 (in-frame) Xho I 부위 및 원거리 TGA 종결 코돈 및 Not I 부위를 첨가시켜, 생성시켰다. 이러한 Xho I - Not I 단편은 상기 hDCIR 외부도메인.IgG 벡터 내의 IgG 암호 서열을 대체하였다. 상기 DCIR.HRP 융합 단백질 벡터를, 상기 정의한 바와 같은 DCIR-외부도메인-암호 영역의 원거리에 gi |208493| 잔기 14-940을 클로닝시킴으로써 생성시켰다.
포유동물 세포로부터 분비된 재조합 단백질의 발현 및 정제 - 융합 단백질을, 제조업자의 프로토콜 (형질감염물 L 당 293 Fectin 시약 1.3 ml를 함유하는 전체 플라스미드 DNA 1 mg)에 따라 FreeStyleTM 293 Expression System (Invitrogen)을 사용하여 제조하였다. 재조합 항체 (rAb)의 제조를 위하여, H 및 L 쇄를 암호화하는 동량의 벡터를 공동-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 3일 동안 배양하고, 배양 상청액을 수거하고, 신선한 배지를 첨가하고, 2일 동안 항온배양을 계속하였다. 수집된 상청액을 여과로 정화시켰다. 수용체 외부도메인.hIgG를, 0.1 M 글리신 pH 2.7로 용출시키는 HiTrap 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제한 다음, PBS에 대하여 투석시켰다. rAb를 HiTrap MabSelectTM 칼럼을 사용하여, 유사하게 정제하였다.
모노클로날 항체의 생성 - 마우스 mAb를 통상의 세포 융합 기법에 의해 생성시켰다. 간략하게, 6주령의 BALB/c 마우스를, Ribi 애주번트와 함께 20 μg의 수용체 외부도메인.hIgGFc 융합 단백질을 복강내 투여하여 면역화시킨 다음, 10일 및 15일 후에 20 μg 항원으로 추가접종하였다. 3 개월 후, 마우스를 비장을 채취하기 3일 전에, 다시 추가접종하였다. 달리, 30 내지 40일의 기간에 걸쳐서 3 내지 4일 마다 Ribi 애주번트와 함께 1 내지 10 μg의 항원을 마우스에게 족저(footpad) 주사하였다. 최종으로 추가접종하고 3 내지 4일 후, 배농 (draining) 림프절을 수거하였다. 비장 또는 림프절로부터의 B 세포를 통상의 기법을 사용하여 SP2/O-Ag 14 세포와 융합시켰다 (Shulman, Wilde et al. 1978). ELISA를 사용하여, 융합 파트너 단독과 비교된 수용체 외부도메인 융합 단백질에 대하여, 또는 AP에 융합된 수용체 외부도메인에 대하여, 하이브리도마 상청액을 스크리닝하였다 (Bates, Fournier et al. 1999). 이어서, 전체 길이의 수용체 cDNA를 암호화하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 293F 세포를 사용하여, 양성 웰을 FACS 중에서 스크리닝하였다.
항-DCIR mAb의 개발을 위하여, 1000개의 하이브리도마 클론으로부터의 상청액을 스크리닝하였다:
90개는 DCIR.Ig 대 Ig ELISA 상에서 양성이었다.
64개는 FACS에 의해 DCIR-293 세포 상에서 양성이었다.
62개의 FACS 양성은 ELISA 양성이었다.
2개는 293 양성이었다 (따라서, DCIR에 특이적이지 않다)
사람 DC에 의한 사이토카인 생성을 자극하는 항-DCIR mAb에 대한 생물학적 스크린 - DC-표적화 목적으로, 항원을 DC로 전달하고, 동시에 DC를 활성화하여 전달된 항원에 대해 보호적 면역 반응을 자극하는 항체를 갖는 것이 잠재적으로 바람작하다. 따라서, 본원의 발명자들은 62개의 FACS 양성 항-DCIR 하이브리도마 상청액의 패널을 DC 자극 활성에 대하여 직접적으로 스크리닝하였다. CD34+-유래된 사람 DC를 24 시간 동안 상기 하이브리도마 상청액과 함께 배양하고, 당해 DC 배양 상청액을 24 시간 후에 케모카인 MCP-1의 존재에 대하여 분석하였다. 아래의 도면은, 전부는 아니지만 다수의 하이브리도마 상청액이, 대조군에 비해 MCP-1의 특이적 생성을 유도하였음을 보여준다.
상기 도면에서 별표로 표시된 선별된 하이브리도마 (거의 전부 MCP-1 생성을 자극함)는 단일 세포로 클로닝되고, CELLine 플라스크 (Intergra) 내에서 증대되었다. 하이브리도마 상청액을 동량의 1.5 M 글리신, 3 M NaCl, 1x PBS, pH 7.8와 혼합하고, MabSelect 수지와 텀블링(tumbling)시켰다. 당해 수지를 결합 완충제로 세척하고, 0.1 M 글리신, pH 2.7로 용출시켰다. 2 M Tris로 중화시킨 후, mAb를 PBS에 대하여 투석하였다.
순수한 항-DCIR mAb의 특징 - 먼저, 순수한 mAb를 ELISA (플레이트에 결합된 DCIR.Ig를 HRP-접합된 항-사람 Fc 시약으로 나타나게 함)로 시험하고, DCIR.HRP 포획 분석 (플레이트에 결합된 mAb를 DCIR.HRP 융합 단백질로 나타나게 함)으로 시험하였다. 도 2는 플레이트에 결합된 DCIR과 mAb의 고 친화적 상호작용을 보여주는 대표적 분석 결과를 제시한다 (결합의 특이성을 보여주는 대조군은 제시되지 않음). DCIR.HRP 포획 분석에서, (전부는 아니지만) 여러 mAb가 가용성 DCIR.HRP를 플레이트 표면에 포획할 수 있었다. 이들 데이터는 선별된 항-DCIR mAb의 패널이 일정 범위의 DCIR 결합 친화성 및 특성을 지녔음을 보여준다.
또한, 순수한 mAb를, 먼저 전체 길이의 DCIR를 암호화하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 293 세포에 대한 FACS 반응성을 시험하고, 이어서, 다양한 유형의 생체외 배양된 사람 DC에 대한 FACS 반응성을 시험하였다. 아래의 도면은 DCIR 293 세포에 대한 FACS 분석에서 적정된 mAb의 대표적 세트를 보여준다 (대조군 세포는 음성이였다).
도 3은 CD14+ 및 CD1a+ 아유형의 CD34-유래된 사람 DC가 세포 표면 DCIR을 발현함을 보여준다. 이들 두 종의 DC 아유형이 체액 면역반응 대 세포용해 면역반응을 유도하는데 완전히 상이한 역할을 하므로, 상기 두 종의 아유형 상에 DCIR이 존재한다는 것은, DCIR을 통해 사람 DC에 표적화된 항원이 두 가지 유형의 면역을 유도하여야 한다는 것을 암시한다 - 이는 예를 들어 바이러스 감염에 대해 유도된 백신의 중요한 특징이다.
도 4는 DCIR이 또한 사람 피부로부터 직접 분리된 3종의 사람 DC 아유형 상에 발현된다는 것을 보여준다. 이러한 관찰은, DCIR 항원 표적화 백신의 경우에, 이들 DC 유형이 모두 상기 수용체를 발현하기 때문에, 피부로 투여하는 것이 유리하다는 것을 보여준다. 이들 DC 유형은 상기 배양된 사람 DC와, 이들의 면역 유도 특성 면에서, 유사하므로, DCIR-보유 피부 DC를 통한 항원 표적화가 바람직한 혼합 면역 반응을 유도하는데 유리하다는 것은 공지되었다.
피부 DC 및 LC를 정상 사람 피부 표본으로부터 정제하였다. 당해 표본을 세균성 프로테아제 디스파제 제2형 중에서, 18 시간 동안 4℃에서, 이어서 2 시간 동안 37℃에서 항온배양하였다. 이어서, 표비와 진부 층을 분리하고, 작은 조각 (약 1 내지 10 mm)으로 자르고, 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 보충한 RPMI 1640 속에 넣었다. 2일 후, 배지로 이동된 세포를 수집하고, Ficoll-디아트리조에이트 구배, 1.077 g/dl를 사용하여 추가로 증균시켰다. 항-CD1a FITC 및 항-CD14 APC mAb로 염색한 후 세포 분류에 의해 DC를 정제하였다.
다른 사람 조직 중의 DCIR의 존재. 도 5는 사람 편도선 내의 배중심 주변의 세포 집단의 DCIR-특이적 염색을 보여준다. 이들 세포는 내재하는 DC이거나, 또는 예컨대, 외래 항원을 가하여 활성화시킨 후에 이 부위로 최근 이동된 DC일 수 있다. 상기 염색은, 면역성이 발생한 기관으로의 접근을 허용하는 피부 이외의 경로로 DCIR-표적화된 백신을 투여하는 것이 면역 반응을 일으키는데 또한 유리하다는 것을 보여준다.
사람 DC로 항원을 표적화하는 항-DCIR mAb의 이용. 제조업자의 프로토콜에 따라 6-[3'(2-피리디닐디티오)-프로피온아미도]헥사노에이트 (설포-LC-SPDP; Pierce)을 사용하여, Flu M1 단백질을 mAb에 화학적으로 가교결합시켰다. 당해 다중-단계 프로토콜은, 실온에서 30분 동안의 SPDP의 NHS 에스테르 그룹을 통한 아민의 변형에 의한 mAb의 활성화에 이은, PBS에 대한 투석을 포함한다. 후속적으로, 두 개의 설프하이드릴 그룹을 함유하는 Flu M1 단백질을 첨가하고, 실온에서 밤새 항온처리하였다. 가교결합 반응의 효율은, mAb에 대한 반응 전의 Flu M1 단백질의 양을 가교결합 후의 mAb/Flu M1 비와 비교하여, 평가하였다. 본원의 발명자들은, 평균적으로, mAb 50%가 하나의 Flu M1 분자에 반응하였다고 계산하였다. 도 6 및 도 7은, DCIR에 대한 가교결합-Flu M1 단백질 및 mAb의 예를 보여준다. 환원된 SDS-PAGE를 통한 분석은, Flu M1 / H 쇄의 염색의 비에 근거한 mAb 당 1-2 Flu M1를 가진 생성물을 확인하였고, 이들 제제는 시험관내 연구에서 사용되었다. 비-환원된 SDS-PAGE 분석 (아래의 두 번째 도면은 복합체가 주로 Flu M1과 단일 mAb 간에 이루어짐을 보여주며, 이는 매우 큰 복합체의 낮은 %에 의해 입증되는 바와 같다).
도 6은 항-DCIR_2C9 mAb에 대한 Coh.Flu M1의 가교결합을 보여준다. 단백질 G 세파로스 친화성에 의해 정제된 가교결합된 생성물의 환원된 SDS-PAGE 분석. 왼쪽으로부터 오른쪽은 2.5 μg, 1 μg Coh.Flu M1, 및 Coh.Flu M1과 mAb의 1:1, 2:1, 4:1 비의 반응으로부터의 10 μg 생성물이다.
도 7은 mAb에 대한 His.Flu M1의 가교결합을 보여준다. 단백질 G-세파로스 친화성에 의해 정제된 가교결합된 생성물의 비-환원된 SDS-PAGE 분석. 왼쪽으로부터 오른쪽은 5 ㎍, His.Flu M1, 이어서, 5 ㎍ mAb (항-CD1a_OKT6, 항-LANG_2G3, 항-DCIR_2C9)와, 5㎍ His.Flu M1와 반응된 5 ㎍ mAb의 쌍.
Flu M1 단백질에 가교결합된 항-Dc 수용체 mAb는 항원을 사람 DC에 효과적으로 표적화한다 - 항-DC 수용체 mAb는 Flu M1 단백질에 화학적으로 가교결합되었고, 다양한 용량을 사람 CD34-유래된 CD1a+ DC와 자가 CD8+ T 세포의 공동-배양물에 첨가하였다. DC 활성화를 위해 24 시간 후에, 상기 배양물에 CD40L를 첨가하고, 이어서, T 세포 증식을 위해 3일째에 IL-2를 첨가하였다. 8 내지 10일 후에, Flu M1 펩타이드 GILGFVFTL (서열번호 53)에 특이적인 T 세포를 MHC 4량체 분석으로 평가하였다. 도 8은 항-DCIR mAb에 가교결합된 Flu M1이 Flu M1-특이적 세포의 증식을 유도하였으며, 한편, 비-가교결합된 Flu M1 및 mAb을 유사한 용량으로 사용하였을 때, 현저하게 감소된 Flu M1-특이적 세포의 증식이 관찰되었음을 보여준다. 용량-범위는, 가교결합된 mAb가 유리 Flu M1 보다 적어도 50배 더 효과적으로 반응을 유도하였음을 보여준다. 이러한 데이터는 항원-표적화, 즉 면역반응의 강화작용 - 이 경우에 특이적 Flu M1 에피토프의 기억을 가진 T 세포의 회상을 입증한다. CD34-DC는 CD1a+LC 또는 CD14+IntDC 서브세트로 분류되었다. 도 9는, 두 세포 유형 상의 DCIR 발현 수준이 유사하더라도, 항-DCIR-표적화된 CD1a+LC가 Flu M1-특이적 CD8+ 세포의 증대를 유도하는데 훨씬 더 강력하다는 것을 보여준다
도 8은 항-DCIR-mAb에 가교결합된 Flu M1이 mAb에 결합되지 않은 Flu M1 단백질 보다 더 효과적으로 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포의 증대를 유도함을 보여준다. CD34-유래된 CD1a+ DC를 CD8+ T 세포 및 표시된 농도의, His.Flu M1에 가교결합된 항-DCIR_2C9 mAb 또는 결합되지 않은 mAb와 함께 항온배양하였다. 이어서, CD8+ T 세포를 Flu M1-특이적 증대에 대하여 분석하였다. 내부 박스는 4량체-특이적 CD8+ T 세포의 %를 나타낸다.
도 9는 항-DCIR mAb에 가교결합된 Flu M1이 Int-DC보다 더 효과적으로 LC를 통하여 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포의 증대를 유도함을 보여준다. HLA-A2 제공자로부터의 LC 또는 Int-DC 및 자가 CD8+ T 세포를 표시된 농도의, His.Flu M1에 가교결합된 항-DCIR_2C9 mAb와 함께 공동-배양하였다. 교차-제시 효율은 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포의 빈도로 평가하였고, HLA-A201/pMI 4량체로 분석하였다. 내부 박스는 4량체-특이적 CD8+ T 세포의 %를 나타낸다.
표준 항원-표적화 백신으로서 재조합 항-DCIR mAb의 개발. 마우스 하이브리도마-암호화된 H 및 L 쇄 가변 (V) 영역 및 사람 Igκ 또는 사람 IgG4H 불변 (C) 영역의 키메라인 분비된 항-DC 수용체 rAb를 일시적으로 형질감염된 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 벡터를 개발하였다. 상이한 특이성 (즉, 상이한 항-DCIR 하이브리도마 기원)을 가진 항-DC 수용체 mAb의 L 및 H 쇄의 V 영역을 cDNA 클로닝하고, DNA 서열 분석으로 특성을 규명하고, 이를 조작하여 이들 벡터 속으로 넣었다. 도 10은 수많은 상이한 항-DCIR mAb에 상응하는 키메라 마우스-사람 rAb를 암호화하는 상기 H+L 쇄 벡터를 293 세포 중에 공동-형질감염시키고, 항-사람 FC ELISA를 이용하여 배양 상청액 속으로의 rAb의 분비에 대하여 분석한 결과를 보여준다.
항-DCIR rAb는, rAb H 쇄와 프레임이 일치하는 약 9.5 kDA dockerin를 암호화하였다. dockerin 도메인 (rAb.Doc로 불림)의 목적은 특이적 [rAb.Doc:Coh.항원] 복합체의 어셈블리를 허용하는 것이다. 이 경우에, Coh.항원은 약 17.5 kDa cohesin 도메인과 항원 간의 융합 단백질을 말한다. cohesin과 dockerin 간의 고 친화적 상호작용은, 본원의 발명자들이 보여준 바와 같이, 수용체 특이성을 지닌 DC의 표면으로 항원을 전달하는 정의된 복합체를 어셈블리하는데 사용된다. 예를 들면, 아래의 도면은 사람 DC의 표면에 결합된 [항-DCIR.Doc:Coh.Flu M1] 복합체를 보여준다 (본원에서, Coh.Flu M1은 비오티닐화되고, 세척 단계 후 세포 표면 상에서 검출된다). 대조군 rAb.Doc:Coh.Flu M1 복합체 (아래의 도면에서 적색으로 표시됨)은 스트렙타비딘-PE 검출 시약 단독보다 조금도 더 결합하지 못하였다.
DCIR은 느린 반응속도 (kinetics)로 항원을 내화시키며, 이는 다른 DC 수용체와 구별된다. DC-SIGN과 같은 DC 수용체는 내화의 신속한 반응속도라는 특징을 가진다. 예를 들면, 도 11은 항-DC-SIGN/L.Doc는 Alexa-표지화된 Coh.Flu M1을 GM-CSF/IFN 배양된 사람 DC 속에 빠르게 내화시킨다 - 대부분의 표지는 15분 이내에 세포 속에 내화된다. 대조적으로, 항-DCIR.Doc는 Coh.Flu M1을 매우 천천히 내화시킨다 - 3 시간째에, 상당량의 내부 항원 및 세포 표면 항원이 존재한다. 이 결과는 DCIR을 느린 내화 DC 수용체로 분류하는데, 이는 "MMR 로 관철된 빠른 반응속도론과 달리, 가교결합 후, DCIR 이 단핵구- 및 CD34 - 유래된 DC 에서 유일하게 천천히 그리고 약하게 내화되었다 (데이터는 제시 안됨). 이러한 발견은 수용체- 매개된 세포내이입에 의한 Ag 포획이 DCIR 의 주기능이 아님을 암시한다"라는 것을 제시한 베이트 등 (Bates et. al.)의 결론과는 상반된다.
도 11은 항-DCIR.Doc rAb에 결합된 Coh.Flu M1이 GM/IL-15 사람 DC에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다. 단핵구-유래된 GM-CSF/IL-15 배양된 사람 DC를, 비오티닐화된 Coh.Flu M1의 4배 몰 과량과 1 시간 동안 미리 혼합된, 표시된 농도의 항-DCIR.Doc rAb와 항온배양하였다. 1 시간 후, 세포를 세척하고, 스트렙타비딘-PE와 항온배양하였다. 또다시 세척한 후, 세포를 FACS로 분석하여 세포-결합된 PE를 검출하였다. 녹색 플롯은 항-DCIR.Doc rAb이고, 적색 곡선은 대조군 IgG4.Doc 복합체이다.
도 12는 항-DC-SIGN/L.Doc 또는 항-DCIR.Doc rAb에 결합된 Coh.Flu M1이 GM-CSF/IL-4 사람 DC에 결합하여, 그 속으로 내화된다는 것을 보여준다. 단핵구-유래된 GM-CSF/IL-4 배양된 사람 DC를, Alexa-표지화된 Coh.Flu M1의 4배 몰 과량과 1 시간 동안 미리 혼합된 항-DCIR.Doc 또는 항-DC-SIGN/L.Doc rAb와 함께 항온배양하였다. 빙상에서 1 시간 후에, 세포를 세척하고, 37℃에 두었다. 공초점 현미경을 사용하여, 세포-결합된 항원 (적색으로 표시)의 세포 위치를 분석하였다. 녹색은 세포막-결합된 액틴을 표시한다.
Coh.Flu M1의 DCIR.Doc을 통한 사람 DC로의 표적화는 DCIR을 백신 개발 목적에 뛰어난 수용체로서 확인한다. Flu M1 항원의 느린-내화 DCIR 수용체를 통한 사람 DC로의 표적화를 빠른-내화 ASGPR 및 LOX-1 수용체를 통한 표적화와 비교하였다. 모니터된 면역 반응은 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포의 증대를 보여주었다. 그 결과는 DCIR을 통한 표적화는 LOX-1 또는 ASGPR를 통한 표적화 보다 훨씬 더 효과적이라는 것을 보여준다. 유사한 실험에서, DCIR을 통한 표적화의 우수성은, CD8+ T 세포와 배양하기 전에 DC를 세척하여 잔사 [rAb.Doc:Coh.항원]을 제거했을 때, 더욱 더 분명해졌다. 이러한 상황은, 표적화된 DC가 투여된 잔여 항원으로부터 멀리 이동하여 배농 림프절 내의 T 세포와 만나는 생체내 상황과 흡사한 것 같다.
도 13은 항-DCIR.Doc:Coh.Flu-복합체가 다른 [항-DC 수용체 rAbs.Doc:Coh.Flu M1]보다 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포를 증대시키는데 효욜적이라는 것을 보여준다. CD34-유래된 CD1a+ DC를, CD8+ T 세포, 및 8 nM (상부 패널) 또는 0.8 nM (하부 패널)의 [항-DCIR_2C9.Doc:Coh.Flu M1], 항-LOX1_15C4.Doc, 항-ASGPR_49C11.Doc 또는 IgG4.Doc 대조군 rAb (이들 각각은 Coh.Flu M1와 복합체를 형성한다)와 공동-배양하였다. 이어서, CD8+ T 세포를 Flu M1-특이적 증대에 대하여 분석하였다. 내부 박스는 4량체-특이적 CD8+ T 세포의 %를 나타낸다.
도 14는 1일 동안 투여된 항-DCIR.Doc:Coh.Flu 복합체가 다른 [항-DC 수용체 rAbs.Doc:Coh.Flu M1] 복합체보다 Flu M1-특이적 CD8+ T 세포를 증대시키는데 더 효율적이라는 것을 보여준다. 연구 조건은, 자가 CD8+ T 세포를 첨가하기 1일 전에 DC를 세척하는 점을 제외하고는 상기 도면에서와 같았다. 일부 항-DCIR V 영역은 rAb H 쇄 C-말단에 융합된 중요한 항원의 분비에 특히 적합하였다.
도 15는 rAb H 쇄의 C-말단에 융합체로서 발현된 각종 항원이 rAb.항원의 분비에 관해 고유 효과를 지니고 있음을 보여준다. 이 경우에, 동일한 항원 암호 영역이, 두 개의 상이한 마우스 V 영역 특이성을 가진 키메라 hIgG4 rAb 상에 조작되어 도입되었다. 이들 발현 작제물을 적당한 L 쇄 마우스 V-영역 - hIgk 작제물과 함께, 293F 세포 속으로 공동-형질감염시키고, 3일 후 rAb의 분비를 평가하였다. 일부 rAb 항원은 발현되었으며, (Flu HA5-1을 포함하여) 다른 것들은 매우 저조하게 발현되었다. 각 항원이 rAb 관련 분비에 영향을 미치는 고유의 생화학적 특성을 가진다는 것이 기대된다. 실제로, 시험된 두 개의 V 영역 특이성과 관련된 발현에 대해 현저하게 유사한 효과가 존재한다.
Flu HA5는 조류 인플루엔자에 대한 백신 개발에서 고려할 중요한 항원이다. 도 16은 상이한 항-DCIR V 영역 (상이한 항-DCIR mAb로부터 기원)이 목적하는 항-DCIR.Flu HA5 백신의 분비에 크게 영향을 준다는 예상치 못한 발견을 보여준다. 아래에 제시된 실시예에서, DCIR_25A4는, 다른 DCIR V 영역과 비교했을 때, 이러한 유형의 백신의 분비에 특히 적합하다.
도 16은 항-DCIR.Flu HA5 rAb가 가변 영역의 성질에 따라 다양한 효율로 분비된다는 것을 보여준다. H 쇄 C-말단을 통해 Doc (청색 원) 또는 HA5-1 (적색 삼각형)에 융합된 키메라 마우스 V 영역 및 사람 C 영역을 암호화하는 H 및 L 쇄 발현 플라스미드를 293 세포 속에 형질감염시키고, 3일 후, 상청액의 희석액을 ELISA로 IgGFc에 대해 분석하였다. DCIR_2C9을 제외하고는, rAb.Doc가 일반적으로 잘 발현되었다. 그러나, rAb.HA5-1의 발현은 매우 다양하다.
rAb.HA5-1의 분비를 유리하게 하는 항-DCIR 25A4 V-영역의 독특한 특성은 청구항 제5항의 적용을 설명한다. 이는, 특정 V-영역이 rAb.항원의 분비에 영향을 줄 수 있다는 본 발명을 토대로 한다. 이는 rAb 융합 단백질과 관련하여 특정 항원의 본래의 저조한 분비가 분비에 적합한 것들에 대한 원하는 조합 특이성을 가진 상이한 V 영역을 스크리닝함으로써 극복될 수 있다는 것을 의미한다. 이는 임의의 분비된 rAb.융합 단백질에 대한 새로운 일반적 원리로서 주장된다.
항-DCIR은 HIV 특이적 CD8+T 세포의 초회감작을 증강시킨다. 도 17은 항-DCIR mAb가 초회감작을 증강시키는 수지상 세포에 특정 작용, 즉 펩타이드의 섭취, 및 당해 펩타이드 항원에 특이적인 T 세포에 대한 표면 MHC 상에서의 이의 제시를 나타낸다는 것을 보여준다. 당해 실시예는, 항-DCIR mAb와 CD40L과 함께 DC를 자극하는 것, 즉 동족 T 세포에 의해 통상적으로 전달된 공지된 DC 활성화 신호가, DC 배양물에 첨가된 면역우세 HIV gag 펩타이드에 특이적인 CD8+ T 세포의 수를 크게 증가시켰음을 보여준다. 이러한 특성은 항-DC 수용체 rAb 백신을 통한 성공적인 항원 표적화를 예고하는 것이고, 항-DCIR.항원 백신이 뛰어날 것이라는 것을 암시한다.
도 17은 항-DCIR mAb가 HIV 항원-특이적 CD8+ 세포의 초회감작을 증강시킨다는 것을 보여준다. 정제된 전체 CD8+ T 세포 (2 x106 세포/웰)를 자가 IFN-DC (1 x 105 세포/웰), 및 HLA-A201-제한된 HIV 펩타이드 pol (pol476 -484 ILKEPVHGV (서열번호 54), pol293 -302 KYTAFTIPSI (서열번호 55)), 및 gag (gag77-85, SLYNTVATL (서열번호 56), gag151 -159, TLNAWVKVV(서열번호 57)) (5 μM)로 자극하였다. PBS pH 9.6으로 희석하고 세밀히 세척한 대조군 모노클로날 항체 또는 항-DCIR mAb 5㎍/웰로 4c에서 밤새 예비-피복한 24웰 플레이트에서, 9일 동안 세포를 배양하였다. 세포를, 10% 사람 AB 혈청, 10 U/ml IL-7 (R&D) 및 100 ng/ml CD40L (R&D)을 보충한 이쎌 (Yssel) 배지에서 배양하였다. IL-2를 3일째에 10 U/ml로 첨가하였다. 펩타이드-특이적 CD8+ T 세포의 증대를, 배양기간의 말기에 펩타이드/HLA-A201 4량체 (Beckman Coulter)에 결합하는 세포의 수를 계수하여 판정하였다.
항-DCIR mAb은 교차 초회감작 (cross priming)을 증진시킨다. 도 18은 항-DCIR mAb이 교차 초회감작을 증진시키는 수지상 세포에 특정 작용, 즉 단백질의 섭취 및 이의 정확한 프로세싱 및 표면 MHC 상에의 제시 (이는 항원-유래된 펩타이드에 특이적인 T 세포의 증대에 의해 측정됨)를 나타냄을 보여준다. 당해 실시예는 항-DCIR mAb와 CD40L과 함께 DC를 자극하는 것, 즉 동족 T 세포에 의해 통상적으로 전달되는 공지된 DC 활성화 신호가, DC 배양물에 첨가된 Cohesin-MART-1 융합 단백질로부터의 면역우세 MART-1 에피토프에 특이적인 CD8+ T 세포의 수를 크게 증가시켰음을 보여준다. 이러한 특성은 항-DC 수용체 rAb 백신을 통한 항원 표적화에 매우 바람직하며, 항-DCIR.항원 백신이 뛰어날 것이라는 것을 암시한다.
도 18은 항-DCIR mAb이 HIV 항원-특이적 CD8+ 세포의 초회감작을 증가시킴을 보여준다. coh.MART-1펩타이드 융합 단백질이 펩타이드를 대체하는 점을 제외하고는 상기 도면의 방법은 이전의 도면의 것과 동일하다.
본 명세서에서 논의되는 모든 양태는 본 발명의 임의의 방법, 키트, 시약 또는 조성물을 고려하여 수행될 수 있으며, 반대의 경우도 마찬가지이다. 더구나, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
도 19는 사람 상피 층 내의 DCIR 분포의 면역조직화학 분석을 보여준다. DR-FITC 염색은 녹색으로 보이고, PAB269 (DCIR)-568은 적색으로 보인다. 상부 우측 패널은 포개진 이미지를 보여준다. 청색 염색은 세포 핵에 대한 DAPI이다. 디지탈 영상화 @ 40x. 세포 형태 및 DR 염색은 상피 랑게르한스 세포의 특징이다. 따라서, 당해 분석은 랑게르한스 세포 상의 DCIR 발현을 밝혀내었으며, 이는 예를 들어 벗겨진 피부에 적용된 항-DCIR.항원 접합체를 섭취하는데 있어서의 DCIR의 유용성을 강조한다. 따라서, 이들 데이터는 애주번트를 통한 DC 활성화와 관련된 랑게르한스 세포의 항원 섭취가 표적화된 항원에 대한 강력한 세포 반응을 초래할 것이라는 것을 보여준다.
도 20A 내지 20D는 DCIR 항원에 대한 모노클로날 항체, 구체적으로 DCIR에 대한 친화성을 보여준다.
DCIR 항원의 고정화: DCIR 항원을 1차 아민을 통해 AKT_iv 공유결합 센서 표면에 고정시켰다 (10 mM 아세트산나트륨, pH 5.5 중의 50 ㎍·mL-1). 카복실레이트 표면을 EDC와 NHS의 혼합물을 사용하여 활성화시키고, DCIR을 모두 4개의 채널에 연결시겼다. 최종적으로, 모든 잔존 카복실레이트 그룹을 전매 차단체를 사용하여 탈활성화시켰다.
HBS 중의 4개의 항- DCIR 항체의 친화성 측정: 4개의 항-DCIR 항체의 친화성을 측정하기 위하여, 각 항체의 일련의 희석물을 10 내지 0.3125 μg mL-1로부터 제조하고, 고정된 DCIR 항원에 대해 180초 동안 똑같이 주사하였다. 샘플 주사물 사이에 표면을 100mM 염산의 2회 60초 주사하여 재생하였다. 바이오센서 측정을 Akubio 음향 바이오센서로 수행하였다.
고정된 DCIR 항원과 4개의 모노클로날 항체의 상호작용으로부터 계산된 반응속도 파라미터
항체 Ka (M-1s-1 x 105) Kd (s-1 x 10-4) KD (pM)
하이브리도마 항-DCIR24A5.4A5 2.07 1.15 560
rAb 항-DCIR24A5.4A5.DocVar1C377 2.38 3.26 1370
하이브리도마 항-DCIR29E9.2E2 5.56 4.70 850
rAb 항-DCIR29E9.2E2.DocVar1C409 1.50 2.90 1940
표 1은 두 개의 바람직한 항-DCIR 모노클로날 항체 24A5 및 9E8의 고 친화성 DCIR 외부도메인 결합 특성을 보여주며, 상기 유래된 마우스 가변 영역은, 사람 IgG4 본체에 이식되면, 주로 고 친화성 결합 특성을 유지한다는 것을 입증한다. 이러한 데이터는, 사람 DCIR에의 결합 유용성에 관한 이들 가변 영역의 서열 [및 이들의 '사람화된' 유도체]에 대한 특정 청구항을 지지한다.
붉은털 원숭이 (Rhesus macaque) DCIR에 대한 항-DCIR의 교차-반응성. 붉은털 원숭이 (Rhesus macaque) DCIR에 대한 항-사람 DCIR mAb의 교차-반응성을 시험하기 위하여, 233F 세포를 포유동물 발현 벡터에 배치된 붉은털 원숭이 (Rhesus macaque) DCIR cDNA로 형질감염시켰다. 항-사람 DCIR 항체의 패널을, 형질감염되지 않은 293F 세포 및 사람 DCIR의 발현을 유도하는 동일한 벡터로 형질감염된 293F 세포와 비교하여, 원숭이 DCIR에 결합에 대하여 FACS를 통해 시험하였다. 사람과 원숭이 DCIR 서열 간의 비교는 아래에 제시된다. 사람과 원숭이 DCIR 간의 교차-반응성을 보이는 이들 항체가 특히 바람직한데, 그 이유는 치료제로서, 예를 들어 재조합 사람화된 항-DCIR.항원 백신으로서 제조되는 경우, NHP 독성 연구가 기전 관련 문제점을 검토할 수 있기 때문이다 [즉, 이들 시험은 독성 대비 효능을 검토할 수 있다].
사람 대 원숭이 DCIR. 제1 서열은 사람의 것이고, 원숭이 DCIR에서 나타난 변화는 사람 서열 아래에 제시된다. 추정상의 막관통 (transmembrane) 영역은 밑줄로 강조한다. 비-보존적 변화는 굵은 글씨체로 강조한다.
MTSEITYAEVRFKNEFKSSGINTASSAASKERTAPHKSNTGFPKLLCASLLIFFLLLAISFFIAFVIFFQKYSQLLEKKT (서열번호 58)
MTSEITYAEVRQNESKSSGIDSASSAASKKRTAPHKSNTGFSKLLCASLMIFFLLLAISFFFAFFIFFQKYSQLLEKMT (서열번호 59)
TKELVHTTLECVKKNMPVEETAWSCCPKNWKSFSSNCYFISTESASWQDSEKDCARMEAHLLVINTQEEQDFIFQNLQEE (서열번호 60)
TKDLVHTTLECVKKNMTTEETAWSCCPKNWKPFSSNCYFISTESASWQKSEKDCARMEAHLLVINTREEQDFIFQNLQEE (서열번호 61)
SAYFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPREPSDPNERCVVLNFRKSPKRWGWNDVNCLGPQRSVCEMMKIHL (서열번호 62)
SAYFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPHEPSDPDERCVVLNFRKTPKRWGWNDVHCIVPQRSVCEMMKIHL (서열번호 63)
도 21은 붉은털 원숭이 (Rhesus macaque) DCIR에 대한 항-DCIR mAb의 교차-반응성을 보여준다. FACS에 의한 샘플 분석이 아래에 제시된다. 녹색 플롯은 대조군 IgG4.gag 재조합 단백질에 의한 배경 결합을 보여준다. 적색 플롯은 항-DCIR.gag 단백질을 통한 결합이다 [제2 항체는 PE-표지화된 항-사람 IgGFc이다]. 당해 결과는 사람 DCIR 발현 플라스미드로 형질감염된 293F 세포에서 9E8 및 24A5 mAb에 의한 필적할만한 결합을 보여주고, 원숭이 DCIR 발현 플라스미드로 형질감염된 293F 세포에서 9E8는 결합되나, 24A5는 결합되지 않음을 보여준다. 유사한 분석에서, mAb 9E8, 29G10, 31A6, 3C2는 원숭이 DCIR에 잘 결합되나, mAb 24A5, 6C8, 24E7, 5F9, 29E9는 결합되지 않는다.
도 22는 특정 글리칸 구조에 대한 DCIR 외부도메인의 결합을 보여준다. DCIR 외부도메인은 293F 세포로부터 분비된 hIgGFc 융합 단백질로서 발현되고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 당해 단백질을, 복합당질기능 (Functional Glycomics) 협회로부터의 프린트 어레이 (printed array) 3.0 버전을 사용하여 특정 글리칸의 결합에 대하여 시험하였다 - 상기 어레이는 6회 반복물 중의 320개의 글리칸 (또는 당형태 (glycoform))으로 이루어진다.
아래에 제시된 엑셀 스프레드 시트 (Excel spread sheet)는, 각각 칼럼 A-F에서, 글리칸 수, 구조 또는 명칭, 6회 반복물로부터의 평균 RFU 값, 표준 편차, 평균 표준 오차 (완전한 데이터 세트를 제시하는 상기 그래프 중의 오차 막대에 대하여 사용됨), 및 %CV를 제시한다. 칼럼 C-Y는 글리칸 수 대 평균 RFU의 그래프를 함유하고, 칼럼 Z-AE는 최고 강도로 결합된 글리칸의 목록을 제공하는 PFU에 의해 분류된 (고 → 저) A-F로부터의 데이터이다. 평균 값이 6보다는 4가 되도록, 6회 반복물의 각 세트로부터 최고 포인트 및 최저 포인트를 제거하였다. 이는 매우 높은 단일 포인트를 함유하는 허위 히트 (false hit)의 일부를 제거한다. 따라서, 높은 %CV의 포인트는 의심스러운 것으로 간주되어야 한다. 당해 분석은 피코에리트린 (Phycoerythrin)으로 표지화된 항-사람 IgG-Fc를 사용한 검출로 수행되었다. DCIR.IgFc를, 2 mM Ca 및 Mg, 1% BSA 및 0.05% Tween 20을 함유하는 Tris-염수 결합 완충제를 사용하여, PBS 중에서 200 μg/ml로 희석시켰다.
이 데이터는 복합당질기능 (Functional Glycomics) 협회와 공동으로 생성되었다. Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3(Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-Sp12는 DCIR 외부도메인이 가장 단단히 결합된 글리칸이었다. 시험된 다른 hIgGFc 융합 단백질은, 여러 사람 혈청 단백질에서 발견된 매우 복잡한 탄수화물인 상기 글리칸을 선호하지 않았다.
따라서, 글리칸 143으로 장식된 항원, 또는 관련 구조물의 패널로부터 스크리닝된 고 친화성 유도체는 DCIR에 대한 항원을 호닝 (honing)해야 하고, DC-표적화 백신 또는 다른 DCIR 표적화 제제의 항-DCIR 성분에 대한 대용물로서 기능한다. 이는 백신 제조 및 보관에 있어서 비용 이점이 있다.
Figure 112009053818941-PCT00001
*** 글리칸 #143은 Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3(Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-Sp12이다.
도 23A 내지 23C는 DCIR이 모든 결합된 DC 서브세트에 대한 광범위한 표적임을 보여준다. DC의 두 개의 서브세트는 혈액에서 동정된다: CD11c+mDC 및 BDCA2+pDC. DCIR은 상기 두 DC 서브세트에서 발견되는 드문 렉틴-형 수용체 중의 하나이다. mDC 및 pDC를 세포성분채집술 (cytapheresis)로 정제하고, 각 DC를 정제된 자가 CD8+T 세포, 및 감소하는 농도의, Flu-MP의 4개의 재조합 형 (Flu-MP, IgG4에 융합된 Flu-MP, 및 두개의 상이한 재조합 항-DCIR 항체, 즉 24A5 및 9E8에 융합된 Flu-MP)와 함께 배양하였다.
아래의 도 23A에 제시된 결과는 두 개의 재조합 DCIR-Flu-MP 융합 단백질이 Flu-MP를 mDC로 강력하게 표적화할 수 있다는 것을 암시하는데, 그 이유는 상기 두 개의 단백질이 Flu-MP 그 자체 및 IgG4-Flu-MP는 항원-특이적 T 세포의 증대를 유도할 수 없는 80 pM의 낮은 농도에서 1.78% 내지 2.18%의 4량체 양성 세포를 유도할 수 있기 때문이다. 또한, pDC는 8 nM에서 4가지 형의 재조합 Flu-MP를 교차-제시할 수 있었다. 0.8 nM 및 80 pM에서, 두 개의 DCIR-Flu-MP 작제물은 교차제시되었지만, 두 개의 다른 Flu-MP 작제물은 그러하지 않았다 (하기 도 B).
종합하면, 이들 데이터는, DCIR가 혈액 mDC 및 pDC 둘 모두에 의한 교차-제시를 위해 단백질을 강력하게 표적화한다는 것을 암시한다. 사람에서, LC 및 IntDC는 우선적으로, 각각 세포 면역 및 체액 면역을 초회감작할 수 있는 능력을 갖는다. DCIR와 같이, 범(pan)-DC 분자에 대한 항원 표적화는 다양한 DC 서브세트를 표적화함으로써 광범위한 체액 및 세포 면역 반응을 잠재적으로 유도할 것이다. 이는 항-랑게린 (Langerin)과 같은 서브세트-특이적 항원-전달 비히클과는 대조적이다.
도 23A는 HLA-A2 제공자로부터의 혈액-유래된 mDC가 8 nM, 0.8 nM 또는 80 pM의 각각의 aDCIR-Flu-MP (a#24A5 및 b#9E8), IgG4-Flu-MP, 또는 Flu-MP로 표적화되고, CD40L로 성숙되고, 자가 CD8+ T 세포와 함께 공동-배양되었음을 보여준다. 10일 후에, T 세포 증대를 특이적 HLA-A2-M1 4량체 염색으로 평가하였다 [수직 축].
도 23B는 HLA-A2 제공자로부터의 혈액-유래된 pDC가 8 nM, 0.8 nM 또는 80 pM의 각각의 aDCIR-Flu-MP (a#24A5 및 b#9E8), IgG4:Flu-MP, 또는 Flu-MP로 표적화되고, CD40L로 성숙되고, 자가 CD8+ T 세포와 함께 공동-배양되었음을 보여준다. 10일 후에, T 세포 증대를 특이적 HLA-A2-M1 4량체 염색으로 평가하였다 [수직 축].
도 23C는 DCIR가 LC 및 피부 CD14+DC에 의한 단백질의 교차-제시를 허용함을 보여준다. HLA-A2 제공자로부터의 피부-유래된 DC는 8nM의 각각의 항-DCIR:Flu-MP, 항-랑게린:Flu-MP 또는 IgG4:Flu-MP로 표적화되고, CD40L로 성숙되고, 자가 CD8+ T 세포와 함께 공동-배양되었다. 10일 후에, T 세포 증대를 특이적 HLA-A2-M1 4량체 염색으로 평가하였다 [수직 축].
도 24는 DCIR-FluM1를 사용한 백신접종이 FluM1 특이적 회상 CD8+ T 세포 면역을 발생시킬 수 있음을 증명한다. 그 결과는, HLA-A*0201+ 건강한 제공자로부터의 3x106 CD34+ HPC로 이식되고, 이식 후 4 내지 8주째에, 20x106 자가 T 세포의 입양전달 (adoptive transfer)로 재구성된, 준치사량으로 방사선조사된 NOD/SCID β2m-/- 면역결핍 마우스로부터 수득된다. 마우스를, 사람 재조합 FLT3-리간드 (FLT3-L)를 5회 투여하여 10일 동안 예비-처리하여, DC를 이동시켰다. 총 30mcg의 DCIR-FluM1 백신이 두 부위에, 즉 복강내 및 정맥내에, 두 시점에, 즉 1일째 및 7일째에, 애주번트인 폴리 IC 50 mcg/마우스와 함께, 전달되었다. 인플루엔자-특이적 면역 반응의 유도는 혈액 및 조직을 매트릭스 단백질 1: FluM158-66 (GILGFVFTL) (서열번호 64) 펩타이드-함유된 4량체로 염색하는 방법으로 평가하였다. 도 1에 제시된 바와 같이, DCIR-FluM1로 백신접종된 4/5 마우스는, 백신접종 후 11일째에, FluM1 4량체에 결합한 혈중 사람 CD8+ T 세포를 증명하였다: 0.63%, 0.34%, 0.21%, 및 0.62%. HIV gag 펩타이드가 적재된 대조군 4량체를 이용한 염색은 거의 음성이었다. 이들 예비적 결과는 마우스의 독립적인 코호트 (cohort)에서 확인되었으며, 고 친화성 FluM1 4량체-결합 CD8+ T 세포의 증대는 총 9/12 백신접종된 마우스에서 관찰되었다. 이들 결과는 DCIR-FluM1를 이용한 백신접종이 FluM1 특이적 회상 CD8+ T 세포 면역을 발생시킬 수 있음을 증명한다.
본원에 기재된 특정 양태는 설명을 위한 것이지, 본 발명을 제한하고자 제시된 것이 아니라는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 양태로 사용될 수 있다. 당업자는 통상적인 수준의 실험을 사용하여 본원에 기재된 구체적 방법과 등가적인 수많은 방법을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위에 속하며, 청구범위에 의해 보호되는 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가의 기술 수준을 나타내는 것이다. 모든 간행물 및 특허 출원은, 개개의 간행물 또는 특허 출원 각각이 구체적으로, 개별적으로 참조로서 인용되는 것임을 나타내는 것과 같은 정도로 본원에 참조로 인용된 것이다.
청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이란 용어와 함께 사용된 부정관사는 "하나"를 의미할 수도 있으나, "하나 또는 이상", "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 의미일 수도 있다. 청구범위 중에 사용된 "또는"이란 용어는, 비록 본원이 단지 양자택일 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지지하더라도, 명시적으로 양자택일을 말하거나, 양자택일이 상호 간에 배제되는 경우가 아닌 한, "및/또는"을 의미하기 위하여 사용된 것이다. 본원 전반에 걸쳐서, "약"이란 용어는, 수치 값이 당해 수치를 측정하기 위하여 사용되는 장치 및 방법에 대한 오차의 고유 편차 또는 연구 대상 중에 존재하는 편차를 포함한다는 것을 나타내기 위하여 사용된 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된, 용어들, "포함하는" (및 "포함한다"와 같은 "포함하는"의 모든 형태), "갖는" (및 "갖는다"와 같은 "갖는"의 모든 형태), 또는 "함유하는" (및 "함유한다"와 같은 "함유하는"의 모든 형태)는 포괄적이거나 개방적이며, 인용되지 않은 추가적 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 "이의 조합"이란 용어는, 당해 용어에 선행하는 열거된 사항의 모든 순열 및 조합을 말하는 것이다. 예를 들면, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중의 하나 이상을 포함하고자 하는 것이며, 만일 순서가 중요한 경우에는, BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB을 또한 포함하고자 하는 것이다. 상기 예에서, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복, 예를 들어 BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등을 함유하는 조합도 명백히 포함된다. 당업자는, 달리 명시되지 않는 한, 통상적으로, 모든 조합 중에 항목 또는 용어의 수에 제한이 없음을 이해할 것이다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본원에 개시된 내용에 근거하여 과도한 실험 없이 제조하고 실행할 수 있다. 비록 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서, 당해 조성물 및 방법, 및 본원에 기재된 조성물 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 한정된 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 여겨진다.
참조문헌
Figure 112009053818941-PCT00002
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<110> Baylor Research Institute <120> Vaccines based on targeting antigen to DCIR expressed on antigen-presenting cells <130> BHCS:2096 <150> US 60/888,032 <151> 2007-02-02 <160> 64 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 1 Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly 65 70 <210> 2 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 2 Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly 65 70 <210> 3 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 3 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Glu Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser 65 70 <210> 4 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 4 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Ile Ser Gly 1 5 10 15 Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Asn Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Val Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Lys 65 70 <210> 5 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 5 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Asn Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Arg Ile Gly Trp Ile Asp Pro Asp 65 70 <210> 6 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 6 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr 65 70 <210> 7 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 7 Met Asn Arg Leu Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu 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cagggaaata gcccttgacc aggcatc 37 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized oligonucleotide <400> 45 ccaggcatcc tagagtcacc gaggagccag t 31 <210> 46 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized oligonucleotide <400> 46 ggtgctggag gggacagtca ctgagctgct catagtgt 38 <210> 47 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized oligonucleotide <400> 47 ctagttgctg gctaatggac cccaaaggct ccctttcctg gagaatactt ctgtttctct 60 ccctggcttt tgagttgtcg tacggattaa ttaagggccc actcgag 107 <210> 48 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized oligonucleotide <400> 48 ctagttgctg gctaatggac cccaaaggct ccctttcctg gagaatactt ctgtttctct 60 ccctggcttt tgagttgtcg tacggattaa ttaagggccc 100 <210> 49 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized oligonucleotide <400> 49 gctagcgata caacagaacc tgcaacacct acaacacctg taacaa 46 <210> 50 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized oligonucleotide <400> 50 caccatcacc atcaccattg agcggccgc 29 <210> 51 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized oligonucleotide <400> 51 gctagcgata caacagaacc tgcaacacct acaacacctg taacaacacc gacaacaaca 60 cttctagcgc 70 <210> 52 <211> 119 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized oligonucleotide <400> 52 gctagcccca ttctgagccc cctgaccaaa ggcattctgg gctttgtgtt taccctgacc 60 gtgcccagcg aacgcaaggg tatacttgga ttcgttttca cacttactta agcggccgc 119 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 53 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 54 Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val 1 5 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 55 Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile 1 5 10 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 56 Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 57 Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val 1 5 <210> 58 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 58 Met Thr Ser Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Val Arg Phe Lys Asn Glu Phe 1 5 10 15 Lys Ser Ser Gly Ile Asn Thr Ala Ser Ser Ala Ala Ser Lys Glu Arg 20 25 30 Thr Ala Pro His Lys Ser Asn Thr Gly Phe Pro Lys Leu Leu Cys Ala 35 40 45 Ser Leu Leu Ile Phe Phe Leu Leu Leu Ala Ile Ser Phe Phe Ile Ala 50 55 60 Phe Val Ile Phe Phe Gln Lys Tyr Ser Gln Leu Leu Glu Lys Lys Thr 65 70 75 80 <210> 59 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 59 Met Thr Ser Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Val Arg Gln Asn Glu Ser Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ile Asp Ser Ala Ser Ser Ala Ala Ser Lys Lys Arg Thr 20 25 30 Ala Pro His Lys Ser Asn Thr Gly Phe Ser Lys Leu Leu Cys Ala Ser 35 40 45 Leu Met Ile Phe Phe Leu Leu Leu Ala Ile Ser Phe Phe Phe Ala Phe 50 55 60 Phe Ile Phe Phe Gln Lys Tyr Ser Gln Leu Leu Glu Lys Met Thr 65 70 75 <210> 60 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 60 Thr Lys Glu Leu Val His Thr Thr Leu Glu Cys Val Lys Lys Asn Met 1 5 10 15 Pro Val Glu Glu Thr Ala Trp Ser Cys Cys Pro Lys Asn Trp Lys Ser 20 25 30 Phe Ser Ser Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Thr Glu Ser Ala Ser Trp Gln 35 40 45 Asp Ser Glu Lys Asp Cys Ala Arg Met Glu Ala His Leu Leu Val Ile 50 55 60 Asn Thr Gln Glu Glu Gln Asp Phe Ile Phe Gln Asn Leu Gln Glu Glu 65 70 75 80 <210> 61 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 61 Thr Lys Asp Leu Val His Thr Thr Leu Glu Cys Val Lys Lys Asn Met 1 5 10 15 Thr Thr Glu Glu Thr Ala Trp Ser Cys Cys Pro Lys Asn Trp Lys Pro 20 25 30 Phe Ser Ser Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Thr Glu Ser Ala Ser Trp Gln 35 40 45 Lys Ser Glu Lys Asp Cys Ala Arg Met Glu Ala His Leu Leu Val Ile 50 55 60 Asn Thr Arg Glu Glu Gln Asp Phe Ile Phe Gln Asn Leu Gln Glu Glu 65 70 75 80 <210> 62 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 62 Ser Ala Tyr Phe Val Gly Leu Ser Asp Pro Glu Gly Gln Arg His Trp 1 5 10 15 Gln Trp Val Asp Gln Thr Pro Tyr Asn Glu Ser Ser Thr Phe Trp His 20 25 30 Pro Arg Glu Pro Ser Asp Pro Asn Glu Arg Cys Val Val Leu Asn Phe 35 40 45 Arg Lys Ser Pro Lys Arg Trp Gly Trp Asn Asp Val Asn Cys Leu Gly 50 55 60 Pro Gln Arg Ser Val Cys Glu Met Met Lys Ile His Leu 65 70 75 <210> 63 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 63 Ser Ala Tyr Phe Val Gly Leu Ser Asp Pro Glu Gly Gln Arg His Trp 1 5 10 15 Gln Trp Val Asp Gln Thr Pro Tyr Asn Glu Ser Ser Thr Phe Trp His 20 25 30 Pro His Glu Pro Ser Asp Pro Asp Glu Arg Cys Val Val Leu Asn Phe 35 40 45 Arg Lys Thr Pro Lys Arg Trp Gly Trp Asn Asp Val His Cys Ile Val 50 55 60 Pro Gln Arg Ser Val Cys Glu Met Met Lys Ile His Leu 65 70 75 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 64 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5

Claims (25)

  1. 표적화된 제제가 부착되어 항체-제제 복합체를 형성하는 DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편을 분리하고 정제하는 단계를 포함하고, 이때 상기 분자는 상기 항체-제제 복합체와 접촉된 항원 제시 세포에 의해 내화됨을 특징으로 하는, DCIR-발현 항원 제시 세포에 의한 항원 제시의 효과를 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편이 Coherin/Dockerin 쌍의 절반에 결합되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편이 Coherin/Dockerin 쌍의 절반에 결합되고, 표적화된 제제가 Coherin/Dockerin 쌍의 상보적 절반에 결합하여 복합체를 형성하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 표적화된 제제가 펩타이드, 단백질, 지질, 탄수화물, 핵산 및 이의 조합으로부터 선택되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 표적화된 제제가 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 표적화된 제제가 인터루킨, 전환 성장 인자 (TGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 상피 성장 인자 (EGF), 결합 조직 활성화 펩타이드 (CTAP), 골원성 인자 및 이러한 성장 인자의 생물학적 활성 유사체, 단편 및 유도체, B/T-세포 분화 인자, B/T-세포 성장 인자, 분열유발성 사이토카인, 화학주성 사이토카인, 콜로니 자극 인자, 혈관형성 인자, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 등, 렙틴, 미오스타틴, 대식세포 자극 단백질, 혈소판-유래된 성장 인자, TNF-α, TNF-β, NGF, CD40L, CD137L/4-1BBL, 사람 림프독소-β, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-1α, IL1-β, IP-10, PF4, GRO, 9E3, 에리트로포이에틴, 엔도스타틴 (endostatin), 안지오스타틴 (angiostatin), VEGF, 전환 성장 인자 (TGF) 슈퍼유전자 계열 (베타 전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3)을 포함); 골 형태형성 단백질 (예를 들어, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); 헤파린-결합 성장 인자 (섬유모세포 성장 인자 (FGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF)); 인히빈 (Inhibin) (예를 들어, 인히빈 A, 인히빈 B); 성장 분화 인자 (예를 들어, GDF-1); 및 액티빈 (Activin) (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB)로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 표적화된 제제가 세균 단백질, 바이러스 단백질, 진균 단백질, 원생동물 단백질 또는 암 단백질을 포함하는 방법.
  9. 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편을 결합시킴을 포함하고, 이때 상기 항원이 상기 항원-항체 복합체와 접촉한 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시됨을 특징으로 하는, 수지상 세포에 의한 항원 제시의 효과를 증가시키는 방법.
  10. 예방적 또는 치료적 면역 반응을 일으킬 목적으로 항원을 항원-제시 세포에 전달하기 위한, DCIR에 대해 유도된 항체 또는 다른 특이적 결합 분자의 용도.
  11. DCIR에 특이적인 항원-표적화 시약의, 피부를 통한 백신접종을 위한 용도.
  12. 공동-투여되거나 결합된 애주번트와, DCIR에 특이적인 항원-표적화 시약의 백신접종을 위한 용도.
  13. 재조합 항원-항체 융합 단백질로서 발현될 수 있는 특이적 항원의 항원-표적화 (백신접종) 목적을 위한 용도.
  14. 환자의 수지상 세포를 분리하고,
    상기 수지상 세포를 활성화량의 항-DCIR 항체 또는 이의 단편 및 항원에 노출하여, 항원-적재된, 활성화된 수지상 세포를 형성하고,
    상기 항원-적재된, 활성화된 수지상 세포를 상기 환자에게 재도입함
    을 포함하여, 수지상 세포의 효과를 증가시키는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항원이 세균 단백질, 바이러스 단백질, 진균 단백질, 원생동물 단백질 또는 암 단백질을 포함하는 방법.
  16. 포유동물 세포로부터 분비된 항-DCIR 면역글로불린 또는 이의 일부 및 당해 면역글로불린에 결합된 항원.
  17. 제16항에 있어서, cohesin/dockerin 도메인의 절반에 결합된 면역글로불린.
  18. 제16항에 있어서, 모듈식 rAb 운반체와 복합체를 형성하는 항원에 결합된 cohesin-dockerin 결합 쌍의 상보적 절반을 추가로 포함하는 면역글로불린.
  19. 제16항에 있어서, 항원과의 융합 단백질인 cohesin-dockerin 결합 쌍의 상보적 절반을 추가로 포함하는 면역글로불린.
  20. 제16항에 있어서, 항원 특이적 도메인이 전체 길이의 항체, 항체 가변 영역 도메인, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편, Fv 단편, 및 Fabc 단편 및/또는 Fc 도메인의 일부를 가진 Fab 단편을 포함하는 면역글로불린.
  21. 제16항에 있어서, 방사성 동위원소, 금속, 효소, 보툴린, 파상풍, 리신 (ricin), 콜레라, 디프테리아, 아플라톡신, 퍼프린겐 (perfringen) 독소, 미코톡신 (mycotoxin), 시가 독소 (shigatoxin), 포도구균 장독소 (staphylococcal enterotoxin) B, T2, 세귀톡신 (seguitoxin), 색시톡신 (saxitoxin), 아브린 (abrin), 시아노기노신 (cyanoginosin), 알파톡신 (alphatoxin), 테트로도톡신 (tetrodotoxin), 아코노톡신 (aconotoxin), 뱀 독 및 거미 독으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 독소에 결합된 면역글로불린.
  22. 제16항에 있어서, 항원이 면역글로불린과의 융합 단백질인, 면역글로불린.
  23. 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 이때 상기 항원이 상기 항체-항원 복합체와 접촉한 수지상 세포에 의해 프로세싱되고 제시됨을 특징으로 하는, 백신.
  24. 제23항에 있어서, 항원이 DCIR을 포함하는 백신.
  25. DCIR에 특이적으로 결합하는 Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1- 3(Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-Sp12를 포함하는 글리칸의 적어도 일부와 결합하는 항원성 T 세포 에피토프 펩타이드를 포함하는 T 세포 항원.
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