KR101330663B1

KR101330663B1 - 재조합 ｈｐｖ 16형 ｅ6 또는 ｅ7 융합 이뮤노글로불린

Info

Publication number: KR101330663B1
Application number: KR1020100114846A
Authority: KR
Inventors: 전태훈; 김상훈; 이석준
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2013-11-15
Also published as: KR20120053627A

Abstract

본 발명은 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HPV 16형 E6 단백질 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HPV 16형 E7 단백질과 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역(Fc region)으로 이루어진 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 HPV 16형 E7 또는 E7 융합 이뮤노글로불린은 수지상 세포(dendritic cell)의 성숙을 효과적으로 유도하며, 생쥐에서 상기 융합 이뮤노글로불린을 처리하면 T helper 1 세포의 항원 특이적인 활성을 일으킨다. 이는 결국, HPV 16형의 인체 내 감염동안 새로운 항원 특이적인 수지상 세포 치료법(antigen-specific dendritic cell therapy)의 이용에 대한 가능성을 제시하며, 본 발명의 융합 이뮤노글로불린을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 백신 조성물은 이미 자궁경부암 진단을 받은 환자들에게는 이용이 불가한 예방용 HPV 백신들을 대신하여 자궁경부암 환자의 효과적인 치료제의 하나로 선택될 수 있다.

Description

재조합 ＨＰＶ 16형 Ｅ6 또는 Ｅ7 융합 이뮤노글로불린 {E6 or E7 fusion immunoglobulin from human papillomavirus type 16}

본 발명은 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HPV 16형 E6 단백질 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HPV 16형 E7 단백질과 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역(Fc region)으로 이루어진 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린에 관한 것이다.

인간 파필로마바이러스(Human papillomavirus, HPV)는 파필로마바이러스과에 속하며, 200 가지 종류의 HPV들은 목표조직이 어디냐에 따라 피부성 HPV 또는 점막성 HPV로 분류된다 [zur Hausen H, (1999) Papillomaviruses causing cancer: evasion from host-cell control in early events in carcinogenesis. J Natl Cancer Inst 92:690-698]. 피부성 HPV의 목표조직은 피부의 편평상피이고, HPV는 그곳에 사마귀를 형성한다. 점막성 HPV는 생식기, 구강, 결막성 유두종의 점막을 목표조직으로 하고, HPV는 그 곳에 상피세포의 증식과 악성종양의 형성을 유도한다 [Orth G and Favre M, (1985) Human papillomaviruses. Biochemical and biologic properties. Clin Dermatol 3:27-42].

점막성 HPV의 네 종류 HPV(HPV 16형, HPV 18형, HPV 31형 및 HPV 45형)는 자궁경부암(cervical cancer)에서 발견되는 악성세포와 밀접한 연관이 있기 때문에, 점막성 HPV는 수많은 가장 위험한 감염원들 중 하나이다. 특히, HPV 16형 단독으로 또는 다른 세 가지 종류의 HPV(HPV 18형, HPV 31형 및 HPV 45형)와 함께 공동감염이 되면, 그것은 자궁암의 결정적인 일차요인으로 여겨진다 [Harro CD, Pang YY, Roden RB, Hildesheim A, Wang Z, Reynolds MJ, Mast TC, Robinson R, Murphy BR, Karron RA, Dillner J, Schiller JT, and Lowy DR, (2001) Safety and immunogenicity trial in adult volunteers of a human papillomarvirus 16 L1 virus-like particle vaccine. J Natl Cancer Inst 93:284-292]. 세계적으로 자궁경부암은 여성들 사이에서 만연하게 나타나는 암들 중 하나이다. 사실 자궁경부암은 전 세계에서 여성에게 두 번째로 만연하는 암 종이며, 사망의 원인이 되는 질병이다 [Harro CD et al., (2001) Safety and immunogenicity trial in adult volunteers of a human papillomarvirus 16 L1 virus-like particle vaccine. J Natl Cancer Inst 93:284-292].

HPV 16형 감염 후의 종양생성은 주로 HPV 16형에서 기인한 E6, E7 단백질의 활성에 의존한다. HPV 16형이 숙주에 침입하는 동안, 이들 단백질들의 기능적인 역할은 세포증식을 혼란하게하고 바이러스의 증식을 촉진하는 것이다 [SyrjSM and SyrjKJ (1999) New concepts on the role of human papillomavirus in cell cycle regulation. Ann Med 31:175-187]. 숙주세포에서 나타나는 증상은 E6 단백질이 p53에 결합하여 p53의 급격한 분해를 매개하고, 세포주기를 G1기에 정지시켜서 세포자멸사(apoptosis)를 촉진하고, 숙주세포에서의 DNA 수선을 막는다 [SyrjSM et al., (1999) New concepts on the role of human papillomavirus in cell cycle regulation. Ann Med 31:175-187]. 또한 E7 단백질과 인산화된 pRB와의 결합은 인산화된 pRB의 기능을 제대로 작동하지 않게 하여, E2F-1의 활성에 이르게 한다. 그리고 E2F-1은 숙주세포가 S기에 들어가는 데에 필수적인 여러 유전자들의 전사를 시작한다. 따라서 E6, E7 단백질은 전반적으로 세포증식을 촉진하는 것과 종양생성을 도입한다 [SyrjSM et al., (1999) New concepts on the role of human papillomavirus in cell cycle regulation. Ann Med 31:175-187].

최근, HPV에 의해 도입되는 자궁경부암에 대한 예방백신 두 가지(Gardasil 및 Cervarix)가 상업적으로 이용가능하다 [Astbury K and Turner MJ (2009) Human papillomavirus vaccination in the prevention of cervical neoplasia. Int J Gynecol Cancer 19:1610-1613]. 가다실(Gardasil)은 HPV 6형, HPV 11형, HPV 16형 및 HPV 18형으로부터 보호하는 4가(quadrivalent) HPV 백신의 상업적 이름이고, 서바릭스(Cervarix)는 HPV 16형 및 HPV 18형에 대한 2가(bivalent) 백신의 상업적 이름이다 [Astbury K et al., (2009) Human papillomavirus vaccination in the prevention of cervical neoplasia. Int J Gynecol Cancer 19:1610-1613]. 그러나 시판되고 있는 예방용 HPV 백신들은 자궁경부암으로 이미 진단을 받은 환자에게는 이용이 불가능하다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, HPV 16형의 E6 또는 E7 단백질과 이뮤노글로불린을 연결하여 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 제조하였으며, 상기 융합 이뮤노글로불린을 미성숙 수지상 세포에 처리하는 경우, 수지상 세포의 성숙을 효과적으로 유도할 뿐만 아니라 Th1 세포의 항원 특이적인 활성을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 HPV 16형 E6 또는 E7 단백질과 인간 이뮤노글로불린의 Fc 영역으로 이루어진 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 이뮤노글로불린을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 백신 조성물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명은 상기 융합 이뮤노글로불린을 처리에 의해 활성화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 항원 특이적 수지상 세포치료제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HPV 16형 E6 단백질 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HPV 16형 E7 단백질과 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역(Fc region)으로 이루어진 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 제공한다.

상기 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린은 HPV 16형의 E6 또는 E7 단백질과 항체의 중쇄(heavy chain)의 일정부위(constant region)를 가지는 이뮤노글로불린(Immunoglobulin, Ig)과 연결하여 제조하였다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 인간 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 인간 이뮤노글로불린 중 항원이 결합하는 Fab 영역(fragment antigen binding region) 이외의 영역으로서 백혈구나 마크로파지(macrophage) 등과 결합할 수 있는 어떤 영역도 될 수 있으며, 구체적으로 그 서열은 NCBI의 CAA75032에서 얻을 수 있다.

또한 상기 HPV 16형 E6 단백질 또는 E7 단백질과 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역사이에는 flexible region인 힌지(hinge)서열이 포함될 수 있으며, 본 발명에서 상기 힌지 서열은 인간 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 연결된 것을 그대로 사용하였다.

또한 상기 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린은 HPV 16형 E6 단백질 또는 E7 단백질의 N' 말단에 Ig 리더 펩타이드(Ig leader peptide)를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 용어 "Ig 리더 펩타이드(leader peptide)"는 분비성 단백질 전구체의 N-말단에 존재하고, 또한 천연 성숙 단백질에는 존재하지 않는 서열을 나타내며, 리더 펩타이드는 단백질 전구체로부터 절단되는 펩타이드를 나타낸다. 일반적으로 리더 서열은 세포 외로의 분비에 따라 프로테아제(또는 시그날 펩타이드)에 의해 절단된다. 이러한 리더 펩타이드는 생물종을 초월하여 일정한 공통된 서열상의 특징을 갖지만 어떤 생물종으로 분비기능을 나타내는 리더 펩타이드가 다른 생물종에서도 반드시 분비기능을 발휘한다는 것은 아니다. 프리프로 단백질 또는 프리 단백질에서, 당해 리더 펩타이드는 상이한 단백질 유래일 수 있거나, 목적 단백질에 천연으로 존재하는 리더 펩타이드일 수 있고, 사용하는 숙주의 분비형 단백질 유래가 바람직하다. 또는 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적인 코돈을 갖도록 변형할 수 있다. 또한 본 발명의 목적에 사용할 수 있는 리더 펩타이드는 이로부터 유래하는 천연 성숙 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 일부 함유할 수 있다. 본 발명에서는 구체적으로 "METDTLLLWVLLLWVPGSTGD"의 아미노산 서열을 갖는 리더 펩타이드를 사용하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 HPV 16형 E6 또는 E7 유전자와 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 HPV 16형 E6 또는 E7 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 재조합 발현벡터는 상기 HPV E6 16형 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 발현시킬 수 있는 복제 가능한 어떤 발현벡터도 될 수 있으나, 바람직하게 도 2b의 개열지도를 갖는 HPV16E6-Ig/pLNCX2 또는 HPV16E7-Ig/pLNCX2인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 볼 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 숙주세포는 상기 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 발현하여 분비할 수 있는 어떠한 동물세포도 가능하나, 바람직하게는 CHO(chinese hamster ovary) 세포, COS-7(Monkey, African green) 세포, NIH/3T3(Mouse fibroblast) 세포, BHK-21(Baby Hamster kidney, Syrian golden) 세포, Hela(Human Carcinoma) 세포, Vero(Monkey kidney, African green) 세포, 및 C127(Mouse) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포를 사용하는 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 CHO 세포를 사용하는 것이 높은 형질전환율로 인하여 좋다. 본 발명의 실시예에서는 Tetracycline off system의 293GPG 세포와 포유동물 유래 세포주인 CHO 세포를 이용하여 형질전환 시켰다. 상기 293GPG 세포를 거쳐 형질전환하면 더욱 안정적으로 발현이 유지되고, 타겟 세포에 독성을 거의 주지 않는 장점이 있기 때문에 293GPG 세포를 거쳐 CHO 세포로 형질전환시켰다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 조성물은 상기 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린에 의해 항원 특이적 수지상 세포(dendritic cell)의 활성화 및 항원 특이적 Th1(T helper 1) 림프구의 활성화를 초래하는 것을 특징으로 한다.

Th1 패턴은 HPV-양성의 여성에게서 우월하게 나타나는데, 이러한 Th1 사이토카인의 반응은 이후의 자궁경부의 HPV 감염의 제거와 연관이 된다 [Scott M, Stites DP, Moscicki AB. Th1 cytokine patterns in cervical human papillomavirus infection. Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Sep;6(5):751-5].

본 발명의 구체적인 실시예에서는 포유류 세포에서의 발현을 확인한 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 이용하여 수지상 세포의 활성 및 항원 특이적 Th1 림프구 활성 여부를 확인하였다.

미성숙 수지상 세포에 본 발명의 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 처리하는 경우, 성숙한 수지상 세포에서만 관찰되는 pro-inflammatory cytokine들의 mRNA 전사량이 측정되었으며, 뿐만 아니라 co-stimulatory molecule의 발현이 증가함을 확인하였다. 상기의 결과로 본 발명의 융합 이뮤노글로불린이 수지상 세포를 활성화시킴을 알 수 있다. 또한 생쥐의 미성숙 수지상 세포에 본 발명의 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 처리한 후 생쥐의 비장세포로부터 IL-2 및 IFN-γ의 발현을 확인해본 결과, 대조구인 인간 IgG1을 처리한 군에 비해 본 발명의 융합 이뮤노글로불린을 처리한 군에서 Th1 cytokine인 IL-2 및 IFN-γ의 분비량이 현저히 증가하였다. 따라서 본 발명의 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린이 Th1 림프구의 활성화를 유도함을 알 수 있다.

본 발명의 자궁경부암 치료용 백신 조성물이 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 본 발명의 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인살 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 주사제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 건강상태, 질병 증상의 정도, 음식, 투여시간, 투여방법 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 당 0.01 ~ 100 mg이 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 수지상 세포에 상기 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 처리하는 것을 포함하는 항원 특이적 수지상 세포의 활성화 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "수지상 세포의 활성화"란 수지상 세포가 항원 신호와 공동자극분자 신호를 T 세포에게 전달할 수 있음으로써 T 세포의 항원특이적 면역반응을 유도할 수 있음을 의미한다.

또한 본 발명은 상기에 따라 활성화된 항원 특이적 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 항원 특이적 수지상 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 미성숙 수지상 세포에 처리하면 성숙 수지상 세포로의 분화를 유도하여 항원 특이적 수지상 세포의 활성화를 유도한다 (도 4 참조). 따라서 본 발명의 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린에 의해 활성화된 항원 특이적 수지상 세포는 HPV 감염에 의한 질환의 세포치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 세포치료제 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 복강내주사, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 상기 세포치료제는 자궁경부암의 예방 및 치료를 위하여 상기 개체에 단독으로 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 세포치료제의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 세포치료제 조성물은 인간에게 일 회 내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 세포 수가 1×10³ 개/kg ~ 1×10⁹ 개/kg, 바람직하게는 1×10⁴ 개/kg ~ 1×10⁸ 개/kg 이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 HPV 16형 E6 또는 E7 단백질을 이용하여 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 제조할 수 있다.

본 발명의 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린은 수지상 세포(dendritic cell)의 성숙을 효과적으로 유도하며, 생쥐에서 상기 융합 이뮤노글로불린을 처리하면 T helper 1 세포의 항원 특이적인 활성을 일으킨다. 이는 결국, HPV 16형의 인체 내 감염 동안 새로운 항원 특이적인 수지상 세포 치료법(antigen-specific dendritic cell therapy)의 이용에 대한 가능성을 제시하며, 본 발명의 융합 이뮤노글로불린을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 백신 조성물은 이미 자궁경부암 진단을 받은 환자들에게는 이용이 불가한 예방용 HPV 백신들을 대신하여 자궁경부암 환자의 효과적인 치료제의 하나로 선택될 수 있다.

도 1은 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린의 유전자 구축 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 발현벡터 pLNCX2의 개열지도를 나타낸 것이며, 도 2b는 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 HPV16E6-Ig/pLNCX2(도 2b의 (A)) 또는 HPV16E7-Ig/pLNCX2(도 2b의 (B))의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질의 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린의 처리에 따른 미성숙 수지상 세포의 성숙화를 RT-PCR로 검증한 결과이며, 도 4b는 유세포 분석기를 이용하여 세포표면의 물질을 분석함으로써 수지상 세포의 성숙화를 검증한 결과이다 (iDC; 미성숙 수지상 세포, LPS; LPS 처리 미성숙 수지상 세포, E6 Ig; HPV 16형 E6 융합 Ig 처리 미성숙 수지상 세포, E7 Ig; HPV 16형 E7 융합 Ig 처리 미성숙 수지상 세포).
도 5는 재조합 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린의 처리에 따른 항원 특이적 Th1 림프구 활성화 결과를 나타낸 것이다 (control Ig; 음성대조구로 사용된 인간 IgG1 처리, E6 Ig; HPV 16형 E6 융합 Ig 처리, E7 Ig; HPV 16형 E7 융합 Ig 처리).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 재조합 수용성 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 유전자의 클로닝

RT-PCR을 이용하여 본 발명의 재조합 수용성 HPV E6 및 E7 이뮤노글로불린 유전자의 클로닝을 수행하였다.

먼저, Caski 세포(cat # CRL-1550)는 HPV 16형 positive 세포주로서 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 세포배양 하였다. HPV 16형 E6 및 E7의 cDNA를 얻기 위해, 상기 Caski 세포를 트리졸(Trizol; Invitrogen) 1 ml당 200 μl의 클로로포름(Chloroform; Sigma)을 넣고 전체 RNA를 분리한 후, 추출한 2 μg의 mRNA를 주형으로 역전사 연쇄중합반응(RT-PCR)에 의해 cDNA를 복제하였다. 상기 cDNA를 주형으로하여 유전자 데이터베이스(database)에서 얻은 염기서열에 따라 하기 표 1의 각각의 프라이머를 제작한 후, 연쇄중합반응을 통해 HPV 16형 E6 및 E7의 cDNA를 획득하였다. 이때, 유전자 클로닝을 쉽게 하기 위해, 정방향 프라이머에 XhoⅠ site를 포함시켰으며, 역방향 프라이머에는 SmaⅠ site를 포함시켰다. 상기 부위는 하기 프라이머의 밑줄 친 부분과 같다. 또한 역전사 효소는 Superscript Ⅲ(Invitrogen)를 사용하였으며, 중합효소는 Tag polymerase(Gene craft)를 사용하였다. 그 결과 PCR product를 얻었으며, 상기 PCR product의 크기는 각각 492, 312 bp이다.

[표 1. HPV 16형 프라이머]

실시예 2. 재조합 수용성 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 발현 플라스미드 제조

HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 유전자로부터 단백질을 발현시키기 위해, HPV 16형 E6 또는 E7 유전자를 포유류의 발현벡터인 pLNCX2(도 2a, CLONTECH)에 클로닝하였다.

먼저, 5' 말단에 제한효소 XhoⅠ의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단부위를 만들고, 3' 말단에도 제한효소 SmaⅠ의 절단 분위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단부위를 만들었다. 이후, 인간 이뮤노글로불린(human Ig)의 Fc region의 cDNA를 HPV E6 또는 E7 유전자의 3' 말단 쪽에 융합(fusion)시켰다. 각각의 융합된 이뮤노글로불린의 유전자 모식도는 도 1에 나타낸 바와 같다. 융합시 사용된 제한효소 부위는 5' 말단에 제한효소 SmaⅠ, 3' 말단에 제한효소 NotⅠ을 사용하였다 (도 1 참조). 상기 제한효소 절단부위의 염기서열은 하기와 같다.

XhoⅠ: CTC GAG

SmaⅠ : CCC GGG

NotⅠ : GCG GCC GC

그 결과 도 1의 구조로된 재조합 HPV 16형 E6 Ig 또는 E7 Ig 융합 이뮤노글로불린을 발현하는 유전자 재조합 벡터 HPV16E6-Ig/pLNCX2(도 2b의 (A)) 또는 HPV16E7-Ig/pLNCX2(도 2b의 (B))를 완성하였다.

실시예 3. 형질전환세포주 제작

재조합 수용성 HPV E6 및 E7 Ig 유전자를 클로닝 한 후, 각각 Tetracycline off system의 293GPG 세포와 포유동물 유래 세포주인 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 사용하여 형질전환 시켰다. 우선, 293GPG 세포를 6-웰(well) 조직 배양 플레이트에 웰(well)당 1×10⁵ 세포가 되도록 접종한 후, 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 세포가 웰(well) 표면의 70 ~ 80% 정도를 덮을 정도로 자라면, 혈청이 무첨가된 DMEM 배지에서 1 ~ 2 μg의 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린(Ig) 발현 벡터 DNA를 6 ~ 8 μg의 Lipofectamine plus(Invitrogen)를 사용하여 293GPG 세포에 도입시켰다. 그 후, 상기 발현 벡터가 도입된 293GPG 세포를 24 시간 동안 배양하여 바이러스(레트로바이러스, retrovirus)를 포함하는 배양 상층액으로 이용하여 숙주세포(CHO cell)를 4 ~ 5 시간 동안 배양한 후, 혈청이 10% 함유된 배지로 바꿔서 24 시간 배양하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 상기 CHO 세포는 형질도입된 세포를 얻기 위해 G418 항생제 1.5 mg/ml을 처리하여 유전자가 발현되는 세포를 얻었다.

실시예 4. 재조합 수용성 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질 발현 및 정제

재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질이 포유류 세포에서 과발현된다는 것을 확인하기 위해, 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer; 20 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 0.5% Triton X-100)를 사용하여 형질전환된 CHO 세포에서 세포 용해물을 얻어내었다. 그 후, 10% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동을 한 후, membrane(Amersham Hybond-p, GE Healthcare)으로 단백질을 이동시킨 후, 일차항체(primary amtibody)로 염소 항-인간이뮤노글로불린 항체를 결합시키고, 이차항체(secondary antibody)로 HRP가 결합된 항-염소이뮤노글로불린 항체를 결합시킨 후, Chemiluminescent Substrate(Thermo, 34080)로 발색하여 코닥 필름(KODAK Biomax Light Film, 868 9358)에 노광시켰다. 음성비교군으로 벡터만을 도입한 CHO 세포를 사용하였다. 이와 더불어 형질전환된 세포를 배양한 상층액에 발현되어 분비된 단백질을 확인하기 위해 ELISA kit(R&D systems)를 통하여 확인하였다.

상기의 방법으로 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질의 발현을 확인하였으며, 확인된 형질전환 세포를 배양하여 얻은 배양 상층액으로부터 발현 단백질을 정제하기 위해 Protein A agarose kit(553-50-00, KPL)를 사용하였다. 먼저, Protein A agarose column에 wash/binding buffer(0.1 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.4)를 통과시킨 다음 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 함유한 배양 상층액을 통과시켜, Protein A와 IgG의 결합력을 이용하여 컬럼(column)에 흡착시켰다. 흡착된 단백질들은 Elution buffer(0.2 M Glycine, pH 3±1.85)를 이용하여 다시 용출시켜 정제하였다. 용출된 시료는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시한 후, 쿠마시블루(coomassie blue)로 염색하여 발현된 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 확인하였다. 상기 단백질 정제 결과는 도 3에 나타내었다.

단백질의 크기는 E6 융합 이뮤노글로불린의 경우, reducing 조건에서는 단량체(monomer) 상태이기 때문에 48.5 kDa이며, non-reducing 조건에서는 이량체(dimer)를 이루기 때문에 97 kDa이다. 또한 E7 융합 이뮤노글로불린의 경우, reducing 조건에서는 40 kDa이고, non-reducing 조건에서는 80 kDa이다. 확인된 단백질들은 PBS에 투석한 후, -70 ℃에 보관한 후 이후의 실험에 사용하였다.

실시예 5. 재조합 수용성 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 이용한 항원 특이적 수지상 세포의 활성화

생쥐 수지상 세포는 C57BL/6 생쥐의 골수세포에서 유래하였으며, 20 ng/ml의 IL-4와 20 ng/ml의 GM-CSF를 넣어 일주일간 배양한 후, 미성숙 수지상 세포(immature DC)로 유도하였다. 그 후 양성 대조구로 100 ng/ml의 LPS를 넣어 일주일간 배양하여 미성숙 수지상 세포를 성숙한 수지상 세포(mature DC)로의 분화를 유도하였다. 또한, HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질 100 ng/ml을 LPS와 동일한 방법으로 세포 배양 배지에 첨가하여 미성숙 수지상 세포를 성숙한 수지상 세포로의 분화를 유도하였다. 이후, RT-PCR과 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 이용한 항원 특이적 수지상 세포의 활성화를 검증하였다.

RT-PCR은 상기 실시예 1에 기술한 바와 동일하게 수행하였으며, 이때 사용된 프라이머는 하기와 같다. 그리고 유세포 분석기를 이용한 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 이용한 항원 특이적 수지상 세포의 활성화를 측정하기 위해 수지상 세포에 LPS, 만들어진 재조합 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 처리한 후, FITC로 표지된 anti-mouse CD86 항체(BDpharmingen)로 염색하고, 유세포 분석기를 통해 형광강도를 측정하였다. 측정 결과는 도 4a 및 4b에 나타내었다.

[표 2. 프라이머]

RT-PCR 결과, HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 미성숙 수지상 세포에 처리하면, 성숙 수지상 세포에서만 관찰되는 주요 pro-inflammatory cytokine(IL-1β, IL-6, IL-12)의 mRNA 전사량이 확인되었다 (도 4a 참조). 또한 유세포 분석기 분석 결과, HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 재조합 단백질을 미성숙 수지상 세포에 처리하면, 성숙 수지상 세포에서 세포표면 발현이 증가되는 주요 co-stimulatory molecule인 CD80과 CD86의 발현이 증가됨을 확인할 수 있다 (도 4b 참조). 상기의 결과로 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 미성숙 수지상 세포에 처리하면 항원 특이적 수지상 세포의 활성화가 일어남을 알 수 있다.

실시예 6. 재조합 수용성 HPV 16형 E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질을 이용한 항원 특이적 Th1 림프구 활성화

재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린을 이용한 항원 특이적 Th1 림프구 활성화를 측정하기 위해, C57BL/6 생쥐의 미성숙 수지상 세포(1×10⁶ cell)에 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 재조합 단백질을 처리한 후, 동일한 유전적 배경을 가진 C57BL/6 생쥐의 꼬리 정맥에 투여하였다. 이때, 음성 대조구로 인간 IgG1을 처리한 동일한 수의 수지상 세포를 C57BL/6 생쥐의 꼬리 정맥에 투여하였다. 수지상 세포를 투여한지 7 일 후, 수용자(donor) 생쥐의 비장에서 비장세포(splenocytes)를 분리한 후, 96-웰 플레이트(well plate)에 1×10⁶ cell로 접종한 후, 100 ng/ml의 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질 또는 100 ng/ml의 인간 IgG1(음성대조구, negative control)을 처리하였다. 처리한지 3일 후, IL-2 EH는 IFN-γ의 분비량을 sandwich ELISA kit(Invitrogen)을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 음성대조구인 인간 IgG1 처리군에 비해, HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린 단백질 처리군이 Th1 cytokine인 IL-2 또는 IFN-γ의 분비량이 현저히 증가한 것을 알 수 있었다 (도 5 참조). 상기의 결과로 보아, 본 발명의 재조합 수용성 HPV E6 또는 E7 융합 이뮤노글로불린이 항원 특이적 Th1 림프구 활성화를 유도함을 알 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(1) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HPV 16형 E6 단백질과 (2) 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역(Fc region)으로 이루어진 재조합 HPV 16형 E6 융합 이뮤노글로불린.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 HPV 16형 E6 융합 이뮤노글로불린은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 HPV 16형 E6 융합 이뮤노글로불린.
서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 HPV 16형 E6와 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 3항에 있어서, 상기 HPV 16형 E6 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 3항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 도 2b의 개열지도를 갖는 HPV16E6-Ig/pLNCX2인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 3항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 6항에 있어서, 상기 숙주세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주세포.
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시험관 내(in vitro)에서 수지상 세포에 제 1항에 따른 재조합 HPV 16형 E6 융합 이뮤노글로불린을 처리하는 것을 포함하는 항원 특이적 수지상 세포의 활성화 방법.
제 10항에 따라 활성화된 항원 특이적 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제 조성물.