KR20210084125A - 신규 사이토메갈로바이러스 dna 백신 컨스트럭트 및 그의 용도 - Google Patents

신규 사이토메갈로바이러스 dna 백신 컨스트럭트 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 CMV 백신에 사용되는 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 신호서열, 막통과 도메인이 결실된 CMV gB 및 CMV 피막 단백질 pp65의 435 내지 438번째 아미노산 위치에서 절단되어 생성되는 N-말단 단편과 C-말단 단편의 순서가 뒤바뀌어 연결된 셔플드 CMV pp65 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 사이토메갈로바이러스 DNA 백신 컨스트럭트 및 그의 용도{A novel DNA vaccine construct for CMV and use thereof}
본 발명은 백신 컨스트럭트 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 사이토메갈로바이러스(CMV) DNA 백신 컨스트럭트 및 그의 용도에 관한 것이다.
사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, 이하, 'CMV'로 약칭함)는 단순포진바이러스문(the order Herpesvirales), 단순포진바이러스과(the family Herpesviridae), 베타헤르세프바이러스 아과(the subfamily Betaherpesvirinae)에 속하는 직경크기가 150 내지 200 nm 정도의 바이러스를 지칭한다. 인간과 원숭이는 자연 숙주의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이 속에는 현재까지 인간을 주로 감염시키는 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV, 인간 단순포진바이러스 5, HHV-5)를 포함하는 8종이 알려져 있다. HHV-5와 연관된 질병에는 선열(glandular fever) 및 폐렴이 포함된다.
CMV에 감염되는 것은 매우 일반적인 일로서, 혈액검사를 할 경우 성인 중 60~90%가 언젠가 한 번 CMV에 감염된 적이 있었던 것으로 보고된 바 있다. 이와 같이, CMV는 매우 쉽게 확산되며, 감염된 사람들은 몇 달 동안 소변 또는 타액으로 바이러스를 배출할 수 있고, 또한 자궁경관 점액, 정액, 배설물 및 모유를 통해 배출될 수 있다. 따라서 CMV는 성적 및 비성적 접촉을 통해 확산된다. 임신부가 감염되는 경우, 태아가 임신 기간 동안 감염되거나, 아기가 분만 동안 감염될 수 있으며, CMV 감염은 감염된 혈액 수혈이나 감염된 장기 이식을 받은 사람들에게서 나타날 수 있다. CMV는 감염 직후에 증상들을 유발할 수 있으며, 다양한 조직들 내에 일생 동안 잠복(비활성) 상태로 남아 있을 수 있다. 다양한 자극이 잠복 중인 CMV를 재활성화할 수 있고 질병을 일으킬 수 있다. 일반적으로 이 CMV 감염은 아무런 증상을 일으키지 않으나, 일부 감염된 사람들은 아프다고 느끼고 발열이 나타나며, 청소년 및 청년들에게 발생한 CMV 감염은 감염단핵구증과 유사한 발열 및 피로 증상과 함께 질병을 유발할 수 있다. 만일 CMV로 오염된 혈액을 수혈받으면, 발열 및 때때로 간 염증이 2~4주 후에 나타나기 시작한다.
한편, 심각한 증상은 전형적으로 출생 전에 감염된 유아(신생아의 몇 가지 감염) 및 예를 들어, AIDS에 걸렸거나 또는 장기 이식 검사를 받은 면역체계가 약화된 사람들에게만 나타난다. 이식 장기 거부를 막기 위해 면역체계를 억제하는 약물(면역억제 약물)을 복용하기 때문에 장기 이식을 받은 사람들은 특히 CMV 감염에 취약하다. 면역체계가 약화된 사람들의 경우, 질병은 종종 잠복 바이러스의 재활성화로 인해 초래된다. 만일 심하게 면역체계가 약해진 사람이 CMV에 감염된 경우에는, 감염이 더 심해질 수 있고 때때로 심한 질병 또는 사망으로 이어질 수 있다. AIDS에 감염된 사람들의 경우, CMV 감염은 일반적인 바이러스성 합병증이다. CMV 바이러스는 눈 망막을 감염시키는 경향이 있으며, 이 감염(CMV 망막염)은 실명을 일으킬 수 있고, 뇌 감염(뇌염), 폐렴 또는 장 또는 식도의 고통스러운 궤양들이 발생할 수 있다.
그러나, 현재까지 CMV는 그 감염이 만연해 있음에도 불구하고 그 증상이 그리 크지 않다는 점 때문에 예방 및 치료를 위한 백신 또는 치료제의 개발이 거의 이루어지지 않았다. 현재 장기이식 후 CMV 감염을 예방하는 방법으로는 일반적 예방(universal prophylaxis) 및 선제적 치료(preemptive therapy)를 통해 CMV 감염증을 예방하는 방법이 사용되고 있는데, 전자는 CMV의 복제 여부와 무관하게 이식 후 일정 기간 항바이러스제를 투약하는 방법이고, 후자는 정기적인 검사를 통해 CMV 복제가 확인된 경우 치료를 시작하는 방법으로 이 경우에도 마찬가지로 ganciclovir, valganciclovir와 같은 항바이러스제를 처방한다.
그러나, 이들 항바이러스제들의 경우 과반수의 환자들이 백혈구 감소증, 기회감염(opportunistic infection) 등 심각한 부작용을 겪는 것으로 보고되고 있다(조윤숙 및 문미라, 병원약사회지, 제30권 제5호 pp. 408-414, 2013).
현재, CMV 백신으로는 코돈 최적화된 DNA 백신인 Vical사의 ASP0113 CMV 백신이 유일하게 임상 3상을 완료한 바 있다(US7,410,795B2).
한편, BK 바이러스(BK virus, 이하, 'BKV'로 약칭함)는 소아마비 바이러스과에 속하는 바이러스로, 인간에게 광범위하게 감염이 되어 있는 바이러스다. 그러나 감염의 유의한 증상은 면역결핍 및 면역억제의 예외적인 경우를 포함하여 일반적이지 않다. BKV는 1971년 B.K.라는 이니셜을 갖는 신장 이식 환자의 소변으로부터 최초로 분리가 되었는데, 다른 바이러스인 JC 바이러스(JCV)와 75%의 서열 상동성을 갖는 등 유사하다. 이들 바이러스 모두 특이적인 항체를 이용한 혈청학적 분석 또는 PCR 기반의 유전자형 분석을 수행함에 의해 확인 및 구분이 가능하다. BKV는 아주 드물게 질병을 유발하는데 이 경우는 신장이식을 받은 환자에서 발생한다. 따라서, 대부분의 감염된 사람은 무증상이다. 증상이 나타나는 경우도 있으나, 호흡기 감염 또는 발열 정도의 가벼운 증상을 나타내는 경향이 있다. 이러한 가벼운 증상을 일차 BK 감염이라고 한다.
BKV는 신장 및 요도로 전파되어 개체의 일생동안 머무른다. 집단의 80% 정도가 잠복기 상태의 BKV에 감염되어 있고, 신체가 일부 형태의 면역억제를 겪을 때까지 발병 없이 잠복해 있는 것으로 여겨진다. 전형적으로 이러한 면역억제는 신장 이식 또는 다중-기관 이식이 수행되는 환경에서 일어난다. 이들 면역결핍 개체에서의 발병은 보다 심각하다. 임상적인 증상은 신장 기능장애, 및 신장 관 세포 및 염증세포가 검출되는 비정상적 소변검사이다. 신장 이식 환자의 1-10% 정도가 BK 바이러스 연관 신장병증을 겪는 것으로 알려져 있고, 이들 환자의 80%는 결국 이식 신장을 상실한다고 한다. 신장염의 개시는 이식 후 수일에서 적어도 5일 내로 발생한다.
미국특허 US9,771,413은 소아마비 바이러스의 폴리펩타이드와 특이적으로 결합할 수 있는 인간-유래 항체를 개시하고 있는데, 상기 항체는 JC 바이러스 및/또는 BK 바이러스 유형의 소아마비 바이러스에 더 잘 결합한다고 알려져 있다.
그러나, 상기 선행기술의 CMV 백신은 2018년 1월 조혈모세포 이식 임상에서의 면역반응 증진 효능을 입증하지 못하고 최종적으로 해당 임상이 실패했음이 발표된 바 있다. 따라서, 기존 백신의 한계인 CMV 특이적인 T세포 면역반응을 효과적으로 증진시킬 수 있는 백신의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인, 특히 장기이식 환자의 바이러스 재활성을 예방할 수 있는 CMV DNA 백신 컨스트럭트 및 이를 포함하는 효과적인 CMV DNA 백신 조성물의 제공을 목적으로 한다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 신호서열 및 막통과 도메인이 결실된 CMV gB, 제1링커펩타이드, CMV 피막 단백질 pp65의 438 내지 561번째 아미노산을 포함하되, 435 내지 438 번째 아미노산을 포함하는 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 C-말단 단편, 제2링커펩타이드 및 CMV 피막 단백질 pp65의 1 내지 435번째 아미노산을 포함하되 상기 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 N-말단 단편을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 핵산분자가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자컨스트럭트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 유전자컨스트럭트를 포함하는 발현벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 신호서열 및 막통과 도메인이 결실된 CMV gB, 제1링커펩타이드, CMV 피막 단백질 pp65의 438 내지 561번째 아미노산을 포함하되, 435 내지 438 번째 아미노산을 포함하는 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 C-말단 단편, 제2링커펩타이드 및 CMV 피막 단백질 pp65의 1 내지 435번째 아미노산을 포함하되 상기 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 N-말단 단편을 포함하는 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자컨스트럭트, 상기 발현벡터 및 상기 융합단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 CMV 감염의 예방 및 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 장기 이식 후 CMV 및 BKV 재활성화 예방방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 CMV DNA 백신은 단독으로 또는 백신보조제와 함께 사용하여, 장기이식 및 조혈모이식 등의 이식질환의 위중한 부작용으로 작용하는 CMV 감염증의 예방 및 치료를 위해 매우 효율적으로 사용이 가능하다. 더 나아가 BKV 백신 컨스트럭트와 함께 사용함으로써 장기이식 환자의 가장 큰 부작용인 CMV 및 BKV의 재활성화에 따른 심각한 위험에 대한 예방을 가능하게 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV DNA 백신 유전자 컨스트럭트인 BD-03A의 구조를 개략적으로 나타내는 유전자 맵이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 BK 바이러스 DNA 백신 유전자 컨스트럭트인 BD-03B의 구조를 개략적으로 나타내는 유전자 맵이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 보조제인 BD-121의 구조를 개략적으로 나타내는 유전자 맵이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 보조제인 BD-121A의 구조를 개략적으로 나타내는 유전자 맵이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신조성물(BD-03A:BD-03B:BD-121= 1:1:1)을 COS7 세포주에 처리시 투여량에 따른 Flt3L의 발현 정도를 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신조성물(BD-03A:BD-03B:BD-121= 1:1:1)을 COS7 세포주에 처리시 CMV 항원 단백질인 gB 및 BK 바이러스 항원인 VP1의 발현여부를 웨스턴블랏 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다:
Mock: 공벡터
clinical: hBD-121를 이용한 임상 시료
pre-clinical: mBD-121를 이용한 비임상 시료.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물 BD-03A+BD-121 및 BD-03B+BD-121을 COS7 세포주에 처리시 CMV 항원 단백질인 gB 및 BK 바이러스 항원인 VP1의 각각 발현여부를 웨스턴블랏 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물을 이용하여 동물실험을 수행하기 위한 백신 조성물의 단일 투여스케쥴을 나타낸다.
도 5b는 상기 도 5a의 스케쥴대로 동물실험을 수행한 결과 CMV 항원(gB 및 pp65) 및 BK 바이러스 항원(VP1) 특이적 면역반응을 나타낸 T 세포의 수를 ELISPOT 분석으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물을 이용하여 동물실험을 수행하기 위한 백신 조성물 2차 투여스케쥴을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 보조제인 BD-121을 COS-7 세포주에 형질도입시 투여량에 따른 IL-12p35(좌측) 및 IL-21(우측)의 발현정도를 ELISA 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 보조제인 BD-121을 COS-7 세포주에 형질도입시 투여량에 따른 IL-12p35(좌측), IL-12p40(중앙) 및 IL-21(우측)의 발현 정도를 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물의 단일 투여스케쥴을 나타낸다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV 백신 조성물(BD-03A)을 단독 또는 백신 보조제인 BD-121과 병용하여 투여하였을 때, CMV 항원 단백질인 pp65(좌측) 및 gB(우측)에 특이적인 반응을 나타낸 T 세포를 ELISPOT 분석으로 계수한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV 백신 조성물(BD-03A)을 단독 또는 BD-121과 병용하여 투여하였을 때, CMV-특이적인 항체반응을 항-gB IgG 항체를 이용하여 ELISA 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물의 이차 투여스케쥴을 나타낸다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물(BD-03A+BD-03B+BD-121)를 1차례 투여한 후(priming) BD-121 투여량의 변화에 따른 gB(좌측) 및 pp65(우측)-특이적인 면역반응을 나타낸 T 세포의 수를 ELISPOT으로 계수한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10c는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물(BD-03A+BD-03B+BD-121)를 2차례 투여한 후(priming 및 boosting), BD-121 투여량의 변화에 따른 gB(좌측) 및 pp65(우측)-특이적인 면역반응을 나타낸 T 세포의 수를 ELISPOT으로 계수한 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 신호서열 및 막통과 도메인이 결실된 CMV gB, 제1링커펩타이드, CMV 피막 단백질 pp65의 438 내지 561번째 아미노산을 포함하되, 435 내지 438 번째 아미노산을 포함하는 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 C-말단 단편, 제2링커펩타이드 및 CMV 피막 단백질 pp65의 1 내지 435번째 아미노산을 포함하되 상기 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 N-말단 단편을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 핵산분자가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자컨스트럭트가 제공된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다. 상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커(linker) 펩타이드가 삽입될 수 있는데, 연결되는 폴리펩타이드의 본래의 기능을 제한하지 않고, 융합단백질의 발현을 저해하지 않는 유연성 펩타이드 링커라면 어느 것이라도 사용이 가능하며, 구체적인 예시는 상술한 바와 같다.
상기 유전자컨스트럭트에 있어서, 상기 융합단백질은 N-말단에 다른 단백질 유래 신호서열을 추가로 포함할 수 있고, 상기 융합단백질은 상기 신호서열 및 상기 CMV gB 사이에 Flt3L이 추가로 삽입된 것일 수 있다. 더 나아가, 상기 융합단백질은 상기 Flt3L 및 상기 CMV gB 사이에 제3링커펩타이드가 추가로 포함된 것일 수 있다.
상기 유전자컨스트럭트에 있어서, 상기 CMV gB는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 CMV pp65 C-말단 단편은 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 상기 CMV pp65 N-말단 단편은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 유전자컨스트럭트에 있어서, 상기 제1 내지 제3링커펩타이드는 각각 독립적으로 GSGSGSGSGSGRA(서열번호 3), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 5), (G4S, 서열번호 55)n(n은 1 내지 10 사이의 정수), (GSSGGS, 서열번호 56)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 57), EGKSSGSGSESKST(서열번호 58), GSAGSAAGSGEF(서열번호 59), (EAAAK, 서열번호 60)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 61), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 62), GGGGGGGG(서열번호 63), GGGGGG(서열번호 64), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 65), PAPAP(서열번호 66), (Ala-Pro)n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 67), PLGLWA(서열번호 68), TRHRQPRGWE(서열번호 69), AGNRVRRSVG(서열번호 70), RRRRRRRR(서열번호 71), GFLG(서열번호 72), 또는 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 73)일 수 있다.
상기 유전자컨스트럭트에 있어서, 상기 신호서열은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 유전자컨스트럭트에 있어서, 상기 Flt3L은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나의 유전자컨스트럭트를 포함하는 발현벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 신호서열 및 막통과 도메인이 결실된 CMV gB, 제1링커펩타이드, CMV 피막 단백질 pp65의 438 내지 561번째 아미노산을 포함하되, 435 내지 438 번째 아미노산을 포함하는 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 C-말단 단편, 제2링커펩타이드 및 CMV 피막 단백질 pp65의 1 내지 435번째 아미노산을 포함하되 상기 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 N-말단 단편을 포함하는 융합단백질이 제공된다.
상기 융합단백질은 N-말단에 다른 단백질 유래 신호서열을 추가로 포함할 수 있고, 상기 융합단백질은 상기 신호서열 및 상기 CMV gB 사이에 Flt3L이 추가로 삽입된 것일 수 있다. 더 나아가, 상기 융합단백질은 상기 Flt3L 및 상기 CMV gB 사이에 제3링커펩타이드가 추가로 포함된 것일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 CMV gB는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 CMV pp65 C-말단 단편은 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 상기 CMV pp65 N-말단 단편은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 제1 내지 제3링커펩타이드는 각각 독립적으로 GSGSGSGSGSGRA(서열번호 3), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 5), (G4S, 서열번호 55)n(n은 1 내지 10 사이의 정수), (GSSGGS, 서열번호 56)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 57), EGKSSGSGSESKST(서열번호 58), GSAGSAAGSGEF(서열번호 59), (EAAAK, 서열번호 60)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 61), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 62), GGGGGGGG(서열번호 63), GGGGGG(서열번호 64), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 65), PAPAP(서열번호 66), (Ala-Pro)n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 67), PLGLWA(서열번호 68), TRHRQPRGWE(서열번호 69), AGNRVRRSVG(서열번호 70), RRRRRRRR(서열번호 71), GFLG(서열번호 72), 또는 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 73)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 중 어느 하나 이상의 유전자컨스트럭트, 상기 발현벡터 및 상기 융합단백질으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물이 제공된다.
상기 백신 조성물은 장기이식 후 체내 잠복하고 있던 CMV의 재활성화의 예방을 위한 것일 수 있다.
상기 백신 조성물은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다:
ⅰ) BK 바이러스의 캡시드 단백질 1(BKV VP1), 캡시드 단백질 2(BKV VP2), 작은 T 항원(ST)의 N-말단 단편(BKV ST-N), ST의 중간 단편(BKV ST-M), 및 ST의 C-말단 단편(BKV ST-C), 큰 T 항원(LT)의 1 내지 44번째 아미노산으로 구성된 제1 N-말단 단편(BKV LT-N1), LT의 45 내지 107번째 아미노산으로 구성된 제2 N-말단 단편(BKV LT-N2), LT의 108 내지 403번째 아미노산으로 구성된 제1 C-말단 단편(BKV L2-C1), LT의 404 내지 595번째 아미노산으로 구성된 제2 C-말단 단편(BKV LT-C2) 및 LT의 596 내지 695번째 아미노산으로 구성된 제3 C-말단 단편(BKV LT-C3)이 뒤섞인 셔플드 융합단백질;
ⅱ) 상기 셔플드 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자컨스트럭트; 및
ⅲ) 상기 제2유전자컨스트럭트를 포함하는 발현벡터.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 셔플드 융합단백질은 BK 바이러스의 캡시드 단백질 1(BKV VP1), 캡시드 단백질 2(BKV VP2), 작은 T 항원(ST)의 N-말단 단편(BKV ST-N), ST의 중간 단편(BKV ST-M), 및 ST의 C-말단 단편(BKV ST-C), 큰 T 항원(LT)의 1 내지 44번째 아미노산을 포함하는 제1 N-말단 단편(BKV LT-N1), LT의 45 내지 107번째 아미노산을 포함하는 제2 N-말단 단편(BKV LT-N2), LT의 108 내지 403번째 아미노산을 포함하는 제1 C-말단 단편(BKV L2-C1), LT의 404 내지 595번째 아미노산을 포함하는 제2 C-말단 단편(BKV LT-C2) 및 LT의 596 내지 695번째 아미노산을 포함하는 제3 C-말단 단편(BKV LT-C3)이 뒤섞인 것일 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 셔플드 융합단백질은 BKV VP1, BKV LT-N1, BKV VP2, BKV LT-N2, BKV ST-N, BKV LT-C1, BKV ST-M, BKV LT-C2, BKV ST-C 및 BKV LT-C3의 순으로 구성되는 것일 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV VP1은 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV VP2은 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV ST-NΔ는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV ST-M은 서열번호 23으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV LT-N1은 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV LT-N2는 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV LT-C1은 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV LT-C2는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV ST-C은 서열번호 24로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 BKV LT-C3는 서열번호 25로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 셔플드 융합단백질은 N-말단에 신호서열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 셔플드 융합단백질은 적어도 하나 이상의 면역증진 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 면역증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있다.
상기 백신 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 백신 면역보조제를 추가로 포할 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 백신 면역조보제는 IL-12 단백질 및 IL-21 단백질을 유효성분으로 포함하거나 상기 IL-12 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 IL-21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 T 림프구 특이적 면역반응 촉진용 백신 면역보조제일 수 있다.
선택적으로, 상기 백신 면역보조제로는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알룸(포타슘 알루미늄 설페이트), MF59, virosome, AS04[알루미늄 하이드록사이드 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)의 혼합물], AS03(DL-α-tocopherol, squalene 및 유화제인 polysorbate 80의 혼합물), CpG, Flagellin, Poly I:C, AS01,AS02, ISCOMs 및 ISCOMMATRIX 등이 사용될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "보조제(adjuvant)" 또는 "백신 면역보조제(vaccine adjuvant)"는 백신의 면역반응을 향상시킬 목적으로 투여되는 약학적 또는 면역학적 제제를 의미한다.
상기 백신 조성물에 있어서,
상기 백신보조제는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다:
ⅰ) p35 사슬(IL-12p35) 및 p40 사슬(IL-12p40)로 구성된 IL-12 단백질 및 IL-21 단백질;
ⅱ) 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 각각 작동가능하게 연결된 제3 내지 제5유전자컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터;
ⅲ) 상기 제3 내지 제5유전자컨스트럭트를 각각 포함하는 제3 내지 제5발현벡터
ⅳ) 상기 제3내지 제5유전자컨스트럭트 중 둘 및 나머지 하나가 각각 포함된 제6발현벡터 및 제7발현벡터;
ⅴ) 상기 IL-12p35 및 IL-12p40 중 어느 하나에 IL-21이 연결된 융합단백질 및 상기 IL-12p35 및 IL-12p40 중 상기 융합단백질에 포함되지 않은 펩타이드;
ⅵ) 상기 v의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제6유전자컨스트럭트 및 상기 융합단백질에 포함되지 않은 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제7유전자컨스트럭트를 포함하는 제8발현벡터;
ⅶ) 상기 제6유전자컨스트럭트 및 제7유전자컨스트럭트를 각각 포함하는 제9발현벡터 및 제10발현벡터;
ⅷ) 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 둘 이상이 내부 리보솜 진입 부위(IRES)로 연결된 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제8유전자컨스트럭트; 및 선택적으로 상기 세 폴리뉴클레오타이드 중 상기 제8유전자컨스트럭트에 포함되지 않은 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제9유전자컨스트럭트를 포함하는 제11발현벡터;
ⅸ) 상기 제8유전자컨스트럭트를 포함하는 제12발현벡터 및 상기 제9유전자컨스트럭트를 포함하는 제13발현벡터; 및
ⅹ) 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 mRNA 분자.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 IL-12p35 단백질은 서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-12p35와 상동성 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 인체 내에서 면역반응을 유도하지 않을 수준의 높은 상동성을 가진 비인간 예컨대 영장류나 유인원 유래의 IL-12p35의 사용도 가능하다. 상기 IL-12p40 단백질은 서열번호 37로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-12p40과 상동성 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 인체 내에서 면역반응을 유도하지 않을 수준의 높은 상동성을 가진 비인간 예컨대 영장류나 유인원 유래의 IL-12p40의 사용도 가능하다. 상기 IL-21 단백질은 서열번호 42로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-21과 상동성 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 인체 내에서 면역반응을 유도하지 않을 수준의 높은 상동성을 가진 비인간 예컨대 영장류나 유인원 유래의 IL-21의 사용도 가능하다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 백신 면역보조제는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다:
ⅰ) MIP-1α 단백질;
ⅱ) 상기 MIP-1α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제10유전자컨스트럭트; 및
ⅲ) 상기 MIP-1α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질 중 어느 하나 이상에 IRES 또는 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 작동가능하게 연결된 제11유전자컨스트럭트; 및
ⅳ) MIP-1α 단백질을 암호화하는 mRNA.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 제10유전자컨스트럭트 또는 상기 제11유전자컨스트럭트는 별도의 발현벡터에 포함되거나, 상기 제1발현벡터 내지 제11발현벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현벡터 내에 포함될 수 있다.
상기 백신 조성물에 있어서, 상기 MIP-1α 단백질은 서열번호 45로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 MIP-1α 단백질과 상동성 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 인체 내에서 면역반응을 유도하지 않을 수준의 높은 상동성을 가진 비인간 예컨대 영장류나 유인원 유래의 MIP-1α 단백질의 사용도 가능하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 CMV 감염의 예방 및 치료방법이 제공된다.
상기 CMV 감염의 예방 및 치료방법에 있어서, 상기 백신 조성물은 생체 내 전기천공법에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 장기 이식 후 CMV 및 BKV 재활성화 예방방법이 제공된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다. 상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 원핵세포내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX27(특허 제1442254호), pX(Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris (1995) Cell 75, 791-803) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham-Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더서열이다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 유전자컨스트럭트가 포함된 벡터가 제공된다.
또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 DNA 백신 제조용 벡터인 pGX27(한국 등록특허 제1442254호)을 사용하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 발현벡터는 숙주세포에서 상기 융합단백질을 발현하도록 할 수 있는 발현벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포가 제공된다. 상기 숙주세포는 세균, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포일 수 있고, 상기 세균은 그람음성균, 그람양성균일 수 있으며, 상기 동물 세포는 곤충세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 상기 포유동물 세포는 쥐, 생쥐, 원숭이, 햄스터, 개, 말, 소, 고양이, 돼지, 코끼리, 원숭이, 영장류 또는 인간으로부터 분리된 초도배양 세포 또는 확립된 세포주일 수 있다.
상기 백신 조성물은 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 일 실시예에 따른 백신 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물은 일반적인 전신성 투여 또는 국소성 투여, 예컨대, 근육내 주사 또는 정맥 주사 방식으로 투여될 수 있으나, DNA 백신 조성물로 제공되는 경우, 가장 바람직하게는 전기천공기(electroporator)를 이용하여 주입될 수 있다. 상기 전기천공기는 시판 중인 DNA 약물 체내 주입용 전기천공기, 예컨대, 이탈리아의 IGEA 사의 GlinporatorTM, 한국의 JCBIO사의 CUY21EDIT, 스위스의 Supertech사의 SP-4a 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 일 실시예에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 투여경로는 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 활막강 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 일 실시예에 따른 백신 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
상기 백신 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 DNA는 100 ng/체중(kg) - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㅅg/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 50 ㅅg/kg(체중)으로 투여될 수 있는데, 상기 요소들을 고려하여 투여량이 조절될 수 있다.
아울러 본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 CMV 감염증의 예방 및 치료방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 CMV 감염증은 장기이식에 의해 발생하는 증상일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 백신 조성물은 생체 내 전기천공법에 의해 투여될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: CMV DNA 백신의 제조
본 발명자들은 CMV DNA 백신에 포함되는 항원단백질로 외피 단백질(envelope protein)로서 세포막과 융합하여 바이러스의 세포내 유입에 관여하는 것으로 알려진 당단백질 B(gB)와 주요 외피단백질(tegument protein)으로 CMV 감염에 대항하는 숙주세포의 면역반응을 조절 및 상쇄하는 단백질인 pp65 단백질을 선정하였고, 생체 내에서 이미 감염된 바이러스와의 재조합에 의한 바이러스 활성화의 위험성을 제거하기 위해 gB의 경우 막통과 도메인을 제거하고, pp65 단백질의 경우 N-말단과 C-말단의 위치를 뒤바꾸는 이른바 뒤섞임 단백질(shuffled protein)의 형태로 고안하였다(도 1 및 표 1). 아울러, 형질도입된 세포에서 세포 외부로 분비가 되도록 인간 tPA(tissue plasminogen activator) 유래의 리더서열(서열번호 1)을 N-말단에 부가하고, 면역반응을 촉진시키기 위한 목적으로 신호서열이 제거된 Flt-3L 단백질(Flt3L27-182, 서열번호 2), 링커펩타이드 1[(GS)5, 서열번호 3, 신호서열 및 막통과 도메인이 제거된 gB(gBΔ1-22, Δ726-771, 서열번호 4), 링커펩타이드 2[(G4S)4, 서열번호 5], pp65-C(a.a. 436-561, 서열번호 6), 링커펩타이드 3(서열번호 5) 및 pp65-N(a.a. 1-435, 서열번호 7)의 순으로 구성되는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 합성한 후, 양 말단에 제한효소 Kpn I(5') 및 Xba I(3') 인식부위를 부가시킨 후, 이를 클로닝 벡터인 pUC57에 삽입한 후, 이를 다시 DNA 백신용 발현벡터인 pGX27 벡터(대한민국 특허 제1442254호)의 Kpn I 및 Xba I 인식 부위를 이용하여 삽입하였다. 상기 발현벡터는 E. coli(DH5α)를 숙주세포로 하여 열충격법으로 유전자 도입을 하여 유지 및 벡터 생산에 사용하였다. 본 발명자들은 상기와 같은 제조된 CMV DNA 백신 컨스트럭트를 "BD-03A"로 명명하였다.
본 발명의 CMV DNA 백신 컨스트럭트의 구성
구성요소 구체적인 구조
(아미노산 서열번호, 핵산 서열번호)		 기원
BD-03A tPA tPA1-22 (1, 8) Uniprot: P00750
Flt3L Flt3L△1-26 (2, 9) Uniprot: P49771
linker 1 (GS)5 (3, 10) Bergeron et al., Biotechnol. Bioeng. 102(5): 1316-1322, 2009
CMV gB gBΔ1-22, Δ726-771 (4, 11) AD169 strain, GenBank ID: CAA35414.1)
linker 2 (G4S)4 (5, 12) Bergeron et al., Biotechnol. Bioeng. 102(5): 1316-1322, 2009
CMV pp65-C pp65436-561 (6, 13) AD169 strain, GenBank ID: CAA35357.1)
linker 3 (G4S)4 (5, 14) Bergeron et al., Biotechnol. Bioeng. 102(5): 1316-1322, 2009
CMV pp65-N pp651-435 (7, 15) AD169 strain, GenBank ID: CAA35537.1)
실시예 2: BKV DNA 백신의 제조
본 발명자들은 궁극적으로 CMV 및 BKV 두 가지 바이러스에 대한 예방 및 치료용 2가 백신을 제조할 목적으로 BKV DNA 백신 컨스트럭트를 제조하였다.
이를 위해, 본 발명자들은 BKV DNA 백신에 포함되는 항원단백질로 캡시드 단백질로서 세포막과 융합하여 바이러스의 세포내 유입에 관여하는 것으로 알려진 VP1 및 VP2, 바이러스 유전자 복제 및 숙주세포 유전자 형질전환에 관여하는 LT(large T-antigen) 및 바이러스의 복제에 관여하는 ST(small T-antigen) 단백질을 선정하였고, 생체 내에서 이미 감염된 바이러스와의 재조합에 의한 바이러스 활성화의 위험성을 제거하기 위해 LT 및 ST의 경우 각각 5개 및 3개의 단편으로 나누고 상기 VP1 및 VP2와 무작위적으로 뒤섞은 셔플드 융합단백질로 발현되도록 고안하였다(도 2 및 표 2). 삽입하고자 하는 셔플드 융합단백질의 길이가 상대적으로 길기 때문에 2단계 클로닝 공정을 사용하였다. 구체적으로, 우선 형질도입된 세포에서 세포 외부로 분비가 되도록 인간 tPA(tissue plasminogen activator) 유래의 리더서열(서열번호 1)을 N-말단에 부가하였고, 면역반응을 촉진시키기 위한 목적으로 신호서열이 제거된 Flt-3L 단백질(Flt3L27-182, 서열번호 2), 링커펩타이드 1[(GS)5, 서열번호 3], BKV VP1(a.a. 1-362, 서열번호 16), BKV LT-N1(LT1-44, 서열번호 17), 및 BKV VP2(a.a. 1-351, 서열번호 18)으로 구성된 첫 번째 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 합성한 후, 5'-말단 및 3'-말단에 각각 Kpn I 및 Not I 인식부위를 부가한 후, 이를 Kpn I 및 Not I을 절단한 pUC57벡터에 삽입하여 클로닝 한 후 이를 pGX27 벡터(대한민국 특허 제1442254호)의 Kpn I 및 Not I 인식 부위를 이용하여 삽입하였다. 이어, BKV LT-N2(LT45-107, 서열번호 19), BKV-ST-NΔ(ST63-111, 서열번호 20), BKV LT-C1(LT108-403, 서열번호 21), BKV ST-M(ST112-138, 서열번호 22), BKV LT-C2(LT404-595, 서열번호 23), BKV ST-C(ST139-172, 서열번호 24), 및 BKV LT-C3(LT596-695, 서열번호 25)의 순서로 구성되는 두 번째 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 합성한 후, 양 말단에 제한효소 Not I(5') 및 Xba I(3') 인식부위를 부가시킨 후, 이를 클로닝 벡터인 pUC57에 삽입하여 클로닝하고, Not I 및 Xba I로 절단시켜 제조된 단편을 상기 첫 번째 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 pGX27 벡터의 Not I 및 Xba I 인식부위를 이용하여 삽입함으로써 전체 길이의 셔플드 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 발현벡터를 제조하였다. 본 발명자들은 상기와 같은 제조된 BKV DNA 백신 컨스트럭트를 "BD-03B"로 명명하였다.
아울러 상기 실시예 1에서 제조된 BD-03A와 BD-03B를 함께 포함하는 2가 DNA 백신을 "BD-03"으로 명명하였다.
본 발명의 BKV DNA 백신 컨스트럭트의 구성
구성요소 구체적인 구조
(아미노산 서열번호, 핵산 서열번호)		 기원
BD-03B tPA tPA1-22 (1, 8) Uniprot: P00750
Flt3L Flt3L△1-26 (2, 9) Uniprot: P49771
linker (GS)5 (3, 10) Bergeron et al., Biotechnol. Bioeng. 102(5): 1316-1322, 2009
BKV VP1 VP11-362 (16, 26) GenBank ID: YP_717939.1
BKV VP2 VP21-351 (18, 28) GenBank ID: P03094.3
BKV ST NΔ ST63-111 (20, 30) GenBank ID: YP_717941.1
M ST112-138 (22, 32)
C ST139-172 (24, 34)
BKV LT N1 LT1-44 (17, 27) GenBank ID: YP_717940.1
N2 LT45-107 (19, 29)
C1 LT108-403 (21, 31)
C2 LT404-595 (23, 33)
C3 LT596-695 (25, 35)
실시예 3: 인간 IL-12 및 IL-21 발현 벡터의 제조
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 상기 BD-03A 및 BD-03B의 DNA 백신으로서의 면역반응을 극대화시키기 위한 목적으로 새로운 DNA 계통의 T 면역반응 특이적 백신 보조제를 개발하였다. 사전 연구를 통해 IL-12 및 IL-21이 백신투여에 따른 T 세포 특이적인 면역반응을 촉진시킬 수 있음을 확인하여, 상기 백신 보조제의 성분으로 IL-12 및 IL-21을 선정하였다.
3-1: 단일 벡터 시스템
본 발명자들은 인간 IL-12 단백질의 두 소단위체인 서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 hIL-12p35 및 서열번호 37로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 hIL-12p40 폴리펩타이드를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 38 및 39)를 서열번호 40으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-유래 내부 리보솜 진입부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결하였고, 상기 hIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단에 서열번호 41로 기재되는 RSV 프로모터(pRSV), 그리고 서열번호 42로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-21 단백질(hIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 43)를 순차적으로 연결한 유전자컨스트럭트를 제조한 후, 상기 유전자컨스트럭트를 pGX-27 벡터(한국 등록특허 제1442254호)의 다중클로닝 부위에 삽입하여 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터를 제조하고 이를 'hBD-121'으로 명명하였다(도 3a).
3-2: 이중 벡터 시스템
상기 hIL-12p35 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 38) 및 hIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 39)를 서열번호 40으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-IRES에 연결한 이를 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하고, 마찬가지로 인간 IL-21 단백질(hIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 43) 역시 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하여, 이중 벡터 시스템을 제조한다.
3-3: 삼중 벡터 시스템
상기 hIL-12p35 폴리펩타이드, hIL-12p40 폴리펩타이드 및 hIL-21을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 38, 39 및 43)를 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 각각 삽입하여 삼중 벡터 시스템을 제조한다.
실시예 4: 인간 IL-12, IL-21 및 MIP-1α 발현 벡터의 제조
서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 hIL-12p35 및 서열번호 37로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 hIL-12p40 폴리펩타이드를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 38 및 39)를 서열번호 40으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-유래 내부 리보솜 진입부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결하였고, 상기 hIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단에 서열번호 41로 기재되는 RSV 프로모터(pRSV), 그리고 서열번호 42로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 IL-21 단백질(hIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 43)가 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드에 서열번호 44로 기재되는 핵산서열로 구성되는 인간 EF1α 프로모터 및 서열번호 45로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 MIP-1α 단백질(hMIP-1α)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 46)를 순차적으로 연결한 유전자컨스트럭트를 제조하여 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하였으며, 이를 hBD-121A로 명명하였다(도 3b).
실시예 5: 마우스 IL-12 및 IL-21 발현 벡터의 제조
마우스 IL-12 단백질의 두 소단위체인 서열번호 47로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 mIL-12p35 및 서열번호 48로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 mIL-12p40 폴리펩타이드를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 49 및 50)를 서열번호 40으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-유래 내부 리보솜 진입부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결하였고, 상기 mIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단에 서열번호 41로 기재되는 RSV 프로모터(pRSV), 그리고 서열번호 51로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 마우스 IL-21 단백질(mIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 52)를 순차적으로 연결한 유전자컨스트럭트를 제조한 후, 상기 유전자컨스트럭트를 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하여 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터를 제조하고 이를 'mBD-121'으로 명명하였다.
실시예 6: 마우스 IL-12, IL-21 및 MIP-1α 발현 벡터의 제조
서열번호 47로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 mIL-12p35 및 서열번호 48로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 mIL-12p40 폴리펩타이드를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 49 및 50)를 서열번호 40으로 기재되는 핵산서열을 갖는 EMCV-유래 내부 리보솜 진입부위(internal ribosome entry site, IRES)로 연결하였고, 상기 mIL-12p40 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단에 서열번호 41로 기재되는 RSV 프로모터(pRSV), 그리고 서열번호 51로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 마우스 IL-21 단백질(mIL-21)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 52)가 순차적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드에 서열번호 44로 기재되는 핵산서열로 구성되는 인간 EF1α 프로모터 및 서열번호 53으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 마우스 MIP-1α 단백질(mMip-1α)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 54)를 순차적으로 연결한 유전자컨스트럭트를 제조하여 pGX-27 벡터의 다중클로닝 부위에 삽입하였으며, 이를 mBD-121A로 명명하였다.
실험예 1: BD-03의 발현 분석
1-1: ELISA 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV DNA 백신인 BD-03A, BKV DNA 백신인 BD-03B 및 실시예 3-1에서 제조된 hBD-121(임상 시료) 또는 실시예 5에서 제조된 mBD-121(비임상 시료)이 동일 비율로 혼합된 DNA 백신 조성물이 포유동물 세포에 도입시 정상적으로 발현되는지 여부를 확인하기 위해, 포유동물 세포에 상기 백신 조성물을 처리한 후 단백질 발현 여부를 각 컨스트럭트에 포함된 Flt3L에 특이적인 항원을 이용하여 분석하였다.
구체적으로 COS-7 세포주를 100 mm culture dish에 접종하여 16시간 배양 후 공벡터(mock plasmid DNA) 및 실시예 1에서 제조된 다양한 용량(0.5, 1, 2 및 4 ㎍)의 상기 백신 조성물(BD-03A:BD-03B:BD-121=1:1:1)을 Lipofectamine 2000을 이용하여 형질감염시키고, 37℃ CO2 배양기에서 3일 동안 배양 후에 각 조건의 COS-7 세포의 배양 상등액을 회수하여 검체로 사용하였다. 검체 내 존재하는 단백질들은 Flt3L가 결합되어 있는 형태이므로 Flt3L ELISA kit를 이용하여 정량하였다(도 4a).
그 결과, 도 4a에서 나타난 바와 같이, 상기 BD-03은 2 ㎍까지는 형질도입 용량에 비례하여 잘 발현되는 것으로 나타났다. 4 ㎍ 용량의 경우 2 ㎍ 용량에 비해 효율이 다소 떨어지는 것으로 나타났다.
1-2: 웨스턴 블랏 분석
본 발명자들은 상기 실험예 1-1에서 수득한 배양세포의 세포용해물(cell lysate)을 이용하여 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고, 나일론 막으로 전사한 후, 항-gB 항체(Abcam, Cat.# ab6499) 및 항-VP1 항체(Abnova, Cat.# MAB3204-M02)를 이용하여 웨스턴블랏 분석을 수행하였다(도 4b).
그 결과 도 4b에서 확인되는 바와 같이, BD-03는 CMV의 gB 단백질 및 BKV의 VP1을 정상적으로 발현하고 있음을 확인할 수 있었다. 두 단백질 모두 융합단백질의 형태로 발현됨에도 불구하고 항체와 결합활성은 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.
한편, BD-03A 및 BD-121의 1:1 조합 및 BD-03B 및 BD-121의 1:1 조합을 각각 투여한 후, 상기와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과, 도 4c에서 확인되는 바와 같이, BD-03A의 경우 임상 시료 및 비임상 시료 모두 gB가 정상적으로 발현되는 것으로 확인되었고, BD-03B의 경우 마찬가지로 VP1 단백질이 정상적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: BD-03의 생체내 면역반응 분석
2-1: 1차 면역시 T 세포 특이적 면역반응 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-03을 실험동물에 투여한 후 T 세포 특이적인 면역반응을 유발하는지 여부를 각 항원에 대하여 면역반응을 보이는 비장 면역세포의 수를 계수하는 방법을 이용하여 조사하였다. 구체적으로 실험동물인 C57BL/6 마우스를 대조군으로 공벡터 투여군(n=5), 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 백신 조성물(BD-03A:BD-03B:BD-121=1:1:1) 1 ㎍, 4 ㎍ 및 12 ㎍ 투여군(각각 n=5)으로 나누어, 대퇴근육에 OrbiJector(SL VAXiGEN, Korea)로 생체내 전기천공법을 이용하여 한 차례 투여하였고, 투여일로부터 3주 경과 후 실험동물을 희생시킨 다음 비장을 적출하여 각 BD-03에 포함된 각 항원(CMV gB, CMV pp65 및 BKV VPL1, ST, LT)에 특이적으로 반응하는 비장 면역세포를 ELISPOT 분석을 이용하여 계수하였다(도 5a 및 5b).
그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-03은 대조군 대비 CMV 및 BKV 특이적인 T 세포 면역반응을 유도할 수 있었다. 특히 pp65-특이적 T 세포 반응은 투여량에 비례적인 관계를 나타내, CMV pp65의 경우 효율적인 백신용 항원일 수 있음이 확인되었다. 반면 gB 특이적 T 세포 반응은 저용량의 DNA 백신의 투여 시에 pp65에 특이적인 T 세포 반응과 유사한 활성을 나타내었다.
2-2: 부스팅에 의한 효과 분석
본 발명자들은 상기 실험예 2-1의 결과로부터 프라이밍 이후 부스팅시 T 세포 면역반응의 변화를 조사하였다.
구체적으로 실험동물인 C57BL/6 마우스를 대조군으로 공벡터 투여군(n=5), 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 백신 조성물(BD-03A:BD-03B:BD-121=1:1:1) 1 ㎍, 4 ㎍ 및 12 ㎍ 투여군(각각 n=5)으로 나누어, 대퇴근육에 OrbiJector(SL VAXiGEN, Korea)로 생체 내 전기천공법을 이용하여 1차 투여하고(priming), 1차 투여일로부터 3주 경과 후 2차 투여한 후(boosting), 2차 투여일로부터 3주 경과 후 실험동물을 희생시킨 다음 비장을 적출하여 각 BD-03에 포함된 각 항원(CMV gB, CMV pp65 및 BKV VP1, ST, LT)에 특이적으로 반응하는 비장 면역세포를 ELISPOT 분석을 이용하여 계수하였다(도 6a 및 6b).
그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 DNA 백신 BD-03을 프라이밍에 이어 부스팅한 결과, CMV gB 특이적인 T 세포 면역반응은 매우 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며, 투여량 의존성은 보이지 않았다. 반면, pp65-특이적 T 세포 면역반응은 프라이밍만 한 것과 비교하여 큰 차이가 없었다. 한편, BKV-특이적 T 세포 반응의 경우 프라이밍만 한 것과 비교하여 부스팅을 하였을 때, 투여량 의존적인 T 세포 반응의 증가가 관찰되었다. 상기 결과들을 종합적으로 검토하면, 본 발명의 BD-03은 부스팅에 의해 그 효과가 증진이 가능한 DNA 백신임을 알 수 있다.
실험예 3: 백신 보조제로서의 BD-121의 효과 분석
3-1: ELISA 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제조된 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 컨스트럭트를 세포에 형질도입한 후 이들 형질전환 세포에서 IL-12 및 IL-21가 정상적으로 발현되는지 여부를 조사하였다. 구체적으로 COS-7 세포주를 100 mm culture dish에 접종하여 16시간 배양 후 공벡터(mock plasmid DNA) 및 실시예 2-1에서 제조된 BD-121 plasmid DNA로 Lipofectamine 2000을 이용하여 각각 형질감염시키고, 37℃ CO2 배양기에서 3일 동안 배양 후에 각 조건의 COS-7 세포의 배양 상등액을 회수하여 검체로 사용하였다. 검체 내 존재하는 IL-12 및 IL-21 단백질들은 각각 IL-12 및 IL-21을 특이적으로 인식하는 항체(IL-12: R&D Systems, cat.# D1200, IL-21: BioLegend, cat.# 433808)를 이용한 ELISA 분석방법을 이용하여 정량하였다(도 7).
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, BD-121 plasmid DNA를 도입한 검체 내 단백질 발현량은 IL-12의 경우 4 ㎍ DNA 도입시 4,000 pg/ml을 상회하여 정상적으로 발현됨을 확인하였고, IL-21 역시 4 ㎍ DNA 도입시 무려 200 ng/ml에 가까운 수치를 나타내 매우 고발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 한편 공벡터를 도입한 대조군의 경우 양 단백질 모두 전혀 발현되지 않아, 본 발명의 백신 면역보조제 발현 시스템이 정상적으로 작동함을 확인할 수 있었다.
3-2: 웨스턴블랏 분석
본 발명자들은 상기 실험예 3-1에서 수득한 세포의 세포용해물(cell lysate)을 이용하여 SDS-PAGE 전기영동을 수행한 후, nylon 막으로 전사한 후, 항-IL-12A(IL-12p35) 항체(Abcam, cat.# ab131039), 항-IL-12B(IL-12p40) 항체(Abcam, cat.# ab133752) 및 항-IL-21 항체(Abcam, cat.# ab5978)를 이용하여 웨스턴블랏 분석을 수행하였다(도 8).
그 결과 도 8에서 확인되는 바와 같이, IL-12 및 IL-21 모두 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-121 플라스미드 DNA의 형질도입에 의해 정상적으로 발현됨을 확인하였다.
실험예 4: BD-03A 및 BD-121의 병용 투여에 의한 효과 분석
4-1: CMV-특이적 T 세포 면역반응 분석
본 발명자들은 상기 실험예 3-1 및 3-2에서 발현이 확인된 BD-121을 BD-03과 함께 투여시 T 세포 특이적 면역반응을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하였다.
구체적으로, 실험동물인 C57BL/6 마우스를 대조군으로 공벡터 투여군(n=5), 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-03A 4 ㎍ 투여군(n=5) 및 상기 BD-03 4 ㎍ 및 상기 실시예 3에서 제조된 BD-121 4 ㎍ 투여군(n=5)으로 나누어, 대퇴근육에 OrbiJector (SL VAXiGEN, Korea) 생체내 전기천공법을 이용하여 한 차례 투여하였고, 2주 경과 후 실험동물을 희생시킨 다음 비장을 적출하여 각 BD-03A에 포함된 CMV 항원(CMV gB 및 CMV pp65)에 특이적으로 반응하는 비장 면역세포를 ELISPOT 분석을 이용하여 계수하였다(도 9a 및 9b).
그 결과, 도 9b에서 나타난 바와 같이, pp65 및 gB 모두에 있어서 BD-03A 단독 투여군에 비하여 BD-121 병용투여군의 경우 3-6배의 CMV 특이적 T-세포 면역반응이 증가됨을 확인할 수 있었다.
4-2: CMV-특이적 항체반응 분석
본 발명자들은 CMV-특이적 T 세포반응에 이어 BD-03A 단독투여시와 BD-121과의 병용투여시의 CMV-특이적 항체 반응의 정도를 조사하였다.
구체적으로 상기 실험예 4-1의 실험동물의 혈액을 채혈하여, 항-gB IgG의 양을 gB 단백질 및 항-마우스 IgG(Prospec, Cat #CMV-211)를 이용한 ELISA 분석을 통해 수행하였다(도 9c). 그 결과 도 9c에서 나타난 바와 같이, BD-121을 병용투여할 경우 항체 반응에는 별 영향이 없었다. 오히려, BD-121 병용투여시 항체 생성은 다소 감소하는 것으로 나타났다.
이는, 본 발명의 백신보조제인 BD-121이 항체반응에는 영향을 미치지 않으면서도 T 세포 면역반응을 선택적으로 활성화시킬 수 있는 T 세포 면역반응 특이적 촉진제임을 시사하는 것이다.
4-3: BD-121의 투여량 변화에 따른 효과 분석
상기 실험예 4-1 및 4-2의 결과를 토대로 최적의 BD-121 투여량을 확인하기 위해, 본 발명자들은 BD-03(BD-03A 및 BD-03B)를 BD-121과 병용투여하되 BD-121의 투여량에 변화를 주어 BD-03 및 BD-121의 병용투여에 따른 T 세포 면역반응의 정도를 조사하였다.
구체적으로, 실험동물인 C57BL/6 마우스를 대조군으로 공 벡터 투여군(n=10), 본 발명의 일 실시예에 따른 BD-03(BD-03A 2 ㎍ + BD-03B 2 ㎍) 단독투여군(n=10) 및 상기 BD-03 및 BD-121 각각 0.2, 2 및 6 ㎍ 투여군(각각 n=10)으로 나누어, 대퇴근육에 OrbiJector(SL VAXiGEN, Korea) 생체내 전기천공법을 이용하여 투여하였고(priming), 투여일로부터 2주 경과 후 일부 실험동물(각 실험군당 5마리)을 희생시킨 다음 비장을 적출하여 각 BD-03A에 포함된 CMV 항원(CMV gB 및 CMV pp65)에 특이적으로 반응하는 비장 면역세포를 ELISPOT 분석을 이용하여 계수하였다(도 10a 내지 10b). 아울러, priming 2주 경과 후 남은 실험동물에 한 차례 더 투여한 후(boosting) 마찬가지로 2주 경과 후 실험동물을 희생시킨 다음 비장을 적출하여 각 BD-03A에 포함된 CMV 항원(CMV gB 및 CMV pp65)에 특이적으로 반응하는 비장 면역세포를 ELISPOT 분석을 이용하여 계수하였다(도 10c).
그 결과, 도 10b에서 확인되는 바와 같이, BD-121의 투여량의 증가에 비례하여 CMV 항원 특이적인 T 세포 면역반응이 pp65는 물론 gB에서 동일하게 증가하는 것으로 확인되었으며, 특히 BD-03A:BD-03B:BD-121=1:1:1 또는 1:1:3의 비율로 투여 한 실험군에서 그 효과가 매우 현저하게 나타남을 확인할 수 있었다. 아울러, 부스팅시, 도 10c에서 확인되는 바와 같이, gB 및 pp65 모두 BD-121 투여시 용량의존적인 면역반응 증가가 나타났으며, 특히 pp65 항원에서 그 경향이 두드러지게 나타났다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 CMV DNA 백신인 BD-03A는 단독으로 또는 BKV DNA 백신인 BD-03B와 함께 투여시, CMV 항원인 pp65 및 gB 특이적인 T 세포 면역반응을 투여량 의존적으로 증가시켰을 뿐만 아니라, 프라이밍(priming)에 이은 부스팅(boosting)에 의해 그 효과가 더욱 향상되었으며, 본 발명자들에 의해 개발된 백신 보조제인 BD-121과 병용투여시 T 세포 면역반응이 극대화되었다. 특히 본 발명에서 사용된 백신 보조제 BD-121은 항체 반응에는 아무런 영향을 미치지 않으면서도 항원 특이적 T 세포 면역반응을 촉진시키는 것으로 나타나, T 세포 면역반응이 중요한 암 또는 감염성 질환의 면역치료에 매우 효율적으로 사용이 가능한 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 CMV DNA 백신은 단독으로 또는 백신보조제와 함께 사용하여, 장기이식 및 조혈모이식 등의 이식질환의 위중한 부작용으로 작용하는 CMV 감염증의 예방 및 치료를 위해 매우 효율적으로 사용이 가능하다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> SL VAXIGEN, Inc. <120> A novel DNA vaccine construct for CMV and use thereof <130> PD19-5874 <160> 73 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tPA signal peptide <400> 1 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala 20 25 <210> 2 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flt3L_delta1-26 <400> 2 Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 1 5 10 15 Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 20 25 30 Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 35 40 45 Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 50 55 60 Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 65 70 75 80 Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 85 90 95 Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 100 105 110 Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 115 120 125 Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser 130 135 140 Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro 145 150 155 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (GS)5 linker peptide <400> 3 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 839 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV gB_delta1-22,delta726-771 <400> 4 Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser His Ala Thr Ser Ser Thr His Asn Gly 1 5 10 15 Ser His Thr Ser Arg Thr Thr Ser Ala Gln Thr Arg Ser Val Tyr Ser 20 25 30 Gln His Val Thr Ser Ser Glu Ala Val Ser His Arg Ala Asn Glu Thr 35 40 45 Ile Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly Asp Val Val Gly Val Asn Thr 50 55 60 Thr Lys Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser Met Ala Gln Gly Thr Asp Leu 65 70 75 80 Ile Arg Phe Glu Arg Asn Ile Ile Cys Thr Ser Met Lys Pro Ile Asn 85 90 95 Glu Asp Leu Asp Glu Gly Ile Met Val Val Tyr Lys Arg Asn Ile Val 100 105 110 Ala His Thr Phe Lys Val Arg Val Tyr Gln Lys Val Leu Thr Phe Arg 115 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340 345 350 Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr 355 360 365 Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr 370 375 380 Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp 385 390 395 400 Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys 405 410 415 Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser 420 425 430 Ala Gly Arg 435 <210> 8 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding tPA signal peptide <400> 8 atggacgcca tgaagagagg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60 agcccc 66 <210> 9 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding Flt3L delata1-26 <400> 9 agccacgcca cccaggactg cagcttccag cacagcccca tcagcagcga cttcgccgtg 60 aagatcagag agctgagcga ctacctgctg caggactacc ccgtgaccgt ggccagcaac 120 ctgcaggacg aggagctgtg cggcggcctg tggagactgg tgctggccca gagatggatg 180 gagagactga agaccgtggc cggcagcaag atgcagggcc tgctggagag agtgaacacc 240 gagatccact tcgtgaccaa gtgcgccttc cagcctcccc ccagctgcct gaggttcgtg 300 cagaccaaca tcagcagact gctgcaggag accagcgagc agctggtggc cctgaagccc 360 tggatcacca gacagaactt cagcagatgc ctggagctgc agtgccagcc cgacagcagc 420 accctgcccc ctccctggag ccccagaccc ctggaggcca ccgctcccac agcccct 477 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding (GS)5 linker peptide <400> 10 ggcagcgggt ccggaagtgg gtctggatcc gggcgcgcc 39 <210> 11 <211> 2517 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CMV gB_delta1-22,delta726-771 <400> 11 gtgagctcca gctctacatc ccacgccaca tcctccaccc acaatggatc ccatacatcc 60 agaaccacct ccgctcagac acggtccgtg tactcccaac acgtgaccag ctccgaggcc 120 gtgagccaca gagccaacga gaccatctac aacacaaccc tgaagtatgg cgacgtggtg 180 ggcgtcaata ccactaagta tccctatcgg gtgtgttcta tggcccaagg aaccgacctg 240 atccggtttg aacggaacat catttgcacc agcatgaaac ccatcaacga ggacctggac 300 gaaggcatca tggtcgtgta caagagaaac atcgtggccc ataccttcaa ggtgagagtc 360 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catcagctgg ttcgccatcg tgctgctggt gagccccctg 60 atggccatgt gggagctgga gaaggacgtg tacgtggtgg aggtggactg gacccccgac 120 gcccccggcg agaccgtgaa cctgacctgc gacacccccg aggaggacga catcacctgg 180 accagcgacc agaggcacgg cgtgatcggc agcggcaaga ccctgaccat caccgtgaag 240 gagttcctgg acgccggcca gtacacctgc cacaagggcg gcgagaccct gagccacagc 300 cacctgctgc tgcacaagaa ggagaacggc atctggagca ccgagatcct gaagaacttc 360 aagaacaaga ccttcctgaa gtgcgaggcc cccaactaca gcggcaggtt cacctgcagc 420 tggctggtgc agaggaacat ggacctgaag ttcaacatca agagcagcag cagcagcccc 480 gacagcaggg ccgtgacctg cggcatggcc agcctgagcg ccgagaaggt gaccctggac 540 cagagggact acgagaagta cagcgtgagc tgccaggagg acgtgacctg ccccaccgcc 600 gaggagaccc tgcccatcga gctggccctg gaggccaggc agcagaacaa gtacgagaac 660 tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaagcccg acccccccaa gaacctgcag 720 atgaagcccc tgaagaacag ccaggtggag gtgagctggg agtaccccga cagctggagc 780 accccccaca gctacttcag cctgaagttc ttcgtgagaa tccagaggaa gaaggagaag 840 atgaaggaga ccgaggaggg ctgcaaccag aagggcgcct tcctggtgga gaagaccagc 900 accgaggtgc agtgcaaggg cggcaacgtg tgcgtgcagg cccaggacag gtactacaac 960 agcagctgca gcaagtgggc ctgcgtgccc tgcagggtga ggagctaa 1008 <210> 51 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-21 <400> 51 Met Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr Val 1 5 10 15 Ala His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu 20 25 30 Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp 35 40 45 Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys 50 55 60 Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser 65 70 75 80 Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu 85 90 95 Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile 100 105 110 Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu 115 120 125 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His 130 135 140 Leu Ser 145 <210> 52 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding mIL-21 <400> 52 atggagagaa cactggtctg cctcgtggtc atcttcctgg gtactgtggc tcataaatcc 60 tcacctcagg gtcccgatag actgctgatc aggctgcggc acctcatcga cattgtggag 120 cagctcaaaa tctacgaaaa cgacctggac cccgagctgc tctctgcccc ccaggatgtc 180 aaggggcact gcgaacatgc cgctttcgca tgttttcaga aggccaaact gaagcccagc 240 aatcctggca acaataagac cttcatcatt gacctggtgg ctcagctcag gagacggctg 300 ccagcacgac gaggaggaaa gaaacagaaa catatcgcta agtgccctag ctgtgattcc 360 tatgagaaaa gaacaccaaa ggagttcctc gaaaggctca aatggctcct ccagaagatg 420 attcaccagc acctctccta a 441 <210> 53 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mMIP-1alpha <400> 53 Met Lys Val Ser Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Thr 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Phe Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val 35 40 45 Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe 50 55 60 Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp 65 70 75 80 Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu Leu Asn Ala 85 90 <210> 54 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding mMIP-1alpha <400> 54 atgaaggtga gcaccaccgc tctggctgtg ctgctctgca ccatgaccct ctgcaaccag 60 gtgttctcag ctccctacgg cgctgatacc cccaccgcct gctgcttcag ctacagccgg 120 aagatccccc ggcagttcat cgtggactac ttcgaaacca gcagcctgtg cagccagccc 180 ggcgtgatct tcctgaccaa acggaaccgg cagatctgcg ctgacagcaa agagacctgg 240 gtgcaggaat acatcaccga cctggaactg aacgcctaa 279 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (G4S)n linker peptide unit <400> 55 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (GSSGGS)n linker peptide unit <400> 56 Gly Ser Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 57 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 58 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 58 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 59 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (EAAAK)n linker peptide unit <400> 60 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 61 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys 1 5 10 <210> 62 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 62 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 63 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 64 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 65 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 66 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 67 Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp 1 5 10 15 Val <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 68 Pro Leu Gly Leu Trp Ala 1 5 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 69 Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 70 Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly 1 5 10 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 71 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 72 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 72 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 73 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 73 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gly Ser Gln Lys Ala Gly Val Asp Glu 20 25 30

Claims (33)

  1. 신호서열 및 막통과 도메인이 결실된 CMV gB, 제1링커펩타이드, CMV 피막 단백질 pp65의 438 내지 561번째 아미노산을 포함하되, 435 내지 438 번째 아미노산을 포함하는 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 C-말단 단편, 제2링커펩타이드 및 CMV 피막 단백질 pp65의 1 내지 435번째 아미노산을 포함하되 상기 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 N-말단 단편을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 핵산분자가 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자컨스트럭트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 N-말단에 다른 단백질 유래 신호서열을 추가로 포함하는, 유전자컨스트럭트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 융합단백질은 상기 신호서열 및 상기 CMV gB 사이에 Flt3L가 추가로 삽입된, 유전자컨스트럭트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 Flt3L 및 상기 CMV gB 사이에 제3링커펩타이드가 추가로 포함되는, 유전자컨스트럭트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 CMV gB는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자컨스트럭트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CMV pp65 C-말단 단편은 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자컨스트럭트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 CMV pp65 N-말단 단편은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자컨스트럭트.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1링커펩타이드는 GSGSGSGSGSGRA(서열번호 3), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 5), (G4S, 서열번호 55)n(n은 1 내지 10 사이의 정수), (GSSGGS, 서열번호 56)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 57), EGKSSGSGSESKST(서열번호 58), GSAGSAAGSGEF(서열번호 59), (EAAAK, 서열번호 60)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 61), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 62), GGGGGGGG(서열번호 63), GGGGGG(서열번호 64), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 65), PAPAP(서열번호 66), (Ala-Pro)n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 67), PLGLWA(서열번호 68), TRHRQPRGWE(서열번호 69), AGNRVRRSVG(서열번호 70), RRRRRRRR(서열번호 71), GFLG(서열번호 72), 또는 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 73)인, 유전자컨스트럭트.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제2링커펩타이드는 GSGSGSGSGSGRA(서열번호 3), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 5), (G4S, 서열번호 55)n(n은 1 내지 10 사이의 정수), (GSSGGS, 서열번호 56)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 57), EGKSSGSGSESKST(서열번호 58), GSAGSAAGSGEF(서열번호 59), (EAAAK, 서열번호 60)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 61), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 62), GGGGGGGG(서열번호 63), GGGGGG(서열번호 64), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 65), PAPAP(서열번호 66), (Ala-Pro)n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 67), PLGLWA(서열번호 68), TRHRQPRGWE(서열번호 69), AGNRVRRSVG(서열번호 70), RRRRRRRR(서열번호 71), GFLG(서열번호 72), 또는 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 73)인, 유전자컨스트럭트.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 신호서열은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자컨스트럭트.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 Flt3L는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 유전자컨스트럭트.
  12. 제4항에 있어서,
    상기 제3링커펩타이드는 GSGSGSGSGSGRA(서열번호 3), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 5), (G4S, 서열번호 55)n(n은 1 내지 10 사이의 정수), (GSSGGS, 서열번호 56)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 57), EGKSSGSGSESKST(서열번호 58), GSAGSAAGSGEF(서열번호 59), (EAAAK, 서열번호 60)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 61), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 62), GGGGGGGG(서열번호 63), GGGGGG(서열번호 64), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 65), PAPAP(서열번호 66), (Ala-Pro)n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 67), PLGLWA(서열번호 68), TRHRQPRGWE(서열번호 69), AGNRVRRSVG(서열번호 70), RRRRRRRR(서열번호 71), GFLG(서열번호 72), 또는 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 73)인, 유전자컨스트럭트.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자컨스트럭트를 포함하는 발현벡터.
  14. 신호서열 및 막통과 도메인이 결실된 CMV gB, 제1링커펩타이드, CMV 피막 단백질 pp65의 438 내지 561번째 아미노산을 포함하되, 435 내지 438 번째 아미노산을 포함하는 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 C-말단 단편, 제2링커펩타이드 및 CMV 피막 단백질 pp65의 1 내지 435번째 아미노산을 포함하되 상기 단백질 카이네이즈 부위의 전부는 포함하지 않아 상기 단백질 카이네이즈 활성이 결여된 CMV pp65 N-말단 단편을 포함하는 융합단백질.
  15. 제14항에 있어서,
    N-말단에 다른 단백질 유래 신호서열을 추가로 포함하는, 융합단백질.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 신호서열 및 상기 CMV gB 사이에 Flt3L이 추가로 삽입되는, 융합단백질.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 Flt3L 및 상기 CMV gB 사이에 제3링커펩타이드가 추가로 포함되는, 융합단백질.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 유전자컨스트럭트, 제13항의 발현벡터, 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    장기이식 후 CMV의 재활성화 예방을 위한 것인, 백신 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    하기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는, 백신 조성물:
    ⅰ) BK 바이러스의 캡시드 단백질 1(BKV VP1), 캡시드 단백질 2(BKV VP2), 작은 T 항원(ST)의 N-말단 단편(BKV ST-N), ST의 중간 단편(BKV ST-M), 및 ST의 C-말단 단편(BKV ST-C), 큰 T 항원(LT)의 1 내지 44번째 아미노산으로 구성된 제1 N-말단 단편(BKV LT-N1), LT의 45 내지 107번째 아미노산으로 구성된 제2 N-말단 단편(BKV LT-N2), LT의 108 내지 403번째 아미노산으로 구성된 제1 C-말단 단편(BKV L2-C1), LT의 404 내지 595번째 아미노산으로 구성된 제2 C-말단 단편(BKV LT-C2) 및 LT의 596 내지 695번째 아미노산으로 구성된 제3 C-말단 단편(BKV LT-C3)이 뒤섞인 셔플드 융합단백질;
    ⅱ) 상기 셔플드 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자컨스트럭트; 및
    ⅲ) 상기 제2유전자컨스트럭트를 포함하는 발현벡터.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 셔플드 융합단백질은 BKV VP1, BKV LT-N1, BKV VP2, BKV LT-N2, BKV ST-N, BKV LT-C1, BKV ST-M, BKV LT-C2, BKV ST-C 및 BKV LT-C3의 순으로 구성되는, 백신 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 셔플드 융합단백질은 N-말단에 신호서열을 추가로 포함하는, 백신 조성물.
  23. 제20항에 있어서,
    상기 셔플드 융합단백질은 적어도 하나 이상의 면역증진 펩타이드를 추가로 포함하는, 백신 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 면역증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, 백신 조성물.
  25. 제18항에 있어서,
    하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 백신 면역보조제를 추가로 포함하는, 백신 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 백신 면역보조제는 IL-12 단백질 및 IL-21 단백질을 유효성분으로 포함하거나 상기 IL-12 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 IL-21 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 T 림프구 특이적 면역반응 촉진용 백신 면역보조제인, 백신 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 백신보조제는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는, 백신조성물:
    ⅰ) p35 사슬(IL-12p35) 및 p40 사슬(IL-12p40)로 구성된 IL-12 단백질 및 IL-21 단백질;
    ⅱ) 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 각각 작동가능하게 연결된 제3 내지 제5유전자컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터;
    ⅲ) 상기 제3 내지 제5유전자컨스트럭트를 각각 포함하는 제3 내지 제5발현벡터
    ⅳ) 상기 제3 내지 제5유전자컨스트럭트 중 둘 및 나머지 하나가 각각 포함된 제6발현벡터 및 제7발현벡터;
    ⅴ) 상기 IL-12p35 및 IL-12p40 중 어느 하나에 IL-21이 연결된 융합단백질 및 상기 IL-12p35 및 IL-12p40 중 상기 융합단백질에 포함되지 않은 펩타이드;
    ⅵ) 상기 v의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제6유전자컨스트럭트 및 상기 융합단백질에 포함되지 않은 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제7유전자컨스트럭트를 포함하는 제8발현벡터;
    ⅶ) 상기 제6유전자컨스트럭트 및 제7유전자컨스트럭트를 각각 포함하는 제9발현벡터 및 제10발현벡터;
    ⅷ) 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 둘 이상이 내부 리보솜 진입 부위(IRES)로 연결된 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제8유전자컨스트럭트; 및 선택적으로 상기 세 폴리뉴클레오타이드 중 상기 제8유전자컨스트럭트에 포함되지 않은 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제9유전자컨스트럭트를 포함하는 제11발현벡터;
    ⅸ) 상기 제8유전자컨스트럭트를 포함하는 제12발현벡터 및 상기 제9유전자컨스트럭트를 포함하는 제13발현벡터; 및
    ⅹ) 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질을 각각 암호화하는 mRNA 분자.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 백신 면역보조제는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 백신조성물:
    ⅰ) MIP-1α 단백질;
    ⅱ) 상기 MIP-1α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제10유전자컨스트럭트; 및
    ⅲ) 상기 MIP-1α 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 IL-12p35, IL-12p40 및 IL-21 단백질 중 어느 하나 이상에 IRES 또는 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 작동가능하게 연결된 제11유전자컨스트럭트; 및
    ⅳ) MIP-1α 단백질을 암호화하는 mRNA.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 제10유전자컨스트럭트 또는 상기 제11유전자컨스트럭트는 별도의 발현벡터에 포함되거나, 상기 제1발현벡터 내지 제11발현벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현벡터 내에 포함되는, 백신 조성물.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 MIP-1α 단백질은 서열번호 45로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 MIP-1α 단백질과 상동성 90% 이상인, 백신 조성물.
  31. 제18항의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 CMV 감염의 예방 및 치료방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 생체내 전기천공법에 의해 투여되는, CMV 감염의 예방 및 치료방법.
  33. 제20항의 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 장기 이식 후 CMV 및 BKV 재활성화 예방방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2023039638A1 (en) * 2021-09-16 2023-03-23 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research "immunogenic compositions and uses thereof"

Cited By (1)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023039638A1 (en) * 2021-09-16 2023-03-23 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research "immunogenic compositions and uses thereof"

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