FR3090319A1 - Melanges d’epitopes t cd8+ immunogenes de la cycline b1 - Google Patents
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Abstract
La présente invention est relative à une composition immunogène ou vaccinale comprenant un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 de la Cycline B1, ledit épitope ou ladite combinaison étant apte à être présenté par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes, de préférence inclus dans un ou plusieurs peptides de la Cycline B1 humaine, polypeptides multiépitopiques ou protéines chimériques, et/ou polynucléotides, et ladite composition étant capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules. L’invention concerne également l’utilisation de ladite composition comme vaccin anti-cancéreux et comme réactif pour le diagnostic du cancer ou l’immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Cycline B1 au cours d’un cancer ou d’un traitement anticancéreux.
Description
Description
Titre de l’invention : MELANGES D’EPITOPES T CD8+ IMMUNOGENES DE LA CYCLINE B1
[0001] L’invention concerne une composition immunogène ou vaccinale comprenant un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 de la Cycline Bl, ledit épitope ou ladite combinaison d’épitopes étant apte à être présenté par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules. L’invention concerne également l’utilisation de ladite composition comme vaccin anticancéreux et comme réactif pour le diagnostic du cancer ou 1’immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Cycline Bl au cours d’un cancer ou d’un traitement anticancéreux.
[0002] Les lymphocytes T constituent des acteurs majeurs de la réponse immunitaire antitumorale. Ils peuvent être induits spontanément chez les patients atteints de cancer et infiltrer les tumeurs, participant ainsi activement aux cas de régression spontanée. Cependant, ces cas restent assez rares et la vaccination a pour but de favoriser leur recrutement.
[0003] Les lymphocytes T impliqués dans l’immunité anti-tumorale appartiennent soit à la famille des lymphocytes T cytotoxiques exprimant le co-récepteur CD8, soit à la famille des lymphocytes T auxiliaires exprimant le co-récepteur CD4. Les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL) sont capables de reconnaître les peptides issus des antigènes tumoraux présentés à la surface des cellules tumorales par les molécules HLA de classe I ou molécules HLA I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) et de lyser les cellules tumorales directement après la reconnaissance des peptides. Les lymphocytes T CD4+ ont une fonction auxiliaire ou régulatrice et reconnaissent les antigènes de tumeurs sous la forme de peptides présentés par les molécules HLA de classe II ou molécules HLA II.
[0004] La différenciation des cellules en cellules tumorales est le résultat d’une dérégulation génétique qui favorise leur prolifération et leur expansion dans l’organisme. Cette dérégulation se traduit par l’expression de protéines normalement peu ou non exprimées dans les cellules normales ou exprimées de manière transitoire. Parmi ces protéines, certaines sont exprimées en quantité suffisante pour être reconnues par le système immunitaire et constituent des antigènes tumoraux. La vaccination anti-tumorale utilise comme cible ces antigènes tumoraux afin de pouvoir induire une réponse immunitaire spécifique des tumeurs qui épargne les cellules saines. Ces antigènes sont répartis en plusieurs catégories, en fonction de leur mode d'expression.
[0005] La Cycline Bl (CCNB1) est une protéine de 433 acides aminés (AA) et de 48kDa impliquée dans la régulation du cycle cellulaire et plus particulièrement dans la transition de la phase G2 vers la phase M. La Cycline B1 humaine correspond à la séquence UniProt P14635 ou SEQ ID NO : 1. La Cycline B1 est surexprimée dans de nombreux cancers incluant des cancers du sein (Agarwam, R ; et al. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res., 2009, 15, 3654-3662), du colon (Li, J.-Q. et al. Int. J. Oncol., 2003, 22, 1101-111), de la prostate (Mashal, R. D. et al. Cancer Res., 1996, 56, 4159-4163), de l’œsophage (Song, Y. et al. Carcinogenesis, 2008, 29, 307-315), de l’estomac (Begnami, M. D. et al. Hum. Pathol., 2010, 41, 1120-1127), des poumons (Soria, J.-C. et al. Cancer Res., 2000, 60, 4000-4004) et des cancers ORL (Hoffmann, T. K. et al. Anticancer Res., 2011, 31, 3151-3157) et cette surexpression est généralement associée à un mauvais pronostic (Ye, C. et al. Oncotarget, 2016, 8, 2224-2232).
[0006] La Cycline B1 représente une cible de choix pour le développement d’un vaccin anticancéreux étant donné qu’elle est fréquemment exprimée dans des cancers variés et indispensable à la croissance tumorale mais exprimée de façon transitoire dans les cellules saines, ce qui est favorable à une absence ou une faible induction de tolérance.
[0007] Plusieurs études ont montré que la Cycline B1 peut être la cible d’une réponse immunitaire.
[0008] Une réponse humorale spontanée dirigée contre la Cycline B1 humaine et a priori dépendante des lymphocytes T CD4+ a été observée chez des patients atteints de cancer (Suzuki, H., et al., Clin. Cancer Res., 2005, 11, 1521-1526) mais également chez des individus sains (Vella, L. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2009, 106, 14010-14015).
[0009] Des épitopes T CD4 de la Cycline B1 humaine ont été décrits (Vella, L. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2009, 106, 14010-14015 ; Chevaleyre, C. et al. J. Immunol., 2015, 195, 1891-1901 ; Demandes Internationales W02015/001526 et WO2010/011994). Parmi ces épitopes T CD4, certains sont capables de lier différentes molécules HLA de classe II prépondérantes et d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ spécifiques caractérisée par une fréquence et une intensité de réponse élevées, chez des individus humains exprimant lesdites molécules HLA II (Chevaleyre, C. et al. J. Immunol., 2015, 195, 1891-1901 ; Demande Internationale W02015/001526).
[0010] Des peptides issus de la Cycline Bl, capables d’induire une réponse en lymphocytes T cytotoxiques spécifiques ont également été identifiés (Kao, H. et al., J. Exp. Med., 2001, 194, 1313-1324, Sprensen, R. B. et al., Clin. Cancer Res., 2009, 15, 1543-1549, Demande Internationale WO 03/033520, Andersen, R. S. et al., Cancer Immunol. Immunother., 2011, 60, 227-234).
[0011] Ainsi, très peu d’épitopes T CD8 de la Cycline B1 ont été décrits jusqu’à présent et ces derniers sont uniquement restreints à l’allèle HLA-A2. Du fait du polymorphisme des molécules HLA I, la séquence de l’épitope T CD8 présenté varie en fonction des molécules HLA I codées par les allèles HLA I du patient, dénommées ci-après allèles HLA I. L’ensemble des allèles HLA I d’un patient est dénommé typage HLA L Pour mettre au point un vaccin efficace contre le cancer permettant d’avoir une couverture vaccinale la plus large possible, il existe donc un réel besoin de disposer d’un ensemble d’épitopes T CD8 de la Cycline B1 capables d’être présentés par des molécules HLA I différentes représentatives de la population à vacciner et d’induire une réponse en lymphocytes T CD8+ spécifiques chez les individus exprimant lesdites molécules HLA L
[0012] Les inventeurs ont identifié un ensemble d’épitopes T CD8 immunogènes de la Cycline B1 humaine. Contrairement aux épitopes T CD8 de l’art antérieur dont la restriction pour les molécules HLA I est limitée à l’allèle HLA-A2, ces épitopes T CD8 sont immunogènes chez des individus humains portant des molécules HLA I variées incluant onze des molécules HLA-A et HLA-B les plus fréquentes dans les populations caucasiennes (HLA-A1, -A2, -A3, -All, -A29, HLA-B7, -B8, -B15, -B35, -B40, B51) [Tableau 3]. Ces onze molécules HLA I couvrent la majorité de la population caucasienne (87 % des individus (65 % des allèles) pour les molécules HLA-A et 68 % des individus (44 % des allèles) pour les molécules HLA-B ; [Tableau 3]). En combinant plusieurs épitopes T CD8 de l’invention, et éventuellement des épitopes T CD4, dans un ou plusieurs peptides issus de la Cycline Bl, polypeptides multiépitopiques ou protéines chimériques, et/ou ou polynucléotides, on obtient ainsi un vaccin contre le cancer qui possède une large couverture vaccinale étant donné qu’il est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD8+ spécifiques chez un grand nombre de patients quel que soit leur typage HLA.
[0013] En conséquence, la présente invention a pour objet une composition immunogène ou vaccinale comprenant au moins un épitope T CD8 ou une combinaison d’épitopes T CD8 de la Cycline Bl humaine, ledit épitope ou ladite combinaison d’épitopes étant apte à être présenté par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes et ladite composition étant apte à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules.
[0014] - On entend par « Cycline B1 » ou « CCNB1 », une protéine Cycline Bl issue de n’importe quel mammifère ; de préférence, il s’agit de la protéine Cycline Bl humaine. La Cycline Bl humaine correspond à la séquence en acides aminés UniProt P14635 ou SEQID NO : 1.
- On entend par « épitope T CD8 », un peptide de 9 à 10 acides aminés qui lie au moins une molécule HLA I, de préférence une molécule HLA I prépondérante telle que présentée au [Tableau 3], et est reconnu par des lymphocytes T CD8+ spécifiques chez des individus humains portant cette molécule HLA I.
- On entend par « épitope T CD8 immunogène de la Cycline B1 » un épitope T CD8 issu de la Cycline B1 qui est apte à être présenté par au moins une molécule HLA I et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins ladite molécule HLA I.
- On entend par « lymphocytes T CD8+ spécifiques », des lymphocytes T CD8+ spécifiques de la Cycline Bl, de préférence la Cycline B1 humaine.
- On entend par « induction d’une réponse en lymphocytes T CD8 ^spécifiques », la stimulation de lymphocytes T CD8+ spécifiques.
- On entend par « molécule HLA I prépondérante », une molécule HLA I dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans une population de référence, par exemple l’une des populations caucasiennes du [Tableau 3].
- On entend par « cancer », un cancer associé à la surexpression de la protéine Cycline B1 par des cellules tumorales tel que de façon non-limitative : les cancers du sein, du colon, de la prostate, de l’œsophage, de l’estomac, des poumons et les cancers ORL. - Le pourcentage d’identité d’une séquence d’acides aminés est défini par le pourcentage de résidus d’acides aminés dans une séquence à comparer qui sont identiques à une séquence de référence après alignement des séquences, en introduisant des espaces si nécessaire, de façon à obtenir une identité de séquence maximale. L’alignement de séquences en vue de déterminer le pourcentage d’identité d’une séquence peut être réalisé de différentes façons connues de l’homme du métier, par exemple en utilisant des logiciels publics disponibles comme BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3), 403-410). Ce logiciel est de préférence utilisé avec des paramètres par défaut.
- Sauf indication contraire, un, signifie au moins un, et ou signifie et/ou.
[0015] Ladite composition comprend une combinaison d’épitopes et/ou au moins un épitope T CD8 de la Cycline Bl humaine selon l’invention. Ledit épitope selon l’invention est apte à être présenté par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules. Ladite combinaison d’épitopes selon l’invention comprend au moins deux épitopes différents, chaque épitope étant apte à être présenté par une molécule HLA I prépondérante différente et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins ladite molécule HLA I. Ladite composition qui comprend ladite combinaison d’épitopes et/ou au moins ledit épitope selon l’invention comprend un ensemble d’épitopes apte à être présenté par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules. En particulier, la composition qui comprend l’épitope ou la combinaison d’épitopes est apte à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ spécifiques dans un groupe d’individus humains exprimant au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes, chaque individu exprimant au moins une molécule HLA I prépondérante différente et l’épitope ou la combinaison d’épitopes T CD8 de la Cycline B1 étant apte à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ spécifiques chez chaque individu du groupe qui comprend au moins deux individus.
[0016] La capacité des épitopes de l’invention d’induire une réponse en lymphocytes T CD8 + spécifiques, par exemple à partir de précurseurs présents chez des individus humains naïfs, de stimuler spécifiquement de telles cellules chez des individus humains atteints d’un cancer associé à la surexpression de la Cycline Bl, la spécificité des lymphocytes T CD8+ induits vis-à-vis des épitopes ou de la protéine Cycline Bl, ainsi que la capacité des épitopes de l’invention d’être reconnus par des lymphocytes T CD8+ spécifiques, sont évaluées selon les techniques standards connues de l’Homme du métier comme par exemple : un test de prolifération cellulaire, un test ELISPOT (dosage des cellules productrices de cytokines) ou un test de dosage de cytokines intracellulaires, spécifiques d’une cytokine produite par des lymphocytes T CD8+ activés, en particulier un cytokine de type Thl telle que par exemple IFN-γ, IL-2 ou TNF-a.
[0017] Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites molécules HLA I prépondérantes sont choisies parmi les molécules HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A29, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B35, HLA-B40 et HLA-B51. De préférence, lesdites molécules HLA I prépondérantes sont codées respectivement par les allèles HLA A*01:01, A*02:01, A*03:01, A*ll:01, A*29:01, B*07:02, B*08:01, B*15:01, B*35:01, B*40:01, et B*51:01.
[0018] Selon un mode de réalisation de l’invention, les épitopes de ladite combinaison qui est apte à être présentée par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant lesdites molécules sont choisis parmi au moins deux groupes différents d’épitopes du [Tableau 1], ou le dit épitope T CD8 apte à être présenté par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules est choisi parmi les épitopes du [Tableau 2].
[Tableaux 1]
| Séquence d’acides aminés de l’épitope | Position en référence à SEQ ID NO : 1 | SEQ ID NO | Restriction HLA | |
| Groupe I | MALRVTRNSK | 1-1.0 | 2 | HL À-A3 |
| ALR.VTRNSK | 2-10 | 3· | ||
| KVSEQLQAK | 51-59 | |||
| GVTAMFIASK | '248-257 | 22 | ||
| AAGAFCLALK | 345-354 | 35 | ||
| Groupe II | KPGLRPRTA | 36-44 | 4 | HLA-B 7 |
| RPRTALGDI | 40-48 | 5 | ||
| KPLEKVPML | 81-89 | 9 | ||
| GroupeΙΠ | RTALGDIGNK | 42-51 | 6 | HLA-A11 |
| VTAMFIASK | 249-257 | 23 | ||
| AFVTDNTYTK | 270-279 | 27 | ||
| fvtdntytk | 271-279 | 28 | ||
| Groupe IV | LPKPLEKVPM | 79-88 | 8 | HLA-B35 |
| YPPEIGDFAF | 262-271 | 24 | ||
| PPEIGDFAF | 263-271 | 25 | ||
| FAFVTDNTY | 269-277 | 2& | ||
| Groupe V | LEKVPMLVPV | 83-92 | 10 | HLA-B40 |
| QMEMKILRAL | 284-293 | 29 | ||
| MEMKILRAL | 285-293 | 30 | ||
| Groupe VI | KLSPEPHV | 114-122 | 13 | HLA-A2 |
| YVKDIYAYL | 170-178 | 14 | ||
| ILIDWLVQV | 204-212 | 15 | ||
| ïR'.l.QETMYM | 216-225 | 16 | ||
| RLLQETMYM | 217 -22 5 | 17 | ||
| LLQETMYMTV | 218-227 | 18 | ||
| TLAKYLMEL | 321-329 | Λ2.· | ||
| YLSYTEESL | 368-376 | 3S | ||
| YTEESLLPV | 371-379 | 39 | ||
| Groupe VU | VPKKMLQLV | 239-247 | 19 | HLA-B51 |
| Groupe V ΣΠ | MLQLVGVTAM | 243-252 | 20 | HLA-B15 |
| LQL VGVTAMF | 244-253 | 21 | ||
| Groupe IX | FGLGRPLPE | 295-303 | 31 | HLA-B8 |
| Groupe X | YLMELTMLDY | 325-334 | 33 | HLA-A29 |
| Groupe XI | TPTLQHYLSY | 362-371 | 36 | HLA-A1 |
| PTLQHYLSY | 363-371 | λ 7 |
Tableau 1 : Groupes d’épitopes TCD8 restreints à une seule molécule HLA I prépondérante
[Tableaux!]
| Sequence d’ackles aminés Se l’épitope | Position en référence à SEQ ID ΝΌ : 1 | SEQ ID NO | Restriction HLA |
| XVPMI.VPVPV | 85-94 | 11 | HLA-A2/ HLA-B7/ HLA-B51 |
| VPMLVPVPV | S 6-94 | 12 | HLA-ET HE A-B 51 |
| LMELTMLDY | 326-334 | 3-4 | liLA-Al. HLA-A.29 |
Tableau 2 : Liste des épitopes restreints à au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes
[0019] Les acides aminés sont désignés à l’aide du code à une lettre. Les positions des épitopes et peptides issus de la Cycline B1 sont indiquées en référence à la séquence de la Cycline B1 humaine (SEQ ID NO: 1).
[0020] Conformément à ce mode de réalisation de l’invention, les épitopes de ladite combinaison sont choisis parmi au moins deux des groupes d’épitopes suivants:
- Groupe I constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 2, 3, 7, 22 et 35, aptes à être présentés par la molécule HLA-A3 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ;
- Groupe II constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 4, 5 et 9, aptes à être présentés par la molécule HLA-B7 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ;
- Groupe III constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 6, 23, 27 et 28, aptes à être présentés par la molécule HLA-A11 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ;
- Groupe IV constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 8, 24, 25 et 26, aptes à être présentés par la molécule HLA-B35 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ;
- Groupe V constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 10, 29 et 30, aptes à être présentés par la molécule HLA-B40 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ;
- Groupe VI constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 13, 14, 15, 16, 17, 18, 32, 38 et 39, aptes à être présentés par la molécule HLA-A2 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule;
- Groupe VII constitué de l’épitope de séquence SEQ ID NO : 19, apte à être présentés par la molécule HLA-B51 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ;
- Groupe VIII constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 20 et 21, aptes à être présentés par la molécule HLA-B15 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ;
- Groupe IX constitué de l’épitope de séquence SEQ ID NO : 31, apte à être présentés par la molécule HLA-B8 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ;
- Groupe X constitué de l’épitope de séquence SEQ ID NO : 33, apte à être présentés par la molécule HLA-A29 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ; et
- Groupe XI constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 36 et 37, aptes à être présentés par la molécule HLA-Al et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant ladite molécule ; ou ledit épitope est choisi parmi les épitopes suivants:
- l’épitope de séquence SEQ ID NO : 11, apte à être présenté par les molécules HLAA2, HLA-B7 et HLA-B51 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant lesdites molécules;
- l’épitope de séquence SEQ ID NO : 12, apte être présenté par les molécules HLA-B7 et HLA-B51 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant lesdites molécules ;
- l’épitope de séquence SEQ ID NO : 34, apte à être présenté par les molécules HLAA1 et HLA-A29 et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant lesdites molécules.
[0021] Ladite composition ou combinaison d’épitopes comprend avantageusement 3 ou plus épitopes T CD8 selon l’invention, par exemple 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus épitopes T CD8 selon l’invention. L’ensemble d’épitopes de la composition est choisi de manière à ce qu’il soit apte à être présenté par au moins 2 molécules HLA I prépondérantes, de préférence 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 molécules HLA I prépondérantes.
[0022] Ladite composition comprenant un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 de la Cycline B1 telle que définie précédemment permet d’améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale en élargissant la couverture d’individus humains répondeurs.
[0023] De préférence, l’épitope du Groupe I est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2 et 3 ; l’épitope du Groupe II est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 4 et 9 ; l’épitope du Groupe IV est la séquence SEQ ID NO : 24 ; l’épitope du Groupe VI est la séquence SEQ ID NO : 15 ; ces épitopes induisent avantageusement une fréquence élevée de répondeurs. Le [Tableau 4] montre que tous les peptides induisent une fréquence de répondeurs d’au moins 90% dans le groupe d’individus testés qui est re présentatif de la population ; les épitopes de séquence SEQ ID NO : 2, 3, 4, 9 et 24 induisant une fréquence de répondeurs de 100 % dans ce groupe d’individus.
[0024] Selon un mode de réalisation, l’épitope ou la combinaison d’épitopes tels que définis ci-dessus, sont inclus dans au moins un peptide de la Cycline Bl humaine, au moins un polypeptide multi-épitopique ou une protéine chimérique, et/ou au moins un polynucléotide codant le ou lesdits peptides, polypeptides et/ou protéines.
[0025] Conformément à ce mode de réalisation, l’invention concerne une composition immunogène ou vaccinale dans laquelle le ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), protéine(s) et/ou polynucléotide(s) comprennent un épitope ou une combinaison d’épitopes apte à être présenté par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes telles que définies ci-dessus, de préférence 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 molécules HLA I prépondérantes différentes.
[0026] Avantageusement, ledit peptide, polypeptide, protéine ou polynucléotide est apte à être présenté par au moins trois, de préférence au moins quatre molécules HLA I prépondérantes différentes telles que définies ci-dessus et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant lesdites molécules.
[0027] L’invention englobe les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d’un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de la Cycline Bl, dès lors que ledit peptide dérivé de la séquence de la Cycline Bl humaine de SEQ ID NO : 1 conserve ses propriétés d’épitope T CD8 immunogène de la Cycline B1 et est capable de stimuler une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques de la Cycline Bl, c’est-à-dire qu’ils sont reconnus par des lymphocytes T CD8+ spécifiques de la séquence sauvage ou d’un variant naturel de la Cycline Bl. Les variants naturels résultent notamment du polymorphisme de la Cycline Bl.
[0028] Dans un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit peptide consiste en une séquence d’au plus 100 acides aminés consécutifs de la séquence de la Cycline Bl humaine SEQ ID NO : 1, c’est-à-dire au plus 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90 acides aminés consécutifs de la séquence de la Cycline Bl humaine SEQ ID NO : 1 ou une séquence d’au plus 100 acides aminés (au plus 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90 acides aminés) issue de la séquence SEQ ID NO : 1 qui présente au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, ledit peptide consiste en une séquence de 31 à 100 acides aminés, de préférence 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80 à 100 acides aminés consécutifs de ladite séquence SEQ ID NO : 1.
[0029] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, ledit peptide consiste en une séquence d’au plus 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 100 acides aminés, de préférence de 31, 32, 33, 34, 35, 40, 50, 60, 70 ou 80 à 100 acides aminés consécutifs de la séquence de la Cycline B1 humaine SEQ ID NO : 1, comprenant au moins les résidus 36 à 59 (SEQ ID NO : 40), ou les résidus 79 à 94 (SEQ ID NO : 41), ou les résidus 239 à 257 (SEQ ID NO : 42), ou les résidus 262 à 279 (SEQ ID NO : 43), ou les résidus 284 à 303 (SEQ ID NO : 44), ou les résidus 321 à 334 (SEQ ID NO : 45) ou les résidus 362 à 379 (SEQ ID NO : 46) de ladite séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, ledit peptide comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 40 à 44 et 46.
[0030] Selon une disposition particulière, ledit peptide consiste en une séquence d’au plus 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 100 acides aminés, de préférence de 31, 32, 33, 34, 35, 40, 50, 60, 70 ou 80 à 100 acides aminés consécutifs de la séquence de la Cycline B1 humaine SEQ ID NO : 1 comprenant au moins les résidus 36 à 59 (SEQ ID NO : 40) ou les résidus 79 à 94 (SEQ ID NO : 41) de ladite séquence SEQ ID NO : 1.
[0031] Avantageusement, le peptide tel que décrit précédemment est un peptide comprenant une combinaison d’épitopes apte à être présentée par au moins trois molécules HLA I prépondérantes différentes et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant lesdites molécules et ledit peptide consistant en une séquence d’au plus 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 100 acides aminés, de préférence de 31, 32, 33, 34, 35, 40, 50, 60, 70 ou 80 à 100 acides aminés consécutifs de la séquence de la Cycline B1 humaine SEQ ID NO : 1 comprenant au moins les résidus 36 à 59 (SEQ ID NO : 40), les résidus 79 à 94 (SEQ ID NO : 41), les résidus 239 à 257 (SEQ ID NO : 42) ou les résidus 321 à 334 (SEQ ID NO : 45) de ladite séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, ledit peptide comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 40 à 44 et 46.
[0032] De manière plus avantageuse, le peptide tel que décrit précédemment est un peptide comprenant une combinaison d’épitopes aptes à être présentés par au moins quatre molécules HLA I prépondérantes différentes et à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant lesdites molécules, et le dit peptide consistant en une séquence d’au plus 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 100 acides aminés, de préférence de 31, 32, 33, 34, 35, 40, 50, 60, 70 ou 80 à 100 acides aminés consécutifs de la séquence de la Cycline B1 humaine SEQ ID NO : 1, comprenant au moins les résidus 79 à 94 (SEQ ID NO : 41) ou les résidus 239 à 257 (SEQ ID NO : 42) de ladite séquence SEQ ID NO : 1.
[0033] Dans un autre mode de réalisation de l’invention, ledit peptide tel que défini précédemment comprend une séquence qui présente au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO : 40 à 46, de préférence l’une des séquences SEQ ID NO :
à 44 et 46.
[0034] Dans un autre mode de réalisation de l’invention, ledit peptide présente au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, et comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 40 à 46, de préférence au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 40 à 44 et 46.
[0035] Pour permettre d’élargir la couverture d’individus humains répondeurs et ainsi améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale, l’épitope ou la combinaison d’épitopes T CD8 tels que définis précédemment peuvent être combinés avec d’autres épitopes, notamment d’autres épitopes T CD8 de la Cycline Bl, des épitopes T CD4 de la Cycline Bl, et des épitopes T CD4 ou T CD8 d’autres antigènes tumoraux, tels que notamment MAGE, NY-ESO-1, Survivine et Midkine.
[0036] Les épitopes T CD4 ou T CD8 issus d’antigènes tumoraux sont notamment décrits dans les Demandes Internationales PCT WO 2007/036638 et WO 2009/153463. Parmi les épitopes pouvant être incorporés dans le mélange de l’invention, on peut citer notamment :
- les épitopes T CD4 de la Cycline B1 humaine tels que décrits dans la Demande Internationale WO 2015/001526 ; en particulier les épitopes de séquence SEQ ID NO : 47 à 50, 58, 59, 63 à 72 et 91 à 145 ;
- les épitopes T CD8 de la Cycline Bl de séquence SEQ ID NO : 73 à 86 ;
- les épitopes T CD8 de MAGE tels que décrits dans le Brevet US 6,063,900 et la Demande PCT WO 2004/052917,
- les épitopes T CD4 de MAGE tels que MAGE-A3 267-282 restreint à DR1 (Demande Internationale PCT WO 02/095051) ; MAGE-A3 149-160 restreint à DR4 et DR7 (Kobayashi et al., Cancer Research, 2001, 61, 4773-4778) ; MAGE-A3 191-205 et 281-295 restreints à DRU (Consogno et al., Blood, 2003, 101, 1038-1044 ; Manici et al., J. Exp. Med., 1999, 189, 871-876) et MAGE-A3 121-134 restreint à DR13 (Brevet US 6,716,809) ; MAGE-AÏ 281-292 restreint à DR15 (Demande Internationale PCT WO 00/78806) ; MAGE-A6 102-116, 121-144, 140-170, 145-160, 150-165 et 246-263 restreints à DR4 (Tatsumi et al., Clinical Cancer Research, 2003, 9, 947-954) ; MAGE-AÏ 281-292 restreint à DR15 (Demande Internationale PCT WO 00/78806) ; MAGE-A6 102-116, 121-144, 140-170, 145-160, 150-165 et 246-263 restreints à DR4 (Tatsumi et al., Clinical Cancer Research, 2003, 9, 947-954) et les épitopes MAGE restreints à HLA-DP4 tels que décrits dans la Demande Internationale PCT WO 2007/026078,
- un épitope T CD8 de la survivine choisi parmi : survivine 96-104 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO : 87) ou 95-104 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO :88), survivine-2B 80-88 (AYACNTSTL, SEQ ID NO :89) ; Survivine 18-27, 18-28, 20-28, 84-92 et 92-101, lesdites positions étant indiquées en référence à la séquence de la survivine humaine UniProtKB-015392, et les peptides tels que décrits dans le tableau I de Bachinsky et al., Cancer Immun., 2005, 5, 6,
- un épitope T CD4 de la survivine tel que décrit dans la Demande Internationale PCT WO 2007/036638 et dans le tableau II de Wang et al., The Journal of Immunology, 2008, 181 :431-439, et notamment le peptide 17-31, 19-33, 20-34, 84-98, 90-104, 93-107, 96-110 et 128-142
- un épitope T CD4 et/ou T CD8 de la Midkine tel que décrit dans la Demande Internationale PCT WO 2009/153463,
- un épitope T CD4 universel naturel ou synthétique tel que le peptide de la toxine tétanique TT 830-846 (O'SULLIVAN et al., J. Immunol., 1991, 147, 2663-2669), le peptide de l’hémagglutinine du virus de la grippe HA 307-319 (O'Sullivan et al., précité), le peptide PADRE (KXVAAWTLKAA, SEQ ID NO :90; Alexander et al., Immunity, 1994, 1, 751-761) et des peptides issus des antigènes de Plasmodium falciparum tels que le peptide CS.T3 (Sinigaglia et al., Nature, 1988, 336, 778-780) et les peptides CSP, SSP2, LSA-1 et EXP-1 (Doolan et al., J. Immunol., 2000, 165, 1123-1137), et
- un épitope B constitué par un sucre (Alexander et al., précité), ledit épitope B étant de préférence sous la forme d’un glycopeptide, et
- un épitope B de la Cycline B1 reconnu spécifiquement par des anticorps dirigés contre ledit antigène tumoral.
[0037] Ainsi, dans un autre mode réalisation, l’invention concerne une composition immunogène ou vaccinale dans laquelle le ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), protéine(s) et/ou polynucléotides comprennent en outre au moins un épitope T CD4 de la Cycline B1 humaine. Le ou les épitopes T CD4 peuvent être inclus dans le même peptide, polypeptide, protéine que le ou lesdits épitopes T CD8 ou dans des peptides, polypeptides ou protéines séparées.
[0038] Le ou les épitopes T CD4 de la Cycline B1 humaine sont avantageusement aptes à se lier et à être ainsi présentés par plusieurs molécules HLA II prépondérantes différentes choisies parmi HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR11, HLADR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DP401 et HLADP402. De préférence, lesdites molécules HLA II sont codées respectivement par les allèles HLA DRBUO101, DRBUO301, DRBUO401, DRBUO701, DRBl*1101, DRBl*1301, DRBl*1501, DRB3*0101, DRB4*0104, DRB5*0101, DP*0401 et DP*0402. De préférence, le ou les épitopes T CD4 de la Cycline B1 humaine sont aptes à se lier et à être ainsi présentés par au moins 6 molécules HLA II prépondérantes différentes telles que définies ci-dessus.
[0039] Conformément à ce mode de réalisation, l’invention concerne une composition im munogène ou vaccinale dans laquelle le peptide ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), protéine(s) et/ou polynucléotide(s) comprennent un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 apte à être présenté par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes, de préférence 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 molécules HLA I prépondérantes différentes et un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD4 apte à être présenté par au moins deux molécules HLA II prépondérantes différentes telles que définies ci-dessus, de préférence 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 molécules HLA II prépondérantes différentes.
[0040] De manière plus particulière, lesdits épitopes T CD4 comprennent avantageusement une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 47 à 50, 58, 59, 63 à 72 et 91 à 145. De préférence, lesdits épitopes T CD4 comprennent les résidus 1 à 15 (SEQ ID NO : 47), 17 à 31 (SEQ ID NO : 63), 168 à 182 (SEQ ID NO : 49), 199 à 216 (SEQ ID NO : 64), 207 à 221 (SEQ ID NO : 91), 212 à 226 (SEQ ID NO : 92), 216 à 230 (SEQ ID NO : 93), 221 à 235 (SEQ ID NO : 94), 225 à 239 (SEQ ID NO : 95), 241 à 258 (SEQ ID NO : 65), 250 à 264 (SEQ ID NO : 66), 267 à 281 (SEQ ID NO : 67), 280 à 299 (SEQ ID NO : 68), 299 à 317 (SEQ ID NO : 69), 320 à 337 (SEQ ID NO : 58), 342 à 356 (SEQ ID NO : 59), 363 à 380 (SEQ ID NO : 70), 374 à 388 (SEQ ID NO : 71) ), 410 à 424 (SEQ ID NO : 96) ou 416-433 (SEQ ID NO : 72) de la séquence de la Cycline B1 humaine SEQ ID NO : 1.
[0041] Dans un mode de réalisation avantageux, la composition immunogène ou vaccinale comprend au moins un peptide d’au plus 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 100 acides aminés, de préférence de 31, 32, 33, 34, 35, 40, 50, 60, 70 ou 80 à 100 acides aminés consécutifs de la séquence de la Cycline B1 humaine, ledit peptide comprenant au moins les résidus 239 à 258 (SEQ ID NO : 51), les résidus 239 à 281 (SEQ ID NO : 52), les résidus 250 à 279 (SEQ ID NO : 53), les résidus 262 à 281 (SEQ ID NO : 54), les résidus 280 à 303 (SEQ ID NO : 55), les résidus 280 à 337 (SEQ ID NO : 56), les résidus 284 à 317 (SEQ ID NO : 57), les résidus 342 à 388 (SEQ ID NO : 60), les résidus 362 à 380 (SEQ ID NO : 61) ou les résidus 362 à 388 (SEQ ID NO : 62) de ladite séquence SEQ ID NO :1. De préférence, ledit peptide comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 52, 56, 57 et 60. De tels peptides comprennent un épitope T CD8 ou une combinaison d’épitopes T CD8 et au moins un épitope T CD4 de la Cycline B1 humaine.
[0042] Dans un autre mode de réalisation, ledit peptide tel que défini précédemment comprend une séquence qui présente au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO : 51 à 57 ou 60 à 62, de préférence l’une des séquences SEQ ID NO : 52, 56, 57 ou 60.
[0043] Dans un autre mode de réalisation de l’invention, ledit peptide présente au moins
70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 et comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 51 à 57 et 60 à 62, de préférence au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 52, 56, 57 et 60.
[0044] Dans un autre mode de réalisation, lesdits épitopes T CD4 tels que définis ci-dessus sont inclus dans un peptide comprenant au moins les résidus 1-31 (SEQ ID NO : 48) ou les résidus 170-216 (SEQ ID NO : 50), ledit peptide pouvant être incorporé dans un mélange comprenant au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique comprenant un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 selon l’invention, ou bien inclus dans un polypeptide multiépitopique ou une protéine chimérique contenant ledit épitope ou ladite combinaison d’épitopes T CD8.
[0045] Selon un autre mode de réalisation, la composition immunogène ou vaccinale comprend une combinaison d’épitopes tels que définis ci-dessus, inclus dans un polypeptide multiépitopique chimérique. On définit ici un polypeptide chimérique comme une succession d’acides aminés qui n’est pas présente dans la nature. Un polypeptide chimérique selon l’invention comprend au moins deux épitopes T CD8 de la Cycline B1 humaine tels que définis ci-dessus, les séquences desdits épitopes étant dans ledit polypeptide, adjacentes, liées par un élément de liaison ou séparées par une séquence comprenant un autre épitope. L’autre épitope est notamment un autre épitope T CD8 ou un épitope T CD4 de la Cycline B1 humaine, ou bien un épitope d’une autre protéine que la Cycline B1 humaine, notamment un autre antigène tumoral. Le polypeptide multiépitopique peut également comprendre plusieurs copies d’une même séquence d’épitope. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide multiépitopique comprend moins de 100 acides aminés consécutifs de la Cycline Bl, de préférence moins de 50, de manière préférée moins de 30. Le polypeptide multiépitopique présente une longueur de 20 à 200 acides aminés, de préférence de 30 à 100 acides aminés, de manière préférée d’environ 50 acides aminés.
[0046] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, ledit peptide ou polypeptide tel que défini ci-dessus est un peptide ou un polypeptide modifié comprenant une modification au niveau de résidu(s) d’acide aminé, de la liaison peptidique ou des extrémités et ledit peptide ou polypeptide modifié conservant ses propriétés d’épitope T CD8 immunogène de la Cycline Bl telles que définies ci-dessus, c’est-à-dire qu’il est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques dans un groupe d’individus humains exprimant au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes. Cette ou ces modification(s), de préférence une ou des modification(s) chimique(s), qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l’homme du métier, incluent de façon non-limitative l’une au moins des modifications chimiques suivantes : l’acétylation du résidu d’acide aminé
N-terminal et/ou l’amidation du résidu d’acide aminé C-terminal (Maillère et al., Molecular Immunology, 1195, 32, 1377-1385), la substitution d’un acide aminé par un acide aminé non-protéinogénique (acide aminé D ou analogue d’acide aminé) ; l’addition de groupement chimique (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d’une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (-CO-NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d’un peptide (épitope d’intérêt pour la vaccination); la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d’une protéine, notamment une chaîne a d’une molécule HLA I ou le domaine extracellulaire de ladite chaîne, et le couplage à une molécule appropriée. Ces modifications sont destinées en particulier à augmenter la stabilité et plus particulièrement la résistance à la protéolyse, ainsi que la solubilité ou l’immunogénicité du peptide ou polypeptide selon l’invention.
[0047] Au sens de la présente invention on entend par « dérivé peptidique » d’un peptide selon l’invention, un peptide modifié ou un polypeptide multi-épitopique, modifié ou non-modifié.
[0048] Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ou polypeptide modifié, il comprend une ou plusieurs N6-acetyl-lysine(s), phosphoserine(s) et/ou phosphothreonine(s). De préférence, la N-acetyl-lysine est en position 73, la ou les phosphoserine(s) sont en position 126, 128, 133 et/ou 147 et la phospho threonine est en position 321 de la de la séquence SEQ ID NO : 1.
[0049] Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide ou polypeptide modifié est un lipopeptide ou un lipopolypeptide. Ledit lipopeptide ou un lipopolypeptide peut être obtenu, notamment par addition d’un lipide sur une fonction α-aminée ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d’un acide aminé dudit peptide ou polypeptide; il peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d’acides gras en C4-20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d’un stéroïde. La partie lipidique préférée est notamment représentée par un groupe N“-acétyl-lysine N'ïpalmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam).
[0050] Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, l’épitope ou la combinaison d’épitopes est inclus dans une protéine de fusion (protéine chimérique) comprenant ledit peptide ou polypeptide fusionné avec une protéine hétérologue (différente de la Cycline B1) ou un fragment polypeptidique hétérologue (fragment d’une protéine différente de la Cycline Bl ou fragment de la Cycline Bl dont la séquence n’est pas directement adjacente à la séquence dudit peptide ou polypeptide dans la séquence de ladite Cycline Bl). Le peptide ou le fragment polypeptide peuvent être fusionnés avec l’extrémité NH2 ou COOH de ladite protéine ou dudit fragment polypeptidique hé16 térologue ou insérés dans la séquence de ladite protéine ou dudit fragment.
[0051] Selon une disposition avantageuse, ladite protéine chimérique est constituée par un peptide ou un polypeptide tels que défini ci-dessus, fusionné avec l’une des chaînes d’une molécule HLA, de préférence la chaîne alpha d’une molécule HLA I, ou bien avec un fragment de celle-ci correspondant à une molécule HLA soluble, notamment un fragment correspondant au domaine extracellulaire précédé du peptide signal homologue ou d’un peptide signal hétérologue. Ledit peptide est avantageusement inséré entre le peptide signal et l’extrémité NH2 du domaine extracellulaire de la chaîne a, comme décrit pour la molécule HLA-A2 (Oved K et al. Cancer Immunol Immunother (2005) 54: 867-879).
[0052] La présente invention a également pour objet une composition immunogène ou vaccinale comprenant au moins un polynucléotide codant pour ledit ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), et/ou ou protéine(s) chimériques tels que définis ci-dessus.
[0053] Conformément à l’invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l’ADNc codant pour ledit ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), et/ou ou protéine(s) chimériques. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l’usage des codons soit optimal chez l’hôte dans lequel elle est exprimée.
[0054] Ces polynucléotides peuvent être insérés dans un vecteur d’expression, sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur approprié, pour permettre l’expression du ou desdits peptide(s) ou polypeptide(s) conforme à l'invention dans une cellule de l’hôte.
[0055] De nombreux vecteurs sont connus en eux-mêmes ; le choix d’un vecteur approprié dépend de l’utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d’intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l’hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des acides nucléiques nus (ADN ou ARN) ou des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d’intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu’un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l’introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l’électroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l’électroporation associée à des liposomes.
[0056] De préférence, ledit vecteur est un vecteur d’expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression du peptide, polypeptide, protéine de fusion tels que définis ci-dessus. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d’expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d’épissage).
[0057] D’autres compositions conformes à l'invention peuvent également comprendre une cellule présentatrice d’antigène modifiée, comprenant au moins un peptide, polypeptide, protéine chimérique, polynucléotide et/ou un vecteur tels que définis cidessus, la cellule pouvant être modifiée de façon stable ou transitoire. La cellule est notamment une cellule présentatrice d’antigène naturelle telle qu’une cellule dendritique ou une cellule présentatrice de l’antigène artificielle, telle que des vésicules dérivées de cellules tumorales ou des exosomes dérivés de cellules dendritiques. La composition selon l’invention peut comprendre une cellule dendritique chargée avec au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique selon l’invention, ou transformée avec au moins un polynucléotide ou un vecteur selon l’invention.
[0058] La composition immunogène ou vaccinale selon l’invention comprend avantageusement un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une substance porteuse et/ou un adjuvant.
[0059] Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.
[0060] Les adjuvants sont avantageusement choisis parmi: les émulsions huileuses, les substances minérales, les extraits bactériens, les oligonucléotides contenant des CpG, la saponine, l’hydroxyde d’alumine, le monophosphoryl -lipide A et le squalène.
[0061] Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nanoparticules.
[0062] La composition conforme à l’invention peut comprendre en outre des adjuvants habituellement utilisés en immunothérapie, et permettant par exemple de favoriser l’administration du principe actif, de le stabiliser, d’augmenter son immunogénicité. Des exemples d’adjuvants utilisables incluent les oligodéoxynucléotides CpG, 1’Apoptosis-Inducing Factor (AIF), les Heat Shock Proteins (HSP), les récepteurs Tolllike (TLRs) tel que des agonistes de TLR3 (Poly I:C), et des cytokines et chimiokines telles que l’IL-7, l’IL-12, l’IL-15 et le GM-CSF et CCL5 (Rantes).
[0063] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, la composition comprend en outre au moins un inhibiteur de point de contrôle immunitaire, tel que de façon nonlimitative un anti-PD-1, un anti-PDL-1 ou un anti-CTLA4, notamment un anticorps, de préférence monoclonal, dirigé contre la molécule PD-1, PDL-1 ou CTLA4, de préférence la molécule humaine hPD-1, hPDL-1 ou hCTLA4. La composition selon l’invention comprend avantageusement un anti-PD-1, en particulier un anticorps monoclonal anti-PD-1, de préférence anti-hPD-1.
[0064] La composition immunogène ou vaccinale comprend une dose efficace d’épitope, de combinaison d’épitopes, d’un ou plusieurs peptides, polypeptides, protéines, polynucléotides, vecteurs, permettant d'obtenir un effet thérapeutique prophylactique (vaccin préventif) ou curatif (vaccin thérapeutique) sur le cancer associé à une surexpression tumorale de la Cycline B1 tel que défini ci-dessus. Cette dose est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l’âge, le sexe et le poids du sujet. La composition est généralement administrée selon les protocoles usuels de vaccination à des doses et pendant une durée suffisante pour induire une réponse cellulaire dirigée contre la protéine Cycline Bl. L'administration peut être intratumorale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale, intra-nasale, par inhalation ou par application transdermique. La composition se présente sous une forme galénique adaptée à une administration choisie.
[0065] La composition selon la présente invention peut être utilisée en immunothérapie dans le traitement des tumeurs surexprimant la Cycline Bl, tel que de façon non-limitative : les cancers du sein, du colon, de la prostate, de l’œsophage, de l’estomac, des poumons et les cancers ORL (oto-rhino-laryngé). La dite composition est utilisée, soit comme vaccin, soit en thérapie cellulaire, ou bien encore par une combinaison des deux approches.
[0066] La thérapie cellulaire comprend la préparation de cellules présentatrices d’antigènes, notamment des cellules dendritiques, par un protocole classique comprenant l’isolement de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) d’un patient à traiter et la mise en culture des cellules dendritiques en présence d’épitope, combinaison d’épitopes, de préférence inclus dans au moins un peptide, polypeptide, protéine, polynucléotide et/ou vecteur tels que définis ci-dessus. Dans une seconde étape les cellules présentatrices d’antigène chargées avec le ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), protéine(s) ou modifiées par ledit polynucléotide ou vecteur sont réinjectées au patient.
[0067] La présente invention a également pour objet une méthode de vaccination antitumorale, prophylactique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu’elle comprend l’administration d’une composition vaccinale telle que définie ci-dessus, à un individu, par tout moyen approprié tel que défini ci-dessus.
[0068] La présente invention a également pour objet, une composition comprenant au moins un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 et un épitope T CD4 de la Cycline Bl telle que définie précédemment, pour son utilisation dans l’immunothérapie prophylactique ou curative d’un cancer associé avec la surexpression de la Cycline Bl, par induction d’une réponse en lymphocytes T CD4+ et T CD8+ chez les individus humains auxquels la composition est administrée.
[0069] La présente invention a également pour objet une composition telle que définie cidessus pour son utilisation en médecine personnalisée, dans la prévention et/ou le traitement de cancers associés à la surexpression de la Cycline Bl humaine, ladite composition étant administrée à des individus exprimant au moins une molécule HLA I prépondérante telle que définie ci-dessus et l’épitope ou la combinaison d’épitopes T CD8 présents dans la composition étant choisis en fonction des molécules HLA I prépondérantes exprimées par ledit individu.
[0070] La présente invention a également pour objet I’utilisation in vitro de la composition telle que définie ci-dessus comme réactif pour le diagnostic d’un cancer associé avec la surexpression de la Cycline Bl.
[0071] La présente invention a également pour objet l’utilisation in vitro de la composition telle que définie ci-dessus comme réactif pour l’immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Cycline Bl, destiné à l'évaluation du pronostic ou au suivi du traitement d’un cancer associé avec la surexpression de la Cycline Bl (chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie).
[0072] La présente invention a également pour objet une méthode in vitro, d'immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Cycline B1 chez un individu présentant un cancer, caractérisée en ce qu’elle comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec une composition comprenant un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 immunogènes de la Cycline Bl tels que définis ci-dessus, et
- la détection de lymphocytes T CD8+ spécifiques de la Cycline Bl, par tout moyen approprié.
[0073] La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic ou d’immunomonitoring comprenant la composition telle que définie ci-dessus. De préférence, ledit réactif comprend au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique tels que définis ci-dessus, par exemple marqué et/ou complexé à une molécule HLA I, notamment complexé à des molécules HLA I marquées, par exemple biotinylées. De préférence, ledit réactif est inclus dans un coffret (kit).
[0074] La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé d’analyse de lymphocytes T CD8+ spécifiques de la Cycline Bl, caractérisé en ce qu’il comprend au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact, in vitro, d'un échantillon cellulaire comprenant des lymphocytes T CD8+ avec des complexes HLA I/peptide marqués, notamment par un fluorochrome, lesdits complexes étant formés par la liaison de molécules HLA I solubles avec au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique comprenant un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 immunogènes de la Cycline Bl tels que définis ci- dessus, et
- l’analyse des cellules liées auxdits complexes HLA I/pcptidc, notamment en cytométrie de flux.
[0075] Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l’analyse des cellules (lymphocytes T CD8+) comprend le tri desdites cellules.
[0076] La présente invention a également pour objet un peptide de la Cycline B1 comprenant un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 et éventuellement au moins un épitope T CD4 de la Cycline Bl humaine tels que définis ci-dessus. De préférence, un peptide d’au plus 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 100 acides aminés, de préférence de 31, 32, 33, 34, 35, 40, 50, 60, 70 ou 80 à 100 acides aminés consécutifs de la séquence de la Cycline Bl humaine SEQ ID NO : 1 ou une séquence présentant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, ledit peptide comprenant au moins l’une des séquences SEQ ID NO : 2 à 14, 19 à 31, 33 à 44, 46, 48, 50 à 57 ou 60 à 62, de préférence SEQ ID NO : 40, 41, 50 ou 62, et plus préférentiellement SEQ ID NO : 40 ou 41 ou une séquence présentant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec ladite séquence. La présente invention a également pour objet une protéine chimérique comprenant ledit peptide. La présente invention a également pour objet un polypeptide multiépitopique chimérique tel que défini ci-dessus, comprenant au moins deux épitopes choisis parmi les séquences SEQ ID NO : 2 à 10, 13, 14, 19 à 33 et 35 à 39 ou au moins un épitope de séquence SEQ ID NO ; 11, 12 ou 34. La présente invention a également pour objet un polynucléotide codant ledit peptide, polypeptide ou protéine chimérique, un vecteur comprenant ledit polynucléotide et une cellule hôte modifiée par ledit polynucléotide ou vecteur.
[0077] Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.
[0078] Les peptides et leurs dérivés tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'homme du métier, notamment par synthèse en phase solide ou liquide ou par expression d’un ADN recombinant dans un système cellulaire approprié (eucaryote ou procaryote). De manière plus précise :
- les peptides et leurs dérivés (variants, polypeptides multiépitopiques) peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse, - les lipopeptides peuvent être notamment préparés selon le procédé décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630, - les peptides et dérivés tels que les variants, les polypeptides multiépitopiques et les protéines de fusion peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l’homme du métier ; l’ADNc est cloné dans un vecteur d’expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d’affinité.
[0079] La présente invention sera mieux comprise à l’aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l’identification et la caractérisation d’épitopes ou combinaison d’épitopes T CD8 immunogènes de la Cycline B1 inclus dans des peptides conformes à l'invention.
Exemples
Matériels et méthodes
[0080] 1. Design et préparation des peptides
[0081] L’analyse de la séquence entière de la Cycline Bl (CCNB1, UniptotKB-P14635) (GenBank : EAW51306.1) (SEQ ID NO : 1) à l’aide de l’outil de prédiction NetMHC v4.0 a permis d’identifier des peptides de 9 ou 10 acide aminés contenant potentiellement un épitope T CD8 capable de se lier à au moins une molécule HLA de classe I (HLA-A ou HLA-B) parmi les plus fréquentes dans la population caucasienne (>5%). Les peptides sélectionnés ont été synthétisés sur support solide suivant la stratégie Fmoc (protection des groupements amine du squelette peptidique avec du Fluorénylméthoxycarbonyle) puis purifiés par chromatographie liquide ultra-haute performance. Chacun des peptides synthétisés a été solubilisé en milieu aqueux contenant un pourcentage variable de DMSO (0 à 100%) déterminé de manière empirique. Des pools de peptides spécifiques à chaque molécule HLA de classe I ont été constitués.
[0082] 2, Préparation des cellules
[0083] Des prélèvements sanguins (couches leuco-plaquettaires) ont été collectés chez des donneurs sains naïfs auprès de l’Etablissement Français du Sang (EFS - Centre de Rungis, France) après consentement éclairé et suivant les principes de l’EFS. Les cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) ont été isolées par gradient de Ficoll. Les cellules dendritiques (DC) immatures ont été générées à partir des PBMC par différenciation des monocytes adhérents après 4-5 jours de culture en milieu AIM22
V contenant 1000 U/ml d’IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF (Bio-techne, France). Les lymphocytes T CD8+ ont été purifiés à partir des PB MC par tri négatif à l’aide de microbilles magnétiques couplées à divers anticorps et permettant de retenir sur la colonne de filtration tous les autres types cellulaires (Miltenyi Biotec, France).
[0084] 3. Typage HLA des donneurs
[0085] Les donneurs HLA-A2 positifs ont été sélectionnés par marquage des PBMC avec un anticorps anti-HLA-A2 (clone BB7.2) et analyse de la fluorescence en cytométrie en flux (cytomètre Accuri C6, BD Biosciences). Le typage HLA complet à haute résolution a été obtenu par séquençage à haut débit (NGS) des loci des gènes codant pour les molécules HLA de classe I et II amplifiés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) à partir de T ADN des PBMC de chaque donneur (société DKMS Life Science Lab GmbH, Allemagne). Seuls les donneurs présentant les allèles les plus fréquents dans au moins une des populations du [Tableau 3], i.e. HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*ll:01, HLA-A*24:02, HLA-A*29:02 et HLA-B*07:02, HLAB*08:01, HLA-B*15:01, HLA-B*18:01, HLA-B*35:01, HLA-B*40:01, HLAB*44:02/03, HLA-B*51:01, ont été inclus dans l’étude.
[0086] 4, Obtention de lignées de lymphocytes T CD8 spécifiques des peptides de la Cycline
B1
[0087] Les DC ont été maturées en les cultivant dans du milieu AIM-V contenant du LPS (1 pg/mL) et du R848 (10 pg/mL). Les DC devenues matures (DCm) ont été chargées avec les pools de peptides de la CCNB1 (ΙΟμΜ chaque) correspondant au typage HLA du donneur, puis lavées soigneusement et irradiées sous UV pendant 6 minutes. Des lymphocytes T CD8+ (2x105, ratio 10:1) autologues ont ensuite été cultivés avec les DCm dans du milieu IMDM supplémenté par du sérum AB (milieu IMDM complet, IMDMc) contenant 30 ng/mL d’IL-21 (Bio-techne). Après 3 jours, la culture est poursuivie en milieu IMDMc supplémenté avec 5 ng/mL IL-15 et 5 ng/mL IL-7 (Bio-techne). Les lymphocytes T CD8+ ont été stimulés une nouvelle fois au bout d’une semaine avec des DCm chargées avec les pools de peptides et cultivés en IMDMc supplémenté avec 5 ng/mL d’IL-15 et 5 ng/mL d’IL-7. Sept jours après la restimulation, la spécificité des lignées T CD8+ a été évaluée par des tests ELISpot IFNY·
[0088] 5. Evaluation de la spécificité de Lymphocytes T CD8 Cultivés par ELISpot IFN-γ
[0089] Des anticorps anti-IFN-γ humain (clone 1-D1K, Mabtech, Suède) ont été adsorbés (2,5pg/ml en PBS IX) sur des plaques 96 puits Multiscreen HA (Millipore, France). Après une nuit d’incubation à 4°C, les plaques ont été saturées en les incubant 2 heures à 37°C avec du milieu IMDMc, puis lavées en tampon phosphate PBS. Les lymphocytes T CD8+ (2x104 cellules/puits) ont été incubés pendant 16 heures à 37°C dans ces plaques dans 200 pL d’AIM-V contenant 0,5 ng/mL d’IL-7, en présence de cellules présentatrices autologues (5000 DC/puits ou 50000 PBMC/puits) et en présence ou non des pools de peptides (ΙΟμΜ). Après l’incubation, les plaques ont été lavées avec de l’eau distillée, du PBS /Tween 0,05% et enfin du PBS. L’anticorps anti-ΙΕΝ-γ humain 7-B6-1 biotinylé (Mabtech) à 0,25pg/ml en PBS 1X/BSA 1% a été ajouté dans les plaques (100 pL/puits) qui ont été incubées lh30 à 37°C. Après plusieurs lavages en PBS/tween 0,05% et PBS, la sécrétion d’ILN-γ a été mise en évidence par l’ajout de l’Extravidine-Phosphatase Alcaline et du substrat NBT/BCIP (Sigma-Aldrich, Erance). Après 5 à 10 minutes d’incubation, la réaction chromogénique a été stoppée par lavage à l’eau courante. Après séchage des plaques, les spots, reflétant la sécrétion d’IEN-γ par chaque lymphocyte T CD8+ activé, ont été comptés sur un lecteur Elispot (AID). Une lignée de lymphocytes T CD8+ est considérée comme positive si le nombre de spots dans les puits contenant le pool de peptides est au moins deux fois plus élevé que le puits sans peptides, la différence entre les deux types de puits étant au moins supérieure à 25. Chaque lignée de lymphocytes T CD8+ identifiée comme positive a ensuite été utilisée dans un second test ELISpot ΙΕΝ-γ avec chaque peptide (présent dans pool initial) testé individuellement afin d’identifier sa spécificité.
Résultats
[0090] 1, Prédiction in silico des épitopes T CD8 potentiels dans la séquence de la Cycline
B1
[0091] La connaissance de la séquence et de la structure des sillons d’ancrage des molécules HLA-A et HLA-B a permis de définir par des moyens bio-informatiques (Net-MHC v4.0) les peptides de 9 et 10 acides aminés présents au sein de séquences protéiques susceptibles de se lier aux molécules HLA de classe I, et donc d’être présentés. Les peptides prédits pour se lier à un allèle particulier sont classés en fonction de leur affinité prédite comparée à celle de 400000 peptides naturels aléatoires.
[0092] L’ensemble de la séquence de la Cycline B1 a été examiné à l’aide du programme de prédiction Net-MHC v4.0. Seuls les allèles HLA-A et HLA-B présents chez au moins 5 % des individus dans au moins une des populations caucasiennes du [Tableau 3], dénommées molécules HLA I prépondérantes ont été considérées. Cela inclut 6 molécules HLA-A (HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A* 11:01, HLA-A*24:02, HLA-A*29:02) présents chez au moins 74 % des allèles de la population caucasienne et 9 molécules HLA-B (HLA-B*07:02, HLA-B*08:01, HLAB*15:01, HLA-B*18:01, HLA-B*35:01, HLA-B*40:01, HLA-B*44:02/03, HLAB*51:01) présents chez au moins 62 % des allèles de la population caucasienne [Tableau 3].
[Tableaux3]
| Allèles | France | Allemagne | USA | Japon | Moyenne population caucasienne | Total | |||||
| Caucasiens | Hispanique ..S | Afroitméiicams | Orientaux | ||||||||
| Royaume- | Espagne | ||||||||||
| HLA A*0i:0i | 13,8 | 15,1 | 18,0 | 11,9 | 16,5 | 6,7 | il T | 1,4 | 0,4 | )5.i | 74 |
| HLA-A *02:01 | 25,7 | 26,7 | 27.4 | 23,7 | 27,6 | 16,9 | 12,3 | 9,5 | 11,6 | 26,2 | |
| HLA-A *03:01 | 14,7 | 14,7 | 13,7 | 11,5 | 14,0 | 8,6 | 8,4 | 1,4 | 0,4 | 13,7 | |
| HLA-A *11:01 | 5,9 | 5,6 | 6,5 | 6,3 | 6,1 | 4.1 | 1,4 | 27.5 | 9,1 | :6.,1 | |
| HL. A-A*23:0i | ? ? | 2 A | 1,5 | 3,7 | 2.0 | 5,4 | 11,0 | 0,2 | 0.0 | ||
| HLA-A*24:02 | 8,9 | 9,5 | 8,6 | 9,0 | 8,5 | 9,4 | 2 5 | 15.2 | 36,5 | 8.9 | |
| HLA-A *29:02 | 3,5 | 2,4 | 3,5 | 6,2 | 3.5 | 6,1 | 3 7 | 1,0 | 0.0 | 3.8 | |
| HLA-A*33:O3 | 0,6 | 0.8 | 0.4 | 0,2 | 0,3 | 0.5 | 5,2 | 10,1 | 7.5 | ||
| HLA-B* 07:02 | 11,2 | 12,0 | 13.8 | 9 2 | 13,1 | 5,7 | 7,3 | 0,8 | 5,6 | 11,9 | 62 |
| HLA-B*08:01 | 8,1 | 9,5 | 13,4 | 7,2 | 11,4 | 4-1 | 3,S | 0,5 | 0.0 | 9.9 | |
| HLA-B*15:01 | 6,5 | 6,5 | 6,7 | 4,9 | 6,1 | 2,3 | 1,1 | 3.0 | 7,6 | 6,1 | |
| HLA-B* 15:03 | 0,2 | 0.2 | 0.Î | 0,6 | 0,1 | 2.0 | 6,4 | 0,1 | 0.0 | ||
| HLA-B*18:01 | 5J5 | 5,0 | 3,6 | 6,8 | 4.4 | 4.1 | 0,3 | 0.0 | 5,1 | ||
| HLA-B*35:01 | 6,1 | 6,2 | 5.2 | 54 | 5,6 | 4.8 | 6,9 | 2 ? | 8.3 | 5.6 | |
| HLA-B*40:01 | 4,0 | 4.9 | 5,8 | 2,4 | 5,3 | 1.7 | 1,3 | 15,4 | 5.3 | 4.5 | |
| HLA-B*42:01 | 0,1 | 0,0 | 0,1 | 0.0 | 0,0 | 1,4 | 5.3 | 0,0 | 0,0 | ||
| HL-A-B*44:0.2 | 7^2- | 7.3 | 9,8 | 6,5 | 9,5 | 4,2 | 2.1 | 0,4 | 0,4 | 8.1 | |
| HLA-B*44:03 | 5,2 | 4,1 | 5,1 | Ί.Ρ | 4,7 | 8,9 | 4.6 | 1,4 | 6,8 | 5,4 | |
| HLA.-B*45.:01 | 0,7 | 0,4 | 0,5 | 1.4 | 0,6 | 2,6 | 5,0 | 0,2 | 0,0 | ||
| HLA-B*51;01 | 6,8 | 6,3 | 4,1 | 7,8 | 4,7 | 6,4 | 2 ? | 4,6 | 8,9 | 5,9 | |
| HLA-B*53:O1 | 0.7 | 0,3 | 0,3 | 1.2 | 0.3 | 9 9 | 11.8 | 0,0 | 0,0 |
Les fi'éqneaces alléliques représentait au moins 554 des individus dans les différentes populations sort représentées en gras.
Les allèles HLA-A et HLA-B ea gras correspondent aux allèles majoritaires dans les différentes populations caucasiennes.
Tableau 3 : Fréquence allélique (%) des principales molécules HLA de classe I (Données issues de wvvw.aiïelefi'equétscies.tiet)
[0093] Les allèles HLA-C n’ont pas été retenus en raison de la faible expression de ces derniers en comparaison des allèles HLA-A et HLA-B (Neefjes, J. J. & Ploegh, H. L., Eur. J. Immunol., 1988, 18, 801-810). 133 peptides dérivés de la Cycline Bl contenant potentiellement un épitope T CD8 capable de se lier à au moins une des molécules
HLA de classe I considérées ont été sélectionnés et synthétisés.
[0094] 2.1nduction de lignées de lymphocytes T CD8+ spécifiques de peptides de la Cycline Bl
[0095] Vingt-sept donneurs (P415 à P603) ont été sélectionnés en fonction de leur typage HLA, de manière à couvrir les 6 allèles HLA-A et 9 allèles HLA-B les plus fréquents dans au moins une des populations du [Tableau 3] (fréquence allélique >5%). Le HLA des donneurs P415 à P505 a été déterminé par marquage avec un anticorps antiHLA-A2 (clone BB7.2) tandis que le typage HLA des donneurs P561 à P603 a été défini par séquençage à haut débit. Pour chaque donneur, les pools de peptides testés ont été sélectionnés en fonction du typage HLA du donneur. Ainsi, entre un et trois pools de peptides par donneur ont pu être testés en parallèle. Des lignées de lymphocytes T CD8+ ont été obtenues par coculture de lymphocytes T CD8+ avec des DCm autologues préalablement chargées avec les pools de peptides de la Cycline Bl. Vingt lignées de lymphocytes T CD8+ ont été ensemencées pour chaque condition. Après amplification, chaque lignée a été testée par ELISpot ΙΕΝ-γ pour sa capacité à reconnaître le pool de peptides issus de la Cycline Bl, puis dans un deuxième test (pour les lignées positives) les peptides individuels contenus dans ce pool. Des réponses en lymphocyte T CD8+ ont été détectées chez 85% des donneurs testés (23/27) couvrant 11 des molécules HLA I prépondérantes considérées, 5 molécules HLA-A (HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A* 11:01 et HLAA*29:02) présentes chez au moins 65 % des allèles de la population caucasienne et 6 molécules HLA-B (HLA-B*07:02, HLA-B*08:01, HLA-B*15:01, HLA-B*35:01, HLA-B*40:01 et HLA-B*51:01) présentes chez au moins 44 % des allèles de la population caucasienne [Tableau 3]. Trente-huit (38) peptides sur les 133 testés, se sont montrés capables d’induire une réponse en lymphocyte T CD8+ chez un nombre variable de donneurs, avec un nombre de lignées positives variant de 1 à 19 sur les 20 ensemencées pour chaque allèle testé.
[0096] Le [Tableau 4] récapitule l’ensemble des 38 épitopes T CD8 de la Cycline Bl identifiés ainsi que le pourcentage de répondeurs et leur restriction pour les différents allèles HLA-A et B testés.
[Tableaux4]
| Peptide | Donneurs | Répondeurs | s < 3 X | r-4 u g «F 3 X | (ε=Ν)εν-νΐΗ | 'ίί s r·* *? 3 X | HLA-A24 (N~2) | HLA-A29 (N=2) | HLA-B7 (N~2) | t-4 fl S 00 es 3 X | 0-4 B g £A i-i CB < —1 X. | II £ 03 r-i CÛ 3 X | HLA-B35 (N=2) | HLA-B40 (N=2) | HLA-B44 (N~3) | HLA-B51 (N =3) |
| 1-10 | 5 | 3 | 100 | 0 | ||||||||||||
| 2Ί0 | 3 | 3 | 100 | |||||||||||||
| 36-44 | 2 | 2 | 100 | |||||||||||||
| 40-48 | 2 | 1 | 50 | |||||||||||||
| 42-51 | 5 | 1 | 0 | 50 | ||||||||||||
| 51-59 | 5 | 1 | 33 | 0 | ||||||||||||
| 79-88 | 4 | 1 | 0 | 50 | ||||||||||||
| 81-89 | 2 | 2 | 100 | |||||||||||||
| 83-92 | 2 | 1 | 50 | |||||||||||||
| 85-94 | 15 | 7 | 33 | 100 | 100 | |||||||||||
| 86-94 | 7 | 5 | 100 | 0 | 100 | |||||||||||
| 114-122 | 12 | 1 | 8 | |||||||||||||
| 170-178 | 12 | 1 | 8 | |||||||||||||
| 204-212 | 12 | 11 | 92 | |||||||||||||
| 216-225 | 12 | 3 | 25 | |||||||||||||
| 217-225 | 12 | 3 | 25 | |||||||||||||
| 218-227 | 12 | 2 | 16 | |||||||||||||
| 239-247 | 3 | 1 | 33 | |||||||||||||
| 243-252 | 2 | 1 | 50 | |||||||||||||
| 244-253 | 2 | 1. | 50 | |||||||||||||
| 248-257 | 5 | 1 | 33 | 0 | ||||||||||||
| 249-257 | 7 | 1 | 0 | 50 | ||||||||||||
| 2S2-271 | 2 | 2 | 100 | |||||||||||||
| 263-271 | 2 | 1 | 50 | |||||||||||||
| 269-277 270-279 | 6 2 | 1 1 | 0 | 50 | 0 | 0 | 50 | |||||||||
| 271-279 | 2 | 1. | 50 | |||||||||||||
| 284-293 | 8 | 1 | û | 0 | 50 | 0 | ||||||||||
| 285-293 | 8 | 1 | 0 | 0 | 50 | 0 | ||||||||||
| 295-303 | 2 | 1 | 50 | |||||||||||||
| 321-329 | 14 | 2 | 16 | 0 | ||||||||||||
| 325-334 | 8 | 1 | 0 | 0 | 50 | 0 | ||||||||||
| 326-334 345-354 | 5 | 3 1 | 66 | 33 | 0 | 50 | ||||||||||
| 362-371 | 7 | 1 | 33 | 0 | 0 | |||||||||||
| 363-371 368-376 | 5 12 | 1 3 | 33 | 25 | β | |||||||||||
| 371-379 | 15 | 1 | 0 | 8 | ||||||||||||
| Nb EPITOPES | 3 | 10 | 5 | 4 | 0 | 2 | 5 | 1 | 2 | 0 | 4 | 3 | 0 | 3 |
Tableau 4 : Epitopes T CDS de CCNS1 identifies pour les différents allèles HLAA et B % Répondeurs (Restriction HLA, Nb donneurs testés)
[0097] Concernant l’allèle HLA-A*02:01 (noté HLA-A2), le plus fréquemment retrouvé dans la population caucasienne [Tableau 3], 13 peptides HLA-A2 potentiels sélectionnés ont été évalués pour leur capacité d’induire une réponse des lymphocytes T
CD8+ chez 12 donneurs sains exprimant HLA-A2. Dix peptides HLA-A2 potentiels sur 13 sélectionnés se sont montrés capables d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ chez un nombre variable de donneurs HLA-A2 positifs, avec un nombre de lignées positives variant de 1 à 19 sur les 20 ensemencées [Tableau 4]. Ces 10 peptides correspondent donc à des épitopes T CD8 de la Cycline Bl restreints à HLA-A2. Sept de ces peptides activent des lymphocytes T chez au moins deux donneurs HLA-A2. La réponse la plus importante a été obtenue contre le peptide constitué des résidus 204 à 212 de la séquence Cycline Bl humaine SEQ ID NO : 1 qui a permis d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ chez 92% des donneurs HLA-A2 testés (11/12) avec la plus forte intensité de réponse (55 lignées positives générées sur 240 lignées ensemencées). A noter que la réponse envers le peptide 368-376 a été la seconde plus importante en terme d’intensité (28 lignées positives sur 240 lignées ensemencées) et liée à la très forte réponse observée chez un donneur répondeur (19 lignées positives sur 20 lignées ensemencées). Vingt-huit autres épitopes ont été identifiés pour les autres allèles majeurs HLA-A et HLA-B : 3 épitopes pour l’allèle HLA-A*01:01 (peptides 326-334, 362-371 et 363-371) ; 5 épitopes pour l’allèle HLA-A*03:01 (peptides 1-10, 2-10, 51-59, 248-257 et 345-354) ; 4 épitopes pour l’allèle HLA-A* 11:01 (peptides 42-51, 249-257, 270-279 et 271-279) ; 2 épitopes pour l’allèle HLA-A*29:02 (peptides 325-334 et 326-334) ; 5 épitopes pour l’allèle HLA-B*07:02 (peptides 36-44, 40-48, 81-89, 85-94 et 86-94), 1 épitope pour l’allèle HLA-B*08:01 (peptide 295-303), 2 épitopes pour l’allèle HLA-B*15:01 (peptides 243-252 et 244-253), 4 épitopes pour l’allèle HLA-B*35:01 (peptides 79-88, 262-271, 263-271 et 269-277), 3 épitopes pour l’allèle HLA-B*40:01 (peptides 83-92, 284-293 et 285-293) et enfin 3 épitopes pour l’allèle HLA-B*51:01 (peptides 85-94, 86-94 et 239-247) [Tableau 4].
[0098] Certains peptides, comme les peptides 85-94 (KVPMLVPVPV)(SEQ ID NO : 11) , 86-91 (VPMLVPVPV) (SEQ ID NO ; 12) et 326-334 (LMELTMLDY)(SEQ ID NO : 34) se sont montrés capables d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ chez des donneurs présentant différents HLA.
[0099] Grâce à cette méthode robuste d’identification, de nouveaux épitopes restreints à plusieurs allèles HLA-A (y compris HLA-A2) et HLA-B ont été identifiés.
[0100] Des peptides restreints à plusieurs allèles HLA-A et/ou B ont été identifiés et sont présentés dans le [Tableau 5]. Le nombre d'épitopes T CD8 (de 9-10 AA) présents dans chaque peptide est indiqué, ainsi que la restriction HLA de chacun de ces épitopes.
[Tableaux5]
| Peptide | Nb aa | Séquence | SEQ ID NO: | NT) épitopes T CD8 | Restriction |
| 36-59 | 24 | KPGLRPRTALGDIGNKVSEQLQAK | 40 | 4 | HLA-A*03:01 HLA-A’lkOl HLA-Bs'07:02 |
| 79-94 | 16 | LPKPL EKVPML VPVPV | 41 | 5 | HLA-Â*O2:Ô1 hla-b*07:02 HLA-B*35:01 HLA-BMCcOi HLA-B^l-Ol |
| 239-257 | 19 | VPKKMLQLVGVTAMFIASK | 42 | 5 | ΗΕΑ-Α’03:01 HLA-A*ll:01 HLA-B«15:01 PILA-B* 51:01 |
| 262-279 | 18 | YPPÈIGDFAFVTDNTyTK | 43 | 5 | HLA-A’lkOl HLA-B«35:O1 |
| 284-303 | 20 | QMEMKÎLRALNFGLGRPLPL | 44 | 3 | HL, A-B 1. HLA-B*4û:01 |
| 321-334 | 14 | TLAKYLMELTML.DY | 45 | 3 | HLA-A’01:01 HLA -As' 02:01 HLA-A’29:03 |
| 362-379 | 18- | TPTLQHYLSYTEESLLPV | 46 | 4 | HLA-A Ή) 1 AH HLA-A*O2:CI |
Tableau 5 : Séquences d'intérêt de la Cycline Bl comportant un ou plusieurs épitopes T CD8
[0101] Les 3 peptides 79-94, 239-257 et 262-279 contiennent chacun 5 épitopes T CD8 restreints aux allèles HLA-A*02:01 / HLA-B*07:02 / HLA-B*35:01 / HLA-B*40:01 / HLA-B*51:01, HLA-A*03:01 / HLA-A*ll:01 / HLA-B*15:01 / HLA-B*51:01 et HLA-A*ll:01 / HLA-B*35:01, respectivement. Les 2 peptides 36-59 et 362-379 contiennent chacun 4 épitopes T CD8 restreints aux allèles HLA-A*03:01 / HLAA*ll:01 / HLA-B*07:02 et HLA-A*01:01 / HLA-A*02:01, respectivement. Les 2 peptides 284-303 et 321-334 contiennent chacun 3 épitopes T CD8 restreints aux allèles HLA-B*08:01 / HLA-B*40:01 et HLA-A*01:01 HLA-A*02:01 HLA-A*29:02, respectivement.
[0102] 3. Combinaison des épitopes T CD8 avec les épitopes T CD4 précédemment identifiés
[0103] Il est désormais couramment accepté que l’efficacité d’un vaccin anti-cancer dépend de sa capacité à induire à la fois une réponse des lymphocytes T CD8+ et T CD4+ synergique dirigée contre l’antigène ciblé (Melief C. J. M., Clin. Cancer Res., 2013, 19, 4295-4296 ; Hirayama, M. & Nishimura, Y. Int. Immunol., 2016, 28, 319-328). Ainsi, en reprenant chacun des épitopes T CD4 immunogènes à large spécificité précédemment décrits dans la Demande internationale W02015/001526, plusieurs longs fragments de la Cycline B1 comportant à la fois des épitopes T CD4 et CD8 ont été définis. Le [Tableau 6] présente 16 peptides parmi les combinaisons possibles. Chacun des peptides présentés dans ce tableau associe donc au moins un épitope CD8 restreint à une ou plusieurs molécules HLA de classe I avec un ou plusieurs épitopes CD4 restreints à au moins six molécules HLA II prépondérantes différentes choisies parmi les molécules HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR11, HLADR13, HLA-DR15, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DP401 et HLADP402 codées respectivement par les allèles HLA DRBl*0101, DRB 1*0301, DRBl*0401, DRBl*0701, DRBl*1101, DRBl*1301, DRBl*1501, DRB3*0101, DRB4*0104, DRB5*0101, DP*0401 et DP*0402. Seul l’allèle HLA-B*07:02 n’a pas d’épitope CD8 commun avec un épitope CD4.
[Tableauxô]
Epitopes CDS Epitopes CD4
| Peptide | Taille | Position | Restriction | Répondeurs (%) | Position | Restriction Mb d'aiièies | Répondeur » |
| HLA ii | |||||||
| 1-15 | 15 AA | 1-10 | HLA--A*03:01 | 100 | 1-15 | 6 | 77 |
| 1-31 | 31 AA | 1-10 | HLA-A *03:01 | 100 | 1-15 | 6 | |
| 17-31 | 5 | ||||||
| 168-182 | 15 AA | 170-178 | HLA-A*O2:Û1 | 8 | 168-182 | 7 | 62 |
| 170-216 | 47 AA | 170-178 | HLA-A*02:01 | 199-216 | 11 | ||
| 204-212 | HLA-A*02:01 | ||||||
| HLA A'03.01 | |||||||
| 239-258 | 20 AA | 239-257 | HLA-A*ll:0I H LA-B* 15:01 HLA-B*51:01 | 62 | 2.4.1 253 | 9 | 54 |
| 2.39-257 | HLA-A*03:01 HLA-A*ll:01 HlA-B*T5:01 HLA-B*51:01 | 241-258 | 11 | ||||
| 239-281 | 43 AA | 67 | 250-264 | 11 | 85 | ||
| 262-279 | HLA-A* 11:01 HLA 8'35.01 | 267-281 | •7 | ||||
| 250-279 | 30 AA | 262-279 | HLA-A* 11:01 HLA-B*35:01 | 67 | 250-264 | 11 | 15 |
| 262-281 | 20 AA | 262-279 | HLA-A* 11:01 » LA-B' 35:01 | 67 | 267-281 | 7 | 46 |
| 280-303 | 24 AA | 284-303 | HLA-B*08:01 H LA-8*40:01 | 50 | 280-299 | 12 | 85 |
| 284-303 | HLA-B*08.:01 | 280-299 | 12 | ||||
| HLA-B*40::01 | 299-317 | 8 | |||||
| 280-337 | 58 AA | 321-334 | HLA 4’01:01 HLA-A*O2:Û1 HLA-A*29:02 | 37 | 320-337 | 12 | 92 |
| 284-317 | 34 AA | 284-303 | HlA-8*Q8:01 HLA-B*40:01 | 50 | 299-317 | 8 | 77 |
| 345-354 | HLA-A*03:01 | 342-356 | 7 | ||||
| 342-388 | 47 AA | 362-379 | HLA~A*Û1:O1 | 41 | 363-380 | u | 85 |
| HLA-A.*02:01 | 374-388 | 6 | |||||
| 362-380 | 19 AA | 362-379 | h LA-AO :01 HLA-A*02:01 | 40 | 363-380 | 11 | 38 |
| 362-388 | 27 AA | 362-379 | HLA-A*01:01 | 40 | 363-380 | 11 | 77 |
| HLA-A*02:01 | 374-388 | 5 |
Tableau 6 : Longs fragments de la Cycline Bl combinant des épitopes T CD8 et CD4
[0104] 4, Conclusions
[0105] Jusqu’à présent, seuls quelques épitopes T CD8 restreints aux molécules HLA
A*02:01 avaient été identifiés dans la séquence de la Cycline Bl. A l’aide de programmes de prédiction de liaison HLA-peptide couplés à des tests in vitro d’amplification de cellules T CD8+ appliqué à des échantillons de sang issus de différents donneurs sains, une analyse exhaustive de la séquence de la Cycline Bl a été réalisée, permettant d’identifier 38 épitopes T CD8 restreints aux principaux HLA de classe I rencontrés dans la population caucasienne. Cela inclut 10 épitopes T CD8 restreints à HLA-A2 et 28 épitopes T CD8 restreints aux dix autres principales molécules HLA de classe I, permettant d’avoir une couverture de 65% des allèles HLA-A et 44% des allèles HLA-B en moyenne dans les différentes populations caucasiennes [Tableau 3].
[0106] Enfin, de longs peptides issus de la Cycline Bl, riches en épitopes T CD8 (multi-épitopiques), ont été identifiés dans la séquence de la Cycline Bl. Combinés avec les épitopes T CD4 très immunogènes, les peptides multiépitopiques identifiés dans la séquence de la Cycline Bl pourraient permettre le design d’un vaccin à large spectre contre les cancers surexprimant la Cycline Bl utilisable chez un grand nombre de patients quel que soit leur typage HLA de classe I et II [Tableau 6].
Claims (1)
-
Revendications [Revendication 1] Composition immunogène ou vaccinale comprenant un épitope ou une combinaison d’épitopes T CD8 de la Cycline Bl humaine : a) ledit épitope étant choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 11, 12 et 34, ou b) les épitopes de ladite combinaison étant choisis parmi au moins deux des groupes d’épitopes suivants: - Groupe I constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 2, 3, 7, 22 et 35 ; - Groupe II constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 4, 5 et 9 ; - Groupe III constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 6, 23, 27 et 28 ; - Groupe IV constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 8, 24, 25 et 26 ; - Groupe V constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 10, 29 et 30 ; - Groupe VI constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 13, 14, 15, 16, 17,18, 32, 38 et 39; - Groupe VII constitué de l’épitope de séquence SEQ ID NO : 19; - Groupe VIII constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 20 et 21; - Groupe IX constitué de l’épitope de séquence SEQ ID NO : 31 - Groupe X constitué de l’épitope de séquence SEQ ID NO : 33; et - Groupe XI constitué des épitopes de séquence SEQ ID NO : 36 et 37 ; ledit épitope ou la dite combinaison d’épitopes étant apte à être présenté par au moins deux molécules HLA I prépondérantes différentes choisies parmi les molécules HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLAA29, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B35, HLA-B40 et HLA-B51, et ladite composition étant apte à induire une réponse en lymphocytes T CD8+ humains spécifiques chez des individus exprimant au moins l’une desdites molécules. [Revendication 2] Composition selon la revendication 1, dans laquelle le ou lesdits épitopes T CD8 sont inclus dans un ou plusieurs peptides de la Cycline Bl humaine, polypeptides multi-épitopiques chimériques, et/ou protéines chimériques. [Revendication 3] Composition selon la revendication 2, dans laquelle ledit ou lesdits peptides de la Cycline Bl humaine consistent en une séquence d’au plus 100 acides aminés consécutifs de la Cycline Bl humaine de SEQ ID NO : 1, de préférence de 31 à 100 acides aminés consécutifs de ladite séquence. [Revendication 4] Composition selon la revendication 3, dans laquelle ledit peptide de la Cycline B1 humaine comprend une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 40 à 46. [Revendication 5] Composition selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, comprenant en outre au moins un épitope T CD4 de la Cycline B1 humaine, inclus dans le même peptide, polypeptide ou protéine que lesdits épitopes T CD8 ou bien dans des peptides, polypeptides ou protéines séparés. [Revendication 6] Composition selon la revendication 5, comprenant au moins un épitope T CD4 de la Cycline B1 choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 47, 49, 58,59, 63 à 72 et 91 à 96 [Revendication 7] Composition selon la revendication 5 ou 6, comprenant au moins un peptide d’au plus 100 acides aminés, de préférence de 31 à 100 acide aminés, de la Cycline B1 humaine, comprenant la séquence SEQ ID NO : 51 à 57 ou 60 à 62. [Revendication 8] Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant en outre au moins un peptide d’au plus 100 acides aminés, de préférence de 31 à 100 acide aminés, de la Cycline B1 humaine, comprenant la séquence SEQ ID NO : 48, 50 ou 59. [Revendication 9] Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant un ou plusieurs polynucléotides codant le ou lesdits peptides, polypeptides et/ou protéines, de préférence inclus dans au moins un vecteur recombinant. [Revendication 10] Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, pour son utilisation dans l’immunothérapie prophylactique ou curative d’un cancer associé à la surexpression de la Cycline Bl, de préférence un cancer sélectionné dans le groupe constitué par : les cancers du sein, du colon, de la prostate, de l’œsophage, de l’estomac, des poumons et les cancers ORL. [Revendication 11] Utilisation in vitro de la composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 pour le diagnostic d’un cancer associé avec la surexpression de la Cycline Bl ou 1’immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Cycline Bl au cours d’un cancer ou d’un traitement anticancéreux.. Sequence de nucléotide
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