BRPI0617330A2 - antìgeno quimérico contendo polipeptìdeo do vìrus da hepatite c e fragmento fc para despertar uma resposta imunológica - Google Patents

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Abstract

ANTIGENO QUIMéRICO CONTENDO POLIPEPTìDEO DO VìRUS DA HEPATITE C E FRAGMENTO FC PARA DESPERTAR UMA RESPOSTA IMUNOLóGICA. São aqui revelados antígenos quiméricos que compreendem um antígeno do vírus da hepatite C (HCV) e umfragmento Fc de uma imunoglobulina para despertar uma resposta imunológica contra o referido antígeno. A resposta imunológica é intensificada por apresentação do sistema imunológico do hospedeiro a um domínio de resposta imunológica (antígeno do HCV de fragmentos da proteína central, do envelope ou não estrutural do HCV) e um domínio de ligação de alvo (um fragmento Fc). Por causa do domínio de ligação de alvo, as células apresentadoras de antígeno internalizam e processam os antígenos quiméricos para apresentação de antígeno, despertando, desse modo, uma resposta imunológica tanto humoral quanto celular.

Description

ANTIGENO QUIMERICO CONTENDO POLIPEPTIDEO DO VIRUS DAHEPATITE C E FRAGMENTO FC PARA DESPERTAR UMA RESPOSTA
IMUNOLÓGICACAMPO TÉCNICO
A presente invenção está relacionada aos antígenosquiméricos (por exemplo, proteínas de fusão) para odirecionamento e ativação de células apresentadoras deantigeno (APCs) para despertar respostas imunológicascelulares e humorais. Em particular, a invenção descrevecomposições é métodos que contêm ou utilizam um ou maisantígenos quiméricos que contêm um ou mais antígenos pré-selecionados do Vírus da Hepatite C (HCV), e um fragmentode imunoglobulina, em que o antigeno quimérico é capaz dese ligar e ativar APCs, especialmente células dendríticas,que processam e realizam a apresentação de antigeno paradespertar respostas imunológicas celulares e humorais.
FUNDAMENTOS
Mais de 170 milhões de pessoas em todo o mundo sãoportadoras crônicas do HCV [Delwaide e cols. (2000) Rev.Med. Llege 55: 337-340] . Não existem atualmente vacinasprofiláticas ou terapêuticas para o HCV. A via de infecçãoé através do sangue e de outros fluidos corporais, e maisde 7 0% dos pacientes se tornam portadores crônicos dovírus. A infecção persistente resulta em hepatite crônicaativa, que pode causar doença hepática progressiva [Alter ecols. (1999) N. Bngl. J. Med. 341: 556-562]. Atualmente, aúnica terapia para a infecção por hepatite C é interferon-I(IFN-I) e Ribavirina. No entanto, essa terapia é cara,possui efeitos colaterais significativos, e só é eficaz emaproximadamente 50% de um grupo selecionado de pacientes.Vacinas terapêuticas que aumentam as respostas imünológicasdo hospedeiro para eliminar a infecção crônica por HCVserão um avanço importante no tratamento dessa doença.
O sistema imünológico tem uma participação crucial noresultado final de uma infecção por HCV. A maioria dosindivíduos expostos ao HCV monta uma ampla e forte respostade células T CD4+ (reguladoras) e CD8+ (citotóxicas)especifica a múltiplos antígenos ao vírus. Esses indivíduosdesenvolvem apenas uma infecção autolimitada. No entanto,em alguns indivíduos expostos ao HCV, uma respostaimunológica fraca ou indetectável e pouco concentradaresulta em infecção crônica.
HCV é um membro da família flaviviridae de vírus deRNA. O genoma do HCV é uma molécula de RNA de fita simplesem sentido positivo de aproximadamente 9,5 Kb, que codificauma única poliproteína que é clivada em proteínasindividuais catalisada por proteases do hospedeiro e viraispara produzir três proteínas estruturais (central [core] ,El, E2) , proteína p7 e 6 proteínas não estruturais (NS2,NS 3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) [Hijikkata e cols. (1991)Proc. Natl. Acad.' Sei. USA 88: 5.547-5.551] . A proteína NS3é a serina protease viral envolvida no processamentoproteolítico das proteínas não estruturais [Bartenschlagere cols. (1993) J. Virol. 67: 3.835-3.844],
Ò mecanismo pelo qual o vírus escapa do maquinárioimünológico do hospedeiro ainda não está claraménteestabelecido [Shoukry e cols. (2004) Ann. Rev. Microbiol.58: 391-424]. Várias proteínas do HCV foram implicadas nomecanismo de evasão imunológica. Esses incluem: NS5A, quesupostamente induz a produção de IL-8, que inibe a respostaantiviral induzida por IFN [Polyak e cols. (2001) J. Virol.75: 6.095-6.106] e inibe a PKR proteína quinase celularinduzida por IFN-γ, inibindo, dessa forma, respostasimunológicas antivirais [Tan e cols. (2001) Virol. 284: 1-12]; Core e NS3, que supostamente inibem a diferenciação deDC [Dolganiuc e cols. (2003) J. Iwmunol. 170: 5.615-5.624];e Core e El [Sarobe e cols. (2002) J. Virol. 77: 10.862-10.871; e Grakoui e cols. (2003) Science 302: 659-662], quesupostamente modulam as respostas de células T pormodulação da maturação da DC; e, finalmente, a ausência decélulas T auxiliares (help) de memória [Shoji e cols.(1999) Virology 254: 315-323].
SUMÁRIO
A presente invenção pertence às composições e aosmétodos para o direcionamento e ativação de" APCs., uma dasprimeiras etapas na formação de uma resposta imunológica.As composições da presente invenção incluem a classeinédita de moléculas (daqui em diante.designadas "antígenosquiméricos") que incluem um domínio de resposta imunológica(IRD), por exemplo, uma proteína recombinante, ligado a umdomínio de ligação de alvo (TBD) , por exemplo, uma porçãode fragmento de anticorpo. Mais especificamente, osantígenos quiméricos são moléculas que acoplam antígenosvirais como, por exemplo, a proteína Core Hepatite C,proteínas do envelope, por exemplo, El e E2, ou proteínasnão estruturais, a um fragmento de imunoglobulina, porexemplo, um fragmento Fc de imunoglobulina G murídea. Emalgumas modalidades, o fragmento de anticorpo é umfragmento de anticorpo xenotípico.
As composições e os métodos da presente invenção sãoúteis pára o direcionamento e ativação de APCs. Ascomposições e os métodos da presente invenção são úteispara a indução de respostas imunológicas celulares e/ouhumorais do hospedeiro contra qualquer antígeno viralassociado ao HCV. A invenção inclui vacinas terapêuticaspara o tratamento de infecções crônicas pelo HCVf além devacinas profiláticas para a prevenção de infecções peloHCV.
Uma ou mais modalidades da presente invenção incluemum ou mais antígenos quiméricos adequados para a iniciaçãode uma resposta imunológica contra o HCV. Nessasmodalidades da invenção, antígenos selecionados do HCV sãoligados a fragmentos de anticorpos. Os antígenos quiméricosresultantes são capazes de direcionar e ativar APCs, porexemplo, células dendríticas.
A presente invenção também inclui métodos para aclonagem de construções de DNA que codificam proteínas defusão e que produzem proteínas de fusão em um sistema deexpressão heterólogos. Em modalidades preferidas dainvenção, os métodos de clonagem e produção introduzemmodificações pós-tradução únicas, incluindo, sem limitação,glicosilação (por exemplo, mahosilação) das proteínas defusão expressas.
A fim de fornecer uma apresentação eficiente dosantígenos, os inventores desenvolveram uma proteína defusão inédita de antígeno viral-fragmento Fc de anticorpomonoclonal murídeo. Essa molécula, em função do fragmentoFc, é reconhecida com alta eficiência através de receptoresespecíficos por APCs (por exemplo, células dendríticas); aproteína de fusão é processada, e epitopos peptídicos doantigeno viral são apresentados, como complexos com aClasse I do Principal Complexo de Histocompatibilidade(MHC) . Esse processamento e essa apresentação de antigenoresultam na supra-regulação da resposta por Iinfócitos Tcitotóxicos, produzindo a eliminação da população decélulas infectadas pelo vírus. Além disso, em função daapresentação de antigeno por moléculas do MHC da Classe IIe da ativação de células T auxiliares, pode ser induzidauma resposta humoral contra o antigeno viral que irá ajudara evitar e/ou eliminar a infecção viral.
A natureza quimérica da molécula ajuda a direcionar oantigeno às células de apresentação de antigeno adequadas(por exemplo, células dendríticas) , tornando-a umaabordagem única na terapia de doenças infecciosas crônicasao se dirigirem especificamente aos receptores de APC. Issoé útil para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas parao tratamento de infecções crônicas por Hepatite C.
A administração dessas proteínas quiméricas de fusãopode despertar uma resposta imunológica ampla pelo hospedeiro, incluindo respostas tanto celulares quantohumorais. Dessa forma, elas podem ser usadas como vacinasterapêuticas para o tratamento de indivíduos que sãoimunologicamente tolerantes a uma infecção por HCV.
Mais especificamente, ã invenção apresenta um antigenoquimérico para despertar uma resposta imunológica, oantigeno quimérico contendo um domínio de respostaimunológica e um domínio de ligação de alvo, o domínio deresposta imunológica contendo um antigeno de hepatite C(HCV) e o domínio de ligação de alvo contendo um fragmentode anticorpo. 0 fragmento de anticorpo pode ser umfragmento de anticorpo xenotlpico. Antígeno quimérico podedespertar uma resposta imunológica humoral, uma respostaimunolõgica celular, ou tanto uma resposta imunológicahumoral quanto uma resposta imunolõgica celular. Alémdisso, o antígeno quimérico pode despertar uma respostaimunolõgica Thl, uma resposta imunológica Th2 ou umaresposta imunológica tanto Thl quanto Th2. A respostaimunolõgica pode ser uma resposta imunológica in vivo ouuma resposta imunológica ex vivo. O domínio de respostaimunolõgica pode conter mais de uma proteína; ele pode, porexemplo, conter uma ou mais porções imunogênicas de uma oumais proteínas que incluem, por exemplo, uma proteínacentral do HCV (1-191) , uma proteína central do HCV (1-177), uma proteína p7 do HCV, uma proteína El do HCV, umaproteína E2 do HCV, uma proteína E1-E2 do HCV, uma proteínaNS3 do HCV, uma proteína NS4B do HCV ou uma proteína NS5Ado HCV. O domínio de ligação de alvo pode ser capaz de seligar a uma célula apresentadora de antígeno (APC). Ofragmento de anticorpo pode ser um fragmento Fc. O antígenoquimérico pode ainda compreender um ou mais de um tag6xHis, um sítio de clivagem de protease e um vinculadorpara ligação do domínio de resposta imunológica e dodomínio de ligação de alvo. O vinculador pode serselecionado de zíperes de leucina, biotina ligada à avidinae uma ligação peptídica covalente. Além disso, o antígenoquimérico pode ser glicosilado, por exemplo, glicosiladocom manose. O fragmento de anticorpo pode incluir umfragmento de cadeia pesada de imunoglobulina, e o fragmentode cadeia pesada de imunoglobulina pode conter uma regiãode dobradiça. Além disso, o fragmento" de cadeia pesada deimunoglobulina pode. conter todo ou uma parte de umfragmento de anticorpo selecionado do grupo que. consiste naChI, na região de dobradiça, no domínio GH2 e no domínioCH3.
Outra modalidade da invenção consiste em. um método deliberação de um antígeno a uma célula apresentadora deantígeno, o método compreendendo a administração à célulaapresentadora de antígeno de qualquer um dos antígenosquiméricos aqui apresentados. A célula de apresentação deantígeno pode ser uma célula dendrítica.
A invenção também fornece um método de ativação de umacélula apresentadora de antígeno; o método pode envolver ocontato de uma célula apresentadora de antígeno comqualquer um dos antígehos quiméricos aqui descritos. 0contato pode ocorrer ex vivo ou in vivo. Ele pode ocorrer,por exemplo, em um ser humano. O método pode incluir aadministração a um indivíduo de uma composição quecompreende qualquer um dos antígenos quiméricos dainvenção, a célula apresentadora de antígeno estando noindivíduo. o contato pode resultar em uma respostaimunológica humoral, uma resposta imunológica celular outanto uma resposta imunológica humoral quanto uma respostaimunológica celular. A resposta imunológica celular podeser uma ou mais de uma resposta Thl, uma resposta Th2 e umaresposta de CTL. 0 indivíduo pode ter, ou ter probabilidadede ter, uma condição passível de tratamento imunológico. Acondição passível de tratamento imunológico pode ser umainfecção aguda (por exemplo, uma infecção viral aguda) ouela pode ser uma infecção crônica (por exemplo, umainfecção viral crônica). A infecção crônica pode ser umainfecção viral crônica por hepatite C. A condição passívelde tratamento imunológico pode ser uma infecção viral porhepatite C, e o domínio de resposta imunológica pode conteruma ou mais porções antigênicas de uma ou mais proteínasselecionadas do grupo que consiste em uma proteína centraldo HCV (1-191) , uma proteína central do HCV (1-177) , umaproteína El do HCV, uma proteína E2 do HCV, uma proteínaE1-E2 do HCV, uma proteína P7 do HCV, uma proteína NS3 doHCV, uma proteína NS4B do HCV e uma proteína NS5A do HCV.
Com o uso do método, o indivíduo pode ser vacinado contrauma. infecção viral, por exemplo, vacinado profilaticamentecontra uma infecção viral ou vacinado terapeuticamentecontra uma infecção viral existente.
Outro aspecto da invenção consiste em um método deprodução de um antígeno quimérico. 0 método pode envolver:
(a) o fornecimento de um microorganismo ou de uma célula, omicroorganismo ou a célula contendo um polinucleotídeo quecodifica um antígeno quimérico; e (b) o cultivo domicroorganismo ou da célula sob condições nas quais oantígeno quimérico é expresso. 0 microorganismo ou a célulapode ser um microorganismo ou uma célula eucariótica. Acélula pode ser uma célula de levedura, uma célula deplanta ou uma célula de inseto. Além disso, o antígenoquimérico pode ser modificado pós-tradução para compreenderglicosilaçãó; por exemplo, ele pode ser modificado pós-tradução para compreender uma glicosilação de manose.
Ainda outra modalidade da invenção consiste em umpolinucleotídeo que codifica um antígeno quimérico, opolinucleotídeo contendo uma primeira porção dopolinucleotídeo que codifica um domínio de respostaimunológica e uma segunda porção do polinucleotídeo quecodifica um domínio de ligação de alvo, o domínio deligação de alvo contendo um fragmento de anticorpo. 0fragmento de anticorpo pode ser um fragmento de anticorpoxenotípico. 0 polinucleotídeo pode conter, por exemplo, umaseqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consistenas seqüências de nucleotídeos estabelecidas nos IDS. DESEQ. Nos: 39 e 41-51. Além disso, o polinucleotídeo podecodificar um antígeno quimérico que é pelo menos 90%idêntico a uma seqüência de aminoácidos inteira selecionadado grupo que consiste nas seqüências de aminoácidosestabelecidas nos IDS. DE SEQ. Nos: 40 e 52-62. 0polinucleotídeo pode hibridizar seletivamente sob condiçõesrigorosas para um polinucleotídeo que possui uma seqüênciade nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nasseqüências de nucleotídeos estabelecidas nos IDS. DE SEQ.Nos: 39 e 41-51. A invenção também fornece um vetorcontendo qualquer um dos polinucleotídeos aqui revelados,por exemplo, um vetor no qual o polinucleotídeo está ligadooperacionalmente a um elemento regulador da transcrição(TRE) . Além disso, a invenção engloba um microorganismo ouuma célula que contém qualquer um dos polinucleotídeos aquirevelados.
Outra modalidade da invenção consiste em um produtomanufaturado que pode conter qualquer um dos antígenosquiméricos aqui apresentados e instruções para aadministração do antígeno quimérico a um indivíduo que delenecessita.
Ainda outro aspecto da invenção consiste em umacomposição farmacêutica que contém qualquer um dosantígenos quiméricos aqui apresentados e um excipientefarmaceuticamente aceitável.
Além disso, a invenção fornece outro método deprodução de um antigeno quimérico. 0 método pode envolver:(a) o fornecimento de um microorganismo ou de uma célula, omicroorganismo ou a célula contendo um polinucleotídeo quecodifica um domínio de ligação de alvo-moléculavinculadora, o domínio de ligação de alvo-moléculavinculadora contendo um domínio de ligação de alvo ligado auma molécula vinculadora; (b) o cultivo do microorganismoou a célula sob condições pelas quais o domínio de ligaçãode alvo-molécula vinculadora é expresso; e (c) o contato dodomínio de ligação de alvo-molécula vinculadora e umdomínio de resposta imunológica sob condições que permitama ligação do vinculador ao domínio de resposta imunológica,a ligação resultando em um antigeno quimérico. Osmicroorganismos ou as células, os polinucleotídeos, osdomínios de ligação de alvo, as moléculas vinculadoras e osdomínios de resposta imunológica podem ser qualquer umdaqueles aqui revelados.
A menos que definido de forma diferente, todos ostermos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmosignificado subentendido por aqueles habilitados na técnicaà qual esta invenção pertence. No caso de conflito, opresente documento, incluindo definições, predominará.Serão descritos abaixo métodos e materiais preferidos,embora métodos e materiais similares ou equivalentesàqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática outeste da presente invenção. Todas as publicações, pedidosde patente, patentes e outras referências aqui mencionadassão incorporadas por referência em sua totalidade. Osmateriais, métodos e exemplos aqui apresentados são apenasilustrativos, e não visam a limitar a invenção.
Outras características e vantagens da invenção, porexemplo, antígenos quiméricos para o tratamento ouprevenção de uma condição imunológica tratável, ficarãoevidentes a partir da descrição seguinte, a partir dosdesenhos e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Fig. 1 é uma representação esquemática de uma formadimerizada da vacina Chimigen3. Ela contêm duassubunidades, cada uma composta por um domínio de respostaimunológica (IRD) e um domínio de ligação de alvo (TBD) .
As Figs. 2A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 9) do ORF (quadro de leituraaberta) no plasmídeo pFastBacHTa-TBD e da seqüência deaminoãcidos 20 (ID. DE SEQ. N° : 10) codificada pelo ORF,respectivamente.
As Figs. 3A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DÊ SEQ. N°: 39) do ORF no plasmídeopFastBacHTa-NS5A-TBD e da seqüência de aminoácidos (ID. DESEQ. N°: 40) codificada pelo ÕRF, respectivamente. Há umamutação espontânea conservada (TTC (Phe) para TTT (Phe))nas posições sublinhadas e em negrito na Fig. 3A e Fig. 3B.
Na seqüência de nucleotídeos:nucleotídeos 1-3: códon de iniciaçãonucleotídeos 13-30: tag de epitopo 6Xhisnucleotídeos 91-1431: NS5A de HCVnucleotídeos 1.432-1.4 61: peptídeo vinculadornucleotídeos 1.462-2.157: TBDnucleotídeos 2.158-2.187: peptídeo terminal
nucleotídeos 2.188-2.190: códon de parada
nucleotídeos 1.639-1.641: mutação conservada TTC-TTT
TBD
Na seqüência de aminoácidos:
aminoácidos 5-10: tag de epitopo 6xHis
aminoácidos 31-477: NS5A de HCV
aminoácidos 478-4 87: peptídeo vinculador
aminoácidos 488-719: TBD
aminoácidos 720-729: peptídeo terminal
As Figs. 4A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 41) do ORF no plasmídeopFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD e da seqüência de aminoácidos(ID. DE SEQ. N°: 52) codificada pelo ORF, respectivamente.
Há uma mutação artificial (GAT (Asp) para TAT (Tyr)) e umamutação espontânea conservada (TTC (Phe) para TTT (Phe) )nas posições sublinhadas e em negrito na Fig. 4A e na Fig. 4B.
Na seqüência de nucleotídeos:
nucleotídeos 1-3: códon de iniciação
nucleotídeos 1-72: peptídeo sinalizador de gp64
nucleotídeos 97-114: tag de epitopo 6Xhis
nucleotídeos 175-1515: NS5A de HCV
nucleotídèos 1.516-1.545: peptídeo vinculador
nucleotídeos 1.546-2.241: TBD
nucleotídeos 2.242-2.271: peptídeo terminal
nucleotídeos 2.272-2.274: códon de parada
nucleotídeos 61-63: mutação artificial do peptídeo
sinalizador GAT para TAT
nucleotídeo 1.725: mutação conservada TTC para TTT TBDNa seqüência de aminoácidos:
aminoácidos 1-24: sinal de secreção de gp64aminoácidos 33-38: tag de epitopo 6xHisaminoácidos 59-505: NS5A de HCVaminoácidos 506-515: peptídeo vinculadoraminoácidos 516-747: TBDaminoácidos 748-757: peptídeo terminalaminoácido 21: mutação artificial do peptídeosinalizador D para Y
As Figs. 5A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 42) do ORF no plasmídeopPSC12-NS5A-TBD e da seqüência de aminoácidos (ID. DE SEQ.N°: 53) codificada pelo ORF, respectivamente.
As Figs. 6A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N0 : 43) do ORF no plasmídeopFastBacHTa-gp64-NS3-TBD e da seqüência de aminoácidos (ID.DE SEQ. N°: 54) codificada pelo 0RF, respectivamente. Háduas mutações mostradas pelos códons sublinhados na Fig. 6Ae pelos aminoácidos na Fig. 6B. De cima para baixo para aFig. 6A, e do terminal N para o terminal C para a Fig.6B,as mutações são: uma mutação projetada CGG (Arg) para GCG(Ala); e uma mutação espontânea CCA (Pro) para GGA (Gly).
As Figs. 7A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 44) do ORF no plasmídeopFastBacHTa NS3mut-TBD e a seqüência de aminoácidos (ID. DESEQ. N°: 55) codificada pelo ORF, respectivamente. Há duasmutações mostradas pelos códons sublinhados e em negrito naFig. 7A e pelos aminoácidos na Fig. 7B. De cima para baixopara Fig. 7A, e do terminal N para o terminal C para aFig.7B, as mutações são: uma mutação espontânea conservadaAGG (Arg) para CGG (Arg) ; e uma mutação projetada CGG (Arg)para GCG (Ala).
Na seqüência de nucleotídeos:nucleotídeos 1-3: códon de iniciaçãonucleotídeos 13-30: tag de epitopo 6Xhisnucleotídeos 91-1965: NS3mut de HCVnucleotídeos 1.966-1.995: peptídeo vinculadornucleotídeos 1.996-2.691: TBDnucleotídeos 2.692-2.721: peptídeo terminalnucleotídeos 2.722-2.724: códon de paradanucleotídeo 1.462-1.464: mutação espontânea NS3mut AGGpara CGG
nucleotídeos 1.474-1.476: mutação projetada NS3mut CGGpara GCG
Na seqüência de aminoácidos:aminoácidos 5-10: tag de epitopo 6xHisaminoácidos 31-655: NS3mut de HCVaminoácidos 656-665: peptídeo vinculadoraminoácidos 666-897: TBDaminoácidos 898-907: peptídeo terminalaminoácido 488: mutação espontânea NS3mut R para Raminoàcido 4 92: mutação projetada NS3mut R para AAs Figs. 8A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 45) do ORF no plasmídeopFastBiacHTa-gp64-NS3mut-TBD e da seqüência de aminoácidos(ID. DE SEQ. N°: 56) codificada pelo ORF, respectivamente.Há três mutações mostradas pelos códons realçados na Fig.8A e pelos aminoácidos na Fig. 8B. De cima para baixo paraFig. 8A, e do terminal N para o terminal C para a Fig. 8B,as mutações são: uma mutação artificial (GAT (Asp) para TAT(Tyr) ) ; uma mutação espontânea conservada AGG (Arg) paraCGG (Arg) ; e uma mutação projetada CGG (Arg) para GCG(Ala).
Na seqüência de nucleotídeos:
nucleotídeos 1-3: códon de iniciação
nucleotídeos 1-72: peptídeo sinalizador de gp64
nucleotídeos 97-114: tag de epitopo 6Xhis
nucleotídeos 175-2.049: NS3mut de HCV
nucleotídeos 2.050-2.079: peptídeo vinculador
nucleotídeos 2.080-2.775: TBD
nucleotídeos 2.776-2.805: peptídeo terminal
nucleotídeos 2.806-2.808: códon de parada
nucleotídeos 61-63: mutação artificial do peptídeosinalizador GAT para TAT
nucleotídeos 1.546-1.548: mutação conservada NS3mutAGG para CGG
nucleotídeos 1.558-1.560: mutação projetada NS3mutCGG-GCG
Na seqüência de aminoácidos:
aminoácidos 1-24: sinal de secreção de gp64
aminoácidos 33-38: tag de epitopo 6xHis
aminoácidos 59-683: NS3mut de HCV
aminoácidos 684-693: peptídeo vinculador
aminoácidos 694-925: TBD
aminoácidos 926-935: peptídeo terminal
aminoácido 21: mutação artificial do peptídeosinalizador D para Y
aminoácido 520: mutação projetada NS3mut R para A
As Figs 9A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 46) do ORF no plasmídeopFastBacHTa-gp64 NS3-NS4B-NS5A-TBD e da seqüência deaminoácidos . (-ID. DE SEQ. N°: 57) codificada pelo ORFirespectivamente. Há quatro mutações mostradas pelos cõdonssublinhados e em negrito na Fig. 9A e pelos aminoácidos naFig. 9B. De cima para baixo para Fig. 9A, e do terminal Npara o terminal C para a Fig. 9B, as mutações são: umamutação artificial (GAT (Asp) para TAT (Tyr)); uma mutaçãoprojetada TCG (Ser) para GCG (Ala); uma mutação projetadaCGG (Arg) para GCG (Ala) ; e uma mutação espontânea CCA(Pro) para GGA (Gly).
As Figs. IOA e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 47) do ORF no plasmídeoFastBacHTa-gp64-NS3-NS5A-TBD e da seqüência de aminoácidos(ID. DE SEQ. N°: 58) codificada pelo 0RF, respectivamente. Há quatro mutações mostradas pelos códons sublinhados naFig. IOA e pelos aminoácidos na Fig. I OB. De cima parabaixo para Fig. 10A, e do terminal N para o terminal C paraa Fig. IOB, as mutações são: uma mutação artificial (GAT(Asp) para TAT (Tyr) ) ; uma mutação projetada TCG (Ser) paraGCG (Ala); uma mutação projetada CGG (Arg) para GCG (Ala);e uma mutação espontânea CCA (Pro) para GGA (Gly) .Na seqüência de nucleotídeos:nucleotídeos 1-3: códon de iniciaçãonucleotídeos 1-72: peptídeo sinalizador de gp64nucleotídeos 97-114: tagr de epitopo 6Xhisnucleotídeos 175-2.049: NS3mut de HCVnucleotídeos 2.050-2.058: peptídeo vinculadornucleotídeos 2.059-3.402: NS5A de HCVnucleotídeos 3.403-3.426: peptídeo vinculadornucleotídeos 3.427-4.122: TBDnucleotídeos 4.123-4.152: peptídeo terminalnucleotídeos 4.153-4.155: códon de paradanucleotídeos 61-63: mutação artificial do peptídeosinalizador GAT para TAT
nucleotídeo 589: mutação projetada NS3mut TCG para GCGnucleotídeos 1.558-1.559: mutação projetada NS3mut CGGpara GCG
nucleotídeos 2.050-2.052: mutação espontânea NS3mutCCA para GGA
Na seqüência de aminoácidos:aminoácidos 1-24: sinal de secreção de gp64aminoácidos 33-38: tag de epitopo 6xHisaminoácidos 59-683: NS3 de HCVaminoácidos 684-686: peptídeo vinculadoraminoácidos 687-1.134: NS5A de HCVaminoácidos 1.135-1.374: TBDaminoácidos 1.375-1.384: peptídeo terminalaminoácido 21: mutação artificial do peptídeosinalizador D para Yaminoácido 197: mutação projetada NS3mut S para Aaminoácido 520: mutação projetada NS3mut R para Aaminoácido 684: mutação espontânea NS3mut P para GAs Figs. IlA e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 48) do ORF no plasmídeopFastBacHTa HCV core (1-177) -TBD e da seqüência deaminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 59) codificada pelo ORF7respectivamente.
As Figs. 12A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 49) do ORF no plasmídeopFas tBacHTa -EI - TBD e da seqüência de aminoácidos (ID. DESEQ. N°: 60) codificada pelo ORF, respectivamente.
As Figs. 13A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N° : 50) do ORF no plasmídeopFastBacHTa E2-TBD e da seqüência de aminoácidos (ID. DESEQ. N°: 61) codificada pelo ORF, respectivamente.
As Figs. 14A e B são representações da seqüência denucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 51) do ORF no plasmídeopFastBacHTa-El-E2-TBD e da seqüência de aminoácidos (ID. DESEQ. N°: 62) codificada pelo ORF, respectivamente.
A Fig. 15 é uma série de perfis de citometria de fluxode f luorescência (FFC) que mostram a ligação, em trêsconcentrações diferentes, da Proteína NS5A Chimigen3 às DCsimaturas.
A Fig. 16 é um par de gráficos de barras que mostram ainibição da ligação da Proteína NS5A Chimigen3 às DCsimaturas por anticorpos específicos para CD32 e CD206.
A Fig. 17 é uma série de gráficos de barras quemostram a expressão dos marcadores da superfície celularindicados por DC madura produzidos como descrito nosExemplos. Os dados foram obtidos por FFC e são apresentadoscomo "% percentual de células positivas" (gráficossuperiores) è "intensidade média de fluorescência" ("MFI")(gráficos inferiores).
As Figs. 18A - B são três conjuntos de gráficos debarras que mostram a proporção de células T que expressamCD69 (Fig. 18A) , células T CD8+ que expressam CD69 (Fig.18B) e células T CD4+ que expressam CD69 (Fig. 18C) emculturas do 4 ° dia de várias concentrações de células T eProteína NS5A Chimigen3 ou DC carregada com toxóidetetânico. Os dados foram obtidos por FFC. 5AC1 e 5AC2: duaspreparações diferentes de Proteína NS5A Chimigen3.
As Figs. 19A-C são três. conjuntos de gráficos debarras que mostram a proporção de células T CFSElo (Fig.19A) , células T CD8+ CFSElo (Fig. 19B) e células . T CD4 +CFSElo (Fig. 19C) em culturas do 4 o dia de váriasconcentrações de células . T e Proteína NS5A Chimigen3 ou DCcarregada com toxóide tetânico. Os dados foram obtidos porFFC. 5ACl e 5AC2: duas preparações diferentes de ProteínaNS5A Chimigen3.
As Figs. 2OA-C são três conjuntos de gráficos debarras que mostram a proporção de células T que expressamCD69 (Fig. 20A) , células T CD8+ que expressam CD69 (Fig.2 OB) e células T CD4+ que expressam CD69 (Fig. 20C) emculturas do 7° dia de várias concentrações de células T ePiOteina NS5A Chimigen3 ou DC carregada com toxôidetetânico ou fitohemaglutinina (PHA; na Fig. 20A) . Os dadosforam obtidos por FFC. 5AC1 e 5AC2: duas preparaçõesdiferentes de Proteína NS5A Chimigen3.
As Figs. 21 A-C são três conjuntos de gráficos debarras que mostram a proporção de células T CFSElo (Fig.21A) , células T CD8+ CFSElo (Fig. 21B) e células T CD4 +CFSElo (Fig. 21C) em culturas do 7° dia de váriasconcentrações de células T e Proteína NS5A Chimigen3 ou DCcarregada com toxóide tetânico ou PHA (na Fig. 2IA) . Osdados foram obtidos por FFC. 5AC1 e 5AC2: duas preparaçõesdiferentes de Proteína NS5Á Chimigen3.
A Fig. 22 é uma série de gráficos de barras quemostram a proporção de células T que são blastos emculturas de 7 dias de várias concentrações de células T éProteína NS 5 A Chimigen3 ou DC carregada com toxóidetetânico ou PHA. Os dados foram obtidos por FFC. 5AC1 e5AC2: duas preparações diferentes de Proteína NS5AChimigen3.
A Fig. 23 é uma série de gráficos de barras quemostram a expressão por DC madura, carregada de antígeno,dos marcadores da superfície celular indicados. Os dadosforam obtidos por FFC.
A Fig. 24 é um par de gráficos de barras que mostram aproporção de células T que são blastos após três estímuloscom DC madura carregada de antígeno, feitos como descritonos Exemplos. Os dados foram obtidos por (FFC). 5AC:Proteína NS5A Chimigen3.
A Fig. 25 é uma série de gráficos de barras quemostram a proporção de células T contendo interferon-Kintracelular (IFN-K) ^ após três estímulos com DC maduracarregada de antígeno, feitos como descrito nos Exemplos.Os dados foram obtidos por FFC. 5AC: Proteína NS 5 AChimigen3; PMA: ácido forbòl mirístico; solução salinatamponadá com fosfato de Dulbecco (DPBS).
A Fig. 26 é um par de gráficos de barras que mostram aproporção <àe células T CD8+ contendo IFN-K intracelularapós três estímulos com DC madura carregada de antígeno,feitos como descrito nos Exemplos. Os dados foram obtidospor FFC. SAC: Proteína NS5A Chimigen3.
A Fig. 27 ê um par de gráficos de barras que mostram aproporção de células T CD4+ contendo IFN-K intracelularapós três estímulos com DC madura carregada de antígeno,feitos como descrito nos Exemplos. Os dados foram obtidospor FFC. 5AC: Proteína NS5A Chimigen3 .
A Fig. 28 é um par de gráficos de barras que mostram aproporção de células T contendo fator de necrose tumoral-Iintracelular (TNF-I) após três estímulos com DC maduracarregada de antígeno, feitos como descrito nos Exemplos.Os dados foram obtidos por FFC. 5AC: Proteína NS 5 AChimigen3; PMA: ácido forbol mirístico; DPBS.
A Fig. 29 é um par de gráficos de barras que mostram aproporção de células T CD8+ (gráfico à esquerda) e célulasT CD4+ (gráfico à direita) contendo TNF-I intracelular apóstrês estímulos com DC madura carregada de antígeno, feitoscomo descrito nos Exemplos. Os dados foram obtidos por FFC.5AC: Proteína NS5A Chimigen3.
A Fig. 30 é um par de gráficos de barras que mostram aproporção de células T CD8+ que expressam as proteínasgranulares GrB (gráfico à esquerda) e Pfn (gráfico àdireita) após três estímulos com DC madura carregada deantígeno, feitos como descrito nos Exemplos. Os dados foramobtidos por FFC. 5AC: Proteína NS5A Chimigen3.
A Fig. 31 é um par de gráficos de barras que mostram onúmero total de linfócitos (células gateá RI) e a proporçãode células blásticas após três estímulos com DC maduracarregada dè antígeno, feitos como descrito nos Exemplos.As células foram analisadas 6 dias após o último estímulo.Os dados foram obtidos por FFC. 5AC: Proteína NS5AChimigen3.
A Fig. 32 é um par de gráficos que mostram asproporções relativas de células T CD8+ que expressam CD69(gráfico à esquerda) e células T CD4+ que expressam CD69(gráfico à direita) após três estímulos com DC maduracarregada de antígeno, feitos como descrito nos Exemplos.As células foram analisadas 6 dias após o último estímulo.Os dados foram obtidos por FFC; 5AC: Proteína NS5AChimigen3.
A Fig. 33 é um par de gráficos de barras que mostramas proporções relativas de células T CD8+ (gráfico àesquerda) e células T CD4+ (gráfico à direita) que possuemreceptores de célula T com especificidade antigênica (TCR)que se ligaram a um tetrâmero peptídeo de EBV/HLA-A2(controle positivo) ou um tetrâmero de controle (tetrâmeronegativo) após três estímulos com DC madura carregada deantígeno, feitos como descrito nos Exemplos. As células detrês poços de cultura individuais (que correspondem às trêsbarras nos grupos de teste e de controle) foram analisadas6 dias após o último estímulo. Os dados foram obtidos por FFC.
A Fig. 34 é ura par de gráficos de barras que mostramas proporções relativas de células T CD8+ que possuem TCRque se ligaram ao pentâmero peptídeo NS5A/HLA-A2 após trêsestímulos (com o uso de diferentes números de células T eDC) com DC madura carregada de antígeno, feitos comodescrito nos Exemplos. As células de três poços de culturaindividuais (que correspondem às três barras nos grupos déteste e de controle) foram analisadas 6 dias após o últimoestímulo. Os dados foram obtidos por FFC. SAC: ProteínaNS5A Chimigen3 .
A Fig. 35 é uma série de perfis de FFC que mostram aligação, em duas concentrações diferentes, da Proteína NS3Chimigen3 às DCs imaturas.
A Fig. 3 6 é um par de gráficos de barras que mostram ainibição da ligação da Proteína NS3 Chimigen3 às DCsimaturas por anticorpos específicos para CD32 e CD206.A Fig. 37 é uma série de gráficos de barras quemostram a proporção de células T CD8+ que expressam CD69(gráficos à esquerda) . e células T CD4+ que expressam CD69(gráficos ã direita) em culturas do 4o dia (gráficossuperiores) e do ^7°, dia contendo Proteína NS3 Chimigen3 ouDC carregada com toxóide.tetânico. Os dados foram obtidospor FFC. 3C: Proteína NS3 Chimigen3. . ·
A Fig. 38 é uma série de gráficos de barras quemostram a proporção de células T CD8+ CFSElo (gráficos àesquerda) e células T CD4+ CFSElo (gráficos à direita) emculturas do 4 o dia (gráficos superiores) e do Io diacontendo Proteína NS3 Chimigen3 ou DC carregada com toxóidetetânico. Os dados foram obtidos por FFC. 3C: Proteína NS3Chimigen3.
A Fig. 39 é um par de gráficos de barras que mostram aproporção de células T que são blastos após três estímuloscom DC madura carregada de antígeno, feitos como descritopara a Proteína NS5A Chimigen3 nos Exemplos. Os estímulosforam realizados com o uso de duas concentrações diferentesde células T e duas concentrações diferentes de DCs. Osdados foram obtidos por FC. 3C: Proteína NS3 Chimigen3.
A Fig. 40 é uma série de gráficos de barras quemostram a proporção de células T contendo IFN-Kintracelular após três estímulos com DC madura carregada deantígeno, feitos como descrito nos Exemplos. Os dados foramobtidos por FFC. 3C: Proteína NS3 Chimigen3.
A Fig. 41 é um par dè gráficos de barras que mostram aproporção de células T CD8+ (gráfico à esquerda) e célulasT CD4+ (gráfico à direita) contendo IFN-K intracelular apóstrês estímulos com DC madura carregada de antígeno, feitoscomo descrito nos Exemplos. Os dados foram obtidos por FFC.3C: Proteína NS3 Chimigen3.
A Fig. 42 é um par de gráficos de barras que mostram aproporção de células T CD8+ (gráfico à esquerda) e célulasT CD4+ (gráfico à direita) contendo TNF-I intracelular apóstrês estímulos com DC madura carregada de antígeno, feitoscomo descrito nos Exemplos. Os dados foram obtidos por FFC.3C: Proteína NS3 Chimigen3.
A Fig. 43 é um par de gráficos de barras que mostram aproporção de células T CD8+ que expressam as proteínasgranulares GrB (gráfico à esquerda) e Pfn (gráfico àdireita) após três estímulos com DC madura carregada deantígeno, feitos como descrito nos Exemplos. Os dados foramobtidos por FFC. 3C: Proteína NS3 Chimigen3.
A Fig. 44 é um par de gráficos que mostram asproporções relativas de células T CD8+ que expressam CD69(gráfico à esquerda) e células T CD4+ que expressam CD69(gráfico à direita) após três estímulos com DC maduracarregada de antígeno, feitos como descrito nos Exemplos.
As células foram analisadas 6 dias após o último estímulo.
Os dados foram obtidos por FFC. 3C: Proteína NS3 Chimigen3.
A Fig. 4 5 é um par de gráficos de barras que mostram ónúmero total de linfócitos (células gated RI) (gráfico àesquerda) e a proporção de células blásticas (gráfico àdireita) após três estímulos com DC madura carregada deantígeno, feitos como descrito nos Exemplos. As célulasforam analisadas 6 dias após o último estímulo. Os dadosforam obtidos por FFC. 3C, ÁS60-1: Proteína NS3 Chimigen3.
A Fig. 46 é um par de gráficos de barras que mostramas proporções relativas de células T CD8+ que possuem TCRque se ligaram ao pentâmero peptídeo NS3/HLA-A2 após trêsestímulos (com o uso de diferentes números de células T eDC) com DC madura carregada, de antígeno, feitos comodescrito nos Exemplos. As células de três poços de cultura individuais (que correspondem às três barras tanto nosgrupos de teste quanto no grupo de controle) foramanalisadas 5 dias após o último estímulo. Os dados foramobtidos por FFC. 3C: Proteína NS3 Chimigen3.
A Fig. 4 7 é uma série de perfis de citometria de fluxo de f luorescência (FFC) que mostram a ligação, em trêsconcentrações diferentes, da Proteína Core HCV Chimigen3 àsDCs imaturas.
As Fig. 48 é um par de gráficos de barras que mostrama iriibição da ligação da Proteína Core HCV Chimigen3 às DCs imaturas por anticorpos específicos para CD32 e CD206,albumina sérica bovina manosiladã (mBSÀ) e fragmentos deIgG murídea.
A Fig. 49 é um par de gráficos de barras que mostram aproporção de células T CD8+ (gráfico à esquerda) e células T CD4+ (gráfico à direita) contendo IFN-K intracelular apóstrês estímulos com DC madura carregada de antígeno, feitoscomo descrito nos Exemplos. Os dados foram obtidos por FFC.HCV Core-TBD: Proteína Core HCV Chimigen3.
A Fig. 50 é um par de dot plots bidimensionais de FFCque mostrám a proporção de células T CD8+ que possuem TCRque se ligaram ao tetrâmero peptídeo Core de HCV/HLA-B7após três estímulos com DC carregada com a Proteína CoreHCV Chimigen3 (HCV Core - TBD) (dot plòt à direita) ou TBDisoladamente (TBD) (dot piot à esquerda).
DESCRIÇÃO DETALHADAA. Visão geral
São aqui reveladas composições e métodos para odesenvolvimento de respostas imunológicas contra antigenos.Em modalidades específicas, os compostos e métodos despertam respostas imunológicas contra antigenos que, deoutro modo, são reconhecidos pelo hospedeiro como antigenosnself". A resposta imunológica é intensificada pelaapresentação ao sistema imunológico do hospedeiro de umantígeno quimérico que compreende um domínio de resposta imunológica e um domínio de ligação de alvo, em que odomínio de ligação de alvo compreende um fragmento deanticorpo. Em função da presença do domínio de ligação dealvo, APCs internalizam, processam e apresentam osantigenos quiméricos, despertando respostas imunológicas tanto humorais quanto celulares.
HCV é um membro da família flaviviridae que podeinfectar seres humanos, causando hepatite aguda e crônica,e pode resultar em carcinoma hepatocelular [Hoofnagle(2002) Hepatology 36: S21-S29]. 0 genoma do HCV é uma molécula de RNA de fita simples de 9,6 Kb uncapped depolaridade positiva, e a replicação ocorre através dé umintermediário de fita negativa [Lindenbach e Rice (2005)Nature 436: 933-938]. 0 genoma do HCV codifica um únicòquadro de leitura aberta que codifica uma poliproteína, aqual é processada para gerar a proteína central (core) oudo capsídeo (C) , duas glicoproteínas do envelope (El & E2) ,uma pequena proteína hidrofóbica (p7), e seis proteínas nãoestruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A & NS5B) . 0processamento da poliproteína nas proteínas individuais é catalisado por proteases do hospedeiro e virais [Lohmann ecols. (1996) J. Hepatol. 24: 11-19, Penin e cols. (2004). J.Hepatol. .24: 11-19] .
Quando . um hospedeiro saudável (humano ou animal)encontra um antígeno ,estranho (como, por exemplo, proteínasderivadas de uma bactéria, vírus e/ou parasita), ohospedeiro normalmente inicia uma resposta imunolõgica. Aresposta imunológica adaptiva pode ser humoral, celular, oude ambos . os tipos [Whitton e cols. (2004) Adv. Virus Res.63: 181-238] . A resposta celular é caracterizada pelaseleção e expansão de células T auxiliares e linfócitos T(CTLs) específicos capazes de eliminar diretamente ascélulas que contêm o antígeno. No caso dá resposta humoral,são produzidos anticorpos por células B e esses sãosecretadós no sangue e/ou Iinfa em resposta a um estímuloantigênico. Os anticorpos neutralizam o antígeno (porexemplo, um vírus) por ligação específica aos epitopos emsua superfície, marcando-o para destruição por célulasfaigocíticas e/ou mecanismos mediados por complemento paraIise das células infectadas [Carroll (2005) Nature Immunol.5: 981-986]. Células auxiliares (em grande parte células TCD4) fornecem a atividade auxiliar necessária tanto àsrepostas por CTL (em grande parte células T CD8) quanto àsrepostas de anticorpos mediadas por célula B.
Em indivíduos com infecções virais crônicas, o sistemaimunológico não responde ao patógeno invasor para produziruma resposta imunolõgica adaptiva para depurar a infecçãoe, dessa forma, o hospedeiro se torna tolerante aopatógeno. Embora o mecanismo que o HCV utiliza para escaparda vigilância imune não seja completamente compreendido,foram sugeridas várias possibilidades. Essas incluem obloqueio da indução mediada por IRF3 de IFN do tipo I porseqüências de NS3-4A, E2 e NS5A, o bloqueio de PKR(proteína quinase ativada por RNA de fita dupla) , bem comopor interferência de proteínas do HCV com a função decélulas NK (natural killer) [Rehermann e cols. (2005)Nature Rev. Immunol. 5: 215-229]. Resultados recentestambém mostram o papel crucial de células T no controle eerradicação da infecção por HCV [Bowen e cols. (2005)Nature 436: 946-952; Wieland e cols. (2005) J. Virol. 79:9.369-9.380]. Na infecção aguda por HCV, embora sejamdetectados anticorpos específicos contra o vírus 7-8semanas após a infecção pelo HCV [Pawlotsky (1999) J.Hepatol. 31 (supl.):71-79], o papel dos anticorpos não estáclaro, já que foi demonstrado que,a infecção pelo HCV podeser resolvida na ausência de anticorpos anti-HCV emchimpanzés [Cooper e cols. (1999) Immunity 10: 439-449] esem soroconversão ém seres humanos [Post e cols. (2 004). J.Infect. Dis.. 189: 1. 846-1.855]. Além disso, evidênciasrecentes sugerem que a incapacidade dos indivíduos emproduzir níveis detectáveis de respostas de célula T CD4+ eCD8+ contra HCV resultava em infecções crônicas [Cooper ecols. (1999) supra; Thimme e cols. (2001) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 99: 15.661-15.668; Thimme e cols. (2002) J. Exp.Med. 194: 1.395-1.406; Shoukry e cols. (2003) J. Exp. Med.197: 1.645-1.655]. Sugeriu-se que ocorreria uma interaçãode funções imunes como, por exemplo, alterações detranscrição na resposta de IFN do tipo I e na respostaimunológica contra RNA de fita dupla produzido durante areplicação viral, mas não foram observadas evidênciasdiretas desse efeito na depuração da infecção viral[Rehermann e cols. (2005) supra] . Foi observado que, empacientes que resolvem uma infecção por HCV, o sistemaimunológico produz fortes respostas de células T CD4+ eCD8+ específicas para múltiplos epitopos [Rehermann e cols.
(2005) supra], enquanto, em pacientes com infecção crônicapelo HCV, a resposta de células T era tardia, transitóriaou pouco concentrada [Thimme e cols. (2001) supra;Diepolder e cols. (1995) Lancet 36: 1.006-1.007; Lechner ecols. (2000) J. Exp. Med. 191: 1.499-1.522].
A ausência de respostas de células T vigorosas contraantlgenos do HCV, o que resulta em infecções crônicas,também pode ser causada por uma ausência de apresentaçãoadequada do antigeno viral apropriado ao sistemaimunológico do hospedeiro. O sucesso na eliminação do víruspode ser conseqüência da forma pela qual o antigeno êprocessado e apresentado pelas APCs e pelo envolvimento decélulas T auxiliares reguladoras e linfócitos T citotóxicos(CTLs).
O principal participante no processo de apresentaçãode antigeno é a célula dendritica (DC), que captura eprocessa os antígenos. Além disso, DCs expressam moléculasco-estimuladoras de linfócitos e migram para os órgãoslinfóides onde secretam citocinas para iniciar respostasimunológicas. DCs também controlam a proliferação delinfócitos B e T, que são os mediadores da imunidade
[Steinman e cols. (1999) Hum. Immunol. 60: 562-567]. Ageração de uma resposta de CTL é crucial na eliminação dascélulas infectadas por vírus e, dessa forma, na resoluçãoda infecção.
Os antígenos encontrados são processadosdiferentemente pelas APCs, dependendo da localização doantígeno [Steinman e cols. (1999) supra] . Os antígenosexógenos são processados dentro dos endossomos das APCs, eos fragmentos peptídicos gerados são apresentados nasuperfície da célula era complexo com moléculas do principalcomplexo de histocompatibilidade (MHC) da classe II. Aapresentação desse complexo às células T CD4+ causa suaativação. Como resultado, citocinas secretadas por célulasT auxiliares fornecem os fatores solúveis necessários paraa ativação de células B para a produção de anticorposcontra o antígeno exógeno (resposta humoral).
Inversamente, os. antígenos intracelulares sãoprocessados no proteossoma, e os fragmentos peptídicosresultantes são apresentados como complexos com moléculasdo MHC da classe I na superfície das APCs. Após a ligaçãodesse complexo ao receptor de célula T (TCR), ocorre aapresentação de antígeno às células T CD8+, o que resultaem uma resposta imunológica de CTL. CTLs podem eliminar ovírus por morte das células infectadas e pela produção defatores como, por exemplo, a citocina interferon-γ (IFN-γ) ,que age para inibir a replicação viral.
À medida que o vírus se replica ativamente emindivíduos com infecções virais crônicas, são produzidosantígenos viráis dentro das células hospedeiras, e osantígenos secretados estão presentes na circulação. Apesarda presença desses antígenos, há uma ausência de umaresposta imunológica eficaz contra o vírus. Uma respostaimunológica eficaz envolveria a produção de CTLs, quepoderiam reconhecer uma ampla gama de epitopos virais comalta afinidade. Dessa forma, uma vacina terapêuticaadequada contendo antígenos virais deve ser internalizada eprocessada no compartimento celular adequado a fim de queos peptideos virais sejam apresentados no sulco dasmoléculas do MHC da classe I. O reconhecimento dos epitopos virais no contexto da apresentação de classe I permitiria aativação, produção e diferenciação de células T CD8+ emCTLs funcionais que sejam capazes de montar uma respostaeficaz contra a infecção viral.
Dessa forma, uma vacina terapêutica contendo antígenos virais seria eficaz, caso fosse processada através da viaproteossômica e apresentada através da classe I do MHC[Larsson e cols. (2001) Trends Immunol. 22: 141-148]. Issopoderia ser obtido tanto pela produção do antigeno dentroda célula hospedeira, quanto. pela liberação ao compartimento celular adequado, de tal forma que o antigenoseja processado e apresentado de uma forma que desperte aresposta celular desejada. Foram documentadas váriasabordagens na literatura para a liberação intracelular deantígenos, incluindo vetores virais [Lorenz e cols. (2001) Hum. Gene Ther. 10: 1.095-1.103], o uso de célulastransfectadas com DNA [Donnelly e cols. (1997) Annu. Rev.Immunol. 15: 617-648], e a expressão do antigeno através devetores de DNA injetados [Lai e cols. (1998) Crit. Rev.Immunol. 18: 44 9-484].
Em função de sua funcionalidade como APC, demonstrou-se que DCs derivadas de monócitos possuem grande potencialcomo moduladores imunológicos que estimulam respostasprimárias de células T [Banchereau e cols. (1998) Nature392: 245-252]. Essa propriedade exclusiva das DCs paracapturar, processar e apresentar eficazmente antígenos fazcom que elas sejam ferramentas muito importantes para odesenvolvimento de vacinas terapêuticas [Laupeze e cols.
(1999) Huni. Immunol. 60: 591-597]. O direcionamento doantígeno às DCs é uma etapa fundamental, e a presença devários receptores nas DCs específicos para a região Fc deanticorpos monoclonais (mAb) foi explorada para essafinalidade [Regnault e cols. (1999) J. Exp. Med. 189: 371-380]. Exemplos dessa abordagem incluem mAb-B43.13 paracâncer de ovário [Berlyn e cols. (2001) Clin. Iwmunol. 101:
276-283] , mAb anti-PSA e complexos antígeno-anticorpo anti-HBV [Wen e cols. (1999) Int. Rev. Immunol.. 18: 251-258].Demonstrou-se que a imunoterapia do câncer com o uso de DCscarregadas com antígenos associados a tumores produzrespostas imúnológicas com especificidade tumoral e
atividade antitumoral [Campton e cols. (2000) J. Invest.Dermatol. 115: 57-61/ Fong e cols. (2000) Annu. Rev.Irrimuno1. 18: 245-273] . Foram obtidos resultados promissoresem testes clínicos in vivo com o uso de tumor DCs pulsadascom antígeno [Tarte e cols. (1999) Leukemia 13: 653-663].
Esses estudos demonstram claramente a eficácia do uso deDCs para a geração de respostas imúnológicas contraantígénos de câncer. Uma vacina terapêutica deve ser capazde despertar respostas imúnológicas do hospedeiro contraantígerios virais aos quais o sistema imunológico dohospedeiro é tolerante. Isso envolve a liberação deantígenos às DÒs, a apresentação apropriada de antígeno e aprèpar ação de células T CD8+ específicas para o HCV quepossam resultar em um efeito terapêutico em portadorescrônicos.
As vacinas de antígeno quimérico da invençãoconstituem uma classe, inédita de "antígenos quiméricos"recombinantes produzidos como proteínas de fusão deantígenos selecionados e regiões específicas de umanticorpo. O design bifuncional da molécula é adaptado paradirecionar o antígeno viral às APGs, especialmente DCs,para despertar respostas imunológicas tanto humorais quantocelulares contra o antígeno selecionado. A vacina contraHCV Chimigen™ em sua forma dimerizada é representadaesquematicamente na Fig. 1.
A vacina possui dois domínios: um domínio de respostaimunológica (IRD) que contém o antígeno viral recombinantede HCV, e um domínio de ligação de alvo (TBD) , que contémum fragmento Fc de um anticorpo monoclonal. O design davacina transmite várias propriedades únicas à sua função. Odesign quimérico favorece a formação de estruturassemelhantes a anticorpos que facilitam sua captação atravésde receptores específicos, e resulta na apresentaçãoapropriada do antígeno. Ele pode ser processado através davia proteossômica e os peptídeos apresentados comocomplexos com classe I do MHC, resultando em uma respostade CTL. As vacinas Chimigen™ também podem ser processadasatravés da via èndossômica, apresentadas pela classe II doMHC, para a produção de uma resposta humoral.
O TBD medeia a ligação da vacina Chimigen™ areceptores de APC específicos, tais como receptores Fcy.Embora a invenção hão seja limitada a um mecanismo de açãoespecífico, parece que a ligação da molécula aos receptoresFcy na APC (por exemplo, DCs imaturas) resulta noprocessamento do antígeno através da via da classe I doMHC. Em algumas modalidades, um TBD xenotípico, o antígenorecombinante, os vinculadores peptídicos de comprimentosvariáveis incorporados nos terminais amino e carbóxi doantlgeno tornam a molécula inteira "estranha" e permitemque o sistema imunológico do hospedeiro monte respostasimunológicas muitiepitópicas contra a proteína de fusão,incluindo o antígeno do HCV. As proteínas da proteína defusão Chimigen3 também podem ser produzidas em células nãomamíferas (por exemplo, células de levedura ou de inseto),de forma que sejam glicosiladas de uma forma não mamífera,aumentando, desse modo, sua imunogenicidade em hospedeirosmamíferos (por exemplo, seres humanos). A glicosilação demanose/pauci-manose introduzida em células de inseto tambémpermite a captação da vacina por receptores de manosé emAPCs para captação.
Portanto, as vacinas Chimigen podem ser internalizadaspelas APCs através de receptores Fcy I, II e III (CD64,CD32, CD16) específicos, receptores de manose (CD206),outros receptores de lectina do tipo C, e por fagocitose[Geijtenbeek e cols. (2004) Annu. Rev. Iwmunol. 22:33-54] .
A captação por meio de receptores específicos, oprocessamento através das vias eridossômicas eproteossômicas e a apresentação em ambas as classes demoléculas do MHC podem resultar em uma resposta imunológicaampla capaz de evitar a infecção viral ou eliminar ascélulas infectadas por vírus. A geração de uma resposta deCTL é crucial para eliminar as células infectadas por vírus[Whitton e cols. (2004) Adv. Vírus Res. 63: 181-238].HepaVaxx B, a primeira vacina terapêutica Chimigen™ daViRexx para o tratamento de infecções crônicas pelo HBV,demonstrou resultados muito promissores em estudos pré-clínicos [George e cols. (2003) "A novel class oftherapeutic vaccines for the treatment of chronic viralinfections: evaluation in ducks chronically infected withduck hepatitis B virus (DHBV)", em Hepdart 2003, "Frontiersin Drug Development for Viral Hepatitis: December 14-18",Kauai, Hawaii, ÈUA; George e cols. (2003) wA novel class oftherapeutic vaccines for the treatment of chronic viralinfections". "International Meeting of the MolecularBiology of Hepatitis B Viruses". 7-10 de setembro, "CentroCongressi Giovanni XXIII", Bergamo, Itália; George e cols.(2 004) "Immunological Evaluation of a Novel ChimericTherapeutic Vaccine for the Treatment of Chronic HepatitisB Infections". (2004) "International Meeting of theMolecular Biology óf Hepatitis B Viruses". Woods Hole, MA,ÈUA, 24-27 de outubro de 2004; George e cols. (2005)BioProcessing Journal 4: 39-45; George e cols. (2006) "Anew class of therapeutic vaccines for the treatment ofchronic hepatitis B infections". Em "Framing the Knowledgeof Viral Hepatitis" Schinazi, R.F. Editor, IHL Press EUA].
B. Definições
Os termos usados neste pèdido possuem os significadosindicados pelas definições seguintes (a menos que indicadode forma diferente).
"Anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulinaproduzida por células B linfõides. Essas moléculas sãocaracterizadas por terem a habilidade para. se ligarespecificamente a um antígeno, cada um sendo definido emfunção do outro.
"Resposta de anticorpo" ou "resposta humoral" refere-se a um tipo de resposta imunológica na qual são produzidosanticorpos por linfõcitos B, os quais são secretados nosangue e/ou na Iinfa em resposta a um estímulo antigênico.Em uma resposta imunológica adequadamente funcional, oanticorpo se liga especificamente aos antígenos nasuperfície das células (por exemplo, um patógeno), marcandoa célula para destruição por células fagocíticas, porcélulas efetoras da citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC) e/ou por mecanismos mediados porcomplemento. Os anticorpos também circulam sistemicamente epodem se ligar a vírions livres. Essa ligação de anticorpopode neutralizar o vírion e evitar que ele infecte umacélula, além de marcar o vírion para eliminação pelohospedeiro por fagocitose ou filtração nos rins..
"Antígeno" refere-se a qualquer substância que, emconseqüência do contato com células apropriadas, induz umestado de sensibilidade e/ou reatividade imunológica e quereage de forma demonstravei com anticorpos e/ou célulasimunológicas do indivíduo sensibilizado in vivo ou invitro. Dessa forma, antígenos podem incluir, por exemplo,células ou partículas virais e/ou cada um de seuscomponentes. No caso de vírus, os componentesespecificamente incluem proteínas virais.
"Célula dé apresentação de antígeno" ("APC") refere-seàs células acessórias de èventos induzidos por antígenosque funcionam primeiramente por internalização deantígenos, processamento de antígenos e apresentação deepitopos antigênicos, no contexto das moléculas da classe Iou II do principal complexo de histocompatibilidadè (MHC) ,aos linfócitos. A interação das APCs com antígenos é umaetapa essencial na indução imune, pois ela permite que oslinfócitos encontrem e reconheçam moléculas antigênicas ese tornem ativados. APCs exemplares incluem macrófagos,monócitos, células de Langerhans, células dendriticasinterdigitadas, células dendriticas foliculares e células B.
"Célula B" refere-se a um tipo de linfócito que produzimunoglobulinas (anticorpos) que interagem com antigenos.
"Região ChI", "região CH2", "região CH3" referem-se auma região diferente do domínio constante da cadeia pesadade um anticorpo.
"Resposta celular" ou "resposta celular do hospedeiro"refere-se a um tipo de resposta imunológica mediada porcélulas T auxiliares e killer específicas capazes deeliminar direta ou indiretamente células infectadas porvírus ou células cancerosas.
Como aqui usado, o termo "antígeno quimérico" refere-se a um polipeptídeo que compreende um domínio de respostaimunológica (IRD) e um domínio de ligação de alvo (TBD) . 0domínio de resposta imunológica e os domínios de ligação dealvo podem estar ligados direta ou indiretamente por meioscovalentes ou não covalentes.
"Complexo" ou "complexo antígeno-anticorpo" refere-seao produto da reação entre um anticorpo e um antígeno.Complexos formados com antigenos polivalentes tendem a serinsolúveis em sistemas aquosos.
"Linfócito T citotóxico" é um tipo especializado delinfócito capaz de destruir células estranhas e célulashospedeiras infectadas com os agentes infecciosos queproduzem antigenos virais.
"Epitopo" refére-se à forma simples de um determinanteantigênico, em uma molécula de antígeno do complexo; é aporção específica de um antígeno que é reconhecida por umanticorpo ou um receptor de célula T.
"Fragmento" refere-se a uma parte de uma entidade nãounificada. No contexto desta invenção, também pode serusado para se referir àquela parte de uma entidadecorrespondente. Conseqüentemente, uma proteína de fusão quecompreende um fragmento Fc pode se referir a uma.molécularecombinante que compreende a mesma seqüência peptídica queo fragmento nativo.
"Proteína de fusão" refere-se a uma proteína formadapor expressão de um gene híbrido feito por combinação deduas ou mais seqüências codificadoras.
"Região de dobradiça" refere-se à porção de umanticorpo que conecta o fragmento Fab ao fragmento Fc; aregião de dobradiça contém ligações dissulfeto que ligamcovalentemente as duas cadeias pesadas em conjunto paraformar uma molécula dimérica.
O'termo "homologa" rèfere-se a uma molécula que exibehomologia para outra molécula, por exemplo, que possuiseqüênciás de resíduos químicos que são iguais ou similaresem posições correspondentes. A frase "% homóloga" ou "% dehomologia" refere-se ao percentual de nucleotídeos ouaminoãcidos na mesma posição de polinucleotídeos oupolipeptideos homólogos que são idênticos ou similares. Porexemplo, caso 75 de 80 resíduos em duas proteínas sejamidênticos, as duas proteínas são 93,75% homólogas. 0percentual de homologia pode ser determinado com autilização de vários programas de computador conhecidos poraqueles habilitados na técnica."Hospedeiro" refere-se a um animal de sangue quente aoqual um antígeno quimérico, por exemplo, pode seradministrado.
No contexto desta invenção, "hibridização" significa opareamento de fitas complementares de compostosoligoméricos. Na presente invenção, o mecanismo preferidode pareamento envolve ligação de hidrogênio, que pode serligação de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou deHoogsteen reversa, entre bases de nucleosideos ou nucleotídeos complementares (nucleobases) das fitas decompostos oligoméricos. Por exemplo, adenina e timina sãonucleobases complementares que pareiam através da formaçãode ligações de hidrogênio. A hibridização pode ocorrer sobcircunstâncias variáveis. Os termos "hibridizam", "que hibridiza", "hibridiza" e semelhantes, usados no contextode polinucleotídeos, se referem às condições convencionaisde hibridização, preferivelmente, por exemplo, hibridizaçãoem formamida 50%/SSC 6X/SDS O,1%/ÍOO pg/ml de mDNA, em queas temperaturas para hibridização são acima'de'370C1 e astemperaturas para lavagem em 0,1X SSC/SDS 0,1% são acima de55 0C.
"Imunidade" ou "resposta imunológica" refere-se àresposta do corpo a um antígeno. Em modalidadesespecíficas, refere-se à habilidade do corpo para resistirou se proteger contra uma doença infecciosa.
"Domínio de Resposta Imunológica (IRD)" refere-se àporção antigênica configurada de forma variável de umamolécula quimérica. O IRD compreende um ou mais antígenosou um ou mais antígenos recombinantes. Antígenos viraispreferidos incluem, sem limitação, Core do HCV, E1-E2 doHCV, Eldo HCV, Ε2 do HCV, P7do HCV, NS3-serina protease doHCV, NS4A do HCV, NS4B do HCV e NS5A do HCV.
Como aqui usada, a frase "condição passível detratamento, imunológico" refere-se a uma condição ou doençaque pode ser evitada, inibida ou aliviada . pelodesenvolvimento ou modulação de uma resposta imunológica noindivíduo.
"Linfócito" refere-se a um subconjunto de célulasnucleadas encontradas, por exemplo, no sangue, que medeiamrespostas imunológicas específicas.
"Anticorpo monoclonal" ou "mAb" refere-se a umanticorpo produzido por um clone ou uma populaçãogeneticamente homogênea de células híbridas fundidas, ouseja, uma célula de hibridoma. As células híbridas sãoclonadas para o estabelecimento de linhagens celulares queproduzem um anticorpo monoclonal específico que é química eimunologicamente homogêneo, ou seja, que reconhece apenasum tipo de antígeno.
Como aqui usado, o termo "ligado operacionalmente"significa incorporado em uma construção genética de formaque seqüências de controle da expressão efetivamentecontrolem a expressão de uma seqüência codificadora deinteresse.
"Ligação peptídica" ou "união peptídica" refere-se àligação química covalente entre dois ou mais aminoácidos.Ela é uma ligação amida substituída entre o grupo a-aminode um aminoácido e o grupo α-carboxil de outro aminoácido.
Um "excipiente farmacêutico" compreende um materialcomo, por exemplo, um adjuvante, um veículo, um agente deajuste do pH e de tamponamento, um agente de ajuste datonicidade, um agente umidificante, um conservante, esemelhantes.
"Farmaceuticamente aceitável" refere-se a umacomposição atóxica ,que é fisiologicamente compatível comseres humanos ou outros animais.
O termo "polinucleo.tídeo", como aqui usado, refere-sea uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquercomprimento, tanto ribonucleotídeos quantodesoxirribonucleotídeos. Esse termo refere-se apenas àestrutura primária da molécula. Dessa forma, o termo incluiDNA e RNA de fita simples ou dupla. Ele também inclui tiposconhecidos de modificações, por exemplo, rótulos que sãoconhecidos na técnica, metilação, "caps", substituição deum ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com umanálogo, modificações internucleotídeos como, por exemplo,aquelas com ligações sem cárga (por exemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatosetc.) e com ligações com carga (por exemplo,fosforotioatos, fosforoditioatos etc.), aquelas que contêmporções pendentes como, por exemplo, proteínas (incluindo,por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeossinalizadores, poli-L-lisina etc.), aquelas comintercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno etc.),aquelas que contêm quelantes (por exemplo, metais, metaisradioativos, boro, metais oxidativos etc.), aquelas quecontêm alquilantes, aquelas com ligações modificadas (porexemplo, ácidos nucléicos alfa-anoméricos etc.), além deformas não modificadas do polinucleotídeo.
Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados deforma intercambiável, e significam qualquer cadeia ligadapor peptídeo de aminoácidos, independentemente docomprimento ou de modificação pós-tradução.
Como aqui usado, "profilaxia" significa a prevençãocompleta dos sintomas de uma doença, um retardo do surgimento dos sintomas de uma doença, ou uma redução dagravidade dos sintomas da doença subseqüentementedesenvolvida.
"Prevenção" de uma doença significa que os sintomas dadoença estão essencialmente ausentes.
"Sítio de clivagem de protease" refere-se a um sítiono qual enzimas proteolíticas catalisam a hidrólise(quebra) de ligações peptídicas entre aminoácidos emcadeias polipeptídicas.
Na presente invenção, a frase "condições rigorosas dehibridização" ou "condições rigorosas" refere-se àscondições sob as quais um composto da invenção hibridizarápara a sua seqüência-alvo, mas para um número mínimo deoutras seqüências.
O termo "indivíduo" refere-se a qualquer animal de sangue quente, preferivelmente um ser humano.
nTag" refere-se a um marcador ou seqüência marcadorausada para isolar ou purificar uma molécula que contém otag. Um tag exemplar inclui um tag 6xHis (ou seja, umaseqüência de seis histidinas).
"Célula T" refére-se a um tipo de linfócito que podemontar uma resposta com especificidade antigênica a umantígeno, e que participa das respostas imunológicashumorais é celulares.
"Domínio de Ligação de Alvo (TBD)" refere-se a toda ouparte da região constante da cadeia pesada de umaimunoglobulina (por. exemplo, ChI (toda ou parte)-CH2-CH3) . .
A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-sea uma quantidade de um agente (por exemplo, um antigenoquimérico ou um polinucleotídeo que codifica um antigenoquimérico) suficiente para despertar uma resposta eficaz decélulas B, de linfócitos T citotóxicos (CTL) e/ou delinfócitos T auxiliares (helper) (Th) ao antigeno, e parabloquear ou curar ou pelo menos interromper parcialmente outornar mais lentos os sintomas e/ou as complicações de umadoença ou distúrbio. Um subconjunto de células T funcionacomo células T auxiliares por secreção de citocinas queajudam a ativar células B para secretar anticorpos, ouajudam outro subconjunto de células T a se tornarlinfócitos T efetores citotóxicos (CTLs).
Os termos "que trata" e "tratamento", como aquiusados, englobam qualquer tratamento de uma condiçãotratável por um antigeno quimérico em um animal,particularmente um ser humano, e incluem: (i) a prevençãoda ocorrência da condição em um indivíduo que pode estarpredisposto ã condição, mas que ainda nãò foi diagnosticádocomo tendo a condição; (ií) a inibição da condição, porexemplo, interrompendo ou tornando mais lento o seudesenvolvimento; ou (iii) o alívio da condição, porexemplo, causando a regressão da condição ou de seussintomas.
Como aqui usado, um agente que é "terapêutico" é umagente que causa a abolição completa dos sintomas de umadoença ou uma diminuição da gravidade dos sintomas dadoença.
"Xenotípico" significa que se origina de uma espéciediferente do hospedeiro. Por exemplo, um anticorpo expressode forma recombinante clonado a partir do genoma de umcamundongo seria xenotípico para um ser humano, mas nãopara um camundongo, independentemente de se aqueleanticorpo expresso de forma recombinante foi produzido emuma célula bacteriana, de inseto, humana ou de camundongo.Dessa forma, no contexto de um antígeno quimérico dainvenção, um TBD xenotípico (por exemplo, uma molécula deanticorpo xenotípica ou um fragmento de anticorpoxenotípico) é um TBD derivado de uma espécie diferentedaquela do antígeno quimérico.
C. Antigenos quiméricos
Uma composição da presente invenção inclui um antígenoquimérico que compreende um domínio de resposta imunológica(IRD) e um domínio de ligação de alvo (TBD) . Em modalidadespreferidas da invenção, a porção de IRD é capaz de induzirrespostas humorais e/ou de células T, e a porção de ligaçãoao alvo é capaz de se ligar a uma APC, por exemplo, umacélula dendrítica. 0 antígeno quimérico da presenteinvenção também pode incluir um ou mais dos seguintes: umaregião de dòbradiça de uma imunoglobulina (ou um segmentodesta) , uma região ChI de uma imunoglobulina (ou umsegmento desta), um vinculador peptídico, um sítio declivagèm cie protease, è um tag adequado para uso com umprotocolo dé purificação. Um antígeno quimérico da presenteinvenção é capaz de se ligar e ativar uma APC. Geralmente,mas não necessariamente, o IRD éstá no terminal N do TBD.
Em algumas modalidades da invenção, o IRD do antígenoquimérico inclui uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, ou 10) proteínas (antígenos) selecionadas do grupoque compreende: uma ou mais proteínas do HCV, tais comoaquelas . aqui descritas, ou uma ou mais proteínasrecombinantes do HCV. Entre essas proteínas, pode haveropcionalmente um vinçulador como, por exemplo, qualquer um dos vinculadores aqui revelados. No antígeno quimérico dainvenção, fragmentos imunogênicos desses antígenos, e nãoos antígenos de comprimento total, podem ser usados. Quandomais de um antígeno estiver presente em um antígenoquimérico, apenas proteínas de comprimento total, apenas fragmentos imunogênicos ou misturas de antígenos decomprimento total e proteínas de comprimento total poderãoser usadas.
Os antígenos quiméricos da invenção podem sermonoméricos (ou seja, contêm uma única unidade que compreende um IRD e um TBD) ou podem ser multiméricos (ouseja, podem conter múltiplas unidades, cada umacompreendendo um IRD e um TBD) . Multímeros podem ser, porexemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentameros,hexâmeros, septâmeros ou octâmeros. Nesses multímeros, as unidades individuais podem ser idênticas ou diferentes, oualgumas podem ser idênticas e outras diferentes. A Fig. 1ilustra um antígeno quimérico dimérico.
Ainda em outra modalidade da invenção, ó IRD doantígeno quimérico inclui um 6xHis-peptídeo fundido a uma ou mais proteínas do HCV, ou uma ou mais proteínasrecombinantes do HCV.
Em algumas modalidades da invenção, o TBD do antígenoquimérico pode ser um fragmento de anticorpo. 0 TBD podeser da mesma espécie que ò hospedeiro (indivíduo) ao qual o antígeno quimérico relevante deve ser administrado. Poroutro lado, em modalidades preferidas da invenção, o TBD doantígeno quimérico é um fragmento de anticorpo xenotípicopara o hospedeiro. Por exemplo, caso o hospedeiro seja umser humano, um fragmento de anticorpo xenotípico exemplar éum fragmento de anticorpo de um animal não humano, porexemplo, um fragmento de anticorpo de camundongo. Em certasmodalidades, da invenção, o fragmento de anticorpoxenotípico compreende um fragmento Fc murídeo. Nasmodalidades mais preferidas da invenção, o TBD compreendeum fragmento Fc xenotípico (ou um segmento deste) , umaregião de dobradiça (ou um segmento desta), uma região ChI(ou um segmento desta) e uma ligação peptídica adequada àligação do domínio de ligação de alvo. aò IRD.
A presente invenção também compreende o uso demoléculas de ligação para unir o IRD ao TBD. Moléculasvinculadoras exemplares incluem zíperes de leucina ebiotina/avidina. Outros vinculadores que podem ser usados(por exemplo, em proteínas de fusão) são seqüênciaspeptídicas. Esses vinculadores peptídicos geralmente têmcomprimento de cerca de 2 a cerca de 4 0 aminoácidos (porexemplo, cerca de 4-10 aminoácidos). Um vinculadorpeptídico exemplar inclui a seqüência de aminoácidosSRPQGGGS (ID'. DE SEQ. N°: 1). Outros vinculadores são bemconhecidos na técnica e são geralmente ricos em glicinaè/oü alanina para permitir flexibilidade entre as regiõesque unem. Geralmente, nos antígenos quiméricos da invenção,o IRD e o TBD não são unidos por uma interação físicaantígenò-anticorpo entre uma parte de ligação de antígenodo TBD (por exemplo, uma molécula de anticorpo ou umfragmento de uma molécula de anticorpo) e um epitopoantigênico apropriado no IRD.
Em uma modalidade, o antígeno quimérico da presenteinvenção é uma proteína de fusão que possui duas porções,especificamente um IRD contendo uma seqüência antigênica(como, por exemplo, um antígeno viral), e um TBD contendoum fragmento Fc xenotípico. O fragmento Fc xenotípicomurídeo se liga aos receptores específicos na APC,especificamente nas células dendríticas. Dessa forma, aregião de ligação do antígeno quimérico se dirigeespecificamente às células de apresentação de antígeno. Omaquinãrio interno da APC então processa o antígenoquimérico e apresenta peptídeos específicos em moléculas doMHC da classe I e da classe II para entrar em contato eativar células T e gerar respostas imuriológicas humorais ecelulares para depurar células infectadas ou outras célulasindesejáveis apropriadas, por exemplo, células cancerosas.
Em uma modalidade adicional, o antígeno quimérico podeser uma proteína de fusão que possui duas porções,especificamente um antígeno ou antígenos viraismodificados, fragmentos de proteína ou peptídeosantigênicos, ou qualquer um" destes com glicosilação emsítios específicos, e um fragmento Fc xenotípico murídeo,que também pode ser glicosilado!
Ainda em outra modalidade, a invenção fornece umantígeno quimérico adicionalmente modificado, em que oantígeno (IRD) é biotinilàdo, e o TBD (por exemplo,frágmento Fc) é conjugado à avidina (por exemplo,estreptavidina) em, por exemplo, uma proteína de fusão.Esse TBD conjugado à avidina facilita a produção de umaampla gama de conjugados IRD-TBD. Observa-se naturalmenteque o IRD pode ser conjugado â avidina (por exemplo, naforma de uma .proteína de fusão) e o TBD (por exemplo,fragmento Fc) pode ser biotinilado..
Ainda em outra modalidade, a invenção fornece umaassociação entre o IRD (antígeno) e o TBD (por exemplo,fragmento Fc de anticorpo) através de conjugação química.
Uma modalidade da presente invenção inclui o uso deantígenos recombinantes de HCV fundidos a um fragmento deanticorpo por técnicas de biologia molecular, produção dasproteínas de fusão em um sistema de expressão debaculovírus, e seu uso como vacinas terapêuticas contrainfecções crônicas pelo HCV. A presente invenção fornece ummétodo eficiente para liberar um antígeno do HCV às APCs invivo de modo a gerar uma resposta imunológica ampla, umaresposta Thl que envolve CTLs e uma resposta Th2(anticorpo). A imunogenicidade do antígeno viral pré-selecionado (por exemplo, um não reconhecido pelo sistemaimunológico de um hospedeiro) pode ser aumentada pelapresença de um fragmento de anticorpo xenotípico, bem comopela presença de glicosilação específica introduzida nosistema de expressão de célula de inseto. A proteína defusão antígeno-fragmento de anticorpo, em função dapresença do componente de anticorpo, ira se ligar areceptores específicos presentes em várias células dosistema imunológico (por exemplo, APC), incluindo célulasdéndríticas, macrófagos, monõcitos, células B egranulócitos. As proteínas de fusão administradas a sereshumanos' ou animais serão internalizadas por APCs,especialmente DCs, serão hidrolisadas até pequenospeptídeos, e apresentadas na superfície celular, emcomplexos com moléculas do MHC da Classe I e/ou da ClasseII ãs células T que possuem receptores de célula T comespecificidade antigênica (TCR) da especificidadeapropriada. Dessa forma, os antigenos quiméricos (proteínasde fusão) podem despertar uma resposta imunológica ampla edepurar a infecção viral.
Como aqui usado, o termo "Domínio de Ligação de Alvo(TBD)" refere-se a toda ou parte de uma região constante dacadeia pesada de imunoglobulina, que ê um fragmento deanticorpo capaz de se ligar a um receptor Fc em uma APC. Deacordo com a presente invenção, o TBD é uma proteína capazde se ligar a um receptor Fc em uma APC, particularmenteuma célula dendrítica, e é subseqüentemente transportadopara dentro da APC por captação mediada por receptor. Deacordo com a presente invenção, a presença de um fragmentoFc aumenta a captação do antígeno quimérico pelo receptorFc nas APCs, especificamente DCs. Em virtude da captaçãoespecífica, o antígeno viral é processado e apresentadocomo estranho; desse modo, é despertada eficazmente umaresposta imunológica ao antígeno viral, o qual, por elepróprio, seria tolerado pelo hospedeiro ou despertaria umaresposta imunológicã muito fraca no hospedeiro.
Além disso, de acordo com a presente invenção, oantígeno quimérico,' preferivelmente, é capaz de se ligar aum receptor de manose de macrófago/receptores de lectina dotipo C. O receptor de manose de macrófago (MMR) , tambémconhecido como CD206, é expresso em APCs como, por exemplo,DCs. Essa molécula é um membro da família da lectina dotipo C de receptores endocíticos. O antígeno quiméricomanosilado pode ser ligado e internalizado por CD206. Emgeral, acredita-se que o antlgeno exógeno seja processado eapresentado primeiramente através da via do MHC da classeII. No entanto, no caso de direcionamento através de CD206,há evidências de que tanto a via do MHC da classe I quantoda classe II estejam envolvidas [Apostolopoulos e cols.(2000) Eur. J. Iwmunol. 30: 1.714; Apostolopoulos e cols.(2001) Curr. Mol. Med. 1: 469; Ramakrishna e cols. (2004)J. Iwmunol. 172: 2.845-2.852]. Dessa forma, célulasdendríticas derivadas de monócitos carregadas com antígenoquimérico que especificamente se dirigem a CD206 induzirãorespostas potentes tanto de CTLs CD8+ dependentes da classeI quanto de células T auxiliares proliferativas dependentesda classe II [Ramakrishna e cols. (2004) J. Immunol.172 (5) : 2.845-52] .
Um TBD exemplar é derivado do mAb anti-HBVsAg decamundongo (Hibridoma 2C12), como clonado no vetor deexpressão pFastBac HTa, e expresso em uma; sistema deexpressão de célula de inseto (Invitrogen, Carlsbad, CA,USA) . Esse TBD consiste em parte de ChI (que possui aseqüência de aminoácidos VDKKI; ID. DE SEQ. N°: 2), eHinge-CH2-CH3 do terminal N para o terminal C do mAb anti-HBVsAg de camundongo. A região constante da molécula deIgGl para a prática da presente invenção pode conter umpeptídéo vinculador, parte de CHl-hinge e as regiões CH2 eCh3. A porção de região de dobradiça do TBD monoméricò podeformar ligações dissulfeto com uma segunda molécula de TBD.
A proteína pode ser expressa como uma proteína de fusão doterminal N com um tag 6xHis, um sítio de clivagem deprotease de sete aminoácido rTEV (vírus etch recombinantedo tabaco) e a fusão do terminal N do Domínio de Ligação deAlvo (TBD) do: mAb xenotípico (murídeo) desenvolvido contraHBVsAg (Hibridoma 2C12). O TBD exemplar é um fragmento dacadeia constante do mAb de IgGl de 2G12 com a seqüência deaminoácidos que compreende o vinculador peptídico de 8aminoácidos; cinco aminoácidos da região ChI, as seqüênciasde dobradiça, seqüências da região CH2 e CH3 e,opcionalmente, um peptídeo no terminal C de dez aminoácidosadicionais codificado por nucleotídeos derivados do vetorde expressão. O fragmento de TBD exemplar aqui definidoforma a molécula original para a geração de proteínas defusão com antígenos derivados do virus da HCV.
D. Polinucleotxdeos inéditos
Outro aspecto da invenção fornece polinucleotídeos quecodificam todos os antígenos quiméricos aqui apresentados.Os polinucleotídeos compreendem uma primeira porção dopolinucleotídeo que codifica um domínio de respostaimunológica e uma segunda porção do polinucleotídeo quecodifica um domínio de ligação de alvo. A primeira e asegunda porções do polinucleotídeo podem estar localizadasna mesma cadeia ou èm cadeias de nucleotídeos diferentes.
Além das regiões dos antígenos quiméricos da invençãodescritas acima, os polinucleotídeos da invenção geralmentecontêm seqüências-líderes que codificam peptídeos-líderesque facilitam a secreção do antígeno quimérico por umacélula (pôr exemplo, uma célula de levedura ou de inseto)que o produz. A seqüência-líder relevante é geralmenteclivada do antígeno quimérico antes da secreção pelacélula. Seqüências-líderes podem ser qualquer uma daquelasaqui reveladas e outras conhecidas na técnica, por exemplo,a seqüência sinalizadorá AcNPV quitinase que possui aseqüência de aminoácidos MPLYKLLNVLWLVAVSNAI (ID. DE SEQ.N0 : 37) codificada pela seqüência de nucleotídeosATGCCCTTGTACAAATTGTTAAACGTTTTGTGGTTGGTCGCCGTTTCTAACGCGATT(ID. DE SEQ. N°: 38) útil para a expressão em células deinseto e o líder do fator alfa-matingr útil para a expressãoem células de levedura (por exemplo, células de levedura dePichia pastoris).
A invenção fornece polinucleotídeos que correspondemou complementares aos genes que codificam antígenosquiméricos, mRNAs e/ou seqüências codificadoras,preferivelmente na forma isolada, incluindopolinucleotídeos que codificam proteínas variantes doantígeno quimérico; DNA, RNA, híbridos de DNA/RNA emoléculas relacionadas, polinucleotídeos ouoligonucleotídeos complementares ou que possuem pelo menos90% de homologia para os genes que codificam um antígenoquimérico ou seqüências de mRNA ou partes destas; epolinucleotídeos ou oligonucleotídeos que hibridizam paraos genes que codificam um antígeno quimérico, mRNAs, oupara polinucleotídeos que codificam o antígeno quimérico.
Adicionalmente, a invenção inclui análogos dos genesque codificam um antígeno quimérico especificamènte aquireveladoi Análogos incluem, por exemplo, mutantes que retêma habilidade para despertar uma resposta imunológica, epreferivelmente possuem homologia de pelo menos 80%, maispreferivelmente 90% e, principalmente, 95% para qualquer umdos polinucleotídeos que codificam um antígeno quimérico,como descrito especificamente pelas seqüênciasrepresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 3 9 e 4.151.
Tipicamente, esses análogos diferem em apenas 1 a 10mudanças de códon. Exemplos incluem polipeptídeos compequenas .variações de aminoácidos em relação à seqüência deaminoácidos. natural;de um antígeno viral ou de um fragmentode anticorpo; em particular, substituições conservadoras deaminoácidos. Substituições conservadoras são aquelas queocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estãorelacionados em suas cadeias laterais. Os aminoácidoscodificados geneticamente são geralmente divididos emquatro famílias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) apolares
alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares nãocarregados = glicina, asparagina, glutamina, cistina,serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são algumas vezes classificados em conjunto comoaminoácidos aromáticos. Por exemplo, é razoável esperar queuma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucinaou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina comuma serina, ou uma substituição conservadora similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionadonão tenha um efeito importante sobre a atividade biológica.Moléculas de polipeptídeo que possuem substancialmente amesma seqüência de aminoácidos que qualquer um dospolipeptídeos aqui revelados, mas que possuem pequenas substituições de aminoácidos que não afetamsubstancialmente á habilidade dos antígenos quiméricos paradespertar uma resposta imunológica, estão dentro dadefinição de üm antígeno quimérico. Derivados incluemconjugados agregadores com outras moléculas de antígeno quimérico e conjugados covalentes com porções químicas nãorelacionadas. Derivados covalentes são preparados porligação de funcionalidades aos grupos encontrados emcadeias de aminoácidos do antígeno quimérico ou nosresíduos de Nor do terminal C por meios conhecidos natécnica.
As abreviações de aminoácidos são fornecidas na Tabela1.
TABELA 1: Abreviações de aminoácidos
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Podem ser feitas substituições conservadoras deaminoácidos em uma proteína, sem alterar a conformação ou afunção da proteína. As proteínas da invenção, ou úteis paraa invenção, podem compreender no máximo 15 (por exemplo, nomáximo: 14; 13; 12; 11; 10; 9; 8; 7; 6; 5; 4; 3; 2; OU 1)substituições conservadoras. Tais mudanças incluem asubstituição de qualquer um de isoleucina (I), valina (V) ,e leucina (L) por qualquer outro desses aminoácidoshidrofóbicos; ácido aspártico (D) por ácido glutâmico (E) evice-versa; glutamina (Q) por asparagina (N) e vice-versa;e serina (S) por treonina (T) e vice-versa. Outrassubstituições também podem ser consideradas conservadoras,dependendo do ambiente do aminoácido particular e de seupapel na estrutura tridimensional da proteína. Por exemplo,glicina (G) e alanina (A) podem freqüentemente serintercambiáveis, bem como alanina (A) e valina (V) .Metionina (M) , que é relativamente hidrofóbica, pode serfreqüentemente trocada por leucina e isoleucina e, algumasvezes, por valina. Lisina (K) e arginina (R) sãofreqüentemente intercambiáveis em localizações nas quais acaracterística significativa dò resíduo de aminoácido é suacarga, e as pKs diferentes desses dois resíduos deaminoácidos não são significativas. Ainda outras alteraçõespodem ser consideradas "conservadoras" em ambientesespecíficos [veja, por exemplo, Biochemistry 4a Ed., LubertStryer ed. (W. H. Freeman e Co.), páginas 18-23; Henikoff ecols. (1992) Proe. Natl. Aead. Sei. USA 89: 10.915-10.919;Lei e cols. (1995) JY Biol. Chem. 270: 11.882-11.885].
Polinucleotídeos análogos adicionais incluem aquelescom uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10,12, 15 ou 20) adições ou eliminações em qualquer um dosTBDs e/ou qualquer um dos IRDs que sirvam, por exemplo,para aumentar a solubilidade do antígeno quiméricorelevante. As adições ou eliminações podem ser de um oumais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50,60, 70, 80, 90, 100, ou mais) aminoácidos nos antígenosquiméricos codificados pelos polinucleotídeos (e os númeroscorrespondentes de nucleotídeos nos própriospolinucleotídeos).
A invenção também inclui polinucleotídeos quehibridizam seletivamente para os polinucleotídeos quecodificam antígenos quiméricos. Preferivelmente, umpolinucleotídeo da invenção irá hibridizar sob condiçõesrigorosas para uma ou mais das seqüências representadas nosIDS. DE SEQ. Nos : 39 e 41-51. O rigor das reações dehibridização é facilmente determinável . por aqueleshabilitados na técnica, e geralmente é um cálculo empíricoque depende do comprimento da sonda, da temperatura dalavagem e da concentração de sal. Em geral, sondas maislongas exigem temperaturas maiores para um anelamentoadequado, enquanto sondas mais curtas precisam detemperaturas mais baixas. A hibridização geralmente dependeda habilidade das seqüências desnaturadas de ácidosnucléicos pará se re-aneIarem quando estão presentes fitascòmplementares em üm ambiente abaixo de sua temperatura defusão. Quanto maior o grau de homologia desejado entre asonda e a seqüência hibridizável, maior a temperaturarelativa que pode ser usada. Conseqüentemente, temperaturasrelativas maiores tenderiam a tornar as condições dehibridização mais rigorosas, enquanto temperaturas maisbaixas, menos. Para mais detalhes e explicações sobre origor das reações de hibridização, veja, por exemplo,Ausubel e cols., "Current Protocols in Molecular Biology",Wiley Interscience Publishers, (®1995, Suplementado emabril de 2004, Suplemento 66) nas páginas 2.9.1-2.10.8 e4.9.1-4.9.13.
"Condições rigorosas" ou "condições de alto rigor",como aqui definidas, são identificadas, sem limitação, poraquelas que: (1) empregam força iônica baixa e temperatura elevada para lavagem, por exemplo, 0,015 M de cloreto desódio/0,0015 M de citrato de sódio/dodecil sulfato de sódio0,1% a 5 0 0C; (2) empregam, durante a hibridização, umagente desnaturante, por exemplo, formamida, por exemplo,formamida 50% (v/v) com albumina sérica bovina 0,1%/ Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,1% /50 mM de tampão de fosfatode sódio em pH 6 ,5 com 750 mM de cloreto de . sódio, 75 mM decitrato de sódio a 42°C; ou (3) empregam formamida 50%, SSC5X (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM defosfato de sódio (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, solução de Denhardt 5X, DNA de esperma de salmão sonifiçado(50 pg/ml), SDS 0,1% e sulfato de dextrana 10% a 42°C, comlavagens a 42°C em SSC 0,2X (cloreto de sódio/citrato desódio) e formamida 50% a 55 °C, seguido por uma lavagem dealto rigor que consiste em SSC 0, IX contendo EDTA a 55°C. "Condições moderadamente rigorosas" são descritas, semlimitação, por aquelas em Sambrook e cols., "MolecularCloning: A Laboratory Manual", 2°d Ed., Nova York: ColdSpring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solução delavagem e condições de hibridização (por exemplo,temperatura, força iônica e % SDS) menos rigorosas do queaquelas descritas acima. Um exemplo de condiçõesmoderadamente rigorosas é incubação de um dia para o outroa 370C em uma solução que compreende: formamida 20%, SSC 5X(150 mM de NaCl, 15 mM citrato trissódico), 50 mM defosfato de sódio (pH 7,6), solução de Denhardt 5X, sulfatode dextrana 10% e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmãotriturado desnaturado, seguido por lavagem dos filtros emSSC IX a aproximadamente 37-50°C. Aqueles habilitados natécnica saberão como ajustar a temperatura, a força iônicaetc. da forma necessária para acomodar fatores como ocomprimento da sonda e semelhantes.
Modalidades de um polinucleotídeo da invenção incluem:um polinucleotídeo que codifica um antígeno quimérico quepossui uma seqüência selecionada de qualquer uma dasseqüências representadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 40 e 52-62,uma seqüência de nucleotídeos de antígeno quiméricoselecionada de qualquer uma das seqüências representadasnos IDS. DE SEQ. Nos: 39 e 41-51, mas com nucleotídeos Tsubstituídos com nucleotídeos U. Por exemplo, modalidadesdò antígeno quimérico nucleotídeos compreendem, semlimitação:
(a) um polinucleotídeo que compreende ou que consisteem uma seqüência selecionada de qualquer uma das seiqüênciasrepresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 39 e 41-51, era que Ttambém pode ser U;
(b) um polinucleotídeo cuja seqüência é pelo menos 80%homóloga a uma seqüência selêcionada de qualquer uma dasseqüências representadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 39 e 41-51;
(c) um polinucleotídeo que codifica um antígenoquimérico cuja seqüência é codificada por um DNA contido emqualquer um dos plasmídeos aqui revelados;
(d) um' polinucleotídeo que codifica um antígenoquimérico cuja seqüência é uma seqüência selecionada dequalquer uma das seqüências representadas nos IDS. DE SEQ.
Nos: 4 0 e 52-62;
(e) um polinucleotídeo que codifica uma proteínarelacionada ao antígeno quimérico qüe é pelo menos 90%idêntica a uma seqüência de aminoácidos inteira cujaseqüência é selecionada de qualquer uma das seqüênciasrepresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 4 0 e 52-62;
(f) um polinucleotídeo que é totalmente complementar aum polinucleotídeo de um de (a)-(e);
(g) um polinucleotídeo que hibridiza seletivamente sobcondições rigorosas para um polinucleotídeo de (a)-(f); e
(h) um polinucleotídeo que compreende ou que consisteem uma seqüência selecionada de qualquer uma das seqüênciasrepresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 39 e 41-51, masdesprovido de todas ou de algumas das seqüências que não doIRD (por exemplo, as proteínas do HCV aqui listadas) e do
TBD e, opcionalmente, que contém, por exemplo, um ou maisvinculadores alternativos e/ou um peptídeo secretoralternativo (líder). Além disso, seqüências adicionais (porexemplo, seqüências derivadas de vetor que codificamaminoácidos no terminal C do TBD) podem ser eliminadas dospolinucleotídeos da invenção. Essas seqüências adicionaispodem ser aquelas que codificam 1-15 (por exemplo, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14) aminoácidos.
A invenção também fornece moléculas de DNArecombinante ou RNA transcrito contendo um polinucleotídeode antígeno quimérico, um análogo ou homólogo deste,incluindo, sem limitação, fagos, plasmídeos, fagomídeos,cosmídeos, YACs (cromossomos artificiais de levedura), BACs(cromossomos bacterianos artificiais) , além de váriosvetores virais e não virais bem conhecidos na técnica, ecélulas transformadas ou transfectadas com essas moléculasde DNA recombinante ou RNA. Métodos para a geração dessasmoléculas são bem conhecidos [veja, por exemplo, Sambrook ecols., 1989, supra].
A invenção ainda fornece um sistema hospedeiro-vetorque compreende uma molécula de DNA recombinante que contémum polinucleotideo de antlgeno quimérico, análogo ouhomólogo deste, dentro de uma célula hospedeiraprocariótica ou eucariótica adequada.. Exemplos de célulashospedeiras eucarióticas adequadas incluem uma célula delevedura, uma célula de planta, ou uma célula animal, porexemplo, uma célula de mamífero ou uma célula de inseto(por exemplo, uma célula infectável por baçulovírus como,por exemplo, uma célula Sf9, Sf21, expresSF®, de DrosophilaS2 ou High Five™) . Exemplos de células de mamíferos
adequadas incluem várias linhagens de células de câncer depróstata como, por exémplo, DU14 5 e TsuPrl, outraslinhagens de células de câncer de próstata que podem sertransfectadas ou transduzidas, células primárias (PrEC),além de diversas células de mamíferos usadas rotineiramentepara a expressão de proteínas recombinántes (por exemplo,células COS, CHO, 293, 293T). Mais particularmente, umpolinucleotideo que compreende a seqüência codificadora doantígeno quimérico ou um fragmento, análogo ou homólogodeste pode ser usado para gerar ò antígeno quimérico destecom o uso de vários sistemas hospedeiro-vetor usadosrotineiramente e amplamente conhecidos na técnica.
Vários sistemas hospedeiro-vetor adequados à expressãode antigenos quiméricos.destes estão disponíveis; veja, porexemplo,. Sambrook e cols., 1989, supra; Ausubel, "CurrentProtocols in Molecular Biology", 1995, supra). Vetorespreferidos para expressão de célula de inseto incluem, semlimitação, o plasmídeo de vetor de transferência pFastBacHTa (Invitrogen).. Com o uso desses plasmídeos de vetor detransferência, podem ser produzidos baculovírusrecombinantes em células de inseto, e esses podem serusados para infectar várias linhagens de células de inseto,incluindo, por exemplo, Sf 9, Sf21, expresSF4®, DrosophilaSâ ou High Five™, para a expressão dos antigenosquiméricos. Um exemplo deste é o sistema de expressão debaculovírus Bac to Bac (Invitrogen) . Alternativamente,sistemas de expressão de levedura preferidos incluemSaccharomyces eerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Piehiapastoris e Piehia august. Os sistemas de hospedeiro-vetorda invenção são úteis para a produção de um antígenoquimérico.
Um antígeno quimérico ou um análogo ou homólogo destetambém pode ser produzido pela transfecção estável decélulas (por exemplo, células de inseto) com uma construçãode plasmídeo que contém um promotor apropriado (porexemplo, um promotor de célula de inseto) e que codifica umantígeno quimérico. Por exemplo, um plasmídeo recombinantepMIB-V5 (Invitrògen) que codifica um antígeno quimérico ouum análogo ou homólogo deste pode ser usado para atransfecção estável de células de inseto Sf9. O antígenoquimérico ou uma proteína relacionada é expresso nascélulas Sf9, e o antígeno quimérico é isolado com o uso demétodos padronizados de purificação. Também podem serempregados vários outros sistemas de expressão bemconhecidos na técnica. Construções de expressão que codificam um peptídeo-líder unido estruturalmente àseqüência codificadora do antígeno quimérico podem serusadas para a geração de uma forma secretada de antígenoquimérico.
Como aqui discutido, a redundância no código genéticopermite uma variação nas seqüências gênicas do antígenoquimérico. Em particular, sabe-se na técnica que espécieshospedeiras específicas freqüentemente possuem preferênciasde cõdon específicas e, dessa forma./ pode-se adaptar aseqüência revelada como preferida para um hospedeiro desejado. Por exemplo, seqüências de códon análogaspreferidas tipicamente possuem códons raros (ou seja,códons que possuem uma freqüência de uso de menos de cercade; 20% em seqüências conhecidas do hospedeiro desejado)substituídos com códons com freqüência maior. Preferências de códons para uma espécie específica são calculadas, porexemplo, com a utilização de tabelas de uso de códonsdisponíveis na INTERNET como, por exemplo, na página da Webwww.kazusa.or.jp/codon.
Modificações de seqüências adicionais são conhecidaspor aumentarem a expressão de proteína em um hospedeirocelular. Essas incluem a eliminação de seqüências quecodificam sinais de pòliadenilação falsos, sinais de sítiosde união de éxons/íntrons, repetições semelhantes atransposon e/ou outras dessas seqüências bem caracterizadas que são prejudiciais à expressão gênica. 0 teor de GC daseqüência é ajustado aos níveis médios para certohospedeiro celular, como calculado por referência a genesconhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível,a seqüência é modificada para evitar estruturas de mRNAsecundário em hairpin previstas. Outras modificações úteisincluem a adição de uma seqüência de consenso de iniciaçãoda tradução do quadro de leitura aberta, como descrito emKozak [(1989) Mol. Cell Biol. 9: 5.073-5.080]. Aqueleshabilitados na técnica entendem que a regra geral de queribossomos eucarióticos iniciam a tradução exclusivamenteno códon AUG 51 proximal só é anulada sob condições raras[veja, por exemplo, Kozak (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA92: 2.662-2.666; Kozak (1987) Nucl. Acids Res. 15: 8.125-8.148].
Clones de Escheriehia eoli, cada um deles transformadocom um dos plasmídeos listados abaixo, foram depositados em11 de outubro de 2006, sob o Tratado de Budapeste no"International Depository Authority of Canada" (IDAC), 1015Arlington Street Winnipeg, Manitoba, R3E 3R2 Canadá(telefone n° : (204) 789-6030; fac-símile n°: (204) 789-2018). Cada clone ê facilmente identificado pelo número deacesso no IDAC indicado.
Plasmxdeo N0 de Acesso no IDAC
pFastBacHTa-gp64 HCV NS3mutS-TBD 111006-01
pFastBacHTa-gp64 HCV NS3mut-TBD 111006-02
pFastBacHTa-gp64 NS3-NS5A-TBD 111006-03
pFastèacHTa-gp64 HCV NS5A-TBD 111006-04
pFastBacHTa HCV NS3mut-TBD 111006-05
pFastBacHTa HCV NS3-NS4B-NS5A-TBD 111006-06
As amostras depositadas no IDAC são retiradas do mesmodepósito mantido pela "ViRexx Medicai Corporation" desdeantes da data de depósito deste pedido. Os depósitos serãomantidos, sem restrição no depósito do IDAC por um períodode 30 anos ou 5 anos após a solicitação mais recente, oupela vida efetiva da patente, o que for mais longo, e serãosubstituídos caso o .depósito fique não viável duranteaquele período.
E. Composições farmacêuticas da invençãoUm aspecto da invenção está relacionado às composiçõesfarmacêuticas que compreendem um excipientefarmaceuticamente aceitável e um antígeno quimérico quecompreende um domínio de resposta imunológica e um domíniode ligação de alvo, em que o domínio de ligação de alvocompreende um fragmento de anticorpo. Em aplicaçõesterapêuticas, as composições farmacêuticas podem seradministradas si um indivíduo em uma quantidade suficientepara despertar uma resposta eficaz de células B, linfócitosT citotóxicos (CTL) e/ou linfócito T auxiliares (Th) aoantígeno, e para evitar a infecção ou para curar ou pelomenos parcialmente interromper ou tornar mais lento ossintomas e/ou as complicações da infecção. Quantidadeseficazes para esse uso depénderão, por exemplo, dacomposição . específica administrada, do modo deadministração, do estágio e da gravidade da doença tratada,dò peso e do estado geral de saúde do indivíduo e daavaliação do médico assistente.
A dosagem para uma imunização terapêutica inicial (comantígeno quimérico) geralmente ocorre em uma faixa dedosagem unitária, na qual o valor inferior é de cerca de 1,5, 50, 500 ou 1.000 ng e o valor superior é de cerca de10.000, 20.000, 30.000 ou 50.000 pg. Os valores de dosagempara um ser humano tipicamente variam de cerca de 500 ng acerca de 50.000 pg por 70 quilogramas do indivíduo.Dosagens de reforço entre cerca de 1,0 ng a cerca de 50.000pg de antígeno quimérico de acordo com um regime de reforçoao longo de dias a meses podem ser administradas,dependendo da resposta do indivíduo e da condição. Aadministração deve continuar.até pelo menos que os sintomasclínicos ou testes laboratoriais indiquem que a condiçãofoi evitada, interrompida, ficou mais lenta ou foieliminada, e por um período posteriormente. As dosagens,vias de administração e posologias de doses são ajustadasde acordo com metodologias conhecidas na técnica.
Uma forma de dose unitária humana de um antígenoquimérico é tipicamente incluída em uma composiçãofarmacêutica que compreende uma dose unitária humana de umveículo aceitável, em uma modalidade um veículo aquoso, e èadministrada em um volume/quantidade conhecida por aqueleshabilitados na técnica como sendo útil para administraçãodesses polipeptídeos a seres humanos (veja, por exemplo,"Remington: The Science and Practice of Phãrmacy", 206Édition, A. Gennaro, Editor, Lippincott Williams & Wilkins,Baltimore, Md., 2000). Como observado por aqueleshabilitados ná técnica, vários fatores podem influenciar adose ideal em um caso em particular. Tais fatores incluem,por exemplo, a meia-vida do antígeno quimérico, a afinidadede ligação do antígeno quimérico, a imunogenicidade dacomposição, o nível da concentração estável desejada, a viade administração, a freqüência do tratamento e a influênciade outros agentes usados em combinação com o método detratamento da invenção, além do estado de saúde de umindivíduo em particular.
Geralmente, é administrado antígeno quiméricosuficiente para despertar uma resposta imunológica aoantígeno quimérico a um indivíduo. O TBD dirige o antígenoquimérico aos receptores específicos em APCs, por exemplo,DCs. O antígeno quimérico é internalizado, processadoatravés das vias de apresentação de antígeno para despertarrespostas imunológicas tanto humorais quanto celulares.
Em certas modalidades, as composições da presenteinvenção são empregadas em estados de doença sérios, ouseja, em situações fatais ou potencialmente fatais. Nessescasos, em conseqüência da natureza relativamente atóxica doantígeno quimérico em composições preferidas da invenção, épossível e pode ser desejável pelo médico responsável pelotratamento administrar excessos substanciais dessesantígenos quiméricos em relação às quantidades de dosagemestabelecidas.
A concentração de antígeno quimérico da invenção nasformulações farmacêuticas pode variar amplamente, ou seja,de menos de cerca de 0,1%, normalmente pelo menos cerca de2%, até 20% a 50% ou mais por peso, e será selecionadaprimeiramente por volumes de fluido, viscosidades etc., deacordo com o modo de administração em particularselecionado.
As composições farmacêuticas podem ser liberadas pormeio de qualquer via conhecida na técnica como, porexemplo, por via parenteral, intratecal, intravascular,intravénosa, intramuscular, transdérmica, intradérmica, subcutânea, intranasal, tópica, oral, retal, vaginal,pulmonar ou intraperitoneal. Preferivelmente, a composiçãoé liberada por vias parenterais como, por exemplo,administração subcutânea ou intradérmica.
As composições farmacêuticas podem ser preparadasmisturando-se.". os antigenos quiméricos desejados com umveículo apropriado adequado para a via de administraçãodesejada. Na fabricação das composições farmacêuticas destainvenção, o antígeno quimérico é normalmente misturado comum excipiente, diluído por um excipiente ou englobadodentro de um veículo que pode estar na forma de umacápsula, sachê, papel ou outro recipiente. Quando oexcipiente farmaceuticamente aceitável servir comodiluente, ele poderá ser um material sólido, semi- sólidoou líquido, que atua como veículo, transportador ou meio para o agente terapêutico. Dessa forma, as composiçõespodem estar ria forma de comprimidos, pílulas, pós,pastilhas, sachês, cápsulas, elixires, suspensões,emulsõés, soluções, xaropes, aerossóis (como um sólido óuem um meio líquido) , pomadas que contêm, por exemplo, até10% por peso do antígeno quimérico, cápsulas de gelatinamacia e dura, supositórios, soluções injetáveis estéreis epós estéreis embalados.
Alguns exemplos de excipientes adequados incluem, semlimitação, dextrose, sacarose, glicerol, sorbitol, manitol,amidos, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos,tragacánto, gelatina, siíicato de 'cálcio, celulosemicrocristalina, polivinilpirrolidona, celulose, águaestéril, xarope e metil celulose. As formulações podemadicioriaimente incluir: agentes lubrificantes, tais comotalco, estearato de magnésio e óleo mineral; agentesumidificantes; agentes . emulsificantes e de suspensão;agentes conservantes, tais como metil- e propilhidroxi-benzoatos; agentes adoçantes e agentes fIavorizantes. Ascomposições da. invenção podem ser formuladas de forma afornecerem uma.liberação rápida, sustentada ou. retardada doantígeno quimérico após administração ao indivíduo peloemprego de procedimento conhecidos na técnica. Veja, porexemplo, Remington, supra, nas páginas 903-92 e páginas1.015-1.050 .
Para a preparação de composições sólidas como, porexemplo, comprimidos, o antígeno quimérico é misturado comum excipiente farmacêutico para formar uma composição depré-formulação solida que contém uma mistura homogênea deum antígeno quimérico da presente invenção. Quando se dizquè essas composições de pré-formulação são homogêneas,significa que o antígeno quimérico está disperso igualmentepor toda a composição de forma que a composição possa serfacilmente subdividida em formas igualmente eficazes dedosagem unitária como, por exemplo, comprimidos, pílulas ecápsulas.
Os comprimidos ou pílulas da presente invenção podemser revestidos ou de algum outro modo compostos parafornecer umà forma de dosagem que gere a vantagem da açãoprolongadà. Por exemplo, o comprimido ou a pílula podecompreender um componente de dosagem interno e umcomponente de dosagem externo, o último na forma de umenvelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem serseparados por uma camada entéricá, que serve para resistirà desintegração no estômago, e permite que o componenteinterno passe intacto para o duodenò ou que tenha aliberação retardada. Podem ser úsados vários materiais paraessas camadas ou revestimentos entéricos, tais materiaisincluindo diversos ácidos poliméricos e misturas de ácidospoliméricos com materiais como goma-Iaca, álcool cetílico eacetato de celulose.
As formas líquidas nas quais as composições inéditasda presénte invenção podem ser incorporadas paraadministração oral ou por injeção incluem soluções aquosas,xaropes adequadamente flavorizados, suspensões aquosas ouoleosas e emulsões flavorizadas com óleos comestíveis, taiscomo óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo degergelim, óleo de coco ou óleo de amendoim, além deelixires e veículos farmacêuticos similares.
Na preparação de uma composição para administraçãoparenteral, deve ser dada grande atenção ao ajuste datonicidade para reduzir a irritação. Uma composiçãoreconstituível é um sólido estéril embalado em uma formaseca. Prefere-se uma composição reconstituível, pois ela émais estável quando estocada como um sólido seco do que em uma solução pronta para administração imediata. 0 sólidoseco é normalmente embalado era um recipiente"estéril comuma tampa de borracha de butil para assegurar que o sólidoseja mantido em uma faixa de umidade ótima. Um sólido secoreconstituível é formado por métodos de preenchimento a seco, secagem por pulverização ou Iiofilização. Descriçõesdesses métodos podem ser encontradas, por exemplo, emRemington, supra, nas páginas 681-685 e 802-803.
Composições para injeção parenteral são geralmentediluídas, e o componente presente na proporção mais elevada é o veículo. O veículo normalmente não possui atividadeterapêutica eé atóxico, mas apresenta o antígeno quiméricoaos tecidos do eorpo em uma forma apropriada para absorção.A· absorção, normalmente ocorrerá mais rápida e; completamentequando o. antígeno quimérico for apresentado como umasolução aquosa. No entanto, a modificação do veículo comlíquidos miscíveis em água ou a substituição com líquidosmiscíveis em água pode afetar a taxa de absorção.Preferivelmente, o veículo de maior valor para essacomposição é o soro fisiológico (isotônico) . Na preparação das composições que são adequadas para injeção, pode-seutilizar veículos aquosos, veículos miscíveis em água eveículos não aquosos.
Podem ser incluídas nas composições injetáveis destainvenção substâncias adicionais para melhorar ou proteger aqualidade da composição. Dessa forma, uma substânciaadicionada pôde "afetar a solubilidade, dar conforto aoindivíduo, aumentar a estabilidade química, ou proteger apreparação contra" o crescimento de microorganismos. Dessaforma, a composição pode incluir um solubilizante adequado,substâncias que atuem comò antioxidantes e substâncias queatuem como conservantes para evitar o crescimento demicroorganismos. Essas substâncias estarão presentes em umaquantidade que seja apropriada para sua função, mas nãoafetarão de forma adversa a ação da composição. Exemplos deagentes antimicrobianos adequados incluem timerosal,cloreto de bénzetônio, cloreto benzalcônio, fenol, p-hidroxibenzoato de metila e p-hidroxibenzoato de propila.Antioxidantes adequados podem ser encontrados em Rémington,supra, nas páginas 1.015-1.017.
Em certas modalidades, lipossomos, nanocápsulas,micropartículas, partículas lipídicas, vesículas esemelhantes são usados para a administração dos antígenosquiméricos da presente invenção. Em particular, ascomposições da presente invenção podem ser formuladas paraliberação encapsuladas em uma partícula lipídica, umlipossomo, uma vesícula, uma nanosfera ou uma nanopartículaou semelhantes. Alternativamente, as composições dapresente invenção podem ser ligadas, de forma tantocovalente quanto não covalente, à superfície dessesveículos.
As composições administradas através de lipossomostambém podem servir: 1) para direcionar o antígenoquimérico a um tecido em particular como, por exemplo, aotecido Iinfóide; 2) para direcionar seletivamente às APCs;3) para transportar moléculas estimuladoras ou reguladorasadicionais; ou 4) para aumentar a meia-vidá da composiçãode antígeno quimérico. Lipossomos incluem emulsões,espumas, micelas, monocamadas insolúveis, cristaislíquidos, dispersões de fosfolipídeos, camadas lamelares e semelhantes. Nessas preparações, o antígeno quimérico a serliberado é incorporado como parte de um lipossomo,isoladamente ou em conjunto com uma molécula que se liga aum receptor prevalente entre as células linfóides como, porexemplo, anticorpos monoclonais que se ligam ao antígeno CD45, ou com outras composições terapêuticas ouimunogênicas. Dessa forma, lipossomos, tanto preenchidosquanto ornados com um antígeno quimérico da invençãodesejado, podem ser dirigidos ao sítio de célulaslinfóides, onde ós lipossomos então liberam os antígenos quiméricos. Lipossomos para uso de acordo com a invençãosão formados a partir de lipídeos padronizados formadoresde vesículas, que geralmente incluem fosfolipídeos neutrose carregados negativamente e um esterol, por exemplo,colestèrol. A seleção de lipídeos é geralmente guiadaconsiderando-se, por exemplo; o tamanho do lipossomo, alábilidade ácida, é a estabilidade dos lipossomos para avia de administração desejada, por exemplo, na correntesangüínea: São disponíveis vários métodos para a preparaçãode lipossomos [como descrito, por exemplo, em Szoka e cols.(1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467-508; e PatentesU.S. Nos: 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 e 5.019.369]. Umasuspensão de lipossomo contendo um antígeno quimêrico podeser administrada por via intravenosa, local, tópica etc.,em uma dose que varia de acordo com, entre outros, o modode administração, o antígeno quimêrico a ser liberado e oestágio da doença tratada.
Composições para inalação ou insuflação incluemsoluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicosfarmaceuticamente aceitáveis, ou misturas destes, e pós. Ascomposições líquidas ou sólidas podem conter excipientesfarmaceuticamente aceitáveis adequados, como aqui descrito.
As composições podem ser administradas pela via oral òurespiratória nasal para efeito local ou sistêmico.
Composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis podemser nebulizadas com o uso de gases inertes. Às soluçõesnebulizadas podem ser inaladas diretamente a partir de umdispositivo de nebulização, ou o dispositivo de nebulizaçãopode ser anexado a uma tenda de máscara facial, ou a umrespirador de pressão positiva intermitente. Às composiçõesde solução, suspensão ou pó podem ser administradas,preferivelmente por via oral ou nasal, por dispositivo queliberam a formulação de forma adequada.
Outra formulação empregada nos métodos da presenteinvenção emprega dispositivos de liberação transdérmica("emplastros"). Esses emplastros transdérmicos podem serusados para infusão contínua ou descontínua do antígenoquimérico. da presente invenção em quantidades controladas.A construção e o uso de emplastros transdérmicos para aliberação de agentes farmacêuticos são bem conhecidos natécnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. N°: 5.023.252,aqui incorporada por referência. Esses emplastros podem serconstruídos para liberação de agentes farmacêuticoscontínua, pulsátil ou sob demanda.
Adicionalmente, pode ser vantajoso incluir pelo menosum agente terapêutico antiviral ou um quimioterápico, alémdo antígeno quimérico e do excipiente farmacêutico. Essesincluem, sem limitação, interferon-α 2a/b, e agentesantivirais como, por exemplo, ribavirina.
Em algumas modalidades, pode ser desejável incluir nascomposições farmacêuticas da invenção pelo menos umcomponente que prepare linfócitos B ou Iinfócitos T.Lipxdeos foram identificados como agentes capazes depreparar CTL ín vivo. Por exemplo, resíduos de ácidopalmítico' podem ser anexados aos grupos β- e α-amino de umresíduo de lisina e depois ligados, por exemplo, através deum ou mais resíduos de ligação como, por exemplo, Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser, ou semelhantes, a um peptídeoimunogênico. O peptídeo lipidado pode então seradministrado diretamente em uma micela ou partícula,incorporado em um lipossomo, ou emulsif içado em umadjuvante, por exemplo, adjuvante incompleto de Freund. Emuma modalidade preferida, uma composição imunogênicaparticularmente eficaz compreende ácido palmítico anexado agrupos β- e α-amino de Lys, que é anexado por meio deligação, por exemplo, Ser-Ser, ao terminal amino dopeptideo imunogênico.
Como outro exemplo dê preparação por lipideo derespostas de CTL, lipoproteinas de E. coli como, porexemplo, tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina(P3CSS), podem ser usadas para preparar CTL comespecificidade viral guando anexadas de forma covalente aum peptideo apropriado [veja, por exemplo, Deres e cols.(1989) Nature 342: 561]. Os antígenos quiméricos dainvenção £>odem ser acoplados à P3CSS, por exemplo, e olipopeptídeò administrado a um indivíduo para prepararespecificamente uma resposta imunológica ao antígeno-alvo.
Embora as composições da presente invenção nãonecessitem do uso de adjuvantes, eles podem ser usados.Podem ser utilizados vários adjuvantes para aumentar aresposta imunológica, dependendo da espécie do hospedeiro,e eles incluem, sem limitação, adjuvante de Frèunà(completa é incompleta), géis minerais como, por exemplo,hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas, tais comolisolecitina, detergentes, polióis plurônicos, poliânions,peptídeos, emulsões oleosas, hemocianinas keyhole,dinitrofenol, seqüências de polinucleotídeosimunoestimulantes e adjuvantes humanos potencialmenteúteis, tais como BCG (bacilos de Calmette-Guerin) eCorynebacterium parvum. Adjuvantes adicionais também sãobem conhecidos na técnica.F. Métodos de utilização de antígenos quiméricos
Outro aspecto da invenção fornece métodos de aumentoda apresentação de antígeno por APCs, o referido métodocompreendendo a administração, às APCs, de um antígenoquimérico que compreende um domínio de resposta imunológicae um domínio de ligação de alvo, em que o domínio deligação de alvo compreende um fragmento de anticorpo (porexemplo, . um fragmento de anticorpo xenotípico) . Em umamodalidade preferida, as APCs são células dendríticas.
Um aspecto da invenção está relacionado aos métodos deativação de APCs, que compreendem o contato da APC com umantígeno quimérico que compreende um domínio de respostaimunológica e um domínio de ligação de alvo, em que odomínio de ligação de alvo compreende um fragmento deanticorpo (por exemplo, um fragmento de anticorpoxenotípico). Em uma modalidade preferida, a APC é colocadaem contato com o antígeno quimérico in vivo. Em outramodalidade preferida, o contato ocorre em um ser humano.
Ainda outro aspecto da invenção fornece métodos de desenvolvimento de uma resposta imunológica, o referidométodo compreendendo a administração a um animai de umantígeno quimérico que compreende um domínio de respostaimunológica e um domínio de ligação de alvo, em que odomínio de ligação de alvo compreende um fragmento de anticorpo (por exemplo, um fragmento de anticorpoxenotípico). A resposta imunológica pode ser uma respostaimunológica humoral e/ou celular. Em uma modalidadepreferida, a resposta imunológica celular é uma resposta deThl, uma resposta de Th2 e/ou uma resposta de CTL.
Outro aspecto da invenção fornece métodos detratamento de condições passíveis de tratamentoimunológico, que compreendem a administração, a um animalque dele necessita, de um antígeno quimérico que compreendeum domínio de resposta imunológica e um domínio de ligaçãode alvo, em que o domínio de ligação de alvo compreende umfragmento de anticorpo xenotípico. Preferivelmente, acondição imune tratável é uma infecção viral crônica porhepatite C. Para o tratamento de HCV, preferivelmente odomínio de resposta imunológica compreende uma proteínaselecionada do grupo que consiste em uma proteína centraldo HCV (1-191), uma proteína central do HCV (1-177), umaproteína El do HCV, uma proteína E2 do HCV, uma proteínaE1-E2 do HCV, uma proteína NS2 do HCV, uma proteína NS3 doHCV, uma proteína NS4A do HCV, uma proteína NS4B do HCV,uma proteína NS5A do HCV, uma proteína NS5B do HCV, umaproteína ρ7 do HCV, e combinações destas.
Outro aspecto da invenção fornece.métodos de vacinaçãode um animal contra uma infecção viral, que compreendem aadministração ao animal de um antígeno quimérico quecompreende um domínio de resposta imunológica e um domíniode ligação de alvo, em que o domínio de ligação de alvocompreende um fragmento de anticorpo. O método da invençãopode vacinar profilática ou terapeuticamente o animalcontra a infecção viral.
A presente invenção também compreende métodos deutilização das composições da presente invenção para seligar e ativar APCs como, por exemplo, DCs. A presenteinvenção também compreende métodos de utilização dascomposições da presente invenção para a ativação de célulasT. Á presente invenção também compreende um método deliberação de um antígeno a uma célula do sistemaimunológico, por exemplo, uma APC. A presente invençãotambém compreende composições e métodos para a ativação deuma rèsposta imunologica humoral e/ou celular em um animalou um ser humano, o referido método compreendendo aadministração de um ou mais antígenos quiméricos dapresente invenção.
Após clonagem e expressão, o antígeno quimérico éavaliado quanto à sua eficácia na geração de uma respostaimunologica. A avaliação envolve a apresentação do antígenoquimérico às DCs ex vivo ou in vivo. As DCs são avaliadasquanto à ligação e internalização dos antígenos quiméricos.
As DCs naive carregadas com o antígeno quimérico. sãoapresentadas aos linfõcitos T, e avaliadas quanto àprodução de interferon-γ como marcador de uma resposta decélulas T. Especificamente, na situação ex vivo, sãoisolados monócitos do sangue periférico, e: diferenciados emDCs. As DCs se ligam, internalizam, processam e apresentamo antígeno aos linfócitos T autõlogos naive. As células T,que reconhecem os antígenos processados apresentados pelasDCs, são ativadas em células efetoras, por exemplo, célulasT auxiliares ou linfócitos T citotòxicos. A ativação dascélulas T pelas células dendríticas é então avaliada pelamedição de marcadores, por exemplo, níveis de interferon-γ,por um procedimento conhecido [por exemplo, Berlyn, e cols.(2001) Clin. Immunol. 101(3): 276-283]. Um aumento dapercentagem de células T que produzem interferon-γ de pelomenos 50% era relação aos níveis basais prevê eficácia invivo. Em modalidades preferidas, o aumento da percentagem éde pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 100%. Nocaso da situação in vivo, o antígeno quimérico éintroduzido diretamente por via parenteral no hospedeiro,onde células dendríticas e outras células de processamentode antígeno disponíveis possuem a capacidade de interagircom todos os antígenos e processá-los de acordo.
G. Terapia de combinação
Outro aspecto da invenção fornece composições para otratamento de infecções virais, que compreendem um antígenoquimérico e um agente antiviral. A invenção também fornecemétodos de tratamento de infecções virais que compreendem aadministração de um antígeno quimérico e de um agenteantiviral, concomitante ou seqüencialmente.
uso de um antígeno quimérico em combinação com umagente antiviral, por exemplo, um análogo de nucleosídeo,pode ser altamente eficaz na indução de respostassustentadas no tratamento de indivíduos que sofrem dehepatite C crônica. Os mecanismos de ação dos dois agentesusados em combinação podem produzir efeitos sinérgicos notratamento de indivíduos com hepatite C. Por exemplo, umacombinação de um antiviral para HCV como, por exemplo,ribavirina, juntamente còm os antígenos do HCV quiméricosaqui descritos, produzirá uma resposta celular comespecificidade antigênica, bem como uma respostaimunológica humoral e, dessa forma, irá depurar a infecçãopor HCV em indivíduos infectados cronicamente.
H. Métodos de preparação de antígenos quiméricos
Um aspecto da invenção fornece métodos para a produçãode um antígeno quimérico que compreende: (a) o fornecimentode um microorganismo ou linhagem celular célula (oucélula), preferivelmente uma célula eucariótica, maispreferivelmente, um microorganismo ou uma linhagem celular(ou célula) não mamífera, que compreende um polinucleotídeoque codifica um antígeno quimérico; e (b) o cultivo doreferido microorganismo ou linhagem celular (ou célula) sobcondições nas quais o antígeno quimérico é expresso.
Preferivelmente, o microorganismo ou a. linhagem celular (oucélula) é uma levedura, uma linhagem de células (ou célula)de planta ou uma linhagem de células (ou célula) de inseto.Mais preferivelmente, a linhagem celular (ou célula) é umalinhagem de células (ou célula) de inseto selecionada dogrupo que consiste em linhagens celulares ou células Sf9,Sf21, expresSF®, Drosophila 52 e High FiveTM.
A presente invenção utiliza a tecnologia estabelecidadè DNA reCbmbinante para a produção das proteínas de fusãode antígeno(s) selecionado (s) e o TBD que são necessáriosna prática da invenção. Construções de proteínas de fusãosão geradas no nível de DNA pela incorporação de sítios deenzima de restrição específicos, que são explorados naincorporação do fragmento de DNA desejado em vetores deexpressão, e usados para expressar as proteínas de fusãodesejadas em um sistema de expressão heterólogo. Como aquiusado, o termo wvetor" representa plasmídeos que sãocapazes de carregar o DNA, que codificam as proteínasdesejadas. Os vetores de plasmídeo usados na presenteinvenção incluem, sem limitação, pFastBac HTa e os"BACMÍDEOS" recombinantes correspondentes (cromossomosbacterianos artificiais) gerados em E. coli DHlOBac™(Invitrogen). É possível mobilizar o ORF das proteínasdesejadas e produzir outros plasmídeos recombinantes paráexpressão das proteínas em outros sistemas (bacterianos oumamíferos), além do sistema de expressão de baculovírusBac-to-Bac® (Invitrogen), empregado na presente invenção. 0termo "expressão" é usado para significar a transcrição daseqüência de DNA em mRNA, a tradução do transcrito de mRNAna proteína de fusão.
Isso é obtido pela transposição do gene de interesseem bacmídeos, transfectados em células de inseto Sf9 e queproduzem baculovírus recombinantes. Esses são usados parainfectar células de inseto Sf9 ou High Five™, que produzem
a proteína de interesse. As proteínas recombinantesproduzidas podem ter um tag SxHis no terminal N, que éexplorado na purificação das proteínas pelo uso de AgaroseNi-NTA (Qiagen, Hilden, Alemanha). As proteínas tambémpodem ter uma protease rTEV no terminal N ou outro sítio de
clivagem clonado. A proteína purificada por Ni é submetidaà digestão com, por exemplo, protease rTEV (Invitrogen),que também tem um tag 6xHis no terminal N. Após a digestãopor protease, a mistura pode ser carregada em uma coluna deagarose Ni-NTA.," e a. proteína pura pode ser retirada por
lavagem, enquanto os fragmentos marcados com 6xHis se
ligarão à coluna. Esse método de purificação é umprocedimento-padrão, e aqueles habilitados na técnica serãocapazes de compreender a metodologia sem maioresexplicações.
A clonagem e a expressão das seqüências de DNA quecodificam o antígeno viral e o fragmento Fc do anticorpomonoclonal murídeo para gerar o antígeno quimérico podemser obtidas através de duas abordagens. A primeiraabordagem envolve a clonagem das duas proteínas como umaproteína de fusão, enquanto a segunda abordagem envolve aincorporação de "bio-vinculadores" específicos como, porexemplo, biotina ou estreptavidina, em uma das moléculas, apurificação dessas proteínas separadamente, e a geração doantígeno quimérico.
Em uma modalidade exemplar, o hibridoma 2C12, queproduz um anticorpo monoclonal contra o antígeno desuperfície de vírus da Hepatite B, foi usado como fonte doRNA total para a imunoglobulina G murídea. 0 RNA total foiisolado e usado para clonar o fragmento Fc murídeo. Especificamente, o RNA total de uma célula de hibridoma queexpressa IgG murídea é isolado com o uso do reagenteTrizol® (Invitrogen/Gibco BRL, número do catálogo deprodutos 10551-018, 10298-016; uma solução monofásica defenol e isotiocianato de guanidina, como descrito naPatente U.S. N0 5.346.994). O mRNA foi purificado do RNAtotal por cromatografia por afinidade em uma coluna oligo-dT (Invitrogen/Gibco BRL, número do catálogo de produtos15939-010). Um DNA complementar (cDNA) foi produzido com ouso de transcriptase reversa em uma reação em cadeia depolimerase. Foram designados iniciadores deoligonucleotídeos para adicionar sítios de reconhecimentode enzima de restrição únicos pára facilitar a clonagem.Esse cDNA foi clonado com o uso do sistema de expressão debaculovírus Bac-to-Bac® (Invitrogen/Gibco BRL, número docatálogo de produtos 15939-010).
O sistema de baculovírus, preferencialmente, é usadonão apenas porque são produzidas grandes quantidades deproteínas heteróloga:s, mas também porque modificações pós-tradução, tais como fosforilação e glicosilação, dasproteínas ocorrem dentro da célula de inseto infectada.Nesse sistema de expressão, o DNA. pode ser clonado emvetores denominados pFastBacT" (Invitrogen/Gibco BRL,número do catálogo de produtos 15939-010). No sistema Bac-to-Bac®, a geração de recombinantes se baseia na transposição sítio-específica com o transposon bacterianoTn7. O gene de interesse é clonado em pFastBac®, que possuielementos miniTn7 que flanqueiam os sítios de clonagem. 0plasmideo é transformado em Escherichia coli cepa DHIOBacTM (Invitrogen/Gibco BRL, número do catálogo deprodutos 10361-012), que possui um plasmideo shuttle debaculovírus (bacmídeo) que contém o sítio de adesão de Tn7dentro de um gene LacZ. A transposição rompe o gene LacZ,de forma que somente os recombinantes produzem: colôniasbrancas, que são facilmente selecionadas. A vantagem da utilização da transposição em E. coli é que colônias únicascontêm apenas recombinantes e, portanto, não sãonecessários a purificação e o rastreamento da placa. Osbacmídeos recombinantes são transfectados em células deinseto para a geração de baculovírus que expressam proteínas recombinantes.
O sistema de expressão de baculovírus Bac-to-Bac® édisponível comercialmente por Invitrogen, e osprocedimentos usados são como descrito nos protocolos daempresa, disponíveis, por exemplo, em www.invitrogen.com. Ó gene de interesse é clonado, por exemplo, no plasmideodoador pFastBac, e a produção de proteínas recombinantes sebaseia no sistema de expressão de baculovírus Bac-To-Bac™(Invitrogen).
Na etapa seguinte, o plasmideo doadorpFastBac HTa contendo o gene de interesse é usado em uma transposiçãosítio-específica a fim de transferir o gene clonado em umvetor shuttle de baculovlrus (bacmídeo) . Isso é obtido emE. coli cepa .DHlOBacTM. Os plasmídeos recombinantespFastBac HTa com o gene de interesse são transformados emcélulas DHlOBac™ para a transposição, para a geração debacmídeos recombinantes.
Os bacmídeos recombinantes são isolados por protocolospadronizados (Sambrook, supra); a amostra de DNA foi usadapara transfecções.
A fim de produzir baculovlrus, o bacmídeo étransfectado em células de inseto Sf9. Após a transfecção,as células são incubadas sob condições adequadas, e ò meiocontendo baculovlrus é coletado e estocado.
Após a produção de baculovlrus e a expressão deproteína terem sido confirmadas, o estoque de vírus éamplificado para produzir um estoque concentrado dosbaculovlrus que carregam o gene de interesse. É uma práticapadrão na técnica a amplificação do baculovlrus pelo menosduas vezes e, em todos os protocolos aqui descritos, essaprática pádrão também foi seguida. Após uma sègunda rodadade amplificação, a concentração dos baculovlrus geradospode ser quantificada com o uso de um ensaio de placas deacordo com os protocolos descritos pelo fabricante do kit(Invitrogen). A concentração mais adequada do vírus parainfectar as células de inseto e o momento ótimo para aprodução da proteína desejada geralmente também sãoestabelecidos.
DNAs que codificam proteínas de interesse são geradospor PCR com iniciadores de oligonucleotídeos que abrigamsítios de enzima de restrição únicos de plasmídeos quecontêm uma cópia de todo o genoma viral, e são clonados como DNA de Fc como uma proteína de fusão. Essa proteínaquimérica é purificada por cromatografia por afinidade emNi-NTA, lectina, proteína A ou proteína G ou por outrosmétodos padronizados de purificação conhecidos por aqueleshabilitados na técnica.
A segunda abordagem para a ligação do IRD e TBDenvolve a incorporação de "bio-vinculadores" específicoscomo, por exemplo, biotina ou avidina (por exemplo,estreptavidina) , em uma das moléculas, a purificação delasseparadamente, e a geração do antígeno quimérico. Osantígenos virais de interesse são clonados em plasmídeosque controlam a expressão de proteínas pelo promotor debacteriófago T7. O plasmídeo recombinante é então transformado em uma cepa de E. coli, por exemplo,: célulasBL21 (DE3) Códon Plus™ RIL (Stratagene, número do catálogode produtos 23 024 5) , que tem a produção de T7 RNApolimerase regulada pelo repressor de Iac. A T7 RNApolimerase ê altamente especifica para promotores T7 eprocessa bem mais (~8 vezes mais rápido) do que RNApolimerase E. coli do hospedeiro. Quando a produção dé T7RNA polimerase é induzida por isopropiltio-P-D-galactosida(IPTG), a especificidade e a capacidade de processamento daT7 RNA polimerase resultam em um nível elevado detranscrição de genes sob controle do promotor T7. A fim deacoplar as duas proteínas em conjunto, a forte ligaçãoentre biotina e avidina (por exemplo, estreptavidina) éexplorada. Em E. coli, ã enzima BirA catalisa a ligaçãocovalente de biotina e um resíduo definido de lisina em umaseqüência de reconhecimento específica. 0 fragmento Fcmurldeo é expresso no sistema de baculovírus, como descritoacima, como uma proteína de fusão com avidina. Essas duasproteínas podem. ser misturadas para formarem um complexoprotéico dimérico por ligação de biotina-estreptavidina.
A prática da presente invenção emprega, a menos, queindicado . de forma.·. diferente, técnicas convencionais debiologia molecular, microbiologia,. DNA recombinante eimunologia, que estão dentro dos conhecimentos da técnica.Tais técnicas são explicadas em sua totalidade naliteratura. Veja, por exemplo, Sambrook, supra; e Ausubel,supra.
I. Produtos manufaturados e kits
Outro aspecto desta invenção fornece um produtomanufaturado que compreende um recipiente que abriga umacomposição, que compreende um antígeno quimérico, que éadequada para injeção ou recònstituição para injeção emcombinação com instruções impressas que fornecem umadiscussão sobre como administrar a composição por viaparenteral, por exemplo, por via subcutânea, intramuscular,intradérmica, nasal ou intravascular. A composição podeestar contida em qualquer recipiente adequado que nãointerajâ significativamente com a composição, e pode serrotulada com a rotulagem adequada que indica que ela serápara uso parenterali Associadas ao recipiente, pode haver apresença de instruções em um rótulo consistentes com ométodo de tratamento, como aqui descrito anteriormente. 0recipiente que abriga a composição desta invenção pode serum recipiente que possui uma composição líquida adequadapara injeção. O recipiente pode ser adaptado para acessopor uma agulha de seringa. 0 produto manufaturado podeincluir uma agulha e uma seringa apropriadas para injeção,de forma que um paciente, médico, enfermeira ou outroprofissional possa administrar o antígeno quimérico.Alternativamente, a composição pode ser uma composição secaou concentrada contendo uma versão solúvel do antígenoquimérico, a ser combinada ou diluída com um veículo aquosoou não aquoso . para dissolver ou suspender a composição.Alternativamente, o recipiente pode ter uma suspensão, em umlíquido, ou pode ser uma versão insolúvel do sal paracombinação com um veículo no qual a versão insolúvel serásuspensa. Recipientes adequados são discutidos emRemington, supra, páginas 788-789, 805, 850-851 e1. 005-1.014.
O kit da invenção compreenderá tipicamente orecipiente descrito acima e um ou mais outros recipientesque compreendem materiais desejáveis do ponto de vistacomercial e dó usuário, incluindo tampões, diluentes,filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso.Um rótulo pode estar presente no recipiente para indicarque a composição é usada para uma terapia específica ouaplicação não terapêuticá, e também pode indicar instruçõespara uso in vivo ou ex vivo como, por exemplo, aquelesdescritos acimà. Instruções e/ou outras informações tambémpodem ser incluídas em uma bula que será incluída ao kit.
V. EXEMPLOS
Os exemplos não limitantes a seguir fornecem umailustração adicional da invenção.
Exemplo 1. Materiais e métodos
Materiais
o TBD usado nas moléculas de Chimigen3 descritasnestes exemplos (e, por conveniência, denominadas nos"TBD") é derivado do Hibridoma 2C12, que produz um mAbmurídeo específico para HBsAgf e que foi licenciado pelolaboratório Tyrrell através dá : Universidade de Alberta,Edmonton, Alberta, Canadá. O plasmídeo pCV-H77C que contémo DNA que codifica os antígenos do HCV foi obtido dolaboratório Tyrrell na Universidade de Alberta.
O vetor de clonagem pFastBac-HTa, a linhagem decélulas de inseto Sf9, o reagente Cellfectin®, solução salina tamponada com fosfato (PBS), DNA polimerase PlatinumPfx, reagente TRizol, transcriptase reversa de síntese daprimeira fita Superscript, X-gal, isopropil-β-
D-tiogalactopiranosida (IPTG) e soro bovino fetal (FBS)foram adquiridos de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) .
O meio de crescimento e expressão de células de insetoESF 921 foi adquirido de Expression Systems (Woodland, CA,EUA) . As enzimas de restrição EcoR I, Spe I, Hind III, RsrII, Ava II e Not I foram adquiridas de New England Biolabs(Ipswich, MA, EUA).
Os estoques virais foram titulados com o uso do"Expression Systems Baculovirus Titering Assay". IgG2A-PE(BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) foi diluída 1:10 eusada còmò controle de isótipo". A titulação de baculovírusfoi determinada com o uso de aquisição e análise FACS. UmFACSCálibur3 da Becton Dickinson Biosciences (quatro cores,laser duplo) adquiriu as células, e ò programa decomputador CELLQuest Pro3 (BD Biosciences) foi usado paraanalisar os dados. Uma planilha do programa de computadorExcel da Microsoft foi fornecida por Expression Systemspara a inserção de dados e para determinar a titulaçãoviral com base em uma curva-padrão. As purificações foramrealizadas com Ni-NTA Superflow3 (QiagenlHilden, Alemanha)e Toyopearl Super Q3 650C (Tosoh Biosciences, Grove City,OH, EUA)
A solução de acrilamida 30% para a produção dos géispara eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódiopoliacrilamida (SDS PAGE) foi adquirida de Bio-Rad(Hercules, CA, USA) . 0 corante PageBlue3 stain, tampão decarga 5x, ladder de proteína pré-corada PageRuler3 e agenteredutor 20x foram adquiridos de Fermentas (Burlington, ON,Canadá).
Nitrocelulose Hybond3 ECL e o wECL Western Detectionkit" (GE Healthcare) foram usados para Western Blotting.
Tween 20, brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB),anticorpo IgG. anti-camundongo (específico para Fc)conjugado à peroxidase de raiz-forte, anticorpo secundárioanti-camundongo... (específico para Fab) conjugado àperoxidase de raiz-forte, anticorpo secundário de cabraánti-coelho conjugado à peroxidase de raiz-forte e osantibióticos canamicina, ampicilina e gentamicina foramadquiridos de Sigma (St. Louis, MO, EUA).
Os anticorpos policlonais de coelho anti-NS5A, deàabra anti-NS3 e de cabra anti-NS4 e o anticorpo monoclonalde camundongo anti-NS5A foram obtidos de Abcam (Cambridge,MA, EUA) . O anticorpo monoclonal 6xHis conjugado àperoxidase de raiz-forte foi adquirido de Clontech (PaioAlto, CA, EUA).
Cassetes "Slide-a-lyzer3" e kit de ensaio wMicro BCA3"foram adquiridos de Pierce (Rockford, IL, EUA) .
Gel de Glicoproteína "Pro-Q® Emerald 300" e wBlotStain Kit" foram adquiridos de Molecular Probes (Carlsbad,CA, EUA).
Amostras de leucoferese de doadores saudáveis foramadquiridas de SeraCare Life Sciences (Oceanside, CA, EUA).
Dynal Dynabeads3 para o isolamento negativo de célula Tforam adquiridos de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) . MeioAIM V®, que contém L-glutamina, sulfato de estreptomicina(50 pg/ml) e sulfato de gentamicina (10 pg/ml), foi obtidode Invitrogen. Soros de doadores combinados foram obtidosda fração de soro após centrifugação de preparações desangue Ficoll-Hypaque. 0 soro, a 50% em meio AIM V®, foiinativado por aquecimento, dividido em alíquotas e estocadoa -20°C. Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco(PBS) foi obtida de Invitrogen.
Anticorpos monoclonais (mAbs) conjugados com asseguintes especificidades foram obtidos de BD Biosciences(San Diego, CA) : CD64-isotiocianato de fluoresceína (FITC),CD32-R-ficoeritrina (PE), CDl6-PE, CD206-PE-Cy5, CD80-PE,CD8 6-FITC, CD83-PE, CD40-FITC, CDllc-PE, CD14-FITC, CD19-FITC, CD3-FITC, CD3-PE, CD3-aloficocianina (APC), CD8-PE-Cy5, CD4-APC, CD69-FITC, CD69-APC, HLA-ABC-FITC, HLA-DR-PE,IFN-γ-ΡΕ, TNF-a-PE, grB-FITC, pfn-FITC e IgGl decamundongo-biotina. Anti-GxHis biotinilado foi obtido deQiagen (Mississauga, Ontário, Canadá). Anticorpo IgG-biotina anti-coelho de cabra foi obtido de Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA) . mAbs de isótipomurídeo e SA-PE-CyS foram obtidos de BD Biosciences.Isômero misto 5-(e 6-)carboxifluoresceína diacetato,succinimidil éster (5(6)-CFDA, SE; CFSE) foi obtido deInvitrogen.A especificidade de células T aos antigenos foi medidacom o uso de tetrâmeros (Beckman Coulter, Mississauga,Ontário, Canadá) ou pentâmeros (Prolmmune, Springfield, VA)específicos conjugados à PE. Os pentâmeros usados incluíramo peptídeo de HCV NS5A VLSDFKTWL (ID. DE SEQ. N°: 3)/HLA-A2e o peptídeo de HCV NS3 CINGVCWTV (ID. DE SEQ. N° : 4)/HLA-A2. Os tetrâmeros usados incluíram o peptídeo de EBVGLCTLVAML (ID. DE SEQ. N°: 5) /FILA A2, o peptídeo de HCVNS 3 KLVALGINAV (ID. DE SEQ. N°: 6)/HLAA2 e um tetrâmeronegativo de controle (multialélico).
As seguintes citocinas foram adquiridas de R&D Systems(Minneapolis, MN) : interleucina-19 (IL-Ιβ), interleucina-4(IL-4), interleucina-6 (IL-6), fator estimulante de colôniade granulócito macrófago (GM-CSF), fator de necrosetumoral-I (TNF-α), interferon-K (IFN-γ) e interferon-I(IFN-a). As citocinas foram reconstituídas de acordo com asinstruções do fabricante, divididas em alíquotas eestocadas a -70°C. Poli IC foi obtido de Sigmai
O uWave Bioreactor System23/10EH" e "Cellbag ÍOL/O"foram adquiridos de Wave Biotech (Somerset, NJ. , EUA).
Métodos
Construção do plasmídeo de expressãopFastBacHTa-TBD: a construção de plasmídeo original
As seqüências de DNA de IgGl dè camundongo quecodificam aminoácidos da região ChI-Hinge-CH2-CH3 foramgeradas por mRNA isolado do hibridoma 2C12 que produz ummAb contra o antígeno de superfície de HBV (sAg) . 0 mRNAtotal foi isolado com o uso do reagente TRizol, e o cDNA doTBD foi gerado por RT-PCR com o uso de síntese da primeirafita Superscript. Os iniciadores de PCR continhamseqüências vinculadoras que codificam o peptídeo vinculador-SRPQGGGS- (ID. DE SEQ. N°: 1) no terminal 5', um sítio NotI exclusivo na extremidade 51 e um sítio de restrição HindIII exclusivo na extremidade 3'. O cDNA resultante contém(5' Not I)-seqüência vinculadora-parte de ChI (VDKKI; ID.DE SEQ. N0.: 2)-Ch2-Ch3 (3.' Hind III).
Após digestão com.as respectivas enzimas, o fragmentofoi ligado com plasmídeo de vetor de expressão pFastBac-HTausando os mesmos sítios de enzima de restrição. O iniciador5' usado para amplificação por PCR foi (Senso) 5'-TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGGATCCGTGGACAAGAAAATTGTGCC AGG-3 '(ID. DE SEQ. N°: 7) e o iniciador 3' foi (anti-senso) 5'ACGAATCAAGCTTTGCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG-3 1 (ID. DE SEQ. N°:8), que continha os sítios Not I e Hind III,respectivamente. 0 DNA amplificado foi digerido com Not I eHind III, o fragmento purificado por géis de agarose eligado com plasmídeo de vetor de expressão pFastBàc-HTadigerido còm ás mesmas enzimas de restrição, para produziro plasmídeo de expressão pFastBacHTa-TBD. Esse produto foiusado para a expressão da proteína de fusão tag 6xHis-sítiode clivagem de rTEV protease-TBD. A seqüência de DNA e aprecisão do quadro de ' leitura aberta (ORF) foramverificadas por métodos de seqüenciamento padronizados. Aseqüência de nucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 9) do ORF empFástBacHTà-TBD e a seqüência de aminoácidos (ID. DE SEQ.N°: 10) codificada pelo ORF são mostradas na Fig. 2.Construção de pFastBacHTa-gp64
Para secreção, a seqüência sinalizadora da proteínagp64 do vírus de poliedrose nuclear Autographa californica(AcNPV) foi clonada em pFastBac-HTa. Dois oligonucleotídeosforam sintetizados e anelados em conjunto. As seqüências deoligonucleotídeos são:
5 ' -GCATGGTCCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATCTGCAGGTACGGTCCGATGC-3 1 (ID. DE SEQ. N°: 11) e
5 ' -GCATCGGACCGTACCTGCAGATCCGCAAAGGCAGAATGCGCCGCCGCCGCCAAAAGCACATATAAAACAATAGCGCTTACÇATGGACCATGC - 3 1 (ID. DE SEQ.N0: 12) .
Os oligonucleotídeos contêm um sítio Ava II 5' e um sítioRsr II 3'. Após digestão com Ava II e Rsr II, o fragmentofoi clonado no pFastBac-HTa digerido com Rsr II, que colocaa seqüência sinalizadora de gp64 imediatamente acima do tag6xHis, para gerar pFast.BacHTa-gp64 .
Construção do plasmídeo de vetor de expressão da proteínade fusão da vacina Chimigen™ NS5A HCV pFastBacHTa
o DNA que codifica o fragmento de NS5A de HCV foigerado pelo modelo do plasmídeo pCV-H77C com o uso dametodologia de PCR. O iniciador 5' usado para a PCR foi(senso) 5 '-CCGGAATTCTCCGGTTCCTGGCTAAGG-3 1 (ID. DE SEQ. N°:13) contendo o sítio de enzima de restrição EcoR I. 0iniciador de PCR para o terminal 3' foi (anti-senso) 51-GGACTAGTCCGCÁCACGACATCTTCCGT-3' (ID. DE SEQ. N°: 14) 'econtém o sítio da enzima de restrição Spe I." O DNAamplificado foi digerido com as respectivas enzimas, eligado a pFas tBacHTa-TBD para gerar a Vacina Chimigen™NS 5 A HCV do plasmídeo de expressão pFastBacHTa (oupFas tBacHTa-NS5À-TBD) . A seqüência de nucleotídeos (ID. DESEQ. N°: 39) e a seqüência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°:40) codificada pelo ORF em pFastBacHTa-NS5A-TBD sãoapresentadas na Fig. 3. Para NS5A isoladamente, o fragmentoNS5A foi ligado em pFastBac-HTa digerido com EcoR .I/Spe I,para gerar pFastBacHTa-NS5A.
Construção do plasmídeo de expressão da vacina Chimigen™NS5A pFastBacHTa-gp64 para secreção
A fim de clonar a Vacina Chimigen™ . NS 5 A empFastBacHTa-gp64, o plasmídeo pFastBacHTa da : VacinaChimigen™ , NS5A HCV (descrito acima) foi digerido com RsrII e Hind III, e ,o fragmento da Vacina Chimigen™ NS5A foipurificado por eletroforese em gel de agarose. O fragmentoda Vacina Chimigen™ NS5A foi ligado ao plasmídeopFastBacHTa-gp64 digerido com Rsr II e Hind III, para geraro plasmídeo de expressão pFastBacHTa-gp64 da VacinaChimigen™ NS 5 A HCV (pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD) (n° deacesso no IDAC 111006-04). A seqüência de nucleotídeos (ID.DE SEQ. N0 : 41) do ORF em pFastBacHTa-gp64-NS5A-TBD e aseqüência de aminòácidos (ID. DE SEQ. N0 : 52) codificadapelo ORF são mostradas na Fig. 4.
Construção do plasmídeo de expressão pPSC12-NS5A-TBD davacina Chimigen™ para secreção
A fim de facilitar a secreção da molécula da VacinaChimigen™ NS5A, foi realizada a clonagem no plasmídeopPSC12 (Protein Sciences Corporation). Esse plasmídeopossui o peptídeo sinalizador para o gene de quitinase dobaculovirus do vírus Autographica californica da poliedrosenuclear (AcNPV). Foram necessários quatro iniciadores dePCR para clonar um gene de interesse no vetor detransferência. A gene de interesse foi amplificado com ouso de dois iniciadores exclusivos (Iniciadores 1GTTTCTAACGCGTCGTACTACCATCACCATCAC (ID. DE SEQ. N°: 15) e 2CCGGGGTACCTTACAGCCCAGGÀGAGTGGGAGAG (ID. DE SEQ. N°: 16)).Foram necessários. dois iniciadores separados paraamplificar uma região de poliedro acima, que contém opromotor de poliedro acima e a seqüência do peptídeosinalizador (Iniciadores 3 CTGGTAGTTCTTCGGAGTGTG (ID. DESEQ. N° : 17) e 4 GGTAGTACGACGCGTTAGAAACGGCGACCAAC (ID. DESEQ. N°: 18)). Finalmente, .dois iniciadores externos(Iniciadores 3 e 2, seqüências acima) foram usados na PCRde extensão sobreposta crítica. NS5A-TBD foi amplificadopor pFastBacHTa-NS5A-TBD por PCR com o uso do iniciador 1, que contém uma seqüência que se anelaria à extremidade 5'do iniciador 4, e o iniciador 2 que adiciona um sítio Kpn I3' único, para a clonagem no vetor. A região de poliedroacima de pPSC 12 foi amplificada com o iniciador 3 e oiniciador 4, o que permitiu que fosse anelada à extremidade51 do iriiciador 1 durante a PCR de extensão sobreposta.Essa região acima também contém um sítio NgoM IV' único, queé usado para a clonagem no vetor. 0 promotor de poliedroacima, a seqüência do peptídeo sinalizador e o genedesejado foram perfeitamente fundidos pòr PCR de extensãosobreposta com o uso dos iniciadores 2 e 3. 0 produtofundido de comprimento total foi digerido com NgoM IV e" KpnI, e o fragmento resultante foi ligado em um pPSC12digerido identicamente, para gerar pPSC12-NS5Á-TBD. Aseqüência de nucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 42) do ORF empPSC12-NS5A-TBD e a seqüência de aminoácidos (ID. DE SEQ.N°: 53) codificada pelo ORF são mostradas na Fig. 5.Construção do plasmídeo pFastBacHTa da Vacina Chimigen™NS3 HCV
o DNA que codifica NS3 foi gerado por PCR pelo modelodo plasmídeo pCV-H77C dos aminòácidos 1.027 a 1.652 (nt3.420 a 5.294) da poliproteína do HCV com o uso dosiniciadores seguintes. Os 6 aminoácidos finais do terminalC de NS3 não foram incluídos na construção, pois aquelasseqüências são as seqüência-alvo para a atividade de serinaprotease de NS3 . O iniciador do terminal 5' usado foi 5'-CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA-3 ' (ID. DE SEQ. N°: 19) contendoum sítio de restrição Eco RI, e o iniciador do terminal 3'foi 5 * -CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCATGAT-3 ' (ID. DE SEQ.N°: 20) contendo o sítio de restrição Spe I. Uma digestãodupla com Eco RI e Spe I resultou em um produto que foiligado com o plasmídeo pFastBacHTa-TBD para gerarpFastBacHTa NS3-TBD.
Mutagênese do vetor de plasmídeo pFastBacHTa da VacinaChimigen™ NS3 HCV
A clivagem interna da proteína NS3, quando expressa emcélulas de inseto, presumivelmente mediada por protease(s)celular, foi relatada por Shoji e cols. [(1999) Virology254:315-323] como ocorrendo no resíduo de arginina em1.488. PCR de extensão sobreposta (OE) foi usada paira geraruma mutação do aminoácido arginina em alanina e, dessaforma, evitar a clivagem da parte NS3 da proteína NS3 deChimigen3. Dois fragmentos de DNA de NS3 foram gerados peloplasmídeo pFastBacHTa NS3-TBD original. 0 fragmento NS3 51foi gerado com o iniciador 5'-CCGGAATTCGCGCCCATCACGGCGTA-3'(ID. DE SEQ. N°: 19) contendo o sítio de restrição Eco RI,e o iniciador de mutação (contendo a mutação arginina emalanina) 5 ' -CTGCCAGTCCTGCCCGCGCGTTGÀGTCCTGGAG3 ' (ID. DESEQ. N0 : 21) . 0 fragmento de NS3 31 foi gerado com oiniciador 5' S^-GGCÀGGACTGGCAGGGGGAAÍSCCAGGCAT-S1 (ID. DE SEQ. N°: 22) e o iniciador 3' 5'-CCGGACTAGTCGGGCCGACATGCATGTCATGAT-3 ' (ID. DE SEQ. : N°: 20)contendo o sítio de restrição Spe I. PCR OE foi feita comos fragmentos -NS3- 51 e 3'., mais os dois iniciadoresexternos. Uma digestão dupla com Eco RI e Spe I resultou em um. produto que poderia ser ligado com o plasmídeopFastBacHTa-TBD para gerar pFastBacHTa NS3mut-TBD (n° deacesso no IDAC 111006-05). A seqüência de nucleotídeos (ID.DE SEQ. N°: 44) do ORF em pFastBacHTa NS 3 mu t -TBD e aseqüência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 55) codificada pelo ORF são apresentadas na Fig. 7. 0 peso molecularprevisto da proteína é de 98,3 KDa. Para NS3mutisoladamente, o fragmento NS3mut foi isolado por digestãocom EcoR I e Spe I, e clonado em pFastBac-HTa, para gerarpFastBacHTa-NS3mut.
Construção do plasmídeo de vetor pFastBacHTa-gp64 da VacinaChimigen™ NS3mut HCV
0 plasmídeo pFastBacHTa HCV NS3mut-TBD foi digeridocom as enzimas de restrição Rsr li e Hind III, e ofragmento NS3mut-TBD foi clonado em pFastBacHTa-gp64digerido com Rsr II e Hind III, para gerar pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD (n° de acesso no IDAC 11 1 006-02) . Aseqüência de nucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 45) do ORF empFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD e a seqüência de aminoácidos(ID. DE SEQ. N°: 56) codificada pelo ORF são apresentadas na 'Fig. 8. O peso molecular previsto da proteína é de 101,5KDa. Um clone do fragmento NS3mut-TBD mutado similar àqueleusado para fazer ρFas tBacHTa-gp64-NS3mut-TBD (masdesprovido de uma mutação espontânea e que possui outra)também foi ligadò em pFastBacHTa-gp64, para gerar um segundo clone de pFastBacHTa-gp64-NS3mut-TBD. A seqüênciade nucleõtídeos (ID. DE SEQ. N°: 43) do ORF no segundoclone dé pFastBacHTa-gp64-NS3-TBD e a seqüência deaminoácidos. (ID. DE SEQ. N°: 54) codificada pelo ORF sãoapresentadas na Fig. 6.
Construção do plasmídeo de vetor de expressão da proteínade fusão pFastBacHTa de Chimigen™ multiantígenos de HCV
Para fazer ό vetor plasmídeo de multiantígenos de HCV,inicialmente foram Acionadas as seqüências de NS4B-NS5A. Aseqüência de DNA que codifica NS4B a NS5A foi gerada porPCR pelo plasmídeo pCV-H77C, com o uso dos iniciadores 5'-GCGCACTAGTGTCTCAGCACTTACCGTACATC - 3 1 (ID. DE SEQ. N°: 23)para o terminal 5' e 5 *-CGGCGCGGCCGCCCGCAGCACACGACATCTTCCG-3' (ID. DE SEQ. N°: 24) para o terminal 3'. A PCR com essesiniciadores resultou em um produto com sítios de enzima derestrição únicos de um sítio Spe I na extremidade 5' e umsítio Not I na extremidade 3' . 0 produto de PCR foidigerido com Spe I e Not I, e ligado em um pFastBacHTa-gp64digerido com Spe I e Not I, para gerar pFastBacHTa-gp64NS4B-NS5A. A seguir, a porção TBD foi adicionada àconstrução. Os plasmídeos pFastBacHTa-TBD e pFastBacHTa-gp64 NS4B-NS5A foram digeridos com Spe I e Hind III. 0fragmento TBD digerido com Spe I/Hind III foi isolado eligado ao pFastBacHTa-gp64 NS4B-NS5A digerido/ para gerarpFastBacHTa-gp64 NS4B-NS5A-TBD.
Mutagênese do resíduo de serina do sítio ativo dè NS3
Em NS3, a serina do sitio ativo (ser 1.165) foi mutadaem alanina para interromper a atividade de protease. Doisfragmentos NS3 foram criados, com o uso de quatroiniciadores diferentes, dois abrigados e doiscomplementares às extremidades 5' e 3', por PCR OE, compFastBacHTa-gp64 NSBmut-TBD como modelo. O fragmento NS3 5'foi gerado com o uso do iniciador do. terminal 5' (senso)51 -CCGGAATTCGCGÇCCATCACGGCGTA-3 1 (ID. DE SEQ. N°: 19), quecontém, ao sitio da enzima de. restrição Eco RI, e o iniciador da mutação (que contém a mutação ser para ala)(anti-senso) 5 ' -CAACAGCGGACCCCCCGCGGAGCCTTTCAA.GTAG-3 1 (ID.DE SEQ. N0 : 25) . 0 fragmento NS3 3' foi gerado com o uso doiniciador do terminal 5' (senso)5 1GTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGAÇACG-3 ' (ID. DE SEQ. N°: 26) e o iniciador do terminal 3' (anti-senso) 5' —CCGGACTAGTCCGGCCGACATGCATGTCA-3 ' (ID. DE SEQ. N°: 27), quecontém o sitio da enzima de restrição Spe I. 0 NS3 decomprimento total (ser1165 —>ala) foi gerado por OE-PCR apartir dos fragmentos 5' e 3 1 e dos dois iniciadores externos. Ò produto resultante, com mutações em Arg 1.488para Ala e Ser 1.165 para Ala é denominado NS3mutS. Essefragmento foi clonado em pFastBacHTa-gp64, para gerarpFastBacHTagp64 NSSmutS-TBD (n° de acesso no IDAC 111006-001) .
Construção do plasmideo de vetor da proteína de fusãomultiantxgenos pFastBacH,ía-gp64 HCV NS3-NS4B-NS5A
Para a produção de üma construção que possa ser usadapara a expressão da proteína de fúsão HCV NS3mutS-NS4B-NS5,o produto de OÈ-PCR NS3mutS foi digerido com as enzimas de restrição Eco RI e Spe I. 0 NS3mutS digerido foi ligado noplasmideo pFastBacHTa-gp64 NS4B-NS5A-TBD digerido com EcoRI e Spe I, para fazer pFastBacHTa-gp64 NS3-NS4B-NS5A-TBD(ri° de acesso no IDAC 111006-06) , que é o plasmideomultiantigenos de HCV pFastBacHTagp64. A seqüência de nucleotideos (ID. DE SEQ. N°: 46) do ORF em pFastBacHTa-gp64 NS3-NS4B-NS5A-TBD e a seqüência de aminoácidos (ID. DESEQ. N°: 57) codificada pelo ORF são mostradas na Fig. 9.
Construção do plasmídeo de vetor da proteína de fusãomultiantígenos pFastBacHTa-gp64 HCV NS3-NS5A
0 DNA para NS5A HCV e TBD foi gerado por PCR a partirdo modelo pFastBacHTa-gp64 HCV NS3-NS4B-NS5A-TBD. Plasmídeode vetor de expressão da proteína de fusão da VacinaChimigen™. O iniciador 5' para a PCR foi (senso) 5' —GAGGGACTAGTGTCCGGTTCCTGGCTAAGGGAC-3' (ID. DE SEQ. N°: 28)contendo o sítio de reconhecimento para a enzima derestrição Spe I. 0 iniciador de PCR para o terminal 3' foi(anti-senso).51-CCGGTCTAGATTATGATCCTCTAGTACTTCTCGAC-31 (ID.DE SEQ. N°: 29). 0 produto de PCR (NS5A-TBD) foi purificadoem gel e subseqüentemente digerido com as enzimas derestrição Spe I e Hind III. 0 plasmídeo pFasTBacHTa-gp64NS3-NS4B-NS5A-TBD foi digerido com as enzimas de restriçãoSpe I e Hind III, liberando um fragmento que consiste nasseqüências que codificam HCV NS4B-NS5A e o TBD. A estrutura:central do vetor pFastBacHTa-gp64 HCV NS3 resultante foipurificada em gel e ligada ao fragmento NS5A-TBD, paragerar o plasmídeo de expressão pFastBacHTagp64 HCV NS3-NS5AVacina Chimigen™ (pFastBacHTa-gp64-NS3-NS5A-TBD) (n° deacesso no IDAC 111006-03). A seqüência de nucleotídeos (ID.DE SEQ. N°: 47) do ORF em FastBacHTa-gp64-NS3-NS5A-TBD e aseqüência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 58) codificadapelo ORF são mostradas na Fig. 10.
Construção do plasmídeo da proteína de fusão pFastBacHTaHCV core (1-177)-TBD e pFastBacHTa HCV core (1-177)
As seqüências de DNA de core HCV que codificam osaminoácidos 1-177 (nt 342-872) da poliproteína de HCV foramamplificadas por PCR a partir de pCV-H77C com o iniciador5' CGGAATTCATGAGCACGAATCCTAAAC (ID. DE SEQ. N°: 30) e oiniciador 3' GGACTAGTCCGAAGATAGAGAAAGAGC (ID. DE SEQ. N°:31). Os iniciadores usados adicionaram sítios 5' EcoR Ϊ e3' Spè I exclusivos. O produto de PCR foi digerido com EcoR
1e Spe I, e ligado em pFastBacHTa-TBD e pFastBac-HTa7 paragerar a construção da vacina Chimigen™ pFastBacHTa HCVcore (1-177)-TBD e pFastBacHTa HCV core (1-177),respectivamente. A seqüência de nucleotideos (ID. DE SEQ.
N°: 48) do ORF em pFastBacHTa HCV core (1-177)-TBD e aseqüência de aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 59) codificadapelo ORF são mostradas na Fig. 11.
O core HCV (1-177) foi clonado era pFastBacHTa-gp64 epPSC12, a fim de produzir a proteína em uma formasecretada. Para a clonagem em pFastBacHTa-gp64, o fragmentocore HCV (1-177) -TBD foi isolado por pFastBacHTa HCV Core(1-177)-TBD por digestão com Rsr II e Hind III, epFastBacHTa-gp64 digerido clonado identicamente, para gerarpFastBacHTa-gp64 HCV core (1-177)-TBD.
Para a clonagem em pPSC12, foi usado um esquemasimilar, como descrito para NS5ATBD, exceto que o iniciador
2 codifica um sítio Bgl II 3' exclusivo(AGTAAGATCTTTACAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG; ID. DE SEQ. N° : 32). Aconstrução resultante ê pPSC 12-HCV core (1-177)-TBD.Construção do plasmídeo da proteína de fusão pFastBacHTaHCV El-TBD e pFastBacHTa-El
A seqüência de DNA que codifica aminoácidos 192 a 369(914-1452) da poliproteína de HCV foi amplificada a partirde pCV-H77C, com o iniciador 5'CCGGAATTCTACCAAGTGCGCAATTCCT (ID. DE SEQ. N°: 33) e Oiniciador 3* GCGCACTAGTCCCTTCGCCCAGTTCCCCACC (ID. DE SEQ.Nc: 34), que adicionam um sitio EcoR I 5' exclusivo e umsitio Spe I 3' exclusivo. Todo o quadro de leitura abertade El termina no aminoãcido 383, mas a área entre osáminóácidos 370 e 383 é a seqüência sinalizadora para E2 e,portanto, não foi amplificada. O produto de PCR foidigerido com EcoR I e Spe I e ligado em pFastBacHTa-TBDdigerido identicamente, para gerar a construção HCV ElChimigen™ pFastBacHTa-El-TBD. Para expressar somente El, o produto de PCR digerido foi clonado em pFastBac-HTadigerido com EcoR I e Spe I, para gerar pFastBacHTa-El. Aseqüência de nucleotideos (ID. DE SEQ. N°: 49) do ORF empFastBacHTa-El-TBD e a seqüência de aminoácidòs (ID- DESEQ. N°: 60) codificada pelo ORF são mostradas na Fig. 12.
Construção do plasmídeo da proteína de fusão pFastBacHTaE2-TBD e pFastBacHTa-E2
As seqüências de E2 dos aminoácido 384 a 718 (nt1.4 94-2.4 95 da poliproteina de HCV) foram amplificadas porPCR a partir de pCV-H77C, com o iniciador 5' GCGCACTAGTCACCCACGTCACCGGGGGAAATG (ID. 'DE SEQ. N° : 35) e oiniciador 3 ' GCGCGCGGCCGCCCGTACTCCCACTTAATGGC (ID. DE SEQ.N°: 36) , que adicionam um sitio Spe I 5' exclusivo e umsítio Nbt I 3 1 exclusivo. Os aminoácidos 719 a 746 são aseqüência sinalizadora para p7 e, portanto, não foram incluídos na construção. Q produto de PCR foi digerido comSpe I e Not I, e ligado a um pFastBacHTa-TBD digeridoidenticamente, pára gerar a construção de HCV E2 Chimigen™pFastBacHTa E2-TBD. A E2 digerida também foi clonada empFastBac-HTa, para gerar pFastBacHTa-E2 pára a expressão daproteína E2 isoladamente. A seqüência de nucleotideos (ID.DE SEQ. N° : 50) do ORF em pFastBacHTa E2-TBD e a seqüênciade aminoácidos (ID. DE SEQ. N°: 61) codificada pelo ORF sãomostradas na Fig. 13.
Construção do plasmxdeo da proteína de fusão pFastBacHTa-E1-E2-TBD 6 pFastBacHTa5 E1-E2
Uma fusão das proteínas El e Ε2 foi gerada porsubclonagem da seqüência de El em pFastBacHTa-El empFastBacHTa-E2. O plasmídeo pFastBacHTa-El foi digerido comEco RI e Spe I, e o fragmento foi clonado em pFastBacHTa-E2digerido com Eco RI e Spe I, para gerar pFastBacHTa-El-E2.Para fazer a construção E1-E2 Chimigen™, pFastBacHTa-El-E2foi digerido com Eco RI e Not I, e clonado em pFastBacHTa-TBD digerido identicamente, para gerar pFastBacHTa-El-E2-TBD. A seqüência de nucleotídeos (ID. DE SEQ. N°: 51) doORF em pFastBacHTa-El-E2-TBD e a seqüência de aminoácidos(ID. DE 'SEQ'.' N° : 62) codificada pelo ORF são mostradas naFig. 14.
Produção de baculovírus recombinantes no sistema deexpressão Bac-to-Bac®
Transformação de E. coli
Plasmídeos Iigados foram usados para transformar E.coil DH5a, e os plasmídeos foram isolados por protocolospadronizados. A seqüência e os quadros de leitura abertaforam verificados por seqüenciamento e usados para aprodução de baculovírus recombinantes.
Transposição
A geração de recombinantes se baseia no sistema declonagem Bac-To-Bac® (Invitrogen), que utiliza transposiçãosítio-éspecífica com o transposon bacteriano Tn7. Isso éobtido em E. coli cepa DHlOBac. As célulás DHlOBac contêm obacmídeo pMON14272, que confere resistência à canamicina, eum plasmídeo auxiliar (pMON7124) que codifica a transposasee confere resistência à tetraciclina.
O gene de interesse é clonado no plasmídeo pFastBacque possui elementos mini-Tn7 que . flanqueiam os sítios declonagem. O plasmídeo é transformado na cepa DHlOBac de E.coli, que tem um plasmídeo shuttle de baculovírus(bacmídeo) que contém o sítio de adesão de Tn7 dentro de umgene LacZa. A transposição rompe o gene LacZa, de forma quesomente recombinantes produzem colônias brancas e, dessaforma, são facilmente selecionados.
A.vantagem de se usar a transposição em E. coli é quecolônias únicas contêm apenas o recombinante. Os bacmídeosrecombinantes. são isolados com o uso de protocolos deisolamento de plasmídeos padronizados, e são usados para atransfecção em células de inseto, para gerar baculovírusque expressam proteínas recombinantes.
Plasmídeos doadores e vetores pFastBacHTa-gp64 davacina Chimigen™ foram usados para a transposição sítio-específica do gene clonado em üm vetor shuttle debaculovírus (bacmídeo). O plasmídeo recombinantepFastBacHTa-gp64 com o gene de interesse foi transformadoem células DHlOBac para a transposição, para gerarbacmídeos recombinantes. Uma alíquota de 40 μΐ de célulasDHlOBac competentes foi congelada no gelo, os plasmídeosbaseados em pFastBacHTa-gp64 foram adicionados, e atransformação foi realizada por eletroporação. A mistura detransformação foi adicionada a 1 ml de meio SOC, e incubadapor 4 horas a 37°C. As células transformadas foram diluídasserialmente com LB até IO"1 e IO"2, e 100 μΐ de cadadiluição foram plaquéados em placas de ágar LBsuplementadás com canamicina (50 pg/ml), gentamicina (7mg/ml) , tetraciclina (10 pg/ml) , X-gal (200 pg/ml) e IPTG(40 μg/ml), e incubadas por pelo menos 36 horas a 37°C.
A resistência ã gentamicina foi conferida peloplasmídeo pFastBacHTa-gp64, e X-gal e IPTG foram usadospara diferenciar entre colônias brancas (bacmídeosrecombinantes) das colônias azuis (não recombinantes). Ascolônias brancas foram retiradas e inoculadas em 2 ml de LB suplementado com canamicina (50 pg/ml), gentamicina (7μg/ml) e tetraciclina (10 pg/ml) , e incubadas de um diapara o outro a 3 7 0C com agitação. Uma alça estéril foiusada para colher uma amostra de uma pequena quantidade dacultura de um dia para o outro, e a amostra foi espalhada em uma placa de ágar LB fresca suplementada com canamicina(50 pg/ml), gentamicina (7 pg/ml), tetraciclina (10 pg/ml) ,X-gal (100 pg/ml) e IPTG (40 pg/ml) , e incubada por pelomenos 3 6 horas a 370C para confirmar um fenótipo branco.
Bacmídeos recombinantes foram isolados por protocolos padronizados [Sambrook e cols. (2001) Em: "MolecularCloning, A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Press], aamostra de DNA foi dissolvida em 4 0 μΐ de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,1 mM de EDTA) , e usada para transfecções.Transfecção: produção de baculovírus recombinantes
A fim de produzir baculovírus recombinantes, obacmídeo relevante foi transfectado em células de insetoSf 9.' As células SfS (9 χ 10s) foram semeadas em cada poçode uma placa dé cultura de células de 6 poços (poços de 35mm) em 2 ml de ESF 921, e deixou-se que aderissem pòr pelomenos 1 hora a 27°C. As transfecções foram realizadas com ouso do reagente Cellfectin®, com os protocolos fornecidospelo fornecedor , das células Sf9. Após a transfecção, ascélulas foram incubadas a 27°C por 72 horas. O meiocontendo baculovírus foi coletado e estocado a 40C no escuro..
A eficiência .- da transfecção foi verificada poravaliação da produção de DNA baculoviral. 0 DNA debaculovírus isolado foi submetido à PCR para rastrear ogene de interesse inserido. A expressão da proteínaheterõloga nas células foi verificada por SDS-PAGE eWestern blots, com o uso do anticorpo monoclonal conjugadoao tag SxHis-HRP ou anticorpo IgG anti-camundongo(específico para Fc) conjugado â pèroxidase de raiz-fortecomo sonda.
Amplificaçaò do estoque de baculovírus recombinantes
Após a confirmação da geração do baculovírus e daexpressão da proteína desejada, a concentração de vírus foiamplificada para produzir ura estoque concentrado dobaculovírus que carrega o gene de interesse. Em todos os protocolos aqüi descritos, foi seguida a pirática-padrão deamplificação do baculovírus pelo menos duas vezes. Após asegunda rodada de amplificação, a concentração dobaculovírus gerado foi quantificada usandò o ensaio detitulação de baculovírus (Expression Systems). A concentração mais apropriada do vírus para infectar célulasSf9 e o momento ótimo para a produção da proteína desejadatambém foram estabelecidos. Os protocolos para a expressãopara cultura tanto de monocamada quanto dé suspensão decélulas Sf9 foram desenvolvidos de acordo com procedimentos padronizados.Ensaio de titulação de baculovírus
Todos os estoques virais são titulados com autilização do ensaio de titulação de baculovírus daExpression Systems. Os estoques virais foram diluídosserialmente de IO"1 a IO"4. Uma alíquota de 100 μΐ de cadauma das amostras diluídas foi adicionada aos poços de umaplaca de 96 poços Costar Low Attachment3. A seguir, 100 μΐde células Sf9 em uma concentração de 2 χ IO6 células/mlforam adicionados a cada poço, e a placa incubada por 18horas a 27°C em uma incubadora com agitação orbital a 200-250 rpm.
Após a incubação, anticorpo conjugado a gp64-PE foidiluído 1:200, e o controle de isótipo (IgG2A-PE) foidiluído 1:10. A placa foi centrifugada por 3 minutos a1.800 rpm. 0 meio foi removido por inversão da placa, e 50μl do anticorpo conjugado a gp64-PE ou 50 μΐ do controle deisótipo foram adicionados aos poços. A placa foi entãoincubada por 20 minutos a 4°C no escuro.
As células foram lavadas por adição de 150 μl de PBSgelado a cada poço, e centrifugação da placa como descritoacima. A seguir, 200 μl de PBS gelado foram adicionados acada poço, seguidos por outra centrifugação e, finalmente,200 μl de PBS/BSA 0,1% foram adicionados a cada poço parare-suspender as células e transferênciá para tubos de FACSpara análise. 0 controle de isótipo foi usado paraestabelecer limites no citômetro de fluxo de fluorescencia.
A titulação viral foi determinada por inserção na planilhaExcel fornecida da percéntàgem da população de células queforam positivas para expressão, e pela produção de umacurva-padrão com base no vírus de controle.Otimização da expressão de proteínas
A expressão da Proteína Chimigen™ foi otimizada emrelação a uma gama. de MOIs e tempos. Quatro culturas de 50ml de células, Sf9 em ESF 921 foram semeadas a 2 χ IO6células/ml, e infectadas com MOIs de 0,5, 1, 5 e 10, e 1 mlda cultura foi coletado após vários pontos do tempo após ainfecção. As amostras das culturas foram centrifugadas a12.000 χ g por 1 minuto, e o sobrenadante e as célulasseparados. As células e o sobrenadante foram imediatamentepreparados para análise SDS-PAGE. As células foram re-suspensas em 500: μΐ de PBS, e 150 μΐ da suspensão foramadicionados a 40 μΐ de tampão de carga 5x e 10 μΐ de agenteredutor 20x. Além disso, 150 μΓ de sobrenadante forammisturados com 40 μΐ de tampão de carga 5x e 10 μΐ deagente redutor 20x. As amostras foram fervidas por 5minutos, e carregadas em um gel de SDS 12% -PAGE paraanálise Western blot. Á produção de proteínas foi avaliadacomo sendo a melhor para proteína Chimigen™ NS5A a 36horas e em uma MOI de 0,5, para a proteína Chimigen™ NS3 a48 horas' em uma MOI de 2, e para uma proteína Òhimigen™mültiantígenòs a 36 horas em uma MOI de 1,5.Purificação de Vacina Chimigen™ intracelularExpressão em grande escala da Proteína Chimigen™ NS5A epreparação de lisado de células
Cinco litros de cultura de células Sf9 em umadensidade de ~2 χ 10"6 célula/ml em meio ESF 921 foraminfectados com baculovírus em uma MOI de 0,5. Ás célulasforam coletadas -36 horas após o início da infecção, quandoa viabilidadè celular era de ~95%. Tempos de expressão maislongos resultavam no aumento da perda de viabilidadecelular e uma degradação intensa da Proteína Chimigen™NS5A. As células .infectadas foram coletadas porcentrifugação, e estocadas a -80cC até serem usadas.
Péletes congelados de 1 litro de cultura de célulasinfectadas foram re-suspensos rapidamente porturbilhonamento em gelo em 200 . ml de tampão de Iisecontendo uma concentração elevada de Tween 20 (6 M deGuHCl, 50 mM de NaH2PO4, 0,5 M de NaCl, Tween 20 1%, 10. mMde 8-mercaptoetanol, pH 8,0). Foi necessária uma altaconcentração de Tween 20 para uma ligação eficiente daProteína Chimigen™ NS5A à resina Ni-NTA. A suspensão re-suspensa foi sonif içada no gelo 3 χ 1 minuto, comintervalos de 2 minutos entre cada pulso de sonificação. 0lisado sonificado fòi então agitado por 2 horas emtemperatura ambiente. O lisado agitado foi depurado porcentrifugação (~27.Õ00 χ g por 15 minutos a 10°C), e osobreriadante usado para cromatografia por afinidade emsuperflow de Ni-NTA.
Expressão de Proteína Chimigen™ NS3 e preparação de lisadode células
Baculovírus recombinantes que codificam a ProteínaChimigen™ NS3 HCV de multiplicidade padronizada deinfecção (MÓI) foram usados para infectar célulás de insetoSf 9 para expressão de proteínas. As células Sf 9 foramsemeadas em uma densidade de 6 χ IO5 células/ml em 500 mlde meio ESF 921 em um frasco de Erlenmeyer 2 litros. Acultura de células foi incubada a 27,5°C com agitação a 120rpm, até que a densidade celular alcançasse 2-3 χ IO6células/ml. Para a Proteína Chimigen™ NS3 HCV, as célulasforam infectadas em uma MOI de 2 por 48 horas. Uma análiseWestern Blot no lisado de células foi realizada paramonitoramento da expressão da proteína de interesse. Ascélulas foram coletadas por centrifugação a 3.000 rpm(1.593 χ g, JAlO, Beckman Coulter Avanti™ J 25) por 10minutos a 4°C, e pélete de células fresco foi usado para apurificação da proteína recombinante. Alternativamente, ospéletes de células foram re-suspensos com o meiocondicionado, distribuídos em tubos cônicos de 50 ml(cultura de 250 ml de células para cada tubo),centrifugados a 2.200 rpm por 8 minutos a 40C na centrífugaBeckman GS-6R. Os péletes de células foram congeladosrapidamente em nitrogênio líquido, e estocados a -80°C.
Um pélete de células congelado (equivalente a 2 χ 500ml de meio de cultura de células) foi re-suspenso em geloem 200 ml de tampão de Iise gelado (6 M de GuHCl, 150 mM deNaCl, 20 mM de Tris-HCl, pH 8,00) por sonificação por 1minuto, 78 W (ajuste 6,5). A mistura foi transferida parauma proveta de vidro de 250 ml, e sonifiçada quatro vezesmais por 1 minuto, 78 W cada vez, com intervalos deresfriamento de 5 minutos. A mistura foi movida para atemperatura ambiente, e foi adicionado CTAB até umaconcentração final de 1% (p/v). O pH foi verificado eajustado ao pH 8,00, e o lisado foi incubado por 2 horas. Olisado foi ceritriifugado por 30 minutos a 15.000 rpm (27.000xg) a 10°C com o uso do rotor JA 25.50 em uma centrífugaBeckman Avanti J-25, e o sobrenadante foi submetido àcromatografia por afinidade em Ni-NTA.
Expressão em grande escala da Proteína Chimigen™multiantígenos e preparação de lisado de células
Quatro litros de meio ESF 921 foram transferidos paraum Cellbag, que foi aquecido até 27,5°C em um WaveBioreactor System 2/10 EH. Um litro de cultura de célulasSf9 a 6 χ IO6 células/ml foi adicionado ao Cellbag. A bolsafoi então incubada a 27,50C com injeção de ar a 0,3 1 porminuto, e foi girada a 130 rpm. Quando a densidade dascélulas alcançou 2 χ IO6 células/ml, foi inoculadobaculovírus recombinantes em MOI de 1,5. Com 36 horas apósa infecção, a bolsa foi resfriada em gelo e as célulasforam coletadas por centrifugação a 4.500 χ g por 10 minutos a 4 °C. O pélete de células foi suspenso em PBSgelado, e depois transferido para um tubo cônico de 50 ml(pélete de cultura de 300 ml por tubo) . 0 pélete de célulasfoi recuperado, por centrifugação a 2.800 χ g por 15 minutosa 4°C. O pélete foi congeladp imediatamente em nitrogênio liquido, e . estocado em um congelador a -80°C, até serusado.
0 pélete congelado de células Sf9 da cultura de 250 mlfoi suspenso em 2 0 ml de PBS IX, Tween 20 1%, 50 mM de DTT,5 mM de EDTA, pH 8,0, e incubado em gelo por 30 minutos. 0pH do lisado foi ajustado até o pH 12,0 com NaOH, e agitadoem temperatura ambiente por 3 0 minutos. 0 pH foi reduzidoaté 8,0 com HCl, e centrifugado por 30 minutos a 39.191 χg. Ò sobrenàdante foi removido e o pélete foi suspenso em20 ml de PBS 1 X, Tween 20 1%, 10 mM de DTT, 1 mM de EDTA, pH 8,0. O pH foi elevado até 12,0 e reduzido até 8,0,''comodescrito acima. Os sobrenadantes foram reúriidós em pool edialisados contra 20 mM de Tris, Tween 20 0, 05%, 0,1 mM deEDTA, 10 mM de 9-mercaptoetanol, pH 8,0, para uso emcromatografia por exclusão de tamanho e por interação hidrofõbica.Para cromatografia por afinidade em Ni-NTA, o péletecongelado de células Sf9 de cultura de 500 ml foi suspensoem 50 ml de tampão de Iise gelado (6 M de Guanidina-HCl, 50mM de carbonato de sódio, etanol 20%, pH 10). O lisado decélulas foi sonificado cinco vezes em gelo pelo Sonicator3000 (Misonic Inc.) a 80 W por 1 minuto. Foi adicionadoTween 20 no lisado (concentração final de 1%), e o lisadofoi agitado por 2 horas em temperatura ambiente. Osparticulados insolúveis no lisado foram removidos porcentrifugação a 39.191 χ g por 30 minutos a 4 °C, esubmetidos à cromatografia por afinidade em Ni-NTA.
Expressão de Proteína Chimigen™ Core HCV e preparação delisado de células
Chimigen™ core HCV foi expressa em dois sistemas.Virus recombinantes foram gerados com co-transfecção deofpPSC12-HCV core (1-177)-TBD e um genoma linearizado debaculovírus em células Sf 9, purificado e amplificado naplaca. Após otimização, as culturas de Sf9 foram infectadasem uma MOI de 5, e coletadas após 50 horas de incubação a27,50C Vírus recombinantes também foram gerados com o usodo sistema Bac-to-Bac® por transfecção de células DHlOBacde E. coli com pFastBacHTa-gp64 HCV core (1-177)-TBD.Bacmídeos recombinantes foram isolados e usados paratransfectar células Sf9 para a produção de baculovírusrecombinantes. As culturas Sf9 foram infectadas em uma MOIde 5 por 49 horas a 27,5°C, antes de serem coletadas porcentrifugação. Os lisados foram preparados essencialmenteda mesma forma descrita acima para outras ProteínasChimigen™, e submetidos à cromatografia por afinidade emNi-NTA.Cromatografia por afinidade em Ni-NTA
O lisado de células foi carregado em uma colunasuperflow Ni-NTA (10 ml de volume de leito de resina por2,5 1 de pélete de cultura de células) que havia sidoequilibrada com 10 volumes de leito de tampão de Iise. Acoluna foi lavada com um tampão de lavagem contendo. Tween20 % reduzido ,(6 M de GuHCl, 50 mM de NaH2PO4, 0,5 M deNaCl, Tween 20 0, 1%, 10 mM de 9-mercaptoetanol, pH 8,0) atéA28o < 0,01, e depois com o mesmo tampão de lavagem contendo 15 mM de imidazol. A proteína-alvo foi então eluída com 10ml volumes de leito de tampão de eluição (6 M de GuHCl, 50mM de NaH2PO4, 250 mM de imidazol, Tween 20 0,1%, 10 mM de9-mercaptoétanol, pH 8,0) em frações de 1 volume de leito.As frações contendo proteína eluída foram reunidas era pool e dialisadas contra tampão de diálise 3x4 1 (8 M uréia,20 mM de Tris, Tween 20 0,1%, 25 mM de etilenodiamina, .10mM de 9-mercaptoetanol, pH 8,5). Todos os tampões quecontêm uréia foram feitos com uréia deionizada para evitara carbamilação da proteína. A uréia foi deionizada com Amberlite® MB-I (Supelcò, PA, EUA) (10 g/l/hora) e foiadicionado o removedor de cianato etilenodiamina (final demM) ao tampão.Cromatografia de troca iônica
A seguir, a amostra dialisada contendo ProteínaChimigen3 NS5A obtida por cromatografia por afinidade emNi-NTA foi passada através de uma coluna de resináToyòpeárl® Super Q3 (2,5 ml de volume de leito/2,5 1 depélete de cultura de células) que havia sido equilibrada emtampão de diálise. A coluna de troca iônica foi lavada comtampão de lavagem de troca iônica (8 M de uréia, 20 mM deTris, Tween 20 0, 05%, 25 mM de etilenodiamina, 10 mM de 9-mercaptoetanol, pH 8,5) até A28O < 0,01. As proteínas foramentão eluídas pela coluna com 10 volumes de leito de tampãode lavagem contendo concentrações crescentes de sal (75 mM, 150 mM de e 500 mM de NaCl) . Foram coletadas frações de 1volume de leito. A Proteína Chimigen™ NS5A eluiupredominantemente nas frações de 15 0 mM de NaCl. Umaproteína contaminante de peso molecular ligeiramente menoreluiu a 75 mM de NaCl. As frações de proteína eluída foramreunidas em pool e dialisadas imediatamente contra tampãode diálise final (150 mM de NaCl, 10 mM de NaH2PO4, Tween20 0,05%, pH 8,5) a 4°C. Dois litros por diálise, com cincotrocas de tampão de diálise. As proteínas dialisadas foramfiltradas através de um filtro de 0,2 μπι que havia sido pré-umedecido para evitar que as proteínas grudassem a ele.A Proteína Chimigen™ NS5A purificada foi estocada a 4°C.
Para uma purificação adicional da Proteína Chimigen3NS3, umas matriz de Fluxo Rápido CM-Sefarose3 foiequilibrada com 8 M de uréia (deionizada), 25 mM de NaH2PO4, 5 Mm de etilenodiamina, Tween 20 0,05% (v/v), 10mM de DTT, pH 6,50. A proteína foi eluída com o uso de umgradiente linear (0 a 0,6 M) de cloreto de sódio rio mesmotampão, em uma taxa de fluxo de 1 ml/min. As fraçõescontendo the proteína (25-50 mM de NaCl) foram reunidas empool.
A Proteína Chimigen3 multiantígenos contendo amostracapturada pela coluna de Ni-NTA foi ainda purificada poruma coluna de 1 ml HiTrap3 Q XL com o uso do sistemaAKTAexplorer3 100 FPLC. A proteína em tampão de elüição da cromatografia por afinidade em Ni-NTA foi concentrada porum Amicon Ultra-15 (MWCO 30.000 Da), e depois o tampão foitrocado por Tampão A (8 M de uréia, 50 mM.de carbonato desódio, 25 mM fr etilenodiamina, Tween 201%, pH 10) . Aproteína foi carregada em uma coluna HiTrap QTM XL, equilibrada com 50 ml de Tampão A, em uma taxa de fluxo de60 ml/hora. A coluna foi lavada com Tampão A até a A2eo deeluição ficar abaixo de 0,01. As proteínas foram eluídaspor eluição,. em gradiente linear, de Tampão A 100% a TampãoB 100%, (Tampão A com 1 M de cloreto de sódio) em 20volumes de coluna. A Proteína Chimigen™ multiantígenos HCVfoi eluída nas frações de fluxo e em frações eluídas entreTampão B 4 0 e 5 0 % .
Cromatografias por exclusão de tamanho
Superdex3 200 de grau preparatório foi compactado emuma coluna Tricon3 10/300 (1 χ 30 cm, Pharmacia Biotech)sob a pressão de 3 MPa, com o uso de um sistema FPLCAKTAexplorer 100 (GE healthcare) . A coluna foi lavada com100 ml de 6 M de guanidina, 50 mM de carbonato de sódio, pH10. Meio ml do lisado contendo a proteína Chimigen3 multiantígenos foi carregado na coluna Superdex 200. Aproteína foi eluída por taxa de fluxo a 30 ml/hora, e foramcoletadas frações de 0,5 ml. A eluição da proteína foimonitorada pela absorbância a 28 0 nm.Cromatografia por interação hidrofóbica
Fenil-65ÒC Toyopearl® (0,5ml, TOSOH Corp.) foicompactada em uma coluna Poíy-prep (Bio-Rad). A coluna foiequilibrada com 20 ml de tampão de ligação HIC (0,1 M deTris, 2 M de cloreto de sódio, pH 8) . Cloreto de sódio emuma concentração final de 2 M foi adicionado no lisado de0,5 ml contendo a proteína Chiniigen3 multiantígenos, e oextrato foi diluído com. 3,5 ml de Tampão de ligação HIC. Osparticulados insolúveis foram removidos por centrifugação a18.000 rpm (39.191 χ g, por rotor JA25.50, centrífugaBeckman Coluter Avanti™ J-25) por 20 minutos. osobrenadante foi carregado na coluna em uma taxa de fluxode 30 ml/hora por fluxo de gravidade. A coluna foi entãolavada com 10 ml de Tampão de ligação HIC, e a proteína,ligada à coluna, foi eluída com 5 ml de Tampão de eluiçãoHIC (8 M de uréia, 50 mM de Etilenodiamina, Tween 20 0,5%,pH 10, 5) .
Avaliação bioquímica de Proteínas Chimigen™ purificadas
As concentrações de proteínas foram estimadas com ouso do kit do reagente de ensaio de proteína Micro BCA3 emum procedimento de microplaca de acordo com o protocolofornecido pêlo fabricante.
Para análise SDS-PAGE, alíquotas de proteínaspurificadas foram desnaturadas por adição de tampão decarga de proteína 5x e agente redutor 2Ox, e fervidas por 5minutos. As proteínas desnaturadas foram separadas em géisde poliacrilàmida SDS 12%, e os géis foram corados comPageBlue3 sob as condições fornecidas pelo fabricante.
Para análise Western blot, as proteínas foramseparadas por SDÍS : 12%-PAGE, e submetidas ao eletroblotsobre membranas de nitrocelulose Hybond3 ECL3 com o uso deum tampão contendo 48 mM de base Tris, 39 mM de glicina,metanol 20% e 0 ,0375% de SDS. As membranas foram incubadasinicialmente em tampão de bloqueio (leite desnatado 1%,Tween 20 0,1% ém PBS) por 1 hora em temperatura ambiente.Anticorpos para detecção foram diluídos em tampão debloqueio até a concentração desejada. As membranas foramincubadas com os anticorpos diluídos por 1 hora emtemperatura ambiente com mistura constante. Após aincubação com cada anticorpo, a membrana foi lavada trêsvezes com tampão de bloqueio por 10 minutos por lavagem emtemperatura ambiente. A detecção de proteínas foi realizadapor quimioluminescência com o kit de detecção Westernblotting ECL3 e exposição ao filme de raios-X Kodak BiomaxXAR.
Para a detecção qualitativa de glicosilação deproteínas, o Gel de Glicoproteína Pro-Q® Emerald 300 e okit de Colorarão Blot desenvolvido por Molecular Probesforam usados. Esse kit pode ser usado para detecção decarboidratos em proteínas separadas por SDS-PAGE em géis ouem blots. A coloração é compatível com a maioria dascolorações de proteína, total e, se desejado, análise porespectrómetria de massa. É produzido um sinal verdebrilhante-fluorescente quando o corante reage com gruposcarboidrato oxidados por periodato, detectando até mesmo0,5 ng de glicoproteína por banda. 0 corante é umamodificação do ácido periódico e dos métodos de Schiff, e ofabricante declara um aumento de mais de 50 vezes no nívelde sensibilidade. São incluídos no kit padrões de pesomolecular CandyCane™. Os padrões consistem em proteínasglicosiladas e não glicosiladas alternantes, que servemcomo controles positivos e negativos, respectivamente. Apósa SDS-PÂGE da amostra de proteína, o gel foi fixado em MeOH50% e ácido acético 5% de um dia para o outro. 0 gel foilavado duas vezes por 20 minutos em ácido acético glacial3%, seguido por oxidação dé glicano no ácido periódico dasolução oxidante por 3 0 minutos. 0 gel foi lavado trêsvezes por 20 minutos com ácido acético .glacial 3%, seguidopor coloração em ,solução de coloração Pro-Q3 Emerald 300fresca, por ura máximo de 120 minutos no escuro,. Duaslavagens adicionais de 20 minutos em ácido acético glacial3% no escuro são necessárias, antes da formação dasimagens. A excitação/emissão máxima da coloração é de280/530 nm, com melhor visualização a -.300 nm.. ,0 gel foivisualizado e .varrido com o uso de um transiIuminadorGeneGenius (Syngene) e o programa de computadorcorrespondente.
Caracterização imunolõgica de Vacinas Chimigen™
PBMCs humanos (células mononucleares do sangue periférico)
PBMCs foram obtidas por centrifugação por gradienteFicoll-Hypaque de uma preparação de leucoferese de indivíduos não infectados por HCV que possuem o haplótipoHLA-A2 (Biological Specialty Corporation). As PBMCs foramestocadas em nitrogênio líquido a 3 X IO7 células/frascocriògênico em meio de congelamento (soro AB humano 50%,AIM-V® 40% e DMSO 10%).
Isolamento e diferenciação de monócitos em DCs (célulasdendríticas) imaturas
As PBMCs foram cultivadas em placas de cultura detecido de 100 mm (BD Biósciences) por 1 hora a 37°C em meioAIM V® com soro combinado 2,5%. Após cultura, as célulasnão aderentes foram removidas, e a placa lavada com meioAIM V®. As células aderentes foram então cultivadas com 2ml de AIM V®/soro combinado 2,5% contendo IL-4 e GM-CSF(1.000 Ul/ml de cada).
Ligação de Proteínas Chimigen™ HCV às DCs imaturas
DCs imaturas foram obtidas do cultivo de monócitos napresença de IL-4 e GM-CSF por 24-72 horas. Após cultura, ascélulas foram coletadas, lavadas uma vez com meio AIM V®contendo soro combinado 2,5%, seguido por duas lavagens comsolução salina tamponada com fosfato de Dulbecco(Invitrogen) contendo BSA 0,1% (p/v) (PBSB) . As célulasforam usadas para avaliar a ligação e internalização daProteína Chimigen™. 0 fenótipo das DCs imaturas foiavaliado por rotulagem para vários marcadores da superfíciecelular, incluindo CD64, CD32, CD16, CD206, HLA-ABC, HLA-DRi CD14, CDllc, CD86, CD80, CD40, CD83, CD19, CD3 e CD4 .
Para o ensaio de ligação, todas as etapas foramrealizadas a 4°C, com lavagens após as incubações. Ascélulas foram incubadas por 60 minutos em PBSB com váriasconcentrações de Proteína Chimigen™ ou o tampão de diálisecorrespondente (2 χ IO5 células/poço em placas de 96 poçoscom fundo em "V", em um volume de 25 μΐ) . A ligação daproteína foi detectada por incubação das células com IgGlbiotinilado anti-camundongo ou anti-6xHis anticorpo em PBSBpor 20 minutós, seguido por SA-PE-Cy5 por 20 minutos. Ascélulas foram re-suspensas em PBSB contendo paraformaldeído2% (PF). Em experimentos que utilizam Pròteína Chimigen™NS5A, a ligação foi detectada com um anticorpo policlonalde coelho anti-NS5A, IgG-biotina de cabra anti-coelho,combinação SÃ-PE-Cy5. As células foram re-suspensas em PBSBcontendo paraformaldeído 2% (PF) , e a ligação celularavaliada por citometria de fluxo de fluorescência (FFC).Caracterização de receptores de DC para Vacinas Chimigen™com o uso de inibidores de ligação
DCs imaturas foram incubadas por 60 minutos a 40C emPBSB com mAb anti-CD32 (isótipo IgG2b), anti-CD206 (isótipoIgGl) ou mAbs IgG2b ou IgGl de controle de isótipo decamundongo. Subseqüentemente, as células foram incubadascom Vacinas Chimigen™. em PBSB por 60 minutos a 4°C. Apósas lavagens, a ligação às células foi detectada por análiseFFC usando mAb IgGl biotinilado anti-camundongo ou mAbbiotinilado anti-6xHis seguido por SA-PE-Cy5.
Análise por citometria de fItixo de fluorescência (FFC)
As células foram adquiridas com um FACSCaliburadaptado com o programa de computador de aquisição eanálise CellQuest Pro (BD Biosciences). Um limite foiestabelecido na população de células viáveis, comodeterminado pelo perfil de dispersão FSC e SSC, e foramadquiridos > 20.000 eventos. A percentagem de célulaspositivas específicas fói calculada como: (% célulaspositivas na amostra de teste — controle de célulaspositivas) / (100 — % células positivas de controle) χ 100.A intensidade média' de fluorescência (MFI) relativa foideterminada como: MFI da amostra dé teste — MFI da amostrade controle.
Ensaios de apresentação de antígeno (APAs)
APAs foram usados para medir a resposta imünológica decélulas T ao antígeno apresentado por APCs. Os ensaiosquantificam respostas imunológicas funcionais de células Te a habilidade das DCs maduras carregadas de antígeno parainduzir proliferação de células T com especificidadeantigênica. O procedimento inclui a diferenciação demónócitos derivados de PBMC às DCs imaturas, a carga dasDCs imaturas com antígeno (Proteína Chimigen™ ou TT), adiferenciação das DCs imaturas em DCs maduras, e depois ocultivo das DCs maduras carregadas com antígeno junto comcélulas T autõlogas naive. Para ensaios de ativação eproliferação, as células T foram analisadas após 7 dias decultura. Para análise da função e especificidade de célulasT, as células T foram estimuladas por mais duas vezes comDCs maduras carregadas de antígeno, e a produção de IFN-γ,TNF-a, granzima B (grB) e perforina (pfn) avaliada. Aespecificidade de células T aos antígenos foi avaliada comtetrâmeros ou pentâmeros específicos da classe I do MHC.Geração de DCs maduras carregadas de antígenoDCs imaturas foram geradas como descrito acima, eincubadas por 8 horas com antígeno ou tampão (controle). Ascélulas foram então.cultivadas por 16 horas com os agentesde maturação poli IC (20 μg/ml), IL-ΐβ recombinante humano(rh) (10 ng/ml), rhTNF-a (10 ng/ml), rhIL-6 (10 ng/ml),rhIFN-aA (1.000 U/ml) e rhIFN-γ (1000 U/ml). A extensão dematuração das DCs foi avaliada; por análise de fenótipo. Ascélulas foram rotuladas para vários marcadores dasuperfície celular, incluindo CD64, CD32, CDl6, CD205,CD206, CD209, HLA-ABC, HLA-DR, CD14, CDllc, CD86, CD80, CD8 3, CD40, CD19, CD3, CD8, e CD4. As DCs amadurecidascarrègadas de antígeno foram lavadas e cultivadas comcélulas T.
Isolamento de células T derivadas de PBMC humanas (célulasmononucleares do sangue periférico)
Células T foram isoladas de PBMCs por seleção negativacom o uso de um kit de seleção negativa de células T DynalBiotech (Invitrogen) de acordo com o procedimento dofabricante. Foram usados soros combinados no lugar de BSA eFBS. O fenótipo das células isoladas foi avaliado porrotulagem de fenótipo para diversos marcadores celulares.Células T (células CD3+) compreenderam mais de 98% dapopulação isolada. As células T foram rotuladas com CFSE(veja abaiko) ou adicionadas diretamente à cultura decélulas com DCs.
Rotulagem com CFSE de células T
Células T recentemente isoladas (1-5 χ IO7 células)foram suspensas em SOO μΐ de PBSB, e misturadas com 500 μΐdè uma ' solução dè estoque de trabalho recentementepreparada de 10 pg/ml de CFSE. Após uma incubação por 10minutos a 37°C, as células foram lavadas intensamente comsorc contendo meio (AIM V®/soro combinado 10%) para aremoção de CFSE não incorporado. A rotulagem com CFSE decélulas T foi confirmada por FFC.Cultura de células T derivadas de PBMC humana
As células T foram incubadas com DCs madurascarregadas de antígeno em proporções de 1-20 χ IO4 célulasT para 1-5 χ IO4 DCs por poço em AIM V®/soro combinado 25%.Para os experimentos APA de ativação e proliferação decélulas T, as células T foram coletadas após 4 dias e 7dias de cultura (veja abaixo) . Para os experimentos APA defunção e especificidade de células T, as células T foramcultivadas por 7 dias, e depois re-estimuladas còm DCsmaduras carregadas de antígeno e cultivadas por mais 7dias. As células T cultivadas pôr 14 dias foram entãodivididas em dois grupos (placa de citocina intracelular(ICC) e placa de tetrâmero), e estimuladas uma terceira vezcom DCs carregadas de antígeno. Brefeldiria Á (BDBiosciences) a 1 pg/ml foi adicionada aos poços da placa deICC IFN-γ, e as células cultivadas por 6 horas. Â expressãode IFN-γ, TNF-ά, grB e pfn foi. avaliada como apresentadoabaixo. A análise do tetrâmero foi realizada cinco a seisdias após o estímulo, como apresentado abaixo.Análise de ativação e proliferação de células T
Para o APA de ativação/proliferação, células T foramcoletadas após 4 ou 7 dias de cultura com DCs carregadas deantígeno. As células T foram avaliadas quanto à expressãode CD6 9 (marcador de ativação inicial) e intensidade deCFSE (grau de proliferação). As células coletadas foramrotuladas com anti-CD3-PE, anti-CD8-PE-Cy5 e anti-CD69-APC.Com o uso de amostras de controle de tampão, foiidentificada a população de células T que não se submeterama qualquer duplicação. Essa população estava rotulada ,comum grau elevado de fluorescência detectado no canal FLl-, efoi designada CFSEhl. As populações de células que foramsubmetidas á uma divisão tinham metade da MFI da populaçãoCFSEhl. Do mesmo modo, as populações que foram submetidas aduás divisões tinham aproximadamente 25% (4 vezes menos) daMFI dá população CFSEhl. As células com uma fluorescênciade CFSE abaixo da fluorescência de CFSEhl foram designadasCFSEl0. Algumas populações de células tinham quase af luorescência de fundo do canal FLl, e poderiam serdesignadas CFSE- (CFSE negativas). No entanto, para asfinalidades dos experimentos aqui apresentados, as célulasT foram considerádas CFSEhl (sem divisões celulares) ouCFSEl0 (pelo menos uma divisão celular).
A ativação de célula T foi quantificada por avaliaçãoda expressão de CD69. Em alguns experimentos, blastos decélulas T foram quantificados por limitação da população decélulas T CD3+ de alta intensidade FSC e SSC. Dessa forma,o número relativo de células blásticas em uma população decélulas foi expresso (para esses estudos) como a proporçãode células com um maior diâmetro (FSC-hi) e com maiorcomplexidade celular (SSChl) , comparadas com as pequenascélulas em repouso (GO) na população.
Detecção de IFN-γ, TNF-α, grB e pfn intracelulares
A produção de IFN-y e TNF-a e a expressão da serinaprotease granzima B (grB) [Lobe e cols. (1986) Science 232:858-861], além da proteína de formação de poros perforina(pfn) [Hameed e cols. (1992) Am. J. Pathol. 140: 1.025-1.030], foram quantificadas com o uso de um protocolo-padrão de ICC (citocinas intracelulares) (BD Biosciences).Resumidamente, esse consistia na rotulagem das células commAbs conjugados a fluorocromo específico para detecção deCD3 (anti-CD3- APC) e CD8 (anti-CD8-PE-Cy5) , seguido porfixação e permeabilização. As amostras celulares foramentão divididas em duas amostras, uma das quais foiincubada com anticorpo anti-IFN-γ-ΡΕ e anticorpo anti-grB-FITC, e a outra com anti-TNF-α-ΡΕ e anti-perforina-FITC. Namédia, entre 20.000-100.000 células por amostra foramadquiridas com o uso de um FACSCalibur BD.
Análise de tetrâmeros e pentâmeros
As células T foram marcadas com anticorpos anti-CD8-PE-Cy5, anti-CD4-APC e anti-CD69-FITC, e um dos seguintestetrâmeros iTag™ conjugados à PE (Beckman Coulter) oupentâmeros (ProImmune) : NS5A HCV (VLSDFKTWL; ID. DE SEQ.N0 : 3) HLA-A*0201, EBV (GLCTLVAML; ID. DE SEQ. N0: 5) HLA-A*0201, peptídeo NS3 HCV (CINGVCWTV; ID. DE SEQ. N0 : 4)HLA-A* 02 01, peptídeo NS3 HCV (KLVALGINAV; ID . DE SEQ. N°:6) HLAA* 020, e um tetrâmero negativo de controle(multialélico). Aproximadamente 100.000 células foramadquiridás com o uso do FACSCalibur.
Análise da ligação, internalização e processamento daProteína Chimigen™ pór microscopia confocal
A ligação, a internalização è o processamento da Proteína Chimigen™ por DCs imaturas foram estudados com ouso de microscopia confocal. As DCs imaturas usadas nessesestudos foram obtidas por diferenciação de monócitosderivados de PBMCs aderentes por 2 dias na presença de GM-CSF e IL-4 em meio AIM V® contendo soro combinado do doador2,5%. No 2° dia, as DCs imaturas foram transferidas paralâminas com câmaras e incubadas por mais um dia antes deserem utilizadas. O 3 o dia foi escolhido como umcompromisso entre as células que possuem os receptores dasuperfície celular e morfologia apropriados.
Para estudar a ligação da Proteína Chimigen™ àsuperfícies das DCs, as células foram incubadas com'5 pg/mlde Proteína Chimigen™ ou com apenas tampão como controlenegativo em PBSB a 4°C por 1 hora. Após 1 hora, as célulasforam lavàdas com PBSB e depois rotuladas com anticorpo IgGl anti-camundongo biotiniládo, seguido poréstreptavidina AlexaFluor® 546. Foram realizadas lavagenscom PBSB entre cada etapa. Após rotulagem e lavagém, ascélulas foram fixadas por 10 minutos a 4°C comparaformaldeído 4% (feito em PBSB). As lâminas foram entãomontadas com reâgente antifade SIowFade® Gold com 4',6-diàmidino-2-fenilindol, dicloridrato (DAPI; Invitrogen) eas lamínülas foram lacradas sobre as lâminas com esmalte deunha.
A internalização da proteína Chimigen™ (5 pg/ml) por DCs foi estudada incubando-se diretamente as células emmeio contendo Proteína Chimigen™ a 37°C (CO2 a 7%) ourotulando-se primeiro os receptores de superfície á 40C emPBSB, removendo-se por lavagem a proteína não ligada, eentão estudando-se a captação da proteína ligada aoreceptor ao longo do tempo (0 minuto, 15 minutos, 60minutos e 240 minutos) a 37°C (CO2 7%) em meio AIM V®/sorocombinado 2,5%. As células incubadas a 37°C foram lavadascom PBSB, e depois fixadas e permeabilizãdas por 10 minutoscom solução Cytofix/Cytoperm™ de BD Biosciences. Ascélulas foram então lavadas e rotuladas (1 hora) combiotina-IgGl anti-camundongo em solução Perm/Wash™ de BDBiosciences, seguido por rotulagem com estreptavidina AlexaFluor® 54 6. A co-rotulagem com outros anticorpos foirealizada, quando necessário. Após a lavagem final dascé^las, as lâminas foram montadas como descrito acima.
Para confirmar que a Proteína Chimigen™ estavaendocitosadá, foram realizados experimentos pulse-chase.DCs imaturas foram pulsadas com Proteína Chimigen™ (5pg/ml) por 3 0 minutos no gelo. As células foram lavadas comPBSB e marcadas em meio AIMV®/soro combinado 2,5%, semProteína Chimigen™, e incubadas a 37°C (CO2 7%) por 15minutos. As células pulse-chased foram lavadas com PBSB,fixadas com paraformaldeído 4% é rotuladas com anticorpo deMHC da Classe II para rotular somente a membranaplasmática. Para determinar se a Proteína Chimigen™ estápresente nos endossomos, as células rotuladas na membranaplasmática foram então fixadas e permeabilizadas por 10minutos com solução Cytbfix/CytopermTw de BD Bisosciences.Após lavagem com BD Perm/Wash™, a Proteína Chimigen™ foidetectada com IgGi anti-camundongo biotina/estreptavidina,como descrito acima.
Para estudos de macropinocitose> FITC Dextrana (pesomolecular 70.000, aniônica, fixável em lisina, Invitrogen)foi usada como marcador de fase de fluido a 5 mg/ml em meio AIM V®/soro combinado 2,5% com ou sem a Proteína Chimigen™(5 pg/ml).
Pára estudar a endocitose mediada por receptor,conjugado de transferrina Alexa Fluor® 488 (Invitrogen) foiusado a 2 0 pg/ml em PBSB contendo Proteína Chimigen™ (5 pg/ml). Lactacistina (Sigma) foi usada tanto como inibidorde cisteína protease quanto como inibidor de proteossoma(concentração final de 5 pg/ml).
Avaliação de respostas imunes em modelos animais in vivo
Esses estudos usam duas espécies endogâmicas de animais de laboratório (camundongo e rato) e uma espécie deanimal out-bred de grande porte (leitão). Em particular,são usados camundongos BALB/c (6-8 semánas de idade, deCharles River Laboratories), ratos Wistar (4-6 semanas deidade, de Charles River Laboratories) e leitões híbridos (4-6 semanas de idade, de "Prairie Swine Center",Universidade de Saskatchewan). 0 estudo determina asrespostas imunológicas e a eficácia protetora da ProteínaChimigen™. :
Avaliação de segurança
As Proteínas Chimigen™ HCV são administradas por viasubcutâriea (s.c.) ou intradèrmica (i.d.). O protocolo e asdoses a seguir são usados para injeções. Os animais sãoimunizados quatro vezes, no dia 0, no "14° dia,'28° dia e no42° dia, a cada duas semanas, s.c. ou i.d. Para injeções s.c. é' i.d'em camundongos, uma dose de 0,1 pg, 1 pg ou 10127/167
pg/camundongo é usada.
As doses para a imunização de ratos serão de 0,15 pg,1,5 pg ou 15 pg/rato, e para leitões são 0,2 pg, 2 pg ou 20pg/leitão.
São coletadas amostras de sangue pré-imunização (Iodia) e 7 dias após cada injeção (7o, 21°, 35°, 49° dias)para análise da quantidade de anticorpos específicos, alémde proporções IgGl/IgG2a por técnicas de ELISA.
Os animais são sacrificados duas semanas após aimunização final. Os perfis de segurança das ProteínasChimigen™ HCV são avaliados por exame físico dos animaispelo menos três vezes por semana após a imunização. Esseinclui peso corporal e observação de eventos adversos. Paratoxicologia sistêmica, as amostras de sangue coletadas emintervalos regulares são usadas para monitorar alteraçõesna bioquímica do soro, incluindo os níveis de aspartatoaminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) .Além disso, no final dos experimentos, tecidos coletados dobaço, fígado, rim, coração, pulmão, músculo e cérebro nomomento da riecropsia são fixados em formalina 10%tamponada, è embebidos em parafina para análise futura dealterações patológicas potenciais. Animais com idadespareadas são usados como controles.
Respostas imunes às Proteínas Chimigen™
Proteínas Chimigen™ supostamente induzem fortesréspostas imunológicas celulares ehumorais. São realizadostestes em animais para determinar as respostas imunológicasdo hospedeiro às vacinas HCV Chimigen™ em leitões.Proteínas Chimigen™ core, NS5Â, NS3 e multiantígenos sãousadas para esses estudos. Na primeira rodada, as respostasimunológicas às Proteínas Chimigen™ HCV são avaliadas. Asproteínas são administradas por via s.c. e i.d., comodescrito acima.
Esplenócitos de camundongos ou ratos e célulasmononucieares do sangue periférico (PBMCs) de leitões sãousados para determinar a quantidade e a qualidade dasrespostas imunológicas às proteínas Chimigen™ HCV,seguindo as vias de administração s.c. e i.d, como. descritoabaixo. Esses experimentos nos permitem determinar quaisdas Vacinas Chimigen™ e das vias de administraçãoinduzirão a resposta imunológica mais forte. A liberaçãodirecionada ao alvo das proteínas Chimigen™ HCV poderiadespertar uma potente resposta imunológica com tendência aThl, além de forte resposta humoral. Estudos de VIDO sobrevacinas para HCV demonstraram que a preparação com vacinasde DNA seguida por reforço com proteína pode induzir fortesrespostas imunológicas equilibradas Thl/Th2 [Yu e cols.(2004) J. Gen. Virol. 85: 533-1.543] .
Avaliação das respostas imunológicas
i) Respostas de anticorpo. A presença de anticorposespecíficos para ò antígeno de HCV é determinada por ELISApara testar a IgG total, bem como os níveis de anticorpoIgGl e IgG2a. Os níveis de IgG demonstram a quantidade dasrespostas imunológicas, enquanto os níveis relativos deIgGl e IgG2a demonstram a qualidade (Thl ou Th2) dasrespostas imunológicas. Esses experimentos são realizadoscom o uso de protocolos; estabelecidos.
ii) Ensaios de proliferação de linfôcitos.Esplenócitos de camundongos ou ratos e célulasmononucieares do sangue periférico (PBMCs) de leitões sãoestimulados com antígénos do HCV in vitro. As respostasproliferativas são medidas por incorporação de [metil-3H]timidina no DNA de células em divisão.
iii) Ensaios de citocina ELISPÓT. Para confirmar aindamais a quálidade das respostas imunológicas, o número decélulas secretoras de interferon-γ e interleucina-4 emesplenócitos (camundongò e rato) ou PBMCs (leitão) édeterminado em ensaios ELISPOT após estímulo com antígénosdo HCV de acordo com nosso protocolo estabelecido.
Imunidade antiviral protetora induzida por ProteínasChimigen™ HCV
O HCV possui um número muito limitado de hospedeiros.Ele se replica somente em seres humanos e chimpanzés. oataque de animais vacinados com HCV vivo não é prático, umavez que chimpanzés são caros e possuem um fornecimentolimitado. No entanto, o ataque com vírus recombinante davacínia que codifica um aritígeno do HCV após vacinação é ummodelo alternativo para avaliação da habilidade protetorainduzida por vacinas profiláticas de HCV em modelosanimais. As Proteínas Chimigen™, individualmente ou comocombinações, são usadas para imunizar os animais. Paraavaliar a imunidade protetora induzida' após as vacinaçõés,os animais são atacados por via intraperitoneal por vírusrecombinante da vacínia que codificam ò mesmo antígeno doHCV que as Proteínas Chimigen3 relevantes duas semanas apóso término da vacinação programada com o uso de umaestratégia predeterminada. As doses de ataque serão de 1 X10^7 unidades de formação de placas (PFUs) para cámundongos,2 X 10^7 PPUs para ratos, e 1 X 10^9 PFUs pará leitões. Cincodias mais tarde, os animais serão sacrificados, e astitulações do vírus da vacínia serão determinadas porensaios de. placas de acordo com o protocolo estabelecido.Identificação do(s) candidato(s) mais adequado(s) paravacinas terapêuticas e profiláticas de HCV
Vacinas terapêuticas se baseiam em proteínas, nãoestruturais do vírus da HCV (por exemplo, NS5A, NS3),enquanto as vacinas prof iláticas se baseiam em proteínasestruturais (por exemplo, El, E2), além de proteínas nãoestruturais. Uma combinação de uma ou mais das VacinasChimigen™ é usada tanto nos ensaios de apresentação deantígeno ex vivo de DC/célula T quanto nos modelos animais,e os resultados imunológicos finais são avaliados.
Os protocolos de imunização, bem como a via deadministração das Vacinas Chimigen™ para usos terapêuticose profiláticos, estão atualmente sendo estudados. Asrespostas imunológicas são avaliadas por medição dos níveisde anticorpos, proliferação de linfõcitos e produção decitocina. A imunidade antiviral protetora induzida porcandidatos de Vacina Chimigen™ HCV profilática também seráavaliada em experimentos de ataque, como descrito acima.
Exemplo 2. Resultados com Proteína Chimigen3 NS5AProtèína Chimigen™ NS5A foi purificada e caracterizada
A proteína Chimigen™ NS5A purificada migrou por SDS-8%PAGE como uma banda de 105 kDA, embora o peso molecularprevisto da proteína seja de ~81 KDa. A discrepância entreos pesos moleculares observados e previstos pode resultar,em parte, do alto teor de prolina (-11%), da glicosilação,e de outra modificação pós-tradução possível da proteína. Aproteína purificada foi detectada com anticorpos contracamundongo IgGl Fc, tag 6xHis e NS5A. A análise MS/MS ID(Espectrometria de Massa) na proteína purificada (corte dabanda do gel) gerou hits significativos para NS5A, cadeiapesada de IgGl- de camundongo e poliproteína de HCV,indicando que era, na verdade, a Proteína Chimigen™ NS 5A.
A Proteína .Chimigen™ NS5A purificada foi separada em umgel SDS 8%, e corada para glicòsilação com o uso do Gel deGlicoproteína Pro-Q® Emeràld 3 00 e do Kit de. ColoraçãoBlot, e detectada por iluminação UV. Esse procedimentomostrou glicosilação da Proteína Chimigen™ NS 5 A purificada.
Proteína Chimigen™ NS5A se liga às DCs imaturas
A Proteína Chimigen™ NS5A foi examinada quanto à suahabilidade para se ligar às DCs imaturas. As células foramincubadas na presença e ausência de várias concentrações deProteína Chimigen™ NS5A por 1 hora a 4°C. A vacina ligadafoi detectada com mAb IgGl biotinilado anti-camundongo eSA-PE-CyS. A percèntagem de células que se ligam à vacina(% de células positivas) e a quantidade relativa deproteína ligada (MFI) foram determinadas por citometria de fluxo (Fig. 15) . Com a Proteína Chimigen™ NS5A a 4-50pg/ml, a maior parte das DCs era positiva para a ligação, ehavia um aumento dose-dependente na quantidade de proteínaligada (Figs. 15 e 16) . Ã ligação da proteína não era muitomaior a 20 pg/ml, comparada com 50 pg/ml, indicando que a ligação ás DCs imaturas era saturável.
A MFI mais elevada da ligação observada sugere que aProteína Chimigen™ NS 5 A se liga muito eficazmente e emníveis elevados às DCs imaturas; o fato de a ligação a 40Cser saturável sugere que o processo é mediado por receptor. A ligação também era muito rápida, com proteína ligadadetectada após 5 minutos de incubação a 4°C, com uma MFI deligação de aproximadamente metade daqμela observada apósincubação por 1 hora (dados não mostrados).
Proteína Chimigen™ NS5A se liga aos receptores específicosem DCs imaturas
Por causa do fragmento Fc que contém, prevê-se que aProteína Chimigen™ NS5A se ligue por meio de sua regiãoTBD a CD32 (FcyRII) em DCs imaturas. Além disso, em funçãode sua glicosilação de manose, prevê-se que a ProteínaChimigen™ NS5A se ligue aos receptores de lectina do tipoC como, por exemplo, CD2 06 (MMR). Para determinar aespecificidade de ligação da vacina candidata, DCs imaturasforam incubadas com Proteína Chimigen™ NS5A na presença demAbs de bloqueio anti-ÇD32 e/ou anti-CD206.
DCs imaturas foram incubadas com controle de tampão ou5 pg/mi de mAb de controle de isótipo, mAb anti-CD32, mAbanti-CD206 òu anti-CD32 e anti-CD206 por 1 hora a 4°C,antes da incubação com Proteína Chimigen™ NS5A por 1 horaa 4°C. A Proteína Chimigen™ NS5A ligada foi detectada commAb biotinilado anti-6xHis seguido por SA-PE-Cy5. mAbs decontrole de isótopó (IgGl e IgG2b murídeas) não inibiram aligação, comparados com controle de tampão. No entanto, emcomparação com controle de tampão, tanto anti-CD32 quantoanti-CD206 inibiram a ligação por aproximadamente 60% e40%, respectivamente.
A adição de ambos os mAbs inibiu ainda mais a ligaçãode Proteína Chimigen™ NS5A, resultando em uma inibição de80%. Esses dados indicam um papel tanto para CD32 quantopara CD206 na ligação de Proteína Chimigen™ NS5A. Pormicroscopia confocal, as células incubadas com ProteínaChimigen™ NS5A a 40C mostraram uma rotulagem intensa emsua superfície, comparada com controles somente de tampãp,indicando que a Proteína Chimigen™ se ligou à superfíciecelular.
A internalização da Proteína Chimigen™ NS5A por DCsimaturas foi avaliada a 37°C. DCs imaturas incubadas comProteína Chimigen™ a 370C por 1 hora mostraram um padrãopuntiforme de rotulagem, freqüentemente nas vizinhanças donúcleo, sugerindo que a Proteína Chimigen™ estavainternalizada e havia muito pouca, ou nenhuma, rotulagem desuperfície.
DCs são capazes de captação de antígeno por meio devárias vias, que incluem fagocitose, macropinocitose,endocitose mediada por clatrina, e endocitose nãoclatrina/CaveoIae. Supostamente, a macropinocitose é umprocesso constitutivo em DCs imaturas (Trombetta e Mellman2005) . A habilidade de DCs imaturas para . internalizar aProteína Chimigen™ NS5A por macropinocitose a 37°C foiavaliada com d uso do marcador de macropinocitose FITCdèxtrana [Hewlett e cols. (1994) J. Cell Biology 124: 68 9-703] . Após incubação das DCs imaturas por 15 minutos e 60minutos com a Proteína Chimigen™ e FITC dèxtrana, foramobservadas estruturas semelhantes a vesículas, quecontinham tanto proteína quanto FITC dèxtrana, indicandoque, a 37C, a Proteína Chimigen™ pode ser recolhida pormacropinocitosè. Deve-se também observar que FITC Dèxtranapode se ligar aos receptores de manose em macrófagos(CD2 06) e, dessa forma, alguns dos endossomos que contêmProteína Chimigen™ e FITC Dextraria podem ter surgidos porendocitose mediada por receptor.O papel da endocitose mediada por receptor na captaçãode Proteína Chimigen™ foi estudado por experimentos pulse -cha.se. DCs imaturas foram pulsadas com Proteína Chimigen™rotulada por fluorescência a 4°C, lavadas e incubadas por15 minutos a 37°C. As células foram fixadas,permeabilizadas e rotuladas com anticorpos, para detectar aProteína Chimigen™, bem como o receptor de transferrina. 0receptor de transferrina é recolhido por endocitose mediadapor receptor e depois reciclado de volta para a membranaplasmática por endossomos iniciais. A 4°C, a ProteínaChimigen™ NS5A se ligou à superfície das células, enquantoo receptor de transferrina estava presentepredominantemente dentro das células. Ao mudar para 37°C,foi observada a formação de endossomos, alguns dos quaiscontinham a Proteína Chimigen™ e. os receptores detransferrina. O grande número de receptores de transferrinaintracelulares preexistentes no início do experimento (4°C)é provavelmente responsável por muitos endossomos quecontêm transferrina não co-localizados com a Proteína Chimigen™.
A captação da ' Proteína Chimigen™ NS5A por DCs e suaco-localização com transferrina, por co-rotulagem com umanticorpo contra o receptor de transferrina, também foiavaliada com o uso de microscopia confocal. A transferrinase liga ao receptor de transferrina e é sabidamenteinternalizada por processos mediados por receptor. Essaanálise mostrou a co-localização das duas moléculasindicando, dessa forma, que a Proteína Chimigen™ NS5A écaptada por endocitose mediada por receptor.
Em uma tentativa de aumentar a superposição entre ossinais da; Proteína Chimigen™ e do receptor detransferrina, as células foram incubadas com Alexa Flúor488 conjugado à transferrina humana, de forma a detectarindiretamente apenas os receptores de transferrinarecentemente endocitados, e não todos os receptores detransferrina na célula. DCs imaturas foram rotuladas nasuperfície a 4°C com uma mistura de Proteína Chimigen™ eAlex Flúor 488 conjugado à transferrina. Foram observadospoucos endossomos positivos para Alexa Flúor 488transferrina, mas, quando presentes, eles continham aProteína Chimigen™ NS5A, indicando que a ProteínaChimigen™ é, na verdade, captada por endocitose mediadapor receptor. Esses resultados mostram que a ProteínaChimigen3 é internalizada predominantemente por endocitosemediada por receptor.
Foi estudado o processamento da Proteína Chimigen™NS 5 A por DCs imaturas. Como a vacina é projètada paràtratar, entre outros,; infecções crônicas, a ativação dècélulas CD8+ e a apresentação cruzada de antígenos por meiode receptores MHC da Classe I são necessárias. Forampropostas duas vias diferentes de processamento para aapresentação cruzada do antígeno [Lizée e cols. (2Ó05)Trends Immunol. 26(3): 141-149]. Ã primeira envolve oprocessamento de antígenos captados por fagocitosè,enquanto a segunda, envolve o processamento de antígenoscaptados por outras vias de endocitose como, por exemplo,endocitose mediada por receptor. Na segunda via, asproteínas são captadas em endossomos iniciais e nosendossomos tardios direcionados, onde são degradas porcatepsinas, e depois carregadas em receptores MHC da ClasseI. Dessa forma, fòram. feitos experimentos para determinarse a Proteína Chimigen™ NS5A poderia ser detectada emendossomos tardios, e também para determinar se ela se co-localiza com receptores MHC da Classe I nessas estruturas.
Células que haviam sido pulsadas com Proteína Chimigen™NS5A a 40C e depois preparadas a 370C foram co-rotuladaspára detectar tanto a Proteína Chimigen™ quanto LAMPl (ummarcador de ehdossomos/lisossomos tardios). Em .4 e 24horas, em poucas células, foi observada superposição entrea proteína Chimigen NS5A e LAMPl, indicando que a proteínaChimigen NS5A estava em endossomos/lisossomos tardios. Emoutro experimento de co-rotulagem, verificou-se que aProteína Chimigen™ NS5A está presente em estruturassimilares com moléculas MHC da Classe I, indicando, dessaforma, que a Proteína Chimigen™ é processada paraapresentação por meio de moléculas MHC da Classe I.
Acredita-se que proteos somas estejam envolvidos nadegradação de antígenos para apresentação cruzada por meioda via de fagolisossomo. As células foram tratadas com oinibidor de proteossoma permeável à célula Lactacistina, emuma concentração de 5 jag/ml. Foi demonstrado recentementeque Lactacistina é menos específica do que se acreditavapreviamente na inibição da protease Iipossomica Catepsina A[Kozlowski e cols. (2001) Tumour Biol. 22(4): 211-215].Caso o processamento da Proteína Chimigen™ NS5A envolvesseproteossomas como ria via fagolisossomo, seria de se esperarum acúmulo parcial de peptídeos incompletamente degradadosnò citosol, e esse acúmulo não seria esperado paraprocessamento no endossomo tardio [Lizéè e cols. (2005)supra] . Células pulsadas tratadas com 5 "pg/ml delactacistina (pulse and chase) após uma preparação de 4horas mostraram um número maior de endossomos contendo aProteína. Chimigen™ NS5A. Além disso, parece que osendossomos continham mais proteína do que aqueles decélulas de controle. Um aumento na proteína NS5A Chimigen™citoplasmática não pode ser detectado com um anticorpomonoclonal contra IgG 1 de camundongo. Esses dados apontamnovamente para a endocitose mediada por receptor, e não avia de fagolisossomo, como sendo o mecanismo pelo qual asProteínas Chimigen3 são internalizadas em DCs.
A apresentação da Proteína Chimigen™ NS5A por DCs resultana ativação e proliferação de célula T CD8+ e CD4 +
A resposta imunológica funcional à Proteína Chimigen™NS5A foi avaliada por APAs ex vivo. Esse ensaio pode serusado para. medir vários parâmetros de uma respostaimunológica funcional de células T após estímulo de célulasT com DCs carregadas dè antígeno. 0 ensaio consisteprimeiro na geração de DCs imaturas a partir de monócitosderivados de PBMC pela adição de IL-4 e GM-CSF. As DCsimaturas são então incubadas com a vacina candidata, tampãode veículo (controle negativo) ou toxóide tetânico (TT)(controle positivo). As DCs são então tratadas comcitocinas e submetidas à maturação, lavadas e incubadas comcélulas T autólogas nalve. Para medida da produção decitocinã, da presença de componentes granulares citotóxicose da geração de células T específicas para NS5A, as célulasT são estimuladas por mais duas vezes, permitindo aexpansão das células T específicas para a PiroteinaChimigen™. A ativação foi avaliada por medida do marcádorda ativação inicial de células T ativação, CD69, e aproliferação foi medida rastreando-se a fluorescência decélulas T rotuladas com CFSE. Tanto a expressão de CD69quanto a fluorescência de CFSE foram avaliadas após 4 e 7dias de cultura com DCs carregadas de antígeno.
Uma análise preliminar indicou que a concentração deDCs e de células T na cultura constituiu parâmetrosimportantes na determinação da resposta imunológica decélulas T. Dessa forma, foi projetado um APA de tal formaque seis proporções diferentes de células T:DC foramavaliadas. Dois conjuntos de concentrações de DC foramusados, uma concentração elevada de 5 χ IO4 DCs/poço e umaconcentração baixa de 1 χ IO4 DCs/poço. Após 4 8 horas decultura, as DCs imaturas foram incubadas com tampão(controle negativo), duas preparações diferentes de
Proteína Chimi gen™ NS 5 A (SAC) a 5 pg/ml, TT (controlepositivo) ou PBS. As DCs foram então cultivadas por 8horas,; e amadurecidas pela adição de poli IC, IL-I, IL-6,TNF-α, IFN-α e IFN-γ. Após cultura de um dia para o outro(16 horas), DCs do grupo de controle de PBS foram lavadas eexaminadas quanto à expressão de vários marcadores de DCsmaduras. As concentrações altas e baixas DCs expressaramníveis elevados de HLA-ABC (classe I dó MHC), HLA-DR(classe II" do MHC) , CD86, CD80 e CD83 (Fig. 17) . Em géral,a concentração maior de DCs expressou níveis ligeiramentemaiores de marcadores da maturação das DCs.
Células T análogas foram isoladas por um procedimentode seleção negativa, e rotuladas com CFSE para adeterminação da divisão celular. A 100 μϊ/poço de DCs emuma placa de 96 poços, foram adicionados 100 μΐ/poço decélulas T, para concentrações por poço de: 2 0 χ IO4, 5 χIO4 ou 2 χ IO4. Para os poços com concentração elevada deDCs (5 χ IO4 DCs/poçò), as combinações de proporção decélula T para DC por poço foram: 20 χ IO4:5 χ IO4 (4:1), 5x IO4:5 XlO4 (1:1) e 2 χ 104:5 χ IO4 (0.4:1). Para os poçoscom concentração baixa de DCs (1 χ IO4 DCs/poço) , ascombinações da proporção de células T para DC por poçoforam: 20 xl04:l χ IO4 (20:1), 5 χ 104:1 χ IO4 (5:1) e 2 X1Ò4:1 x IO4 (Í2 : i) . As células T foram adicionadas às DCs naausência de quaisquer citocinas exógenas. Como controle, no 3° dia de cultura, PHA a 1 pg/ml foi adicionado às célulasT carregadas no grupo de DCs tratadas com PBS.
Após 4 dias de cultura, metade da cultura de células(100 μl) foi colhida para análise da ativação eproliferação. À metade restante da cultura de células, 100 μl de AIM V®/soros combinados 2,5% frescos foramadicionados, e as células cultivadas por mais 3 dias. Aexpressão de CD69 nas células T após 4 dias de cultura émostrada nas Figs. 18À-C. A Fig. 18A mostra a percentagemde células CD3 + que expressam CD69 para as diferentes proporções de células T:DC. A maioria das células tratadascom PHA expressou CD69, independentemente da proporção decélulas T:DC. CD69 também foi detectado em células Tcultivadas com a concentração alta de DCs, mas foi poucodetectado em células T cultivadas com a concentração baixade DCs. Comparado com o controle de tampão, células Testimuladas por antígeno expressaram um nível mais elevadode CD69. DCs carregadas com Proteína Chimigen™ NS 5 Ainduziram uma percentagem mais elevada de células T CD8+que expressam CD69 do que células T CD4+ no 4o dia (Figs. 18B e C) . A percentagem de expressão de CD69 de células TCD8+ foi equivalente ou maior para a Proteína Chimigen3,comparada com o antígeno de lembrança TT. Isso indicou quea Proteína Chimigen™ NS5A é um forte ativador de células TCD 8 + naíve.
A percentagem de células que passaram por pelo menosuma divisão (CFSEl0) após quatro dias de cultura é mostradanas Figs. 19A-C. As células T tratadas com PHA 24 horasantes começaram a se dividir (Fig. 19A) . Células T CD8+ eCD4+ tratadas com DCs carregadas com TT passaram por proliferação detectável após 4 dias de cultura, mas isso sóera evidente na concentração mais elevada de DCs (Fig. 19Be C). Houve pouca detecção de proliferação de células T nosgrupos tratados com Proteína Chimigen™ no 4o dia. Dessaforma, células T naive foram ativadas por DCs carregadas com Proteína Chimigen™ NS5A no 4° dia de cultura, comoevidenciado por expressão de CD69, mas essas células Tainda não se dividiram ou se dividiram de formaindetectável pelo ensaio usado.
Após 7 dias de cultura, as células foram coletadaspara análise de ativação e proliferação. À expressão deCD69 nas células T após 7 dias de cultura é mostrada nasFigs. 20A-C. A Fig. 20A mostra a percentagem de célulasCD3+ que expressam CD69 para as diferentes proporções decélulas T:DC. Houve um aumento acentuado na expressão de CD69 das células T tratadas com PHA. No entanto, apercentagem cie células que expressam CD69 diminuiu emrelação àquela observada no 4° dia, consistente com o quese espera de uma resposta PHA: uma indução rápida de CD69,seguida por uma diminuição na expressão com o tempo. Paracélulas T estimuladas com a Proteína Chim.igen3, CD69 foidetectado em níveis acima de 5% em células T cultivadas coma concentração elevada de DCs, mas foi pouco detectada emcélulas T cultivadas com a concentração baixa de DCs. Dessaforma, a concentração baixa de DCs (1 χ 10^4 DCs/poço) nãofoi suficiente para a ativação de células T comespecificidade antigênica. Comparado com o controle detampão, um número maior de células T estimuladas com aProteína Chimigen3 expressou CD69 par as proporções de 5 χ10^4 células T e 2 χ 10^4 célula T : 5 χ 10^4 DCs. A expressãode CD69 foi reduzida para a resposta TT de lembrança no 7odia. Em contraste com células T d4, DCs carregadas comProteína ChimigenTM NS 5A induziram uma percentagem maiselevada de células T CD4+ que expressam CD69 do que célulasT CD8+ no 7° dia (Figs. 20B e C). Para a concentração maiselevada de DCs (5 χ 10^4/poço) a percentagem de expressão deCD69 de CD8+ e células T CD4+ foi equivalente ou maior paraa Proteína Chimigen™, comparada com tampão ou antígeno delembrança TT. Dessa forma, a Chimigen™ NS5A ativa célulasT CD8+ nalve inicialmente, seguido por células T CD4+"
A percentagem de células que passaram por pelo Menosuma divisão (CFSEl0) após sete dias de cultura é mostradanas Figs. 21A-C. Os resultados mostram que essencialmentetoda célula T tratada com PHA se dividiu (Fig. 2IA) . DCscarregadas com Proteína Chimigen3 ou TT resultaram emproliferação acentuada de células T após 7 dias de cultura,mas isso foi mais evidente na concentração mais elevada deDCs. Apenas os poços cõm concentração elevada de DCsinduziram proliferação acentuada de células T CD8+, comoresultado da carga de antígeno (Fig. 21B) . No entanto, aconcentração baixa de DCs carregadas com antígeno foisuficiente para induzir proliferação de células T CD4+(Fig. 21C) . Notavelmente, na concentração mais elevada deDCs, as DCs carregadas com a Proteína Chimigen3 induziramproliferação de células T em níveis comparáveis às DCscarregadas com TT.
Outra medida da proliferação de células T é aproporção relativa de células T blãsticas na população decélulas T. células T blásticas são definidas como aquelascélulas que possuem uma FSC (forward light scatter) e SSC(sidelight scatter) mais elevadas do que linfócitos emrepouso no compartimento de linfócitos, como avaliado porcitometria de fluxo. A percentagem de blastos de células Tnas culturas é mostrada na Fig. 22. Esses resultados têmboa correlação com a percentagem de células que passam pordivisão, como mostrados na Fig. 21A. Portanto, a ávaliaçãode blastos de células T em uma população pode ser usadacomo uma alternativa ao ensaio de : CFSE. No geral, essesachados indicam que a Proteína Chimigen™ NS5A foi muitoeficiente na indução de uma resposta primária de células T,medida por ativação e proliferação de células T.
A apresentação da Proteína Chimigen™ NS5A por DCs resultana geração dé células T CD8+ e CD4+ que produzem IFN-y eTNF-a
Á resposta imunológica funcional à vacina Chimigen™ NS5A foi avaliada por um APA de três estímulo ex vivo. DCsimaturas a 4 χ IO4 DCs/poço (concentração elevada) ou a 2 χ10"4 DCs/poço (concentração baixa) foram carregadas comtampão de veículo de controle, PBS, TT (controle positivo),ou Proteína Chimigen™ NS5A. As DCs fòram entãoamadurecidas, é seu fénótipo avaliado. A maturação das DCsfoi estabelecida com o uso das expressões de nível alto deciasse I do MHC, classe II do MHC, CD86, CD80 e CD83 (Fig.23). Células T aútólogàs foram incubadas com as DCsamadurecidas carregadas de ántígeno em uma proporção de 20 χ IO4 células T/poço : 4 χ IO4 DCs/poço ou 4 χ IO4 célulasT/poço "": 2 χ IO4 DCs/poço. As células T foram estimuladastrês vezes, e a função de célula T avaliada 6 horas após oterceiro estímulo por detecção dos níveis intracelularesdas citocinas Thl IFN-γ e TNF-a. Além disso, o nível de células T blásticas também foi avaliado.
A Fig. 24 mostra a percentagem de células T blásticasna concentrações de DCs alta e baixa. A proporção de 2:1 decélulas T:DC resultou uma menor resposta proliferativa decélulas T de fundo (tampão), comparada com a proporção de 5:1. Como resultado, com a proporção de 2:1 houve umadiferença mais acentuada entre resposta proliferativa decélulas T induzida por tampão e por antígèno.
A resposta de IFN-γ foi medida nas proporções de 5:1 e2:1 de células T:DCs. Os dados são mostrados como as respostas de cada poço do grupo e uma média dos três poçoscom o desvio padrão da média (Fig. 25) . Uma comparação daresposta de célúlas T de IFN-γ mostrou uma diferençaacentuada entre as proporções de 5:1 e 2:1 de célulasT: DCs. Com a concentração mais elevada de DCs não houveevidências de uma resposta de IFN-γ induzida por Chimigen 3em relação àquela do tampão de controle. No entanto, com aconcentração menor de DCs, muito poucas células Tcultivadas com DCs carregadas com tampão de controleproduziram IFN-γ, enquanto uma percentagem alta de células T cultivadas com DCs carregadas com Proteína Chimigen3produziu IFN-γ.
Houve mais células produtoras de IFN-γ nas células Testimuladas com DCs que. foram carregadas com 5 pg/ml,comparado ,com 2,5 pg/ml de Proteína Chimigen™ NS5A. Apercentagem de células T que. expressam IFN-γ na populaçãoCD8+ e CD4+ também .foi. medida (Figs. 26 e: 27). Os grupos deconcentração baixa de.DCs.mostraram uma percentagem elevadade células. T CD8+ que expressam IFN-γ, còmo resultado doestímulo com DCs-Chimigen3. A percentagem de células T CD8+que expressam IFN-γ foi maior para células T estimuladascom DCs carregadas com Proteína Chimigen3, comparadas comDCs carregadas com TT (Fig. 26). Do mesmo modo, tambémhouve uma percentagem elevada de células T CD4+ queexpressou IFN-γ mediante estímulo com Proteína Chimigen™NS5A, comparado com tampão de controle (Fig. 27). Apercentagem de células T CD4+ que expressam IFN-K foicomparável para células T estimuladas com DCs carregadascom a Proteína Chimigen3, comparadas com DCs carregadas comTT (Fig. 27). Esses resultados indicam que a ProteínaChimigen™ NS5A indúz uma resposta acentuada de IFN-γ empopulações de células T CD8+ e CD4 +, e sugerem que amolécula é processada pelas DCs nas vias de MHC da classe Ie da classe II.
A Fig. 28 mostra a percentagem de células T queproduziram TNF-a como resultado de um estímulo de 6 horascom DCs maduras carregadas dé antígeno. Esses resultadossão similares aos resultados de IFN-γ. Embora houvesse umaumento na percentagem de células que produzem TNF-α emconseqüência do estímulo de antígeno das células T com aconcentração elevada de DCs (proporção de 5:1), houve umadiferença ainda maior com a concentração baixa de DCs(proporção de 2:1).Uma percentagem mais elevada de célulasT produziu TNF-α quando estimulada por DCs carregadas com 5pg/ml de Proteína Chimigen3, comparado com 2,5 pg/ml deproteína. A resposta de TNF-α foi maior para a ProteínaChimigen™ NS5A, comparada com TT. 0 ,estímulo com DCscarregadas com TT resultou em uma percentagem mais elevadade células T CD4 + que expressam TNF-α, comparadas comcélulas T CD8+ (Fig. 29) . No entanto, DCs carregadas comProteína ChimigenTM NS5A induziram um grau similar deprodução de TNF-α nas populações de células T CD8+ e CD4 +(Fig. 29) .
A apresentação de antígeno Chimigen™ NS5A por DCs resultana geração de células T CD8+ què expressam grB e pfn + ecélulas T CD4+ 6 horas após o 3° estímulo
A habilidade de células T para produzir as proteínasgranulares citotóxicas grB e pfn também foi avaliada porensaios ex vivo de apresentação de antígeno. DCs imaturasforam carregadas com tampão de controle, com TT (controlepositivo) ou concentrações variáveis de Proteína Chimigen™NS 5 A e, com a maturação, foram incubadas com células Tautólogas. A expressão de grB pode ser detectada dediferentes formas, incluindo ensaios enzimáticos e poranticorpos específicos [Ewen e cols. (2003) J. Immunol.Meth. 276: 89-101; Spaeny-Dekking e cols. (1998) J.Immunol. 160: 3.610; Hamann e cols. (1997) J. Exp. Med.186: 1.407] . A expressão de GrB e pfn foi detectada porcoloração intracelular com o uso de mAbs anti-grB e anti-pfn, respectivamente. A Fig. 30 mostra a percentagem decélulas T CD8+ que expressam grB e pfn após três estímuloscom DCs maduras carregadas de antígeno. DCs carregadas comProteína Chimigen™ NS5A induziram um aumento na expressãode grB e pfn em células T CD8 + , comparado como o controlesem antígeno... Esses resultados indicam que a Proteína Chimigen™ NS5A induz, a expressão de grB. e pfn em células TCD8+, e isso . sugere que essa proteína é processada pelasDCs nas vias. da. Classe I para a apresentação eficaz àscélulas Τ, o que resulta em sua diferenciação de células TCD8+ nãive em linfócitos T citotóxicas (CTLs). A apresentação de antígeno Chimigen™ NS5A por DCs madurasresulta na geração e ativação mantida de células T CD8+ eCD4 +
Células T foram estimuladas com DCs carregadas deantígeno três vezes em um ΑΡΑ. Após 6 dias de cultura depois do terceiro éstímulo, as células T foram coletadas einvestigadas por FFC quanto à percentagem de célulasblásticas, como uma medida da proliferação, e quanto àexpressão do marcador de ativação CD69. Além disso, como ummeio para 'estimar os números absolutos de células Trecuperadas da cultura, foi determinado o número de célulasgated que caem no grate de linfócitos {gate RI) com base naanálise por citometria de fluxo de FSC e SSC.
Houve uma' diferença acentuada na 'recuperação decélulas T de células estimuladas com TT e ProteínaChimigen™, comparado com controle de tampão (Fig. 31) . Ascélulas estimuladas com TT geraram uma recupéração decélulas T maior do que as células éstimuladas como ProteínaChimigen3. No entanto, á resposta de TT é uma resposta delembrança e, dessa forma, seria de sé esperar que apopulação de partida de células T que respondemespecificamente ao TT maior do que aquela da população departida de células T nalve específicas para NS5A.Notavelménte, na avaliação da população de célulasblásticas, a percentagem de células blásticas /células emproliferação foi;, na verdade, maior nas culturas deProteína NS5A Chimigen3, comparadas com as culturas de TT.Houve muito poucas células- blásticas / células emproliferação; nas culturas de. controle de tampão. Apercentagem de células T CD8+ e CD4+ ativadas, avaliada porexpressão de CD69, é mostrada na Fig. 32. Houve umapercentagem elevada de células T CD4+ e CD8+ que expressamCD6 9 em células T estimuladas com DCs carregadas comProteína Chimigen3, comparado com controle de tampão. Essesresultados mostram que o estímulo com a Proteína Chimigen3resulta na ativação e proliferação acentuadas de células T,o que é evidente até mesmo seis dias após o terceiroestímulo (20° dia da cultura de células Τ). A ProteínaChimigen3 é, portanto, muito eficaz na ativação e expansãode células T CD8+ e CD4+.
A apresentação da Proteína Chimigen™ NS5Á por DCs madurasinduz a geração de células T CD8+ específicas para NS5A
Para avàliár a especificidade antigênica da respostaimunológica à Proteína Chimigen™ NS5A, foi quantificada apercentagem de células T específicas para um epitopoimunodominante de NS5A no contexto de HLA-A2. Isso foideterminado por rotulagem das células T com um pentâmero depeptídeo NS5A/HLA-A2 conjugado à PE. Células T nalve foramestimuladas três vezes com DCs carregadas com diferenteconcentrações de Proteína Chimigen™ NS5A, e comparadas comos respectivas DCs de controle carregadas sem antígeno(tampão) em um ΑΡΑ. As células T foram coletadas seis diasapós o terceiro estímulo, e células T específicas para NS5Aou células T específicas para EBV (controle) foramdetectadas por rotulagem de tetrâmero e FFC.
As percentagens de células T CD8+ e CD4+ de rotulagemtetrâmero-negativa (controle negativo), e de rotulagem detetrâmero EBV (controle positivo) são mostradas na Fig. 33.Um poço dos três testados foi positivo para rotulagem detetrâmero EBV (tetrâmero positivo) na população de célulasT CD8+. Como as células T avaliadas foram dos poçostratados com controle de tampão, seria de se esperar que onúmero de células T rotuladas com tetrâmero EBV seriarelativamente baixo. A percentagem de rotulagem de célulasT CD8+ com um pentâmero NS5A após q APA é mostrada na Fig.
34. 0 carregamento, das DCs com Proteína Chimigen™ NS5Aresultou na geração de células T com especificidade para oepitopo de NS5A VLSDFKTWL (ID'."DE SEQ. N0 : 3) , A expansãoacentuada de células T CD8+ com essa especificidade foievidente em dois poços dos poços com concentração elevadade DCs, e três poços dos poços com concentração baixa deDCs. Dessa forma, a Proteína NS5A Chimigen3 é capaz deinduzir a geração de células T específicas para ésseepitopo imunodominante de NS5A, e é provável que estejampresentes células T com especificidades para outros épitopos de NS5A.
Exemplo 3. Resultados com a Proteína Chimigeh3 NS3A Proteína Chimigen™ NS3 foi purificada e caracterizada
A Proteína Chimigen™ NS3 expressa em células Sf9 foipurificada por cromatografia por afinidade em Ni-NTA, seguida por' cromatografia por troca catiônica. As amostraspurificadas foram analisadas com o uso de géis de SDS 10%-PAGE·.: Após eletroforese, : os géis.. foram transferidos paranitrocelulosè para Western blotting. O gel de SDS-PAGE foicorado -com PageBlue..,. e foram desenvolvidos .· Western blotscom anticorpos.-específicos" para diferentes... componentes daProteína Chimigen™ NS3 . A proteína purificada surgiu comoum dupleto de. aproximadamente 110 KDa e 120K Da. Ambas asespécies foram detectadas por anticorpos,contra o terminalN (anti-6xHis) , TBD (anti'-Fc) e NS3 (anti-NS3 policlonal) ,o que indicava que a proteína purificada estava intacta.
Uma avaliação qualitativa da glicosilação da ProteínaChimigen™ NS3 purificada foi realizada com o uso do Gel deGlicoproteína Pro-Q® Emerald 300 e o Kit de Coloração Blot.Após eletroforese da proteína purificada em um gel de SDS8%-poliacrilamida, o gel foi corado com o uso do protocolodo fabricante e escaneado sòb iluminação com UV. Como aproteína purificada é um dupleto, presume-se que adiferença nó peso molecular seja causada pelos diferentesníveis de glicosilação.
Proteína Chimigen™ NS3 se liga às DCs imaturas
A Proteína Chimigen™ NS3 foiexaminada quanto à suahabilidadè para se ligar às DCs imaturas. As células foramincubadas na presença e na ausência de várias concentraçõesde Proteína Chimigen™ NS3 por 1 hora a 4°C. A proteínaligada foi detectada com mAb IgGl biotinilado anti-camundongo è SA-PE-Cy5. A percentagem de células que seligam à proteína Chimigen3 (% dè células positivas) e "aquantidade' relativa de proteína ligada (MFI) : foideterminada por FFC. Com Proteína Chimigen™ NS3 a 4-55pg/ml, a maior parte das DCs era positiva quanto à ligação,e houve um aumento dose-dependente na quantidade deproteína ligada (Figs. 35 e 36). A ligação da proteína foibem maior a 22 ^g/ml, comparado com 55 pg/ml, indicando quea ligação às DC? imaturas era saturável. A MFI elevada daligação observada indicou que a Proteína Chimigen™ NS3 seliga muito eficazmente e em níveis elevados às DCsimaturas. A ligação a, 4°C era saturável, indicando que émediada por receptor. A ligação também era muito, rápida,com a proteína ligada detectada após 5 minutos de incubaçãoa 4°C, com uma MFI de ligação de aproximadamente metadedaquela observada após uma incubação de 60 minutos (dadosnão mostrados).
A Proteína Chimigen™ NS3 se liga aos receptoresespecíficos em DCs imaturas
Em virtude da presença do fragmento Fc, prevê-se que aProteína Chimigeh™ NS3 se ligue .por meio de sua região TBDa CD32 (FcyRII) em DCs imaturas. Além disso, em função desua glicosilação de manose, prevê-se que a ProteínaChimigen™ NS3 se ligue aos receptores de lectina do tipo Ccomo, por exemplo, CD206 (MMR). Para determinar aespecificidade de ligação da proteína, DCs imaturas foramincubadas com Proteína Chimigen™ NS3 na presença de mAbsbloqueio anti-CD32 e/ou anti-CD2Ó6.
DCs imaturas foram incubadas com controle de tampão ou5 pg/ml de mAb de controlé de isótipo, mAb anti-CD32, mAbanti-CD206, ou anti-CD32 ' e anti-CD206 por 1 hora a 4°C,antes da incubação com a Proteína Chimigen™ NS3 por 1 horaá 4°C. Â Proteína Chimigen™ NS3 ligada foi detectada commAb biotinilado anti-6xHis, seguido por SA-PE-Cys. mAbs decontrole de isótopo (IgGl e IgG2b murídeas) não inibiram aligação, comparados com controle de tampão. No entanto, emcomparação com :controle de tampão, tanto anti-CD32 quantoanti-CD206 inibiram a ligação por aproximadamente 70% e60%, respectivamente (Fig. 36). A adição de ambos os mAbs de bloqueio inibiram ainda mais a ligação da ProteínaChimigen™ NS 3, resultando em uma inibição de 90% (Fig.36). Dessa forma, os dados indicam uma participação tantopara CD32 quanto para CD206 na ligação da ProteínaChimigen™ NS3 às DCs imaturas.
A ligação da Proteína Chimigen™ NS3 foi visualizadapor microscopia confocal. DCs imaturas foram incubadas comProteína Chimigen™ NS3 a 4 °C. Uma forte rotulagem nasuperfície celular, comparada com controles somente detampão, indicou que a Proteína Chimigen™ se ligava àsuperfície das células, possivelmente aos receptores.
Para investigar a internalização, DCs imaturas foramincubadas com a Proteína Chimigen™ a 37°C por 1 hora. Ascélulas mostraram pouca ou nenhuma rotulagem de superfície(esboços da membrana plásmãticaj, mas, em vez disso,mostraram um padrão puntiforme de rotulagem, freqüentementenas vizinhanças do núcleo, indicando que a ProteínaChimigen™ estava internalizada.
À apresentação da Proteína Chimigen™ NS3 por DCs resultaha ativação e proliferação de células T CD8+ e CD4 +Á resposta imunolõgica funcional à Proteína Chimigen™NS3A foi avaliada por ensaios ex vivo de apresentação deantígéno (APAs). Esses ensaio pode ser usado para mwedirvários parâmetros de uma resposta imunolõgica funcional decélulas T após estímulo de células T com DCs carregadas de antígéno. Ό ensaio consiste primeiro na geração de DCsimaturas a partir de mònócitos derivados de PBMC pelaadição de IL-4 e GM-CSF. As DCs imaturas são entãoincubadas com a vacina candidata, tampão de veículo(controle negativo) ou TT (controle positivo).
Subseqüentemente, as DCs são tratadas com citocinas paraocorrer a maturação, lavadas e incubadas com células Tautólogas nalve. Para a medida da produção de citocina, apresença de componentes granulares citotóxicos e a geraçãode células T específicas para NS3, as células T sãoestimuladas por mais duas vezes, o que permite a expansãodas células T específicas para Proteína Chimigen™. Noentanto, seria esperado que um único estímulo iniciaria aexpansão de uma população de células T nalve. A ativaçãofoi avaliada pela medida do marcador de ativação célula Tinicial, CD69, e a proliferação foi medida por rastreamentoda fluorescência de células T rotuladas com CFSE. Tanto aexpressão de CD69 quanto a f luorescência com CFSE foramavaliadas após 4 e 7 dias de cultura com DCs carregadas deantígeno.
A análise preliminar indicou que a concentração de DCse de células T na cultura representa parâmetros importantesna determinação da resposta imunológica de células T. Dessaforma, o APA foi projetado de tal forma que seisconcentrações diferentes de células T: DC foram avaliadas.
Dois conjuntos de concentrações de DC foram usados, umaconcentração elevadà dè 5 χ IO4 DCs/poço e uma concentraçãobaixa de I x IO4 DCs/poço. Após 48 horas de cultura, as DCsimaturas foram incubadas com tampão (controle negativo),Proteína Chimigen™ NS3 (3C) á 5 pg/ml, TT (controlepositivo) ou PBS. As DCs foram então cultivadas por 8 horase amadurecidas pela adição de poli IC, IL-1, IL-6, TNF-ct,IFN-a e IFN-γ. Após cultura de um dia para o outro (16horas), as DCs do grupo de controle de PBS foram lavadas eexaminadas quanto à expressão de vários marcadores de DCsmaduras. As DCs de concentração alta e baixa expressaramníveis elevados , de HLA-ABC (classe I do MHC), HLA-DR(classe II do MHC).,.. CD86, CD80 e CD83 . Células T análogasforam isoladas por um procedimento de seleção negativa, erotuladas com CFSE para determinação da divisão celular. A100 μl/poço de DCs em uma placa de 96 poços, 100 μΐ/poço decélulas T foram adicionadas para concentrações por poço de:χ 10^4, 5 χ 10^4, ou 2 χ 10^4. Para os poços comconcentração elevada de DCs (5 χ 10^4 DCs/poço) ascombinações de proporção de célula T para DC por poçoforam: 20 X 10^4:5 X 10^4 (4 :1) , 5 X 10^4 : 5 X 10^4 (1:1) e 2 X10^4:5 χ 10^4 (0,4:1). Pará os poços com concentração baixade DCs (5 χ 10^4 DCs/poço) , as combinações dá proporção decélulas T para DC por poço foram: 20 χ 10^4:1 χ 10^4 (20:1),5 X 10^4:1 χ 10^4 (5:1) e 2 χ 10^4:1 x 10^4 (2:1) . As células Tforam adicionadas às DCs na ausência de qüaisquer citocinasexõgenas. Como controle, no 3o dia de cultura, foiadicionado PHA a 1 μg/ml às células T carregadas no grupode DCs tratadas com PBS.
Após 4 dias de cultura, metade da cultura de células(100 μL) foi coletada para análise de ativação eproliferação. À metade restante da cultura de células, 100μL de AIM V®/soros combinados 2,5% fresco foramadicionados, e as células cultivadas por mais 3 dias. Aexpressão de CD69 nas células T na proporção de 5 χ 10^4células T/poço: 5 χ IO4 DCs/poço (1:1) após 4 e 7 dias decultura é mostrada na Fig. 37. A maioria das célulastratadas com PHA expressou CD69, independentemente daproporção de células T: DC. CD69 foi detectado em células Tcultivadas com a concentração elevada de DCs, mas foi poucodetectada em células T cultivadas com a concentração baixade DCs (dados não mostrados) . Comparadas com controle detampão, as células T estimuladas por antígeno expressaramum nível mais elevado de CD69. As DCs carregadas com a
Proteína Chimigen™ NS3 induziram uma percentagem maiselevada de células T CD8+ que expressam CD69 do que ascélulas T CD4+ no 4o . dia. A percentagem de células quepassaram por pelo menos uma divisão (CFSEl0) após quatrodias de cultura é mostrada na Fig. 38. Os resultadosindicam que as células T tratadas com PHA 24 horas antescomeçaram a se dividir. Células T CD8+ e. CD4+ tratadas comDCs carregadas com TT passam por proliferação detectávelapós 4 dias de cultura, mas isso só era evidente naconcentração mais elevada de DCs (dados não mostrados).
Houve pouca detecção de proliferação de células T nosgrupos tratados com a vacina candidata no 4 o dià. Dessaforma, células T naiVe são ativadas por DCs carregados comProteína Chimigen™ NS 3 no 4 ° dia de cultura, comoevidenciado por expressão de CD69, mas essas células Tainda não se dividiram.
Após 7 dias de cultura, fòram coletadas células paraanálise de ativação è proliferação. A expressão de CD69 nascélulas T após 7 dias de cultura é mostrada na Fig. 37.Para as células T estimuladas pela Proteína Chimigen3, CD69foi detectado em níveis acima de 5% em-células T cultivadascom a concentração elevada de DCs, mas foi pouco detectadaem células T cultivadas com a concentração baixa de DCs(dados não mostrados). Dessa forma, a concentração baixa deDCs (1 χ IO4 DCs/poço) não' foi suficiente para ativação decélulas T com especificidade antigênica. A expressão de CD69 era reduzida para a resposta de TT de lembrança no 7°dia, Èm contraste com as células T d4, as DCs carregadascom a Proteína Chimigen™ NS3 induziram uma percentagemmais elevada de células T CD4+ que expressam CD69 do que ascélulas T CD8+ no 7o dia. A percentagem de expressão de CD69 de CD8+ e de células T CD4+ no 1° dia foi maior para aProteína Chimigen3, comparada com o antígeno de lembrançaTT. Dessa forma, a Proteína Chimigen3 inicialmente ativacélulas T CD8+ rzaiVe, seguido por células T CD4 + . Apercentagem de células que passaram por pelo menos uma divisão (CFSEl0) após sete dias de cultura é mostrada naFig. 38. DCs carregadas com Proteína Chimigen3 ou TTresultaram em proliferação acentuada de células T CD8+ eCD4+ após 7 dias de cultura, e isso era mais evidente naconcentração mais elevada de DCs (resultados não mostrados).
Á apresentação de Proteína Chimigen™ NS3 por DCs resultana geração de células T CD8+ e CD4+ que produzem IFN-γ èTNF-a
A resposta imunológica funcional à Proteína Chimigen™ NS3 foi avaliada por um APA ex vivo de três estímulo. DCsimaturas a 4 χ IO4 DCs/poço (concentração elevada) ou a 2 χIO4 DCs/poço (concentração baixa) foram carregadas comtampão de veiculo de controle, PBS, TT (controle positivo)ou Proteína Chimigen™ NS3. As DCs foram entãoamadurecidas, e seu fenótipo avaliado. As DCs foramavaliadas como maduras quando expressavam níveis elevadosde classe I do MHCi classe II do MHC, CD86, CD80 e CD83.Células T análogas foram incubadas com as DCs amadurecidascarregadas de antígeno, em uma proporção de 20 χ 10^4células T/poço : 4 χ 10^4 DCs/poço ou 4 χ 10^4 células T/poço2 χ 10^4 DCs/poço. As células T foram estimuladas trêsvezes, e a função de célula T avaliada 6 horas após oterceiro estímulo, por detecção dos níveis intracelularesdas citocinas Thl IFN-γ e TNF-a. Além disso, também foiavaliada a extensão de células T blásticas.
A medida da percentagem de células T blásticas em umapopulação de.células T pode ser usada como uma estimativada extensão da proliferação de células T. Células Tblásticas são definidas como aquelas células que possuemuma dispersão luminosa FSC e SSC maior do que os linfócitosem repouso no gate de linfócito, como avaliado porcitometria de fluxo. A percentagem de célula T blásticasnas culturas após 14 dias de cultura é mostrada na Fig. 39.A Proteína Chimigen™ NS 3 foi eficiente na indução deproliferação de células T (produção de células blásticas) ,com a proporção de 2:1 de células T:DC resultando em umamenor resposta prolif erativa de células T de fundo(tampão), comparada com a proporção de 5:1. Como resultado,na proporção de 2:1 de células T:DC houve uma diferençaacentuada na proliferação de células T mediante estímulocom a Proteína Chimigen™ NS3, comparada com tampão.
A resposta de IFN-γ foi medida em ambas as proporçõesde 5:1 ê 2:1 de células T: DCs. Os dados são mostrados comoas respostas de cada poço do grupo e uma média dos trêspoços com o desvio padrão da média (Fig. 40) . Umacomparação da resposta de célula T de IFN-γ mostrou umadiferença acentuada entre as proporções de 5:1 e 2:1 decélulas T:DCs. Com a concentração mais elevada de DCs,houve poucas evidências de uma resposta de IFN-γ induzidapela vacina candidata em relação àquela do tampão decontrole. No entanto, com a concentração menor de DCs,muito poucas células T cultivadas com DCs carregadas comtampão de controle produziram IFN-γ, .enquanto umapercentagem alta de células T cultivadas com DCs carregadascom a vacina candidata produziu IFN-γ. Não houve reduçãonas células produtoras de IFN-γ com as células Tèstimuladas com DCs que foram carregadas com 2,5 pg/ml,comparado com : 5 pg/ml de Proteína . Chimigen™ NS3. Apercentagem de células T que expressam IFN-γ na população CDS+ e CD4+ foi quantificada, e é mostrada na Fig. 41. Apercèntagem de células T CD8+ que expressam IFN-γ foicomparável para células T estimuladas com 2,5 pg/ml de DCscarregadas com a vacina candidata, comparadas _ com DCscarregadas com Τι. Da mesma forma, também houve uma percentagem elevada de células T CD4+ que expressou IFN-γmediante ' estimulo com Proteína Chimigen™ NS3, comparadocom tampão dè controle. Á percentagem de células T CD4+ queexpressam IFN-γ foi. comparável para células T estimuladascom DCs carregadas com a vacina candidata, comparado comDCs cárregadás com TT. Esses resultados indicam que aProteína Chimigen™ NS3 induz uma résposta acentuada deIFN-γ em populações de células T CD8+ e CD4 + , e sugere que amolécula é'processada pelas DCs nas vias do MHC da classe Ie dã classe II.
A Fig. 42 mostra a percentagem dé células T queproduziram TNF-α, como resultado de um estímulo de 6 horascom DCs maduras carregadas de antígeno. Esses resultadossão similares, aos resultados de IFN-γ..,Α resposta de TNF-afoi aproximadamente equivalente ou maior, para a ProteínaChimigen™ NS3, comparada com TT. 0 estímulo com. DCscarregadas com TT ou com Proteína Chimigen™ NS3 resultouem. uma percentagem mais elevada de células T CD4+ queexpressam TNF-α, comparadas com células T CD8+.A apresentação da Proteína Chimigen™ NS3 por DCs resultana geração de células T CD8+ que expressam grB e pfn
A habilidade de células T para produzir as proteínasgranulares citotóxicas grB e pfn também foi avaliada porÀPAs éx vivo. DCs imatúras foram carregadas com tampão decontrole, com TT (controle positivo) ou com concentraçõesvariáveis de Proteína Chimigen™ NS3 e, com a maturação,foram incubadas com células T autóiogas. A expressão de GrBe pfn foi detectada por coloração intracelular com o uso demÁbs anti-grB e anti-pfn, respectivamente. A Fig. 43 mostraA percentagem de células T CD8+ que expressam grB e pfnãpos três estímulos com DCs maduras carregadás de antígeno.As DCs carregadas com Proteína Chimigen™ NS3 induziram úmaumento na expressão de grB e pfn em células T CD8 +,comparado com DCs tratadas com controle de tampão. Essesresultados indicaram que a Vacina Chimigen™ NS3 induziu aexpressão de grB e pfn em células T CD8+. Esse achadoindica que a vacina candidata é processada pelás DCs na viada classe I do MHC para a apresentação eficaz às células T,para resultar na sua diferenciação de células T CD8+ naiveem linfócitos T citotóxicas (CTLs).
A apresentação da Proteína Chimigen™ NS3 por DCs madurasresulta na geração e ativação mantida de células T CD8+ eCD4 +
Células T foram estimuladas còm DCs carregadas deantígeno três vezes em um ΑΡΑ. Após 6 dias de culturadepois do terceiro estímulo, as células T foram coletadas einvestigadas por citometria de fluxo quanto à percentagemde células blásticas, como medida da proliferação, e quantoà expressão do marcador de ativação CD69. Além disso, comouma forma de estimar números absolutos de células Trecuperados da cultura, foi determinado o número de célulasgated que caem no gate de linfócitos (gate RI) com base emanálise FFC de FSC e SSC.
A percentagem dé células T CD8+ e CD4+ ativadas,avaliada por expressão de CD69, é mostrada na Fig. 44.Houve uma percentagem aumentada de células T CD4+ e CD8+que expressam CO69 em células T estimuladas com DCscarregadas com Proteína Chimigen3, comparadas com controlede tampão. Houve uma diferença acentuada na recuperação decélulas T de poços estimulados com TT e ProteínaChimigen™, comparado com controle de tampão (Fig. 45) . Ospoços estimulados com TT gérarãm uma recuperação maior decélulas T do que os poços estimulados com a vacinacandidàta. No entanto, a resposta de TT ê uma resposta delembrança e, dessa forma, era esperado que a população decélulas T de partida reativas específicas para TT fossemaior do que a da população de partida de células T naíveespecíficas para NS3. Com o exame dos blastos de células Tpresentes nas culturas, notavelmente a percentagem decélulas blásticas / células em proliferação foi maior nasculturas contendo Proteína Chimigen™ NS3, comparadas comas culturas de TT. Havia poucas células:blásticas / célulasem proliferação nas culturas de controle de tampão. Dessaforma, o estímulo com a Proteína Chimigen3 resultou naativação e proliferação acentuadas de células T, que eraevidente até mesmo seis dias após o. terceiro estímulo (20°dia da cultura de. células Τ) . A Proteína Chimigen™ NS3 é,portanto, muito eficaz na ativação e expansão.de células TCD8+ e CD4+.
A apresentação de Proteína Chimigen™ NS3 por DCs madurasinduz a geração de células T CD8+ específicas para NS3
Para avaliar a especificidade da resposta imunológicaà Proteína Chimigen™ NS3, foi quantificada a percentagemde células T específicas para dois epitopos imunodominantesde NS3 no contexto de HLA-A2. Isso foi determinado porrotulagem das células T com pentâmerõs de peptídeo NS3/HLA-A2 conjugados à PÉ. Células T nalve foram estimuladas trêsvezes com DCs carregadas com diferente concentrações deProteína Chimigen™, NS3 e comparadas com as respectivasDCs de controle carregadas sem antígeno (tampão) em um ΑΡΑ.As células T foram coletadas seis dias após o terceiroestímulo, e células T específicas para NS3 ou células Tespecíficas para EBV (controle) foram detectadas porrotulagem de tetrâmero, e analisadas por citometria defluxo. Um poço de três do grupo de controle de tampãotestou positivo para rotulagem de tetrâmero de EBV(tetrâmero positivo) na população de células T CD8+, enenhum poço foi positivo para rotulagem tètrâmero-negativa(dados não mostrados) . Como as células T avaliadas eram dospoços tratados com controle de tampão, seria esperado que onúmero de células T rotuladas com tetrâmero EBV fosserelativamente baixo. A percentagem de células T CD8+rotuladas com um pentâmero NS3 após o APA é mostrada naFig. 46. O carregamento das DCs com Proteína Chimigen™ NS3resultou na geração de células T com especificidade paraepitopos de NS3. A expansão acentuada de células T CD8+ comessa especificidade era aparente em quatro de. seis poços dogrupo de concentração baixa de DCs. Dessa forma, a ProteínaChimigen™ NS3 foi capaz de induzir a geração de células Tespecíficas para os epitopos imunodominantes de NS3, e éprovável que células T com especificidades para outrosepitopos de NS3 também estivesses presentes.
Exemplo 4. Resultados com a Proteína Chimigen3 NS3-NS4B-NS5A multiantígenos
Expressão de HCV HCV NS3-NS4B-Proteína Chimigen™ NS5A
A cronologia da expressão da Proteína Chimigen™ HCV
Multiantígenos em células Sf 9 foi analisada por Westernblot após SDS-PAGE. Considerando-se fatores tanto deexpressão quanto de degradação da Proteína Chimigen™ HCVMultiantígeno, a melhor condição para a expressão deproteínas foi determinada como MOI de 1,5 para 36 horasapôs infecção.
Purificação de HCV NS3-NS4B-NS5A-Proteína Chimigen™ delisado limpo de pêlete de células SfS»Cromatografia por afinidade em Ni-NTA
Como uma primeira etapa de purificação, HCV NS3-NS4B-Proteína Chimigen™ NS5A foi capturada em uma coluna de Ni-NTA Superflow3. A proteína, ligada na coluna de Ni-NTASuperflow3, foi analisada por SDS-PAGE e por Western blot.O Western blot mostrou uma banda dominante da ProteínaChimigen™; no entanto, a coloração com prata da membranade nitrocelulose mostrou bandas adicionais de proteínas nãoimunorreativas.
Cromatografia por troca iônica HiTRap Q-XL
As proteínas, capturadas pela coluna de Ni-NTA SuperfIow, foram ainda separadas por cromatografia emcoluna de 1 ml HiTrap Q XL. A proteína foi eluída nasfrações de fluxo e as frações eluídas em uma concentraçãode sal entre 0,4 e 0,5 M de NaCl. HCV NS3-NS4B-NS5Amultiantígenos Proteína Chimigen™, ligada na coluna, tevemenos contaminante do que a proteína nas frações flow-through. Foram observadas pelo menos 6 bandas de proteínanão imunorreativa por coloração com prata.Cromatografia em Superdex 200
As proteínas no lisado foram fracionadas por umacoluna Superdex 200. Á Proteína Chimigen™ HCV 3 0 NS3-NS4B-NS5A-multiarit.ígenos foi eluída no primeiro pico. WesternJblot e coloração com prata da fração foram realizados. Aproteína é mostrada como uma banda dominante na coloraçãocom prata; no entanto, várias bandas de contaminantes também eram visíveis. Os resultados do western blot sugerema agregação da proteína durante a purificação.Cromatografia por interação hidrofóbica em Fenil-650CToyopearl
Liisado cellular contendo a Proteína Chimigen™ HCVNS3-NS4B-NS5A multiantígenos foi carregado em Fenil-650CToyopear1, e eluído tanto nas frações não absorvidas quantonas absorvidas. Westérn blot e coloração com prata dasfrações foram realizados. Em ambas as frações, a ProteínaChimigen™ HCV Multiantígenos foi observada como uma banda dominante em IVestera blot e na coloração com prata damembrana de nitrocelulose.
Exemplo 5. Resultados com a Proteína Core HCV Chimigen3HCV Core Proteína Chimigen™ foi purificada e caracterizada
A Proteína Core HCV Chimigen3 foi purificada porcromatografia por quelação de Ni (superflow de Ni-NTA) sobcondições desnaturantes, seguida por . cromatografia portroca catiônica (sefarose CM) . A proteína purificada foianalisada em géis de SDS 12%-PAGE. A banda principal era aproteína de fusão (-55 KDa), a segunda banda, percebida em28 kDa, é muito provavelmente um produto de degradação.Após separação em um a gel de SDS 12%-PAGE, as proteínaspurificadas foram eletroblotted em membranas denitrocelulose. Western blotting foi realizado com anticorpoanti-6xHis conjugado a HRP, anticorpo anti-Fc específico conjugado a HRP e anticorpo anti-HCV core, com anticorpoanti-Fab específico conjugado a HRP como anticorposecundário. Os anticorpos ligados foram detectados porquimioluminescência. A ligàção dos anticorpos ao blotindicou que a HCV core-TBD purificada tem um terminal Nintacto, core e porções TBD. Além disso, a banda de pesomolecular mais baixo foi detectada por todos os 3anticorpos, o que indicava que era uma proteína derivada damolécula HCV core Chimigen™ de comprimento total, e queprovavelmente era resultado de degradação. HCV Core Proteína Chimigen™ se liga às DCs imaturas
HCV Coré vacina Chimigen™ foi examinada quanto à suahabilidade para se ligar às DCs imaturas. As células foramincubadas na presença e ausência de várias concentrações deHCV Core Proteína Chimigén™ por 1 hora a 4°C, e a ligaçãofoi detectada por FFC ou por microscopia confocal. Paraanálise FFCi HCV Core Proteína Chimigen™ ligada foidetectada com um mAb IgGl biotinilado anti-camundongo e SA-PE-Cy5.
A percentagem de células que se ligam a HCV CoreProteína Chimigen™ (% de células positivas) e a quantidaderelativa de Proteína ligada (MFI) foi determinada por.FFC.Com HCV Core Proteína Chimigen™ a 5-40 pg/ml,aproximadamente 100% das células foram positivas para aligação, e houve um aumento dose-dependente na quantidadede HCV Core Proteína Chimigen™ ligada (Fig. 47). A MFIelevada da ligação observada sugeria que HCV Core ProteínaChimigen™ se liga muito eficazmente e em níveis elevadosàs DCs imaturas.
A ligação de HCV, Core Proteína Chimigen™ também foiestudada com o uso de microscopia confocal. A ligação foidetectada com uma IgG de cabra anti-camundongo conjugada aFITC; O corante fluorescente azul DAPI foi usado paraformar a imagem do núcleo. A imagem confocal e a imagemóptica correspondente mostraram que a proteína se liga àmembrana de DCs imaturas após um pulso de 1 hora a 4°C.
HCV Core Proteína Chimigen™ se liga a receptoresespecíficos em DCs imaturás
Ém virtude da presença do fragmento Fci prevê-se queHCV Core Proteína Chimigen™ seja capaz de se ligar pormeio de sua região TBD a CD32 (FcyRII) em DCs imaturas.Além disso, em função de sua glicosilação de manose, prevê-se também que HCV Core Proteína Chimigen™ se ligue aosreceptores de lectina do tipo C como, por exemplo, CD206(MMR). Para determinar a especificidade de ligação de HCVCore Proteína Chimigen™, DCs imaturas foram incubadas comHCV Core Proteína Chimigen™ na presença de mAbs debloqueio específicos para CD32 ou CD206. A ligação tambémfoi examinada na presença de. Iigantes .de competição,fragmentos Fc de IgG murídea para receptores Fcy, e BSA manosilado (mBSA) para receptores de lectina do tipo C.
DCs ; imaturas foram incubadas. com PBS (tampãocontrole) , fragmentos. Fc de .IgG murídea (500 pg/ml) , CD32mAb (200 pg/ml), BSA manosilado (500 pg/ml) ou anti-CD206(2 00 pg/ml) por 1 hora a 40C, antes da incubação com HCV Core Proteína Chimigen™ (30 pg/ml) por 1 hora a 4 0C. AProteína ligada foi detectada tanto com mAb IgGlbiotinilado 'anti-camundongo quanto com mAb biotiniladoanti-HCV core, seguido por SAPE-Cy5. A quantidade relativade HCV Core Proteína Chimigen™ ligada (MFI) foi determinada por FFC. Os resultados dos estudos de ligação edè inibição mostraram que HCV Core Proteína Chimigen™ seligavá aos receptores Fcy como, por exemplo, CD32, e aosreceptores de lectina do tipo C còmô, por exemplo, CD206(Fig. 48).
A apresentação de HCV Core Proteína Chimigen™ por DCsresulta èm níveis intracelular aumentados de IFN-γ emcélulas T CD8+ e CD4+
A resposta imunológica funcional à HCV Core ProteínaChimigen™ foi avaliada por ensaios ex vivo dè apreséntação de antígeno.' DCs imaturas foram carregadas com PBS (tampãocontrole), com toxóide tetânico (controle positivo) ou comconcentrações variáveis de HCV Core Proteína Chimigen™.Após a maturação das DCs, elas foram incubadas com célulasT autólogas. A função de célula T foi avaliada por detecção dos níveis intracelulares da citocina Thl IFN-γ. 0 fenótipoCD3 e CD8 das células também foi determinado por FFC. AsFigs. 4 9A e B mostram a percentagem de células T CD8+ eCD4 +, respectivamente, que expressam IFN-γ 12 horas após oterceiro estímulo com DCs maduras carregadas de antígeno. 0toxóide tetânicò^ foi usado como controle positivo para aapresentação de antígeno eficaz. DCs carregados com HCVCore Proteína Chimigen™ induziram um aumento acentuado.naexpressão de IFN-γ em células T CD8+, comparado com ocontrole sem antígeno. Houve um aumento na expressão deIFN-γ na população de células T CD4+ mediante estímulo comDCs carregadas com HCV Core Proteína Chimigen™. Essesresultados indicam que HCV Core Proteína Chimigen™ induzuma resposta de IFN-γ em populações de células T CD8+ eCD4 + , e sugerem que a molécula é processada pelas DCs nasvias do MHC da classe Ie da classe II.
 apresentação de HCV Core Proteína Chimigen™ por DCsmaduras induz a geração de células T CÍ)8+ específicas paraHCV Core
Para avaliar a especificidade da resposta imunológicaà HCV core, foi quantificada a percentagèm de células Tespecíficas para um epitopo imunodominante de HCV core riocontexto de HLA-B7. Isso foi obtido por rotulagem decélulas T com um tetrâmero peptídeo HCV core/HLAB7conjugado à PE. Além disso, as células T foram rotuladascom luAbs específicos para CD4 e CD8.
Células T nalve para HCV core foram estimuladas trêsvezes com DCs carregadas com diferente concentrações deProteína HCV Core Chimigen™, e comparadas com asrespectivas DCs de controle carregadas sem antígeno, comtoxóide tetânico, ou com TBD. Células T foram coletadas 5dias após o terceiro estimulo, e células \T especificas paraHCV core foram detectadas. por FFG bidimensional. Os doisdot plots / dimensionais dê FFC na Fig. 50 mostram quecélulas T incubadas com DCs carregadas com HCV Core Proteína Chimigen™. mostraram um pequeno aumento nascélulas T positivas para o tetrâmero core.
A revelação do Pedido Provisório de Patente U.S. N060/726.701, incluindo todos os Anexos, é aqui incorporadapor referência em sua totalidade.
Todas as publicações, pedidos de patente e patentesmencionados na especificação acima são aqui incorporadospor referência. Várias modificações e variações do método edo sistema da invenção descritos ficarão evidentes paraaqueles habilitados na técnica, sem se afastar do escopo e do espirito da invenção. Embora a invenção tenha sidodescrita em relação às modalidades específicas preferidas,deve-se entender que a invenção, como reivindicada, nãodeve ser limitada a essas modalidades específicas. Naverdade, várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção que são óbvias para aqueleshabilitados na técnica visam ser englobadas dentro doescopo das reivindicações em anexo.LISTAGEM DE SEQUENCIA
<110> ViRexx Medicai Corp.
<120> ANTfGENOS QUIMÉRICOS DO VÍRUS DA HEPATITE C PARA DESPERTAR UMARESPOSTA IMUNOLÓGICA
<130> 17506- 014WOl
<140> PCT/CA2 006/001685<141> 13-10-2006
<150> US 60/726,701 <151> 13-10-2005
<160> 62
<170> FastSEQ for Windows Versão 4.0
<210> 1<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> exemplar de ligador de peptídeo<400> 1
Ser Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2 '
Val Asp Lys Lys Ile1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> polímero sintético
<400> 3
Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu1 5
<210> 4 <211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> polímero sintético<400> 4
Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val1 5
<210> 5
<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> polímero sintético
<400> 5
Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leul 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> polímero sintético
<400> 6
Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val1 5 10
<210 > 7
<211> 55
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> iniciador PCR
<400> 7
tgtcattctg cggccgcaag gcggcgggat ccgtggacaa gaaaattgtg ccagg
<210> 8
<2Il> 36<212> DNA
<213> Séquência Artificial<220>
<223> iniciador PCR
<400> 8
acgaatcaag ctttgcagcc caggagagtg ggagag36
<210> 9
<211> 870
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<22 0>
<223> construtor sintético
<221> CDS<222> (1)...(867)<400> 9.
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca acg5 48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc aaa ggc96
Thr Glu. Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Lys Gly20 - 25 30
cta cgt cga cga gct caa cta gtg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg 144
Leu Arg Arg Arg Ala Gln Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val35 40 45
gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt 192
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys50 55 60
aca gtc cca gaa gta tca tet gtc ttc ate ttc ccc cca aag ccc aag 240
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
65 70 75 80
gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta288
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val85 90 95
gac ate age aag gat gat ccc gag gtc cag ttc age tgg ttt gta gat35 336
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp100 105 110
gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc384
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe115 120 125
aac age act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc ate atg cac cag gac 432
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
130 135 140
tgg etc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc aac agt gea gct ttc
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Vàl Asn Ser Ala Ala Phe
145 150 155 160
cct gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag 528
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys165 170 175
gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag 576
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys180 185 190
gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac624
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp195 200 205
att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag672
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys210 215 220
aac act cag ccc ate atg gac aca gat ggc tet tac ttc gtc tac age720
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
225 230 235 240
aag ctc aat gtg cag aag age aac tgg gag gea gga aat act ttc acc768
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
245 250 255
tgc tet gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac cat act gag aag age816
Cys Ser Val Lèu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
260 265 270
ctc tcc cac tet cct ggg ctg caa age ttg tcg aga agt act aga gga864
Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly275 280 285
tca taa870
Ser
<210> 10<211> 289<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220 ><223> construtor sintético<400> 10
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15
Thr Glu Asn Lèu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Lys Gly
20 25 30
Leu Arg Arg Arg Ãla Gln Leu Val Árg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val
35 40 45
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys50 55 60
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys65 70 75 80
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val85 90 95
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
100 105 110Asp Val Glu 115 Val His Thr Ala Gln 120 Thr Gln Pro Arg Glu 125 Glu Gln Phe Asn Ser 130 Thr Phe Arg Ser Val 135 Ser Glu Leu Pro Ile 140 Met His Gln Asp Trp 145 Leu Asn Gly Lys Glu 150 Phe Lys Cys Arg Val 155 Asn Ser Ala Ala Phe 160 Pro Ala Pro Ile Glu 165 Lys Thr Ile Ser Lys 170 Thr Lys Gly Arg Pro 175 Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 180 185 190 Asp Lys Val 195 Ser Leu Thr Cys Met 200 Ile Thr Asp Phe Phe 205 Pro Glu Asp Ile Thr 210 Val Glu Trp Gln Trp 215 Asn Gly Gln Pro Ala 220 Glu Asn Tyr Lys Asn 225 Thr Gln Pro Ile Met 230 Asp Thr Asp Gly Ser 235 Tyr Phe Val Tyr Ser 240 Lys Leu Asn Val Gln 245 Lys Ser Asn Trp Glu 250 Ala Gly Asn Thr Phe 255 Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 260 265 270 Leu Ser His 275 Ser Pro Gly Leu Gln 280 Ser Leu Ser Arg Ser 285 Thr Arg Gly Ser
<210 > 11<211> 92<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> oligonucleotídeo sintético<400> 11
gcatggtcca tggtaagcgc tattgtttta tátgtgcttt tggcggcggc ggcgcattct60
gcctttgcgg atctgcaggt acggtccgat gc92
40 <210> 12<211> 92<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> oligonucleotídeo sintético
<400> 12
gcatcggacc gtacctgcag atccgcaaag gcagaatgcg ccgccgccgc caaaagcaca50 60
tataaaacaa tagcgcttac catggaccat gc92
<210> 13<211> 27<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
60 <223> iniciador PCR<400> 13
ccggaattct ccggttcctg gctaagg27
<210> 14<211> 28<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> iniciador PCR
<400> 14
ggactagtcc gcacacgaca tcttccgt28
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> iniciador PCR
<400> 15
gtttctaacg cgtcgtacta ccatcaccat cac33
<210> 16<211> 34<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> iniciador PCR<400> 16
ccggggtacc ttacagccca ggagagtggg agag
34
<210> 17<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> iniciador PCR
<400 > 17ctggtagttc ttcggagtgt g21
<210> 18<211> 32<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> iniciador PCR
<400> 18ggtagtacga cgcgttagaa acggcgacca ac32
<210> 19<211> 26<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> iniciador PCR<400> 19
ccggaattcg cgcccatcac ggcgta26
<210> 20<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> iniciador PCR
<400> 20
ccggactagt ccggccgaca tgcatgtcat gat33
<210> 21<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 21
ctgccagtcc tgcccgcgcg ttgagtcctg gag33
<210> 22<211> 29<212> DNA
<213> Séquência Artificial
<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 22
ggcaggactg gcãgggggaa gccaggcat29
<210> 23<211> 32<212> DNA<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 23gcgcactagt gtctcagcac ttaccgtaca tc32
<210> 24<211> 34<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador PCR<400> 24
cggcgcggcc gcccgcagca cacgacatct tccg34
<210> 25<211> 34<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 25
caacagcgga ccccccgcgg agcctttcaa gtag
34
<210> 26<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 26
gtccgctgtt gtgccccgcg ggacacg27
<210> 27<211> 29<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 27
ccggactagt ccggccgaca tgcatgtca29
<2l0> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 28gagggactag tgtccggttc ctggctaagg gac33
<210> 29 .<211> 35<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador PCR<400> 29
ccggtctaga ttatgatcct ctagtacttc tcgac
<210> 30<211> 27<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador PCR<400> 30
cggaattcat gagcacgaat cctaaac27
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciadoir PCR
<400> 31
ggactagtcc gaagatagag aàagagc27
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 32
agtáagatct ttacagccca ggagagtggg agag 34
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 33ccggaattct accaagtgcg caattcct28
<210> 34<211> 31<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador PCR<400> 34
gcgcactagt cccttcgccc agttccccac c
31
<210> 35<211> 33<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 35
gcgcactagt cacccacgtc accgggggaa atg33
<210> 36<211> 32 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador PCR
<400> 36
gcgcgcggcc gcccgtactc ccacttaatg gc32
<210> 37<211> 19<212> PRT
<213> Autographa californica <400> 37
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
15 10 15
Asn Alá Ile
<210> 38<211> 57<212> DNA
<213> Autographa californica
<400> 38
atgçccttgt acaaattgtt aaacgttttg tggttggtcg ccgtttctaa cgcgatt57
<210 > 39
<211> 2190<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> construtor sintético
<221> CDS
<222> <1) . . . (2187)
<400> 39
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca acg48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc tcc ggt96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ser Gly20 25 30
tcc tgg cta agg gac ate tgg gac tgg ata tgc gag gtg ctg age gac
144
Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp35 40 45
ttt aag acc tgg ctg aaa gcc aag etc atg cca caa ctg cct ggg att192
Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile50 55 60
ccc ttt gtg tcc tgc cag cgc ggg tat agg ggg gtc tgg cga gga gac240
Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp
65 70 75 80
ggc att atg cac act cgc tgc cac tgt gga gct gag ate act gga cat288
Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His85 90 95
gtc aaa aac ggg acg atg agg ate gtc ggt cct agg acc tgc agg aac336
Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn100 105 110
atg tgg agt ggg acg ttc ccc att aac gcc tac acc acg ggc ccc tgt384
Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys115 120 125
act ccc ctt cct gcg ccg aac tat aag ttc gcg ctg tgg agg gtg tet432
Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser130 135 140
gea gag gaa tac gtg gag ata agg cgg gtg ggg gac ttc cac tac gta480
Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val
145 150 155 160tcg ggt atg act act gac aat ctt aaa tgc ccg tgc cag ate cca tcg528
Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser
165 170 175
ccc gaa ttt ttc aca gaa ttg gac ggg gtg cgc cta cac agg ttt gcg576
Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala180 185 190
ccc cct tgc aag ccc ttg ctg cgg gag gag gta tca ttc aga gta gga624
Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly195 200 205
ctc cac gag tac ccg gtg ggg tcg caa tta cct tgc gag ccc gaa ccg672
Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro210 215 220
gac gta gcc gtg ttg acg tcc atg ctc act gat ccc tcc cat ata aca720
Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr
225 230 235 240
gea gag gcg gcc ggg aga agg ttg gcg aga ggg tca ccc cct tet atg768
Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met245 250 255
gcc age tcc tcg gct age cag ctg tcc gct cca tet ctc aag gea act816
Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr260 265 270
tgc acc gcc aac cat gac tcc cct gac gcc gag ctc ata gag gct aac864
Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ilè Glu Ala Asn275 280 285
ctc ctg tgg agg cag gag atg ggc ggc aac ate acc agg gtt gag tca912
Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser290 295 300
gag aac aaa gtg gtg att ctg gac tcc ttc gat ccg ctt gtg gea gag960
Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu
305 310 315 320
gag gat gag cgg gag gtc tcc gta cct gea gaa att ctg cgg aag tet1008
Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser
325 330 335
cgg aga ttc gcc cgg gcc ctg ccc gtc tgg gcg cgg ccg gac tac aac1056
Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn
340 345 350ccc ccg cta gta gag acg tgg aaa aag cct gac tac gaa cca cct gtg1104
Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val
355 360 365
gtc cat ggc tgc ccg cta cca cct cca cgg tcc cct cct gtg cct ccg1152
Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro
370 375 380
cct cgg aaa aag cgt acg gtg gtc ctc acc gaa tca acc cta tct act1200
Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr
385 390 395 400
gcc ttg gcc gag ctt gcc acc aaa agt ttt ggc age tcc tca act tcc1248
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser405 410 415
ggc att acg ggc gac aat acg aca aca tcc tct gag ccc gcc cct tct1296
Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser420 425 430
ggc tgc ccc ccc gac tcc gac gtt gag tcc tat tct tcc atg ccc ccc1344
Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro435 440 445
ctg gag ggg gag cct ggg gat ccg gat ctc age gac ggg tca tgg tcg1392
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acg gtc agt agt ggg gcc gac acg gaa gat gtc gtg tgc gga cta gtg1440
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465 470 475 480
cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat1488
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Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr515 520 525
cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac ate age aag gat gat ccc gag1632
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu530 535 540gtc cag ttt age tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag1680
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acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac age act ttc cgc tca gtc agt1728
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gaa ctt ccc ate atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa1776
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tgc agg gtc aac agt gea gct ttc cct gcc ccc ate gag aaa acc ate1824
Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile595 600 605
tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca1872
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cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg1920
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tgg gag gea gga aat act ttc acc tgc tet gtg tta cat gag ggc ctg2112 '·
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cac aac cac cat act gag aag age ctc tcc cac tet cct ggg ctg caa2160
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age ttg tcg aga agt act aga gga tca taa2190
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<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> construtor sintético<4 00> 4 0
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20 25 30
Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp 35 40 45
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50 55 60
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165 170 175
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245 250 255
Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr
260 265 270
Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn 275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn
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370 375 380
Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr385 390 395 400
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser
405 410 415Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser
420 425 430
Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro435 440 445
Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser450 455 460
Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Gly Leu Val465 470 475 480
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500 505 510
Phe íle Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr515 520 525
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580 585 590
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660 665 670
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<210> 41
<211> 2274
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> construtor sintético
<221> CDS
<222> (1) . . . (2271) 1
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tat ttt cag192
Tyr Phe Gln50
gac ate tgg240
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ctg aaa gcc288
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tgc cag cgc336
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act cgc tgc384
Thr Arg Cys
115
acg atg agg432
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acg ttc ccc480
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145
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gtg gag ata576
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act gac aat624
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aca gaa ttg672
Thr Glu Leu210
cac cát cac gatHis His His Asp
ggc gcc atg gat
Gly Ala Met Asp55
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ggg tat agg ggg
Gly Tyr Arg Gly100
cac tgt gga gct
His Cys Gly Ala
ate gtc ggt cct
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att aac gcc tac
Ile Asn Ala Tyr150
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Tyr Lys Phe Ala165
agg cgg gtg ggg
Arg Arg Val Gly180
ctt aaa tgc ccgLeu Lys Cys Pro
gac ggg gtg cgc
Asp Gly Val Arg215
tac gat ate cca acg
Tyr Asp Ile Pro Thr40
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Pro Glu Phe Ser Gly60
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Glu Val Leu Ser Asp75
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Gln Leu Pro Gly Ile90
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Arg Thr Cys Arg Asn140
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Thr Thr Gly Pro Cys155
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tgc cag ate cca tcg
Cys Gln Ile Pro Ser200
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Leu His Arg Phe Ala220
acc gaa aac ctg
Thr Glu Asn Leu45
tcc tgg cta aggSer Trp Leu Arg
ttt aag acc tgg
Phe Lys Thr Trp80
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Pro Phe Val Ser95
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Gly Ile Met His110
gtc aaa aac ggg
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act ccc ctt cct
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Ser Gly Met Thr190
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ccc cct tgc aagPro Pro Cys Lysccc ttg ctg cgg gag gag gta tca ttc aga gta gga ctc cac gag tac720
Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly Leu His Glu Tyr
225 230 235 240
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Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala
260 265 270
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305 310 315 320
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Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Arg Arg Phe Ala355 360 365
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Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val
370 375 380
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Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His Gly Cys
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ccg cta cca cct cca cgg tcc cct cct gtg cct ccg cct cgg aaa aag1248 '
Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg Lys Lys
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tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg1776
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gag gag cag ttc aac age act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc ate1824
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Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
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ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag gag1968
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Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe660 665 670
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gag aac tac aag aac act cag ccc ate atg gac aca gat ggc tet tac2112
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Ser Thr Arg Gly Ser755
<210> 42
<211> 2211
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> construtor sintético
<221> CDS
<222> (1) . . . (2208)<400> 42
atg ccc ttg48
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aac gcg tcg96
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ggt tcc tgg192
Gly Ser Trp50
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Asp Phe Lys
65
att ccc ttt288
Ile Pro Phe
gac ggc att336
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gta tcg ggt576
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etc ccc cag gat gct gtc tcc cgg act caa cgc gcg ggc agg act ggc1488
Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Ala Gly Arg Thr Gly
485 490 495
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cag aag gcc ctc ggc ctc ctg cag acc gcg tcc cgc cat gea gag gtt2160
Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Ser Arg His Ala Glu Val
705 710 715 720
ate acc cct gct gtc cag acc aac tgg cag aaa ctc gag gtc ttt tgg2208
Ile Thr Pro Ala Val Gln Thr Asn Trp Gln Lys Leu Glu Val Phe Trp
725 730 735
gcg aag cac atg tgg aat ttc ate agt ggg ata caa tac ttg gcg ggc2256
Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu Ala Gly
740 745 750ctg tca acg ctg cct ggt aac ccc gcc att gct tca ttg atg gct ttt2304
Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe
755 760 765
aca gct gcc gtc acc age cca cta acc act ggc caa acc ctc ctc ttc2352
Thr Ala Ala Val Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gly Gln Thr Leu Leu Phe
770 775 780
aac ata ttg ggg ggg tgg gtg gct gcc cag ctc gcc gcc ccc ggt gcc2400
Asn Ilè Leu Gly Gly Trp Val Ala Ala Gln Leu Ala Ala Pro Gly Ala
785 790 795 800
gct act gcc ttt gtg ggt gct ggc cta gct ggc gcc gcc ate ggc age2448
Ala Thr Ala Phe Val Gly Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Ile Gly Ser
805 810 815
gtt gga ctg ggg aag gtc ctc gtg gac att ctt gea ggg tat ggc gcg2496
Val Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala
820 825 830
ggc gtg gcg gga gct ctt gta gea ttc aag ate atg age ggt gag gtc2544
Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys Ile Met Ser Gly Glu Val835 840 845
ccc tcc acg gag gac ctg gtc aat ctg ctg ccc gcc ate ctc tcg cct2592
Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro850 855 860
gga gcc ctt gtà gtc ggt gtg gtc tgc gea gea ata ctg cgc cgg cac2640
Gly Ala Leu Val Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His
865 870 875 880
gtt ggc ccg ggc gag ggg gea gtg caa tgg atg aac cgg cta ata gcc2688
Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala885 890 895
ttc gcc tcc cgg ggg aac cat gtt tcc ccc acg cac tac gtg ccg gag
2736' ■"■■-'■
Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu
900 905 910
age gat gea gcc gcc cgc gtc act gcc ata etc age age ctc act gta2784
Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala Ile Leu Ser Ser Leu Thr Val915 920 925
acc cag ctc ctg agg cga ctg cat cag tgg ata age tcg gag tgt acc2832 '
Thr Gln Leu Leu Arg Arg Leu His Gln Trp Ile Ser Ser Glu Gys Thr
930 935 940act cca tgc tcc ggt tcc tgg cta agg gac ate tgg gaç tgg ata tgc2880
Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys
945 950 955 960
gag gtg ctg age gac ttt aag acc tgg ctg aaa gcc aag ctc atg cca2928
Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro965 970 975
caa ctg cct ggg att ccc ttt gtg tcc tgc cag cgc ggg tat agg ggg2976
Gln Leu Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly980 985 990
gtc tgg cga gga gac ggc att atg cac act cgc tgc cac tgt gga gct3024
Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala995 1000 1005
gag ate act gga cat gtc aaa aac ggg acg atg agg ate gtc ggt cct3072
Glu Ile Thr Gly His Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro1010 1015 1020
agg acc tgc agg aac atg tgg agt ggg acg ttc ccc att aac gcc tac3120
Arg Thr Cys Arg Asn Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr1025 1030 1035 1040
acc acg ggc ccc tgt act ccc ctt cct gcg ccg aac tat aag ttc gcg3168
Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala1045 1050 1055
ctg tgg agg gtg tet gea gag gaa tac gtg gag ata agg cgg gtg ggg3216
Leu Trp Arg Val Ser Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly1060 1065 1070
gac ttc cac tac gta tcg ggt atg act act gac aat ctt aaa tgc ccg3264
Asp Phe His Tyr Val Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro1075 1080 1085
tgc cag ate cca tcg ccc gaa ttt ttc aca gaa ttg gac ggg gtg cgc3312
Cys Gln Ile Pro Ser Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg1090 1095 1100
cta cac agg ttt gcg ccc cct tgc aag ccc ttg ctg cgg gag gag gta3360 '
Leu His Arg Phe Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val
1105 / 1110 1115 1120
tca ttc aga gta gga ctc cac gag tac ccg gtg ggg tcg caa tta cct3408
Ser Phe Arg Val Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro1125 1130 1135tgc gag ccc gaa ccg gac gta gcc gtg ttg acg tcc atg ctc act gat3456
Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp1140 1145 1150
ccc tcc òat ata aca gca gag gcg gcc ggg aga agg ttg gcg aga ggg3504
Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly1155 1160 1165
tca ccc cct tct atg gcc age tcc tcg gct age cag ctg tcc gct cca3552
Ser Pro Pro Ser Met Ala Ser Ser Ser Ala Sèr Gln Leu Ser Ala Pro1170 1175 1180
tct ctc aag gca act tgc acc gcc aac cat gac tcc cct gac gcc gag3600
Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thir Ala. Asn His Asp Sgit Pito Asp Ala. Glu1185 1190 1195 1200
ctc ata gag gct aac ctc ctg tgg agg cag gag atg ggc ggc aac ate3648
Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile1205 1210 1215
acc agg gtt gag tca gag aac aaa gtg gtg att ctg gac tcc ttc gat3696
Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp
1220 1225 1230
ccg ctt gtg gca gag gag gat gag cgg gag gtc tcc gta cct gca gaa3 744 ■'■
Pro Leu Val Ala Glu Glu Asp Glu' Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu
1235 1240 1245
att ctg cgg aag tct cgg aga ttc gcc cgg gcc ctg ccc gtc tgg gcg3792
Ile Leu Arg Lys Ser Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala1250 1255 1260
cgg ccg gac tac aac ccc ccg cta gta gag acg tgg aaa aag cct gac3840
Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp1265 1270 1275 1280
tac gaa cca cct gtg gtc cat ggc tgc ccg cta cca cct cca cgg tcc3888 '-
Tyr Glu Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser1285 1290 1295
cct cct gtg cct ccg cct cgg aaa aag cgt acg gtg gtc ctc acc gaa3936
Pro Pro Val Pro1Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu
1300 1305 1310
tca acc cta tct act gcc ttg gcc gag ctt gcc acc aaa agt ttt ggc3984
Ser Thr Leu Ser Thr Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly1315 1320 1325age tcc tca act tcc ggc att acg ggc gac aat acg aca aca tcc tet4032
Ser Ser Ser Thr Ser Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser
1330 1335 1340
gag ccc gcc cct tet ggc tgc ccc ccc gac tcc gac gtt gag tcc tat4080
Glu Pro Ala Pro Ser Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr1345 1350 1355 1360
tet tcc atg ccc ccc ctg gag ggg gag cct ggg gat ccg gat ctc age4128
Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser1365 1370 1375
gac ggg tca tgg tcg acg gtc agt agt ggg gcc gac acg gaa gat gtc4176
Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val1380 1385 1390
gtg tgc tgc ggg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att4224
Val Cys Cys Gly Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile1395 1400 1405
gtg ccc agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa4272
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu1410 1415 1420
gta tcá tet gtc ttc ate ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc4320
Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr1425 1430 1435 1440
att act ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac ate age aag4368
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
1445 1450 1455
gat gat ccc gag gtc cag ttc age tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg4416
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val1460 1465 1470
cac aca gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac age act ttc4464
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
1475 1480 1485
cgc tca gtc agt gaa ctt ccc ate atg cac cag gac tgg ctc aat ggc4512
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly1490 1495 1500
aãg gag ttc aaa tgc agg gtc aac agt gea gct ttc cct gcc ccc ate4560
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala- Phe Pro Ala Pro Ile
1505 1510 1515 1520gag aaa acc ate tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg4608
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
1525 1530 1535
tac acc att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt4656
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
1540 1545 1550
ctg acc tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag4704
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu1555 1560 1565
tgg cag tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc4752
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro1570 1575 1580
ate atg gac aca gat ggc tet tac ttc gtc tac age aag ctc aat gtg4800
Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
1585 1590 1595 1600
cag aag age aac tgg gag gea gga aat act ttc acc tgc tet gtg tta4848
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu1605 1610 1615
cat gag ggc ctg cac aac cac cat act gag aag age ctc tcc cac tet4896
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser1620 1625 1630
cct ggg ctg caa age ttg tcg aga agt act aga gga tca taa4938
Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser1635 1640 1645
<210> 47
<211> 4155
<212> DNA
45 <213 > Seqüência Artificial
<220> '
<223> construtor sintético
50 <221> CDS
<222> (1) . . . (4152)
<400> 47
atg gta age gct att gtt tta tat gtg ctt ttg gcg gcg gcg gcg cat55 48
Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His1 5 10 15
tet gcc ttt gcg tat ctg cag gta cgg tcc gaa acc atg tcg tac tac60 96
Sér Ala Phe Ala Tyr Leu Gln Val Arg Ser Glu Thr Met Ser Tyr Tyr20 25 30
cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca acg acc gaa aac ctg
144
His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu35 40 45
tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc gcg ccc ate acg gcg tac192
Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ala Pro Ile Thr Ala Tyr50 55 60
gcc cag cag acg aga ggc etc cta ggg tgt ata ate acc age ctg act240
Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr
65 70 75 80
ggc cgg gac aaa aac caa gtg gag ggt gag gtc cag ate gtg tca act288
Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr
85 90 95
gct acc caa acc ttc ctg gea acg tgc ate aat ggg gta tgc tgg act336
Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr
100 105 110
gtc tac cac ggg gcc gga acg agg acc ate gea tca ccc aag ggt cct384
Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro
115 120 125
gtc ate cag atg tat acc aat gtg gac caa gac ctt gtg ggc tgg ccc432
Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro
130 135 140
gct cct caa ggt tcc cgc tca ttg aca ccc tgt acc tgc ggc tcc tcg480
Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser
145 150 155 160
gàc ctt tac ctg gtc acg agg cac gcc gat gtc att ccc gtg cgc cgg528
Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg
165 170 175
cga ggt gat age agg ggt age ctg ctt tcg ccc cgg ccc att tcc tac576
Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr
180 185 190
ttg aaa ggc tcc gcg ggg ggt ccg ctg ttg tgc ccc gcg gga cac gcc624
Leu Lys Gly Ser Ala Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala
195 200 205
gtg ggc cta ttc agg gcc gcg gtg tgc acc cgt gga gtg gct aaa gcg672
Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala210 215 220gtg gac ttt ate cct gtg gag aac cta ggg aca acc atg aga tcc ccg720
Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Gly Thr Thr Met Arg Ser Pro
225 230 235 240
gtg ttc acg gac aac tcc tet cca cca gea gtg ccc cag age ttc cag768
Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln
245 250 255
gtg gcc cac ctg cat gct ccc acc ggc age ggt aag age acc aag gtc816
Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val
260 265 270
ccg gct gcg tac gea gcc cag ggc tac aag gtg ttg gtg etc aac ccc864
Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro275 280 285
tet gtt gct gea acg ctg ggc ttt ggt gct tac atg tcc aag gcc cat912
Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His290 295 300
ggg gtt gat cct aat ate agg acc ggg gtg aga aca att acc act ggc960
Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly
305 310 315 320
áge ccc ate acg tac tcc acc tac ggc aag ttc ctt gcc gac ggc ggg1008
Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly
325 330 335
tgc tca gga ggt gct tat gac ata ata att tgt gac gag tgc cac tcc1056
Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser340 345 350
acg gat gcc aca tcc ate ttg ggc ate ggc act gtc ctt gac caa gea1104
Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala355 360 365
gag act gcg ggg gcg aga ctg gtt gtg etc gcc act gct acc cct ccg1152
Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro
370 375 380
ggc tcc gtc act gtg tcc cat cct aac ate gag gag gtt gct ctg tcc1200
Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser
385 390 395 400
acc acc gga gag ate ccc ttt tac ggc aag gct ate ccc ctc gag gtg1248
Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val405 410 415ate aag ggg gga aga cat ctc ate ttc tgc cac tca aag aag aag tgc1296
Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys
420 425 430
gac gag ctc gcc gcg aag ctg gtc gea ttg ggc ate aat gcc gtg gcc1344
Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala435 440 445
tac tac cgc ggt ctt gac gtg tet gtc ate ccg acc age ggc gat gtt1392
Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val450 455 460
gtc gtc gtg tcg acc gat gct ctc atg act ggc ttt acc ggc gac ttc1440
Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe
465 470 475 480
gac tet gtg ata gac tgc aac acg tgt gtc act cag aca gtc gat ttc1488
Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe485 490 495
age ctt gac cct acc ttt acc att gag aca acc acg ctc ccc cag gat1536
Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp500 505 510
gct gtc tcc agg act caa cgc gcg ggc agg act ggc agg ggg aag cca1584
Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Ala Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro515 520 525
ggc ate tat aga ttt gtg gea ccg ggg gag cgc ccc tcc ggc atg ttc1632
Gly Ile Tyr Arg Phe Val Alá Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe530 535 540
gac tcg tcc gtc ctc tgt gag tgc tat gac gcg ggc tgt gct tgg tat1680
Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr
545 550 555 560
gag ctc acg ccc gcc gag act aca gtt agg cta cga gcg tac atg aac1728
Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn565 570 575
acc ccg ggg ctt ccc gtg tgc cag gac cat ctt gaa ttt tgg gag ggc1776 '
Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly
580 585 590
gtc ttt acg ggc ctc act cat ata gat gcc cac ttt tta tcc cag aca1824
Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leii Ser Gln Thr595 600 605aag cag agt ggg gag aac ttt cct tac ctg gta gcg tac caa gcc acc1872
Lys Gln Ser Gly Glu Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr
610 615 620
gtg tgc gct agg gct caa gcc cct ccc cca tcg tgg gac cag atg tgg1920
Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp
625 630 635 640
aag tgt ttg ate cgc ctt aaa ccc acc ctc cat ggg cca aca ccc ctg1968
Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu645 650 655
cta tac aga ctg ggc gct gtt cag aat gaa gtc acc ctg acg cac cca2016
Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro660 665 670
ate acc aaa tac ate atg aca tgc atg tcg gcc gga cta gtg tcc ggt2064
Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met Ser Ala Gly Leu Val Ser Gly675 680 685
tcc tgg cta agg gac ate tgg gac tgg ata tgc gag gtg ctg age gac2112
Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp690 695 700
ttt aag acc tgg ctg aaa gcc aag ctc atg cca caa ctg cct ggg att2160 :
Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile
705 710 715 720
ccc ttt gtg tcc tgc cag cgc ggg tat agg ggg gtc tgg cga gga gac2208 1
Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp
725 730 735
ggc att atg cac act cgc tgc cac tgt gga gct gag ate act gga cat2256
Glv Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His
740 745 750
gtc aaa aac ggg acg atg agg ate gtc ggt cct agg acc tgc agg aac2304
Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn
755 760 765
atg tgg agt ggg acg ttc ccc att aac gcc tac acc acg ggc ccc tgt2352 "
Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys
770 775 780
act ccc ctt cct gcg ccg aac tat aag ttc gcg ctg tgg agg gtg tet2400
Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser
785 790 795 800gca gag gaa tac gtg gag ata agg cgg gtg ggg gac ttc cac tac gta2448
Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val805 810 815
tcg ggt atg act act gac aat ctt aaa tgc ccg tgc cag ate cca tcg2496
Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser820 825 830
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Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala835 840 845
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Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly850 855 860
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Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro
865 870 875 880
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Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr885 890 895
gca gag gcg gcc ggg aga agg ttg gcg aga ggg tca ccc cct tet atg2736
Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met900 905 910
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Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr
915 920 925
tgc acc gcc aac cat gac tcc cct gac gcc gag ctc ata gag gct aac2832
Cys Thr Ala Asn His Asp Sér Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn930 935 940
ctc ctg tgg agg cag gag atg ggc ggc aac ate acc agg gtt gag tca2880
Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser
945 950 955 960
gag aac aaa gtg gtg att ctg gac tcc ttc gat ccg ctt gtg gca gag2928
Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu965 970 975
gag gat gag cgg gag gtc tcc gta cct gca gaa att ctg cgg aag tet2976
Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser980 985 990cgg aga ttc gcc cgg gcc ctg ccc gtc tgg gcg cgg ccg gac tac aac3024
Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn995 1000 1005
ccc ccg cta gta gag acg tgg aaa aag cct gac tac gaa cca cct gtg3072
Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Ijys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val1010 1015 1020
gtc cat ggc tgc ccg cta cca cct cca cgg tcc cct cct gtg cct ccg3120
Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro1025 1030 1035 1040
cct cgg aaa aag cgt acg gtg gtc ctc acc gaa tca acc cta tct act3168
Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr1045 1050 1055
gcc ttg gcc gag ctt gcc acc aaa agt ttt ggc age tcc tca act tcc3216
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser1060 1065 1070
ggc att acg ggc gac aat acg aca aca tcc tct gag ccc gcc cct tct3264
Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser1075 1080 1085
ggc tgc ccc ccc gac tcc gac gtt gag tcc tat tct tcc atg ccc ccc3312
Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro1090 1095 1100
ctg gag ggg gag cct ggg gat ccg gat ctc age gac ggg tca tgg tcg3360
Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser1105 1110 1115 1120
acg gtc agt agt ggg gcc gac acg gaa gat gtc gtg tgc tgc ggg cgg3408
Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Cys Gly Arg1125 1130 1135
ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt3456
Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys1140 1145 1150
ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc3504
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe1155 1160 1165
ate ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct3552
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro1170 1175 1180aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac ate age aag gat gat ccc gag gtc3600
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ilè Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val1185 1190 1195 1200
cag ttc age tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg3648
Gln Phe Ser Trp Phè Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr1205 1210 1215
caa ccc cgg gag gag cag ttc aac age act ttc cgc tca gtc agt gaa3696
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu1220 1225 1230
ctt ccc ate atg cac cag gac tgg etc aat ggc aag gag ttc aaa tgc3744
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys1235 1240 1245
agg gtc aac agt gea gct ttc cct gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc3792
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser1250 1255 1260
aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct3840
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro1265 1270 1275 1280
ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata3888
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile1285 1290 1295
aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg3 93 6
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
1300 1305 1310
cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc ate atg gac aca gat3984
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp1315 1320 1325
ggc tet tac ttc gtc tac age aag ctc aat gtg cag aag age aac tgg4032 :
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp1330 1335 1340
gag gea gga aat act ttc acc tgc tet gtg tta cat gag ggc ctg cac4080
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
1345 1350 1355 1360
aac cac cat act gag aag age ctc tcc cac tet cct ggg ctg caa age4128
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser1365 1370 1375ttg tcg aga agt act aga gga tca taa4155
Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser1380
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<220>
<223> construtor sintético
<221> CDS
<222> (1) . . . (1377)
<400> 48
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca acg48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc atg age96
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Ser
25 30
acg aat cct aaa cct caa aga aaa acc aaa cgt aac acc aac cgt cgc
144
Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg
35 40 45
cca cag gac gtc aag ttc ccg ggt ggc ggt cag ate gtt ggt gga gtt192
Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val50 55 60
tac ttg ttg ccg cgc agg ggc cct aga ttg ggt gtg cgc gcg acg agg
240
Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg
65 70 75 80
aag act tcc gag cgg tcg caa cct cga ggt aga cgt cag cct ate ccc288
Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro
85 90 95
aag gea cgt cgg ccc gag ggc agg acc tgg gct cag ccc ggg tac cct336
Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro100 105 110
tgg ccc ctc tat ggc aat gag ggt tgc ggg tgg gcg gga tgg ctc ctg384
Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu115 120 125
tet ccc cgt ggc tet cgg cct age tgg ggc ccc aca gac ccc cgg cgt432
Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg130 135 140
agg tcg cgc aat ttg ggt aag gtc ate gat acc ctt acg tgc ggc ttc480
Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe
145 150 155 160
gcc gac ctc atg ggg tac ata ccg ctc gtc ggc gcc cct ctt gga ggc528
Alá Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly
165 170 175
gct gcc agg gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gaa gac ggc gtg576
Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val
180 185 190
aac tat gea aca ggg aac ctt cct ggt tgc tet ttc tet ate ttc gga624
Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Gly
195 200 205
cta gtg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc672
Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro210 215 220
agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca720
Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser
225 230 235 240
tet gtc ttc ate ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act768
Ser Val Phe Ile Phè Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
245 250 255
ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac ate age aag gat gat816
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp
260 265 270
ccc gag gtc cag ttc age tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca864
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr275 280 285
gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac age act ttc cgc tca912 ' "
Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser
290 295 300
gtc agt gaa ctt ccc ate atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag960
Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
ttc aaa tgc agg gtc aac agt gea gct ttc cct gcc ccc ate gag aaa1008
Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335acc ate tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc1056
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr340 345 350
att cca cct ccc aag gag cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc1104
Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr
355 360 365
tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag1152
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tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc ate atg1200
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met
385 390 395 400
gac aca gat ggc tet tac ttc gtc tac age aag etc aat gtg cag aag1248
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age aac tgg gag gea gga aat act ttc acc tgc tet gtg tta cat gag1296
Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu420 425 430
ggc ctg cac aac cac cat act gag aag age ctc tcc cac tet cct ggg1344
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly435 440 445
ctg caa age ttg tcg aga agt act aga gga tca taa1380
Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser450 455
<210> 49<211> 1428<212 > DNA
<213> Seqüência Artificial
<220> '
<223> construtor sintético
<221> CDS
<222> (1)...(1425)
<400> 49
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca acg
48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1 5 10 15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc tac caa96Thr Glu Asn
gtg cgc aat144
Val Arg Asn35
tcg agt att192
Ser Ser Ile50
tgt gtc cct240
Cys Val Pro65
gtg acc ccc288
Val Thr Pro
ctt cga cgt336
Leu Arg Arg
gcc ctc tac384
Ala Leu Tyr115
ctg ttt acc432
Leu Phe Thr130
tgt tct ate480
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tcc tcg ggg cttSer Ser Gly Leu
gtg tac gag gcg
Val Tyr Glu Ala55
tgc gtt cgc gag
Cys Val Arg Glu70
acg gtg gcc acc
Thr Val Ala Thr85
cat ate gat ctg
His Ile Asp Leu100
gtg ggg gac ctg
Val Gly Asp Leu
ttc tct ccc agg
Phe Ser Pro Arg135
tat ccc ggc cat
Tyr Pro Gly His150
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Asn Tirp Ser Pro165
cca caa gcc ate
Pro Gln Ala Ile180
gcg ggc ata gcgAla Gly Ile Ala
gta gtg ctg ctgVal Val Leu Leu
Gly Ala Met Asp Pro25
tac cat gtc acc aat
Tyr His Val Thr Asn40
gcc gat gcc ate ctg
Ala Asp Ala Ile Leu60
ggt aac gcc tcg agg
Gly Asn Ala Ser Arg75
agg gac ggc aaa ctc
Arg Asp Gly Lys Leu90
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Leu Val Gly Ser Ala105
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Cys Gly Ser Val Phe120
cgc cac tgg acg acg
Arg His Trp Thr Thr140
ata acg ggt cat cgc
Ile Thr Gly His Arg155
acg gea gcg ttg gtg
Thr Ala Ala Leu Val170
atg gac atg ate gct
Met Asp Met Ile Ala185
tat ttc tcc atg gtg
Tyr Phe Ser Met Val200
cta ttt gcc ggc gtcLeu Phe Ala Gly Val
Glu Phe Tyr Gln30
gat tgc cct aac
Asp Cys Pro Asn45
cac act ccg ggg
His Thr Pro Gly
tgt tgg gtg gcg
Cys Trp Val Ala80
ccc aca acg cag
Pro Thr Thr Gln95
acc ctc tgc tcg
Thr Leu Cys Ser110
ctt gtt ggt caa
Leu Val Gly Gln125
caa gac tgc aatGln Asp Cys Asn
atg gea tgg gat
Met Ala Trp Asp160
gta gct cag ctg
Val Ala Gln Leu175
ggt gct cac tgg
Gly Ala His Trp190
ggg aac tgg gcg
Gly Asn Trp Ala205
gac gcg gaa ggaAsp Ala Glu Gly210 215 220
cta gtg cgg ccg caa ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc720
Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro
225 230 235 240
agg gat tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca768
Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser
245 250 255
tct gtc ttc ate ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act816
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
260 265 270
ctg act cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac ate age aag gat gat864
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp
275 280 285
ccc gag gtc cag ttc age tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca912
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr290 295 300
gct cag acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac age act ttc cgc tca960
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340 345 350
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tgc atg ata aca gac ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag1200
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tgg aat ggg cag cca gcg gag aac tac aag aac act cag ccc ate atg1248
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met
405 410 415gac aca gat ggc tct tac ttc gtc tac age aag ctc aat gtg cag aag1296
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys
420 425 430
age aac tgg gag gea gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag1344
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<220>
<223> construtor sintético
<221> CDS
<222 > (1) ,. . (1935)
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atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca acg48
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acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc acc cac96
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gtc acc ggg gga aat gcc ggc cgc acc acg gct ggg ctt gtt ggt ctc144
Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu
35 40 45
ctt aca cca ggc gcc aag cag aac ate caa ctg ate aac acc aac ggc192
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agt tgg cac ate aat age acg gcc ttg aat tgc aat gaa age ctt aac240
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65 70 75 80
acc ggc tgg tta gea ggg ctc ttc tat caa cac aaa ttc aac tct tca288Thr GXy Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser85 90 95
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Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys195 200 205
gtg tgc gga gcg ccc cct tgt gtc ate gga ggg gtg ggc aac aac acc672
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Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr
225 230 235 240
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Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val Asp
245 250 255
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Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val
305 310 315 320
ctt ccg tgt tet ttc acg acc ctg cca gcc ttg tcc acc ggc ctc ate1008
Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile
325 330 335
cac ctc cac cag aac att gtg gac gtg cag tac ttg tac ggg gta ggg1056
His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly
340 345 350
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Leu Leú Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln Gly385 390 395 400
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Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
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cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tet gtc ttc ate ttc ccc1296
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
420 425 430
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Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
435 440 445
tgt gtt gtg gta gac ate age aag gat gat ccc gag gtc cag ttc age1392
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
450 455 460
tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg1440
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
465 470 475 480gag gag cag ttc aac age act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc ate1488
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ttc gtc tac age aag ctc aat gtg cag aag age aac tgg gag gea gga1824
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aat act ttc acc tgc tet gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac cat1872
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 610 615 620
act gag aag age ctc tcc cac tet cct ggg ctg caa age ttg tcg aga1920
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625 630 635 640
agt act aga gga tca taa1938
Ser Thr Arg Gly Ser 645
<210> 51<211> 2517 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22 O >
<223> construtor sintético
<221> CDS
<222> (1) . . . (2514)
<400> 51 .
atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat ate cca acg48
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15
acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc tac caa96
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20 25 30
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gtg acc ccc acg gtg gcc acc agg gac ggc aaa ctc ccc aca acg cag 288
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85 90 95
ctt cga cgt cat ate gat ctg ctt gtc ggg age gcc ácc ctc tgc tcg 33 6
Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser100 105 110
gcc ctc tac gtg ggg gac ctg tgc ggg tet gtc ttt ctt gtt ggt caa 384
Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln115 120 125
ctg ttt acc ttc tet ccc agg cgc cac tgg acg acg caa gac tgc aat 432
Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn130 135 140
tgt tet ate tat ccc ggc cat ata acg ggt cat cgc atg gea tgg gat 480
Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp145 150 155 160
atg atg atg aac tgg tcc cct acg gea gcg ttg gtg gta gct cag ctg 528
Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu165 170 175
ctc cgg ate cca caa gcc ate atg gac atg ate gct ggt gct cac tgg576
Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp180 185 190
gga gtc ctg gcg ggc ata gcg tat ttc tcc atg gtg ggg aac tgg gcg624
Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala195 200 205
aag gtc ctg gta gtg ctg ctg cta ttt gcc ggc gtc gac gcg gaa acc672
Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr210 215 220
cac gtc acc ggg gga aat gcc ggc cgc acc acg gct ggg ctt gtt ggt720
His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly
225 230 235 240
ctc ctt aca cca ggc gcc aag cag aac ate caa ctg ate aac acc aac768
Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn
245 250 255
ggc agt tgg cac ate aat age acg gcc ttg aat tgc aat gaa age ctt816
Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu
260 265 270
aac acc ggc tgg tta gea ggg ctc ttc tat caa cac aaa ttc aac tet864
Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser
275 280 285
tca ggc tgt cct gag agg ttg gcc age tgc cga cgc ctt acc gat ttt912
Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe
290 295 300
gcc cag ggc tgg ggt cct ate agt tat gcc aac gga age ggc ctc gac960
Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp
305 310 315 320
gaa cgc ccc tac tgc tgg cac tac cct cca aga cct tgt ggc att gtg1008
Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val
325 330 335
ccc gea aag age gtg tgt ggc ccg gta tat tgc ttc act ccc age ccc1056
Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro
340 345 350
gtg gtg gtg gga acg acc gac agg tcg ggc gcg cct acc tac age tgg1104
Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp355 360 365ggt gca aat gat acg gat gtc ttc gtc ctt aac aac acc agg cca ccg1152
Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro 370 375 380
ctg ggc aat tgg ttc ggt tgt acc tgg atg aac tca act gga ttc acc1200
Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr 385 390 395 400
aaa gtg tgc gga gcg ccc cct tgt gtc ate gga ggg gtg ggc aac aac1248
Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn 405 410 415
acc ttg ctc tgc ccc act gat tgc ttc cgc aaa cat ccg gaa gcc aca1296
Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr 420 425 430
tac tet cgg tgc ggc tcc ggt ccc tgg att aca ccc agg tgc atg gtc1344
Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val
435 440 445
gac tac ccg tat agg ctt tgg cac tat cct tgt acc ate aat tac acc1392
Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr 450 455 460
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Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Vãl Glu His Arg Leu Glu
465 470 475 480
gcg gcc tgc aac tgg acg cgg ggc gaá cgc tgt gat ctg gaa gac agg1488
Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg 485 490 495
gac agg tcc gag ctc age ccg ttg ctg ctg tcc acc aca cag tgg cag1536 '
Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Léu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln
500 505 510
gtc ctt ccg tgt tet ttc acg acc ctg cca gcc ttg tcc acc ggc ctc1584
Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu 515 520 525
ate cac ctc cac cag aac att gtg gac gtg cag tac ttg tac ggg gta1632
Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val
530 535 540
ggg tca age ate gcg tcc tgg gcc att aag tgg gag tac gtc gtt ctc1680
Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu 545 550 555 560ctg ttc ctt ctg ctt gca gac gcg cgc gtc tgc tcc tgc ttg tgg atg1728
Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met
565 570 575
atg tta ctc ata tcc caa gcg gag gcg gct gga cta gtg cgg ccg caa1776
Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln580 585 590
ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt1824
Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
595 600 605
aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc ate ttc1872
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe610 615 620
ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc1920
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
625 630 635 640
acg tgt gtt gtg gta gac ate age aag gat gat ccc gag gtc cag ttc1968
Thr Cys Val Val vàl Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe645 650 655
age tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc2016 '
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro660 665 670
cgg gag gag cag ttc aac age act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc2064
Arg Glu Glú Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro675 680 685
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Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val690 695 700
aac agt gca gct ttc cct gcc ccc ate gag aaa acc ate tcc aaa acc2160 ■
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
705 710 715 720
aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag22 08
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
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gág cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac2256
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp740 745 750ttc ttc cct gaa gac att act2304
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr755
gcg gag aac tac aag aac act2352
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tac ttc gtc tac age aag ctc2400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu785 790
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Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser805
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aga agt act aga gga tca taa2517
Arg Ser Thr Arg Gly Ser835
<210> 52<211> 757<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> construtor sintético
<400> 52
Met Val Ser Ala Ile Val Leu1 5
Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Gln20
His His His His His His Asp
35
Tyr Phe Glh Gly Ala Met Asp
50 55
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Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro85
Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly100
Thr Arg Cys His Cys Gly Ala115
Thr Met Arg Ile Val Gly Pro130 135
Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr145 150
Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala
gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag ccaVal Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro760 765 cag CCC ate atg gac aca gat ggc tetGln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser 780 aat gtg cag aag age aac tgg gag geaAsn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 795 800gtg tta cat gag ggc ctg cac aac càcVal Leu His Glu Gly Leu His Asn His 810 815 cac tet CCt ggg ctg caa age ttg tcgHis Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser 825 830 Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 10 15 Val Arg Ser Glu Thr Met Ser Tyr Tyr 25 30 Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu40 45 Pro Glu Phe Ser Gly Ser Trp Leu Arg 60 Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp 75 80Gln Leu Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser 90 95 Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met His 105 110 Glu Ile Thr Gly His Val Lys Asn Gly120 125 Arg Thr Cys Arg Asn Met Trp Ser Gly 140 Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Leu Pro 155 160Leu Trp Arg Val Ser Ala Glu Glu Tyr165 170 175
Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val Ser Gly Met Thr
180 185 190
Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser Pro Glu Phe Phé195 200 205
Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala Pro Pro Cys Lys
210 215 220
Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly Leu His Glu Tyr225 230 235 240
Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val
245 250 255
Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His lie Thr Ala Glu Ala Ala
260 265 270
Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met Ala Ser Sèr Ser275 280 285
Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Alá Asn
290 295 300
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Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu Glu Asp Glu Arg
340 345 350
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Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val
370 375 380
Glu Thr Trp Lys Lys Pró Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His Gly Cys385 390 395 400
Pro LeU Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg Lys Lys
405 410 415
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420 425 430
Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Sei: Ser Ser Thr Ser Gly Ilè Thr Gly435 440 445
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450 455 460
Asp Sei" Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Lèu Glu Gly Glü465 470 475 480
Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Ser
485 490 495
Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Gly Leu Val Arg Pro Gln Gly
500 505 510
Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys515 520 525
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
530 535 540
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leü Thr Pro Lys Val Thr545 550 555 560
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
565 570 575
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580 585 590
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610 615 620
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys625 630 635 640
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
645 650 655Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
660 665 670
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Ser Thr Arg Gly Ser755
<210> 53<211> 736<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> construtor sintético<400> 53
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser1 5 10 15
Asn Ala Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro
20 25 30
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50 55 60
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130 135 140
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Ser Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr
165 170 175
Val Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro
180 185 190
Ser Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe 195 200 205
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210 215 220
Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu225 230 235 240
Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile
245 250 255
Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser
260 265 270
Met Àla Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala 275 280 285
Thr Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala290 295 ' 300
Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu305 310 ' 315 320
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340 345 350
Ser Arg Arg Phe Ala Arg Alá Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr355 360 365
Asn Pro Pro Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro370 375 380
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Pro Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser 405 410 415
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Ser Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro435 440 445
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Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg
500 505 510
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Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu530 535 540
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro545 550 555 560
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580 585 590
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660 665 670
Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp675 680 685
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<210> 54
< 211> 935
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<22 O >
<223> construtor sintético
<400> 54 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Gln Val Arg Ser Glu Thr Met Ser Tyr Tyr 20 25 30 His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu 35 40 45 Tyr Phè Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Ala Pro Ile Thr Ala Tyr 50 55 60 Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr 65 70 75 80 Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr 100 105 110 Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro 115 120 125 Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro 130 135 140 Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser 145 150 155 160 Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg 165 17 0 175 Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr 180 185 190 Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala 195 200 205 Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala 210 215 220 Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Gly Thr Thr Met Arg Ser Pro 225 230 235 240 Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln 245 250 255 Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val 260 265 270 Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro 275 280 285 Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His 290 295 300 Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly 305 310 315 320 Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly 325 330 335 Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser 340 345 350 Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala 355 360 365 Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro 370 375 380 Gly Ser Val Thr Val Ser His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser 385 390 395 400 Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val 405 410 415 Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys 420 425 430 Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala 435 440 445 Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val450 455 460
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Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser930 935<210> 55<211> 907<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> construtor sintético
<400> 55
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450 455 460
Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr465 470 475 480
Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Ala Gly Arg Thr Gly
485 490 495
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530 535 540
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565 570 575
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645 650 655
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660 665 670
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<213 >. Seqüência Artificial<220>
<223> construtor sintético
<400> 56
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435 440 445
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' 435 440 445
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755 760 765
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820 825 830Gly Val Ala Gly Ala Lèu Val Ala Phe Lys Ile Met Ser Gly Glu Val
835 840 845
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885 890 895
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<210> 58<211> 1384 <212 > PRT
<213> Sequênciá Artificial
<22 0>
<223> construtor sintético
<400> 58
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Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu
645 650 655
Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro
660 665 670
Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met Ser Ala Gly Leu Val Ser Gly 675 680 685
Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp
690 695 700
Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile705 710 715 720
Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp
725 730 735
Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His
740 745 750
Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn 755 760 765
Met Trp Ser Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys
770 775 780
Thr Pro Leu Pró Ala Pro Asn Tyr Lys Phè Ala Leu Trp Arg Val Ser785 790 795 800
Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val
805 810 815
Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser
820 825 830
Pro Glu Phè Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala 835 840 845
Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly
850 855 860
Leu His Glu Tyr Pro Vál Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro865 870 875 880
Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr
885 890 895
Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met
900 905 910
Ala Ser Ser Ser Alá Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr 915 920 925
Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn
930 935 940
Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser945 950 955 960
Glu Asn Lys Val Vál Ilè Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu
965 970 975
Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Alá Glu Ile Leu Arg Lys Ser
980 985 990
Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn 995 1000 1005
Pro Pro Lêu Val Glu Thir Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val
1010 1015 1020
Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro1025 1030 1035 1040
Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr
1045 1050 1055Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser
1060 1065 1070
Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser1075 _ 1080 1085
Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro1090 1095 1100 .
Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser1105 1110 1115 1120
Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Cys Gly Arg 1125 1130 1135
Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
1140 1145 .1150
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe1155 1160 1165
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro1170 1175 1180
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val1185 1190 1195 1200
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 1205 1210 1215
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
1220 1225 1230
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys1235 1240 1245
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser1250 1255 1260
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro1265 1270 1275 1280
Pro Lys Glu Gln Meit Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 1285 1290 1295
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
1300 1305 1310
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pró Ile Met Asp Thr Asp1315 1320 1325
Gly Ser Tyr Phe Val Tyir Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp1330 1335 1340
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His1345 1350 . 1355 1360
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser 1365 1370 1375
Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser1380
<210> 59<211> 459<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<22 0 >
<223> construtor sintético
<400> 59 Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15 Thr Glu Asn Leu 20 Tyr Phe Gln Gly Ala 25 Met Asp Pro Glu Phe 30 Met SerThr Asn Pro 35 Lys Pro Gln Arg Lys 4 0 Thr Lys Arg Ash Thr 45 Asn Arg ArgPro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val 50 55 60 Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Vál Arg Ala Thr Arg65 70 75 80 Lys Thr Ser Glu Arg 85 Ser Gln Pro Arg Gly 90 Arg Arg Gln Pro Ile 95 Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro 100 105 110 Trp Pro Leu 115 Tyr Gly Asn Glu Gly 120 Cys Gly Trp Ala Gly 125 Trp Leu Leu Ser Pro 130 Arg Gly Ser Arg Pro 135 Ser Trp Gly Pro Thr 140 Asp Pro Arg Arg Arg 145 Ser Arg Asn Leu Gly 150 Lys Val Ile Asp Thr 155 Leu Thr Cys Gly Phe 160 Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly 165 170 175 Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val 180 185 190 Asn Tyr Ala 195 Thr Gly Asn Leu Pro 200 Gly Cys Ser Phe Ser 205 Ile Phe Gly Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro 210 215 220 Arg 225 Asp Cys Gly Cys Lys 230 Pro Cys Ile Cys Thr 235 Val Pro Glu Val Ser 240 Ser Val Phe Ile Phe 245 Pro Pro Lys Pro Lys 250 Asp Val Leu Thr Ile 255 Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp 260 265 270 Pro Glu Val 275 Gln Phe Ser Trp Phe 280 Val Asp Asp Val Glu 285 Val His Thr Ala Gln 290 Thr Gln Pro Arg Glu 295 Glu Gln Phe Asn Ser 300 Thr Phe Arg Ser Val 305 Ser Glu Leu Pro Ile 310 Met His Gln Asp Trp 315 Leu Asn Gly Lys Glu 320 Phe Lys Cys Arg Val 325 Asn Ser Ala Ala Phe 330 Pro Ala Pro Ile Glu 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Ile Pro Pro 355 Pro Lys Glu Gln Met 360 Ala Lys Asp Lys Val 365 Ser Leu Thr Cys Met 370 Ile Thr Asp Phe Phe 375 Pro Glu Asp Ile Thr 380 Val Glu Trp Gln Trp 385 Asn Gly Gln Pro Ala 390 Glu Asn Tyr Lys Asn 395 Thr Gln Pro Ile Met 400 Asp Thr Asp Gly Ser 405 Tyr Phe Val Tyr Ser 410 Lys Leu Asn Val Gln 415 Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu 420 425 430 Gly Leu His 435 Asn His His Thr Glu 440 Lys Ser Leu Ser His 445 Ser Pro Gly Leu Gln 450 Ser Leu Ser Arg Ser 455 Thr Arg Gly Ser
<210> 60
<211> 475 - . ·
<212> PRT
<213> Seqüência Artificiai
<220> "
<223> construtor sintético
<400> 60
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Aõp Ile Pro Thr1 5 10 15Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gln 20 25 30 Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn 35 40 45 Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly 50 55 60 Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala 65 . 70 75 80 Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln 85 90 95 Leu Arg Arg His. Ile Asp . Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser 100 105 110 Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln 115 120 125 Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn 130 135 140 Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp 145 150 155 160 Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu 165 170 175 Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp 180 185 190 Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala 195 200 205 Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Gly 210 2.15 220 Leu Val Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro 225 230 235 240 Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser 245 250 255 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pró Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr 260 265 270 Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Phè Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr 290 295 300 Alá Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser 305 310 315 320 Vãl Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr 370 3 75 3 80 Cys Met ile Thr Asp Phe Phè Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln 385 390 395 400 Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Ásn Thr Gln Pro Ile Met 405 410 415 Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys 420 425 430 Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu 43 5 440 445 Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Sêr His Ser Pro Gly
455 460
Leu Gln Ser Leu Ser Arg Ser Thr Arg Gly Ser465 470 475
60 <210> 61<211> 645<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223 > construtor sintético
<400> 61 Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 . Thr Glu Asn Leu 20 Tyr Phe Gln Gly Ala 25 Met Asp Pro Glu Phe 30 Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu 35 40 45 Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly 50 55 60 Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn 65 70 75 80 Thr Gly Trp Leu Ala 85 Gly Leu Phe Tyr Gln 90 His Lys Phe Asn Ser 95 Ser Gly Cys Pro Glu 100 Arg Leu Ala Ser Cys 105 Arg Arg Leu Thr Asp 110 Phe Ala Gln Gly Trp 115 Gly Pro Ile Ser Tyr 120 Ala Asn Gly Ser Gly 125 Leu Asp Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro 130 135 140 Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val 145 150 155 160 Val Val Gly Thr Thr 165 Asp Arg Ser Gly Ala 170 Pro Thr Tyr Ser Trp 175 Gly Ala Asn Asp Thr 180 Asp Val Phe Val Leu 185 Asn Asn Thr Arg Pro 190 Pro Leu Gly Asn Trp 195 Phe Gly Cys Thr Trp 2 00 Met Asn Ser Thr Gly 205 Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Prò Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr 210 215 220 Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Prò Glu Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Ser Arg Cys Gly Ser 245 Gly Pro Trp Ile Thr 250 Pro Arg Cyis Met Val 255 Asp Tyr Pro Tyr Arg 260 Leu Trp His Tyr Pro 265 Cys Thr Ile Asn Tyr 270 Thr Ile Phe Lys Val 275 Arg Met Tyr Val Gly 280 Gly Val Glu His Arg 285 Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp 290 295 300 Arg Ser Glu Leu Ser Pro Lèu Leu Leü Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val 305 310 315 320 Leu Pro Cys Ser Phe 325 Thr Thr Leu Pro Ala 330 Lèu Sér Thr Gly Leu 335 Ile His Leu His Gln 340 Asn Ile Val Asp Val 345 Gln Tyr Leü Tyr Gly 350 Val Gly Ser Sèr Ile 355 Ala Ser Trp Ala Ile 360 Lys Trp GlU Tyr Val 365 Vál Leu Léu Phe Leu LeU Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met Met 370 375 380 Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln Gly 385 390 395 400 Gly Giy Ser Val Asp 405 Lys Lys Ile Val Pro 410 Arg Asp Cys Gly Cys 415 Lys Pro Cys Ile Cys 420 Thr Val Pro Glu Val 425 Ser Ser Val Phe Ile 430 Phe ProPro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr 435 440 445 Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser 450 455 460 Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg 465 470 475 480 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile . - 485 490 495 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 500 505 510 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 515 520 525 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 530 535 540 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 545 550 555 560 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 565 570 575 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 580 585 590 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 595 600 605 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 610 615 620 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser Arg 625 630 635 640 Ser Thr Arg Gly Ser 645 <210> 62 <211> 838 <212> PRT <213> Seqüência Artificial. <22 0> <223> construtor sintético <400> 62 Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 Thr Glu Asn Léu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gln 20 25 30 Val Arg Ásn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn 35 40 45 Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Alá Ile Leu HiS Thr Pró Gly 50 55 60 Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala 65 70 75 80 Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pró Thr Thr Gln 85 90 95 Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser 100 105 110 Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln 115 120 125 Leú Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn 130 135 140 Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp 145 150 155 160 Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu 165 170 175 Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His TrpGly Val Leu195Lys Val Leu210
His Val Thr225
Leu Leu Thr
Gly Ser Trp
Asn Thr Gly275
Ser Gly Cys290
Ala Gln Gly305
Glu Arg Pro
Pro Ala Lys
Val Val Val355
Gly Ala Asn370
Leu Gly Asn385
Lys Val Cys
Thr Leu Leu
Tyr Ser Arg435
Asp Tyr Pro450
Ile Phe Lys465
Ala Ala Cys
Asp Arg Ser
Val Leu Pro515
Ile His Leu530
Gly Ser Ser545
Leu Phe Leu
Met Leu Leu
Gly Gly Gly595
Lys Pro Cys610
Pro Pro Lys625
Thr Cys ValSer Trp Phe
180
Ala Gly Ile Ala
Val Val Leu Leu215
Gly Gly Asn Ala230
Pro Gly Ala Lys245
His Ile Asn Ser260
Trp Leu Ala Gly
Pro Glu Arg Leu295
Trp Gly Pro Ile310
Tyr Cys Trp His325
Ser Val Cys Gly340
Gly Thr Thr Asp
Asp Thr Asp Val375
Trp Phe Gly Cys390
Gly Ala Pro Pro405
Cys Pro Thr Asp420
Cys Gly Ser Gly
Tyr Arg Leu Trp455
Val Arg Met Tyr470
Asn Trp Thr Arg485
Glu Leu Ser Pro500
Cys Ser Phe Thr
His Gln Asn Ile535
Ile Ala Ser Trp550
Leu Leu Ala Asp565
Ile Ser Gln Alà580
Ser Val Asp Lys
Ile Cys Thr Val615
Pro Lys Asp Val630
Val Val Asp Ile645
Val Asp Asp Val660
185 Tyr Phe Ser Met Val200 Leu Phe Ala Gly Val 220Gly Arg Thr Thr Ala 235 Gln Asn Ile Gln Leu 250 Thr Ala Leu Asn Cys 265 Leu Phe Tyr Gln His280 Ala Ser Cys Arg Arg 300Ser Tyr Ala Asn Gly 315 Tyr Pro Pro Arg Pro 330 Pro Val Tyr Cys Phe 345 Arg Ser Gly Ala Pro360 Phe Val Leu Asn Asn 380Thr Trp Met Asn Ser 395 Cys Val Ile Gly Gly 410 Cys Phe Arg Lys His 425 Pro Trp Ile Thr Pro440 His Tyr Pro Cys Thr 460Val Gly Gly Val Glu 475 Gly Glu Arg Cys Asp 490 Leu Leu Leu Sér Thr 505 Thr Leu Pro Ala Leu520 Val Asp Val Gln Tyr 540Ala Ile Lys Trp Glu 555 Ala Arg Val Cys Ser 570 Glu Ala Ala Gly Leu 585 Lys Ile Val Pro Arg600 Pro Glu Val Ser Ser 620Leu Thr Ile Thr Leu 635 Ser Lys Asp Asp Pro 650 Glu Val His Thr Ala 665
190
Gly Asn Trp Ala205
Asp Ala Glu Thr
Gly Leu Val Gly240
Ile Asn Thr Asn255
Asn Glu Ser Leu270
Lys Phe Asn Ser285
Leu Thr Asp Phe
Ser Gly Leu Asp 320Cys Gly Ile Val 335 Thr Pro Ser Pro 350 Thr Tyr Ser Trp365 Thr Arg Pro ProThr Gly Phe Thr 400Val Gly Asn Asn 415 Pro Glu Ala Thr 430 Arg Cys Met Val445 Ile Asn Tyr ThrHis Arg Leu Glu 480Leu Glu Asp Arg 495 Thr Gln Trp Gln 510 Ser Thr Gly Leu525 Leu Tyr Gly ValTyr Val Val Leu 560Cys Leu Trp Met 575 Val Arg Pro Gln 590 Asp Cys Gly Cys605 Val Phe Ile Phe
Thr Pro Lys Val640
Glu Val Gln Phe655
Gln Thr Gln Pro670Arg Glu Glu Gln675
Ile Met His Gln690
Asn Ser Ala Ala705
Lys Gly Arg Pro
Glu Gln Met Ala 740
Phe Phe Pro Glu755
Ala Glu Asn Tyr770
Tyr Phe Val Tyr785
Gly Asn Thr Phe
His Thr Glu Lys 820
Arg Ser Thr Arg835
Phe Asn Ser Thr Phe Arg680
Asp Trp Leu Asn Gly Lys695
Phe Pro Ala Pro Ile Glu710
Lys Ala Pro Gln Vãl Tyr725 73 0
Lys Asp Lys Val Ser Leu745
Asp Ile Thr Val Glu Trp'' 760
Lys Asn Thr Gln Pro Ile775
Ser Lys Leu Asn Val Gln790
Thr Cys Ser Val Leu His805 810
Ser Leu Ser His Ser Pro825
Gly Ser
Ser Val Ser Glu Leu Pro685
Glu Phe Lys Cys Arg Val700
Lys Thr Ile Ser Lys Thr715 720
Thr Ile Pro Pro Pro Lys735
Thr Cys Met Ile Thr Asp750
Gln Trp Asn Gly Gln Pro765
Met Asp Thr Asp Gly Ser780
Lys Ser Asn Trp Glu Ala795 800
Glu Gly Leu His Asn His815
Gly Leu Gln Ser Leu Ser830

Claims (49)

1. Antígeno quimérico para despertar uma respostaimunológica, o referido antígeno quimérico caracterizadopor compreender um domínio de resposta imunológica e umdomínio de ligação de alvo, em que o domínio de respostaimunológica compreende um antígeno de hepatite C (HCV) e odomínio de ligação de alvo compreende um fragmento deanticorpo.
2. Antígeno quimérico, de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpoê fragmento de anticorpo xenotípico.
3. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que oantígeno quimérico desperta uma resposta imunológicahumoral, uma resposta imunológica celular, ou tanto umaresposta imunológica humoral quanto uma respostaimunológica celular.
4. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que oantígeno quimérico desperta uma resposta imunológica Thl,uma resposta imunológica Th2 ou uma resposta imunológicatanto Thl quanto Th2.
5. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de quea resposta imunológica é uma resposta imunológica in vivo.
6. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato deque o domínio de resposta imunológica compreende mais deuma proteína.
7. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fatode que o domínio de resposta imunológica compreende uma oumais porções imunogênicas de uma ou mais proteínasselecionadas do grupo que consiste em uma proteína centraldo HCV (1-191) , uma proteína central do HCV (1-177) , umaproteína p7 do HCV, uma proteína El do HCV, uma proteína E2do HCV, uma proteína E1-E2 do HCV, uma proteína NS3 do HCV,uma proteína NS4B do HCV, e uma proteína NS5A do HCV.
8. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelofato de que o domínio de ligação de alvo é capaz de seligar a uma célula apresentadora de antígeno (APC).
9. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um fragmento Fc.
10. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizadoainda por compreender um ou mais de um tag 6xHis, um sítiode clivagem de protease, e um vinculador para ligação do domínio de resposta imunológica e do domínio de ligação dealvo.
11. Antígeno quimérico, de acordo com a reivindicação-10, caracterizado pelo fato de que o vinculador éselecionado do grupo que consiste em zíperes de Ieucina7 biotina ligada à avidina, e uma ligação peptídicacovalente.
12. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11,caracterizado pelo fato de que o antígeno quimérico é glicosilado.
13. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12,caracterizado pelo fato de que o antígeno quimérico églicosilado com manose.
14. Antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13,caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpocompreende um fragmento de cadeia pesada de imunoglobulina.
15. Antígeno quimérico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento de cadeiapesada de imunoglobulina compreende uma região dedobradiça.
16. Antígeno quimérico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fragmento de cadeiapesada de imunoglobulina compreende todo ou uma parte de umfragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste naCHI, na região de dobradiça, no domínio CH2, e no domínioCH3.
17. Método de liberação de um antígeno a uma célulaapresentadora de antígeno, o método caracterizado porcompreender a administração à célula apresentadora deantígeno de um antígeno quimérico de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,- 14, 15 ou 16.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a célula apresentadora deantígeno é uma célula dendrítica.
19. Método de ativação de uma célula apresentadora deantígeno, o método caracterizado por compreender o contatoda célula apresentadora de antígeno com um antígenoquimérico de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,-6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 OU 16.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o contato ocorre ex vivo.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o contato ocorre in vivo.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o contato ocorre em um serhumano.
23. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que ométodo compreende a administração a um indivíduo de umacomposição que compreende um antígeno quimérico dareivindicação 1, e em que a célula apresentadora deantígeno está no indivíduo.
24. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21, 22 ou 23, caracterizado pelo fato de queo contato resulta em uma resposta imunológica humoral, umaresposta imunológica celular ou tanto uma respostaimunológica humoral quanto uma resposta imunológicacelular.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a resposta imunológicacelular é uma ou mais de uma resposta Thl, uma respostaTh2, e uma resposta de CTL.
26. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de queo indivíduo tem, ou tem probabilidade de ter, uma condiçãopassível de tratamento imunológico.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a condição passível detratamento imunológico é uma infecção aguda.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a condição passível detratamento imunológico é uma infecção crônica.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que a infecção crônica é umainfecção viral crônica por hepatite C.
30. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 26, 27, 28 ou 29, caracterizado pelo fato deque a condição passível de tratamento imunológico é umainfecção viral por hepatite Ceo domínio de respostaimunológica compreende uma ou mais porções antigênicas deuma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma proteína central do HCV (1-191), uma proteína centraldo HCV (1-177) , uma proteína El do HCV, uma proteína E2 doHCV, uma proteína E1-E2 do HCV, uma proteína P7 do HCV, umaproteína NS 3 do HCV, uma proteína NS4B do HCV, e umaproteína NS5A do HCV.
31. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30,caracterizado pelo fato de que o indivíduo é vacinadocontra uma infecção viral.
32. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31,caracterizado pelo fato de que o indivíduo é vacinadoprofilaticamente contra uma infecção viral.
33. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que oindivíduo é vacinado terapeuticamente contra uma infecçãoviral existente.
34. Método de produção de um antígeno quiméricocaracterizado por compreender:(a) o fornecimento de um microorganismo ou uma célula,o microorganismo ou a célula compreendendo umpolinucleotídeo que codifica um antígeno quimérico; e(b) o cultivo do referido microorganismo ou célula sobcondições nas quais o antígeno quimérico é expresso.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de que o microorganismo ou a célulaé um microorganismo ou célula eucariótica.
36. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que acélula é uma célula de levedura, uma célula de planta ouuma célula de inseto.
37. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de queo antígeno quimérico é modificado após a tradução paracompreender glicosilação.
38. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 34, 35, 36 ou 37, caracterizado pelo fato deque o antígeno quimérico é modificado após a tradução paracompreender uma glicosilação de manose.
39. Polinucleotídeo que codifica um antígenoquimérico, o referido polinucleotídeo caracterizado porcompreender uma primeira porção do polinucleotídeo quecodifica um domínio de resposta imunológica e uma segundaporção do polinucleotídeo que codifica um domínio deligação de alvo, em que o domínio de ligação de alvocompreende um fragmento de anticorpo.
40. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 39,caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo éum fragmento de anticorpo xenotípico.
41. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 3 9 ou 40, caracterizado pelo fato de que opolinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeosselecionada do grupo que consiste nas seqüências denucleotídeos estabelecidas nos IDS. DE SEQ. Nos: 39 e 41--51.
42. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 39, 4 0 ou 41, caracterizado pelo fato de queo polinucleotídeo codifica um antígeno quimérico que é pelomenos 90% idêntico a uma seqüência de aminoácidos inteiraselecionada do grupo que consiste nas seqüências deaminoácidos estabelecidas nos IDS. DE SEQ. Nos: 4 0 e 52-62.
43. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 39, 40, 41 ou 42, caracterizado pelo fato deque o polinucleotídeo hibridiza seletivamente sob condiçõesrigorosas para um polinucleotídeo que possui uma seqüênciade nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nasseqüências de nucleotídeos estabelecidas nos IDS. DE SEQ.Nos: 39 e 41-51.
44. Vetor caracterizado por compreender opolinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 39, 40,-41, 42 OU 43.
45. Vetor, de acordo com a reivindicação 44,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo estáligado operacionalmente a um elemento regulador datranscrição (TRE).
46. Microorganismo ou célula caracterizado porcompreender o polinucleotídeo de qualquer uma dasreivindicações 39, 40, 41, 42 ou 43.
47. Produto manufaturado caracterizado por compreenderum antígeno quimérico de qualquer uma das reivindicações 1,-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 OU 16 einstruções para a administração do antígeno quimérico a umindivíduo que dele necessita.
48. Composição farmacêutica caracterizada porcompreender um antígeno quimérico de qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15 ou 16 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
49. Método de produção de um antígeno quiméricocaracterizado por compreender:(a) o fornecimento de um microorganismo ou uma célula,o microorganismo ou a célula compreendendo umpolinucleotídeo que codifica um domínio de ligação de alvo-molécula vinculadora, em que o domínio de ligação de alvo-molécula vinculadora compreende um domínio de ligação dealvo ligado a uma molécula vinculadora;(b) o cultivo do referido microorganismo ou célula sobcondições pelas quais o domínio de ligação de alvo-moléculavinculadora é expresso; e(c) o contato do domínio de ligação de alvo-moléculavinculadora e de um domínio de resposta imunológica sobcondições que permitam a ligação do vinculador ao domíniode resposta imunológica, a ligação resultando em umantígeno quimérico.
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