WO2020144355A2 - Peptides immunogènes issus de la nucléoprotéine du virus ebola zaïre - Google Patents

Peptides immunogènes issus de la nucléoprotéine du virus ebola zaïre Download PDF

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WO2020144355A2
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Bernard Maillere
Yann GALLAIS
Evelyne CORREIA
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the invention relates to an immunogenic or vaccine composition against the Ebola virus, comprising at least one immunogenic peptide derived from the nucleoprotein of the Zaire Ebola virus, which is capable of inducing a response in human CD4 + T lymphocytes specific for the Ebola virus.
  • the invention also relates to the use of said composition as a preventive vaccine against the Ebola virus and as a reagent for the immunomonitoring of the cellular response against the Ebola virus.
  • the Ebola virus is a virus from the family of the highly virulent Filoviridae, responsible for epidemics of fatal haemorrhagic fevers, in humans and non-human primates. This virus consists of a single envelope protein, Glycoprotein (GP), as well as internal proteins including Nucleoprotein (NP).
  • Glycoprotein GP
  • NP Nucleoprotein
  • the Zaire Ebola virus (EBOV) has been responsible for most outbreaks since the discovery of the Ebola virus in 1976, with an average case fatality rate of around 50% (25% to 90% in recent outbreaks).
  • GP glycoprotein
  • replicative viral vectors such as vesicular stomatitis virus (rVSV-Ebov), cytomegalovirus (rCMV), or human parainfluenza virus type 3 (HPIV3), as well as non-replicative adenoviruses Chad3-EBOV (Chimp adenovirus), EBOLA rAd-5 and Ad26.ZEBOV.
  • plasmids INO-4212 or VRC-EBODNA023-00-VP
  • nanoparticles containing the recombinant glycoprotein (GP) combined with a saponin-based adjuvant Matrix-M TM.
  • CD4 + T lymphocytes have an auxiliary or regulatory function and recognize antigens like antigens of pathogens, especially viruses, in the form of peptides presented by the molecules of the Major Histocompatibility Complex Class II (HLA II in l 'man).
  • HLA II Major Histocompatibility Complex Class II
  • the specificity of binding of HLA II molecules being very variable from one HLA class II molecule to another, these peptides vary from one individual to another, taking into account the polymorphism of HLA II molecules in the population.
  • CD4 + T epitopes of the Ebola virus and in particular of Ebola Zaire have been described so far and only in studies in mice, in particular in transgenic mice for the HLA- allele DR3.
  • EBOV Ebola Zaire
  • five potential CD4 + T epitopes of GP and NP of EBOV were identified on the basis of their prediction of binding to the HLA-DR1, -DR3, -DR4, -DR7, -DR8, - DR1 1 alleles, -DR13 and -DR15.
  • CD4 + T epitopes of Ebola Zaire EBOV
  • NP nucleoprotein
  • the inventors have identified many peptides of NP and GP of the Zaire Ebola virus capable of stimulating CD4 + T lymphocytes specific to the Ebola virus in a panel of healthy donors representative of the Caucasian and African populations ([Table 2] and [Table 3]; [Fig. 1] and [Fig. 2]).
  • the responses against peptides from NP are more intense than those against peptides from GP, both in terms of the number of donor donors and in terms of response intensity (number of positive lines) and there is a good correlation between response rate and intensity, for NP peptides.
  • NP peptides are more conserved and therefore potentially effective against the different Ebola strains, as evidenced by the cross-reaction of CD4 T lymphocytes specific for conserved NP peptides from the Zaire strain with respect to the peptides.
  • Ten peptides for NP and eight for GP induce responses in 50% of donors or more.
  • Four peptides from NP and five peptides from GP allow vaccination coverage of the entire reference population (frequency of responders 100%), while inducing a response intensity of 20% for NP and 23% for GP ([Table 8] and [Table 9 ];
  • LSP long polypeptide fragments
  • 3 LSPs for NP make it possible to cover all of the donors tested, with a response intensity of 29% and 41% respectively [(Fig. 5 ] and [Fig. 6]).
  • the addition of other peptides or other LSPs without increasing the response rate makes it possible to amplify the intensity of response.
  • Many CD4 T lymphocyte lines specific for NP and GP peptides are capable of recognizing presenter cells loaded with the corresponding protein, demonstrating that these epitopes are naturally presented by presenter cells.
  • the present invention relates to an immunogenic or vaccine composition against the Ebola virus, comprising at least a first immunogenic peptide derived from the nucleoprotein of the Zaire Ebola virus which is capable of inducing a response in human CD4 + T lymphocytes specific for the Ebola virus, and optionally at least one second immunogenic peptide derived from the Zaire Ebola glycoprotein which is capable of inducing a response in human CD4 + T lymphocytes specific for the Ebola virus.
  • nucleoprotein (NP) of the Zaire Ebola virus is meant the protein of sequence SEQ ID NO: 1 or UniProt AAD14590.1.
  • glycoprotein (GP) from the Zaire Ebola virus (ZEBOV) means the protein with sequence SEQ ID NO: 25 or UniProt AKG65268.1.
  • CD4 + T epitope means a peptide of 11 to 25 amino acids which binds to at least one HLA II molecule, in particular at least one HLA-DR allele frequent in different populations as presented in [Table 1], and is recognized by specific CD4 + T lymphocytes in individuals carrying this HLA II molecule; the peptide comprises a sequence of 9 amino acids including the anchoring residues for HLA II molecules, flanked by at least 1 amino acid, preferably at least 2 or 3 amino acids at each of its ends.
  • CD4 + T lymphocytes are understood to mean CD4 + T lymphocytes specific for NP or GP for the Ebola virus.
  • frequency or rate of in vitro responders to a peptide according to the present invention means the percentage of human individuals from a reference group for which human CD4 + T lymphocyte lines specific for said peptide have been obtained.
  • Intensity of the in vitro response to a peptide according to the present invention is understood to mean the percentage of CD4 + T lymphocyte lines specific for said peptide which have been obtained in a group of reference human individuals relative to the totality of the lines specific CD4 + T lymphocytes obtained with the different peptides of the same protein (NP or GP).
  • reference group is meant a set of human individuals expressing various HLA II molecules, in particular various HLA-DR molecules including the most frequent HLA-DR alleles in different populations, such as the reference group of examples ( [Table 2] and [Table 3]).
  • the reference group is considered to be representative of a population or a set of populations, that is to say, it provides extrapolable results to this or these population (s).
  • Ebola virus means any isolate of the Ebola virus.
  • the percentage identity of an amino acid sequence is defined by the percentage of amino acid residues in a sequence to be compared which are identical to a reference sequence after alignment of the sequences, by introducing spaces, if necessary. , so as to obtain an identity of maximum sequence. Alignment of sequences in order to determine the percentage identity of a sequence can be carried out in various ways known to those skilled in the art, for example using available public software such as BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-). This software is preferably used with default settings.
  • the peptide NP comprises at least one CD4 + T epitope derived from the NP of sequence SEQ ID NO: 1
  • the peptide GP comprises at least one CD4 + T epitope derived from the GP of sequence SEQ ID NO: 25, which epitope binds at least one HLA-DR allele as presented in [Table 1] and is capable of inducing a response in human CD4 + T lymphocytes specific for the Ebola virus.
  • the capacity of the peptides of the invention to bind HLA II molecules are evaluated according to standard techniques known to those skilled in the art, such as those described in particular in the examples. These include in silico methods and standard binding tests specific for HLA II molecules.
  • the in silico methods use CMH-II binding prediction tools, notably from the IEDB database (http://www.iedb.org/) and appropriate software such as the NetMHCIIpan and Sturniolo algorithms, for example.
  • the conventional tests for specific binding of HLA II molecules are in particular tests in competition with immunoenzymatic revelation as described in the American patent US 6,649,166.
  • the capacity of the peptides of the invention to induce a response in specific human CD4 + T lymphocytes, the specificity of the CD4 + T lymphocytes induced with respect to the peptides or the NP or GP protein, as well as the The ability of the peptides of the invention to be recognized by specific CD4 + T lymphocytes is evaluated according to standard techniques known to those skilled in the art, such as those described in the examples. These include a cell proliferation test, an ELISPOT test (assay of cytokine-producing cells) or a assay test for intracellular cytokines, specific for a cytokine produced by activated CD8 + T cells such as IFN-g, IL-2, IL-4 or IL-10.
  • the examples show that the peptides of the invention are capable of inducing a response in specific human CD4 + T lymphocytes from precursors present in naive human individuals of a reference group.
  • said NP or GP peptide binds to at least four different HLA-DR alleles chosen from HLA-DRB1 * 01:01, HLA-DRB1 * 03:01, HLA-DRB1 * 04: 01, HLA-DRB1 * 04: 05, HLA-DRB1 * 07: 01, HLA-DRB1 * 01, HLA-DRB1 * 01, HLA-DRB1 * 01, HLA-DRB1 * 07: 01, HLA-
  • DRB1 * 13 01, HLA-DRB1 * 15: 01, HLA-DRB3 * 01: 01, HLA-DRB3 * 02: 02, HLA-DRB4 * 01: 01 and HLA-DRB5 * 01: 01; these 15 HLA-DR alleles are representative of the Caucasian and African populations.
  • said NP or GP peptide induces a response in specific human CD4 + T cells in a reference group expressing the HLA-DRB1 * 01:01 alleles, HLA-DRB1 * 03:01 , HLA- DRB1 * 04:01, HLA-DRB1 * 07:01, HLA-DRB1 * 09:01, HLA-DRB1 * 11:01, HLA-
  • DRB1 * 13 01, HLA-DRB1 * 15: 01, HLA-DRB3 * 01: 01, HLA-DRB3 * 02: 02, HLA-
  • HLA-DRB5 * 01: 01 these HLA-DR alleles are representative of the Caucasian and African populations.
  • this set of alleles makes it possible to cover 83% of the individuals of the world population; 88% of individuals from Europe; 60% of individuals from Central Africa; 70.4% of individuals in East Africa; 21.2% of individuals from Sub-Saharan Africa; 73% of individuals in North Africa and 63.8% of individuals in West Africa.
  • said NP peptide is selected from the group consisting of: sequences SEQ ID NO: 2 to 24 and sequences comprising at most three amino acid mutations in said sequences or a deletion of at most three amino acids at the ends of said sequences.
  • said GP peptide is selected from the group consisting of: the sequences SEQ ID NO: 26, 27 and 29 to 58 and the sequences comprising at most three amino acid mutations in said sequences or a deletion of at most three amino acids at the ends of said sequences.
  • the invention encompasses the natural or synthetic variant peptides obtained by mutation (insertion, deletion, substitution) of one or more amino acids in the nucleoprotein sequence of sequence SEQ ID NO: 1 or of the glycoprotein of sequence SEQ ID NO: 25, since said peptide retains its immunogenic properties of the CD4 + T epitope of the Ebola virus and is capable of stimulating a response in human CD4 + T lymphocytes specific to the Ebola virus, that is to say that they are recognized by CD4 + T lymphocytes specific for the wild sequence or for a natural variant of the Ebola virus.
  • the mutations are advantageously dispersed in the sequence of the peptides; preferably they are spaced by at least 3 amino acids, preferably by at least 5 amino acids.
  • the variant peptide comprises a deletion of 1, 2 or 3 amino acids at one and / or the other end of said sequences.
  • said variant peptide comprises at most three (1, 2 or 3) amino acid substitutions in said sequences.
  • Said substitutions are advantageously dispersed substitutions as defined above.
  • said composition comprises at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 23 and 24; such peptides advantageously have an in vitro responder frequency of at least 33% and / or an in vitro response intensity of at least 3.5% in a reference group ([Table 2]).
  • Said composition preferably comprises at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, 3, 6, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 19, 23 and 24; such peptides advantageously have an in vitro responder frequency of at least 50% and / or an in vitro response intensity of at least 5% in a reference group ([Table 2]).
  • said composition comprises at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 3, 6, 8, 17, 19, 23 and 24; such peptides advantageously have an in vitro responder frequency of at least 50% and an in vitro response intensity of at least 5% in a reference group ([Table 2]).
  • said composition comprises at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 21, 22 and 23; preferably at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 3, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 21 and 23; preferably at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 4, 8, 9, 13, 14 and 18.
  • said composition comprises at least one conserved NP peptide, that is to say the sequence of which is conserved in at least one other species of the Ebola virus, preferably Ebola Sudan; preferably a sequence conserved in Ebola Zaire Sudan, Reston, Bundibugyo and Tai Forest.
  • the sequence of said peptide has at least 75% identity, preferably at least 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with the sequence of another species of the Ebola virus, of preferably Ebola Sudan; preferably with the sequences of Ebola Sudan, Reston, Bundibugyo and Tai Forest.
  • composition advantageously comprises at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, 3, 5, 8, 9, 17, 19, 21, 23 and 24, the sequences SEQ ID NO: 2, 3, 5, 8 , 9, 17, 21, 23 and 24, the sequences SEQ ID NO: 3, 5, 8, 9, 17, 23 and 24 or the sequences SEQ ID NO: 3, 5, 8, 9, 17, 19, 23 and 24; preferably at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 3, 5, 9, and 23; preferably at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 9, 3 and 23.
  • said composition advantageously comprises at least one NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 9, 3 and 23, that is to say the peptide of sequence SEQ ID NO: 9; the peptide of sequence SEQ ID NO: 3; the peptide of sequence SEQ ID NO: 23; peptides of sequence SEQ ID NO: 9 and 3; peptides of sequence SEQ ID NO: 9 and 23; peptides of sequence SEQ ID NO: 3 and 23 or peptides of sequence SEQ ID NO: 3, 9 and 23; said composition optionally comprises at least one other conserved NP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 2, 5, 8, 17, 19, 21 and 24; the sequences SEQ ID NO: 2, 5, 8, 17, 21 and 24; the sequences SEQ ID NO: 5, 8, 17 and 24 or the sequences SEQ ID NO: 5, 8, 17, 19 and 24; preferably from the sequences SEQ ID NO: 8 and 17; said composition advantageously comprises at least one another NP peptide selected from the group consisting of the sequences
  • composition preferably comprises 4 to 10 (4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) or plus said NP peptides including the peptide of sequence SEQ ID NO: 9, the peptide of sequence SEQ ID NO: 3 and / or the peptide of sequence SEQ ID NO: 23.
  • said NP peptides are chosen from the sequences SEQ ID NO: 2 to 18 and 20 to 24.
  • said composition comprises at least one GP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 29, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 41, 42, 43, 48, 53 and 57; such peptides advantageously have an in vitro responder frequency of at least 33% and / or an in vitro response intensity of at least 3.5% in a reference group ([Table 3]).
  • Said composition preferably comprises at least one GP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 42 and 43; such peptides advantageously have an in vitro responder frequency of at least 50% and / or an in vitro response intensity of at least 5% in a reference group ([Table 3]).
  • said composition comprises at least one GP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 31, 33, 35, 39, 42 and 43; such peptides advantageously have an in vitro responder frequency of at least 50% and an in vitro response intensity of at least 5% in a reference group ([Table 3]).
  • said composition comprises at least one GP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 44, 46 to 51, 53 and 56 to 58; preferably at least one GP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 31, 33, 39, 41, 48, 53 and 57; preferably at least one GP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 31, 33 and 39.
  • said composition comprises at least one conserved GP peptide, that is to say the sequence of which is conserved in at least one other species of the Ebola virus, preferably Ebola Sudan ; preferably a sequence conserved in Ebola Zaire Sudan, Reston, Bundibugyo and Tai Forest.
  • the sequence of said peptide has at least 75% identity, preferably at least 90%, 95%, 98%, 99% or 100% identity with the sequence of another species of the Ebola virus, of preferably Ebola Sudan; preferably with sequences from Ebola Sudan, Reston, Bundibugyo and Tai Forest.
  • the composition advantageously comprises at least one GP peptide chosen from the sequences SEQ ID NO: 31, 33 and 35; preferably at least the peptide GP of sequence SEQ ID NO: 35.
  • said composition comprises at least four NP and / or GP peptides as defined above, preferably 4 to 10 (4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) or more of NP and / or GP peptides as defined above.
  • said composition comprises at least 4 NP peptides and / or at least 5 GP peptides as defined above.
  • said composition comprises at least 4 NP peptides and / or at least 5 GP peptides as defined above including at least one conserved peptide as defined above, preferably at least one NP peptide preserved chosen from the sequences SEQ ID NO: 9, 3 and 23.
  • said composition is capable of inducing a frequency of in vitro responders and / or a determined intensity of in vitro response, for example a frequency of at least 75%, 90% or 100% and / or a response intensity of at least 20%, 30% or 50% in a reference group.
  • the sequence and the number of peptides making it possible to obtain the desired frequency or intensity of response are determined using the response profile of the peptides in the reference group of examples as presented in [Table 2] and the [Table 3], respectively for NP and GP.
  • the frequency and intensity of response of the composition are determined for the NP or GP protein, by adding the frequencies or the intensities obtained for each of the NP or GP peptides present in the composition.
  • compositions according to the invention there may be mentioned:
  • composition comprising:
  • composition is capable of inducing an in vitro responder frequency of 100% and a response intensity of 20% in a reference group [Fig. 3];
  • composition comprising:
  • composition comprising the NP peptides of sequence SEQ ID NO: 3, 6, 8, 12, 16, 17, 19, 23 and 24; this composition is capable of inducing an in vitro responder frequency of 100% and a response intensity of 50% in a reference group;
  • composition comprising the peptides GP of sequence SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35, 37 42, 43 and 53; this composition is capable of inducing an in vitro responder frequency of 100% and a response intensity of 50% against GP in a reference group;
  • composition comprising the peptides NP of sequence SEQ ID NO: 8, 9 and 17; preferably the NP peptides of sequence SEQ ID NO: 5, 8, 9, 17 and 19; this composition includes peptides conserved in the different Ebola strains and is capable of inducing an in vitro responder frequency of 75% and a response intensity of 18.5% and 28% respectively against NP in a reference group.
  • said composition according to the invention comprises at least:
  • polypeptide comprising at least one of the peptides defined in (a), in particular a polypeptide derived from the NP protein of sequence SEQ ID NO: 1 or a polypeptide derived from the GP protein of sequence SEQ ID NO: 25; said polypeptide possibly being modified;
  • a chimeric multiepitopic polypeptide comprising at least one of the peptides defined in (a); said polypeptide possibly being modified;
  • a fusion protein comprising at least one of the peptides defined in (a); said fusion protein possibly being modified;
  • the composition comprises a mixture of peptides; a polypeptide derived from NP or GP or a mixture of said polypeptides; a mixture of peptides and polypeptides; a polynucleotide or a mixture of polynucleotides.
  • the immunogenic or vaccine composition comprises at least one isolated NP peptide, and optionally at least one isolated GP peptide, preferably a mixture of at least 2, preferably 4 to 10 (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) or more of said NP peptides, and optionally GP.
  • the immunogenic or vaccine composition comprises at least one polypeptide derived from the NP protein of sequence SEQ ID NO: 1 comprising at least one NP peptide, and optionally at least one polypeptide derived of the GP protein of sequence SEQ ID NO: 25 comprising at least one GP peptide.
  • said polypeptide comprises at least two N P or GP peptides, preferably 3 to 5 (3, 4, 5) or more of said peptides.
  • Said polypeptide derived from NP is advantageously a polypeptide of at most 100 amino acids derived from NP of sequence SEQ ID NO: 1, comprising at least one sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2 to 24 and the sequences comprising at most three amino acid mutations in said sequences or a deletion of at most three amino acids at the ends of said sequences as defined above.
  • Said peptide advantageously consists of a sequence of 20 to 100 amino acids (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 or 90, 95 or 100), preferably 30 to 70 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence of 20 to 100 amino acids (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 , 80, 85 or 90, 95 or 100), preferably 30 to 70 amino acids, having at least 70% identity, preferably at least 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% or 99%% identity with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • said composition comprises at least one polypeptide derived from said NP selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 59 to 66.
  • composition comprising the NP peptide of sequence SEQ ID NO: 12 and the NP polypeptides of sequence SEQ ID NO: 61 and 62; this composition is capable of inducing an in vitro responder frequency of 100% and a response intensity of 29% [Fig. 5].
  • Said polypeptide derived from GP is advantageously a polypeptide of at most 100 amino acids derived from GP with sequence SEQ ID NO: 25, comprising at least one sequence chosen from the sequences sequences SEQ ID NO: 26, 27 and 29 to 58 and the sequences comprising at most three amino acid mutations in said sequences or a deletion of at most three amino acids at the ends of said sequences as defined above.
  • Said peptide advantageously consists of a sequence of 20 to 100 amino acids (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 or 90, 95 or 100), preferably 30 to 70 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID NO: 25 or a sequence of 20 to 100 amino acids (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 , 80, 85 or 90, 95 or 100), preferably 30 to 70 amino acids, having at least 70% identity, preferably at least 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% or 99%% identity with the sequence SEQ ID NO: 25.
  • said composition comprises at least one polypeptide derived from said GP selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 67 to 74.
  • a preferred composition according to the invention mention may be made of the composition comprising the GP polypeptides of sequence SEQ ID NO: 68, 69 and 73; this composition is capable of inducing an in vitro responder frequency of 100% and a response intensity of 41% [Fig. 6].
  • compositions inducing equivalent frequencies and intensities of response can be easily obtained with other combinations of peptides and / or GP polypeptides, determined at from the response profiles of the GP peptides presented in [Table 3] and of the sequences of the peptides and polypeptides of NP presented in [Table 9].
  • the immunogenic or vaccine composition comprises a chimeric multiepitopic polypeptide comprising at least two NP peptides or at least one NP peptide and a GP peptide or a third peptide as defined above .
  • a chimeric polypeptide is defined as a succession of amino acids which is not present in nature.
  • a chimeric multiepitopic polypeptide according to the invention comprises at least two peptides as defined above, the sequences of said peptides being in said polypeptide, adjacent, linked by a linking element or separated by a sequence comprising another epitope.
  • the other epitope is in particular another CD4 + T epitope, a CD8 + T epitope or an NP and / or GP epitope of the Ebola virus, or else an epitope of an antigen of another pathogen, in particular a virus. hemorrhagic fever.
  • epitopes B of the NP of the Ebola virus there may be mentioned the peptides 173-187, 361-375, 365-379, 381-395, 417-431, 425-439, 485-499 and 505-515 of EBOV, said positions being indicated with reference to the sequence SEQ ID NO: 1.
  • epitopes B of the GP of the Ebola virus mention may be made of peptides 41-55, 52-66, 93-107, 112-126, 201-215, 217-231, 221-235, 225-239, 236-250, 301-305, 309-323, 317-331, 321-335, 325-339, 329-343, 333-347, 337-351, 341- 355, 345-359, 381-395, 385-399, 389-403, 393-407, 397-411 and 469-483 of EBOV, said positions being indicated with reference to the sequence SEQ ID NO: 25.
  • the polypeptide multiepitopic can also include several copies of the same peptide / epitope sequence.
  • the multiepitopic polypeptide comprises less than 100 consecutive amino acids of the NP of sequence SEQ ID NO: 1 and / or of the GP of sequence SEQ ID NO: 25, preferably less than 50, preferably less than 30.
  • the Multiepitopic polypeptide has a length of 20 to 200 amino acids, preferably 30 to 100 amino acids, preferably about 50 amino acids.
  • said peptide or polypeptide as defined above is a modified peptide or polypeptide comprising a modification in the amino acid residue (s), of the peptide bond or of its ends and said modified peptide or polypeptide retaining its properties of immunogenic peptide of NP or GP of the Ebola virus as defined above, that is to say that it is capable of inducing a response in specific human CD4 + T cells.
  • This or these modification (s), preferably one or more chemical modification (s), which are introduced into the peptides by the conventional methods known to a person skilled in the art, include, without limitation, one to minus the following chemical modifications: acetylation of the N-terminal amino acid residue and / or amidation of the C-terminal amino acid residue (Maillère et al., Molecular Immunology, 1195, 32, 1377-1385) , substitution of an amino acid by a non-proteinogenic amino acid (amino acid D or amino acid analog); the addition of a chemical group (lipid, oligo or polysaccharide) at the level of a reactive function, in particular of the side chain R; modification of the peptide bond (-CO-NH-), in particular by a bond of the retro or retro-inverso type (-NH-CO-) or a bond different from the peptide bond; cyclization; the fusion of the sequence of said peptide with that of a peptide (epitope of interest for vaccination);
  • modified peptide or polypeptide it comprises one or more N6-acetyl-lysine (s), phosphoserine (s) and / or phosphothreonine (s).
  • said modified peptide or polypeptide comprises the acetylation of its N-terminal amino acid residue and / or the amidation of its C-terminal amino acid residue.
  • said modified peptide or polypeptide is a lipopeptide or a lipopolypeptide.
  • Said lipopeptide or a lipopolypeptide can be obtained, in particular by adding a lipid to an ⁇ -amino function or to a reactive function of the side chain of an amino acid of said peptide or polypeptide; it may comprise one or more chains derived from C 4-20 fatty acids, optionally branched or unsaturated (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, 2-amino hexadecanoic acid, pimelautide, trimetauxide) or a derivative of a steroid.
  • the preferred lipid part is in particular represented by an N “-acetyl-lysine N e group (palmitoyl), also called Ac-K (Pam).
  • said NP peptide (s), and optionally said GP peptide (s) are included in a fusion protein (chimeric protein) comprising said peptide (s) fused with a heterologous protein (different from the NP or GP) or a heterologous polypeptide fragment (fragment of a protein different from NP or GP whose sequence is not directly adjacent to the sequence of said peptide in the sequence of said NP or GP).
  • Said peptide or peptides can be fused with the NH 2 or COOH end of said protein or of said heterologous polypeptide fragment or inserted into the sequence of said protein or of said fragment.
  • said chimeric protein consists of one or more peptides as defined above, fused with one of the chains of an HLA molecule, preferably the beta chain of an HLA II molecule or the alpha chain of an HLA I molecule, or else with a fragment thereof corresponding to a soluble HLA molecule, in particular a fragment corresponding to the extracellular domain preceded by the homologous signal peptide or a heterologous signal peptide.
  • Said peptide is advantageously inserted between the signal peptide and the NH 2 end of the extracellular domain of the chain a or b, as described for the HLA-DR molecule (Kolzin et al., PNAS, 2000, 97, 291-296).
  • the present invention also relates to an immunogenic or vaccine composition
  • an immunogenic or vaccine composition comprising at least one polynucleotide coding for at least one peptide, polypeptide, and / or chimeric protein as defined above.
  • the sequence of said polynucleotide is that of the cDNA encoding said peptide (s), polypeptide (s), and / or chimeric protein (s). Said sequence can advantageously be modified so that the use of the codons is optimal in the host in which it is expressed.
  • polynucleotides can be inserted into an expression vector, under the transcriptional control of an appropriate promoter, to allow the expression of said peptide (s) or polypeptide (s) according to the invention in a cell from the host.
  • vectors are known in themselves; the choice of an appropriate vector depends on the envisaged use for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of this sequence in extrachromosomal form, or else integration into the chromosomal material of the host), as well as the nature of the host cell.
  • naked nucleic acids DNA or RNA
  • viral vectors can be used such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses and AAVs into which the sequence of interest has been inserted beforehand; one can also associate said sequence (isolated or inserted into a plasmid vector) with a substance allowing it to cross the membrane of host cells, such as a transporter such as a nanotransporter or a preparation of liposomes, or cationic polymers, or else the introducing into said host cell using physical methods such as electroporation or microinjection.
  • these methods can advantageously be combined, for example by using electroporation associated with liposomes.
  • said vector is an expression vector comprising all the elements necessary for the expression of the peptide, polypeptide, fusion protein as defined above.
  • said vector comprises an expression cassette including at least one polynucleotide as defined above, under the control of regulatory sequences of transcription and optionally of appropriate translation (promoter, activator, intron, initiation codon ( ATG), stop codon, polyadenylation signal, splicing site).
  • said composition comprises at least one polynucleotide encoding said peptide (s), polypeptide (s), and / or fusion protein (s) as defined above , inserted into a naked nucleic acid, preferably naked DNA.
  • compositions in accordance with the invention may also comprise a modified antigen presenting cell, comprising at least one peptide, polypeptide, chimeric protein, polynucleotide and / or a vector as defined above, the cell being able to be changed stably or transiently.
  • the cell is in particular a cell presenting natural antigen such as a dendritic cell or a cell presenting artificial antigen, such as exosomes derived from dendritic cells.
  • the composition according to the invention can comprise a dendritic cell loaded with at least one peptide, polypeptide or chimeric protein according to the invention, or transformed with at least one polynucleotide or a vector according to the invention.
  • the immunogenic or vaccine composition according to the invention advantageously comprises a pharmaceutically acceptable vehicle, a carrier substance and / or an adjuvant.
  • compositions are those conventionally used.
  • the adjuvants are advantageously chosen from: oily emulsions, mineral substances, bacterial extracts, oligonucleotides containing CpG, saponin, aluminum hydroxide, monophosphoryl-lipid A and squalene.
  • the carrier substances are advantageously selected from the group consisting of: unilamellar or multilamellar liposomes, ISCOMS, virosomes, viral pseudoparticles, saponin micelles, solid microspheres of saccharide nature (poly (lactide-co-glycolide )) or gold, and nanoparticles.
  • composition according to the invention may further comprise adjuvants usually used in vaccines, and for example for promoting the administration of the active ingredient, stabilizing it, increasing its immunogenicity.
  • the immunogenic or vaccine composition comprises an effective dose of one or more peptide (s), polypeptide (s), protein (s), polynucleotide (s), and / or vector (s), making it possible to obtain a preventive effect on infection with an Ebola virus.
  • This dose is determined and adjusted based on factors such as the subject's age, gender and weight.
  • the composition is generally administered according to the usual vaccination protocols, at doses and for a duration sufficient to induce a cellular response in CD4 + T lymphocytes directed against the NP protein, and optionally against the GP protein (when the composition comprises immunogenic peptides of the GP).
  • the administration can be oral, parenteral or local, preferably by injection, in particular subcutaneous or intramuscular.
  • the composition is presented in a galenical form adapted to a chosen administration.
  • composition according to the present invention is advantageously used as a vaccine for the prevention of infections with the Ebola virus, in particular Ebola Zaire, Sudan, Reston, Bundibuygo and Tai Forest; preferably Zaire Ebola.
  • Ebola virus in particular Ebola Zaire, Sudan, Reston, Bundibuygo and Tai Forest; preferably Zaire Ebola.
  • the present invention also relates to a method of vaccination against the Ebola virus, characterized in that it comprises the administration of a vaccine composition as defined above, to an individual, by any appropriate means such as defined above.
  • composition according to the invention induces a response a cellular response in CD4 + T lymphocytes directed against the protein NP, and optionally against the GP protein (when the composition comprises GP immunogenic peptides).
  • the individual is preferably a human individual.
  • said immunogenic or vaccine composition is used in combination with another vaccine composition against the Ebola virus, in particular a composition comprising a recombinant GP protein or a vector encoding said protein.
  • Said vaccine compositions are used simultaneously, separately or sequentially.
  • the present invention also relates to the in vitro use of the composition as defined above as a reagent for the diagnosis of infection with the Ebola virus.
  • the present invention also relates to the in vitro use of the composition as defined above as a reagent for the immunomonitoring of the cellular response against the Ebola virus in an individual who has been exposed to the Ebola virus or who has been vaccinated against the Ebola virus.
  • the present invention also relates to an in vitro method of immunomonitoring of the cellular response against the Ebola virus in an individual who has been exposed to the Ebola virus or who has been vaccinated against the Ebola virus, characterized in that it includes:
  • the individual is preferably a human individual.
  • the biological sample is in particular whole blood, isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC), isolated CD4 + T lymphocytes or lymphocytes, in particular from PBMC.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the present invention also relates to a diagnostic or immunomonitoring reagent comprising the composition as defined above.
  • said reagent comprises at least one peptide, polypeptide or protein chimeric as defined above, for example labeled and / or complexed with an HLA molecule, in particular complexed with labeled HLA molecules, for example biotinylated, in the form of multimeric HLA / peptide complexes such as tetramers of HLA / peptide complexes , marked.
  • said reagent is included in a box (kit).
  • the present invention thus further relates to a method for analyzing CD4 + T lymphocytes specific for the Ebola virus, characterized in that it comprises at least the following steps:
  • a cell sample comprising CD4 + T lymphocytes with multimeric HLA / peptide complexes, labeled, in particular with a fluorochrome, said complexes being formed by the binding of soluble HLA molecules with at least one peptide , chimeric polypeptide or protein derived from the NP or GP of the Zaire Ebola virus according to the invention, and
  • the analysis of cells comprises the sorting of said cells.
  • the present invention also relates to an immunogenic peptide of the NP protein of the Zaire Ebola virus capable of inducing a response in specific human CD4 + T lymphocytes as defined above.
  • said NP peptide is selected from the group consisting of: sequences SEQ ID NO: 2 to 24 and sequences comprising at most three amino acid mutations in said sequences or a deletion of at most three amino acids at the ends of said sequences.
  • Said peptide advantageously consists of a sequence of 20 to 100 amino acids (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 or 90, 95 or 100), preferably 30 to 70 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence of 20 to 100 amino acids (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 or 90, 95 or 100), preferably 30 to 70 amino acids, having at least at least 70% identity, preferably at least 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% or 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • said polypeptide derived of said NP is selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 59 to 66.
  • the present invention also relates to an immunogenic peptide of the GP protein of the Zaire Ebola virus capable of inducing a response in specific human CD4 + T lymphocytes as defined above, said GP peptide being selected from the group consisting of: the sequences SEQ ID NO: 26, 27, 30, 31, 33, 34, 36, 38 to 44, 46 to 53 and 56 to 58 and the sequences comprising at most three amino acid mutations in said sequences or a deletion of '' at most three amino acids at the ends of said sequences.
  • Said peptide advantageously consists of a sequence of 20 to 100 amino acids (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 or 90, 95 or 100), preferably 30 to 70 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID NO: 25 or a sequence of 20 to 100 amino acids (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 , 80, 85 or 90, 95 or 100), preferably 30 to 70 amino acids, having at least 70% identity, preferably at least 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% or 99%% identity with the sequence SEQ ID NO: 25.
  • said polypeptide derived from said GP is selected from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 67 to 74.
  • the present invention also relates to a chimeric multiepitopic polypeptide or a chimeric protein comprising at least one NP and / or GP peptide as defined above, as well as a polynucleotide encoding at least one NP and / or GP peptide , a chimeric multiepitopic polypeptide and / or a chimeric protein comprising at least one NP and / or GP peptide as defined above, optionally inserted into an expression vector as defined above, in particular a viral vector or a naked nucleic acid as defined above.
  • the peptides and their derivatives as defined above are prepared by conventional techniques known to those skilled in the art.
  • the peptides and their derivatives can be synthesized in solid phase, according to the Fmoc technique, originally described by Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) or in the liquid phase, and purified by high performance liquid chromatography in the reverse phase.
  • the lipopeptides can in particular be prepared according to the method described in International Applications WO 99/40113 or WO 99/51630.
  • the peptides and their derivatives as defined above can also be produced from the corresponding cDNAs, obtained by any means known to those skilled in the art; the cDNA is cloned into a eukaryotic or prokaryotic expression vector and the protein or fragment produced in the cells modified by the recombinant vector are purified by any appropriate means, in particular by affinity chromatography.
  • the polynucleotides according to the invention are obtained by the conventional methods, known in themselves. For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR, by screening of genomic DNA libraries by hybridization with a homologous probe, or else by total or partial chemical synthesis.
  • Recombinant vectors are constructed and introduced into host cells by conventional recombinant DNA and genetic engineering methods, which are known per se. Brief description of the drawings
  • FIG. 1 shows the response rate and the intensity of response of CD4 + T cells to NP peptides.
  • A Number of donor donors for each of the 20-mer NP peptides tested.
  • B Number of T-cell lines positive for each of the 20-mer NP peptides tested.
  • FIG. 2 shows the response rate and intensity of response of CD4 + T lymphocytes to GP peptides.
  • A Number of donor donors for each of the 20-mer GP peptides tested.
  • B Number of positive T lymphocyte lines for each of the 20-mer GP peptides tested.
  • FIG. 3 shows an example of combinations of NP peptides.
  • A Percentage of donor donors according to the accumulation of peptides.
  • B Response intensity (in% of positive lines) as a function of the accumulation of peptides.
  • FIG. 4 shows an example of combinations of GP peptides.
  • FIG. 5 shows an example of combinations of long peptide fragments (LSP) originating from NP.
  • FIG. 6 shows an example of combinations of long peptide fragments (LSP) from GP.
  • LSP long peptide fragments
  • FIG. 7 shows the recognition of peptides from variants of the Ebola virus by CD4 T lymphocytes specific for conserved peptides from NP and GP from the Zaire strain of the virus.
  • CD4 T lymphocyte lines specific for peptides from the Zaire strain were incubated in the presence of presenting cells alone (NC or uncharged), or loaded with peptides from the Zaire strain (reference), Sudan, Reston or Bundibugyo .
  • the ability to recognize peptides from the Sudan, Reston and Bundibugyo variants of the Ebola virus by CD4 T cell lines is evaluated by ELISpot IFN- ⁇ .
  • FIG. 8 shows the recognition of the NP (nucleoprotein) and GP (glycoprotein) proteins of the Ebola virus by CD4 T lymphocytes specific for peptides.
  • the CD4 T lymphocyte lines specific for NP and GP peptides were incubated in the presence of presenting cells without peptide (NC or uncharged), or with a mixture of NP or GP peptides, or in presence of presenting cells previously loaded with NP protein or GP protein. After an overnight incubation, the activation of T lymphocytes is evaluated by ELISpot IFN- ⁇ .
  • the sequences of the NP (UniProt AAD14590.1; SEQ ID NO: 1) and of the GP (UniProt AKG65268.1; SEQ ID NO: 25) of the Ebola virus come from the Center US for Biotechnology Information (NCBI). The Zaire strain from 1976 was used (ZEBOV).
  • the peptides were selected using the CMH-II binding prediction tool, obtained from the IEDB database (http://www.iedb.org/).
  • the NetMHCIIpan and Sturniolo algorithms were used to predict the binding capacity of a given peptide to the selected HLA class II molecules.
  • Peptides of 20-seas containing the nearby hearts were then defined, so that the hearts are not in position 1 or in position 20 of the peptide.
  • the 20-sea peptides were synthesized by Pepscan (Netherlands), with a minimum purity of 80%.
  • the blood samples come from the French Blood Establishment (Rungis Center).
  • Peripheral blood mononuclear cells PBMC
  • Immature dendritic cells DC
  • Mature DCs were obtained from immature DCs after being cultured for two days in the presence of LPS.
  • CD4 + T lymphocytes were purified from PBMCs using magnetic microbeads coupled with anti-CD4 antibodies (Miltenyi Biotec). Donor genotyping was carried out by NGS by the company DKMS Life Science (Dresden, Germany).
  • CD4 + T lymphocytes (1 to 3 ⁇ 10 5 ) were cultured in a 96-well plate with a round bottom with autologous mature DCs previously loaded with pools of peptides (10 ⁇ g / ml).
  • the culture is carried out in IMDM medium supplemented with AB Serum (complete IMDM medium) containing 1000U / ml of IL-6 (R&D Systems) and 10ng / ml of IL-12 (R&D Systems). 25 lymphocyte lines were seeded for each pool of peptides.
  • the culture is stimulated after one week by adding 10,000 to 30,000 DC loaded with the peptide pools, 20 U / ml of IL-2 (R&D Systems) and 10ng / ml of IL-7 (R&D Systems ). Another stimulation is made after 14 and 21 days of culture. Between 5 and 7 days after the last stimulation, a specificity test is performed by ELISpot. Each culture well constitutes a line of CD4 + T lymphocytes.
  • Anti-human IFN-g antibodies (clone 1-D1 K, Mabtech, Sweden) were adsorbed at 2.5 ⁇ g / ml in PBS 1X (Mabtech) on 96-well Multiscreen HA plates (Millipore). After overnight incubation at 4 ° C, the plates were saturated by incubating them for 2 hours at 37 ° C with complete IMDM medium. The CD4 + T lymphocytes were incubated for 16 hours at 37 ° C. in these plates after having been washed in AIM-V medium containing 0.5 ng / ml of IL-7, in the presence of presenting cells (50,000 PBMC / well ) incubated in the presence of 10pg / ml of peptides.
  • a CD4 + T cell line is considered to be specific for the antigen if the number of spots in the wells containing the antigen is at least twice as high as the well not containing the antigen, the difference between the two types of wells being at least greater than 25.
  • RTable P Allelic frequency (%) of the main HLA-DRB1 molecules (data from www.allefrequencies.net]
  • the selected alleles are indicated in bold.
  • HLA-DRB3 * 01:01 alleles, HLA-DRB3 * 02:02, HLA-DRB4 * 01:01 and HLA-DRB5 * 01:01 were added.
  • 15 HLA-DR alleles, representative of the Caucasian and African populations, cited below were selected: HLA- DRB1 * 01: 01, HLA-DRB1 * 03: 01, HLA-DRB1 * 04: 01, HLA-DRB1 * 04: 05, HLA- DRB1 * 07: 01, HLA-DRB1 * 08: 02, HLA-DRB1 * 09:01, HLA-DRB1 * 11:01, HLA- DRB1 * 12:01, HLA-DRB1 * 13:01, HLA- DRB1 * 15:01, HLA-DRB3 * 01: 01, HLA- DRB3 * 02: 02, HLA-DRB4 * 01: 01 and HLA-DRB5 * 01: 01.
  • the NetMHCIIpan and Sturniolo algorithms predicted the binding capacity of a given peptide to selected HLA class II molecules. For each peptide, a rank is determined, its predicted affinity being compared with that of 200,000 natural peptides. In our case, peptides from 9-seas (heart) with a rank below 10% for at least 4 HLA-DR alleles, or peptides having a rank below 5% for at least 1 allele were selected. Peptides of 20 seas containing close hearts were then defined, so that the hearts are not in position 1 or in position 20 of the peptide. 23 peptides 20-mer for NP and 33 peptides 20-mer for GP were selected to be tested in vitro.
  • CD4 + T lymphocyte lines were obtained by co-culture of CD4 + T lymphocytes with autologous dendritic cells previously loaded with peptide pools. After amplification of the T lymphocytes, each line was tested by ELISpot for its ability to recognize pools of peptides and then in a second test, the individual peptides contained in the pool recognized by the lines. To ensure the capacity of each donor to respond, CD4 + lymphocyte lines specific to a pool of peptides specific for Cytomegalovirus, Epstein-barr and influenza have also been produced.
  • [Table 2] and [Table 3] present the individual responses in specific CD4 + T lymphocytes against different peptides of NP and of Ebola GP respectively.
  • the CD4 T lymphocyte lines were obtained by in vitro stimulation with dendritic cells previously loaded with the peptides of NP or GP. The specificity for these peptides was assessed by Elispot IFNY.
  • [Table 2] and [Table 3] indicate the responder rate (in%) and the response intensity (percentage of positive lines) for each of the peptides.
  • GP18-37 does not induce a response in any of the donors.
  • the intensity of response is variable depending on the donors, from 1 to 14 positive lines.
  • the number of total positive lines per donor is also extremely variable, from 1 to 83 and from 1 to 105 for NP and GP respectively.
  • the results obtained are very heterogeneous depending on the peptides studied. As part of the vaccination against the Ebola virus, it is necessary to select the peptides which make it possible to induce a significant cellular response in a maximum of individuals.
  • the data can therefore be analyzed according to two parameters: the response rate (number of donor donors) [Fig.lA] and [Fig.2A] and the intensity (number of total positive lines) of each peptide [Fig.lB] and [Fig.2B] for the peptides originating from NP and GP respectively.
  • Ten peptides for NP and 8 for GP induce responses in 50% of donors or more.
  • the peptides identified and studied are derived from the Zaire strain of the Ebola virus.
  • the conservation of the peptide sequence between the different strains of the Ebola virus has been studied for peptides with a high response rate.
  • the results are represented as a percentage of sequence identity with respect to the Zaire strain.
  • the percentage of identity of the peptides between the different strains is higher for the peptides of NP than of GP [Table 4] and [Table 5] ⁇ . [0105] [Table 4]
  • CD4 T lymphocyte lines specific for the conserved peptides of NP and GP of the Zaire strain of the Ebola virus were generated from cells of 6 donors. The specific lines thus obtained were incubated in the presence of presenting cells (autologous dendritic cells) alone (NC or uncharged), or loaded with the peptides originating from the Zaire (reference), Sudan, Reston or Bundibugyo strain. The ability to recognize peptides from the Sudan, Reston and Bundibugyo variants of the Ebola virus by CD4 T cell lines is evaluated by ELISpot IFN-g. Examples Representative are shown in Figure 7.
  • the 1.10 line of donor 1026 specific for the NP27-46 peptide recognizes the peptides from the Sudan and Bundibugyo strains, but not that from the Reston strain.
  • the line 2.11 of donor 1027 specific for the peptide NP717-736 recognizes only the variant originating from Bundibugyo.
  • the 3.04 line from donor 1039 recognizes all of the variants corresponding to the peptide GP123-142, while the line 4.05 from donor 899, specific for the peptide GP155-174 recognizes only the variant from the Bundibugyo strain.
  • CD4 T lymphocytes specific for N P and GP peptides were obtained from cells of different donors (6 for NP, 10 for GP).
  • CD4 T lymphocytes were incubated in the presence of presenting cells (autologous dendritic cells) without peptide (NC or uncharged), or with a mixture of peptides of NP or GP or in the presence of presenting cells previously loaded with the NP protein or GP protein. After an overnight incubation, the activation of T lymphocytes is evaluated by ELISpot IFN-g.
  • FIG. 8 shows representative examples.
  • the set of data is compiled in Table 7. Many lines of lymphocytes specific for the peptides are capable of recognizing the presenting cells loaded with the corresponding protein, demonstrating that these epitopes are naturally presented by the presenting cells. [Table 7] Recognition of the NP and GP proteins of the Ebola virus by CD4 T lymphocytes specific for the peptides.
  • the lines obtained are from different donors (between 2 for NP154-173 and NP293-312 and 6 for GP155-174), with the exception of the specific lines of peptides NP14-33, NP720-739 and GP209-228 , obtained each time from a single donor.
  • peptides in particular the NP peptides, should thus be able to be used in a vaccine composition for all the strains of the Ebola virus.
  • LSP long peptide fragments
  • the peptides NP14-33, NP27-46 and NP39-58 can be grouped in the form of the LSP NP14-58. These LSPs can then be combined, so as to obtain optimal donor coverage.
  • 3 LSPs for the NP NP226-290, NP147-207, NP205-224) as for the GP (GP123-186, GP31-79, GP545-595) make it possible to cover all of the donors tested, with a response intensity of 29% and 41% respectively ( Figures 5 and 6, respectively). Adding other LSPs, without increasing the response rate, amplifies the response intensity. From the results obtained for the 20-seas, it is possible to define other LSPs and other combinations of LSPs.
  • Peptides capable of stimulating CD4 + T lymphocytes specific to the Ebola virus in a panel of healthy donors representative of the Caucasian and African populations (reference group) have been identified in the NP and GP of the Zaire Ebola virus.
  • the responses against peptides from NP are more intense than those against peptides from GP, both in terms of the number of donor responders and in terms of response intensity (number of positive lines).
  • Ten peptides for NP and 8 for GP induce responses in 50% of donors or more.
  • These peptides, in particular the NP peptides can therefore allow good coverage of the population, while inducing an effective response.
  • the NP peptides are generally more conserved and therefore potentially effective against the different Ebola strains, as shown by the cross-reaction of CD4 T lymphocytes specific for conserved NP peptides from the Zaire strain vis-à-vis the NP peptides. variants from other Ebola strains. 4 peptides from NP and 5 peptides from GP provide optimal vaccination coverage for the population since they are capable of inducing a response rate of 100% in the reference group, while inducing 20% response intensity for NP and 23% for GP.
  • LSP long polypeptide fragments
  • 3 LSPs for NP make it possible to cover all of the donors tested with a response intensity of 29% and 41% respectively.
  • Adding other peptides or other LSPs without increasing the response rate amplifies the response intensity.
  • Many CD4 T lymphocyte lines specific for NP and GP peptides are capable of recognizing the presenting cells loaded with the corresponding protein, demonstrating that these epitopes are naturally presented by the presenting cells.

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Abstract

L'invention concerne une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins un premier peptide immunogène issu de la nucléoprotéine (NP) du virus Ebola Zaïre, qui est capable d'induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, ledit peptide étant sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d'acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d'au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences. L'invention concerne également l'utilisation de ladite composition comme vaccin préventif contre le virus Ebola et comme réactif pour l'immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola.

Description

PEPTIDES IMMUNOGÈNES ISSUS DE LA NUCLÉOPROTÉINE DU VIRUS
EBOLA ZAÏRE
Domaine technique
[0001] L’invention concerne une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins un peptide immunogène issu de la nucléoprotéine du virus Ebola Zaïre, qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola. L’invention concerne également l’utilisation de ladite composition comme vaccin préventif contre le virus Ebola et comme réactif pour l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola.
Technique antérieure [0002] Le virus Ebola est un virus de la famille des Filoviridae hautement virulent, responsable d’épidémies de fièvres hémorragiques mortelles, chez l’Homme et le primate non-humain. Ce virus comprend une seule protéine d’enveloppe, la Glycoprotéine (GP), ainsi que des protéines internes dont la Nucléoprotéine (NP). Cinq espèces du virus Ebola ont été identifiées: Zaïre, Soudan, Reston, Forêt de Taï et Bundibugyo. Le virus Ebola Zaïre (EBOV) est responsable de la plupart des flambées épidémiques depuis la découverte du virus Ebola en 1976, avec un taux de létalité moyen d’environ 50 % (25 % à 90 % au cours des flambées récentes).
[0003] Aucun vaccin préventif n’a été approuvé pour le traitement des infections par Ebola mais plusieurs vaccins basés sur la glycoprotéine (GP) sont en développement. Il s’agit de vecteurs viraux réplicatifs tels que le virus de la stomatite vésiculaire (rVSV-Ebov), le cytomégalovirus (rCMV), ou le virus parainfluenza humain de type 3 (HPIV3), ainsi que d’adénovirus non-réplicatifs tels que Chad3-EBOV (Chimp adenovirus), EBOLA rAd-5 et Ad26.ZEBOV. On peut citer également, des plasmides (INO-4212 ou VRC-EBODNA023-00-VP) et des nanoparticules contenant la glycoprotéine (GP) recombinante combinées à un adjuvant à base de saponine (Matrix-M™). Les essais précliniques, chez le rongeur ou le primate non-humain se sont révélés concluants, apportant la preuve de concept d’une protection virale par vaccination dans ces modèles. Des essais chez l’homme sont également en cours.
[0004] Bien que prometteurs, ces vaccins présentent plusieurs limites. Initialement développés pour la lutte contre le bioterrorisme, ils ne sont pas adaptés à une vaccination à grande échelle en Afrique Sub-Saharienne. Une production massive est compliquée, et une dissémination dans les régions endémiques nécessite un stockage à -80°C pour assurer leur conservation. Par ailleurs, l’existence d’une immunité dirigée contre les vecteurs, comme les adénovirus, peut rendre le vaccin inefficace.
[0005] Peu d’études sont consacrées à l’immunité contre le virus Ebola et les corrélats de protection ne sont pas connus. Des titres élevés d’anticorps dirigés contre la GP du virus sont toutefois toujours détectables chez des patients ayant survécu à l’infection virale. La présence de lymphocytes T CD4+ et CD8+ dirigés contre les protéines virales, en particulier la NP et la GP a également été montré chez des patients ayant survécu à l’infection virale (McElroy et al., Proc. Natl. Sci., 2015, 112, 4719-4724). Compte tenu du rôle majeur des lymphocytes T CD4+ dans l’initiation des réponses humorales et cytotoxiques, la réponse des lymphocytes T CD4+ est nécessaire à l’établissement de l’immunité anti-EBOLA mais les caractéristiques de cette réponse sont peu connues.
[0006] Les lymphocytes T CD4+ ont une fonction auxiliaire ou régulatrice et reconnaissent les antigènes comme les antigènes de pathogènes, notamment de virus, sous la forme de peptides présentés par les molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe II (HLA II chez l’homme). La spécificité de liaison des molécules HLA II étant très variable d’une molécule HLA de classe II à l’autre, ces peptides varient d’un individu à l’autre, compte-tenu du polymorphisme des molécules HLA II dans la population. Problème technique
[0007] Très peu d’épitopes T CD4+ du virus Ebola et en particulier d’Ebola Zaïre (EBOV) ont été décrits jusqu’à présent et uniquement dans des études chez la souris, notamment chez des souris transgéniques pour l’allèle HLA-DR3. Ainsi, cinq épitopes T CD4+ potentiels de la GP et de la NP d’EBOV ont été identifiés sur la base de leur prédiction de liaison aux allèles HLA-DR1 , -DR3, -DR4, -DR7, -DR8, - DR1 1 , -DR13 et -DR15. Toutefois, seul un peptide de la GP (EBOV-GP 32-59) mais aucun peptide de la NP d’Ebola Zaïre, est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ spécifiques chez des souris transgéniques pour HLA-DR3 (Bounds ét al., Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2017, 13, 2824-2836).
[0008] Pour mettre au point des vaccins efficaces contre le virus Ebola, il existe donc un réel besoin de disposer d’épitopes T CD4+ d’Ebola Zaïre (EBOV), et en particulier de la nucléoprotéine (NP), capables d’induire une réponse T CD4+ efficace, c’est-à-dire d’intensité élevée chez une majorité d’individus.
Résumé de l’invention
[0009] Les inventeurs ont identifié de nombreux peptides de la NP et la GP du virus Ebola Zaïre capables de stimuler des lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus Ebola chez un panel de donneurs sains représentatif des populations caucasienne et africaine ([Tableau 2] et [Tableau 3] ; [Fig. 1] et [Fig. 2]) . Les réponses contre les peptides issus de la N P sont plus intenses que celles contre les peptides de la GP, aussi bien en termes de nombre de donneurs répondeurs, qu’en termes d’intensité de réponse (nombre de lignées positives) et il existe une bonne corrélation entre taux et intensité de réponse, pour les peptides de la NP. De plus les peptides de la NP sont plus conservés et donc potentiellement efficaces contre les différentes souches d’Ebola, comme l’atteste la réaction croisée des lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides NP conservés issus de la souche Zaïre vis-à-vis des peptides NP variants issus d’autres souches d’Ebola. Dix peptides pour la NP et huit pour la GP induisent des réponses chez 50% des donneurs ou plus. Quatre peptides issus de la NP et cinq peptides de la GP permettent une couverture vaccinale de l’ensemble de la population de référence (fréquence de répondeurs de 100 %), tout en induisant une intensité de réponse de 20% pour la NP et 23% pour la GP ([Tableau 8] et [Tableau 9] ; |Fig. 3] et [Fig.4]). En combinant plusieurs peptides dans de longs fragments polypeptidiques (LSP), 3 LSP pour la NP comme pour la GP, permettent de couvrir l’ensemble des donneurs testés, avec une intensité de réponse de 29% et 41 % respectivement [(Fig. 5] et [Fig. 6]). L’ajout d’autres peptides ou d’autres LSP, sans augmenter le taux de réponse permet d’amplifier l’intensité de réponse. De nombreuses lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides NP et GP sont capables de reconnaître les cellules présentatrices chargées avec la protéine correspondante, démontrant que ces épitopes sont naturellement présentés par les cellules présentatrices.
Exposé de l’invention
[0010] En conséquence, la présente invention a pour objet une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins un premier peptide immunogène issu de la nucléoprotéine du virus Ebola Zaïre qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, et éventuellement au moins un deuxième peptide immunogène issu de la glycoprotéine du virus Ebola Zaïre qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola.
[0011] Conformément à la présente invention :
- On entend par nucléoprotéine (NP) du virus Ebola Zaïre (ZEBOV), la protéine de séquence SEQ ID NO : 1 ou UniProt AAD14590.1.
- On entend par glycoprotéine (GP) du virus Ebola Zaïre (ZEBOV), la protéine de séquence SEQ ID NO : 25 ou UniProt AKG65268.1.
- Les acides aminés sont désignés à l’aide du code à une lettre. Les positions des peptides issus de la NP du virus Ebola Zaïre sont indiquées en référence à la séquence SEQ ID NO : 1. Les positions des peptides issus de la GP du virus Ebola Zaïre sont indiquées en référence à la séquence SEQ ID NO : 25.
- On entend par épitope T CD4+, un peptide de 11 à 25 acides aminés qui lie au moins une molécule HLA II, en particulier au moins un allèle HLA-DR fréquent dans différentes populations tel que présenté au [Tableau 1], et est reconnu par des lymphocytes T CD4+ spécifiques chez les individus portant cette molécule HLA II; le peptide comprend une séquence de 9 acides aminés incluant les résidus d’ancrage aux molécules HLA II, flanquée d’au moins 1 acide aminé, de préférence au moins 2 ou 3 acides aminés à chacune de ses extrémités.
- On entend par lymphocytes T CD4+ spécifiques, des lymphocytes T CD4+ spécifiques de la NP ou de la GP du virus Ebola.
- On entend par induction d’une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques, la stimulation de lymphocytes T CD4+ humains spécifiques, in vitro ou in vivo.
- On entend par fréquence ou taux de répondeurs in vitro à un peptide selon la présente invention, le pourcentage d’individus humains d’un groupe de référence pour lesquels des lignées de lymphocytes T CD4+ humains spécifiques dudit peptide ont été obtenues.
- On entend par intensité de la réponse in vitro à un peptide selon la présente invention, le pourcentage de lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques dudit peptide qui ont été obtenues dans un groupe d’individus humains de référence par rapport à la totalité des lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques obtenues avec les différents peptides de la même protéine (NP ou GP).
- On entend par groupe de référence, un ensemble d’individus humains exprimant des molécules HLA II variées, notamment des molécules HLA-DR variées incluant les allèles HLA-DR les plus fréquents dans différentes populations, tel que le groupe de référence des exemples ([Tableau 2] et [Tableau 3]). Le groupe de référence est considéré comme représentatif d’une population ou d’un ensemble de populations, c’est-à-dire qu’il fournit des résultats extrapolables à cette ou ces population(s).
- On entend par virus Ebola, n’importe quel isolat du virus Ebola.
- Le pourcentage d’identité d’une séquence d’acide aminé est défini par le pourcentage de résidus d’acides aminés dans une séquence à comparer qui sont identiques à une séquence de référence après alignement des séquences, en introduisant des espaces, si nécessaire, de façon à obtenir une identité de séquence maximale. L’alignement de séquences en vue de déterminer le pourcentage d’identité d’une séquence peut être réalisé de différentes façons connues de l’homme du métier, par exemple en utilisant des logiciels publics disponibles comme BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-). Ce logiciel est de préférence utilisé avec des paramètres par défaut.
[0012] Le peptide immunogène issu de la NP du virus Ebola Zaïre selon l’invention, est dénommé ci-après peptide NP et le peptide immunogène issu de la GP du virus Ebola Zaïre selon l’invention, est dénommé ci-après peptide GP. Conformément à l’invention, le peptide NP comprend au moins un épitope T CD4+ issu de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 et le peptide GP comprend au moins un épitope T CD4+ issu de la GP de séquence SEQ ID NO : 25, lequel épitope lie au moins un allèle HLA-DR tel que présenté au [Tableau 1] et est apte à induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola.
[0013] La capacité des peptides de l’invention de lier des molécules HLA II sont évaluées selon les techniques standards connues de l’Homme du métier telles que celles décrites en particulier dans les exemples. Il s’agit notamment de méthodes in silico et de tests classiques de liaison spécifiques des molécules HLA II. Les méthodes in silico utilisent des outils de prédiction de liaison au CMH-II, issus notamment de la base de données IEDB (http://www.iedb.org/) et des logiciels appropriés tels que par exemple les algorithmes NetMHCIIpan et Sturniolo. Les tests classiques de liaison spécifiques des molécules HLA II sont notamment des tests en compétition avec révélation immuno-enzymatique tel que décrit dans le Brevet américain US 6,649,166.
[0014] La capacité des peptides de l’invention d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques, la spécificité des lymphocytes T CD4+ induits vis-à-vis des peptides ou de la protéine NP ou GP, ainsi que la capacité des peptides de l’invention d’être reconnus par des lymphocytes T CD4+ spécifiques, est évaluée selon les techniques standards connues de l’Homme du métier telles que celles décrites dans les exemples. Il s’agit notamment d’un test de prolifération cellulaire, d’un test ELISPOT (dosage des cellules productrices de cytokines) ou d’un test de dosage de cytokines intracellulaires, spécifiques d’une cytokine produite par des lymphocytes T CD8+ activés telle que IFN-g, IL-2, IL-4 ou IL-10. Les exemples montrent que les peptides de l’invention sont capables d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques à partir de précurseurs présents chez des individus humains naïfs d’un groupe de référence.
[0015] Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide NP ou GP se lie à au moins quatre allèles HLA-DR différents choisi parmi HLA-DRB1 *01 :01 , HLA- DRB1 *03:01 , HLA-DRB1 *04:01 , HLA-DRB1 *04:05, HLA-DRB1 *07:01 , HLA-
DRB1 *08:02, HLA-DRB1 *09:01 , HLA-DRB1 *11 :01 , HLA-DRB1 *12:01 , HLA-
DRB1 *13:01 , HLA- DRB1 *15:01 , HLA-DRB3*01 :01 , HLA-DRB3*02:02, HLA- DRB4*01 :01 et HLA-DRB5*01 :01 ; ces 15 allèles HLA-DR sont représentatifs des populations Caucasienne et Africaine.
[0016] Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide NP ou GP induit une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques dans un groupe de référence exprimant les allèles HLA-DRB1*01 :01 , HLA-DRB1 *03:01 , HLA- DRB1 *04:01 , HLA-DRB1 *07:01 , HLA-DRB1 *09:01 , HLA-DRB1 *11 :01 , HLA-
DRB1 *13:01 , HLA-DRB1 *15:01 , HLA-DRB3*01 :01 , HLA-DRB3*02:02, HLA-
DRB4*01 :01 et HLA-DRB5*01 :01 ; ces allèles HLA-DR sont représentatifs des populations Caucasienne et Africaine. En particulier, cet ensemble d’allèles permet de couvrir 83 % des individus de la population mondiale ; 88 % des individus d’Europe ; 60 % des individus d’Afrique Centrale ; 70,4% des individus d’Afrique de l’Est ; 21 , 2 % des individus d’Afrique Sub-Saharienne ; 73 % des individus d’Afrique du Nord et 63,8 % des individus d’Afrique de l’Ouest.
[0017] Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide NP est sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences.
[0018] Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide GP est sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 26, 27 et 29 à 58 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences. [0019] L’invention englobe les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d’un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de la nucléoprotéine de séquence SEQ ID NO : 1 ou de la glycoprotéine de séquence SEQ ID NO : 25, dès lors que ledit peptide conserve ses propriétés d’épitope T CD4+ immunogène du virus Ebola et est capable de stimuler une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, c’est-à- dire qu’ils sont reconnus par des lymphocytes T CD4+ spécifiques de la séquence sauvage ou d’un variant naturel du virus Ebola. Les mutations sont avantageusement dispersées dans la séquence des peptides ; de préférence elles sont espacées d’au moins 3 acides aminés, de manière préférée d’au moins 5 acides aminés.
[0020] Le peptide variant comprend une délétion de 1 , 2 ou 3 acides aminés à l’une et/ou l’autre extrémité desdites séquences.
[0021] Alternativement, ledit peptide variant comprend au plus trois (1 , 2 ou 3) substitutions d’acides aminés dans lesdites séquences. De préférence une ou deux substitutions d’acides aminés. Lesdites substitutions sont avantageusement des substitutions dispersées telles que définie ci-dessus.
[0022] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21 , 23 et 24 ; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeurs in vitro d’au moins 33 % et/ou une intensité de réponse in vitro d’au moins à 3,5 % dans un groupe de référence ([Tableau 2]). Ladite composition comprend de préférence, au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 6, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 19, 23 et 24 ; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeurs in vitro d’au moins 50 % et/ou une intensité de réponse in vitro d’au moins 5 % dans un groupe de référence ([Tableau 2]). De manière préférée, ladite composition comprend au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 6, 8, 17, 19, 23 et 24 ; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeurs in vitro d’au moins 50 % et une intensité de réponse in vitro d’au moins 5 % dans un groupe de référence ([Tableau 2]). [0023] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, ladite composition comprend au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 21 , 22 et 23 ; de préférence au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 21 et 23 ; de manière préférée au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 4, 8, 9, 13, 14 et 18.
[0024] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, la dite composition comprend au moins un peptide NP conservé, c’est-à-dire dont la séquence est conservée dans au moins une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée une séquence conservée dans Ebola Zaïre Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. De préférence, la séquence dudit peptide présente au moins 75 % d’identité, de préférence au moins 90 %, 95 %, 98 %, 99% ou 100 % d’identité avec la séquence d’une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée avec les séquences d’Ebola Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. La composition comprend avantageusement au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 5, 8, 9, 17, 19, 21 , 23 et 24, les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 5, 8, 9, 17, 21 , 23 et 24, les séquences SEQ ID NO : 3, 5, 8, 9, 17, 23 et 24 ou les séquences SEQ ID NO : 3, 5, 8, 9, 17, 19, 23 et 24 ; de préférence au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 5, 9, et 23 ; de manière préférée au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 9, 3 et 23. Conformément à ce mode de réalisation, ladite composition comprend avantageusement au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 9, 3 et 23, c’est-à-dire le peptide de séquence SEQ ID NO : 9 ; le peptide de séquence SEQ ID NO : 3 ; le peptide de séquence SEQ ID NO : 23 ; les peptides de séquence SEQ ID NO : 9 et 3 ; les peptides de séquence SEQ ID NO : 9 et 23 ; les peptides de séquence SEQ ID NO : 3 et 23 ou les peptides de séquence SEQ ID NO : 3, 9 et 23 ; ladite composition comprend éventuellement au moins un autre peptide NP conservé choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 5, 8, 17, 19, 21 et 24 ; les séquences SEQ ID NO : 2, 5, 8, 17, 21 et 24 ; les séquences SEQ ID NO : 5, 8, 17 et 24 ou les séquences SEQ ID NO : 5, 8, 17, 19 et 24 ; de préférence parmi les séquences SEQ ID NO : 8 et 17 ; ladite composition comprend avantageusement au moins un autre peptide NP sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 2, 4 à 8, 10 à 22 et 24 ou les séquences SEQ ID NO : 2, 4 à 8, 10 à 18, 20 à 22 et 24 ; de préférence choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21 et 24 ou les séquences SEQ ID NO : 2, 4, 5, 6, 8, 10,
12, 13, 15, 16, 17, 18, 21 et 24 ; de manière préférée parmi les séquences SEQ ID
NO : 2, 6, 8, 10, 16, 17, 18, 19 et 24 ou les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 6, 8, 10, 16, 17, 18 et 24 ; de manière encore plus préférée parmi les séquences SEQ ID
NO : 6, 8, 17, 19 et 24 ou les séquences SEQ ID NO : 6, 8, 17 et 24. Ladite composition comprend de préférence 4 à 10 (4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) ou plus desdits peptides NP incluant le peptide de séquence SEQ ID NO : 9, le peptide de séquence SEQ ID NO : 3 et/ou le peptide de séquence SEQ ID NO : 23.
[0025] Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdits peptides NP sont choisis parmi les séquences SEQ ID NO : 2 à 18 et 20 à 24.
[0026] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 29, 31 , 32, 33, 35, 37, 39, 41 , 42, 43, 48, 53 et 57; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeurs in vitro d’au moins 33 % et/ou une intensité de réponse in vitro d’au moins à 3,5 % dans un groupe de référence ([Tableau 3]). Ladite composition comprend de préférence, au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 42 et 43 ; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeurs in vitro d’au moins 50 % et/ou une intensité de réponse in vitro d’au moins 5 % dans un groupe de référence ([Tableau 3]). De manière préférée, ladite composition comprend au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31 , 33, 35, 39, 42 et 43 ; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeurs in vitro d’au moins 50 % et une intensité de réponse in vitro d’au moins 5 % dans un groupe de référence ([Tableau 3]).
[0027] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, ladite composition comprend au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 26, 27, 28, 30, 31 , 33, 34, 36, 38, 39, 40, 41 , 44, 46 à 51 , 53 et 56 à 58 ; de préférence au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31 , 33, 39, 41 , 48, 53 et 57 ; de manière préférée au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31 , 33 et 39.
[0028] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, ladite composition comprend au moins un peptide GP conservé, c’est-à-dire dont la séquence est conservée dans au moins une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée une séquence conservée dans Ebola Zaïre Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. De préférence, la séquence dudit peptide présente au moins 75 % d’identité, de préférence au moins 90 %, 95 %, 98 %, 99% ou 100 % d’identité avec la séquence d’une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée avec les séquences des d’Ebola Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. La composition comprend avantageusement au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31 , 33 et 35; de préférence au moins le peptide GP de séquence SEQ ID NO : 35.
[0029] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins quatre peptides NP et/ou GP tels que définis ci-dessus, de préférence 4 à 10 (4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) ou plus de peptides NP et/ou GP tels que définis ci-dessus. De préférence, ladite composition comprend au moins 4 peptides NP et/ou au moins 5 peptides GP tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux, la dite composition comprend au moins 4 peptides NP et/ou au moins 5 peptides GP tels que définis ci-dessus dont au moins un peptide conservé tel que défini ci-dessus, de préférence au moins un peptide NP conservé choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 9, 3 et 23.
[0030] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro et/ou une intensité de réponse in vitro déterminée, par exemple une fréquence d’au moins 75 %, 90 % ou de 100 % et/ou une intensité de réponse d’au moins 20 %, 30 % ou 50 % dans un groupe de référence. La séquence et le nombre de peptides permettant d’obtenir la fréquence ou l’intensité de réponse souhaitées sont déterminés à l’aide du profil de réponse des peptides dans le groupe de référence des exemples tel que présenté dans le [Tableau 2] et le [Tableau 3], respectivement pour la NP et la GP. La fréquence et l’intensité de réponse de la composition sont déterminées pour la protéine NP ou GP, en ajoutant les fréquences ou les intensités obtenues pour chacun des peptides NP ou GP présent dans la composition.
[0031] A titre d’exemple illustratif de compositions préférées selon l’invention, on peut citer :
a) la composition comprenant :
- un premier peptide NP de séquence SEQ ID NO : 8 ;
- un deuxième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 12 ;
- un troisième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 16 ; et
- un quatrième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 23 ou 24 ; ou un quatrième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 3 ou 15 et un cinquième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 13 ; de préférence comprenant les peptides NP de séquence SEQ ID NO : 8, 12, 16 et 23 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 20 % dans un groupe de référence [Fig. 3];
b) la composition comprenant :
- un premier peptide GP de séquence SEQ ID NO : 31 ;
- un deuxième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 33, 42, 54, 55 ou 57 ;
- un troisième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 29, 32, 50, 51 ou 53 ;
- un quatrième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 50 ou 53
- un cinquième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 37 ou 57 ; et éventuellement
- un sixième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 33 ou 49 et
- un septième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 29, 32, 34, 35, 37, 39, 42, 43, 52, 53, 56 ou 57 ; de préférence les peptides GP de séquence SEQ ID NO : 29, 31 , 33, 37 et 53 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 23 % contre la GP dans un groupe de référence [Fig. 4] ;
c) la composition comprenant les peptides NP de séquence SEQ ID NO : 3, 6, 8, 12, 16, 17, 19, 23 et 24 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 50 % dans un groupe de référence;
d) la composition comprenant les peptides GP de séquence SEQ ID NO : 29, 31 , 33, 35, 37 42, 43 et 53 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 50 % contre la GP dans un groupe de référence ;
e) la composition comprenant les peptides NP de séquence SEQ ID NO :8 , 9 et 17 ; de préférence les peptides NP de séquence SEQ ID NO : 5, 8, 9, 17 et 19 ; cette composition comprend des peptides conservés dans les différentes souches d’Ebola et est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 75 % et une intensité de réponse de respectivement 18.5 % et 28 % contre la NP dans un groupe de référence.
[0032] Ces exemples qui sont donnés uniquement à titre illustratif ne sont pas limitatifs et d’autres compositions induisant des fréquences et des intensités de réponse équivalentes peuvent être aisément obtenues avec d’autres combinaisons de peptides, déterminées à partir des profils de réponse des peptides NP et GP présentées au [Tableau 2] et au [Tableau 3].
[0033] Selon un mode de réalisation de l’invention, ladite composition selon l’invention comprend au moins :
(a) un peptide isolé ou un mélange de peptides comprenant ledit ou lesdits peptide(s) NP (premier peptide), et éventuellement ledit ou lesdits peptides GP (deuxième peptide) et/ou troisième peptide(s), éventuellement modifié(s) ;
(b) un polypeptide comprenant au moins un des peptides définis en (a), notamment un polypeptide issu de la protéine NP de séquence SEQ ID NO : 1 ou un polypeptide issu de la protéine GP de séquence SEQ ID NO : 25 ; ledit polypeptide pouvant être éventuellement modifié ;
(c) un polypeptide multiépitopique chimérique comprenant au moins un des peptides définis en (a) ; ledit polypeptide pouvant être éventuellement modifié ;
(d) une protéine de fusion comprenant au moins un des peptides définis en (a); ladite protéine de fusion pouvant être éventuellement modifiée ;
(e) un polynucléotide codant pour au moins peptide, polypeptide, protéine de fusion définis en (a) à (d), éventuellement inséré dans un vecteur, en particulier un vecteur d’expression ; ou (f) un mélange dudit ou desdits peptide(s), polypeptide(s), protéine(s) de fusion et/ou polynucléotide(s) définis en (a) à (e).
[0034] Par exemple, la composition comprend un mélange de peptides ; un polypeptide issu de la NP ou de la GP ou un mélange desdits polypeptides; un mélange de peptides et de polypeptides ; un polynucléotide ou un mélange de polynucléotides.
[0035] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, la composition immunogène ou vaccinale comprend au moins un peptide NP isolé, et éventuellement au moins un peptide GP isolé, de préférence un mélange d’au moins 2, de préférence 4 à 10 (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) ou plus desdits peptides NP, et éventuellement GP.
[0036] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, la composition immunogène ou vaccinale comprend au moins un polypeptide issu de la protéine NP de séquence SEQ ID NO : 1 comprenant au moins un peptide NP, et éventuellement au moins un polypeptide issu de la protéine GP de séquence SEQ ID NO : 25 comprenant au moins un peptide GP. De préférence ledit polypeptide comprend au moins deux peptides N P ou GP, de préférence 3 à 5 (3, 4, 5) ou plus desdits peptides.
[0037] Ledit polypeptide issu de la NP est avantageusement un polypeptide d’au plus 100 acides aminés issu de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 , comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences telles que définies ci-dessus. Ledit peptide consiste avantageusement en une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés, possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. [0038] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins un polypeptide issu de ladite NP sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 59 à 66.
[0039] A titre d’exemple illustratif de composition préférée selon l’invention, on peut citer la composition comprenant le peptide NP de séquence SEQ ID NO : 12 et les polypeptides NP de séquence SEQ ID NO : 61 et 62 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 29 % [Fig. 5].
[0040] Cet exemple qui est donné uniquement à titre illustratif n’est pas limitatif et d’autres compositions induisant des fréquences et des intensités de réponse équivalentes peuvent être aisément obtenues avec d’autres combinaisons de peptides et/ou polypeptides NP, déterminées à partir des profils de réponse des peptides NP présentés au [Tableau 2] et des séquences des peptides et polypeptides de la NP présentés au [Tableau 8].
[0041] Ledit polypeptide issu de la GP est avantageusement un polypeptide d’au plus 100 acides aminés issu de la GP de séquence SEQ ID NO : 25, comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences les séquences SEQ ID NO : 26, 27 et 29 à 58 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences telles que définies ci-dessus. Ledit peptide consiste avantageusement en une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 25 ou une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés, possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 25.
[0042] Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins un polypeptide issu de ladite GP sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 67 à 74. [0043] A titre d’exemple illustratif de composition préférée selon l’invention, on peut citer la composition comprenant les polypeptides GP de séquence SEQ ID NO : 68, 69 et 73 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 41 % [Fig. 6].
[0044] Cet exemple qui est donné uniquement à titre illustratif n’est pas limitatif et d’autres compositions induisant des fréquences et des intensités de réponse équivalentes peuvent être aisément obtenues avec d’autres combinaisons de peptides et/ou polypeptides GP, déterminées à partir des profils de réponse des peptides GP présentés au [Tableau 3] et des séquences des peptides et polypeptides de la N P présentés au [Tableau 9].
[0045] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la composition immunogène ou vaccinale comprend un polypeptide multiépitopique chimérique comprenant au moins deux peptides NP ou au moins un peptide NP et un peptide GP ou un troisième peptide tels que définis ci-dessus. On définit ici un polypeptide chimérique comme une succession d’acides aminés qui n’est pas présente dans la nature. Un polypeptide multiépitopique chimérique selon l’invention comprend au moins deux peptides que défini ci-dessus, les séquences desdits peptides étant dans ledit polypeptide, adjacentes, liées par un élément de liaison ou séparées par une séquence comprenant un autre épitope. L’autre épitope est notamment un autre épitope T CD4+, un épitope T CD8+ ou un épitope B de la NP et/ou de la GP du virus Ebola, ou bien un épitope d’un antigène d’un autre pathogène, notamment un virus de fièvre hémorrhagique. Parmi les épitopes B de la NP du virus Ebola on peut citer les peptides 173-187, 361-375, 365-379, 381-395, 417-431 , 425-439, 485-499 et 505-515 d’EBOV, lesdites positions étant indiquée en référence à la séquence SEQ ID NO : 1. Parmi les épitopes B de la GP du virus Ebola on peut citer les peptides 41-55, 52-66, 93-107, 112-126, 201-215, 217-231 , 221-235, 225- 239, 236-250, 301-305, 309-323, 317-331 , 321-335, 325-339, 329-343, 333-347, 337-351 , 341-355, 345-359, 381-395, 385-399, 389-403, 393-407, 397-411 et 469- 483 d’EBOV, lesdites positions étant indiquée en référence à la séquence SEQ ID NO : 25. Le polypeptide multiépitopique peut également comprendre plusieurs copies d’une même séquence de peptide/épitope. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide multiépitopique comprend moins de 100 acides aminés consécutifs de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 et/ou de la GP de séquence SEQ ID NO : 25, de préférence moins de 50, de manière préférée moins de 30. Le polypeptide multiépitopique présente une longueur de 20 à 200 acides aminés, de préférence de 30 à 100 acides aminés, de manière préférée d’environ 50 acides aminés.
[0046] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, ledit peptide ou polypeptide tel que défini ci-dessus est un peptide ou un polypeptide modifié comprenant une modification au niveau de résidu(s) d’acide aminé, de la liaison peptidique ou de ses extrémités et ledit peptide ou polypeptide modifié conservant ses propriétés de peptide immunogène de la NP ou de la GP du virus Ebola telles que définies ci-dessus, c’est-à-dire qu’il est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques. Cette ou ces modification(s), de préférence une ou des modification(s) chimique(s), qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l’homme du métier, incluent de façon non-limitative l’une au moins des modifications chimiques suivantes : l’acétylation du résidu d’acide aminé N-terminal et/ou l’amidation du résidu d’acide aminé C-terminal (Maillère et al., Molecular Immunology, 1195, 32, 1377-1385), la substitution d’un acide aminé par un acide aminé non-protéinogénique (acide aminé D ou analogue d’acide aminé); l’addition de groupement chimique (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d’une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (-CO-NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d’un peptide (épitope d’intérêt pour la vaccination); la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d’une protéine, notamment une chaîne a d’une molécule HLA I ou HLA II, une chaîne b d’une molécule HLA II ou le domaine extracellulaire de ladite chaîne, ou bien encore une séquence de ciblage de l’endosome dérivée notamment de la chaîne invariable li ou de la protéine LAMP-1 ; et le couplage à une molécule appropriée. Ces modifications sont destinées en particulier à augmenter la stabilité et plus particulièrement la résistance à la protéolyse, ainsi que la solubilité ou l’immunogénicité du peptide ou polypeptide selon l’invention. [0047] Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ou polypeptide modifié, il comprend une ou plusieurs N6-acetyl-lysine(s), phosphoserine(s) et/ou phosphothreonine(s).
[0048] Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide ou polypeptide modifié comprend l’acétylation de son résidu d’acide aminé N-terminal et/ou l’amidation de son résidu d’acide aminé C-terminal.
[0049] Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide ou polypeptide modifié est un lipopeptide ou un lipopolypeptide. Ledit lipopeptide ou un lipopolypeptide peut être obtenu, notamment par addition d’un lipide sur une fonction a-aminée ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d’un acide aminé dudit peptide ou polypeptide; il peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d’acides gras en C4-20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d’un stéroïde. La partie lipidique préférée est notamment représentée par un groupe N“-acétyl-lysine Ne(palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam).
[0050] Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, le ou lesdits peptides NP, et éventuellement le ou lesdits peptides GP sont inclus dans une protéine de fusion (protéine chimérique) comprenant ledit ou lesdits peptides fusionnés avec une protéine hétérologue (différente de la NP ou de la GP) ou un fragment polypeptidique hétérologue (fragment d’une protéine différente de NP ou de la GP dont la séquence n’est pas directement adjacente à la séquence dudit peptide dans la séquence de ladite NP ou GP). Ledit ou lesdits peptides peuvent être fusionnés avec l’extrémité NH2 ou COOH de ladite protéine ou dudit fragment polypeptidique hétérologue ou insérés dans la séquence de ladite protéine ou dudit fragment.
[0051] Selon une disposition avantageuse, ladite protéine chimérique est constituée par un ou plusieurs peptides tels que défini ci-dessus, fusionnés avec l’une des chaînes d’une molécule HLA, de préférence la chaîne béta d’une molécule HLA II ou la chaîne alpha d’une molécule HLA I, ou bien avec un fragment de celle-ci correspondant à une molécule HLA soluble, notamment un fragment correspondant au domaine extracellulaire précédé du peptide signal homologue ou d’un peptide signal hétérologue. Ledit peptide est avantageusement inséré entre le peptide signal et l’extrémité NH2 du domaine extracellulaire de la chaîne a ou b, comme décrit pour la molécule HLA-DR ( Kolzin et al., PNAS, 2000, 97, 291-296).
[0052] La présente invention a également pour objet une composition immunogène ou vaccinale comprenant au moins un polynucléotide codant pour au moins un peptide, polypeptide, et/ou ou protéine chimérique tels que définis ci- dessus.
[0053] Conformément à l’invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l’ADNc codant pour ledit ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), et/ou ou protéine(s) chimériques. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l’usage des codons soit optimal chez l’hôte dans lequel elle est exprimée.
[0054] Ces polynucléotides peuvent être insérés dans un vecteur d’expression, sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur approprié, pour permettre l’expression du ou desdits peptide(s) ou polypeptide(s) conforme à l'invention dans une cellule de l’hôte.
[0055] De nombreux vecteurs sont connus en eux-mêmes ; le choix d’un vecteur approprié dépend de l’utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d’intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l’hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des acides nucléiques nus (ADN ou ARN) ou des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d’intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu’un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l’introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l’électroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l’électroporation associée à des liposomes. [0056] De préférence, ledit vecteur est un vecteur d’expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression du peptide, polypeptide, protéine de fusion tels que définis ci-dessus. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d’expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d’épissage).
[0057] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, ladite composition comprend au moins un polynucléotide codant ledit ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), et/ou protéine(s) de fusion tels que définis ci-dessus, inséré dans un acide nucléique nu, de préférence un ADN nu.
[0058] D’autres compositions conformes à l'invention peuvent également comprendre une cellule présentatrice d’antigène modifiée, comprenant au moins un peptide, polypeptide, protéine chimérique, polynucléotide et/ou un vecteur tels que définis ci-dessus, la cellule pouvant être modifiée de façon stable ou transitoire. La cellule est notamment une cellule présentatrice d’antigène naturelle telle qu’une cellule dendritique ou une cellule présentatrice de l’antigène artificielle, telle que des exosomes dérivés de cellules dendritiques. La composition selon l’invention peut comprendre une cellule dendritique chargée avec au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique selon l’invention, ou transformée avec au moins un polynucléotide ou un vecteur selon l’invention.
[0059] La composition immunogène ou vaccinale selon l’invention comprend avantageusement un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une substance porteuse et/ou un adjuvant.
[0060] Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.
[0061] Les adjuvants sont avantageusement choisis parmi: les émulsions huileuses, les substances minérales, les extraits bactériens, les oligonucléotides contenant des CpG, la saponine, l’hydroxyde d’alumine, le monophosphoryl -lipide A et le squalène. [0062] Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nano-particules.
[0063] La composition conforme à l’invention peut comprendre en outre des adjuvants habituellement utilisés dans les vaccins, et permettant par exemple de favoriser l’administration du principe actif, de le stabiliser, d’augmenter son immunogénicité.
[0064] La composition immunogène ou vaccinale comprend une dose efficace d’un ou plusieurs peptide(s), polypeptide(s), protéine(s), polynucléotide(s), et/ou vecteur(s), permettant d'obtenir un effet préventif sur une infection par un virus Ebola. Cette dose est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l’âge, le sexe et le poids du sujet. La composition est généralement administrée selon les protocoles usuels de vaccination, à des doses et pendant une durée suffisante pour induire une réponse cellulaire en lymphocytes T CD4+ dirigés contre la protéine NP, et éventuellement contre la protéine GP (lorsque la composition comprend des peptides immunogènes de la GP). L'administration peut être orale, parentérale ou locale, de préférence par injection, notamment sous-cutanée ou intramusculaire, La composition se présente sous une forme galénique adaptée à une administration choisie.
[0065] La composition selon la présente invention est avantageusement utilisée comme vaccin pour la prévention des infections par le virus Ebola, notamment Ebola Zaïre, Soudan, Reston, Bundibuygo et Tai Forest ; de préférence Ebola Zaïre.
[0066] La présente invention a également pour objet une méthode de vaccination contre le virus Ebola, caractérisée en ce qu’elle comprend l’administration d’une composition vaccinale telle que définie ci-dessus, à un individu, par tout moyen approprié tel que défini ci-dessus.
[0067] L’administration de la composition selon l’invention à un individu, induit une réponse une réponse cellulaire en lymphocytes T CD4+ dirigés contre la protéine NP, et éventuellement contre la protéine GP (lorsque la composition comprend des peptides immunogènes de la GP). L’individu est de préférence un individu humain.
[0068] Selon un mode de réalisation, ladite composition immunogène ou vaccinale est utilisée en combinaison avec une autre composition vaccinale contre le virus Ebola, notamment une composition comprenant une protéine recombinante GP ou un vecteur codant ladite protéine. Lesdites compositions vaccinales sont utilisées simultanément, séparément ou de façon séquentielle.
[0069] La présente invention a également pour objet l’utilisation in vitro de la composition telle que définie ci-dessus comme réactif pour le diagnostic d’une infection par le virus Ebola.
[0070] La présente invention a également pour objet l’utilisation in vitro de la composition elle que définie ci-dessus comme réactif pour l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola chez un individu ayant été exposé au virus Ebola ou ayant été vacciné contre le virus Ebola.
[0071] La présente invention a également pour objet une méthode in vitro, d'immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola chez un individu ayant été exposé au virus Ebola ou ayant été vacciné contre le virus Ebola, caractérisée en ce qu’elle comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu comprenant des lymphocytes T CD4+ avec une composition selon l’invention telle que définie ci- dessus, et
- la détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus Ebola, par tout moyen approprié.
[0072] L’individu est de préférence un individu humain. L’échantillon biologique est notamment du sang total, des cellules mononucléées du sang périphériques (PBMC) isolés, des lymphocytes ou des lymphocytes T CD4+ isolés, notamment à partir de PBMC.
[0073] La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic ou d’immunomonitorage comprenant la composition telle que définie ci-dessus. De préférence, ledit réactif comprend au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique tels que définis ci-dessus, par exemple marqué et/ou complexé à une molécule HLA, notamment complexé à des molécules HLA marquées, par exemple biotinylées, sous la forme de complexes multimériques HLA/peptide tels que des tétramères de complexes HLA/peptide, marqués. De préférence, ledit réactif est inclus dans un coffret (kit).
[0074] La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé d’analyse de lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus Ebola, caractérisé en ce qu’il comprend au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact, in vitro, d'un échantillon cellulaire comprenant des lymphocytes T CD4+ avec des complexes multimériques HLA /peptide, marqués, notamment par un fluorochrome, lesdits complexes étant formés par la liaison de molécules HLA solubles avec au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique issu de la NP ou GP du virus Ebola Zaïre selon l’invention, et
- l’analyse des cellules liées auxdits complexes HLA l/peptide, notamment en cytométrie de flux.
[0075] Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l’analyse des cellules (lymphocytes T CD4+) comprend le tri desdites cellules.
[0076] La présente invention a également pour objet un peptide immunogène de la protéine NP du virus Ebola Zaïre apte à induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humain spécifiques tel que définis ci-dessus.
[0077] Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide NP est sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences.
[0078] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, il s’agit d’un polypeptide d’au plus 100 acides aminés issu de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 , comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences telles que définies ci-dessus. Ledit peptide consiste avantageusement en une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés, possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, ledit polypeptide issu de ladite NP est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 59 à 66.
[0079] La présente invention a également pour objet un peptide immunogène de la protéine GP du virus Ebola Zaïre apte à induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humain spécifiques tel que définis ci-dessus, ledit peptide GP étant sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 26, 27, 30, 31 , 33, 34, 36, 38 à 44, 46 à 53 et 56 à 58 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences.
[0080] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, il s’agit d’un polypeptide d’au plus 100 acides aminés issu de la GP de séquence SEQ ID NO : 25, comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 26, 27, 30, 31 , 33, 34, 36, 38 à 44, 46 à 53 et 56 à 58 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences telles que définies ci- dessus. Ledit peptide consiste avantageusement en une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 25 ou une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés, possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 25. De préférence, ledit polypeptide issu de ladite GP est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 67 à 74. [0081] La présente invention a également pour objet un polypeptide multiépitopique chimérique ou une protéine chimérique comprenant au moins un peptide NP et/ ou GP tel que défini ci-dessus, ainsi qu’un polynucléotide codant au moins un peptide NP et/ ou GP, un polypeptide multiépitopique chimérique et/ou ou une protéine chimérique comprenant au moins un peptide NP et/ ou GP tels que défini ci-dessus, éventuellement inséré dans un vecteur d’expression tel que défini ci-dessus, notamment un vecteur viral ou un acide nucléique nu tels que définis ci- dessus.
[0082] Les peptides et leurs dérivés tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'homme du métier. Par exemple, les peptides et leurs dérivés peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) ou en phase liquide, et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse. Les lipopeptides peuvent être notamment préparés selon le procédé décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. Les peptides et t leurs dérivés tels que définis ci-dessus peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l’homme du métier ; l’ADNc est cloné dans un vecteur d’expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d’affinité.
[0083] Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes. Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. Brève description des dessins
[0084] La présente invention sera mieux comprise à l’aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l’identification et la caractérisation des peptides immunogènes issus de la nucléoprotéine et de la glycoprotéine du virus Ebola Zaïre selon la présente invention, ainsi qu’aux figures annexées, sur lesquels :
Figure 1
[0085] [Fig. 1] montre le taux de réponse et l’intensité de réponse des lymphocytes T CD4+ vis-à-vis des peptides de la NP. A. Nombre de donneurs répondeurs pour chacun des peptides de 20-mers NP testés. B. Nombre de lignées de lymphocytes T positives pour chacun des peptides de 20-mers NP testés.
Figure 2
[0086] [Fig. 2] montre le taux de réponse et l’intensité de réponse des lymphocytes T CD4+ vis-à-vis des peptides de la GP. A. Nombre de donneurs répondeurs pour chacun des peptides de 20-mers GP testés. B. Nombre de lignées de lymphocytes T positives pour chacun des peptides de 20-mers GP testés.
Figure 3
[0087] [Fig. 3] montre un exemple de combinaisons de peptides de la NP. A. Pourcentage de donneurs répondeurs en fonction du cumul de peptides. B. Intensité de réponse (en % de lignées positives) en fonction du cumul de peptides.
Figure 4
[0088] [Fig. 4] montre un Exemple de combinaisons de peptides de la GP. A. Pourcentage de donneurs répondeurs en fonction du cumul de peptides. B. Intensité de réponse (en % de lignées positives) en fonction du cumul de peptides.
Figure 5
[0089] [Fig. 5] montre un exemple de combinaisons de longs fragments peptidiques (LSP) issus de la NP. A. Pourcentage de donneurs répondeurs en fonction du cumul de LSP. B. Intensité de réponse (en % de lignées positives) en fonction du cumul de LSP. Figure 6
[0090] [Fig. 6] montre un exemple de combinaisons de longs fragments peptidiques (LSP) issus de la GP. A. Pourcentage de donneurs répondeurs en fonction du cumul de LSP. B. Intensité de réponse (en % de lignées positives) en fonction du cumul de LSP.
Figure 7
[0091] [Fig. 7] montre la reconnaissance des peptides issus des variants du virus Ebola par des lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides conservés issus de la NP et de la GP de la souche Zaïre du virus. Les lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides issus de la souche Zaïre ont été incubées en présence de cellules présentatrices seules (NC ou non-chargées), ou chargées avec les peptides issus de la souche Zaïre (référence), Soudan, Reston ou Bundibugyo. La capacité de reconnaissance des peptides issus des variants Soudan, Reston et Bundibugyo du virus Ebola par les lignées de lymphocytes T CD4 est évaluée par ELISpot IFN-y.
Figure 8
[Fig. 8] montre la reconnaissance des protéines NP (nucléoproteine) et GP (glycoprotéine) du virus Ebola par des lymphocytes T CD4 spécifiques de peptides. Les lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides de la NP et de la GP ont été incubées en présence de cellules présentatrices sans peptide (NC ou non- chargées), ou avec un mélange de peptides de la NP ou de la GP, ou en présence de cellules présentatrices préalablement chargées avec la protéine NP ou la protéine GP. Après une nuit d’incubation, l’activation des lymphocytes T est évaluée par ELISpot IFN-y. EXEMPLES
Matériels et méthodes
1. Design et production des peptides
[0092] Les séquences de la NP (UniProt AAD14590.1 ; SEQ ID NO : 1 ) et de la GP (UniProt AKG65268.1 ; SEQ ID NO : 25) du virus Ebola proviennent du Centre américain pour les informations biotechnologiques (NCBI). La souche Zaïre de 1976 a été utilisée (ZEBOV). Les peptides ont été sélectionnés à l’aide de l’outil de prédiction de liaison au CMH-II, issu de la base de données IEDB (http://www.iedb.org/). Les algorithmes NetMHCIIpan et Sturniolo ont été utilisés pour prédire la capacité de liaison d’un peptide donné aux molécules HLA de classe Il sélectionnées. Des peptides de 20-mers contenant les cœurs proches ont ensuite été définis, de manière à ce que les cœurs ne soient pas en position 1 ou en position 20 du peptide. Les peptides de 20-mers ont été synthétisés par Pepscan (Pays-Bas), avec une pureté minimale de 80%.
2. Préparation des cellules
[0093] Les prélèvements sanguins (Couche leuco plaquettaire) proviennent de l’Établissement Français du Sang (Centre de Rungis). Les cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) ont été isolées par gradient de ficoll. Les cellules dendritiques (DC) immatures ont été obtenues à partir des PBMC par différenciation des cellules adhérentes après 5 jours de culture en milieu AIM-V contenant 1000 U/ml d’IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF (R&D Systems). Les DC matures ont été obtenues à partir des DC immatures après avoir été cultivées pendant deux jours en présence de LPS. Les lymphocytes T CD4+ ont été purifiés à partir des PBMC à l’aide de microbilles magnétiques couplées à des anticorps anti-CD4 (Miltenyi Biotec). Le génotypage des donneurs a été réalisé par NGS par la société DKMS Life Science (Dresden, Allemagne).
3. Obtention de lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques des peptides
[0094] Les lymphocytes T CD4+ (1 à 3x105) ont été mis en culture en plaque 96 puits à fond rond avec des DC matures autologues préalablement chargées avec des pools de peptides (10 pg/ml). La culture est faite dans du milieu IMDM supplémenté par du Sérum AB (milieu IMDM complet) contenant 1000U/ml d’IL-6 (R&D Systems) et 10ng/ml d’IL-12 (R&D Systems). 25 lignées lymphocytaires ont été ensemencées pour chaque pool de peptides. La culture est stimulée au bout d’une semaine par ajout de 10000 à 30000 DC chargées avec les pools de peptides, de 20U/ml d’IL-2 (R&D Systems) et de 10ng/ml d’IL-7 (R&D Systems). Une autre stimulation est faite après 14 et 21 jours de culture. Entre 5 et 7 jours après la dernière stimulation, un test de spécificité est réalisé par ELISpot. Chaque puits de culture constitue une lignée de lymphocytes T CD4+.
4. Evaluation de la spécificité de Lymphocytes T CD4 cultivés avec les peptides par ELISpot
Des anticorps anti-IFN-g humain (clone 1-D1 K, Mabtech, Suède) ont été adsorbés à 2,5pg/ml en PBS 1X (Mabtech) sur des plaques 96 puits Multiscreen HA (Millipore). Après une nuit d’incubation à 4°C, les plaques ont été saturées en les incubant 2 heures à 37°C avec du milieu l’IMDM complet. Les lymphocytes T CD4+ ont été incubés pendant 16 heures à 37°C dans ces plaques après avoir été lavés dans du milieu AIM-V contenant 0,5ng/ml d’IL-7, en présence de cellules présentatrices (50000 PBMC/puits) incubés en présence de 10pg/ml de peptides. Après l’incubation, les plaques ont été lavées avec de l’eau distillée, du PBS /Tween 0,05% et enfin du PBS. L’anticorps anti-IFN-y humain 7-B6-1 biotinylé (Mabtech) à 0,25pg/ml en PBS 1X/BSA 1 % a été ajouté dans les plaques (100pL/puits) puis incubé 1 h30 à 37°C. Après plusieurs lavages en PBS ou PBS/tween 0,05%, la sécrétion d’IFN-y a été mise en évidence par l’ajout de l’Extravidine-Phosphatase Alcaline et du substrat NBT/BCIP (Sigma-Aldrich, France). Après 5 à 10 minutes d’incubation, la réaction a été stoppée par lavage à l’eau courante. Après séchage, les spots, reflétant la sécrétion d’IFN- y par chaque lymphocyte T CD4+ activé, ont été comptés sur un lecteur ELISpot (AID). Une lignée de lymphocytes T CD4+ est considérée comme spécifique de l’antigène si le nombre de spots dans les puits contenant l’antigène est au moins deux fois plus élevé que le puits ne contenant pas l’antigène, la différence entre les deux types de puits étant au moins supérieure à 25.
Résultats
I . Sélection des peptides par prédiction in silico
Les peptides ont été sélectionnés à l’aide de l’outil de prédiction de liaison au CMH-
II, issu de la base de données IEDB (http://www.iedb.org/). Seules les molécules HLA-DR les plus abondamment exprimées à la surface des Cellules Présentatrices d’Antigène (CPA) ont été étudiées. Les allèles DRB1 parmi les plus fréquents dans différentes populations [Tableau 1] ont été sélectionnés.
Figure imgf000031_0001
[0096] rTableau P: Fréquence allélique (%) des principales molécules HLA- DRB1 (données issues de www.allefrequencies.net]
Les allèles sélectionnés sont indiqués en gras.
[0097] Les allèles HLA-DRB3*01 :01 , HLA-DRB3*02:02, HLA-DRB4*01 :01 et HLA- DRB5*01 :01 ont été ajoutées. Ainsi, 15 allèles HLA-DR, représentatifs des populations Caucasienne et Africaine, cités ci-après ont été sélectionnés : HLA- DRB1*01 :01 , HLA-DRB1 *03:01 , HLA-DRB1 *04:01 , HLA-DRB1 *04:05, HLA- DRB1 *07:01 , HLA-DRB1 *08:02, HLA-DRB1 *09:01 , HLA-DRB1*11 :01 , HLA- DRB1*12:01 , HLA-DRB1*13:01 , HLA- DRB1*15:01 , HLA-DRB3*01 :01 , HLA- DRB3*02:02, HLA-DRB4*01 :01 et HLA-DRB5*01 :01.
Les algorithmes NetMHCIIpan et Sturniolo ont permis de prédire la capacité de liaison d’un peptide donné aux molécules HLA de classe II sélectionnées. Pour chaque peptide, un rang est déterminé, son affinité prédite étant comparée à celle de 200000 peptides naturels. Dans notre cas, les peptides de 9-mers (coeur) avec un rang inférieur à 10% pour au moins 4 allèles HLA-DR, ou les peptides ayant un rang inférieur à 5% pour au moins 1 allèle ont été sélectionnés. Des peptides de 20- mers contenant les cœurs proches ont ensuite été définis, de manière à ce que les cœurs ne soient pas en position 1 ou en position 20 du peptide. 23 peptides 20-mer pour la NP et 33 peptides 20-mer pour la GP ont été sélectionnés pour être testés in vitro.
2. Obtention de lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques de la NP et de la GP de ZEBOV
[0098] 16 donneurs sains comportant des molécules HLA variées et représentatives de la population caucasienne ont été sélectionnés. Des lignées de lymphocytes T CD4+ ont été obtenues par co-culture des lymphocytes T CD4+ avec des cellules dendritiques autologues préalablement chargées avec des pools de peptides. Après amplification des lymphocytes T, chaque lignée a été testée par ELISpot pour sa capacité à reconnaître des pools de peptides puis dans un second test, les peptides individuels contenus dans le pool reconnu par les lignées. Afin de s’assurer de la capacité de chaque donneur à pouvoir répondre, des lignées lymphocytaires CD4+ spécifiques d’un pool de peptides spécifiques du Cytomégalovirus, Epstein-barr et de la grippe ont également été produites.
[0099] Le [Tableau 2] et le [Tableau 3] présentent les réponses individuelles en lymphocytes T CD4+ spécifiques contre des différents peptides de la NP et de la GP d’Ebola respectivement. Les lignées de lymphocytes T CD4 ont été obtenues par stimulation in vitro par des cellules dendritiques préalablement chargées avec les peptides de la NP ou de la GP. La spécificité pour ces peptides a été évaluée par Elispot IFNY. Le [Tableau 2] et le [Tableau 3] indiquent le taux de répondeurs (en %) et l’intensité de réponse (pourcentage de lignées positives) pour chacun des peptides.
[0100] [Tableau 21: Réponse individuelle des lymphocytes T CD4 contre les peptides NP
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
[0102] Il est à noter que seul un peptide (GP18-37) n’induit de réponse chez aucun des donneurs. Pour chaque peptide, l’intensité de réponse est variable en fonction des donneurs, de 1 à 14 lignées positives. Par ailleurs, le nombre de lignées positives totales par donneur est également extrêmement variable, de 1 à 83 et de 1 à 105 pour la NP et la GP respectivement.
[0103] Les résultats obtenus sont très hétérogènes en fonction des peptides étudiés. Dans le cadre de la vaccination contre le virus Ebola, il est nécessaire de sélectionner les peptides qui permettent d’induire une réponse cellulaire importante chez un maximum d’individus. Les données peuvent donc être analysées selon deux paramètres : le taux (nombre de donneurs répondeurs) [Fig.lA] et [Fig.2A] et l’intensité (nombre de lignées totales positives) de réponse pour chaque peptide [Fig.lB] et [Fig.2B] pour les peptides issus de la NP et la GP respectivement. Dix peptides pour la NP et 8 pour la GP induisent des réponses chez 50% des donneurs ou plus. On peut noter une bonne corrélation entre taux et intensité de réponse, en particulier pour la NP. En effet, les peptides répondant chez le plus grand nombre de donneurs sont également ceux pour lesquels le nombre de lignées positives est le plus élevé. Ces peptides peuvent donc permettre une bonne couverture de la population, tout en induisant une réponse efficace.
3. Reconnaissance des peptides issus des variants du virus Ebola par des lymphocytes T CD4+ spécifiques des épitopes issus de la NP et de la GP de la souche Zaïre du virus.
[0104] Les peptides identifiés et étudiés sont issus de la souche Zaïre du virus Ebola. La conservation de la séquence peptidique entre les différentes souches du virus Ebola a été étudiée pour les peptides présentant un fort taux de réponse. Les résultats sont représentés en pourcentage d’identité de séquence par rapport à la souche Zaïre. Le pourcentage d’identité des peptides entre les différentes souches est plus élevé pour les peptides de la NP que de la GP [Tableau 4] et [Tableau 5]· . [0105] [Tableau 4] Conservation des séquences des peptides issus de la NP entre les différentes souches du virus Ebola
Figure imgf000036_0001
[0106] [Tableau 5] Conservation des séquences des peptides issus de la GP entre les différentes souches du virus Ebola
Figure imgf000036_0002
[0107] Des lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides conservés de la NP et de la GP de la souche Zaïre du virus Ebola ont été générées à partir de cellules de 6 donneurs. Les lignées spécifiques ainsi obtenues ont été incubées en présence de cellules présentatrices (cellules dendritiques autologues) seules (NC ou non-chargées), ou chargées avec les peptides issus de la souche Zaïre (référence), Soudan, Reston ou Bundibugyo. La capacité de reconnaissance des peptides issus des variants Soudan, Reston et Bundibugyo du virus Ebola par les lignées de lymphocytes T CD4 est évaluée par ELISpot IFN-g. Des exemples représentatifs sont présentés en Figure 7. La lignée 1.10 du donneur 1026, spécifique du peptide NP27-46 reconnaît les peptides issus des souches Soudan et Bundibugyo, mais pas celui issu de la souche Reston. La lignée 2.11 du donneur 1027, spécifique du peptide NP717-736 ne reconnaît que le variant issu de Bundibugyo. La lignée 3.04 du donneur 1039 reconnaît tous les variants correspondant au peptide GP123-142, tandis que la lignée 4.05 issue du donneur 899, spécifique du peptide GP155-174 ne reconnaît que le variant issu de la souche Bundibugyo.
[0108] Les résultats de l’ensemble des peptides sont présentés dans le Tableau 6. Ils sont exprimés en pourcentage de lignées spécifiques de la souche Zaïre capables de reconnaître les peptides issus de la souche testée. Il est à noter que les peptides NP147-166, 154-173, 293-312, ainsi que les peptides NP390-409 issus des souches Soudan et Reston présentent des séquences identiques à la souche de référence Zaïre, et n’ont par conséquent pas été testés dans la mesure où ils devraient ainsi pouvoir être utilisés dans une composition vaccinale pour l’ensemble de ces souches du virus Ebola. De plus, les peptides GP177-196 et GP209-228 des souches Soudan Reston et Bundibugyo présentent de forts taux de mutations par rapport à la souche Zaïre, et n’ont donc pas été testés.
[0109] [Tableau 6] Reconnaissance des peptides de la N P ou de la GP issus des variants du virus Ebola
Figure imgf000037_0001
[Tableau 6] Les résultats sont exprimés en pourcentage de lignées spécifiques de la souche Zaïre capables de reconnaître les peptides issus de la souche testée (Conservé : séquence identique entre le variant testé et la souche Zaïre, /: séquence trop différente de la séquence de référence, NT: non testé).
4. Reconnaissance des protéines NP et GP du virus Ebola par des lymphocytes T CD4 spécifiques de peptides
[0110] Des lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides de la N P et de la GP ont été obtenues à partir de cellules de différents donneurs (6 pour la NP, 10 pour la GP). Les lymphocytes T CD4 ont été incubés en présence de cellules présentatrices (cellules dendritiques autologues) sans peptide (NC ou non- chargées), ou avec un mélange de peptides de la NP ou de la GP ou en présence de cellules présentatrices préalablement chargées avec la protéine NP ou la protéine GP. Après une nuit d’incubation, l’activation des lymphocytes T est évaluée par ELISpot IFN-g La Figure 8 montre des exemples représentatifs. La lignée 1.02 du donneur 1070 et la lignée 1.24 du donneur 1071 , spécifiques des peptides NP27-46 et NP147-166 respectivement reconnaissent les cellules dendritiques chargées avec le mélange de peptides (témoin positif), celles chargées avec la NP, mais pas celles chargées avec la GP (témoin négatif). A l’inverse, les lignées 4.06 du donneur 1071 et 4.09 du donneur 1070, spécifiques des peptides GP60-79 et GP155-174 respectivement, ne reconnaissent pas les cellules dendritiques chargées avec la NP (témoin négatif), mais reconnaissent les cellules dendritiques chargées avec la GP.
[0111] L’ensemble des données est compilé dans le Tableau 7. De nombreuses lignées de lymphocytes spécifiques des peptides sont capables de reconnaître les cellules présentatrices chargées avec la protéine correspondante, démontrant que ces épitopes sont naturellement présentés par les cellules présentatrices. [0112] [Tableau 7] Reconnaissance des protéines NP et GP du virus Ebola par des lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides.
Figure imgf000039_0001
[Tableau 7] : Le nombre de lignées capables de reconnaître la protéine et le nombre de donneurs répondeurs à la protéine sont indiqués.
[0113] Les lignées obtenues sont issues de différents donneurs (entre 2 pour NP154-173 et NP293-312 et 6 pour GP155-174), à l’exception des lignées spécifiques des peptides NP14-33, NP720-739 et GP209-228, obtenues à chaque fois chez un seul donneur.
[0114] Ces peptides, en particulier les peptides NP, devraient ainsi pouvoir être utilisés dans une composition vaccinale pour l’ensemble des souches du virus Ebola.
5. Sélection des peptides d’intérêt
a) Combinaison de peptides de 20-mer
[0115] Les résultats obtenus ici montrent que tous les donneurs testés peuvent développer une réponse des lymphocytes T CD4 vis-à-vis des protéines virales NP et GP. Néanmoins, les peptides permettant cette réponse varient en fonction des individus. Dans le but d’optimiser une composition vaccinale, il est nécessaire de déterminer un cocktail minimal de peptides permettant de couvrir l’ensemble de la population. Ainsi, on peut observer que 4 peptides issus de la NP, et 5 peptides de la GP permettent d’obtenir cette couverture, tout en induisant une intensité de réponse de 20% pour la NP et 23% pour la GP ([Fig. 3] et [Fig. 4] respectivement). L’ajout de peptides supplémentaires permet alors de gagner en intensité de réponse. Cette exemple est non-limitatif, d’autres combinaisons de peptides permettant d’induire un taux de réponse de 100 % dans le groupe d’individus étudié peuvent être sélectionnées à partir des taux de réponse des peptides NP et GP présentées aux [Tableau 2] et [Tableau 3]. b) Combinaison de longs fragments d’intérêt
[0116] De manière à limiter le nombre de peptides, il est possible de définir des longs fragments peptidiques (LSP) couvrant les 20-mers identifiés. Ceux-ci sont construits de manière à regrouper les peptides 20-mers chevauchants et d’intérêt
[Tableau 8] et [Tableau 9].
[0117] [Tableau 8]
Figure imgf000041_0001
[0118] [Tableau 9]
Figure imgf000042_0001
[0119] Par exemple, les peptides NP14-33, NP27-46 et NP39-58 peuvent être regroupés sous la forme du LSP NP14-58. Ces LSP peuvent ensuite être combinés, de manière à obtenir une couverture de donneurs optimale. On voit alors que 3 LSP pour la NP (NP226-290, NP147-207, NP205-224) comme pour la GP (GP123-186, GP31-79, GP545-595) permettent de couvrir l’ensemble des donneurs testés, avec une intensité de réponse de 29% et 41% respectivement (Figures 5 et 6, respectivement). L’ajout d’autres LSP, sans augmenter le taux de réponse permet d’amplifier l’intensité de réponse. A partir des résultats obtenus pour les 20-mers, il est possible définir d’autres LSP et d’autres combinaisons de LSP.
[0120] Conclusion
Des peptides capables de stimuler des lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus Ebola chez un panel de donneurs sains représentatif des populations caucasienne et africaine (groupe de référence) ont été identifiés dans la NP et la GP du virus Ebola Zaïre. Les réponses contre les peptides issus de la NP sont plus intenses que celles contre les peptides de la GP, aussi bien en termes de nombre de donneurs répondeurs, qu’en termes d’intensité de réponse (nombre de lignées positives). Dix peptides pour la NP et 8 pour la GP induisent des réponses chez 50% des donneurs ou plus. On peut également noter une bonne corrélation entre taux et intensité de réponse, en particulier pour la NP. Ces peptides, en particulier les peptides NP, peuvent donc permettre une bonne couverture de la population, tout en induisant une réponse efficace. De plus les peptides de la NP sont globalement plus conservés et donc potentiellement efficaces contre les différentes souches d’Ebola comme le montre la réaction croisée des lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides NP conservés issus de la souche Zaïre vis-à-vis des peptides NP variants issus d’autres souches d’Ebola. 4 peptides issus de la NP et 5 peptides de la GP permettent d’obtenir une couverture vaccinale optimale de la population étant donné qu’ils sont capables d’induire un taux de réponse de 100 % dans le groupe de référence, tout en induisant une intensité de réponse de 20% pour la NP et 23% pour la GP. En combinant plusieurs peptides dans de longs fragments polypeptidiques (LSP), 3 LSP pour la NP comme pour la GP, permettent de couvrir l’ensemble des donneurs testés avec une intensité de réponse de 29% et 41% respectivement. L’ajout d’autres peptides ou d’autres LSP, sans augmenter le taux de réponse permet d’amplifier l’intensité de réponse. De nombreuses lignées de lymphocytes T CD4 spécifiques des peptides de la NP et de la GP sont capables de reconnaître les cellules présentatrices chargées avec la protéine correspondante, démontrant que ces épitopes sont naturellement présentés par les cellules présentatrices..

Claims

Revendications
1. Composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins un premier peptide immunogène issu de la nucléoprotéine (NP) du virus Ebola Zaïre qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, ledit peptide étant un peptide conservé de ladite NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 9, 3 et 23.
2. Composition selon la revendication 1 , comprenant au moins un autre peptide immunogène issu de la NP du virus Ebola Zaïre qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 2, 4 à 8, 10 à 22 et 24.
3. Composition selon la revendication 2, comprenant au moins un peptide de ladite NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 21 , et 24 ; de préférence au moins un peptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 6, 8, 10, 16, 17, 18 et 24 ; de manière préférée, au moins un peptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 6, 8, 17 et 24.
4. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant au moins un autre peptide conservé de ladite NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 5, 8, 17, 21 et 24 ou 5, 8, 17 et 24 ; de préférence au moins un peptide conservé de ladite NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 5, 8 et 17; de manière préférée au moins un peptide conservé de ladite NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 8 et 17.
5. Composition, selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant au moins un deuxième peptide immunogène issu de la glycoprotéine (GP) du virus Ebola Zaïre qui est apte à induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, ledit peptide étant sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 26, 27 et 29 à 58.
6. Composition selon la revendication 5, comprenant au moins un peptide de ladite GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 29, 31 , 32, 33, 35, 37, 39, 41 , 42, 43, 48, 53 et 57; de préférence au moins un peptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 29, 31 , 32, 33, 35, 37, 39, 42 et 43 ; de manière préférée, au moins un peptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31 , 33, 35, 39, 42 et
43.
7. Composition selon la revendication 6, comprenant au moins un peptide conservé de ladite GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31 , 33 et 35; de préférence au moins un peptide conservé de ladite GP de séquence SEQ ID NO : 35.
8. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant au moins 4 desdits peptides de la NP et/ou de la GP, de préférence 4 à 10 ou plus desdits peptides.
9. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, qui est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro d’au moins 75 %, de préférence de 100 %, et/ou une intensité de réponse in vitro d’au moins 20 %, de préférence d’au moins 50 %, dans un groupe de référence exprimant les allèles HLA- DRB1 *01 :01 , HLA-DRB1 *03:01 , HLA-DRB1 *04:01 , HLA-DRB1 *07:01 , HLA- DRB1 *09:01 , HLA-DRB1 *1 1 :01 , HLA-DRB1 *13:01 , HLA-DRB1 *15:01 , HLA- DRB3*01 :01 , HLA-DRB3*02:02, HLA-DRB4*01 :01 et HLA-DRB5*01 :01 .
10. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant au moins un troisième peptide immunogène choisi parmi un autre peptide immunogène du virus Ebola ou un peptide immunogène d’un autre pathogène.
11. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant au moins:
a) un peptide isolé ou un mélange de peptides comprenant ledit ou lesdits premier peptide(s), et éventuellement ledit ou lesdits deuxième et/ou troisième peptide(s) ; b) un polypeptide d’au plus 100 acides aminés de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 ou de la GP de séquence SEQ ID NO : 25 comprenant au moins un des peptides définis en a);
c) une protéine de fusion ou un polypeptide multiépitopique chimérique comprenant au moins des peptides définis en a) ; d) un polynucléotide codant au moins un peptide, polypeptide, protéine de fusion défini en a) à c) ; ou un mélange dudit ou desdits peptide(s), polypeptide(s), protéine(s) de fusion et/ou polynucléotide(s) définis en a) à d).
12. Composition selon la revendication 1 1 , dans laquelle ledit polynucléotide est sous forme d’acide nucléique nu.
13. Composition selon la revendication 1 1 , comprenant au moins un polypeptide issu de ladite NP sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 59 à 66.
14. Composition selon la revendication 1 1 ou 13, comprenant au moins un polypeptide issu de ladite GP sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 67 à 74.
15. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, pour son utilisation comme vaccin dans la prévention d’une infection par le virus Ebola.
16. Utilisation in vitro d’une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, pour le diagnostic d’une infection par le virus Ebola ou l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola.
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