CA2477762A1 - Peptides utilisables en immunotherapie antitumorale - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation de peptides immunogènes représentant des épitopes T présentés par le CMH I, dérivés des antigènes Melan-A, MAGE-A6, gp100, tyrosinase et NY-ESO-1 dans le cadre du diagnostic ou du traitement des mélanomes chez des sujets HLA-B35.

Description

PEPTIDES UTILISABLES EN IMMUNOTHERAPIE ANTITUMORALE
La présente invention est relative à des peptides représentant des épitoges partagés d'antigènes tumoraux, et à leur utilisation en immunothérapie.
. La vaccination ou immunothérapie peptidique est une approche thérapeutique qui fait actuellement l'objet d'un grand intérêt dans le cadre de la prévention ou du traitement des cancers. Son principe repose sur l'immunisation par des peptides reproduisant des épitoges T d'antigènes associés aux tumeurs (TAA) reconnus par les lymphocytes T
cytotoxiques (CTL), qui jouent un rôle majeur dans l'élimination des cellules cancéreuses exprimant ces antigènes à leur surface.
On rappellera que les CTLs ne reconnaissent pas les antigènes protéiques entiers, mais des fragments peptidiques de ceux-ci, présentés par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) exprimées à la surface de différentes cellules. Ce sont ces fragments peptidiques qui constituent les épitoges T. Les peptides présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) ont généralement 8 à
11 acides aminés, et sont reconnus par les cellules T CD8+, qui représentent la composante majeure de la réponse cytotoxique. Les peptides présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) ont généralement 13 à 18 acides aminés et sont reconnus par les cellules T CD4+.

2 0 L'identification de ces épitoges, et notamment de ceux présentés par le CMH I (compte tenu du rôle essentiel de la réponse CD8+ dans la cytotoxicité), constitue donc une étape essentielle pour le développement de compositions d'immunothérapie anti-tumorale.
Dans le cas des mélanomes, on a identifié deux classes principales d'antigènes associés aux mélanomes (MAA) : les antigènes spécifiques des mélanomes, peu ou pas exprimés 2 5 dans les tissus normaux, et les antigènes de différenciation mélanocytaire qui sont également exprimés par les mélanocytes (pour revue, voir CASTELLI et al., 2000, J Cell l'hysiol, 182, 323-31 ; KIRI~IN et al., 2002, Ca~zcef° Invest, 20, 222-36).
Les antigènes de différenciation mélanocytaire, comme Melan-A/MART-1, gp-100 et la tyrosinase, sont exprimés par une proportion importante des tumeurs de type mélanome.
30 En outre, ces antigënes sont reconnus efficacement aussi bien par les CTLs de sujets sains que par ceux des patients atteints de mélanome (BENLALAM et al., 2001, Eur Jlmrnunol, 31, 2007-15 ; I~AWAKAMI et al., 2000, JInZmunotlzef; 23, 17-27 ; LABARRIERE et al., 1998, Int J Cancer, 78, 209-15 ; PITTET et al., 1999, J Exp Med, 190, 705-15 ;
VALMORI et al., 2002, Cayacer Res, 62, 1743-50). On connaît à l'heure actuelle, plus de 35 trente épitoges de ces antigènes reconnu par les CTLs, dont près des deux tiers sont présentés dans le contexte HLA-A*0201.
Les antigènes spécifiques des mélanomes incluent des familles d'antigènes dits « partagés par les cancers et Ies testicules » : MAGE, GAGE, BAGE et LAGE. Ces antigènes, qui sont exprimés par différentes tumeurs, génèrent des épitoges CTL présentés dans une grande variété de contextes HLA, y compris HLA-B et C (KIRKIN et al., 2002). A
l'exception de NY-ESO-1 (JAGER et al., 1998, JExp Med, 187, 265-70), et à la différence des antigènes de différenciation mélanocytaire, les antigènes partagés par les cancers et les testicules sont rarement reconnus par les lymphocytes infiltrant les tumeurs (TILs).
L'identification de la plupart des épitoges présents chez ces antigènes s'est effectuée à
l'aide de CTLs générés ex-vivo par stimulation répétée de lymphocytes du sang périphérique (PBL) par des cellules présentatrices (CPA) chargées avec des antigènes (SCHULTZ et al., 2001, Tissue Antigens, 57, 103-9), à l'exception des épitoges de MAGE-A6 et MAGE-A12, puisqu'ils ont été identifiés avec des clones CTLs dérivés de TILs (PANELLI et al., 2000, Jlmmunol, 164, 4382-92; ZOON & HERCEND, 1999, Eur J
Imrnunol, 29, 602-7).
Jusqu'à présent, la plupart des essais d'immunothérapies peptidiques sur les mélanomes ont été effectuées dans le contexte HLA-A*0201 ou HLA-A*0101 et en n'utilisant qu'un nombre limité d'épitoges de TAA (LAU et al., 2001, J Irnmunother, 24, 66-78 ;
MACKENSEN et al., 2000, Int J Cazzcer, 86, 385-92 ; MARCHAND et al., 1999, Int J
Cancer, 80, 219-30 ; PANELLI et al., 2000, Jlfnfnunotlzet; 23, 487-98 ;
ROSENBERG et al., 1998, J Natl Cancer° Inst, 90, 1894-900 ; SALGALLER et al., 1996, Cancer Res, 56, 4749-57). Or, la sous-expression d'allèles HLA, et l'apparition de variants de TAA ayant 2 0 perdu les épitoges reconnus par les CTLs pourraient constituer des mécanismes permettant l'échappement des cellules tumorales, vis à vis du système immunitaire (FERRONE ôi MARINCOLA, 1995, Inzmunol Today, 16, 487-94 ; MAEURER et al., 1996, Clin Caneer Res, 2, 641-52), ce qui pourrait expliquer la faible efficacité des vaccins utilisant des peptides.
2 5 Pour pallier cet inconvénient, il a été proposé d'utiliser des vaccins polyvalents composés d'une multitude de peptides issus de différents TAA et présentés dans des contextes HLA
variés. Toutefois, ceci nécessite l'identification de nouveaux complexes peptides/HLA qui soient efficacement présentés par les cellules tumorales.
En outre, l'identification de peptides présentés dans différents contextes HLA
permet

3 0 également de développer des outils permettant de mesurer la réponse des cellules T chez les patients immunisés. En effet, si l'identification de nouveaux peptides antigéniques est essentielle pour augmenter la disponibilité et l'efficacité des vaccins, elle l'est aussi pour améliorer le suivi de la réponse CTL des patients qui ont été immunisés avec des peptides ou d'autres formes d'antigènes, comme des protéines recombinantes complètes ou des 3 5 virus recombinants.
Dans la mesure où HLA-B35 constitue l'un des allèles HLA-B les plus fréquents, présent chez environ 20% de la population caucasienne (dont 60% correspond à l'allèle B*3501 ;
MORI et al., 1997, Transplantation, 64, 1017-27), l'identification de nouveaux peptides antigéniques présentés dans le contexte HLA-B35 est très souhaitable pour le développement de l'immunothérapie cancéreuse.
Les Inventeurs ont identifié de nouveaux épitoges, qui sont dérivés d' antigènes mélanocytaires ou d'antigènes partagés par les cancers et les testicules, et qui sont présentés dans le contexte HLA-B35.
Les peptides reproduisant ces épitoges peuvent être utilisés dans un but diagnostique ou thérapeutique, dans le cadre de la prévention ou du traitement de mélanomes chez des patients exprimant un allèle HLA-B35, en particulier HLA-B*3501 ou HLA-B*3503.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un peptide immunogène représentant un épitoge T présenté par le CMH I, choisi parmi a) un peptide comprenant la séquence EX1AGIGILX2 (SEQ ID NO : 1) dans laquelle X~
représente A ou P, et X2 représente T ou Y, capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigëne Melan-A ;
b) un peptide comprenant la séquence EVDPIGHVY (SEQ ID NO : 2), capable d'induire une réponse T cytotoxique dirigée contre l'antigène MAGE-A6 ;
c) un peptide comprenant la séquence VPLDCVLYR (SEQ ID NO : 3), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène gp100 ;
d) un peptide comprenant la séquence TPRLPSSADVEF (SEQ ID NO : 4) capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène tyrosinase ;
2 0 e) un peptide comprenant la séquence MPFATPMEA (SEQ ID NO : 5), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène NY-ESO-l;
pour l'obtention d'un médicament destiné à l'immunothérapie anti-tumorale chez un patient HLA-B35. Avantageusement, ledit médicament est destiné au traitement des mélanomes.
2 5 Avantageusement, on pourra utiliser - au moins un peptide a) répondant à une séquence choisie parmi :
TAEEAAGIGILTV
(SEQ ID NO : 6), EAAGIGILTVIL (SEQ ID NO : 7), EAAGIGILTV (SEQ ID NO : 8), EAAGIGILTY (SEQ ID NO : 9), EAAGIGILY (SEQ ID NO : 10), EPAGIGILTY
(SEQ ID NO : 11 ), EPAGIGILTV (SEQ ID NO : 12) ;
3 0 - un peptide b) répondant à la séquence EVDPIGHVY (SEQ ID NO : 2) ;
- au moins un peptide c) répondant à une séquence choisie parmi VPLDCVLYR (SEQ
ID
NO : 3) et VPLDCVLYRY (SEQ ID NO : 13) ;
- au moins un peptide d) répondant à une séquence choisie parmi TPRLPSSADVEFCL
(SEQ ID NO : 14) et TPRLPSSADVEF (SEQ ID NO : 4) ;
3 5 - au moins un peptide e) répondant à une séquence choisie parmi :
LAMPFATPMEAEL
(SEQ ID NO : 15), LAMPFATPMEAE (SEQ ID NO : 16), MPFATPMEAEL (SEQ ID
NO : 17), MPFATPMEAE (SEQ ID NO : 18), et MPFATPMEA (SEQ ID NO : 5).

4 Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, on utilise une combinaison comprenant au moins deux peptides de deux catégories différentes parmi les catégories a), b), c), d) ou e) définies ci-dessus, afin d'être en mesure d'induire une réponse cytotoxique contre au moins deux antigènes tumoraux.
La présente invention a également pour objet une composition mufti-épitopique associant au moins deux peptides de deux catégories différentes parmi les catégories a) b) c) d) ou e) ci-dessus. Avantageusement, ces compositions comprennent au moins un peptide de chacune de ces catégories a) b) c) d) ou e).
Des compositions mufti-épitopiques conformes à l'invention peuvent également comprendre un ou plusieurs autres) peptides immunogène(s), issus des antigènes mentionnés ci-dessus, ou d'antigènes différents. Ces peptides peuvent représenter des épitoges issus du même antigène, ou de deux ou plusieurs antigènes différents.
A titre d'exemple, on citera le peptide EVDPIGHLY (SEQ ID NO : 19), qui représente un épitoge de MAGE-A3, déjà connu comme pouvant être présenté dans un contexte HLA-B35 (Demande PCT WO 01/53833).
Ces compositions peuvent également comprendre, pour être plus largement utilisables sur une population dont les individus portent des allèles HLA différents, un ou plusieurs peptides présentés par des molécules du CMH I autres que HLA-B35. A titre d'exemple, on citera le peptide PLDCVLYRY (SEQ ID NO : 20), décrit ci-après.
2 0 Des compositions mufti-épitopiques conformes à l'invention peuvent notamment se présenter sous forme d'un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies de chacun des épitoges choisis.
Des polypeptides chimériques conformes à l'invention peuvent être facilement obtenus par des méthodes connues en elles-mêmes, et notamment par les techniques classiques de 2 5 l'ADN recombinant.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide codant pour un polypeptide chimérique conforme à l'invention, ainsi qu'un vecteur d'acide nucléique contenant ledit polynucléotide.
La présente invention englobe également l'utilisation dudit polynucléotide ou dudit vecteur 30 d'acide nucléique en immunothérapie antitumorale.
Des exemples non limitatifs de mise en ouvre de la présente invention sont indiqués ci-après.
On peut par exemple injecter au patient à traiter un peptide, un polypeptide chimérique, ou une composition mufti-épitopique tels que définis ci-dessus, éventuellement associés à un 3 5 adjuvant approprié.
On peut également utiliser l'un des peptides définis ci-dessus pour charger in vitro des cellules présentatrices de l'antigène professionnelles HLA-B35, notamment des cellules dendritiques, afin d'induire la prolifération de CTLs anti-tumeurs, comme décrit par

5 PCT/FR03/00698 exemple par BAKKER et al. (Cancer Res., 55, 5330-5334, 1995) ou VAN ELSAS et al.
(Eur. J. Immunol., 26, 1683-1689, 1996).
Les cellules présentatrices de l'antigène HLA-B35 chargées de la sorte font également partie de l'objet de la présente invention.
5 Les polynucléotides conformes à l'invention de préférence intégrés dans des vecteurs d'acide nucléique, notamment des vecteurs viraux tels que des adénovirus, peuvent également être administrés par injection au patient à traiter.
Un polynucléotide comprenant une séquence codant pour un peptide défini par l'une des séquences SEQ ID NO: 1 à 18 ci-dessus, et notamment un polynucléotide codant pour un polypeptide chimérique conforme à l'invention, peut également être utilisé
pour transfecter in vitro des cellules présentatrices de l'antigène professionnelles HLA-B35, notamment des cellules dendritiques, qui sont ensuite injectées au patient, comme décrit par exemple par KAPLAN et al. (J. Immunol., 163(2), 699-707, 1999) ou KIM et al. (Annals of Surgical Oncology, 5(1), 64-76, 1998). Ces cellules présentatrices de l'antigène transfectées font également partie de l'objet de la présente invention.
La présente invention englobe aussi l'utilisation des peptides définis ci-dessus, pour la détection izz vitf°o de CTLs dirigés contre un ou plusieurs des antigènes Melan-A, MAGE-A6, gp100, tyrosinase, et NY-ESO-1, dans un prélèvement biologique obtenu à
partir d'un sujet HLA-B35.
2 0 Ces peptides peuvent également étre utilisés pour réaliser le tri spécifique de ces CTLs.
Les CTLs ainsi isolés peuvent ensuite être amplifiés ih vitro et réinjectés en grand nombre (de l'ordre du milliard) au patient.
La présente invention a également pour objet des compositions thérapeutiques comprenant, en tant que principe actif, un peptide ras muté, une composition mufti-épitopique, un polypeptide chimérique, un polynucléotide, ou une cellule présentatrice de l'antigène conforme à l'invention.
Les compositions thérapeutiques conformes à l'invention peuvent comprendre en outre les excipients usuels, ainsi que des adjuvants habituellement utilisés en immunothérapie, et permettant par exemple de favoriser l'administration du principe actif, de le stabiliser, d'augmenter son immunogénicité, etc.
Parmi les peptides des catégories a), b), c), d), et e) mentionnées ci-dessus, certains étaient déjà connus comme capable d'induire une réponse CTL, mais dans d'autres contextes que HLA-B35.
D'autres n'avaient jamais été décrits comme des épitopes capables d'induire une réponse T
3 5 cytotoxique et n'avaient donc pas été isolés. Il s'agit des peptides suivants:
- les peptides EAAGIGILTY (SEQ ID NO : 9), EAAGIGILY (SEQ ID NO : 10), EPAGIGILTY (SEQ ID NO : 11), EPAGIGILTV (SEQ ID NO : 12) ;
- les peptides VPLDCVLYR (SEQ ID NO : 3) et VPLDCVLYRY (SEQ ID NO : 13) ;

6 - les peptides TPRLPSSADVEFCL (SEQ ID NO : 14)et TPRLPSSADVEF (SEQ ID
NO : 4).
La présente invention englobe également ces peptides particuliers, ainsi que toute composition mufti-épitopique comprenant au moins un de ces peptides. Ceci inclut notamment des polypeptides chimériques contenant au moins un de ces peptides.
Les polynucléotides codant pour ces polypeptides chimériques, et les vecteurs d'acide nucléique contenant ces polynucléotides font aussi partie de l'objet de la présente invention.
Les inventeurs ont en outre constaté que le peptide VPLDCVLYRY (SEQ ID NO :
13) issu de l'antigène gp100, était aussi reconnu, dans le contexte HLA*A0101, par un clone T
CD8 (M199.6.12) issu d'une population de TILs de mélanome. A partir de ce peptide, ils ont identifié un peptide plûs court, (PLDCVLYRY, SEQ ID NO : 20), qui n'est pas reconnu dans le contexte HLA-B35, mais est très efficacement reconnu dans le contexte A*0101. Le peptide SEQ ID NO : 20 fait également partie de l'objet de la présente invention, ainsi que les polypeptides chimériques contenant au moins ce peptides. Les polynucléotides codant pour ces polypeptides chimériques, et les vecteurs d'acide nucléique contenant ces polynucléotides font aussi partie de l'objet de la présente invention. Ce peptide, les polypeptides chimériques le contenant, ainsi que les polynucléotides codant pour ces polypeptides chimériques peuvent étre employés dans le cadre de la détection ou du traitement de mélanomes chez des sujets HLA-A1, et notamment HLA*A0101, selon les mémes techniques que celles indiquées ci-dessus pour les peptides reconnus dans le contexte HLA-B35.
D'autre part, des études effectuées sur des modèles animaux ont permis d'identifier d'autres antigènes de rejet tumoral, dont un grand nombre sont des protéines mutées oncogènes (PREHN et al., J. Natl. Cancer Inst., 18, 769, 1998 ; DE PLAEN et al., PNAS, 85, 2274, 1988 ; DLJBEY et al., J. Exp. Med., 185, 695, 1997). La présentation par des molécules du CMH des fragments mutés de ces protéines à la surface des cellules tumorales induit la destruction spécifique de celles-ci par les CTLs et le rejet de la tumeur.
Chez l'homme, les protéines mutées oncogènes apparaissent également comme des cibles 3 0 particulièrement intéressantes pour l'immunothérapie anti-tumorale.
Toutefois, ceci implique d'identifier les épitopes présentés à la surface des cellules tumorales et capables d'induire une réponse T cytotoxique.
Parmi les oncogènes les plus fréquemment impliqués dans différents types de tumeurs, on citera les oncogènes ras (K ras, H f~as et N ras) qui résultent de mutations ponctuelles 3 5 (substitution d'un seul acide aminé) des proto-oncogènes ras p21. Ces mutations interviennent essentiellement au codon 12, au codon 13, ou au codon 61 (BOS, Cancer Res., 49, 4682, 1989 ; WEIJZEN et al., Leulcemia, 13, 502, 1999). Du fait du nombre limité de substitutions oncogéniques pouvant intervenir, des mutations pas présentes dans

7 de nombreuses tumeurs identiques peuvent ainsi générer des épitoges tumoraux partagés, présentés par une fraction significative de tumeurs humaines (WEIJZEN et al., Leukemia, 13, 502, 1999).
Il a ainsi été proposé d'utiliser en immunothérapie anti-tumorale des peptides synthétiques reproduisant des épitoges ras mutés. Ainsi, la demande PCT WO 92/14756 propose l'utilisation de peptides reproduisant des épitoges ras mutés au codon 12 ou au codon 61.
Toutefois ces épitoges sont présentés par le CMH II (DQ et DR), et induisent donc une réponse CD4+. Or, bien qu'il puisse être avantageux d'induire ce type de réponse, dans la mesure où les lymphocytes auxiliaires CD4+ permettent d'augmenter la réponse cytotoxique (WALTER et al., N. Engl. J. Medicine, 333, 1038, 1995), la réponse CD8+
demeure l'acteur essentiel de la cytotoxicité. En outre, des études récentes effectuées chez la souris suggèrent que l'immunisation avec des peptides présentés par le CMH
II pourrait induire une stimulation de la croissance tumorale au lieu de la protection espérée (SIEGEL
et al., J. Exp. Med., 191, 1945, 2000).
Plusieurs épitoges ras mutés aux positions 12, 13 ou 61 ont sélectionnés sur la base de leur capacité d'ancrage à des molécules du CMH de classe I (VAN ELSAS et al., Int.
J.
Cancer, 61, 389, 1995 ; BERGMANN et al., Cell Immunol., 187, 103, 1998 ;
GOUTTEFANGEAS et al., Human Immunol., 55, 117, 1997). Les peptides ainsi sélectionnés peuvent stimuler la croissance de CTLs spécifiques à partir de PBL in vitro.
2 0 Mais ces CTLs reconnaissent faiblement les cellules tumorales mutées, suggérant que l'expression endogène de ces épitoges est limitée (VAN ELSAS et al., Int. J.
Cancer, 61, 389, 1995 ; ABRAMS et al., Cell Immunol., 182, 137, 1997 ; BERGMANN et al., Cell Immunol., 187, 103, 1998), et qu'ils ne permettent donc pas l'élimination efficace des cellules tumorales par des CTLs spécifiques, ce qui limite considérablement leur intérêt en 2 5 immunothérapie.
Il apparaît donc nécessaire de disposer d'autres épitoges ras mutés restreints au CMH I et présentés efficacement par une fraction significative de tumeurs humaines.
Les Inventeurs ont maintenant identifié un épitoge ras muté en position 61 par substitution d'une glutamine par une arginine (Q61R), et restreint au CMH I. Cet épitoge, dénommé ci 3 0 après 55-64Q6iR est présenté efficacement par plusieurs lignées de mélanome HLA
A*0101+ exprimant un oncogène ras portant la mutation Q61R. Il est capable d'induire spécifiquement l'expansion de clones de lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) obtenus à partir de ces mélanomes. De plus, les cellules dendritiques chargées avec ce peptide stimulent de façon efficace des CTLs spécifiques à partir de lymphocytes du sang 35 périphérique (PBL) de donneurs sains HLA-A*0101, et ces CTLs reconnaissent toutes les lignées de mélanomes HLA-A*0101 exprimant l'oncogène ras Q61R, et ne reconnaissent pas les cellules exprimant la protéine ras non-mutée.

8 Le peptide 55-64Q6iR ne possède pas une capacité d'ancrage supérieure à celle du peptide de type sauvage correspondant. L'affinité de liaison à HLA-A*0101 du peptide de type sauvage est similaire à celle du peptide 55-64Q61R. Cependant, même à
concentrations élevées, ce peptide de type sauvage ne peut induire ni l'expansion de TIL
spécifiques, ni celle de CTLs spécifiques. Il apparaît donc que la substitution d'une glutamine par une arginine en position 61 crée un nouvel épitope présenté par HLA-A*0101.
En outre, une analyse effectuée sur la banque de données BIMAS
(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind ; PARKER et al., J. Immunol. 152, 163, 1994), montre que ce peptide a un score de liaison identique pour HLA-A*0101 et HLA-B* 1501.
En conséquence, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un peptide ras muté immunogène de séquence ILDTAGREEY (SEQ ID NO : 35) pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement immunothérapique de tumeurs chez un patient HLA-A*0101 ou HLA-B* 1501, Avantageusement, ledit médicament est utilisable pour le traitement de tumeurs exprimant une protéine K-ras, H-ras ou N-ras mutée par substitution de la glutamine en position 61 par une arginine.
On citera notamment les mélanomes, ainsi que d'autres tumeurs dans lesquelles les mutations ras affectant le résidu 61 sont détectées avec une fréquence élevée, telles que les nxvi mélanocytiques congénitaux (PAPP et al., Journal of Medical Genetics, 36, 610, 1999), les myélomes multiples (BEZIEAU et al., Hum. Mutat., 18, 281, 2001), et les tumeurs de la thyroïde (ESAPA et al., Cinical Endocrinology, 50, 529, 1999).
Ledit peptide est utilisable notamment dans le cadre de compositions mufti-épitopiques, et en particulier de polypeptides chimériques, comme mentionné ci-dessus. Un polynucléotide codant pour un tel polypeptide chimérique, ainsi qu'un vecteur d'acide 2 5 nucléique contenant ledit polynucléotide peuvent également être utilisés comme mentionné
ci-dessus.
Ledit peptide ou ledit polynucléotide peuvent aussi être utilisés respectivement pour charger ou transfecter ira vitro des cellules présentatrices de l'antigène HLA-A*0101 ou HLA-B* 1501 professionnelles, afin d'induire la prolifération de CTLs anti-tumeurs.
3 0 Les cellules présentatrices de l'antigène, HLA-A*Ol O1 ou HLA-B* 1501 chargées ou transfectées de la sorte font également partie de l'objet de la présente invention.
Ledit peptide ras muté peut également être utilisé pour détecter in vitro des CTLs dirigés contre l'antigène s'as muté dont il est issu, dans un prélëvement biologique obtenu à partir d'un sujet HLA-A*0101 ou HLA-B*1501. Il peut également être utilisé pour réaliser le tri 3 5 spécifique de ces CTLs.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant les propriétés de peptides ras

9 mutés conformes à l'invention utilisables en immunothérapie, par la mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention.
EXEMPLE 1: MISE EN EVIDENCE D'EPITOPES ANTIGENIQUES

CLONES CTLS
Lors d'une étude précédente (BENLALAM et al., 2001), les inventeurs ont obtenu des clones de TILs CD8+ restreints à HLA-B35, et reconnaissant respectivement les antigènes Tyrosinase (TIL M171), Melan-A (TIL M171 and M28), et gp100 (TIL M171, M28 et M110).
Ils ont complété cette collection de clones par un clone reconnaissant MAGE-A6 (TIL-M171) et un clone reconnaissant NY-ESO-1 (TIL Ml 18).
La réponse de ces différents clones TIL vis-à-vis de cellules COS-7 co-transfectées avec l'antigène et l'allèle HLA-B35 pertinents est détectée par mesure de leur production de TNF.
Les cellules COS-7, cultivées dans du milieu DMEM (Sigma) contenant 10% de sérum de veau feetal, des antibiotiques et de la L-glutamine, ont été transfectées par fADNc codant pour l'un des allèles HLA-B*3501, HLA-B*3503, HLA-B*3508, seul ou en association avec un ADNc codant pour l'un des antigènes MAGE-A3, MAGE-A6, tyrosinase, Melan-A/MART-1, gp-100, et NY-ESOI/LAGE-2. La transfection a été effectuée selon le 2 0 protocole décrit par DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125-42, 1997). 16,5 103 cellules COS-7 ont été transfectées avec 100 ng de plasmide pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), contenant fADNc de l'allèle HLA-B*35 concerné, et, pour la co-transfection, 100 ng de plasmide contenant fADNc codant pour l'antigène choisi.
Ces cellules COS-7 ont étê utilisées 48h après transfection pour stimuler les différents clones TILs (2x103 à 104). Les surnageants de culture ont été prélevés 6 heures plus tard et leur concentration en TNF a été déterminée par mesure de la cytotoxicité de ces surnageants de culture pour le clone 13 WEHI 164, comme décrit par DE PLAEN et al.
( 1997, précité).
Les résultats sont illustrés par la Figure 1.
3 0 En ordonnée, la concentration de TNF en pg/ml En abscisse les différentes populations de TIL
O: Sécrétion de TNF par les clones TIL en présence des cellules COS-7 transfectées uniquement par un ADNc codant pour une molécule HLA-B35.
/: Sécrétion de TNF par les clones TILs en présence des cellules COS-7 co-transfectées 3 5 avec un ADNc codant pour une molécule HLA-B35 et un ADNc codant pour un MAA.
Deux clones (M171.958 and M28.IOB), reconnaissent un complexe Melan-A/B*3501, un clone (M28.9B) reconnaît un complexe gp100/B*3501, un clone (M171.100B) reconnaît un complexe tyrosinase/B*3501, un clone (M171.8C) reconnaît un épitoge MAGE-A3 et MAGE-A6 dans le contexte B*3501 et un clone (M118.45) reconnaît un épitoge NY-ESO-1 dans les contextes B*3501 et B*3503.
EXEMPLE 2 : IDENTIFICATION DES EPITOPES ANTIGENIQUES PRÉSENTES
5 DANS LE CONTEXTE HLA-B35.
Pour identifier les régions codant pour les épitoges reconnus par les clones TILs, les inventeurs ont construit une série de fragments des ADNc des différents MAAs.
Les fragments d'ADNc Melan-A/MART-1 et NY-ESO-1 ont été obtenus par digestion à
l'exonucléase III : les plasmides comprenant l'ADNc codant pour Melan-A/MART-1 ou

10 NY-ESO-1 ont été ouverts par XbaI et ApaI, ou SpHI et NotI respectivment.
Les fragments obtenus ont ensuite été digérés par l'exonucléase III à l'aide du système Erasea-base (Promega, Madison, WI).
Un fragment de restriction de gp-100 (1156-1986) contenant les nucléotides situés entre le site KpnI 1156 pb en aval du codon d'initiation, et la fin de la séquence codante, a été
généré par digestion enzymatique par KpnI.
Les fragments d'ADNc correspondant aux fragments des antigènes tyrosinase et gp100 ont été obtenus par PCR à partir des plasmides contenant la séquence compléte codant pour chacun de ces deux antigènes.
L'expression de ces différents fragments par les cellules COS-7 s'effectue comme dans 2 0 l'exemple 1. Les réponses des différents clones TILs vis-à-vis de ces cellules COS-7 co transfectées avec les fragments d'antigène et falléle HLA-B35 pertinents sont mesurées comme dans l'exemple 1.
Les résultats sont illustrés dans la figure 2 Les positions des rëgions des ADNc codant pour les épitoges potentiels sont indiquées en 2 5 paires de bases.
D: Fragment reconnu par des clones CTLs spécifiques (sécrétion de TNF
significative).
~: Fragment non reconnu par des clones CTLs spécifiques (sécrétion de TNF non-significative).
Il apparaît que les différentes populations TILs reconnaissent des épitoges qui sont codés 30 respectivement par le fragment d'ADNc Melan-A s'étendant des nucléotides 95 à 119 (acides aminés 32 à 39), le fragment d'ADNc gp100 1200 à 1601 (acides aminés 400 à
533), le fragment d'ADNc tyrosinase 937 à 975 (acides aminés 313 à 325) et le fragment d'ADNc NY-ESO-1 259 à 339 (acides aminés 87 à 113).
EXEMPLE 3 : IDENTIFICATION DES PEPTIDES ANTIGENIQUES PRÉSENTES
3 5 DANS LE CONTEXTE HLA-B35.
Les peptides de type sauvage et modifié dont les séquences sont indiquées dans le Tableau I ci-dessous ont été obtenus auprès de EPYTOP (Nîmes, France). La pureté (>
70%) est

11 contrôlée par chromatographie liquide à haut rendement en phase inverse (HPLC). Les peptides sont lyophilisés, puis dissous dans du DMSO à 10 mg/ml et stockés à -80°C.
La réponse des différents clones TIL a été évaluée, par un test de relargage de TNF, après 6 heures de co-culture avec des cellules EBV exprimant une molécule HLA-B*3501 chargée avec 10~,M du peptide d'intérêt. Les résultats sont réunis dans le tableau I.
Tableau I
Position des peptides Squence TNF p /ml Melan-A

22-33 TTAEEAAGIGIL (SEQ ID NO 2 : 21) 23-35 TAEEAAGIGILTV (SEQ ID 107 NO : 6) 26-37 EAAGIGILTVIL (SEQ ID NO 125 : 7) 26-35 EAAGIGILTV (SEQ ID NO 182 : 8) 27-35 AAGIGILTV (SEQ ID NO : 4 22) 26-34 EAAGIGILT SEQ ID NO : 13 gp100 470-479 QVPLDCVLYR (SEQ ID NO 430 : 24) 471-479 VPLDCVLYR (SEQ ID NO : 170 3) 471-480 VPLDCVLYRY (SEQ ID NO 380 : 13) 472-480 PLDCVLYRY SEQ ID NO : 2,8 Tyrosinase 309-322 TPRLPSSADVEFCL (SEQ ID 308 NO : 14) 309-321 TPRLPSSADVEFC (SEQ ID 214 NO : 25) 309-320 TPRLPSSADVEF (SEQ ID NO 605 : 4) 309-319 TPRLPSSADVE (SEQ ID NO 89 : 26) 310-322 PRLPSSADVEFCL (SEQ ID 27 NO : 27) 309-318 TPRLPSSADV (SEQ ID NO 0,2 : 28) 312-320 LPSSADVEF (SEQ ID NO : 7,4 29) 312-321 LPSSADVEFC SEQ ID NO : 9,7 168-176 EVDPIGHLY SEQ ID NO : 265 168-176 EVDPIGHVY SEQ ID NO : 43 92-104 LAMPFATPMEAEL (SEQ ID 345 NO : 15) 92-103 LAMPFATPMEAE (SEQ ID NO 219 : 16) 94-104 MPFATPMEAEL (SEQ ID NO 264 : 17) 94-103 MPFATPMEAE (SEQ ID NO 292 : 18) 94-102 MPFATPMEA (SEQ ID NO : 258 5) 92-100 LAMPFATPM (SEQ ID NO : 87 31 ) 96-104 FATPMEAEL SEQ ID NO : 0 D'autre part, l'antigénicité des peptides a été testée en évaluant la capacité
des clones TILs à lyser des cellules BM36.1 (KELLY et al., 1992, Nature, 355, 641-4), qui sont déficientes en transporteur TAP, et qui expriment naturellement HLA-B*3501 et HLA-A*0101.
Les cellules BM36.1 sont marquées pendant lh à 37°C avec 100 Ci de SICr (Na251Cr04, GRIS, Gif sur-Yvette, France). Les cellules sont ensuite pulsées pendant 20 minutes avec les différents peptides synthétiques. 103 cellules BM36.1 ainsi traitées sont incubées avec 104 cellules T du clone (rapport EfFecteur :Cible de 10 :l) pendant 4 heures. Les surnageants de culture sont récupérés et la quantité de SICr libéré est évalué à l'aide d'un compteur de plaque 13 (EG&G Wallac, Evry, France). Pour chaque clone TIL, un contrôle négatif est effectué avec un peptide non-pertinent.

12 La quantité de peptide nécessaire pour obtenir 50% de la lyse maximale (EC50) a été
déterminée. D'autre part, l'affinité et la stabilité des peptides pour le HLA-B35 ont été
mesurées comme décrit par TOURDOT et al., Eur. J. Zinmunol., 30 :3411-3421, 2000).
Pour mesurer l'affinité des peptides, les cellules BM36.1 sont incubées pendant 18h avec une gamme de concentrations de chaque peptide. Les cellules BM36.1 sont parallèlement incubées avec une gamme d'un peptide de référence, se fixant au HLA-B35 (peptide 37F, TAKAMIYA et al., Int. Immunol., 6 : 255-261, 1994 ; SCH~NBACH et al., J.
Immunol., 154 : 5951-5958, 1995). La quantité relative de peptide fixée est ensuite estimée à chaque concentration, pour chacun des peptides, par la mesure de stabilisation du HLA-B35 à la surface cellulaire. Cette mesure est effectuée en cytométrie de flux à l'aide d'un anticorps anti HLA-B/C (qui ne reconnaît dans le cas des cellules BM36.1 que le HLA-B*3501, ces cellules n'exprimant spontanément aucune molécule HLA-C). On calcule ensuite le % de liaison au B*35 pour chaque concentration, en fixant le 100% de liaison pour 100 p,M de chaque peptide. L'affinité relative (RA) est ensuite déterminée de la façon suivante RA = [concentration de peptide] pour 20% de liaison/ [concentration du peptide 37F] pour 20% de liaison.
Pour mesurer la stabilité des peptides, les cellules BM36.1 sont incubées 18h avec 100 ~M
de chacun des peptides. Elles sont ensuite incubées en présence de BFA (10 ~g/ml) pendant une heure afm de bloquer le transport de molécules HLA nouvellement 2 0 synthétisées à la surface cellulaire. Les cellules BM36.1 sont lavées en PBS et reprises dans du milieu de culture contenant 5% SVF et 0.5 ~g/ml de BFA, ce qui constitue le temps 0. Des cellules sont ensuite prélevées, après 30 minutes, lh, 2h, 4h et 6h d'incubation. La quantité relative de peptide fixée est ensuite estimée à
chaque temps, pour chacun des peptides, par la mesure de stabilisation du HLA-B35 à la surface cellulaire.
Cette mesure est effectuëe en cytométrie de flux à l'aide d'un anticorps anti HLA-B/C. Le temps indiqué dans le tableau II correspond au temps de 1/2 vie du peptide sur le HLA-B*35.
Les résultats sont illustrés par la Figure 3, et le Tableau II ci après.

13 Tableau II
Position des S uence EC 50 R A Stabilit e tides Melan-A

26-35 EAAGIGILTV (; SEQ ID NO 0,5 nM 5,9 1h30 : 8) 26-35 EAAGIGILTY (1; SEO ID NO 0,01 0,75 >6h : 9) nM

26-34 EAAGIGILY (~; SEQ ID NO 10 nM 1,32 >6h : 10) 26-35 EPAGIGILTY (0; SEQ ID NO 0,05 0,66 >6h : 11) nM

26-34 EPAGIGILY (*; SEQ ID NO 100 nM 0,4 >6h : 33) 26-35 EPAGIGILTV (O; SEQ ID NO 0,8 nM 5,1 1h30 : 12 gp100 471-480 VPLDCVLYRY (~; SEQ ID NO 0,02 2,6 >6h : 13) nM

471-479 VPLDCVLYR (O; SEO ID NO 2 nM 20 <30 : 3) min 470-479 QVPLDCVLYR(; SEQ ID NO : 20 M -24) Tyrosinase 309-322 TPRLPSSADVEFCL (O; SEQ ID 2 nM >20 >6h NO : 14) 309-321 TPRLPSSADVEFC (; SEQ ID 12 nM 16,7 <30 NO : 25) min 309-320 TPRLPSSADVEF ~; SEQ ID NO 0,2 nM 1,3 >6h : 4) 312-320 LPSSADVEF *; SEQ ID NO : - 1,25 6h 168-176 EVDPIGHLY (O; SEQ ID NO 0,45 2,3 >6h : 19) pM

168-176 EVDPIGHVY (~; SEQ ID NO 4,2 nM 1,1 6h : 2) 92-104 LAMPFATPMEAEL (0; SEQ ID 0,1 nM 0,58 >6h NO : 15) 92-103 LAMPFATPMEAE (1; SEQ ID 5 nM 0,75 >6h NO : 16) 94-104 MPFATPMEAEL (; SEQ ID NO 0,05 1,32 >6h : 17) nM

94-103 MPFATPMEAE (O; SEQ ID NO 1 nM 0,66 >6h : 18) 94-102 MPFATPMEA (;SEO ID NO : 1 pM 0,4 >6h 5) 92-100 LAMPFATPM (D;SEQ ID NO : 100 nM 5,1 1h30 31) Légende de la Figure 3 : En ordonnée, le pourcentage de lyse cellulaire obtenue. En abscisse la concentration en peptide (en nM).
Les résultats des Tableaux I et II et de la Figure 3 montrent que:
* Trois peptides Melan-A chevauchants sont reconnus par le clone M28.1 OB. Le peptide le plus efficacement reconnu est le décapeptide 26-35 (EAAGIGILTV,SEQ ID NO :
8,). Ce peptide Melan-A 26-35 correspond probablement au peptide naturellement présenté, dans le contexte B*3501, par les cellules de mélanome et reconnu par les TIL du patient M28. Il est connu que ce même peptide Melan-A 26-35 est présenté par des molécules HLA, mais uniquement dans le contexte HLA-A*0201 (KAWAKAMI et al., 1994, J Exp. Med, 180, 347-52 ; VALMORI et al., 1998, J ImrnufZOl, 160, 1750-8). Une présentation croisée d'un même épitoge par différents isotypes de molécules HLA de classe I est relativement peu commune.
* Le clone spécifique de gp100 (M28.9B) reconnaît, dans le contexte HLA-B~3501, trois peptides chevauchants (deux décamères et un nonamère) localisés entre les acides aminés 470 et 480. Cependant, des concentrations importantes du peptide QVPLDCVLYR
(SEQ ID NO : 24) sont nécessaires pour induire une réponse du clone T
spécifique (EC50 à 20 ~,M). Les résultats de mesure d'affinité et de stabilité pour ce peptide montrent qu'il

14 n'est pas capable de se fixer au HLA B*35. La faible réponse obtenue par le clone peut s'expliquer par une contamination de ce peptide (préparé à 70% de pureté) avec d'autres peptides reconnus par ce clone T.
Plusieurs épitopes dérivés de gp100 présentés dans les contextes HLA-A ou C
sont connus (CASTELLI et al., 1999, J Immuhol, 162, 1739-48 ; I~AWAKAMI et al., 1998; TSAI
et al., 1997, J Immur~ol, 1 S~, 1796-802). En revanche, on ne connaissait pas jusqu'à présent d'épitopes de gp100 présentés dans le contexte HLA-B.
* Le clone spécifique de la tyrosinase (M171.100B) reconnaît efficacement trois peptides chevauchants : le 14-mer 309-322, le 13-mer 309-321, et le 12-mer 309-320. Le 12-mer est le peptide reconnu le plus efficacement, avec 50% de la lyse maximale obtenue à 0,2 nM, contre 2 nM et 12 nM pour le 14-mer et le 13-mer respectivement (figure 3). La délétion de la phénylalanine à l'extrémité C-terminale du 12-mer réduit fortement la reconnaissance par les CTLs. Le peptide 312-320, dont il a été montré qu'il est reconnu par un clone CTL
dans le contexte HLA-B*3501 (MOREL et al., 1999, Int J Cafzcer, 83, 755-9), n'est pas reconnu par le clone TIL M171.100B. En outre, si des exemples d'épitopes de cellules de type 11-mer (AARNOUDSE et al., 1999, Int. J Cancer, 82, 442-8; CHIARI et al., 1999, Cafzce~ Res, 59, 5785-92; KAWAKAMI et al., 2001, J Immu~col, 166, 2871-7) et 14-mer existe (PROBST-KEPPER et al., 2001,~JExp Med, 193, 1189-98), il s'agit d'épitoges de taille significativement supérieure à celle des épitoges habituellement présentés par les 2 0 cellules T.
* Le clone M171.8C spécifique de MAGE-A3/A6 reconnaît l'épitoge EVDPIGHLY
MAGE-A3/B*3501 précédemment décrit par SCHULTZ et al., (2001, précité). Comme ce clone TIL réagit également avec MAGE-A6, ceci indique que le peptide MAGE-A6 176 (EVDPIGHVY), qui diffère de l'épitoge MAGE-A3 par un seul acide aminé en position 8, constitue un autre épitoge de mélanome restreint au contexte HLA-B*3501.
* Le clone spécifique d'un épitoge NY-ESO-1 dans les contextes B*3501/B*3503 (M118.45) reconnaît efficacement cinq peptides chevauchants : le 13-mer 92-104, le 12-mer 92-103, le 11-mer 94-104, le décamère 94-103 et le nonamére 94-102. Le nonamère 94-102 est le peptide reconnu le plus efficacement, avec 50% de la lyse maximale obtenue 3 0 à 1 pM, contre 0.05 nM pour le 11-mer, 0,1 nM pour le 13- mer, 1 nM pour le décamère et 5 nM pour le 12-mer.
Il est connu que les nonamères 94-102 et 92-100 sont présentés dans les contextes HLA-B51 (JAGER et al, Cancer Immunity, 2002, volt, page 12) et HLA-Cw3 (GNJATIC et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 10917-22) respectivement. Cependant, leur présentation dans un contexte HLA-B35 n'avait pas été décrite auparavant.

EXEMPLE 4 : MODIFICATION DES PEPTIDES ANTIGENIQUES PRÉSENTES
DANS LE CONTEXTE HLA-B35.
Certains des peptides antigéniques identifiés ne présentent pas les résidus d'ancrage appropriés pour les molécules HLA-B*3501, i.e. P, A or V en position 2, Y, F, M, L or I
5 en position 9, pour les nonamères, et en position 10 pour les décamères (FALK et al., 1993,. Irnrnunogeraetics, 38, 161-2 [erratum dans Immunogenetics 1994;39(5):379J).
Pour essayer d'augmenter l'affinité de ce peptide pour le contexte HLA-B*3501 et la réponse des cellules T, les inventeurs ont introduit des résidus modifiés aux positions 2 et/ou 9, ou 10, des peptides Melan-A/MART1 26-34 et 26-35 respectivement.
10 Les résultats obtenus avec ces peptides modifiés sont présentés dans la figure 3 (Melan A).
On observe que les décapeptides modifiés EAAGIGILTY (SEQ ID NO : 9) et EPAGIGILTY (SEQ ID NO : 11 ) induisent une lyse maximale par le clone M28. l OB à des concentrations 10 à 50 fois inférieures au peptide sauvage (10 et SOpM au lieu de SOOpM).
En outre ces peptides présentent une stabilité améliorée (figure 3).

15 Ces modifications permettent donc d'augmenter l'affinité de liaison de ces peptides pour HLA-B*3501, mais aussi d'induire une réactivité supérieure du clone TIL
spécifique.
EXEMPLE 5 : PRÉSENTATION NATURELLE DES PEPTIDES ANTIGENIQUES
DANS LE CONTEXTE HLA-B35 PAR LES CELLULES DE MÉLANOME.
Pour tester l'intérêt, en tant que cibles pour l'immunothérapie, des différents peptides 2 0 antigéniques identifiés dans les exemples 3 et 4, les inventeurs ont analysés leur présentation par un panel de lignées de cellules de mélanome exprimant les différents antigènes, dont sont dérivés ces peptides, et les molécules HLA-B*3501. Pour augmenter l'expression à la surface des cellules des molécules HLA, les cellules de mélanome ont été
préincubées, pour certaines expérimentations, 48 heures dans du milieu contenant 500 2 5 U/ml de IFN-y (Tebu, Paris, France).
La réponse des différents clones TIL vis à vis de ces lignées est détectée par mesure de leur production de TNF comme dans l'exemple 1 (Rapport Effecteur :Cible de 1 :3).
Des contrôles négatifs ont été effectués en utilisant des lignées cellulaires de mélanome n'exprimant pas les molécules HLA (M113).
3 0 Les lignées de cellules de mélanome ont été établies à partir de fragments de tumeurs métastatiques ou de tumeurs ayant envahi les ganglions lymphatiques, et mises en culture dans du milieu RPMI 1640 (Sigma, St Loins, USA) contenant 10% de sérum de veau foetal (Gibco-BRL, Cergy-Pontoise, France), de la pénicilline (10 mg/ml) de la streptomycine (l0U/ml) (Sigma) et de la L-glutamine (2nM) (Sigma, St Louis, USA).
3 5 Les résultats sont illustrés par la figure 4 : en ordonnée, la concentration en TNF en pg/ml ;
en abscisse, les lignées de mélanome exprimant HLA-B35 et les différents antigènes (M47, M125, M131, M140, et M147), ou n'exprimant pas l'allèle HLA-B35 (M113).
~ : lignées cellulaires de mélanome pré-traitées avec SOOU/ml d'INF-y .

16 Q : lignées cellulaires de mélanome non pré-traitées avec l'INF-y.
Les clones spécifiques de Melan-A, de la tyrosinase et de MAGE-A3 reconnaissent les lignées cellulaires de mélanome M47, M131 et M147 indépendamment d'un traitement à
l'IFN-y. Toutefois, ces mêmes clones ne reconnaissent les lignées M125 et M140 qu'après l'induction de l'expression de HLA-B35 par un traitement à l' IFN-y.
Le clone spécifique de gp100 reconnaît une lignée de mélanome indépendamment d'un traitement à l'IFN-y (M147). Ce clone reconnaît également les lignées M125 et après un traitement par l'IFN-y (faiblement pour M125).
Le clone spécifique de NY-ESO-1 reconnaît l'une de ces lignées exprimant spontanément cet antigène (M47) et les deux autres lignées après traitement à l'IFN-y (M131 et M140, figure 4).
Dans le cas des lignées M125 et M140, l'absence de reconnaissance de ces lignées, par les différents clones TIL, est probablement liée à un nombre limité de complexes CMH/peptides présents à la surface de ces cellules. En effet, ces deux lignées cellulaires expriment la molécule HLA-B35 uniquement après traitement à l'IFN-y.
La reconnaissance spontanée des lignées de mélanome par les différents clones T CDB, montre que les épitopes identifiés sont naturellement présentés par ces tumeurs.
EXEMPLE 6 : ANTIGENICITE DU PEPTIDE RA.S MUTE 55-64Q6iR
Les peptides ras de type sauvage 55-64'~'~T (ILDTAGQEEY ; SEQ ID NO : 34), le 2 0 décamère muté 55-64Q61R, et le peptide MAGE-A3 (EVDPIGHLY ; SEQ ID NO :
20) ont été obtenus auprès de SYNT:EM (Nîmes, France). La pureté (>85%) est contrôlée par chromatographie liquide à haut rendement en phase inverse. Les peptides sont lyophilisés, puis dissous dans du DMSO à 10 mg/ml et stockés à-80°C.
L'antigénicité du peptide 55-64Q61R et celle de son analogue de type sauvage (55-64WT), 2 5 sont évaluées en testant la capacité de ces peptides à induire la croissance de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques par stimulation in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par des cellules dendritiques (DC) pulsées avec ces peptides.
Les lymphocytes CD8+ sont obtenus à partir des PBMC d'un donneur HLA-A*0101 par 3 0 tri négatif des cellules T CD4+ sur billes magnétiques (MILTENY BIOTECH, France).
Les cellules dendritiques sont préparées à partir de PBMC adhérentes mises en culture pendant 7 jours dans des plaques de culture à 6 puits contenant du milieu de culture RPMI
additionné de sérum de veau foetal 10%, 50 nglml de GM-CSF (SIGMA) et 50 ng/ml d'IL-4 (SIGMA). A J+7, la maturation des cellules dendritiques est induite pendant 2 jours dans 3 5 un milieu de culture RPMI additionné de sérum de veau foetal 10%, 10 ng/ml de TNF-a, (SIGMA) et 100 p,g/ml de Poly-IC (SIGMA). A J+9, les cellules dendritiques matures sont

17 incubées pendant 2 heures avec 5 ~.g/ml de peptide ras 55-64Q6iR ou de peptide ras 55-64wT ; elles sont ensuite lavées pour éliminer les peptides libres.
Les cellules dendritiques pulsées avec le peptide ras 55-64Q6iR ou le peptide ras 55-64~'T
sont utilisées pour stimuler les lymphocytes CD8+ (3,10' cellules). 3 stimulations sont effectuées à une semaine d'intervalle.
Chaque puits de culture est testé pour la présence de CTLs spécifiques du peptide.
Dans ce but, 7 jours après la derniére stimulation, des 2,106 cellules BM36.1 et exprimant HLA-A*0101 (KELLY et al.. Nature. 355. 641. 1992) préalablement incubées à
37°C
pendant 12 heures dans du RPMI additionné de 100 ~M de peptide N-ras 55-64WT
ou 55-64Q61R, 1 ~M de (32 microglobuline, et lavées dans du PBS, sont ajoutées dans chaque puits.
La réponse CTL spécifique à la stimulation par le peptide N-ras de type sauvage ou muté
est mesurée par dosage de l'interféron y (IFN-y ), comme décrit par LABARRIERE
et al.
(Int. J. Cancer, 78, 209, 1998).
Deux des cinq puits de culture stimulés avec le peptide ras présentent une prolifération de CTL spécifique du peptide (0,3 et 0,5% de cellules réactives par puits), alors qu'aucune prolifération n'est observée dans les puits stimulés avec le peptide 55-64wT.
EXEMPLE 7 : PROPRIETES D'UN CLONE DE LYMPHOCYTES T INDUIT PAR
LE PEPTIDE 55-64Q6iR
2 0 Des clones lymphocytaires ont été obtenus par dilution limite à partir des cellules du puits de culture contenant 0,5% de cellules T réactives.
La capacité des cellules T issues de l'un de ces clones à lyser des cellules BM36.1 présentant le peptide 55-64Q6iR ou le peptide 55-64WT est évaluée selon un dosage standard de libération du SICr (HERIN et al., Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987).
Des cellules BM36.1 marquées avec du SICr (Na251Cr04, ORIS, Gif sur-Yvette, France).
Les cellules sont ensuite pulsées pendant 1 heure à 37°C avec 10 ~,M de peptide 55-64~
ou de peptide 55-64Q61R, et lavées. 103 cellules BM36.1 ainsi traitées sont incubées avec 5,103 cellules T du clone à tester pendant 4 heures. Les surnageants de culture sont récupérés et le pourcentage de SICr libéré est évalué.
On observe une lyse importante des cellules BM36.1 pulsées avec le peptide ras muté 55-64Q61R. En revanche, la lyse des cellules BM36.1 pulsées avec le peptide ras de type sauvage est très faible.
La spécificité de ce clone vis-à-vis de cellules exprimant HLA-A*0101 et la protéine sauvage ou la protéine N-ras portant la mutation Q61R est évaluée sur des cellules COS
transfectées, ou sur des cellules de mélanome HLA-A*0101, exprimant ou non la mutation Q61 R.

18 Pour la transfection des cellules COS, un ADNc de 334 pb codant pour un fragment de la protéine N-ras de type sauvage est obtenu par amplification PCR, à partir d'ADNc complet de la protéine N-ras sauvage. Un ADNc codant pour un fragment de la protéine N-ras muté à la position 61 par substitution de la glutamine par une arginine est obtenu par mutagenèse dirigée.
L'ADNc sauvage ou muté est inséré dans le vecteur pcDNA3 et amplifié dans la souche bactérienne E. coli TOP 10 F' (INVITROGEN, référence C2020-03).
Un ADNc codant pour la molécule HLA-A*0101 est introduit dans le vecteur pcDNA
3.1 (INVITROGEN, référence CV790-20).
Des cellules COS-7 sont co-transfectées avec ces constructions comme décrit ci-après Des cellules COS-7, (BRICHARD et al., J. Exp. Med., 178, 489, 1993) sont cultivées dans le milieu DMEM (BIOWHITTAKER) contenant du sérum de veau foetal 10%, 100 U/ml de pénicilline, 100 ~,g/ml de streptomycine (SIGMA, St Louis, USA) et 2 mM de glutamine-L (SIGMA, St Louis, USA).
16,5.103 cellules COS sont co-transfectées avec 100 ng d'un mélange du vecteur pcDNA
3.1 exprimant HLA-A*0101 et d'un vecteur pcDNA3 exprimant la protéine N-ras sauvage ou mutée, par le procédé chloroquine-dextrane-DEAE (BRICHARD et al., J. Exp.
Med., 178, 489, 1993 ; SEED et al., PNAS, 84, 3365, 1987,). Les détails de cette méthode sont décrits par DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125, 1997).
2 0 La stimulation des cellules T est mesurée par dosage du TNF (DE PLAEN et al., Methods, 12, 125, 1997 ; LABARRIERE et al., Int. J. Cancer, 78, 209, 1998).
2,103 à 104 cellules du clone T testé sont ajoutées à 3,104 cellules COS, 48 heures après transfection, ou à 3,104 cellules de mélanome. Les surnageants de culture sont récupérés 6 heures plus tard et leur contenu en TNF est déterminé en mesurant leur effet cytotoxique 2 5 sur le clone 13 du fibrosarcome murin WEHI 164 (BRICHARD et al., J. Exp.
Med., 178, 489, 1993) par dosage colorimétrique MTT. Les résultats obtenus avec les cellules COS
transfectées sont présentés dans la Figure Sa : en abscisse, peptides ras de type sauvage ou mutés à la position 61 par substitution de la glutamine par une arginine ; en ordonnée, concentration de TNF en pg/ml.
3 0 Les résultats montrent que les cellules T du clone sont fortement stimulées par les cellules exprimant la protéine N-r°as Q61R, alors qu'on n'observe qu'une faible stimulation avec la protéine N-ras sauvage.
Les résultats obtenus avec les cellules de mélanome sont présentés dans la Figure Sb : en abscisse, lignées cellulaires de mélanome exprimant la mutation >~as Q61R (M6, M90, 35 MEL4) ou non (M36, M105, M106, M122, M138, MVl) ; en ordonnée, concentration de TNF en pg/ml

19 Ces résultats montrent que parmi les lignées de mélanome HLA-A*0101, seules celles exprimant la mutation Q61R (lignées M6, M90 et MEL4) stimulent une réponse des cellules T du clone.
EXEMPLE 8 : IDENTIFICATION D'UN PEPTIDE ANTIGENIQUE PRÉSENTE
DANS LE CONTEXTE HLA-A*0101.
Un clone T CD8+, issu d'une population de TIL de mélanome reconnaît un peptide non décrit issu de l'antigéne gp100, dans le contexte A*0101 (PLDCVLYRY, SEQ ID
NO : 20). L'antigénicité de ce peptide a été testée en évaluant la capacité du clone à lyser des cellules BM36.1 présentant le peptide d'intérêt dans le contexte HLA-A*0101. Les cellules BM36.1 sont marquées pendant lh à 37°C avec 100 Ci de SICr (Na251Cr04, ORIS, Gif sur-Yvette, France). Les cellules sont ensuite pulsées pendant 20 minutes avec les différents peptides synthétiques. 103 cellules BM36.1 ainsi traitées sont incubées avec 104 cellules T du clone (rapport Effecteur :Cible de 10 :1) pendant 4 heures. Les surnageants de culture sont récupérés et la quantité de SICr libéré est évalué à l'aide d'un compteur de plaque 13 (EG&G Wallac, Evry, France). Un contrôle négatif est effectué avec un peptide non-pertinent.
Les résultats sont présentés dans la figure 6 : en ordonnée le pourcentage de lyse cellulaire obtenue, en abscisse la concentration en peptide PLDCVLYRY (0), ou VPLDCVLYRY
(~). L'EC50 pour le peptide PLDCVLYRY est de 0,6 ~M, alors que l' EC50 pour le 2 0 peptide PLDCVLYRY est de 10 ~M.
La séquence de ce peptide est comprise dans la séquence du décamère reconnu dans le contexte B*3501, mais ce peptide n'est pas reconnu par le clone M28.9B. En revanche, le peptide VPLDCVLYRY (SEQ ID NO : 13) est également reconnu dans le contexte A*0101 par le clone M199.6.12 (Tableau I et Figure 6).
De plus, la reconnaissance spontanée par le clone M199.6.12, de lignées de mélanome partageant le HLA-A*0101 montre que cet épitope est présenté efficacement par ces tumeurs.

SÉQUENCE LISTTNG
<110> INSERM
UNIVERSITÉ DE NANTES
LINARD, Boris JOTEREAU, Francine BENLALAM, Houssem DIEZ, Elizabeth GUILLOUX, Yannick LABARRIERE, Nathalie GERVOIS, Nadine DERRE, Laurent <120> PEPTIDES UTILTSABLES EN IMMUNOTHÉRAPIE ANTITUMORALE
<130> MJPbv598/64 <160> 35 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial sequence <220>
<223> peptide modifié
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2). (2) <223> Xaa= A ou P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9) <223> Xaa= T ou Y
<400> 1 Glu Xaa Ala Gly Ile Gly Ile Leu Xaa <210> 2 <21l> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr <210> 3 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 3 Val Pro Leu Asp Cys Va1 Leu Tyr Arg <210> 4 <211> 12 <2l2> PRT
<213> Homo sapiens <400> 4 Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe <2l0> 5 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 5 Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala <210> 6 <21l> 13 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 6 Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Tle Gly Ile Leu Thr Val <210> 7 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile Leu <210> 8 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 8 Glu Ala Ala Gly Ile Gly I1e Leu Thr Val <210> 9 <2ll> 10 <212> PRT
<ê13> Artificial sequence <220>
<223> peptide modifié
<400> 9 Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Tyr <210> 10 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial sequence <220>
<223> peptide modifié
<400> 10 Glu Ala Ala Gly I1e Gly Ile Leu Tyr <210> 11 <21l> 10 <212> PRT
<213> Artificial sequence <220>
<223> peptide modifié
<400> ll Glu Pro Ala Gly Ile Gly Tle Leu Thr Tyr <210> 12 <211> 10 <212> PRT
<213> Artificial sequence <220>
<223> peptide modifië
<400> 12 Glu Pro Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val <210> 13 <211> 10 <2l2> PRT
<2l3> Homo sapiens <400> 13 Val Pro Leu Asp Cys Val Leu Tyr Arg Tyr <210> 14 <211> 14 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 14 Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe Cys Leu 1 5 l0 <2l0> 15 <211> 13 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 15 Leu A1a Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu 1 5 l0 <210> 16 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 16 Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met G1u Ala Glu <210> 17 <21l> 11 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 17 Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu <210> 18 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 18 Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu <210> 19 <211> 9 <212> PRT
<2l3> Homo sapiens <400> 19 Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr <210> 20 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 20 Pro Leu Asp Cys Val Leu Tyr Arg Tyr <210> 21 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 21 Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu <210> 22 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 22 Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val <210> 23 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 23 Glu Ala Ala Gly I1e Gly Ile Leu Thr <210> 24 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 24 Gln Val Pro Leu Asp Cys Val Leu Tyr Arg <210> 25 <211> 13 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 25 Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe Cys <210> 26 <211> 11 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 26 Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu <210> 27 <211> 13 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 27 Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe Cys Leu <210> 28 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 28 Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val <210> 29 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 29 Leu Pro Ser Ser A1a Asp Val Glu Phe <210> 30 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 30 Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val Glu Phe Cys <210> 31 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 31 Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met <210> 32 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> ~ 32 Phe Ala Thr Pro Met G1u A1a Glu Leu <210> 33 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial sequence <220>
<223> peptide modifié
<400> 33 Glu Pro Ala Gly Ile Gly Ile Leu Tyr <210> 34 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 34 Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr <210> 35 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 35 Ile Leu Asp Thr A1a Gly Arg Glu Glu Tyr

Claims (10)

REVENDICATIONS

1) Utilisation d'au moins un peptide immunogène représentant un épitope T
présenté par le CMH I, choisi parmi:
a) un peptide comprenant la séquence EX1AGIGILX2 (SEQ ID NO : 1) dans laquelle représente A ou P, et X2 représente T ou Y, capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène Melan-A;
b) un peptide comprenant la séquence EVDPIGHVY (SEQ ID NO : 2), capable d'induire une réponse T cytotoxique dirigée contre l'antigène MAGE-A6;
c) un peptide comprenant la séquence VPLDCVLYR (SEQ ID NO : 3), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène gp100;
d) un peptide comprenant la séquence TPRLPSSADVEF (SEQ ID NO : 4), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène tyrosinase;
e) un peptide comprenant la séquence MPFATPMEA (SEQ ID NO : 5), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène NY-ESO-1;
pour l'obtention d'un médicament destiné à l'immunothérapie anti-tumorale chez un patient HLA-B35.

2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit peptide est choisi parmi:
a) un peptide de séquence choisie parmi : TAEEAAGIGILTV (SEQ ID NO : 6), EAAGIGILTVIL (SEQ ID NO : 7), EAAGIGILTV (SEQ ID NO : 8), EAAGIGILTY
(SEQ ID NO : 9), EAAGIGILY (SEQ ID NO : 10), EPAGIGILTY (SEQ ID NO : 11), EPAGIGILTV (SEQ ID NO : 12) ;
b) un peptide de séquence EVDPIGHVY (SEQ ID NO : 2);
c) un peptide de séquence choisie parmi VPLDCVLYR (SEQ ID NO : 3) et VPLDCVLYRY(SEQ ID NO : 13);
d) un peptide de séquence choisie parmi TPRLPSSADVEFCL (SEQ ID NO : 15) et TPRLPSSADVEF (SEQ ID NO : 4);
e) un peptide de séquence choisie parmi : LAMPFATPMEAEL (SEQ ID NO : 16), LAMPFATPMEAE (SEQ ID NO : 17), MPFATPMEAEL (SEQ ID NO : 18), MPFATPMEAE (SEQ ID NO : 19) et MPFATPMEA (SEQ ID NO : 5).

3) Peptide immunogène représentant un épitope T présenté par le CMH I, choisi parmi:
- un peptide de séquence choisie parmi : EAAGIGILTY (SEQ ID NO : 9), EAAGIGILY
(SEQ ID NO : 10), EPAGIGILTY (SEQ ID NO : 11), EPAGIGILTV (SEQ ID NO : 12) ;
- un peptide de séquence choisie parmi : VPLDCVLYR (SEQ ID NO : 3), VPLDCVLYRY (SEQ ID NO : 13) et PVPLDCVLYRY (SEQ ID NO : 14);
- un peptide de séquence choisie parmi : TPRLPSSADVEFCL (SEQ ID NO : 15) et TPRLPSSADVEF (SEQ ID NO : 4).

4) Composition multi-épitopique comprenant au moins deux peptides de deux catégories différentes parmi les catégories a) b) c) d) ou e) telles que définies dans la revendication 1 ou 2.

5) Composition multiépitopique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide de chacune de ces catégories a) b) c) d) ou e) telles que définies dans la revendication 1 ou 2.

6) Composition multi-épitopique selon une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies de chacun desdits peptides.

7) Polynucléotide codant pour un polypeptide chimérique selon la revendication 6.

8) Cellule présentatrice de l'antigène exprimant un allèle HLA-B35 du CMH I, caractérisée en ce qu'elle est chargée par un peptide tel que défini dans une quelconque des revendications 1 ou 2.

9) Cellule présentatrice de l'antigène exprimant un allèle HLA-B35 du CMH I, caractérisée en ce qu'elle est transfectée par un polynucléotide selon la revendication 7.

10) Utilisation d'au moins un peptide tel que défini dans une quelconque des revendications 1 à 3, pour la détection in vitro de CTLs dirigés contre un ou plusieurs des antigènes Melan-A, MAGE-A6, gp100, tyrosinase, et NY-ESO-1, dans un prélèvement biologique obtenu à partir d'un sujet HLA-B35.