JP2010252804A - ネコcd80、ネコcd86、ネコcd28およびネコctla−4核酸およびポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【課題】 ネコCD80、ネコCD86、ネコCD28およびネコCTLA−4核酸およびポリペプチド。
【解決手段】 本発明は、ネコCD80(B7−1)リガンド、ネコCD86(B7−2)リガンド、ネコCD28レセプター、又はネコCTLA−4(CD152)レセプターをコードする分離され精製されたDNA、及びネコCD80、ネコCD86、ネコCD28又はネコCTLA−4をコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明は、CD80をコードするベクター、CD86をコードするベクター、CD28をコードするベクター、又はCTLA−4をコードするベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。本発明は、ネコCD80、ネコCD86、ネコCD28、又はネコCTLA−4の核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。本発明は、ネコCD80、ネコCD86、ネコCD28、又はネコCTLA−4の核酸にコードされるポリペプチドの有効量を含むワクチンを提供する。本発明は又、病原体に由来する免疫原を更に含むワクチンも提供する。本発明は、免疫反応を促進することができるワクチンを提供する。発明は又免疫反応を抑制することができるワクチンも提供する。
【選択図】なし
【解決手段】 本発明は、ネコCD80(B7−1)リガンド、ネコCD86(B7−2)リガンド、ネコCD28レセプター、又はネコCTLA−4(CD152)レセプターをコードする分離され精製されたDNA、及びネコCD80、ネコCD86、ネコCD28又はネコCTLA−4をコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明は、CD80をコードするベクター、CD86をコードするベクター、CD28をコードするベクター、又はCTLA−4をコードするベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。本発明は、ネコCD80、ネコCD86、ネコCD28、又はネコCTLA−4の核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。本発明は、ネコCD80、ネコCD86、ネコCD28、又はネコCTLA−4の核酸にコードされるポリペプチドの有効量を含むワクチンを提供する。本発明は又、病原体に由来する免疫原を更に含むワクチンも提供する。本発明は、免疫反応を促進することができるワクチンを提供する。発明は又免疫反応を抑制することができるワクチンも提供する。
【選択図】なし
Description
本明細書は、その内容が本明細書中に参照されここに取り込まれている1998年、5月1日出願の米国出願番号09/071,699号の優先権を主張するものである。本明細書を通し、各種刊行物はカッコ内に引用される。これら刊行物の完全な引用は明細書末、配列表直前に見ることができるだろう。これら刊行物の開示は、本発明が関係する技術状態をより完全に記述するために、その全体が本明細書中に参照され本明細書に取り込まれる。
[発明の背景]
現在、ネコにおけるネコ免疫不全疾患およびネコ感染性腹膜炎疾患の予防に有効なワクチンは存在しない。現在、ネコ白血病ウイルスワクチンがあるが、その効果のレベルには疑問が残っており、ある場合には病気を起こす事もあるだろう。従って、本分野では、未だ既存のワクチンが存在しないこれらの及び他の疾病からの保護を与える、又は既存の一般的に使用されているワクチンの効力を改善する物質(agent)又は組成物が必要とされている。更に、子ネコのワクチン投与については、子ネコ内の母親由来抗体に打ち勝つことが不可能なことから困難である。これら障害を越えるのに役立つ安全、かつ有効な作用物質も求められている。
現在、ネコにおけるネコ免疫不全疾患およびネコ感染性腹膜炎疾患の予防に有効なワクチンは存在しない。現在、ネコ白血病ウイルスワクチンがあるが、その効果のレベルには疑問が残っており、ある場合には病気を起こす事もあるだろう。従って、本分野では、未だ既存のワクチンが存在しないこれらの及び他の疾病からの保護を与える、又は既存の一般的に使用されているワクチンの効力を改善する物質(agent)又は組成物が必要とされている。更に、子ネコのワクチン投与については、子ネコ内の母親由来抗体に打ち勝つことが不可能なことから困難である。これら障害を越えるのに役立つ安全、かつ有効な作用物質も求められている。
宿主内の疾病に応答して生じるT細胞の活性化と増殖は、2種類相互作用に依存していると考えられている:MHCクラスI分子に関連した免疫原性ペプチドのT細胞レセプター(TCR)による認識、およびCD80やCD86の様なアクセサリーリガンドと、T細胞上に存在するそれらの補助レセプター、CD28および/又はCTLA−4との二次的な相互作用である。これら2つの経路が上手く相互作用すると、CD4+CD8+T細胞の活性化と増殖がもたらされ、Th1およびTh2型の免疫制御サイトカインの産生が増加する。T細胞の適切な共刺激が存在しないとT細胞が増殖し、サイトカインを分泌できない無力状態が発生する。最近2種類の分子、CD28、及びそのリガンドであるCD80とCD86がT細胞応答の重要な制御因子として注目されている。CD28は一次T細胞共刺激レセプターであり、CD80およびCD86と相互作用すると、T細胞の増殖とサイトカインの合成を促進し、T細胞の死滅を阻止する。CD28の相同体であるCTLA−4(CD152とも呼ばれる)も共刺激に重要や役割を果たす。完全には解明されていないが、T細胞共刺激反応を阻害するようである。共刺激プロセスに於けるCD28、CTLA−4およびそれらのリガンドであるCD80とCD86間の相互作用と相互影響は、宿主の病気に対する免疫応答の全体的な誘導および抑制にとって重要である。これら4種類の共刺激性分子の発現を操作することで、T細胞反応を、拡大、抑制あるいは再方向付けを通じ制御し、特定の病原菌または疾病状態に向け所望する免疫応答を惹起させることができるかもしれない。特に、感染症に対するワクチン処理、感染症の治療および新生物性、退行性、自己免疫および免疫不全状態の治療に有益であろう。
哺乳動物の免疫系のTリンパ細胞は、制御およびエフェクター機能の両方を提示する。T細胞の始源細胞は骨髄内で幹細胞より生じ、胸腺に移動する。胸腺では成熟化と選別が起こり、主要組織適合性複合体(MHC)提示に関係する抗原を認識することができるが自己反応性ではない、免疫細胞のナイーブ集団の産生が起こる。胸腺での成熟に続き、各T細胞はその抗原特異性を決定するクローン毎に分配されたT細胞レセプター(TCR)を所有する。更に、成体動物に認められる2つの主要サブセットであるCD4+CD8+T細胞は、αおよびβサブユニットを含むTCRを持っている(AllisonとLanier、1987)。
TCRタンパク質のタンパク質および遺伝子の構成は、免疫グロブリン(Ig)分子で観察されるそれと類似しており、B細胞上の膜結合Igに類似する多くの特性を有している(AllisonおよびLanier、1987)。Ig分子同様、TCRは潜在的には非常に多くの想定され得る抗原配列を認識しなければならない。その為にTCR遺伝子の構成および再配置は、B細胞で観察されるものと同様複雑である(DavisとBjorkman、1988)。B細胞により産生される抗体分子と同様に、T細胞に於けるイディオタイプ性の多様化形成には、生殖系列における複数コピーの可変域(V)遺伝子の生成、αおよびβサブユニットの無作為な再構成、および結合と挿入による多様化の形成が含まれる(DavisとBjorkman、1988)。しかしTCRの可能なレパートリーはIg分子のそれ同様に大きいと考えられているが、B細胞とは異なりT細胞は体細胞変異による多様性の形成は示さない。
TCRは抗原認識を担当するものの、シグナル供給能は有していない(AllisonとLanier、1987)。抗原提示細胞上のMHCに関連し提示された抗原への結合に続くTCRの立体構造の変化は、CD3およびζ_鎖を含む非共有結合性に結合した表面分子の複合体を介してシグナルを提供する(Cleversら、1988)。TCR結合はCD3複合体のリン酸化をもたらし、そのが間接的に細胞内へのCa+流入を誘導し、IL−2およびIL−2R産生を開始させる(WeissとLittman、1994)。このカスケードはT細胞活性化の初期段階と考えられている。
TCRは、抗原がMHCと共に提示された場合だけそれを認識する。T細胞に提示される抗原と結合するMHCタンパク質には2種類のサブセットがある。MHCクラスIは体内にある殆ど全ての有核細胞上に見いだされ、内因性に生み出されるペプチドの表面発現に機能する(Matasumuraら、1992)。MHCクラスIに関連し発現されたペプチドは、TCRと共にCD8を発現しているT細胞により認識される(Littman、1987)。CD8+T細胞はウイルス感染した細胞および悪性細胞の除去に関する免疫サーベイランスにおいて機能している。CD8+T細胞による非自己分子の認識(悪性を示すペプチド又は変化した自己ペプチド)の結果、細胞の破壊を伝達する細胞傷害性Tリンパ細胞(CTL)が発生する(Berke、1994)。
第二の主要組織適合性サブセットであるMHCクラスII分子は、特定の刺激に反応し幾つかの別の細胞集団上に誘導されることはあるが、通常はB細胞、マクロファージ/単球および樹状細胞を含む抗原提示担当細胞にのみ見いだされる(Germain、1993)。MHCクラスII分子は、CD4+T細胞への外来性抗原の提示を担当している。貪食され、内部に取りこまれた、あるいは表面Igに結合され、抗原提示細胞により吸収される抗原は内在性に処理され、MHCクラスIIに結合する(Unanue、1987)。その後、該分子は、表面に発現され、CD4発現αβT細胞により認識できるようになる(Littman、1987)。CD4+T細胞により抗原が認識され、多くの活性免疫反応事象の開始および拡大に必要とされるサイトカインおよび成長因子の産生が起こる(MosmannとCoffman、1987)。
CD4およびCD8はαβT細胞サブセットを分別し、各群の機能特性を規定するT細胞上へのCD4およびCD8の提示は相互排反的である(Littman、1987)。即ち、胸腺での選択および成熟に続きαβT細胞はCD4またはCD8のみを提示する。分子はTCRとMHCに結合した抗原間の相互作用を安定する様に作用し、T細胞がMHCクラスI又はクラスIIに関係し提示された抗原を認識するか否かを決定する(Littman、1987)。CD4又はCD8分子の結合ドメインは、クラスI又はクラスII分子のそれぞれの非多型領域を認識する(Claybergerら、1994)。これら特異的領域へのCD4又はCD8の結合は、T細胞活性化の開始に関するTCR/抗原結合MHC相互作用の安定化に働く(Littman、1987)。即ち、CD4+T細胞はクラスIIに関連する抗原を発現し、ヘルパーT反応を開始するAPCのみと機能的に相互作用するのに対し、CD8+T細胞はクラスIと関連し提示される抗原のみを認識し、結合によって細胞傷害性反応を開始する(Germain、1993)。ヘルパーT細胞およびCTLという二つの別個の表現型は、CD4又はCD8いずれかの表面発現により分別できる。
CD4を有するT−リンパ細胞は、CD4+CTLのサブセットとされているものも存在するが、一般には大部分がヘルパー細胞と考えられている(Yasukawaら、1989)。CD4+ヘルパーT細胞は、刺激性および抑制性サイトカインの組み合わせの産生を通じた免疫反応の主要制御因子である(MosmannとCoffman、1987)。これら細胞により産生された因子は、体液性または抗体伝達反応の開始、および細胞性又は遅延型過敏反応(DTH)の重要な伝達因子である(MosmannとCoffman、1987)。CD4+T細胞が活性化され、可溶性の成長因子を産生するようになるには、複雑なカスケード現象が起こらねばならない。抗原は担当APC、通常はマクロファージにより検出され内在化される(Unanue、1984)。APCはタンパク質を変性し、より小さな断片に分断し、次に15−18アミノ酸残基間に分断されたペプチド断片は小胞体内でMHCと結合し、続いて発現のために表面に移動する(Rotzschkeら、1994)。即ち表面に発現された抗原はT−リンパ細胞により認識可能となり、適当なTCRイディオタイプを持ち、かつCD4を発現しているT細胞サブセットによって認識される(Germain、1993)。T細胞が適当な抗原を認識すると、適当なアクセサリーシグナルが提供され、ナイーブリンパ細胞の分化が起こり、クローンの拡大が進む。いまだ特定されていない刺激が、2型(体液性)反応に対し1型(細胞性)反応を優先的に発生させる(MosmannとCoffman、1989)。
体液性反応と細胞性反応の両反応の活性の多くに、T細胞の支援が必要とされる。大部分の抗原に対する抗体の産生に必要なT細胞依存型B細胞反応は、適切なB細胞成熟がおこるためにT細胞の支援が必要である(Chesnutら、1986)。B細胞表面上に発現したIgに抗原が結合すると、内部への取り込み、プロセッシング及びこれら抗原のMHCクラスII表面発現が起こる(Germain、1993)。適当なTCRイディオタイプを持つCD4+細胞とB細胞間の細胞と細胞との直接の接触は、T細胞の活性化と増殖を促進する(Chesnutら、1986)。活性化されたヘルパーT細胞は、B細胞の増殖と分化に必要な因子を分泌することでII型反応を促進できるだろう(MosmannとCoffman、1989)。これら因子には、B細胞の活性化と増殖を誘導できるIL−4、IL−5及びIL−13が含まれており、Ig分子へのイディオタイプスイッチにとって重要であるが、IL−10はI型反応の開始を阻止する様に作用し、体液性活性を逆にダウンレギュレートする(MosmannとCoffman、1989)。
細胞性反応(I型)は、体液性反応(II型)と同一の様式では成熟しない(Sherら、1992)。T細胞の活性化とI型反応への成熟により、細胞性免疫に好ましい因子がT細胞により生産される。IL−2はT細胞成長因子であり、CTL反応も促進するが、IFNγはマクロファージ、CTL及び好中球を活性化するように作用する(Wangら、1993)。
即ち、ヘルパーT細胞は、大部分が相互に排反的である二つの応答を伝達することができる。体液性反応を開始させるサイトカインの分泌パターンには、細胞性反応を抑制する因子及びその逆の因子が含まれる(Mosmann及びCoffman、1989)。APCにより作られる抗原又は可溶性因子を提示するAPCのタイプが生ずるサイトカインのパターンに影響すると提言されているものの、T細胞が1型のパターン(IL−2、IFNγ、及びリンフォトキシン)又は2型のパターン(IL−4、5,6,10及び13)のいずれを生じるのかは不明である(MosmannとCoffman、1989)。1型と2型のヘルパー細胞に加え、その分泌のパターンが1型と2型の中間にある0型のヘルパーTサブセットが存在している(Gajewskiら、1989)。ヘルパーTサブセットは主にイン・ビトロ実験で提示されているものであるが、これらはイン・ビボ環境に於ける特異的反応の発生のモジュレートにおけるヘルパーT細胞の役割に関する重要なモデルである。
CD4+ヘルパーTリンパ細胞サブセットに加え、第二のαβT細胞集団はCD8を持つ細胞傷害性リンパ細胞を含んでいる。CD8+CTLは、その一次機能がウイルス及び細胞内細菌に感染した細胞ならびに悪性細胞の破壊である。免疫サーベイランスシステムの主要成分と考えられている(Berke、1994)。これらの細胞はサイトカインを産生することもできるが、一般には細胞性反応(IL−2、IFNγ及びTNF)の誘導に関係するものだけを産生氏得る(FongとMosmann、1990)。CD8と関係するこれらの細胞のTCRは、MHCクラスIに関係し提示された抗原を認識する(Littman、1987)。一般に、全ての有核細胞は内因性に合成されたペプチドを提示するクラスIを表面に発現している(Matasumara、1992)。具体的には、インターフェロン暴露により誘導可能であるが、脳及び精巣を含む免疫的に特別な部位では、タンパク質の発現は低レベルである(Moffett及びPaden、1994)。細胞の正常な代謝を通じて小胞体内に産生されたタンパク質は、表面発現の為に変性を受け、部分的に破壊され、MHCクラスIと結合する(Engelhard、1994)。ポリペプチドはタンパク質分解的に直線状にされ、クラスIに9−12アミノ酸のエピトープで結合し、続いて細胞の表面に発現される(Engelhard、1994)。理論的には、全ての内因性に産生されたペプチドはこの様式にて表面に発現され、理想的には胸腺での選別の結果、全ての自己反応性T細胞の排除が起こり、免疫サーベイランスはウイルス感染した又は形質転換細胞の存在を検出できる(Berke、1993)。発現された外来ペプチドのクラスIによる認識は、CD8+CTL上の抗原特異的T細胞レセプターにより促進される(Lechlerら、1990)。活性化の進行にはエフェクター細胞と標的細胞が接触することが求められる(Berke、1994)。異物と認識される抗原がTCRにより検出されると、感染細胞上のクラスIへのCD8結合により分子間相互作用は安定化する(Littman、1987)。認識され、T細胞が活性化されると標的細胞とエフェクターT細胞の間に結合が形成され、エフェクター細胞は実行可能になる(TaylorとCohen、1992)。即ち、この様式では、病原体により自己タンパク質が変化し、又は細胞機構が支配される、ペプチドは免疫サーベイランスにより認識されるようになり、この免疫システム部分は病気の細胞を排除できる(Berke、1994)。
細胞性の細胞傷害性は2つある主要経路の1つを生ずると考えられる。CTLによる細胞障害性顆粒の放出により、細胞にアポトーシスを誘導するか、あるいは溶解される(Berke、1993)。細胞死を招く遺伝子発現を誘導するCTLによる因子の放出を通し標的細胞にアポトーシスが誘導される(Russel、1983)。このメカニズムの利点は、細胞融解が起こらず、細胞の潜在的感染性含有物が放出される可能性が低下することである(Nagata及びGolstein、1995)。しかし細胞融解は、それにより標的排除が起こるより一般的なメカニズムである。標的細胞膜に穿孔をあけるパーフォリンはCTL細胞傷害性顆粒の主要成分である(Liuら、1995)。この免疫サーベイランスの型には他の型の細胞も含まれていることから、CTLは抗ウイルス及び抗腫瘍免疫の主要構成体であり、特定の病原因子に対してはその防御にとって不可欠と考えられている(KupferとSinger、1989)。
まず細胞表面タンパク質が利用され、特異的な細胞集団を分化させる。ごく最近これら分子について機能的な観点が明らかにされた結果、これらが細胞集団の分類にとっても重要ではあるが、それらが多くの細胞の機能に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある。
生産的免疫反応の発生において役割を果たす様々なアクセサリー及び接着分子はT細胞及び抗原発現細胞上に発現されている(van Seventerら、1991)。接着分子は免疫系の多くの細胞上にあるレベルで発現されている。これらは細胞をある領域内に留め、細胞と細胞の接触を開始させ、また維持する上で重要である(Mescher、1992)。
CD−2/LFA3(CD58)及びLFA−1/ICAM−1はT細胞/APC相互作用の安定化と活性促進に関わる2種類の接着分子複合体である(Springerら、1987)。CD2は前T細胞上に最初に発現されるマーカーの1種であり、細胞の生涯を通じそのまま存在するが、LFA−1はT細胞上に遅く発現され、メモリー細胞内又は誘導によりアップレギュレーションされている(Springerら、1987)。
アクセサリー分子複合体も接着特性を示すが、その主要な機能はおそらくリガンド結合による細胞内シグナルの供給である(Andersonら、1988)。レセプターとそのリガンドとの間の相互作用が確立すると、分子構造内に立体構造の変化が起こり、その結果各種シグナルが一方または両方の細胞の細胞質に伝達される(HutchcroftとBierer、1994)。これら分子より供給されたシグナルはT細胞発生の促進において様々な役割を果たしているが、これら分子により伝達されたシグナルが無い場合にはT細胞は無力になる(LeungとLinsley、1994)。
CD28/CD80相互作用は、生産的T細胞を介した免疫反応の主要成分である(Linsleyら、1993a)。ナイーブT細胞の完全な活性化と増殖には、CD28アクセサリー分子とそのリガンドであるCD80との相互作用が必要とされる(Linsleyら、1991a)。該相互作用は活性化された記憶CD4+T細胞の増殖及びアポトーシス性細胞死の防止にも重要な役割を果たすと考えられる(Linsleyら、1991a)。相互作用の発見とそのメカニズムの解明は、T細胞によって伝達される免疫を理解する上で重要な手がかりを提供する。
[発明の概要]
本発明はネコCD80(B7−1)リガンド、ネコCD86(B7−2)リガンド、ネコCD28レセプター、又はネコCTLA−4(CD152)レセプターをコードする単離、精製されたDNA、並びにネコCD80,ネコCD86、ネコCD28、又はネコCTLA−4をコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明はCD80をコードするベクター、CD86をコードするベクター、CD28をコードするベクター、またはCTLA−4をコードするベクターによりトランスフォームされた宿主細胞を提供する。発明はネコCD80、ネコCD86、ネコCD28又はネコCTLA−4によりコードされたポリペプチドを提供する。
本発明はネコCD80(B7−1)リガンド、ネコCD86(B7−2)リガンド、ネコCD28レセプター、又はネコCTLA−4(CD152)レセプターをコードする単離、精製されたDNA、並びにネコCD80,ネコCD86、ネコCD28、又はネコCTLA−4をコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明はCD80をコードするベクター、CD86をコードするベクター、CD28をコードするベクター、またはCTLA−4をコードするベクターによりトランスフォームされた宿主細胞を提供する。発明はネコCD80、ネコCD86、ネコCD28又はネコCTLA−4によりコードされたポリペプチドを提供する。
本発明はネコCD80、ネコCD86、ネコCD28又はネコCTLA−4の核酸によりコードされたポリペプチドの有効量を含むワクチンを提供する。本発明は更に病原菌に由来する免疫原を更に含むワクチンも提供する。発明は免疫反応を促進できるワクチンを提供する。発明は、免疫反応を抑制できるワクチンも提供する。
[発明の詳細な説明]
本発明はネコCD80リガンド又はネコ可溶性CD80リガンドをコードする単離された核酸を含む。本発明はネコCD86リガンド又はネコ可溶性CD86リガンドをコードする単離された核酸を含む。本発明はネコCD28レセプター又はネコ可溶性CD28レセプターをコードする単離された核酸を含む。本発明はネコCTLA−4レセプター又はネコ可溶性CTLA−4レセプターをコードする単離された核酸を含む。
本発明はネコCD80リガンド又はネコ可溶性CD80リガンドをコードする単離された核酸を含む。本発明はネコCD86リガンド又はネコ可溶性CD86リガンドをコードする単離された核酸を含む。本発明はネコCD28レセプター又はネコ可溶性CD28レセプターをコードする単離された核酸を含む。本発明はネコCTLA−4レセプター又はネコ可溶性CTLA−4レセプターをコードする単離された核酸を含む。
実施形態の一つでは、本発明はメチオニンから開始し、スレオニンで終結する図1Aに示す配列(配列番号1)を有するネコCD80リガンドをコードする核酸配列を提供する。別の実施形態では、本発明はメチオニンから開始し、グルタミンで終結する3A5に示す配列(配列番号5)を有するネコCD86リガンドをコードする核酸配列を提供する。実施形態の一つでは、本発明はメチオニンから開始し、セリンで終結する図4Aに示す配列(配列番号7)を有するネコCD28レセプターをコードする核酸配列を提供する。実施形態の一つでは、本発明はメチオニンから開始し、アスパラギンで終結する図5Aに示す配列(配列番号9)を有するネコCTLA−4レセプターをコードする核酸配列を提供する。
上記発明の実施形態では、核酸はDNA又はRNAである。別の実施形態は、DNAはcDNA又はゲノミックDNAである。
発明は、上記CD28、CD80、CD86又はCTLA−4をコードする核酸内に特異的に存在する配列に相補的な配列を有する少なくとも12ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを提供する。発明の別の実施形態は、上記CD28、CD80、CD86又はCTLA−4をコードする核酸内に特異的に存在する配列に相補的な配列を有する少なくとも15又は16ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを提供する。
上記発明の別の実施形態は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを提供する。実施形態の一つでは検出可能標識体は放射性同位体、蛍光体又はビオチンを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは選択的にメチル化される。
発明はネコCD80リガンド又はネコ可溶性CD80リガンドをコードする核酸を含むベクターを提供する。発明の別の実施形態は、PSI−B7−1/871−35と称されるプラスミドベクター(ATCC受託番号209817)を提供する。このプラスミドは特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約規定に従い、American Type Culture Collection(ATCC)、10801、University Boulevard、Manassas、Va 20108−0971、U.S.Aに1998年4月29日に寄託された。
発明はネコCD86リガンド又はネコ可溶性CD86リガンドをコードする核酸を含むベクターを提供する。発明の別の実施形態は、B7−2#19−2/011298と称されるプラスミドベクター(ATCC受託番号209821)を提供する。このプラスミドは特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約規定に従い、American Type Culture Collection(ATCC)、10801、University Boulevard、Manassas、Va 20108−0971、U.S.Aに1998年4月29日に寄託された。
本発明は、ネコCD28レセプター又はネコ可溶性CD28レセプターをコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明はPSI−CD28 #7/100296(ATTC受託番号209819)と称されるプラスミドベクターを提供する。本プラスミドは特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約規定に従い、American Type Culture Collection(ATCC)、10801、University Boulevard、Manassas、Va 20108−0971、U.S.Aに1998年4月29日に寄託された。
本発明は、ネコCTLA−4レセプター又はネコ可溶性CTLA−4レセプターをコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明はCTLA−4#1/091997(ATTC受託番号209820)と称されるプラスミドベクターを提供する。本プラスミドは特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約規定に従い、American Type Culture Collection(ATCC)、10801、University Boulevard、Manassas、Va 20108−0971、U.S.Aに1998年4月29日に寄託された。
発明は、核酸に作用可能に結合したプロモーターを更に含む上記ベクターを提供する。別の実施形態では、発明は上記ベクターの何れかを含む宿主細胞を提供する。実施形態の1つでは、上記ベクターの一つを含む宿主細胞は真核細胞又は前核細胞である。別の実施形態では、宿主細胞はE.coli、酵母、COS細胞、PC12細胞、CHO細胞、またはGH4C1細胞である。
発明は、請求項1のネコCD80リガンド又はネコ可溶性CD80リガンドをコードする核酸配列によりコードされるポリペプチドを提供する。発明の実施形態はネコCD86リガンド又はネコ可溶性CD86リガンドをコードする核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。発明の別の実施形態はネコCD28レセプター又はネコ可溶性CD28レセプターをコードする核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。本発明はネコCTLA−4レセプター又はネコ可溶性CTLA−4レセプターをコードする核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、発明はポリペプチドを発現する宿主細胞を培養し、生じたポリペプチドを回収することにより上記ポリペプチドを製造する方法を提供する。
本発明は上記ポリペプチド及び適切な担体を有効量含むワクチンを提供する。別の実施形態では、発明は上記ポリペプチド及び好適キャリアーの有効量が投与量当たり約0.01mgないし約100mgであるワクチンを提供する。別の実施形態では、発明は上記ポリペプチド及び適切な担体の有効量が約0.25mg/kgネコ体重/日ないし約25mg/kgネコ体重/日であるワクチンを提供する。
本発明は更に、病原菌に由来する免疫原を更に含む上記ワクチンを提供する。別の実施形態では、ワクチン内の免疫原は、ネコ病原菌、狂犬病ウイルス、クラミジア、トキソプラズマ原虫、イヌ糸状虫、ノミ、又は細菌性病原菌に由来する。別の実施形態では、発明はネコ病原菌がネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ネコ白血球ウイルス(FeLV)、ネコ感染性腹膜炎ウイルス(FIP)、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコレオウイルス3型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコシンシチアルウイルス、ネコザルコーマウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコボロナ病ウイルス、又はネコ寄生虫であるワクチンを提供する。
発明は更に、ネコに対し上記免疫原の何れかを含むワクチンの投与量を投与することを含むネコに免疫を誘導する方法を提供する。発明は更に、ポリペプチド、免疫原及び好適キャリアーの有効量を含む、ネコに於ける免疫反応を増強する方法も提供する。発明は上記ワクチンを皮下、筋肉内、全身、局所又は経口的に投与する方法を提供する。
発明の別の実施形態は、ネコに対し効果的免疫反応抑制量のポリペプチドをコードするネコCTLA−4核酸を投与することを含む、ネコに於ける免疫反応の抑制に適した方法を提供する。別の実施形態では、発明はネコに対しネコCD80、ネコCD86、又はネコCD28をコードする可溶性ポリペプチドの有効免疫反応抑制量を投与することを含む、ネコに於ける免疫反応を抑制する方法を提供する。
別の実施形態では、ネコに対し約0.25mg/kg体重/日ないし約25mg/kg体重/日のポリペプチドをコードするネコCTLA−4核酸を投与することを含む、ネコに於ける免疫反応の抑制に適した方法を提供する。別の実施形態では、本発明はネコに対しネコCD80、ネコCD86、又はネコCD28をコードする可溶性ポリペプチドを0.25mg/kg体重/日ないし約25mg/kb体重/日を投与することを含む、ネコに於ける免疫反応を抑制する方法を提供する。
本発明は、免疫反応を抑制するのに有効な量のポリペプチドをコードするネコCTLA−4核酸をネコに投与することによって、自己免疫疾患に罹患したネコ、または組織若しくは臓器移植のレシピエントであるネコの免疫反応を抑制する方法も提供する。
本発明は、ネコに対しネコCD80、ネコCD86、又はネコCD28をコードする可溶性ポリペプチドの有効免疫反応抑制量を投与することによる、自己免疫疾患を患うネコ、又は組織あるいは臓器移植のレシピエントであるネコに於ける免疫反応を抑制する方法も提供する。
発明は、約941ヌクレオチドの単離、精製されたネコCD80(B7−1)cDNAを提供する。発明は更に、分子量約33,485kDa、等電点約9.1、pH7.0に於ける総電荷が10である未変性の膜結合又は成熟型である約292アミノ酸の単離、精製されたネコCD80ポリペプチドも提供する。
CD80と補助刺激分子(costimulatory molecule)CD28、及び腫瘍抗原又は病原性生物の抗原との共発現は、T−リンパ細胞を活性化し、又は促進して免疫刺激性のサイトカインの産生を誘導し、別のタイプの細胞の増殖を制御する能力を有している。CD80と補助刺激分子CTLA−4との共発現は、T−リンパ細胞の活性化を制御する能力を有する。
発明は約1176ヌクレオチドの単離、精製されたネコCD86(B7−2)のcDNAを提供する。発明は更に、分子量約36,394kDa、等電点約9.19、pH7.0に於ける総電荷が11.27である未変性の膜結合又は成熟型である約320アミノ酸の単離、精製されたネコCD86ポリペプチドも提供する。CD86と補助刺激分子CD28、及び腫瘍抗原又は病原性生物の抗原との共発現は、T−リンパ細胞を活性化し、又は促進して免疫刺激性のサイトカインの産生を誘導し、別のタイプの細胞の増殖を制御する能力を有している。CD86と補助刺激分子CTLA−4との共発現は、T−リンパ細胞の活性化を制御する能力を有する。
本発明によるネコCD80またはCD86は未変性又は膜結合供給源より得られる。本発明によるネコCD80又はCD86は、未変性及び膜結合型、又は膜貫通ドメインを欠いた分泌型を含む。
発明は、約689ヌクレオチドの単離、精製されたネコCD28のcDNAを提供する。発明は更に、分子量約25,319kDa、等電点約9.17、pH7.0に於ける総電荷が9.58である未変性の膜結合又は成熟型である約221アミノ酸の単離、精製されたネコCD28ポリペプチドを提供する。
発明は、約749ヌクレオチドの単離、精製されたネコCTLA−4のcDNAを提供する。発明は更に、分子量約24,381kDa、等電点約6.34、pH7.0に於ける総電荷が−0.99である未変性の膜結合又は成熟型である約223アミノ酸の単離、精製されたネコCTLA−4ポリペプチドを提供する。
別の態様では発明は、ネコCD28又はネコCTLA−4有り、または無しにおいて、免疫反応を増強するのに有効な量のネコCD80又はネコCD86より前、後、あるいは実質同時に免疫原を投与することにより達成される、免疫原に対するネコ科動物に於ける免疫反応を増強する方法を提供する。
別の態様では発明は、ネコCD28又はネコCTLA−4有り、または無しにおいて、あるいはネコCD80あるいはネコCD86、又はネコCD28あるいはネコCTLA−4を一部又は全部コードしているアンチセンスRNAあるいはDNAと共に、免疫反応抑制有効量のネコCD80又はネコCD86より前、後、あるいは実質的に同時に免疫原を投与することにより達成される、免疫原に対するネコ科動物の免疫反応を抑制する方法を提供する。
別の態様では、発明は免疫原及び免疫反応増強に適したネコCD80の有効量を含む、ネコ科動物に於ける免疫原に対する免疫反応の誘導に適したワクチンを提供する。免疫原は、例えばネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコパルボウイルス、ネココロナウイルス、ネコレプトウイルス等のネコ病原菌に由来する。
別の態様では、発明は免疫原のDNA又はRNA、及び免疫反応をモジュレートするのに有効な量のタンパク質またはタンパク質の断片をコードするネコCD80、CD86、CD28アクセサリー分子のDNA又はRNAを、何れかの組み合わせにて投与することで達成される、ネコ科動物の免疫原に対する免疫反応の誘導に適したワクチンを提供する。
ネコCD80タンパク質は、ヒト及びマウスのそのタンパク質とそれぞれ59%及び46%同一であるアミノ酸配列を有する。ネコCD86タンパク質は、ヒト及びウサギのそのタンパク質とそれぞれ68%及び64%同一であるアミノ酸配列を有する。ネコCD28タンパク質は、ヒト及びマウスのそのタンパク質とそれぞれ82%及び74%同一であるアミノ酸配列を有する。ネコCTLA−4タンパク質は、ヒト及びマウスのタンパク質とそれぞれ88%及び78%同一であるアミノ酸配列を有する。ヒト又はマウスのCD80又はCD86タンパク質は、ネコのCD80又はCD86タンパク質を機能的に代替できない。従って、ネコCD80、ネコCD86、ネコCD28及びネコCTLA−4は、ネコ科動物の免疫の制御に必要な新規試薬である。
本発明はネコ種のT細胞制御アクセサリー分子、CD80(B7−1)又はCD86(B7−2)あるいはCD28又はCTLA−4(CD152)を包含する。発明は、ネコCD80又はネコCD86あるいはCD28又はネコCTLA−4の一部又は全部をコードする単離、精製された核酸、及び天然あるいは組換え体資源より精製されたCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドを提供する。本発明により生産されたネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4は、腫瘍及び病原性生物に対するネコワクチンの有効性を高めるために、又ネコに於けるウイルス性及び細菌性疾患の治療に利用される。本発明により製造されるネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4は、免疫反応の過度の活性化、過剰な反応、又は誤って誘導された免疫反応に起因する病気を緩和するために利用される。
[核酸、ベクター、トランスフォーマント]
ネコCD80(配列番号1)、ネコCD86(配列番号5)、ネコCD28(配列番号7)又はネコCTLA−4(配列番号9)をコードするcDNAの配列は図1ないし5に示されており、ネコCD80(配列番号2)、ネコCD86(配列番号6)、ネコCD28(配列番号8)又はネコCTLA−4(配列番号10)の推測アミノ酸配列は図1ないし5に示されている。これらネコポリペプチドは、これらポリペプチドのヒト、又はマウス、あるいはウサギ相同体との部分アミノ酸配列相同性、CD80又はCD86ポリペプチドのネコCD28レセプター(以下参照)又はCTLA−4への結合能及びT−リンパ細胞を活性化し、あるいは刺激し、又は活性化を制御する能力に基づきCD80,CD86、CD28又はCTLA−4と命名された。更に、理論に拘泥することを望むものではないが、ネコCD80又はネコCD86ポリペプチドは以下の生物活性の1またはそれ以上を有すると推測される:NK(ナチュラルキラー)の活性化、B−細胞成熟の促進、MHC拘束細胞傷害性T−リンパ細胞の活性化、マスト細胞の増殖、サイトカインレセプターとの相互作用及び免疫−制御サイトカインの誘導。
ネコCD80(配列番号1)、ネコCD86(配列番号5)、ネコCD28(配列番号7)又はネコCTLA−4(配列番号9)をコードするcDNAの配列は図1ないし5に示されており、ネコCD80(配列番号2)、ネコCD86(配列番号6)、ネコCD28(配列番号8)又はネコCTLA−4(配列番号10)の推測アミノ酸配列は図1ないし5に示されている。これらネコポリペプチドは、これらポリペプチドのヒト、又はマウス、あるいはウサギ相同体との部分アミノ酸配列相同性、CD80又はCD86ポリペプチドのネコCD28レセプター(以下参照)又はCTLA−4への結合能及びT−リンパ細胞を活性化し、あるいは刺激し、又は活性化を制御する能力に基づきCD80,CD86、CD28又はCTLA−4と命名された。更に、理論に拘泥することを望むものではないが、ネコCD80又はネコCD86ポリペプチドは以下の生物活性の1またはそれ以上を有すると推測される:NK(ナチュラルキラー)の活性化、B−細胞成熟の促進、MHC拘束細胞傷害性T−リンパ細胞の活性化、マスト細胞の増殖、サイトカインレセプターとの相互作用及び免疫−制御サイトカインの誘導。
遺伝子コードの縮重(即ち、特定アミノ酸を複数のコドンがコードする)により、図1ないし5に示された以外のDNA配列も図1ないし5に示されるネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4アミノ酸配列をコードできる。このような他のDNAには、あるコドン中の一以上のヌクレオチドの変化が、その位置でコードされているアミノ酸に変化をもたらさない、「配列保存的」変異を含有するものが含まれる。更に、ポリペプチド中の既述アミノ酸残基は、しばしば天然ポリペプチドの全体立体構造及び機能を変化させることなく変化させることができる。この様な「機能保存的」変異には、例えば酸性、塩基性、疎水性、親水性、芳香性等ののような類似の物理−化学的特性を持つアミノ酸とのアミノ酸置換(例えばリジンとアルギニン、アスパラギンとグルタミン、グリシンとアラニンの置換)が含まれるが、もとよりこれに限定されるものではない。更に、アミノ酸配列は分子の生物活性を破壊することなく付加又は欠失される。例えば付加アミノ酸配列はアミノ−又はカルボキシル末端に加えられ、ヒスチジンタグのような精製用タグ(即ち、タンパクの1段階精製を可能とするものであり、精製後にそれらは化学的又は酵素的に除去される)として利用される。あるいは、付加配列は、さらなる細胞表面結合部位を付与し、又は抗体のための抗原結合部位の付加を用いた場合のように、ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4の標的細胞特異性を変化させる。
本発明の範囲内のネコCD80又はネコCD86、あるいはネコCD28又はネコCTLA−4のcDNAは、図1ないし5のcDNA、配列保存的変異DNAs、機能保存的変異ポリペプチドをコードするDNA配列、及びその組み合わせである。本発明は、単独又は他の配列あるいは成分との組み合わせに於いて、有用な程度の生物活性を有するネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4の断片を包含する。以下で説明する如く、CD80、CD86、C28、又はCTLA−4の配列を予測的に取り扱い、あるネコCD80、CD86、C28、又はCTLA−4の変種が、ある適用、又はこれらの分子の結合活性に影響を与えて有効性を増加させる適切な安定性と生物活性を有しているかどうかを確定することは、本分野における通常の技術に属する。ネコCD80及びCD86はそれぞれ補助レセプターCD28又は補助レセプターCTLA−4と結合するだろう。これは組換え系内で変異体CD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドを発現し、精製し、そのT細胞刺激活性及び/又は成長促進活性を細胞培養及び動物内にてアッセイした後、前記適用において試験を行うことにより達成できる。変異体CD80は、CD28又はCTLA−4レセプターへの機能的結合により生物活性について試験される。変異体CD86は、CD28又はCTLA−4レセプターに対する機能的結合により生物活性が試験される。同様の様式にて、変異体CD28又は変異体CTLA−4は生物活性に関し試験される。
本発明は、もとよりこれに限定されるものではないが、ネコ、ライオン、トラ、チータ、ボブキャット等を含む他のネコ種に由来するネコCD80,CD86、CD28又はCTLA−4DNAs(及びポリペプチド)も包含する。図1ないし5に示す配列のネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4相同体は、cDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングし図1ないし5の配列の全て又は一部を含むプローブにハイブリダイズするクローンを同定することで容易に特定される。あるいは、発現ライブラリーはネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4を認識する抗体を用いてスクリーニングされる。理論に拘泥することを望むものではないが、他のネコ種のCD80又はCD86遺伝子は、ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4遺伝子と少なくとも約70%相同性を共有すると考えられる。又、本発明の範囲には、ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4と少なくとも約25%のアミノ酸同一性を共有するポリペプチドをコードするDNAとして規定されるCD80、CD86、CD28又はCTLA−4の相同体をコードするDNAである。
一般に、本発明による核酸の操作では、例えば分子クローニング、研究室マニュアル(Molecular Cloning、A Laboratory Manual)(2nd Ed.,Sambrook、Fritsh及びManiatis、Cold Spring Harbor)、又は現代分子生物学プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)(Eds. Aufubel,Brent、KIngston、More、Feidman、SmithとStuhl、Greene Publ.Assoc.,Wiley−Interscience、NY,NY,1992)に開示されている様な、当業者に公知である方法を用いる。
本発明は、cDNA及びRNA配列、及びセンス及びアンチセンスを包含する。発明は、さらにネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4のゲノミックDNA配列と、制御配列のような(これに限定されない)隣接配列も包含する。ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、反応エレメント、シグナル配列、ポリアデニレーション配列、イントロン、5’−及び3’−非コーディング領域等の異種配列とも結合される。ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4cDNAと作用可能に結合した転写制御エレメントは、原核細胞、真核細胞、原核細胞のウイルス、真核細胞のウイルス、及びその組み合わせに由来する遺伝子を発現させる能力を有するものが含まれるが限定なく含む。その他の有益な異種制御配列は当業者に公知である。
本発明の核酸配列は、当業者に公知の方法によって、その安定性、溶解性、結合親和性、及び特異性を変化させるために修飾される。例えば、配列は選択的にメチル化される。本発明の核酸配列は検出可能なシグナルを提供できる標識によっても直接的、又は間接的に修飾される。標識の例には放射性同位体、蛍光分子、ビオチン等が含まれる。
本発明は更にCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドの一部又は全部をコードする核酸を含むベクターも提供する。これらベクターは、例えば様々な真核生物又は原核生物宿主のDNA中での発現に適したプラスミドベクターを含む。好ましくは、ベクターはネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドをコードする部分に作用可能に結合されたプロモーターも含む。コードされたネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドは、本明細書で説明される、又は当業者公知のその他の好適なベクター及び宿主細胞を用いて発現される。
本発明の実施の利用に好適なベクターには、YEp352、pcDNAI(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア(Invitrogen、Carlsbad、CA))、pRc/CMV(インビトロゲン社)、及びpSFV1(ギブコ/BRL社、ゲイターブルグ、メリーランド(GIBCO/BRL、Gaithersburg,MD))。発明への利用に適した好ましいベクターの一つはpSFV1である。適切な宿主細胞はE.Coli、酵母、COS細胞、PC12細胞、CHO細胞、GH4Cl細胞、BHK−21細胞及び両生類メラノフォア細胞を含む。BHK−21細胞は本発明の実施の利用に適した好ましい宿主細胞系である。裸のDNA又は遺伝子ワクチンの構築に適したベクターには、pTarget(プロメガ社、マジソン、ウイスコンシン(Promega、Madison、WI))、pSI(プロメガ社、マジソン、ウイスコンシン)及びpcDNA(インビトロン社、カールスバッド、カリフォルニア)が含まれるが、これらに限定されない。
ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドを含む核酸は、組換えによっても細胞内に導入される。例えば、これら配列は細胞内にマイクロインジェクションされ、ポリペプチド、その類似体又は偽遺伝子、又はネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドをコードする遺伝子と実質的に同一性を有する配列をコードする内因性遺伝子の部位に相同的組換えを起こさせる。非相同的組換えのようなその他の組み換えをベースとする方法、及び相同的組換えによる内因性遺伝子の欠失も、特に多能性細胞に於いて利用できる。
本発明は、ネコCD28若しくはネコCTLA−4と共に、又はネコCD28若しくはネコCTLA−4なしで、免疫反応を増強するのに有効な量のネコCD80又はネコCD86より前、後、あるいは実質的に同時に免疫原を投与することにより達成される、免疫原に対するネコ科動物の免疫反応を増強する方法を提供する。
本発明は、ネコCD28若しくはネコCTLA−4と共に、又はネコCD28若しくはネコCTLA−4なしに、ネコ病原菌由来の免疫原を含む発現ベクターと共に免疫反応を増強するのに有効な量のネコCD80又はネコCD86アクセサリー分子を投与することにより達成される、免疫原に対する免疫反応を増強する方法を提供する。
本発明は、ネコCD28若しくはネコCTLA−4と共に、又はネコCD28若しくはネコCTLA−4なしに、ネコ病原菌由来の免疫原を含む発現ベクターと共に、免疫反応を増強するのに有効な量のネコCD80又はネコCD86を投与することにより達成される、免疫原に対する免疫反応を増強する方法を提供する。
本発明は、ネコCD28若しくはネコCTLA−4と共に、又はネコCD28若しくはネコCTLA−4なしに、あるいはネコCD80、又はネコCD86を、又はネコCD28又はネコCTLA−4をコードするアンチセンスRNA若しくはDNAと共に、免疫反応を抑制するのに有効な量のネコCD80又はネコCD86の前、後又は実質的に同時に免疫原を投与することで達成される、ネコ科動物の免疫原に対する免疫反応を抑制する方法を提供する。
本発明は、免疫原と、免疫反応増強用のネコCD28若しくはネコCTLA−4と共に、又は免疫反応増強用のネコCD28若しくはネコCTLA−4と共になしに有効量のネコCD80又はネコCD86、あるいは免疫反応抑制用のネコCTLA−4とともに有効量のネコCD80又はネコCD86とを含むワクチンを提供する。別の態様では、本発明は、ネコの病原体に対する免疫原の遺伝子と、免疫応答増強又は抑制用ネコCD28若しくはネコCTLA−4と共に、又は免疫応答増強若しくは抑制用ネコCD28若しくはネコCTLA−4なしにCD80、CD86の遺伝子を含有する発現ベクターとを含むワクチンを提供する。
[ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチド]
ネコCD80遺伝子(図1及び2に示されるcDNA及びアミノ酸配列)は約292アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコCD86遺伝子(図5及び6に示されるcDNA及びアミノ酸配列)は約320アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコCD28遺伝子(図4に示されるcDNA及びアミノ酸配列)は約221アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコCTLA−4遺伝子(図5に示されるcDNA及びアミノ酸配列)は約223アミノ酸のポリペプチドをコードする。
ネコCD80遺伝子(図1及び2に示されるcDNA及びアミノ酸配列)は約292アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコCD86遺伝子(図5及び6に示されるcDNA及びアミノ酸配列)は約320アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコCD28遺伝子(図4に示されるcDNA及びアミノ酸配列)は約221アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコCTLA−4遺伝子(図5に示されるcDNA及びアミノ酸配列)は約223アミノ酸のポリペプチドをコードする。
天然又は組換え体採取源から得られたネコCD80、CD86、CD28、又はCTLA−4の精製は、イオン交換クロマトグラフィー、C4カラムによる逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点フォーカシング、アフィニティークロマトグラフィー等の当業者公知の方法により達成されるが、もとよりこれに限定されない。好適な実施形態では、大量の生物活性なネコCD80、CD86、CD28、又はCTLA−4は、pSFV1レプリコン(ギブコ/BRL)中の6C−末端ヒスチジン残基をコードする配列とフレーム中に融合したネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4に関するコーディング域を含む組換え体DNA配列を構築することで得られる。このプラスミドによりコードされるmRNAは当業者に公知の技術を利用して合成され、エレクトロポレーションによりBHK−21細胞内に導入される。細胞は、成熟したグリコシル化された6個のC−末端ヒスチジンを含むネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドを合成し、分泌する。修飾されたネコCD80、CD86、CD28、又はCTLA−4ポリペプチドは細胞上清よりヒスチジン結合樹脂(His−Bind、ノバゲン社(Novagen)、マジソン(Madison)、ウイスコンシン)を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製させる。
いずれかの採取源より単離されたネコCD80又はネコCD86ポリペプチドは、当業者に公知の方法により修飾される。例えば、ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4はリン酸化、脱リン酸化、グリコシル化又は脱グリコシル化等を受ける。CD80、CD86、CD28又はCTLA−4の溶解性、安定性及び結合性及び親和性を変える修飾は特に有益である。
[ネコCD80、CD86、CD28、CTLA−4キメラ分子]
本発明は、ネコCD80、CD86、CD28、CTLA−4の何れかの組み合わせより成る断片から作られるキメラ分子の製造も包含する。例えば、CD28結合部位の代わりにCTLA−4の結合部位を導入し、免疫反応の増強を維持しながらCD28の結合親和性を増加する。
本発明は、ネコCD80、CD86、CD28、CTLA−4の何れかの組み合わせより成る断片から作られるキメラ分子の製造も包含する。例えば、CD28結合部位の代わりにCTLA−4の結合部位を導入し、免疫反応の増強を維持しながらCD28の結合親和性を増加する。
実施形態の1つでは、CTLA−4及びCD28上のCD80又はCD86の結合部位は交換され、その結果CD28上の結合域はCTLA−4の結合域により交換される。CTLA−4結合領域を持つキメラCD28分子の効果は、CD80又はCD86に対するCD28の親和性を上げ、免疫反応の増強の程度を高めることである。別の実施形態では、CD80とCD86、並びにCD86とCD28のキメラ分子又はその断片は膜に結合しており、これら分子の免疫増強能を改善する。別の実施形態では、CD80とCTLA−4、又はCD86とCTLA−4のキメラ分子、又はその断片は膜に結合しており、これら分子の免疫抑制能を改善する。別の実施形態では、CD80とCTLA−4又はCD86とCTLA−4のキメラ分子、又はその断片は膜に結合しており、免疫反応を再度方向付けし、所望する効果を達成する。
[抗−ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4抗体]
本発明は、上記に規定されるネコCD80、CD86、CD28、CTLA−4ポリペプチドに対し特異的な抗体を包含する。抗体はポリクローナル又はモノクローナルであり、様々な種のネコCD80、CD86、CD28、CTLA−4を識別し、機能的ドメイン等を同定する。この様な抗体はHarlow及びLane、抗体(Antibodies)、研究室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory、1988に開示されている方法及び成分、並びに当業者公知の免疫学的及びハイブリドーマ技術を利用して容易に作製される。天然及び合成のネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4−誘導型ペプチドがネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4特異的免疫反応の誘導に利用される場合は、ペプチドはKLHの様な適切な担体に容易に結合され、フレンドのアジュバントの様な適切なアジュバント中に投与される。好ましくは、選択されたペプチドはTan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:5409−5413の方法に本質従い、リジンコアキャリアーに結合される。得られた抗体は、特に内部イメージング抗イディオタイプ抗体も既知方法により調製される。
本発明は、上記に規定されるネコCD80、CD86、CD28、CTLA−4ポリペプチドに対し特異的な抗体を包含する。抗体はポリクローナル又はモノクローナルであり、様々な種のネコCD80、CD86、CD28、CTLA−4を識別し、機能的ドメイン等を同定する。この様な抗体はHarlow及びLane、抗体(Antibodies)、研究室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory、1988に開示されている方法及び成分、並びに当業者公知の免疫学的及びハイブリドーマ技術を利用して容易に作製される。天然及び合成のネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4−誘導型ペプチドがネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4特異的免疫反応の誘導に利用される場合は、ペプチドはKLHの様な適切な担体に容易に結合され、フレンドのアジュバントの様な適切なアジュバント中に投与される。好ましくは、選択されたペプチドはTan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:5409−5413の方法に本質従い、リジンコアキャリアーに結合される。得られた抗体は、特に内部イメージング抗イディオタイプ抗体も既知方法により調製される。
実施形態の1つでは、精製されたネコCD80、CD86、CD28、又はCTLA−4はマウスの免疫に利用され、その後その膵臓が取り出され、膵臓細胞を用いミエローマ細胞との細胞ハイブリッドを形成し、当業者に標準的である技術に従い抗体を分泌する細胞のクローンを得る。これら細胞より分泌され得られたモノクローナル抗体を以下の活性に関するインビトロアッセイを利用し、アッセイする:ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4への結合、及びネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4のT細胞刺激活性の阻害。
抗ネコCD80、抗CD86、抗CD28、又は抗CTLA−4抗体は、ELISA、RIA等の免疫アッセイを利用したネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4の同定及び定量に利用される。抗ネコCD80、抗CD86、抗CD28又は抗、CTLA−4抗体は、ネコCD80又はCD86、あるいはCD28、又はCTLA−4の抽出物の免疫除去にも利用される。更に、これら抗体は、各種採取源からのネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4を同定、分離及び精製し、細胞下レベル及び組織化学的局在研究を実施するために利用できる。
[応用]
本発明により製造されたネコCD80(B7−1)リガンド、ネコCD86(B7−2)リガンド、ネコCD28レセプター又はネコCTLA−4(CD152)レセプターは感染症予防のワクチンとして、又は同種または異種ネコ種に於ける増殖を促進するのに有益に利用できる。例えば、CD80又はCD86の補助促進分子であるCD28又はCTLA−4との、何れかの組み合わせによる共発現、及び腫瘍細胞又は病原生物由来の抗原。ネコCD80又はCD86とネコCTLA−4レセプターとの共発現は、T−リンパ細胞の活性化を阻害し、免疫反応を抑制する能力を有する。具体的な例は、CD80又はCD86と、FIV、FeLV、又はFIP由来免疫原とウイルスベクター中、又はDNA発現ベクター中での共発現であり、ワクチンとして投与された場合には、CD4+CD8+T−リンパ細胞の増殖を活性化、促進又は制御し、IL−2、IFN−γ、IL−12、TNFα、IL−6等の免疫−制御サイトカインを誘導するだろう。別の具体的な例は、CD80、CD86、CD28又はCTLA−4をウイルスベクター又はDNA発現ベクター中にて発現させるものであり、治療薬として投与されると免疫反応を制御し、又は方向付け直す。
本発明により製造されたネコCD80(B7−1)リガンド、ネコCD86(B7−2)リガンド、ネコCD28レセプター又はネコCTLA−4(CD152)レセプターは感染症予防のワクチンとして、又は同種または異種ネコ種に於ける増殖を促進するのに有益に利用できる。例えば、CD80又はCD86の補助促進分子であるCD28又はCTLA−4との、何れかの組み合わせによる共発現、及び腫瘍細胞又は病原生物由来の抗原。ネコCD80又はCD86とネコCTLA−4レセプターとの共発現は、T−リンパ細胞の活性化を阻害し、免疫反応を抑制する能力を有する。具体的な例は、CD80又はCD86と、FIV、FeLV、又はFIP由来免疫原とウイルスベクター中、又はDNA発現ベクター中での共発現であり、ワクチンとして投与された場合には、CD4+CD8+T−リンパ細胞の増殖を活性化、促進又は制御し、IL−2、IFN−γ、IL−12、TNFα、IL−6等の免疫−制御サイトカインを誘導するだろう。別の具体的な例は、CD80、CD86、CD28又はCTLA−4をウイルスベクター又はDNA発現ベクター中にて発現させるものであり、治療薬として投与されると免疫反応を制御し、又は方向付け直す。
ネコCD80又はCD86とCD28又はCTLA−4との相互作用を通じた免疫増強、又はネコCD80又はCD86とCTLA−4との相互作用による免疫反応の阻害には、全身性又は長期の健康に対する有害効果も倍加することがある異物の添加に比べて、制御プロセスが自然であるという利点がある。CD80、CD86、CD28又はCTLA−4分子は、その他の組換え体分子、例えば免疫誘導に関し所望される抗原をコードする分子と共に投与される。ネコCD80、CD86、CD28及び/又はCTLA−4遺伝子は発現ベクター内に挿入され、標的細胞に感染またはトランスフェクションされ、標的細胞内にて遺伝子産物を発現し、それは標的細胞又は抗原提示細胞の原形質膜内に固定されるか、又は標的細胞あるいは抗原提示細胞の外に分泌される。プラスミド、セムリキ森林熱ウイルス、ポックスウイルス、又はヘルペスウイルスの様な発現ベクターは、遺伝子を抗原提示細胞に運搬する。ネコCD80、CD86、CD28および/又はCTLA−4遺伝子又は遺伝子の断片の何れかの組み合わせは、DNA又はRNA発現ベクター内に挿入され、ネコに注射され、ネコの中で遺伝子産物を”裸の”DNA/RNA又は遺伝子ワクチンとして発現する。標的細胞又はネコ科動物内での免疫原とCD80、CD86、CD28及び/又はCTLA−4の共発現はTリンパ細胞、Bリンパ細胞及びその他の細胞の活性化に寄与し、活性化を増強し、又は制御する。あるいは、発現したタンパク質はプラスミド内で発現された後に投与することができる。ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4タンパク質は通常細胞膜内に固定され、原形質膜アクセサリー分子として機能するが、その他の形、特に膜アンカー無しには存在できないだろう。
実施形態の1つでは、ネコCD80及びネコCD86は可溶性であり、膜貫通ドメイン又は疎水性領域を欠いており、補助刺激分子であるCD28又はCTLA−4と膜結合型又は可溶型の何れかの形で相互作用する。別の実施形態では、ネコCD80又はネコCD86は膜結合しており、補助刺激分子であるCD28又はCTLA−4は可溶性形状にあり、膜貫通ドメインまたは疎水領域を欠いている。可溶性CD28又はCTLA−4は、好ましくは2量体であり、ネコに於けるT細胞介在型免疫抑制に関連した病気の治療に有用である。可溶性CD28又はCTLA−4は移植組織の拒絶を防止し、自己免疫疾患の治療に利用できる。具体的には、可溶性CD28又はCTLA−4は骨髄移植に於ける移植体対宿主病の防止に有用である。可溶性CD28又はCTLA−4は細胞含有膜結合ネコCD80又はCD86の結合を阻止する。
ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4DNA及びポリペプチド、又は生物活性的なネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4断片又は亜断片は、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、病原性微生物由来の抗原、抗体、又はhis−タグあるいはレポーター遺伝子、大腸菌lacZ、E.coli uidAの様な精製遺伝子、または緑色蛍光タンパク質といった別の配列とフレーム内にて融合する。
[ワクチン]
本発明は、ネコ種に於ける免疫反応の効率を促進する方法及び成分を包含する。本実施形態では、ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4は、それに対する免疫反応の惹起が望まれる免疫原と組み合わせて利用される。例えば、ネコ免疫不全ウイルス及びネコ白血病ウイルスの様な病原体、又はネコパルボウイルス、ネコレプトウイルス、及びネココロナウイルスの様なその他の病原体由来の免疫原を含むネコワクチンでは、ワクチン中に免疫反応の規模と質を制御するネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4を含む。この目的に関しては、天然又は組換え体採取源から精製されたネコCD80、CD86、CD28、CTLA−4がワクチン調剤中に約0.01ないし100.0mg/ワクチン/ネコ含まれる。
本発明は、ネコ種に於ける免疫反応の効率を促進する方法及び成分を包含する。本実施形態では、ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4は、それに対する免疫反応の惹起が望まれる免疫原と組み合わせて利用される。例えば、ネコ免疫不全ウイルス及びネコ白血病ウイルスの様な病原体、又はネコパルボウイルス、ネコレプトウイルス、及びネココロナウイルスの様なその他の病原体由来の免疫原を含むネコワクチンでは、ワクチン中に免疫反応の規模と質を制御するネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4を含む。この目的に関しては、天然又は組換え体採取源から精製されたネコCD80、CD86、CD28、CTLA−4がワクチン調剤中に約0.01ないし100.0mg/ワクチン/ネコ含まれる。
ネコワクチンの市販の採取源は、当業者に公知であり(Veterinary Phramaceuticalsのコンペディウム(Compedium)、1997)、より効果的ワクチンとするために本発明と組み合わせ使用される。
ネコに於ける免疫原に対する免疫反応を誘導し、又は制御するためのワクチンは、免疫原と、免疫反応増強用のネコCD28若しくはネコCTLA−4と共に、又は免疫反応増強用のCD28若しくはネコCTLA−4なしに、有効量のネコCD80又はネコCD86とを、又は免疫反応抑制用のネコCTLA−4と共にネコCD80又はネコCD86とを含む。
免疫原は、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス(parvo)、ネコカリチウイルス、ネコレオウイルス3型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコシンシチアルウイルス、ネコザルコーマウイルス、ネコヘルペスウイルス(鼻気管炎ウイルス)、ネコボロナ病ウイルス、クラミジア、トキソプラズマ原虫、ネコ寄生虫、イヌ糸状虫、ノミ、細菌性病原菌等のようなネコ病原体を含むグループより選択されるが、これに限定されるものではない。
T−リンパ細胞のような細胞種の増殖の制御又は活性化の制御は、該制御反応が細胞の増殖を刺激し、又は抑制することを意味する。ネコ科動物に於ける免疫反応の制御は、免疫反応が刺激され、又は抑制されネコ科動物の病気又は感染病原体を治療することを意味する。
遺伝子ワクチン又は裸DNAワクチンとして投与することを目的とした、ネコ免疫原の遺伝子を含有する発現ベクター内での、ネコCD80、CD86、CD28、又はCTLA−4単独の発現、又は任意の一部又は全部を組合せた発現。ベクターには、pTarget(プロメガ社、マジソン、ウィスコンシン)、pcDNA(インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア)。(Donnelly JJ,ら、1997;HassettとWhitton、1996.)が含まれるが、これらに限定されない。
CD80、CD86、CD28及びCTLA−4の遺伝子又は遺伝子断片は、単独で、又は任意の一部若しくは全部を組み合わせて、ネコ科動物又はその他の動物の染色体に挿入又はトランスフェクトされる。このようなこれら遺伝子の組み込みは、レトロウイルスベクターと同様にして達成され、遺伝子治療の一形態として利用されるだろう。
本発明は、医療及び/又は市販目的のネコ種の病気に対する耐性を改善するための方法及び成分を提供する。この実施形態では、単独で、又は任意の一部若しくは全部を組合せて、且つネコ免疫原をコードする遺伝子と組み合わせて、又は組み合せずに発現されたCD80、CD86、CD28、又はCTLA−4は、適当な投与様式によりネコ科動物に投与される。増殖促進又は病気耐性に関しては、単独又は組み合わせにより発現されたネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4を約0.01ないし100mg/ワクチン/ネコ範囲の濃度になる量、好ましくは約0.25mg/kg/日ないし約25mg/kg/日になる量が調剤に加えられる。ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4の必要量は、投与量と頻度のマトリックスを作り、マトリックスの各点について実験ユニットと被験者のグループとを比較する様な当業者に公知の日常実験により決定できることが理解されるだろう。
本発明によれば、天然又は組換えネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4は、生理学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝化生理食塩水又は脱イオン水のような担体とともに調剤される。調剤は、光沢剤、可塑剤、吸収促進剤、殺菌剤等の当業者公知の賦形剤も含むだろう。本発明のネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4ポリペプチドは、静脈内、皮下、筋肉内、経筋肉的、局所、または経口経路を含む、これに限定されない有効な何れかの手段により投与される。皮下投与に関しては、例えば投与形状はネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4を滅菌生理的食塩水中に含む。経口又は呼吸器投与では、ネコCD80、CD86、CD28又はCTLA−4は、賦形剤と共に、又は賦形剤なしに、例えばリポソームやミクロスフェアー中に、ミクロ−又はマクロ−カプセル化される。皮膚用パッチ(又は、除法投与形状)も利用される。
[例]
[例1A]
ネコCD80(B7−1)−TAMU、CD86(B7−2)、CD28及びCTLA−4cDNAのクローニング:
ネコCD80(B7−1)、CD86(B7−2)、CD28、CTLA−4cDNAは、ネコmRNAと相互作用する変性プライマーを作製する程度に十分保存されている2ヶ所の配列の間の領域を増幅する第一のRT−PCR(逆転写酵素/ポリメラーゼチェインリアクション反応)を利用してクローニングした。mRNAの採取源は、少なくとも16時間ConAにより刺激された末梢血単核細胞(PBMC)であった。このPCR産物は配列決定された。配列はRACE(cDNA末端の迅速増幅)PCRに適したプライマーの作製に使用された。5’末端は、新たに配列決定された保存域に対し相補的である下流域プライマーを使いまずcDNAを作製することで増幅された。オリゴヌクレオチドはcDNAの3’末端に結合された(mRNAの5’末端に対する祖補体)。この配列は、新たに配列決定された領域内の別の領域に対応する下流域PCRプライマーに適合したPCRである上流プライマーに関する結合部位として機能する。変性プライマーはネステッド反応に於いて複数使用されて、3’末端を得る。このPCRに関する上流プライマーは、新たに配列決定された領域の配列と反応する様に設計されている。産物は直接配列決定されるか、又はTAクローニングベクター内にクローン化され、プラスミドより配列決定された。全オープンリーディングフレームは、既知配列より構築されたプライマーを用いたPCRによってその全体が増幅され、クローン化された。ORFは3回クローン化され、配列決定された。B7−1OFRはSV40プロモーターを持つpSIプラスミド、及びSFVプラスミド内にサブクローン化された。pSIはB7−1とネコCD28との機能的相互作用の確立に利用された。
[例1A]
ネコCD80(B7−1)−TAMU、CD86(B7−2)、CD28及びCTLA−4cDNAのクローニング:
ネコCD80(B7−1)、CD86(B7−2)、CD28、CTLA−4cDNAは、ネコmRNAと相互作用する変性プライマーを作製する程度に十分保存されている2ヶ所の配列の間の領域を増幅する第一のRT−PCR(逆転写酵素/ポリメラーゼチェインリアクション反応)を利用してクローニングした。mRNAの採取源は、少なくとも16時間ConAにより刺激された末梢血単核細胞(PBMC)であった。このPCR産物は配列決定された。配列はRACE(cDNA末端の迅速増幅)PCRに適したプライマーの作製に使用された。5’末端は、新たに配列決定された保存域に対し相補的である下流域プライマーを使いまずcDNAを作製することで増幅された。オリゴヌクレオチドはcDNAの3’末端に結合された(mRNAの5’末端に対する祖補体)。この配列は、新たに配列決定された領域内の別の領域に対応する下流域PCRプライマーに適合したPCRである上流プライマーに関する結合部位として機能する。変性プライマーはネステッド反応に於いて複数使用されて、3’末端を得る。このPCRに関する上流プライマーは、新たに配列決定された領域の配列と反応する様に設計されている。産物は直接配列決定されるか、又はTAクローニングベクター内にクローン化され、プラスミドより配列決定された。全オープンリーディングフレームは、既知配列より構築されたプライマーを用いたPCRによってその全体が増幅され、クローン化された。ORFは3回クローン化され、配列決定された。B7−1OFRはSV40プロモーターを持つpSIプラスミド、及びSFVプラスミド内にサブクローン化された。pSIはB7−1とネコCD28との機能的相互作用の確立に利用された。
ネコCD80(B7−1)cDNAのRT/PCRに利用されたDNAプライマーは:
5’プライマー:5’−CGCGGATCCGCACCATGGGTCACGCAGCAAAGTGGAAAAC−3’(配列番号11)
3’プライマー:5’−CCTAGTAGAGAAGAGCTAAAGAGGC−3’(配列番号12)
(ネコCD28cDNAに関するプライマーの完全リストについては上記を参照)
ネコCD28cDNAのRT/PCRに利用されたDNAプライマーは:
5’プライマー:5’−CGCGGATCCACCGGTAGCACAATGATCCTCAGG−3’(配列番号13)
3’プライマー:5’−CGCGGATCCTCTGGATAGGGGTCCATGTCAG−3’(配列番号14)
(ネコCD28cDNAに関するプライマーの完全リストについては上記を参照)
ネコCTLA−4cDNAのRT/PCRに利用されたDNAプライマーは:
1.第1PCR産物(672bp)に関する変性プライマー:
Deg5’P:5’−ATGGCTT(C)GCCTTGGATTT(C)CAGC(A)GG−3’(配列番号15)
Deg3’P:5’−TCAATTG(A)ATG(A)GGAATAAAATAAGGCTG−3’(配列番号16)
2.CTLA−4(455bp)の5’末端:変性された、遺伝子特異的(GSP)及びネステッド遺伝子特異的(NGSP)プライマー:
第1段階PCR:
Deg5’P:5’−TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG−3’;(配列番号17)
3’GSP:5’−GCATAGTAGGGTGGTGGGTACATG−3’(配列番号18)
第1段階のPCR産物によるネステッドPCR:
Deg5’P:5’−TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG−3’;(配列番号19)
3’NGSP:5’−ACATGAGCTCCACCTTGCAG−3’;(配列番号20)
3.CTLA−4の3’末端;アダプタープライマー1(AP1、クローンテックラブ社(Clonetech Lab、Inc.,)CA);ネステッドアダプタープライマー(AP2、クローンテックラブ社)、遺伝子−特異的プライマー(GSP)、及びネステッド遺伝子特異的プライマー(NGSP);
3’RACE PCR:
AP1:5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’;(配列番号21)
5’GSP:5’−GTGAATATGGGTCTTCAGGCAATG−3’;(配列番号22)
3’RACE PCRの産物によるネステッドRACE PCR:
AP2:5’−ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC−3’;(配列番号23)
5’NGSP:5’−GAAATCCGAGTGACTGTGCTGAG−3’;(配列番号24)
4.全CTLA−4ゲノム用プライマー
Fel CTLA−4 5’プライマー:5’−AACCTGAACACTGCTCCCATAAAG−3’;(配列番号25)
Fel CTLA−4 3’プライマー:5’−GCCTCAGCTCTTAGAAATTGGACAG−3’;(配列番号26)
ネコCD86(B7−2)cDNAのRT/PCRに利用されたDNAプライマーは:
1.第1PCR産物(423bp)に関する変性プライマー:
Deg5’P:5’−TAGTATTTTGGCAGGACCAGG−3’(配列番号27)
Deg3’P:5’−CTGTGACATTATCTTGAGATTTC−3’(配列番号28)
2.第2PCR産物(574bp)に関する変性プライマー:
Deg5’P:5’−GA(G)CA(T)GCACT(A)ATGGGACTGAG−3’;(配列番号29)
3’GSP:5’−CTGTGACATTATCTTGAGATTTC−3’(配列番号30)
3.CD86の5’末端:AP1、AP2(クローンテックラブ社)、変性3’−遺伝子特異的(GSP)及び3’−ネステッド遺伝子特異的(NGSP)プライマー:
5’RACE PCR:
AP1:5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’;(配列番号31)
3’GSP:5’−TGGGTAACCTTGTATAGATGAGCAGGTC−3’(配列番号32)
5’RACEのPCR産物によるネステッド5’RACE PCR:
AP2:5’−ACTCACTATAGGGGCTCGAGCGGC−3’;(配列番号33)
3’NGSP:5’−CAGGTTGACTGAAGTTAGCAAGCAC−3’;(配列番号34)
4.B7−2の3’末端:AP1、AP2、5’GSP及び5’NGSP:
3’RACE PCR:
AP1:5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’;(配列番号35)
5 GSP:5’−GGACAAGGGCACATATCACTGTTTC−3’;(配列番号36)
3’RACE PCRの産物によるネステッド3’RACE PCR:
AP2:5’−ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC−3’;(配列番号37)
5’NGSP:5’−CAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACC−3’;(配列番号38)
全CD86遺伝子
Fel B72(1)5’プライマー:5’−CGGGAATGTCACTGAGCTTATAG−3’;(配列番号39)
Fel B72(1176)3’プライマー:5’−GATCTTTTTCAGGTTAGCAGGGG−3’;(配列番号40)
[例1B]
CD80(B7−1)−Syntro/SPAHのクローニング;プラスミド917−19−8/16
ネコ脾臓細胞をネコから抽出し、コンカナバリンAと共に5時間培養した。細胞を沈殿させ、PBSで洗浄し、これを用いて全RNAを分離した(Qiagen RNeasyトータルRNAシステム)。全RNAをDNAseI(Boehringer Mannheim)で処理し、RNA標本よりDNA汚染を除いた。次にQiagenのオリゴテックスビーズ(Santa Clara,CA)及びクイックカラムを用いてこれら標本よりメッセンジャーRNAを抽出した。ランダムヘキサマー、dNTPs、RNAsin、逆転写酵素(プロメガ)及び逆転写酵素緩衝液(プロメガ)存在下、42℃、30分間インキュベートしてmRNAよりコピーDNAを作製した。次に、センスプライマー5/97.5(5’−ATGGGTCACGCAGCAAAGTG−3’);(配列番号41)及びアンチセンスプライマー5/97.51(5’−CTATGTAGACAGGTGAGATC−3’);(配列番号42)、dNTPs、B7−1cDNA(第1鎖)、MgSO4、ベントポリメラーゼ(BRL)及びベントポリメラーゼ緩衝液(BRL)を用いたPCRによりネコB7−1オープンリーディングフレーム(ORF)の2本鎖、完全長cDNAクローンを作製した。PCR条件は次の通りである:94℃、15秒1サイクル、94℃、30秒、48℃2分間、72℃2分間を35サイクル、72℃10分間を1サイクル。PCR反応体は1%低融点アガロースゲルにかけ、B7−1OFRに期待される大きさに一致するDNA断片を郡理し、ゲル精製(キアゲン社(Qiagen)、ゲル精製キット、サンタクララ、カリフォルニア(Santa Clara、CA))、インビトロゲン社製Zero Blunt PCRクローニングきっと(サンジェゴ、カリフォルニア(San Diego、CA)を用い、pCR−BLUNTプラスミドベクターにクローニングした。カナマイシン耐性最近コロニーから抽出されたDNAを、特異的NheI部位(ネコCD80(B7−1)−TAMU内に含まれる)の存在について前スクリーニングした。800−900bpの範囲の大きさで、NheI部位を持つ挿入体をABI社製蛍光自動シークエンスプロトコールと装置を使用し(パーキンエルマーシータス(Perkin−Elmer−Cetus);アプライドバイオシステム社(Applied Biosystems,Inc.))、配列決定した。プラスミドベクター及びB7−1、前もってクローン化されたB7−1遺伝子に由来する遺伝子特異的プライマーを用いて作製されたDNA配列pCR−Bluntプライマーは1/97.36(5’−CAGGAAACAGCTATGAC−3’);(配列番号43)及び1/97.37(5’−AATACGACTCACTATAGG−3’);(配列番号44)である。
5’プライマー:5’−CGCGGATCCGCACCATGGGTCACGCAGCAAAGTGGAAAAC−3’(配列番号11)
3’プライマー:5’−CCTAGTAGAGAAGAGCTAAAGAGGC−3’(配列番号12)
(ネコCD28cDNAに関するプライマーの完全リストについては上記を参照)
ネコCD28cDNAのRT/PCRに利用されたDNAプライマーは:
5’プライマー:5’−CGCGGATCCACCGGTAGCACAATGATCCTCAGG−3’(配列番号13)
3’プライマー:5’−CGCGGATCCTCTGGATAGGGGTCCATGTCAG−3’(配列番号14)
(ネコCD28cDNAに関するプライマーの完全リストについては上記を参照)
ネコCTLA−4cDNAのRT/PCRに利用されたDNAプライマーは:
1.第1PCR産物(672bp)に関する変性プライマー:
Deg5’P:5’−ATGGCTT(C)GCCTTGGATTT(C)CAGC(A)GG−3’(配列番号15)
Deg3’P:5’−TCAATTG(A)ATG(A)GGAATAAAATAAGGCTG−3’(配列番号16)
2.CTLA−4(455bp)の5’末端:変性された、遺伝子特異的(GSP)及びネステッド遺伝子特異的(NGSP)プライマー:
第1段階PCR:
Deg5’P:5’−TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG−3’;(配列番号17)
3’GSP:5’−GCATAGTAGGGTGGTGGGTACATG−3’(配列番号18)
第1段階のPCR産物によるネステッドPCR:
Deg5’P:5’−TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG−3’;(配列番号19)
3’NGSP:5’−ACATGAGCTCCACCTTGCAG−3’;(配列番号20)
3.CTLA−4の3’末端;アダプタープライマー1(AP1、クローンテックラブ社(Clonetech Lab、Inc.,)CA);ネステッドアダプタープライマー(AP2、クローンテックラブ社)、遺伝子−特異的プライマー(GSP)、及びネステッド遺伝子特異的プライマー(NGSP);
3’RACE PCR:
AP1:5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’;(配列番号21)
5’GSP:5’−GTGAATATGGGTCTTCAGGCAATG−3’;(配列番号22)
3’RACE PCRの産物によるネステッドRACE PCR:
AP2:5’−ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC−3’;(配列番号23)
5’NGSP:5’−GAAATCCGAGTGACTGTGCTGAG−3’;(配列番号24)
4.全CTLA−4ゲノム用プライマー
Fel CTLA−4 5’プライマー:5’−AACCTGAACACTGCTCCCATAAAG−3’;(配列番号25)
Fel CTLA−4 3’プライマー:5’−GCCTCAGCTCTTAGAAATTGGACAG−3’;(配列番号26)
ネコCD86(B7−2)cDNAのRT/PCRに利用されたDNAプライマーは:
1.第1PCR産物(423bp)に関する変性プライマー:
Deg5’P:5’−TAGTATTTTGGCAGGACCAGG−3’(配列番号27)
Deg3’P:5’−CTGTGACATTATCTTGAGATTTC−3’(配列番号28)
2.第2PCR産物(574bp)に関する変性プライマー:
Deg5’P:5’−GA(G)CA(T)GCACT(A)ATGGGACTGAG−3’;(配列番号29)
3’GSP:5’−CTGTGACATTATCTTGAGATTTC−3’(配列番号30)
3.CD86の5’末端:AP1、AP2(クローンテックラブ社)、変性3’−遺伝子特異的(GSP)及び3’−ネステッド遺伝子特異的(NGSP)プライマー:
5’RACE PCR:
AP1:5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’;(配列番号31)
3’GSP:5’−TGGGTAACCTTGTATAGATGAGCAGGTC−3’(配列番号32)
5’RACEのPCR産物によるネステッド5’RACE PCR:
AP2:5’−ACTCACTATAGGGGCTCGAGCGGC−3’;(配列番号33)
3’NGSP:5’−CAGGTTGACTGAAGTTAGCAAGCAC−3’;(配列番号34)
4.B7−2の3’末端:AP1、AP2、5’GSP及び5’NGSP:
3’RACE PCR:
AP1:5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’;(配列番号35)
5 GSP:5’−GGACAAGGGCACATATCACTGTTTC−3’;(配列番号36)
3’RACE PCRの産物によるネステッド3’RACE PCR:
AP2:5’−ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC−3’;(配列番号37)
5’NGSP:5’−CAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACC−3’;(配列番号38)
全CD86遺伝子
Fel B72(1)5’プライマー:5’−CGGGAATGTCACTGAGCTTATAG−3’;(配列番号39)
Fel B72(1176)3’プライマー:5’−GATCTTTTTCAGGTTAGCAGGGG−3’;(配列番号40)
[例1B]
CD80(B7−1)−Syntro/SPAHのクローニング;プラスミド917−19−8/16
ネコ脾臓細胞をネコから抽出し、コンカナバリンAと共に5時間培養した。細胞を沈殿させ、PBSで洗浄し、これを用いて全RNAを分離した(Qiagen RNeasyトータルRNAシステム)。全RNAをDNAseI(Boehringer Mannheim)で処理し、RNA標本よりDNA汚染を除いた。次にQiagenのオリゴテックスビーズ(Santa Clara,CA)及びクイックカラムを用いてこれら標本よりメッセンジャーRNAを抽出した。ランダムヘキサマー、dNTPs、RNAsin、逆転写酵素(プロメガ)及び逆転写酵素緩衝液(プロメガ)存在下、42℃、30分間インキュベートしてmRNAよりコピーDNAを作製した。次に、センスプライマー5/97.5(5’−ATGGGTCACGCAGCAAAGTG−3’);(配列番号41)及びアンチセンスプライマー5/97.51(5’−CTATGTAGACAGGTGAGATC−3’);(配列番号42)、dNTPs、B7−1cDNA(第1鎖)、MgSO4、ベントポリメラーゼ(BRL)及びベントポリメラーゼ緩衝液(BRL)を用いたPCRによりネコB7−1オープンリーディングフレーム(ORF)の2本鎖、完全長cDNAクローンを作製した。PCR条件は次の通りである:94℃、15秒1サイクル、94℃、30秒、48℃2分間、72℃2分間を35サイクル、72℃10分間を1サイクル。PCR反応体は1%低融点アガロースゲルにかけ、B7−1OFRに期待される大きさに一致するDNA断片を郡理し、ゲル精製(キアゲン社(Qiagen)、ゲル精製キット、サンタクララ、カリフォルニア(Santa Clara、CA))、インビトロゲン社製Zero Blunt PCRクローニングきっと(サンジェゴ、カリフォルニア(San Diego、CA)を用い、pCR−BLUNTプラスミドベクターにクローニングした。カナマイシン耐性最近コロニーから抽出されたDNAを、特異的NheI部位(ネコCD80(B7−1)−TAMU内に含まれる)の存在について前スクリーニングした。800−900bpの範囲の大きさで、NheI部位を持つ挿入体をABI社製蛍光自動シークエンスプロトコールと装置を使用し(パーキンエルマーシータス(Perkin−Elmer−Cetus);アプライドバイオシステム社(Applied Biosystems,Inc.))、配列決定した。プラスミドベクター及びB7−1、前もってクローン化されたB7−1遺伝子に由来する遺伝子特異的プライマーを用いて作製されたDNA配列pCR−Bluntプライマーは1/97.36(5’−CAGGAAACAGCTATGAC−3’);(配列番号43)及び1/97.37(5’−AATACGACTCACTATAGG−3’);(配列番号44)である。
B7−1遺伝子特異的プライマーは;12/96.22(5’−AACACCATTTCATCATCCTTT−3’);(配列番号45)、1/97.33(5’−ATACAAGTGTATTTGCCATTGTC−3’);(配列番号46)、12/96.20(5’−AGCTCTGACCAATAACATCA−3’);(配列番号47)、12/96.21(5’−ATTAGAAATCCAGTTCACTGCT−3’);(配列番号48)、1/97.32(5’−TCATGTCTGGCAAAGTACAAG−3’);(配列番号49)、11/96.32(5’ATTCACTGACGTCACCGA−3’);(配列番号50)、11/96.31(5’−AAGGCTGTGGCTCTGA−3’);(配列番号51)である。2つのクローンが、2ヶ所のDNA点突然変異を除き元のCD80配列に相当する完全長のCD80配列を含んでいた。この点突然変異の1つはアミノ酸配列に影響しなかった。2番目の点突然へにはアミノ酸をロイシンからイソロイシンに変えた。得られたネコCD80クローンは917−19.8/16.(CD80−Syntro/SPAH)と命名された。
EcoRI及びBamHIクローニングサイトを含むpoxプロモーターの後へのネコCD80(B7−1)遺伝子のクローニングを促進するために、2種類のプライマーを設計してCD−80OFRの5’及び3’末端上にそれぞれEcoRI及びBamHI制限酵素クローニングサイトを導入した。これら2種類のプライマーは;センスプライマー1/97.43(5’−TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG−3’);(配列番号52)及びアンチセンスプライマー1/97.6(5’−GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT−3’);(配列番号53)である。得られたPCR断片をEcoRI及びBamHIにて消化し、SPV組換え体ウイルス生成に適したO1LSPVホモロジーベクター(ブタ痘ウイルスのHIndIII Mゲノム断片中のAccI挿入部位)内にクローン化した。これにより初期/後期合成poxプロモーター、LP2EP2の後にネコCD80のORFを含むSPVO1Lホモロジーベクターであり、かつ合成後期Poxプロモーター、LP2により促進される大腸菌LacZマーカー遺伝子カセットに接続されたカセット、930−23.A1が得られた。プラスミドベクター930−23.A1をSPV001とコトランスフェクションし、ネコB7−1及び大腸菌β−ガラクトシダーゼタンパク質を発現する組換え体SPVウイルスを作製した。
[例1C]:poxウイルスホモロジーベクター内へのCD−28のサブクローニング
ネコCD−28のコーディング域を通常のクローニングサイトを含む合成プライマーを利用しPCR増幅し、pox特異的ホモロジーベクターの構築に適した何れかのpoxプロモーターの後へのCD−28のクローニングを促進した。合成プライマーを作製し、EcoRI及びBg1IIクローニングサイトをPCR断片のそれぞれ5’及び3’末端に導入した。2種類のプライマーは;センスプライマー7/97.1(5’−GATGAATTCCATGATCCTCAGGCTGGGCTTCT−3’);(配列番号54)及びアンチセンスプライマー7/97.2(5’−GATCAGATCTCAGGAACGGTATGCCGCAA−3’);(配列番号55)である。得られたPCR DNA断片をEcoRI及びBg1IIで消化し、SPV組換え体ウイルス生成に適したO1LSPVホモロジーベクター内にクローン化した。これにより初期/後期合成poxプロモーター、LP2EP2の後にネコCD−28のORFを含むSPVO1Lホモロジーベクター(ブタ痘ウイルスHIndIII Mゲノム断片内のAccI挿入部位)であり、かつ合成後期Poxプロモーター、LP2により促進される大腸菌LacZマーカー遺伝子カセットに接続されたカセット、930−26.A1が得られた。ホモロジーベクター930−26.A1をSPV001とコトランスフェクションし、ネコCD−28及びβ−ガラクトシダーゼタンパク質を発現する組換え体SPVウイルスを作製した。
ネコCD−28のコーディング域を通常のクローニングサイトを含む合成プライマーを利用しPCR増幅し、pox特異的ホモロジーベクターの構築に適した何れかのpoxプロモーターの後へのCD−28のクローニングを促進した。合成プライマーを作製し、EcoRI及びBg1IIクローニングサイトをPCR断片のそれぞれ5’及び3’末端に導入した。2種類のプライマーは;センスプライマー7/97.1(5’−GATGAATTCCATGATCCTCAGGCTGGGCTTCT−3’);(配列番号54)及びアンチセンスプライマー7/97.2(5’−GATCAGATCTCAGGAACGGTATGCCGCAA−3’);(配列番号55)である。得られたPCR DNA断片をEcoRI及びBg1IIで消化し、SPV組換え体ウイルス生成に適したO1LSPVホモロジーベクター内にクローン化した。これにより初期/後期合成poxプロモーター、LP2EP2の後にネコCD−28のORFを含むSPVO1Lホモロジーベクター(ブタ痘ウイルスHIndIII Mゲノム断片内のAccI挿入部位)であり、かつ合成後期Poxプロモーター、LP2により促進される大腸菌LacZマーカー遺伝子カセットに接続されたカセット、930−26.A1が得られた。ホモロジーベクター930−26.A1をSPV001とコトランスフェクションし、ネコCD−28及びβ−ガラクトシダーゼタンパク質を発現する組換え体SPVウイルスを作製した。
[例2]
ネコCD80(B7−1)TAMU、CD86(B7−2)、CD28、CTLA−4及びCD80(B7−1)−Syntro/SPAH cDNAs及びポリペプチドの特性解析:
単離、精製された約941ヌクレオチドのネコCD80(B7−1)cDNAは、分子量約33,485kDaの未変性膜結合又は成熟型で、等電点が約9.1pH7.0での総電荷が10.24である、約292アミノ酸のネコCD80ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする。タンパク質の膜貫通ドメインは約241ないし271アミノ酸。
ネコCD80(B7−1)TAMU、CD86(B7−2)、CD28、CTLA−4及びCD80(B7−1)−Syntro/SPAH cDNAs及びポリペプチドの特性解析:
単離、精製された約941ヌクレオチドのネコCD80(B7−1)cDNAは、分子量約33,485kDaの未変性膜結合又は成熟型で、等電点が約9.1pH7.0での総電荷が10.24である、約292アミノ酸のネコCD80ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする。タンパク質の膜貫通ドメインは約241ないし271アミノ酸。
ネコCD80−TAMU及びネコCD80−Syntro/SPAHは2種類の材料より独立に分離されたcDNAsとポリペプチドであり、DNA及びアミノ酸の配列は僅かに異なっている。CD80−TAMU mRNAの資源はConAにより刺激されたネコ末梢血単核細胞であり、CD80−Syntro/SPAH mRNAの資源はConA刺激を受けたネコ脾臓細胞であった。ネコCD80−TAMU及びネコCD80−Syntro/SPAH間のcDNA配列の差は、ヌクレオチド351に於けるTからC及び670に於けるCからAである。アミノ酸配列に於いては、ヌクレオチド351の変化はサイレントであり、ヌクレオチド670の変化は天然アミノ酸の保存的変化、アミノ酸残基224でロイシンがイソロイシンを生ずる。
単離、精製された、約1176ヌクレオチドのネコCD86(B7−2)cDNAは、分子量約36,394kDa、等電点約9.19、pH7,0での総電荷11.27の、未変性の膜結合型又は成熟型である、約320アミノ酸のネコCD86ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードしている。
単離、精製された、約689ヌクレオチドのネコCD28のcDNAは、分子量約25,319kDa、等電点約9.17、pH7,0での総電荷9.58の、未変性の膜結合型又は成熟型である、約221アミノ酸のネコCD28ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードしている。
単離、精製された、約749ヌクレオチドのネコCTLA−4のcDNAは、分子量約24,381kDa、等電点約6.34、pH7,0での総電荷−0.99の、未変性の膜結合型又は成熟型である、約223アミノ酸のネコCTLA−4ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードしている。
CD80と、補助刺激分子であるCD28又はCTLA−4、及び腫瘍抗原又は病原性生物の抗原との共発現は、T−リンパ細胞、より具体的にはTh−1リンパ細胞を活性化し、又活性化を増強し、その他のタイプの細胞の増殖を促進する能力を有する。補助刺激分子CTLA−4とのCD80の共発現は、T−リンパ細胞、より具体的にはTh−1リンパ細胞の活性化を抑制する能力を有する。補助刺激分子CD28又はCTLA−4及び腫瘍抗原又は病原性生物由来の抗原とのCD86の共発現は、T−リンパ細胞、より具体的にはTh−1リンパ細胞の活性化を増強し、また他のタイプの細胞の増殖を促進する能力を有する。補助刺激分子CTLA−4とのCD86との共発現は、T−リンパ細胞、より具体的にはTh−1リンパ細胞の活性化を抑制する能力を有する。
[例3]
ネコCD80(B7−1)、CD86(B7−2)、CD28及びCTLA−4のワクチンへの利用。
ネコCD80(B7−1)、CD86(B7−2)、CD28及びCTLA−4のワクチンへの利用。
以下の実験を行い、ネコCD80、CD86、CD28及びCTLA−4のネコワクチンに於ける免疫増強能力を評価した。
別の方法では、8週齢のネコにネコCD80、CD86、CD28及びCTLA−4分子に関するプラスミド100μgを、FIV env及びgag、又はFeLV env及びgagのcDNAを含むプラスミドと共に筋肉内注射し、あるいはCD80とCD28、又はCD80とCTLA−4、又はCD86とCD28、又はCD86とCTLA−4 の対の組み合わせを発現するcDNAを含むプラスミド100μgをCD28又はCTLA−4とペアにして、FIV envとgag、又はFeLV envとgagのcDNAを含むプラスミドと共に筋肉内注射したコントロールのネコはCD80、CD86、CD28およびCTLA−4を受け入れない。ネコに有毒性のFeLV又はFIVを接種し、上記の様な病気の徴候について観察された。接種実験の結果、ネコCD80、CD86、CD28及びCTLA−4を含むcDNAベクター、及びFIV遺伝子又はFeLV遺伝子を含むcDNAベクターを受け取ったネコはこれら病気から100%予防されたが、FIV遺伝子又はFeLV遺伝子を含むcDNAのみを受け取ったネコはこれらの病気に対し75%の予防率を示した。
別の方法では、8週齢のネコに、ネコCD80、CD86、CD28及びCTLA−4分子の精製タンパク質0.1ないし100mgを、あるいは上記組換体cDNAベクターのCD80又はCD86とCD28又はCTLA−4タンパク質とをペアにした対の組み合わせを筋肉内注射し、そしてFIV env及びgag、又はFeLV envとgag0.1ないし100mgと共に筋肉内注射した。コントロールのネコはCD80、CD86、CD28およびCTLA−4を受け入れなかった。ネコに有毒性のFeLV又はFIV株を接種し、病気の発生を定期的に観察した。接種実験の結果、ネコCD80、CD86、CD28及びCTLA−4に関する精製タンパク質及びFIV又はFeLVを含むサブユニットワクチンを受け取ったネコは、FIV又はFeLVタンパク質を含むサブユニットワクチンのみを受け取ったネコに比べて有意に低い病気発生率を示した。
[例4]
腫瘍細胞増殖の阻害と破壊へのネコCD80、CD86、CD28及びCTLA−4の利用。
腫瘍細胞増殖の阻害と破壊へのネコCD80、CD86、CD28及びCTLA−4の利用。
ネコからの腫瘍細胞にCD80又はCD86をCD28又はCTLA−4と組み合わせ発現しているベクターをトランスフェクトした。トランスフェクトされた腫瘍細胞はネコに再投与され、腫瘍細胞の表面上のCD80、CD86、CD28及びCTLA−4の存在はトランスフェクトされた、及びトランスフェクトされていない腫瘍細胞に対し広域の免疫反応を惹起し、局所及び転移性の腫瘍細胞を殺す。別の方法では、ネコCD80又はCD86をCD28又はCTLA−4と組み合わせて発現しているベクターをネコの腫瘍内に直接注射し、局所及び転移性の腫瘍細胞を殺滅する。
[例5]
[ネコCD80cDNAのクローニングと配列決定]
[序]
サイトカインに加え、幾つかの細胞表面分子は特定の免疫反応を増強又は抑制することが示されている。CD80(B7−1)はT細胞上のそのレセプターであるCD28に結合するアクセサリー分子である(Freemanら、1989)。この相互作用は二次刺激に於いて、MHCの関係にて提示された抗原のT細胞レセプターによる認識より供給される一次刺激と組み合わさって機能しT細胞の活性化と増殖をもたらす(AllisonとLanier、1994)。これはまずB−細胞抗原として報告されたが、その後CD80は各種細胞上に発現している事、多くが抗原提示する毛細血管を伴うことが示された(Freemanら、1989)。
[ネコCD80cDNAのクローニングと配列決定]
[序]
サイトカインに加え、幾つかの細胞表面分子は特定の免疫反応を増強又は抑制することが示されている。CD80(B7−1)はT細胞上のそのレセプターであるCD28に結合するアクセサリー分子である(Freemanら、1989)。この相互作用は二次刺激に於いて、MHCの関係にて提示された抗原のT細胞レセプターによる認識より供給される一次刺激と組み合わさって機能しT細胞の活性化と増殖をもたらす(AllisonとLanier、1994)。これはまずB−細胞抗原として報告されたが、その後CD80は各種細胞上に発現している事、多くが抗原提示する毛細血管を伴うことが示された(Freemanら、1989)。
霊長類及び齧歯類では、CD80分子は約290アミノ酸より成る60kDaのポリペプチドである(Freemanら、1987;Freemanら、1989)。推定アミノ酸配列の確認より、それを免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)のメンバーの特徴を有することを示唆した(Peachら、1995)。それは2種類の細胞外IgSFドメイン、疎水性膜貫通ドメイン及び短い細胞質テールを含む(Freemanら、1989)。成熟ペプチドの細胞外ドメインは、100アミノ酸のIgSF定常(C)様ドメインが続く124残基のNH3末端IgSF可変(V)様ドメインを持つ(Freemanら、1989)。ヒトの対応部分は8個の潜在的N−結合グリコシル部位を有し、これら炭水化物残基は結合ドメインと反対側に向いていると考えられていることからCD28又はCTLA−4への結合には関与しないと考えられている(Bajorathら、1994)。更に、炭水化物残基の除去は結合能に影響しないと考えられ、むしろそれらの機能は分子の細胞外部分の可溶性を増すことにあると提言されている(Linsleyら、1994a)。
CD80は、T細胞が活性化される間の異なる時点に於いて、2種類の異なるレセプターに結合する。CD28は各種リンパ細胞及びナイーブ及び活性化T細胞上に認められており、またT細胞の活性化及び増殖に於いて顕著な役割を果たしている(Aruffo、1987)。第2のCD80レセプターであるCTLA−4は、通常は遅れて完全に活性化されたT細胞上に認められる(Linsleyら、1991b)。CTLA−4の役割は明瞭にされていないが、この分子が作用し、活発な既存T細胞の反応を抑制するだろうと仮定されている(Hutchcroft及びBierer、1996)。
CD80分子自体はシグナル能を有していないと考えられている。細胞質領域は比較的短く、シグナルまたは酵素機能を示す残基を有していない(Hathcockら、1994)。成熟及びヒトペプチドの間に細胞質テールが保存されていないことは、CD80がシグナル機能を欠き、そしてCD28又はCTLA−4との相互結合にのみ作用する可能性にも反映される(Linsleyら、1994a)。
CD80及びCD28間の相互作用がナイーブT細胞の活性化状態への成熟、即ち一次T細胞反応の開始に必要であることが示されている(Damleら、1988)。CD80はまず活性化されたB細胞上に認められたが(Freedmanら、1987)、続いてマクロファージ/単核細胞を含む大部分の専任(professional)抗原提示細胞Freedmanら、1987)、ランゲルハンス細胞(Symingtonら、1993)、樹状細胞(Liuら、1992)、活性化T細胞(Razi−Wolfら、1992)及び各種腫瘍株(Chenら、1992)に見いだされている。APC上でのCD80分子の存在はCD4+及びCD8+T細胞の活性化に重要であることが示されている(AllisonとLanier、1994;Belloneら、1994)。分子は通常専任APC上にのみ有意なレベルで存在しているが、幾つかの腫瘍細胞株はシグナル分子をアップレギュレートすることが示されている(Chenら、1992)。
形質転換に対する反応では、幾つかの腫瘍株はCD80発現をアップレギュレートすると考えられている。これら非抗原提示細胞由来の腫瘍、並びに幾つかの不死化細胞株では、CD80は、T細胞の完全な活性化を促進するのに十分なレベルで表面に発現される(Chenら、1992)。発現の動態は不明確であるが、腫瘍由来CD80は「腫瘍形成性傷害」に対する反応であり、それを通じて免疫系が形質転換又は腫瘍形成性細胞を除去できる進化的な機序であり得る(Antoniaら、1995)。
CD28−B7相互作用の役割は一次T細胞活性化にとって重要と考えられた。TCRによるMHCが関連した抗原の認識は、それ自体ではT細胞の最適な増殖と活性化の開始には不十分である(Schwartz、1992)。アクセサリーシグナルが無い状態での刺激はT細胞集団に於ける抗原反応不顕性又は低反応性状態を導くことができる(Jenkinsら、1987)。T細胞上のCD28分子と抗原提示細胞上のCD80分子との結合は、T細胞の活性化に必要な第2のシグナルを提供するだろう(Schwartz、1992)。TCRが結合すると、この第2のシグナルがない状態でナイーブ細胞は活性化されず、抗原反応不顕性になる(Lanierら、1995)。このCD28−CD80相互作用に関する重要な役割は、ナイーブCD4+細胞の活性化だけでなく、CD4+Th1及びTh2クローン、及び小休止末梢血リンパ細胞に由来するナイーブ及びメモリーCD8+T細胞についても明瞭に示されている(Linsleyら、1993a)。
CTLA−4/CD28ファミリーの場合と同様に、CD80に関連した別の相手方レセプターが少なくとも1つ存在する。一次免疫反応に於けるCD80の重要性を示すことを試みた初期の研究は、CTLA−4Igが免疫系を阻害したものの、CD80に対するモノクローナ(mAb)ル抗体を加えた場合には同様の結果が得られないことから問題を抱えてしまった(Lenschowら、1993)。CD80ノックアウトマウスの開発は、偶然第2CTLA−4/CD28レセプターの発見をもたらした(Freemanら、1993)。これらマウスはそれまでに開発された不適切なT細胞反応を示すCD28ノックアウトマウスと類似の表現形を共有する様に感じられた(Freemanら、1993)しかし、CD80ノックアウトマウスでは、反応は通常に起こっており、APCはT細胞の成熟化に必要な第2シグマ留を発していることが分かった(Freemanら、1993)。これら結果より、第二のレセプターが仮定され、実際に分離された。続いて関連するCD86(B7−2又はB7−0)レセプターが発見されたことから、CD80ノックアウトに見られた矛盾は解決し、構造及び結合の類似性に関連して分子が共通の機能と起源を共有している可能性が反映されたものと考えられた(Hatchockら、1994)。
CD86(B7−2)は、CD80とある程度類似性を示し、構造的に類似の細胞外IgSF V領域及びC領域を共有している(Freemanら、1993)。しかしながら、保存された残基が両細胞外ドメインの反対面に散在しているものの、前記分子間の全体的な相同性は25%未満である(Bajorathら、1994)。結合領域はいずれの分子についても特定されていないが、配列の相同性により、推定相互作用部位として提案された予想領域が与えられている(Linsleyら、1994a)。保存性は欠くものの、CD80及びCD86は両レセプターに対して類似の結合活性を保持しているが、CD86はCTLA−4からより早く解離する(Linsleyら、1995a)。
CD86はCD80と類似の発現パターンを示し、活性化されたB細胞、T細胞、マクロファージ、及び単核細胞上に発現する(Azumaら、1993a)。しかし発現の動態は2つの分子で若干異なっている(Hathcockら、1994)。CD86は一般にCD80に比べて早く活性免疫反応に出現し、単核細胞上に持続的に発現されると思われる(Freemanら、1991)。CD80は初期刺激から24時間までに出現するが、CD86は反応初期に出現するか骨髄性細胞上に低レベルで持続的に出現していると思われる(Hathcockら、1994)。前記2種類の表面タンパク質はCD4+又はCD8+T細胞のいずれかの上にあるそれぞれに対応するレセプターと結合し、類似の細胞内反応を惹起する(Lanierら、1995)。T細胞の活性化及び増殖を開始させ、又はCTL活性を誘導する能力について、両分子の間に差は認められない(Hathcockら、1994)。即ち、データは両分子がCD28又はCTLA−4ぞれぞれの結合に対して類似のシグナルカスケードを開始することを示唆している(Hathcockら、1994)。両分子は対応するレセプターに対して同一の反応速度で結合し、その効果に差はないと考えられることから、この「2リガンド/2レセプター」システムの進化上の意義については不明である(Lanierら、1995)。
CD80は本来B−細胞のマーカーとして報告されており、リポポリサッカライド(LPS)、抗−Ig、抗−CD40、コンカナバリンA(ConA)、cAMP、IL−2及びIL−4により刺激を受けたB細胞上ではCD80及びCD86は共に高いレベルで見いだされている(Hathcockら、1994)。IFNγ及びIL−5に関しヒトシステム又はCD80についてのデータはないものの、これら免疫システム制御因子はマウスB−細胞に於いてはCD86をアップレギュレートすることが示されている(Azumaら、1993a)。発現の反応速度は、B細胞では各分子により若干違いがある。CD86は刺激後すぐに(6時間)発現されるが、CD80はほとんど24時間になるまで存在せず、又48時間後になるまで発現はピークに達しない(Lenachowら、1993)。B−細胞上のCD80のアップレギュレーションもMHCクラスII介在シグナリングにより制御されていると考えられている(Nabaviら、1992)。2種類の他の表面レセプターもCD80の表面発現において重要と考えられている。Igまたは対応レセプターを発現するT細胞によってB細胞上に発現されたCD40が交叉結合されると、CD80発現が増す(Azumaら、1993b)が、Fcレセプターとの交叉結合は両分子の発現をダウンレギュレーションする(Barcyら、1995)。
CD40及びそのリガンドであるCD40Lは、APC上に於けるCD80発現制御の経路として提案されている(Pageら、1994)。CD40はB細胞、単核細胞、樹状細胞、繊維芽細胞及びヒト内皮細胞を含む様々なタイプの細胞上に発現され、IFNγ存在下にこれらの細胞上でアップレギュレートされている(de Boerら、1993)。CD40リガンド(CD40L)は活性化されたCD4+T細胞上に発現される。CD40LのCD40への結合は、APCに於けるCD80の発現をアップレギュレーションすることが示されているが、内皮細胞を含むレセプターを発現している他のタイプの細胞での発現は誘導しないと考えられている(Pageら、1994)。
CD80及びCD86分子は、そのアミノ酸同一性は25%以下であるにもかかわらず構造類似性を有しており、遠く関連していると考えられている(Freemanら、1993)。相同残基はIg−様ドメイン内に集中しており、膜貫通又は細胞質ドメイン内の保存残基はごく少数である(Juneら、1995)。CD80及びCD86に加えブチロフィリン(BT)、ミエリン/オリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)、ニワトリMHC類似体、B−Gを含む、B7遺伝子を含むファミリーが提言されている(Linsleyら、1994b)。BT、MOG及びB−Gは全てMHC遺伝子複合体によりコードされており、これらはMHCと必須共刺激性分子間の潜在的な進化的結びつきを示している(Linsleyら、1994b)。
休止状態のマウス及びヒトT細胞は低レベルのCD86を発現しているが、抗−CD3で活性化されたヒト及びマウスT細胞(及びT細胞クローン)はCD80とCD86を高いレベルで発現する(Mathcockら、1994)。活性化T細胞上でのCD80及びCD28の発現は、自己分泌による共刺激を介したT細胞の拡大能力を反映するだろう(Azumaら、1993b)。興味深いことに、CD80はHIV感染CD4+T細胞上ではアップレギュレートされているが、それに伴ってCD28はダウンレギュレートされることが示されている。これは、未感染CD4+T細胞がCD28/CD80を介し感染リンパ細胞と接触した時の、ウイルス感染の想定メカニズムとして提案されている(Haffarら、1993)。
ヒト末梢血単核細胞は低レベルのCD80と高レベルのCD86を発現しているが、GM−CSF又はIFNγに曝されるとCD80及びCD86の表面発現は共にアップレギュレーションされる(Barcyら、1995)。LPSはヒト末梢血単核細胞に於けるCD80発現の強力な誘導因子である(Schmittelら、1994)。ヒトシステムでの腹腔マクロファージに関するデータは無いが、休止状態にあるマウスマクロファージは低レベルのCD80及びCD86を発現している(Freemanら、1991;Hathcockら、1994)。LPS及びIFNγによるマウスのマクロファージ刺激は表面発現を増加させるが、インターロイキン10と組み合わせたIFNγは両レセプターをダウンレギュレーションする(Dingら、1993)。
脾臓樹状細胞は両分子を低レベルに発現しており、ランゲルハンス細胞はCD86を低レベル発現しているが、いずれの細胞も培養により発現が増す傾向にある(Larsenら、1994)。樹状細胞の場合、培養によりCD86はより強力にアップレギュレートされ、より早く出現し、樹状細胞を介したシグナル伝達においてより重要な役割を果たすだろう(Hathcockら、1994)。興味深いことに、IL−10は樹状細胞に於けるCD80発現に影響を及ぼさないものの、それはCD86発現をダウンレギュレートする様に作用する(Buelensら、1995)。O’Dohertyら、(1993)は、CD80の初期値は低いものの、成熟すると樹状細胞はより高レベルのCD80を提示することを報告している。CD80のランゲルハンス細胞の発現はIL−10及びIFNγの両方により阻害されるが、GM−CSFへの暴露はIL−10による阻害には作用しないもののIFNγによる阻害は逆行させる(Ozawaら、1996)。
ヒト及びマウスでは、特異的サイトカインがCD80及びCD86の発現を制御することが示されている。IL−4はCD86の強力な誘導因子であり、B細胞上のCD80に対する作用は弱いが(Stackら、1994)、IFNγはB細胞単核細胞及びマクロファージを含む様々な細胞上でのCD86の発現を増加する(Hathcockら、1994)。IFNγは単核細胞でのCD80発現をアップレギュレーションすると考えられているが、マクロファージでは発現をダウンレギュレーションする様に作用するだろう。IL−10は、IFNγが存在する場合でも、単核細胞上でのCD80及びCD86の発現のダウンレギュレーションに作用する(Dingら、1993)。この相互作用はTh1反応(DTH)からTh2反応(体液)へのスイッチの潜在メカニズムであろう。しかしIL−10は樹状細胞上でのCD80発現に影響しない(Buelensら、1995)。樹状細胞は2型反応の開始に於いて重要と考えられることから、この事は更にこれら分子のヘルパーTサブセット制御に於いて果たす役割を反映しているだろう。IL−7は他の細胞に対する作用は未確定であるもののT細胞上ではCD80の発現を増加する(Ysselら、1993)が、一方、B細胞のCD80の発現はp75TNFレセプターの交叉結合を介して伝達されることが示されており、発現はIL−4存在時に増加できる(RanheimとKipps、1995)。興味深いことにTNFは別の強力なCD80発現開始体であるCD40と同一の分子ファミリーに属する。GM−SFは樹状細胞及びランゲルハンス細胞の表面CD80の発現をアップレギュレーションすると考えられているが、一方IFNγはこれら細胞に於いてCD86のアップレギュレーションのみを起こす(Larsenら、1994)。
CD8+細胞傷害性T−リンパ細胞(CTL)による形質転換及びウイルス感染標的細胞の認識、結合及び溶解は、長い間MHCクラスIの関連において発現される外来ペプチドのTCR認識を通じてのみ伝達されると考えられていた(Berke、1993)。最近、CTL及び標的細胞の両方により発現された各種表面分子が完全な相互作用の生起に必要とされることが解明された(Mescher、1992)。この相互作用に於ける重要な因子はCD80及びその対応レセプターであるCD28である。B7−CD28相互作用により供給されるアクセサリーシグナルは、CD8+小休止リンパ細胞が傷害性状態に分化するのに必要である(Mescher、1992)。興味深いことに、一度CTLが分化すれば、傷害特性の発現にこの2次シグナルはもはや必要なくなる(Hodgeら、1994)。
CTLはウイルス性免疫の重要なメディエイターとして長く知られてきた。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染者に於いては、長期間の無進行にはGag、Pol及びEnvに特異的な高いレベルのCD8+メモリーCTL、及び末梢血単核細胞中の極めて低レベルのHIV DNA及びRNAが伴う(Rinaldo、1995)。逆に、感染後期にある患者ではメモリーCTL(mCTL)は大きく低下している(Zanussiら、1996)。これら所見の相関性は、mCTLが感染の宿主制御の主要因子であり、ナイーブな未感染個体に於ける防御免疫の確率に於いて重要な役割を果たしているという考えを支持している(Zanussiら、1996)。更に、HIV感染との病理学的相関性は、病気の進行に於けるCD80及びCD28の潜在的役割を反映している。
CD80はHIV感染の病原性の発生においても役割を果たしていると提言されている(Haffarら、1993)。T細胞は通常CD80を発現しているが、そのレベルは極めて低く、また活性化後にのみ発現する(Schwartz、1992)。同種刺激された一次T細胞株に於けるHIVのイン・ビトロ研究では、CD28はダウンレギュレーションされると考えられ、CD80発現はMHC CIIにより増強されると考えられている(Haffarら、1993)。これら事象の原因は不明であるが、潜在的な傷害的役割が仮定されている。クラスIIと結びついた表面上でのCD80の存在は、感染T細胞と未感染CD4+細胞間の接触を増大させる(Haffarら、1993)。この相互作用はT細胞間の伝達速度を高めるよう作用するが、別の役割は感染細胞上のCD80とCD8+T細胞により発現されたCD28間の相互作用による2次シグナル供給を介し、CTLに仲介された認識と殺滅を増加することであろう(Haffarら、1993)。これによりAIDS関連疾患の発症に関連して、CD4+細胞集団の減少は加速されるだろう(Haffarら、1993)。
マウス及びヒトシステムの両方に於いて、B7ファミリータンパク質の発現は、形質転換細胞の免疫認識に於いて重要な因子と考えられている(Chenら、1992)。発現は幾つかの形質転換細胞に認められるものの、多くの腫瘍は通常CD80又はCD86を発現しておらず、従って潜在的に免疫原性な腫瘍抗原が発現された場合にT細胞による完全な認識が起こるとは考えにくい(Chenら、1993)。しかし、CD80分子を用い殺腫瘍細胞融解するトランスフェクション実験は成功することが証明されている(Hodgeら、1994)。
機能的CD80分子を発現しているレトロウイルス及びワクシニアベースのベクターは、悪性細胞のトランスフェクトに利用されている(Liら、1994;Hodgeら、1994)。通常腫瘍抗原の認識が不要であることに加えCD80を発現しているこれら細胞が宿主内に再導入されると、悪性細胞上に発現した腫瘍抗原に対し細胞性免疫が生ずると考えられている(TownsendとAllison、1993)。驚くべき事に、複数の型の腫瘍を用いたこれら実験の結果は有効であった。多くの場合、宿主は悪性体に対し強力な細胞反応を加えることができ、これをコントロールまたは排除できた(Hodgeら、1994)。
続いて、CD80有り、及び無しに腫瘍細胞を宿主内に再導入すると、同様のレベルの抗腫瘍免疫が生じた(Hodgeら、1994)。即ち、一度記憶が成立すると、反応の維持又は再導入が起こった場合にそれを開始するのにCD80分子は必要とされないと考えられる(Hodgeら、1994)。これらの実験は、CD80分子は細胞免疫の効果的メディエイターであり、特異的反応を誘導され、悪性病変を制御し再定着を予防することが可能であることを示している(Hodgeら、1994)。
増加したCD80の発現は、自己免疫の幾つかの形の発生に見られる様に障害作用を持つことができる。多発性硬化症(MS)の初期発生では、IL−12と相乗作用するCD80が重要でありT細胞刺激とDTHの発生を起こすと考えられている(Windhagenら、1995)。実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)は、実験体に対し可溶性CTLA−4Igを投与することで部分的に阻害できる。CD28/CD80相互作用の遮断による脱ミエリン化の阻害は、病気の増悪化に於けるこの相互作用に関する潜在的役割を反映する(Arimaら、1996)。
効果的免疫反応の進行に於けるCD80の重要性は明らかである。タンパク質をコードするcDNAは齧歯類及び霊長類にて分離されているが、これらの属外からは分離されていない。ネコは重要なペット動物であり、レトロウイルス疾患の潜在的モデルである。ネコ科動物からの免疫作用物質のクローニングは、獣医分野に於ける重要な病気の研究に適した、他の種に於ける病気の進行又は予防に利用できる可能性を持つする道具を提供するだろう。
[材料と方法]
[初期断片の単離]
mRNAは、16時間ConAにて刺激した末梢血単核細胞より、RNAzolB RNA抽出試薬(バイオテックス、ヒューストン、テキサス(Biotexc、Houston、TX))を用い抽出された。まずこのRNAより、3’プライマーとしてオリゴdTを使った逆転写(RT)反応によりcDNAを得た。要約すると、RNA及びオリゴdTを75度で3分間加熱し、2次構造を除いた。次にRT、dNTP、緩衝液及び蒸留水を加え、混合液を1時間42℃にてインキュベーションした。このインキュベーション後、サンプルを95℃にて5分間加熱し、RTを失活させた。次に、遺伝子の定常ドメイン内の中心域をコードする344ヌクレオチド(ntd.)断片の初期増幅に関し、ヒト及びマウスCD80の公表配列(ジーンバンク、ガイサーブルグ、マサチューセッツ(GeneBank、Gaithersburg,MA))内のコンセンサス域より得た変性プライマーを使用した:
5’プライマーB7−2 GGC CCG AGT A(CT)A AGA ACC GGA C
3’プライマーB7−3 CAG (AT)TT CAG GAT C(CT)T GGG AAA (CT)TG。
[初期断片の単離]
mRNAは、16時間ConAにて刺激した末梢血単核細胞より、RNAzolB RNA抽出試薬(バイオテックス、ヒューストン、テキサス(Biotexc、Houston、TX))を用い抽出された。まずこのRNAより、3’プライマーとしてオリゴdTを使った逆転写(RT)反応によりcDNAを得た。要約すると、RNA及びオリゴdTを75度で3分間加熱し、2次構造を除いた。次にRT、dNTP、緩衝液及び蒸留水を加え、混合液を1時間42℃にてインキュベーションした。このインキュベーション後、サンプルを95℃にて5分間加熱し、RTを失活させた。次に、遺伝子の定常ドメイン内の中心域をコードする344ヌクレオチド(ntd.)断片の初期増幅に関し、ヒト及びマウスCD80の公表配列(ジーンバンク、ガイサーブルグ、マサチューセッツ(GeneBank、Gaithersburg,MA))内のコンセンサス域より得た変性プライマーを使用した:
5’プライマーB7−2 GGC CCG AGT A(CT)A AGA ACC GGA C
3’プライマーB7−3 CAG (AT)TT CAG GAT C(CT)T GGG AAA (CT)TG。
Taqポリメラーゼを利用するホットスタートポリメラーゼチェインリアクション(PCR)法を使い、産物を増幅した。Taq酵素を欠いた反応混合液をまず95℃に5分間のホットスタートステップで加熱し、プライマーダイマーの形成を阻止した。温度サイクルを開始する前に酵素を加えた。次にPCR反応体を95℃で30秒加熱し、2本鎖DNAを融解した。次に反応液を42℃、30秒間冷却し、変性プライマーのアニーリングを促進した。低アニーリング温度を使い、相同性が100%以外であるプライマーの結合を促進した。次に反応体を、Taqポリメラーゼに取って最適温度である72℃で45秒間加熱し、プライマーを伸長し、反対側のDNA鎖をコピーした。温度サイクルは30回繰り返された。30サイクル後、72℃、7分間の最終伸長ステップを利用し、未完成産物の伸長を促進した。1%アガロースゲル上にて視認した後、配列決定用に産物を一晩、16℃にてTAクローニングベクター(インビトロジェン、サンジェゴ、カリフォルニア)に連結した。連結反応液2μlを使い、コンピテントInvαF’細胞を形質導入した。形質導入された細菌をLBプレート(50μg/mlアンピシリン)上に画線し、50μg/mlのx−gal液、40μlでコートした。翌日、白色のコロニーを選別し、100μg/mlのアンピシリンを含むKB培地5ml中に接種し、225rpmにて振盪しながら37℃で一晩増殖させた。
一晩培養したものをMini−Prepにかけ、正確な挿入体を持つプラスミドを含むクローンを特定した。通常のアルカリ溶解法を使い、培養体からプラスミドを抽出し、さらにDNAをフェノール:クロロフォルム抽出法により精製した(Maniatisら、1982)。DNAは2倍量のエタノールにより沈殿され、続いてEcoRIにて消化された。消化物を1%アガロース上にて視覚化し、適当な挿入体を含むプラスミドを有するコロニーを決定した。次に陽性クローンからプラスミドを精製し、シークエナーゼをベースとした(USB、クリーブランド、オハイオ)S35放射標識ジデオキシターミネーターシークエンシング、又は蛍光色素ターミネーターサイクルシークエンシング(パーキンエルマー、ノルウォーク、コネチカット)を用いて配列決定した。cDNAの配列より、cDNA端の5’迅速増幅(RACE)反応及び、3’非翻訳域(UTR)からの変性プライマーに関連した3’配列誘導に適した特異的3’及び5’プライマーを構築した。
[5’領域の単離]
Marathon cDNA増幅法(クローンテック、パロアルト、カルフォルニア)を使い、遺伝子の5’配列を誘導した。mRNAは12時間ConAにて、続いて4時間LPSにて刺激したPMBCより作製された。mRNAはULTRASPEC RNA抽出試薬(バイオテックス、ヒューストン、テキサス)を使い抽出された。cDNAは、ポリAテールの5’終末端へのプライマーの結合を促進する5’末端の変性ヌクレオチドを持つアンカーオリゴdTプライマーを使い作製された。次にcDNAは上記の如くに転写された。T4DNAリガーゼを使い、特異的リンカーをcDNAに結合する。前に増幅された領域に対し特異的な内部3’プライマー:
B7−284:TTA TAC TAG GGA CAG GGA AG
B7−190:AGG CTT TGG AAA ACC TCC AG
及び、接続されたリンカー配列に対し相補的なアンカープライマーを使い、タッチダウンPCRをcDNAについて行った。KlenTaqポリメラーゼミックス(クローンテック、パロアルト、カリフォルニア)を用いたタッチダウンPCR反応のパラメーターは次の通りである:95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、72℃、30秒及び68℃、45秒を5サイクル;95℃、30秒、65℃、30秒及び68℃、45秒を5サイクル;95℃、30秒、60℃、30秒及び68℃、45秒を25サイクル。この反応液1μlを50μlの水で希釈し、この希釈液5μlを使い、リンカー特異的アンカープライマー及び初期プライマーの5’に位置する遺伝子特異的3’プライマー(図6)を利用したネステッドPCR反応を行った(KlenTaqポリメラーゼミックスを利用し、95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、65℃、30秒及び68℃、45秒を30サイクル)。
Marathon cDNA増幅法(クローンテック、パロアルト、カルフォルニア)を使い、遺伝子の5’配列を誘導した。mRNAは12時間ConAにて、続いて4時間LPSにて刺激したPMBCより作製された。mRNAはULTRASPEC RNA抽出試薬(バイオテックス、ヒューストン、テキサス)を使い抽出された。cDNAは、ポリAテールの5’終末端へのプライマーの結合を促進する5’末端の変性ヌクレオチドを持つアンカーオリゴdTプライマーを使い作製された。次にcDNAは上記の如くに転写された。T4DNAリガーゼを使い、特異的リンカーをcDNAに結合する。前に増幅された領域に対し特異的な内部3’プライマー:
B7−284:TTA TAC TAG GGA CAG GGA AG
B7−190:AGG CTT TGG AAA ACC TCC AG
及び、接続されたリンカー配列に対し相補的なアンカープライマーを使い、タッチダウンPCRをcDNAについて行った。KlenTaqポリメラーゼミックス(クローンテック、パロアルト、カリフォルニア)を用いたタッチダウンPCR反応のパラメーターは次の通りである:95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、72℃、30秒及び68℃、45秒を5サイクル;95℃、30秒、65℃、30秒及び68℃、45秒を5サイクル;95℃、30秒、60℃、30秒及び68℃、45秒を25サイクル。この反応液1μlを50μlの水で希釈し、この希釈液5μlを使い、リンカー特異的アンカープライマー及び初期プライマーの5’に位置する遺伝子特異的3’プライマー(図6)を利用したネステッドPCR反応を行った(KlenTaqポリメラーゼミックスを利用し、95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、65℃、30秒及び68℃、45秒を30サイクル)。
B7−20:TTG TTA TCG GTG ACG TCA GTG
B7−135:CAA TAA CAT CAC CGA AGT CAG G。
B7−135:CAA TAA CAT CAC CGA AGT CAG G。
各反応液20μlを1.5%アガロースゲル上で視覚化し、適当な断片をゲルより切り出した。ゲルスライスをゲルネブライザーとマイクロピュア0.22μmフィルター(アミコン、バーバリー、マサチューセッツ(Amicon、Bererly,MA)を通すことで、cDNAをアガロースより抽出し、精製した。次に精製DNAを、直接色素ターミネーターサイクルシークエンシング(パーキンエルマー、ノルウォーク、コネチカット)を用い配列決定した。
[3’領域の単離]
遺伝子の3’領域は、344ntd.断片及び先に配列決定された5’領域より5種類の遺伝子特異的プライマーを選択することで実施された:
B7−s220 GTC ATG TCT GGC AAA GTA CAA G
B7−50 CAC TGA CGT CAC CGA TAA CCA C
B7−140:CTG ACT TCG GTG ATG TTA TTG G
B7−550:GCC ATC AAC ACA ACA GTT TCC
B7−620:TAT GAC AAA CAA CCA TAG CTT C。
遺伝子の3’領域は、344ntd.断片及び先に配列決定された5’領域より5種類の遺伝子特異的プライマーを選択することで実施された:
B7−s220 GTC ATG TCT GGC AAA GTA CAA G
B7−50 CAC TGA CGT CAC CGA TAA CCA C
B7−140:CTG ACT TCG GTG ATG TTA TTG G
B7−550:GCC ATC AAC ACA ACA GTT TCC
B7−620:TAT GAC AAA CAA CCA TAG CTT C。
次に変性3’プライマーが、ヒト及びマウスCD803’UTRのコンセサンス領域より選択された。
B7−1281 C(A/G)A AGA (A/T)TG CCT CAT GA(G/T) CC
B7−1260 CA(C/T) (A/C)AT CCA ACA TAG GG。
B7−1260 CA(C/T) (A/C)AT CCA ACA TAG GG。
cDNAはULTRASPEC(バイオテックス、ヒューストン、テキサス)を使い、既報の如くにConA及びLPSにて刺激されたPBMCより抽出されたRNAから産出される。アンカーされたオリゴdTをcDNAへのRNA転写用初期3’プライマーとして使用した。このcDNAについて、特異的5’プライマー及び変性3’プライマーを使用したTaqポリメラーゼをベースとしたPCR反応(95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、42℃、30秒及び72℃、40秒を30サイクル;72℃、7分間)を実施した。正確な大きさの単一断片を得る前に、2回目のネステッド反応が必要とされた。この産物を1.5%アガロースゲルより切り取り、前記同様にして精製し、色素ターミネーターサイクルシークエンシングにより配列決定した(パーキンエルマー。ノルウォーク、コネチカット)。
5’及び3’領域の配列データより、ネコCD80遺伝子の全オープンリーディングフレームをコードする領域を増幅するプライマーが構築された:
B7 START:ATG GGT CAC GCA GCA AAG TGG
B7−960:CCT AGT AGA GAA GAG CTA AAG AGG C。
B7 START:ATG GGT CAC GCA GCA AAG TGG
B7−960:CCT AGT AGA GAA GAG CTA AAG AGG C。
先に作製され、そして遺伝子をコードするDNAを含むことが既知であるPBMCのcDNAを使用した。このPCR反応(95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、42℃、30秒及び72℃を30サイクル;72℃7分間)は、Taqポリメラーゼに伴いしばしば起こるランダムエラーを減らすことを目的にいくらかの5’エンドヌクレアーゼ活性を保持した酵素カクテルであるKlenTaqDNAポリメラーゼを利用した。反応は960塩基対(bp)の断片を増幅し、これはTAクローニングベクター内にクローン化され(インビトロジェン、サンジェゴ、カリフォルニア)、前記同様にして配列決定された。遺伝子の最終配列には2種類の動物由来のcDNAが含まれた。遺伝子の各塩基対は、個々のPCR反応に由来する、少なくとも3つの分離配列について独立に検証され、PCRにより誘導された誤りによるエラーの可能性を下げた。
[結果]
実験ネコNK5より抽出されたRNAを、CD80に関する初期増幅に使用したが、その後このネコは屠殺され、追加産物は別の動物で作製された。HNKのConAで刺激されたPBMC RNAを初期増幅した結果、ヒトCD80遺伝子と70%の相同性を有する344bpの産物を得た(図7及び8)。プライマーはIgC様ドメインに対応するコーディング配列の中央内の領域に対し特異的であった。これら初期実験ではより多くのペプチドをコードする領域を増幅するために別の変性プライマーも利用されたが、B7−2(5’)及びB7−3(3’)の組み合わせ以外は適当な大きさの産物を生じなかった。これら遺伝子特異的プライマーによる追加の変性プライマーを使ったその後の実験は成功しなかった。即ち、5’及び3’領域は他の方法を利用して得なければ成らなかった。
実験ネコNK5より抽出されたRNAを、CD80に関する初期増幅に使用したが、その後このネコは屠殺され、追加産物は別の動物で作製された。HNKのConAで刺激されたPBMC RNAを初期増幅した結果、ヒトCD80遺伝子と70%の相同性を有する344bpの産物を得た(図7及び8)。プライマーはIgC様ドメインに対応するコーディング配列の中央内の領域に対し特異的であった。これら初期実験ではより多くのペプチドをコードする領域を増幅するために別の変性プライマーも利用されたが、B7−2(5’)及びB7−3(3’)の組み合わせ以外は適当な大きさの産物を生じなかった。これら遺伝子特異的プライマーによる追加の変性プライマーを使ったその後の実験は成功しなかった。即ち、5’及び3’領域は他の方法を利用して得なければ成らなかった。
初期産物から得られた配列データより、新たに6組の遺伝子特異的プライマー(B7−20 5’、135 5’、140 3’、50 3’、284 5’、及び190 5’)が作られた。まず3’プライマーを、CD28分子の5’領域の増幅に成功した時の方法に若干類似した5’RACE PCR法に使用された。この方法を使用した場合、産物は得られなかった。
Marathon RACE cDNA増幅システム(クロンテック、パロアルト、カリフォルニア)は、5’コーディング領域をコードする領域を上手く増幅した。ConA刺激されたEK6より得たRNAはこの方法により上手く増幅された。初回増幅はB7−284及びB7−3、及びアンカープライマーAP1により行われた。この反応は特定の1本のバンドを生じなかったため、この産物を鋳型に使ったネステッド反応を、B7−20及びB7−135をネステッド3’プライマーに、そしてアンカープライマーAP−1を5’プライマーに使用し実施した。これら反応それぞれより、適当な長さの産物が得られた(図9)。
RACE産物のダイレクトシークエンシングに由来する配列データは、最初に配列決定された344bp産物と重複する完全に同一な20及び135bpの領域を提供した。断片は、既知5’領域よりネコ遺伝子の5’ATG開始コドンを通り5’非翻訳領域内に伸びた。これら産物に由来する5’コーディング配列とヒトCD80遺伝子の5’領域との間の同一性は、ネコ遺伝子の344bp域とヒト配列中の類似領域との間の同一性よりも低かった。同様の相同性の欠如は、同様領域内のヒト及びマウス配列間にも見いだされた。コーディング領域外に由来する配列の比較からは、更に顕著な保存性の低下が示された(データ示さず)。
3’非翻訳領域をコードする変性プライマーの新しいプールを、ヒト及びマウス配列の3’UTR内のコンセンサス域より合成した。これらプライマーは、ネコED3より得たConA刺激PBMCより単離されたRNAよりcDNAを上手く増幅した。初期増幅法とは異なり、最終産物を得るためには一連のネステッド反応を実施しなければならなかった。344bp断片及び5’領域内のこれら変性プライマー及びアンカープライマーを利用した一次PRC反応は初めは明瞭な同定可能なバンドを生じなかった(図10)。しかし、希釈された一次産物及び追加の特異的5’プライマーを用いたネステッド反応の結果、残りの3’領域をコードする産物を産生した(図11)。
3’産物の配列決定により、この場合も定常域の外側では同一性が低いことが判明した。コーディング配列の遠位端は極めて低い同一性を示したが、停止コドンの後は更に低かった。
3’配列からは、ヌクレオチド960より始まるコーディング域外側のリバースプライマーが構築された。この構築体は開始コドンを包含するプライマーとの組み合わせると、予想通りの大きさの産物を増幅した。最終産物の配列決定は、これまでに決定された領域それぞれが実際に重複していること、またこの断片がネコCD80遺伝子の連続した完全な配列を提供することを示した(図12)。
最終産物の増幅のため、動物ED3及びEK6のConA刺激PBMCより得たRNAからサンプルが増幅された。少なくとも各動物からの2産物が完全に配列決定され、少なくとも3回の正確に読みとられた配列により各配列位置のチェックと確認が行われた。次に今後の参照と作業の為に、動物EK6からの産物をTAクローニングベクター内にクローン化した。完全核酸配列は図8に提供されている。
960ヌクレオチド断片は、位置1の開始コドン、ヌクレオチド888の停止コドン、及び3’非翻訳域の追加の72ヌクレオチドを含む(図13)。全断片の包含体を作製、配列決定し、追加の5’及び3’領域が配列決定された(データ示さず)。5’RACE産物からの5’開始コドンの上流域の配列決定は、位置1−3のATGが最初のフレーム内メチオニン部位であること及びマウス及びヒト配列内の類似位置に合致することを示している。位置888に存在する停止コドンも、既に配列決定された遺伝子内の同様位置に合致した。配列のアラインメントは、公表ヒト及びマウスCD80核酸配列とそれぞれ77%及び62%の同一性を示した(図14)。他の霊長類及び齧歯類配列との相同性は、それぞれヒト及びマウスに観察されたレベルと同等であった。各種のCD86遺伝子との同一性は25%以下であった。
MacVectorDNA分析ソフトウエアー(IBI、ロチェスター、ニューヨーク(Rochester、NY))を利用し、核酸配列はアミノ酸に翻訳された。翻訳の結果、長さに関し同一ではないがマウス及びヒト両タンパク質に類似の292アミノ酸のペプチドが得られた(図15)。シグナルペプチドは位置1から25までの範囲と提言された。分子の細胞外領域は、残基139を通り広がる115塩基のIgSF可変様ドメイン、及びおよそ残基240まである100塩基のIgSF定常様ドメインを含む。残基241−271の膜内ドメインに続き21残基の短い細胞質テールがある。ヒト分子同様に、ネコポリペプチドはドメイン中に8個の潜在的N−結合グリコシル化部位を含むが、その位置は同一ではない。ネコ、ヒト及びマウスペプチド間の相同性は、核酸配列に観察された同一性に比べ明らかに低かった(表1)。
ネコCD80について提案されているペプチド配列と提案されている前記ヒトタンパク質とを並置することにより、2つの分子間の相同性の多くが定常領域(残基140−240)に起因することが示された。シグナル配列中のペプチド間の相同性は低く、同一性の欠如はIgV様ドメインに及んだ。既述の如く、保存性は定常ドメインを通じて強いが、この同一性は連続的なものでなく、ネコペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞内細胞質テールと、ヒト分子中の類似領域との間に相同性は殆どなかった(図16)。
ネコ、ヒト及びマウスCD80遺伝子とマウス及びヒトCD86遺伝子とのアラインメントからは、2つのB7ファミリーメンバーの間には限定された全体相同性のみ認められるが、B7遺伝子ファミリーの指標と考えられている残基はネコペプチドにより保持されていた(図17)。これら分子は、折りたたみに関係すると考えられている残基、及び結合領域と言われる領域を含む。
ヒト及びネコCD80配列間の相同性は、2種類のCD28分子間の同一性ほど大きくなく、提案されている親水性プロットの比較は特定アミノ酸配列内に様々な変化があるものの、これらの変化は相同的なことが多く、ペプチドの表面特性を変えない可能性を示している(図18)。
[考察]
ネコとヒト、及びネコとマウスのCD80間のヌクレオチドの同一性は中程度であるが、このヌクレオチド相同性の大きさはペプチドに翻訳されない。遺伝子コードは縮重されるものの、ある分子では(例えばCD28)ヌクレオチド配列間の差はペプチドを大きく変化させず、CD80の全体的なアミノ酸保全性は重要ではなく、従って種を越えた分子内の進化的変化がより許容されると考えられた。
ネコとヒト、及びネコとマウスのCD80間のヌクレオチドの同一性は中程度であるが、このヌクレオチド相同性の大きさはペプチドに翻訳されない。遺伝子コードは縮重されるものの、ある分子では(例えばCD28)ヌクレオチド配列間の差はペプチドを大きく変化させず、CD80の全体的なアミノ酸保全性は重要ではなく、従って種を越えた分子内の進化的変化がより許容されると考えられた。
核酸の全体配列は比較的低い同一性を有するが、完全長配列を得るには複雑さを伴う。初期CD80産物は、クローン化された種のcDNA内において高い保存性を示す領域である分子の定常域より得られた。この領域を認識し、産物を上手く増殖するプライマーは容易に作製され、良く保存されたIgC領域を含む344ntdの断片を生じた。残念なことに、シグナルペプチド及び細胞質ドメイン及び3’UTR内に相同性を欠いたために、これら領域の配列の分離にはより複雑な操作が必要とされた。しかし、中央域からの配列データの存在が、残りの分子が推測できる強いアンカー点を提供した。ネコCD80は、短い分子より得て、そしてRACE法、及び変性プライマーと配列決定された領域からのアンカープライマーとを組み合わせ利用することにより、全長配列が容易に得ることができるかの好例である。
これらクローン化されたCD80分子の推定アミノ酸配列の比較からは、全体的な相同性が無いことが示された。マウス及びヒトポリペプチドは、アミノ酸レベルにおいて50%以下の相同性を示した。この値は、ネコとヒト間の同一性59%、及びネコとマウスポリペプチド間の同一性46%に匹敵するものであり、種の進化的近接性を反映するだろう。その相対的親水性に基づき露出、又は埋没の可能性のあるアミノ酸を示す、ネコ及びヒト残基の推定親水性の比較からは、アミノ酸レベルではあるが特定アミノ酸が保持されないらしいこと、及び変化が比較的保存されていることが示された。このことは、分子の親水性/疎水性の特性が保持されているる可能性を示しており、従って全体として構造的に類似のポリペプチドを反映するだろう。表面タンパク質は、結合に直接関与する特定のアミノ酸、及び結合領域との相互作用を可能にする構造の保持にのみ必要な他の構造アミノ酸を有すると考えられている。
霊長類、齧歯類及びネコ種からのCD80分子内のアミノ酸残基同一性には幅があるものの、IgSFの特徴は保持されている。ネコCD80分子はアミノ末端のIgC様ドメイン、及び膜結合域に隣接したIgV様ドメインを含む。マウスとヒトCD80間の保存性同様に、同一性は可変域に比べると定常域ではるかに高くなる(Freemanら、1989)。全体として、可変域の保存性は50%を越える程度であるが、定常域では70%を越え、残基164−198の短い範囲(最初の344ntd断片を得た領域)ではそれ以上の同一性を示す。定常域内の56アミノ酸の中心域(残基165−211)はヒトとネコ配列の間で87%の相同性を示し、28アミノ酸(残基171−198)の突出域では差は1個のみである。ネコの領域も、マウスポリペプチド内の対応残基に対し高い相同性を示す。この領域内のアミノ酸の親水性の特性は、表面への発現の可能性が高いこと、及び、種間での保存のレベル故に、リガンド/受容体相互作用に関与していることを示している。該分子のIgC部分はレセプターリガンド相互作用に関する結合ドメインの提示に直接関係している(Peachら、1995)。しかし、可変及び定常モチーフの何れもが効果的な結合に必要であることが実験的に示されている(Peachら、1995)。細胞外ドメイン中のIgC領域に相同残基が集中することは、膜貫通及び細胞質ドメイン内に於いて大きなバラツキがあることと併せ、CD80の役割がシグナル伝達能ではなくリガンドであることをさらに確認する。
ヒト及びマウスCD80同様に、ネコ分子も高度にグリコシル化されている。炭水化物残基は結合に直接関与しないと考えられているが、分子の細胞外タンパク質の溶解性の増加を助けるだろう(Peachら、1995)。ヒトペプチド内に見いだされる8ヶ所の潜在部位の内、7ヶ所はネコタンパク質でも同一位置に局在する。ネコ分子中アミノ酸残基39に位置する部位は、ヒトCD80には見つからないが、ネコタンパク質には見いだされない残基232に部位がある(Freedmanら、1987)。マウスでは同一位置である2ヶ所を含む7ヶ所の部位が発見されているが、これらは一般にネコ及びヒトのペプチドと同一分子域に存在している(Freemanら、1989)。グリコシル化部位の数と位置が保持されることは、分子機能に於けるモチーフの重要性を反映するものと考えられる。
様々なネコCD80の潜在的応用がある。既に考察したように、分子は成熟T細胞反応の適切な発生にとって重要である。RNA及びタンパク質レベルの両方にて遺伝子の発現をモニタリングすることは、ネコ免疫システムが感染を処理している方法の確立に役立つ。他のモデルシステムの研究より得た観察と組み合わせることで、このシステムが特異的病原を処理する方法はヒト免疫反応について更に深い考察を提供するだろう。さらに重要なペット動物と同様に、ネコシステムが有益に操作される方法の洞察は高い任意選択性を持つ動物薬を提供するだろう。
他の種に於いて提言されているCD80分子に関するその他重要な応用は、宿主内への再導入によるCTLをベースとした腫瘍免疫の惹起を含む、形質導入細胞へのCD80遺伝子導入による腫瘍特異免疫の誘導である(TownsendとAllison、1993)。上記考察のごとく、腫瘍細胞によるCD80の表面発現の結果として悪性疾患に対し特異的CTL反応が生ずる(Hodgeら、1994)。更に、CD8+T細胞のメモリー集団が宿主内に確立される(Hodgeら、1994)。この技術は腫瘍免疫に関するものであるが、そのアナロジーより抗ウイルス免疫の確立にも応用できるだろう。
前記考察の様に、後天性免疫不全症候群に於ける長期の無進行は、強い抗−HIV CTL反応の初期確立を介すると考えられている(Landayら、1994)。感染後長期にわたり無症候状態を維持できる個体は、ウイルスに対する強力なCTL反応を発生し、維持できるだろう。
従来のワクチンは液性反応の確立を目的とするものであるが、ワクチンが抗−HIV/FIV mCTL集団の発生を誘導できれば、この集団は長期無進行者に見られるものに類似の防御を提供するだろう。ナイーブな個体では、FIVタンパク質にCD80ペプチドを組み合わせた遺伝子ベースのワクチンの導入はFIVエピトープのMHC CI提示と組合わさった補助刺激分子の表面発現を生じるだろう。上手くいけば、これによりナイーブ個体の中にFIV特異的mCTL集団の拡大がもたらされる。続いて有毒性ウイルスに暴露されると、ワクチン投与された個体はプライムされウイルスに感染した細胞に対する免疫反応が出現し、ウイルスがそれ自体を確立し、免疫システムの成分の破壊を開始する前にそれらを排除する。
[例6]
[ネコCD28cDNAのクローニングと配列決定]
[序]
CD28は、同一のジスルフィド結合された44kDaサブユニットより構成されるホモダイマーとして通常発現される表面糖タンパク質である。それは免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、単一の細胞外V領域、膜貫通ドメイン及び短い細胞内テールにより特徴付けられている(AruffoとSeed、1987)。分子は糖化されているものの、成分は結合には役割を持たず、細胞外ドメインの可溶性を増すと仮定されている(Peachら、1994)。ヒト、ラット、マウス及びウサギペプチド、及びニワトリの類似タンパク質をコードするcDNAがクローン化され、配列決定されている(Linsleyら、1995a)。
[ネコCD28cDNAのクローニングと配列決定]
[序]
CD28は、同一のジスルフィド結合された44kDaサブユニットより構成されるホモダイマーとして通常発現される表面糖タンパク質である。それは免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、単一の細胞外V領域、膜貫通ドメイン及び短い細胞内テールにより特徴付けられている(AruffoとSeed、1987)。分子は糖化されているものの、成分は結合には役割を持たず、細胞外ドメインの可溶性を増すと仮定されている(Peachら、1994)。ヒト、ラット、マウス及びウサギペプチド、及びニワトリの類似タンパク質をコードするcDNAがクローン化され、配列決定されている(Linsleyら、1995a)。
CD28は大部分のCD4+CD8+リンパ細胞、及び末梢のCD4+ならびにCD8+T細胞に認められ、αντL−x△3、PHA及びPMA刺激により、発現は増加し、抗CD28の結合により抑制される(Linsleyら、1993b)。その発見直後には、CD28がCD4+及びCD8+T細胞の活性化制御に重要な役割を果たすことが発見された(Juneら、1990)。T細胞活性化及び増殖の促進に加え、更にこの2次シグナルの提供はCTLでの細胞融解活性の誘導に作用することも示された(Azumaら、1993c)。
CD28はT細胞の成熟において初期に発現される。未熟CD3−細胞は通常CD28−であり、中間型CD4+CD8+細胞は低レベルで発現し、そしてCD4+又はCD8+、CD3+胸腺細胞は高レベルでCD28を発現する(Turkaら、1991)。成熟後、ヒトではは殆ど全てのCD4+及び半数以上のCD8+T細胞に(Turkaら、1991)、そしてマウスT細胞でもほぼ100%にレセプターが見いだされる(Juneら、1990)。分子は細胞表面に一定レベルでは発現されない(Turkaら、1990)T細胞活性化後に表面の発現は増加するが、活性化された細胞ではそのリガンド又は特異的mAbによる分子結合は、mRNA及びタンパク質両方のレベルでの遺伝子のダウンレギュレーションをもたらす(Linsleyら、1993a)。多くはCD28はT細胞系リンパ細胞に発見されているが、骨髄生検からの形質細胞種上にも報告されており(Kozberら、1987)、ナチュラルキラー様白血病細胞株の培養でも発現される(Azumaら、1992)。
CD28は他のB7レセプターであるCTLA−4とある程度の構造相同性を有しており、両者はIgSFグループ内のサブファミリーに分類されている(Linsleyら、1995a)。この2つの分子は細胞外IgV領域、単一膜内ドメイン、及び短い細胞質シグナル伝達ドメインを持つ(Aruffoら、1987)。2つの分子間の全体的相同性は約31%に過ぎないが、2分子間には完全に保存された短い領域及び特異的残基があり、B7認識と構造上の完全性に於いてこれらモチーフが重要な役割を果たしている可能性を反映している(LeungとLinsley、1994)。6残基域であるMYPPPYモチーフは、分離されたCD28/CTLA−4ファミリーのメンバー全てに保持されている(Peachら、1994)。これは分子内のCD3−様ループ域にマップされ、変異により変更されるとCD28及びCTLA−4に対する結合力が低下する(Peachら、1994)。この領域はCD28及びCTLA−4タンパク質上での潜在的リガンド結合部位と言われているが、この領域がB7に対する実際の結合部位であるか、又は結合の発生にとって間接的に必要とされる構造モチーフであるかは決定されれていない(Peachら、1994)。CD28及びCTLA−4の間には保存残基が共有されているが、CTLA−4はCD28に比べるとより強い結合力でCD80及びCD86の両方に結合する(Ellisら、1996)。即ち、CTLA−4は活性化T細胞上CD28レベルの2−3%でしか発現していないが、イン・ビトロでは20倍強い結合力で結合する(Linsleyら、1995b)。
CTLA−4及びCD28分子は進化的に関連し、共通リガンドを共有するが、機能及びシグナル伝達能は関連しないと考えられている(Balazanoら、1992)。各分子のシングナル伝達領域を比較しても高い同一性はみとめられず、分子毎に異なるシグナル伝達経路が開始されることが示唆されている(HutchcroftとBierer、1996)。
CD28は休止状態のT細胞に発現し、活性化に反応しまずアップレギュレーションされが、CTLA−4の発現は活性化48時間後にピークを形成し、活性化後96時間までにベースラインのレベルに戻る(Linsleyら、1992a)。CTLA−4の発現はCD28のダウンレギュレーションに対応すると考えられる(Lindstenら、1993)。更に、CD28分子のリガンド結合を通じ伝達されるシグナル経路はCTLA−4の発現のアップレギュレーションにおいて重要と思われる(Linsleyら、1993a)。CD28−であるT細胞は、PMA又はカルシウムイオノフォアーによる刺激に対する反応では、CTLA−4を顕著に発現しない(Lindstenら、1993)。
あるカスケードは仮定されているものの(HutchcroftとBierer、1996)、CD28が介在するシグナル伝達事象の完全な順序はまだ決まってはいない。CD28のシグナル伝達は細胞内Ca+の移動、フォスフォ−イノシタイドの代謝とタンパク質チロシンリン酸化の導入を含むことが示唆されている(HutchcroftとBierer、1996)。
CD28分子の細胞質テールは、CD80又はCD86により交叉結合された後の細胞内シグナル伝達に関与すると考えられている(Juneら、1994)。41個のアミノ酸よりなる細胞質内領域には酵素活性は認められず、細胞内チロシン活性化モチーフ(TCRの様な)も、Srcファミリー細胞質チロシンキナーゼの結合に関するシステイン残基も含まれていない(Juneら、1994)。しかし、分離された配列内には複数の潜在的リン酸化部位が保存されている(HutchcroftとBierer、1996)。CD28による活性に関係する酵素は明らかにされていないが、細胞内酵素活性及びタンパク質−タンパク質相互作用は差別的タンパク質リン酸化により制御されていることが多い(Luら、1992)。細胞質内テールに存在するコンセンサス部位、YMXMはSrc相同性2フォスフォ−チロシン−結合ドメイン(SH2ドメイン)依存性フォスファチジルイノシトール−3キナーゼ(PI3キナーゼ)結合の部位として提案されている(Prasadら、1995)。これはCD28に関する考え得る1つのシグナル経路であるが、PI3キナーゼの活性がIL−2活性に相関しないことが示されており、そしてIL−2産生の増加がCD28シグナル伝達の一次コンセンサスであることを考えると、細胞内シグナル伝達に由来する活性化には別の経路があると思われる(Juneら、1994)。
これら事象の役割は完全には理解されていないが、CD28の共刺激はT細胞によるサイトカインの産生を増加させる。抗CD3又はPHAにより活性化されたCD28+T細胞では、抗−CD28はIL−1、IL−2、IL−3、IL−4、腫瘍壊死因子(TNFα)、リンフォトキシン、IFNγ、及び顆粒細胞−単核細胞コロニー刺激因子(GM−CSF)並を含む一連のサイトカイン及びIL−2レセプターの定常RNAレベルを増加する(Lenschowら、1996)。定常状態のmRNAの増加は、転写体の安定化と転写の増加に拠る(HutchcroftとBierer、1996)。
CD28共刺激はCD4+T細胞クローンでまず報告された(Martinら、1986)が、現在CD28は多くのタイプの細胞の活性化に役割を持つことが知られている。この経路の共刺激は、ナイーブCD4+T細胞のサブポピュレーションではIFNγの産生、Th1型サイトカイン及びIL−4の産生、Th2型サイトカインを制御することが示されている(Sederら、1994)。CD28の共刺激経路はCD8+CTLの活性化にとっても重要であるが、CTL介在殺滅のエフェクター期にとっては必要とは考えられていない(Hodgeら、1994)。興味深いことに、CD28はHIV感染でも役割を持っている。ウイルス陽性の複数の個体より培養されたリンパ細胞では、モノクローナル抗体によるCD28の結合はHIV産生の増加をもたらした(Asjoら、1993)。
霊長類及び齧歯類では、CD80とCD28との結合により供給される2次シグナルはT細胞の初期活性化の中に明らかに大きな役割を果たしている(AruffoとSeed、1987)。しかし最近のデータは、相互作用の主な影響はアポトーシスの発生を防ぐととで増殖を持続させるここであると示唆している(Lenschowら、1996)。増殖のG0期にある休止T細胞は、TCR複合体の形成を通じて活性化できるが、CD28交叉結合無しには増殖及びIL−2の分泌はできず、いわゆるクローン性の無力化状態になる(Linsleyら、1991a)。成熟T細胞は、TCRとAPC上のMHCとの結合を通じてのみ活性化できるが、時にこれはアポトーシスによる活性化誘導細胞死を誘導する(Radvaniら、1996)。他の二次的相互作用(即ち、ICAM−1共刺激)も補助的増殖シグナルを提供できるが、CD28が伝達する共刺激はクローン性無力化及びアポトーシスの継続発生を阻止する上で特異的である(Linsleyら、1993a)。CD28は、アポトーシスからのT−リンパ細胞防御に於いて重要な役割を果たすことが知られている制御遺伝子について、重要な役割を担っている(Boiseら、1995)。bcl−xξ発現の持続的増加が、CD28交叉結合により刺激されたT細胞について観察されている(Boiseら、1995)。CD28共刺激はアポトーシスの発生を阻止する、コードされたポリペプチドの発現によりbcl−xξmRNAの安定化に作用するだろう(Radvanyiら、1996)。
各種ヘルパーT1型及び2型サイトカインの産生の促進について、CD28の結合が役割を持つことが示されている(Lenschowら、1996)。又、この相互作用は特異的ヘルパーTサブセットの発生にも役割を持つと考えられている。ナイーブCD4+T細胞は、CD28/CD80伝達シグナルが無い場合には、通常Th1表現形を発生するだろう(Lenshowら、1996)。これはIL−2が外来性に添加されたことにより誘導されるIL−4産生の間接的役割であり、IL−2産生に於けるCD28シグナル伝達の役割は常に考察されている(Sederら、1994)。CD28ノックアウトマウスを含むその他の研究からも、Th2細胞の発生に於けるレセプターの役割は支持されている。
CD28由来2次シグナル無しの状態での感染に動物がどう適応するかを調べる目的で、CD28+/−マウスがShaniniaと共同研究者により作られた(Shahinianら、1993)。第2エクソンをネオマイシン耐性遺伝子により部分弛緩することで、胚性幹細胞中に遺伝子は破壊された(Shahinianら、1993)。ノックアウトについてホモ接合体であるマウスのPBMCは、そのT細胞上にCD28を発現しないが、ヘテロ接合体CD28−/+は低下した分子表面発現を有することが見いだされている(Shahinianら、1993)。CD28−/+マウス由来のT細胞のマイトジェン刺激はT細胞増殖と、外来性IL−2によって部分的にのみ回復されるサイトカインの産出を減少させた。高度に精製されたT細胞はAPCが存在しない状態ではレクチンにより活性化されないことが示されている(Unanue、1984)。このノックアウト株を使い、CD28/CD80相互作用がT細胞レクチンのマイトジェン活性に必要であることが示された(Shaninianら、1993)。相互作用は抗原に対する反応に於けるB細胞によるイディオタイプのスイッチの伝達に於いても重要であることが見いだされている(Shahinianら、1993)。CD80ノックアウトとは異なり、CD28に関し提示された役割については遺伝子ノックアウト技術により決定できた。CTLA−4ノックアウトマウスはまだ報告されていないが、CTLA−4 Igを過剰発現するトランスジェニックマウスが研究されている(Laneら、1994)。予想通り、この株はCD28欠失株に似た幾つかの特徴を有している(Laneら、1994)。分離されたT細胞は正常な量のIFNγを産生し、刺激により産生されるIL−4の量は明らかに少なかった(Roncheseら、1994)。これによりB細胞は適切な液性反応を発生、又は維持できなくなる(Roncheseら、1994)。Th1及びTh2分化について提示されている多くの経路を通して、CD28/B7相互作用はT細胞サブセットの分化に大きな影響を与える。
インターロイキン−2mRNAの安定化はCD28交叉結合の重要な機能ではあるが、この相互作用により多くの他のサイトカインも直接又は間接的に影響を受けることが示されている(Linsleyら、1991a)。炎症メディエイターであるIL−1α、IL−6及びTNFαはCD28シグナル伝達に反応してメモリT細胞手段内に産生されるが、ナイーブ集団ではIL−1αのみ産生される(Gerdanら、1991;van Kootenら、1991)。IL−4発現もCD28シグナル伝達経路により制御を受けている(Sederら、1994)。他の重要な液性反応のメディエイターであるIL−5、IL−10及びIL−13も相互作用によりアップレギュレーションされている(deWaal Malefytら、1993、Mintyら、1993)。更にGM−CSF、CSF−1及びIL−3を含むコロニー刺激及び増殖因子及びIL−8を含む化学誘引因子も全てCD28により供給されるシグナルによりアップレギュレーションされる(Harlanら、1995)。
癌免疫の誘導に於けるCD80の応用の可能性についてはこれまでも考察されてきたが、CD28及びCD80に関しては他の様々な臨床利用にちても提言されている。齧歯類のモデルシステムは、CD28とCD80間の相互作用を阻止すると、幾つかの自己免疫疾患の予防又は治療を、臓器拒絶又は移植体対宿主病の発生の予防を、そして敗血症に伴うサイトカイン放出の阻止を促進することが示されている(Harlanら、1995;Nickoloffら、1993;Thomasら、1994;Zhouら、1994)。マウスではCD28/CD80相互作用を阻止するためのCTLA−4 Igの添加は、NZB/NZWマウスに於けるループス用症状を防止し、ラットに於いては致死的EAE及び致死的腎臓炎を部分的に予防した(Harlanら、1995)。ヒトに於ける自己免疫疾患についてはこの様式の免疫治療は試みられていないが、ヒトについては乾癬及びリューマチ性関節炎に於いて、それら生検がCD80の発現を示すのに対し正常生検にはこの発現が存在しないことが示されている(Nickoloffら、1993;Thomasら、1994)。マウスでの骨髄及び臓器移植体、及びイン・ビトロでのヒト実験では、CTLA−4 Igの添加及びCD28/B7相互作用の阻止により、臓器拒絶からの少なくとも部分的な保護、GVHDの防止、又は抗原特異的寛容性の導入が誘導できる(Harlanら、1995)。また、最終的には、イン・ビボでのCTLA−4投与によりマウスではサイトカインの放出、及び敗血症性のショック又は敗血症につながる敗血症の発症が防止できる(Zhouら、1994)。CD28/CD80相互作用の操作は、T細胞共刺激のより完全な理解を提供し、様々な問題の解決法確立に見識を提供する。
[材料と方法]
[CD28の初期断片の単離]
mRNAは、16時間ConAにて刺激したHK5の末梢血リンパ細胞より、RNAzolB RNA抽出試薬(バイオテックス、ヒューストン、テキサス(Biotexc、Houston、TX))を用い抽出された。まずこのRNAより、3’プライマーとしてオリゴdTを使った逆転写(RT)反応によりcDNAを得た。要約すると、RNA及びオリゴdTを75度で3分間加熱し、2次構造を除いた。次にRT、dNTP、緩衝液及び蒸留水を加え、混合液を1時間42℃にてインキュベーションした。このインキュベーション後、サンプルを95℃にて5分間加熱し、RTを失活させた。次に、ヒト、マウス及びウサギのCD28の公開核酸配列(ジーンバンク、ガイサーブルグ、マサチューセッツ(GeneBank、Gaithersburg,MA))内のコンセンサス域より得た変性プライマーを使い、オープンリーディングフレームの大部分をコードする673ntdの断片の初期増幅をおこなった。
[CD28の初期断片の単離]
mRNAは、16時間ConAにて刺激したHK5の末梢血リンパ細胞より、RNAzolB RNA抽出試薬(バイオテックス、ヒューストン、テキサス(Biotexc、Houston、TX))を用い抽出された。まずこのRNAより、3’プライマーとしてオリゴdTを使った逆転写(RT)反応によりcDNAを得た。要約すると、RNA及びオリゴdTを75度で3分間加熱し、2次構造を除いた。次にRT、dNTP、緩衝液及び蒸留水を加え、混合液を1時間42℃にてインキュベーションした。このインキュベーション後、サンプルを95℃にて5分間加熱し、RTを失活させた。次に、ヒト、マウス及びウサギのCD28の公開核酸配列(ジーンバンク、ガイサーブルグ、マサチューセッツ(GeneBank、Gaithersburg,MA))内のコンセンサス域より得た変性プライマーを使い、オープンリーディングフレームの大部分をコードする673ntdの断片の初期増幅をおこなった。
CD28−113:CAA CCT TAG CTG CAA GTA CAC
CD28−768:GGC TTC TGG ATA GGG ATA GG。
CD28−768:GGC TTC TGG ATA GGG ATA GG。
Taqポリメラーゼを利用するホットスタートPCRプロトコールを使い、産物を増幅した(95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒間、48℃、30秒間及び72℃、45秒間、30サイクル;72℃7分間、1サイクル)。次に前述同様に、断片を1%アガロースゲル上にて視認し、TAクローニングベクター(インビトロジェン、サンジェゴ、カリフォルニア)に連結、配列決定した。cDNAの配列より、cDNA端の5’RACE反応の使用に適した特異的3’プライマーを構築した。
CD28190:CGG AGG TAG AAT TGC ACT GTC C
CD28 239:ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC。
CD28 239:ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC。
[5’領域の単離]
改良型ギブコ社製5’RACEプロトコール(ギブコBRL、ガイサーブルグ、メリーランド)を使い、ネコCD28分子の残りの5’配列を得た。RNAは16時間のConA刺激PBMCより抽出される。第1鎖cDNA合成には3’遺伝子特異的プライマーを使用した。RNA及びプライマーは、その他のRT試薬を加える前に75℃にて5分間加熱された。変性後、混合液を4℃まで冷却し、反応緩衝液、塩化マグネシウム、dNTP、DTT及びSuperScriptRT(ギブコBRL、ガイサーブルグ、メリーランド)を加えた。RT混合液を42℃にて30分間インキュベーションし、続いて70℃で15分間加熱しRTを変性した。次にRNaseカクテルを加え、反応液を55℃にて10分間インキュベーションし、残ったRNAを除き誤ったターミナルトランスレラーゼ(TdT)伸長を阻止した。続いてcDNAをGlassMax(ギブコBRL、ガイサーブルグ、メリーランド)スピンカラムにかけ精製し、取り込まれていないdNTP及びプライマーを除いた。次に、カラムより溶出された精製cDNAにTdTを接続した。TdTを使い、cDNAに20−30ヌクレオチドのdCテールを加えた。cDNAを95℃にて3分間変性した後、精製されたcDNA、塩化マグネシウム、反応緩衝液及びdCTPの混合液に、酵素を加えた。反応液を37℃、10分間インキュベーションし、続いて酵素を70℃で更に10分間加熱し、不活性化した。テールの付いたcDNAをTaqポリメラーゼをベースとしたホットスタートPCR反応で増幅した(95℃、5分間;95℃、30秒間、55℃、30秒間及び72℃、45秒間、35サイクル;72℃、7分間)。この反応のプライマーは、cDNA合成プライマーの5’に位置する3’プライマー、及びdCリンカに対し特異的であり、僅かなdI残基を含み大部分がdGであるアンカープライマーを含む。この反応液1μlを50μlの水で希釈し、この希釈液5μlを使い、dG/dI5’アンカープライマー及びその他の上流遺伝子特異的3’プライマーを使ったネステッドPCR反応を行った(KlenTaqポリメラーゼミックスを利用し、95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、55℃、30秒及び72℃、45秒を30サイクル)。
改良型ギブコ社製5’RACEプロトコール(ギブコBRL、ガイサーブルグ、メリーランド)を使い、ネコCD28分子の残りの5’配列を得た。RNAは16時間のConA刺激PBMCより抽出される。第1鎖cDNA合成には3’遺伝子特異的プライマーを使用した。RNA及びプライマーは、その他のRT試薬を加える前に75℃にて5分間加熱された。変性後、混合液を4℃まで冷却し、反応緩衝液、塩化マグネシウム、dNTP、DTT及びSuperScriptRT(ギブコBRL、ガイサーブルグ、メリーランド)を加えた。RT混合液を42℃にて30分間インキュベーションし、続いて70℃で15分間加熱しRTを変性した。次にRNaseカクテルを加え、反応液を55℃にて10分間インキュベーションし、残ったRNAを除き誤ったターミナルトランスレラーゼ(TdT)伸長を阻止した。続いてcDNAをGlassMax(ギブコBRL、ガイサーブルグ、メリーランド)スピンカラムにかけ精製し、取り込まれていないdNTP及びプライマーを除いた。次に、カラムより溶出された精製cDNAにTdTを接続した。TdTを使い、cDNAに20−30ヌクレオチドのdCテールを加えた。cDNAを95℃にて3分間変性した後、精製されたcDNA、塩化マグネシウム、反応緩衝液及びdCTPの混合液に、酵素を加えた。反応液を37℃、10分間インキュベーションし、続いて酵素を70℃で更に10分間加熱し、不活性化した。テールの付いたcDNAをTaqポリメラーゼをベースとしたホットスタートPCR反応で増幅した(95℃、5分間;95℃、30秒間、55℃、30秒間及び72℃、45秒間、35サイクル;72℃、7分間)。この反応のプライマーは、cDNA合成プライマーの5’に位置する3’プライマー、及びdCリンカに対し特異的であり、僅かなdI残基を含み大部分がdGであるアンカープライマーを含む。この反応液1μlを50μlの水で希釈し、この希釈液5μlを使い、dG/dI5’アンカープライマー及びその他の上流遺伝子特異的3’プライマーを使ったネステッドPCR反応を行った(KlenTaqポリメラーゼミックスを利用し、95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、55℃、30秒及び72℃、45秒を30サイクル)。
次に、ネステッド反応液30μlを1.5%アガロースゲル上で視覚化し、適当な断片をゲルより切り出した(図19)。cDNAを前記同様にしてAmiconゲルネブライザーとマイクロピュアフィルター(アミコン、バーバリー、マサチューセッツ(Amicon、Bererly,MA)を使い精製した。精製cDNAは、色素ターミネーターサイクルシークエンシング(パーキンエルマー、ノルウォーク、コネチカット)を用い配列決定した。完成した断片より、コンセンサス配列を得た。配列よりネコCD28遺伝子の全オープンリーディングフレームを包含するプライマーペアを構築した。
feCD28 5’:CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG
feCD28 3’:CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G。
feCD28 3’:CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G。
これらプライマーを利用し、全コーディング域を含むcDNA分子を、ConA刺激したEK6およびED3 PBMC由来cDNAより増幅した。このPBMC cDNAは前の作製され、遺伝子をコードするRNAを含むことが示されている。このTaqポリメラーゼに伴いしばしば起こるランダムエラーを少なくすることを期待し行われたKlenTaqDNAポリメラーゼを利用したPCR反応(95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、42℃、30秒及び72℃、45秒を30サイクル;72℃、7分間)は754bpの断片を生じ、これはTAクローニングベクター内にクローン化され、前記同様に配列決定された。CD80分子同様に、各ヌクレオチドの位置は少なくとも独立に得られた3配列によって確認された。
[結果]
マウス、ヒト及びウサギCD28のcDNA配列内のコンセンサス域より選択された変性プライマーがPCR反応に使用され、ネココーディング配列の殆ど全てを包含する産物を得た。CD28分子に見られる高い保存性により、変性プライマーを使用した初期増幅は実際に全体分子を産生した。最初に短い中央部の断片のみが作られたネコCD80分子とは逆に、CD28cDNAのオープンリーディングフレームからは最も5’側にある113ntdのみが失われていた(図20)。この配列初期断片は、ヒト配列内の同類域と86%の相同性を有し、ウサギcDNAとは86%の同一性を、そしてマウスコーディング配列とは79%の相同性を有していた。
マウス、ヒト及びウサギCD28のcDNA配列内のコンセンサス域より選択された変性プライマーがPCR反応に使用され、ネココーディング配列の殆ど全てを包含する産物を得た。CD28分子に見られる高い保存性により、変性プライマーを使用した初期増幅は実際に全体分子を産生した。最初に短い中央部の断片のみが作られたネコCD80分子とは逆に、CD28cDNAのオープンリーディングフレームからは最も5’側にある113ntdのみが失われていた(図20)。この配列初期断片は、ヒト配列内の同類域と86%の相同性を有し、ウサギcDNAとは86%の同一性を、そしてマウスコーディング配列とは79%の相同性を有していた。
5’ATG及びその他の110ntd、並びに幾つかの上流5’配列が、5’RACE PCR(ギブコ、ガイサーブルグ、メリーランド)を利用し単離された。テーリング反応にはEK6ConA刺激PBMCより転写されたcDNAが利用された。この材料を使い、プライマーCD28−786及びアンカープライマーdGによる増幅の結果極僅かな特定可能な物質を得た(図21)。
同定可能なバンドはプライマーの組み合わせdG/CD−786により増幅されたが、その反応液からの希釈cDNAはネステッドCD28プライマーであるCD28−182及びCD28−239を使い増幅された。視認可能なバンドが約600pbの位置に存在した。この産物をアガロースゲルより分離し、配列決定したところ、開始コドンを含み、かつ連続する5’上流の配列を含んでいた(図22)。
これら産物の配列より、開始コドンを含む5’プライマーを得た。このプライマーは、3’構築体と組み合わせ使用し、EK6及びED3のConA刺激PBMCより抽出されたRNAからcDNAを増幅し、754bpの産物を得た(図23)。
各動物ついて少なくとも2産物を完全に配列決定し、各ヌクレオチド部位は独立に正確に読みとられた3配列により確認された。配列決定後、完全長の産物をTAクローニングベクターより配列決定し、産物が安定かつ再現性あるものであることを確認した。
全オープンリーディングフレームをコードする最終の685bp断片内では、5’TAGは位置1に位置し、停止コドンは位置664−66に位置し、更に19ヌクレオチドが3’UTR内に存在していた(図24)。feCD80分子同様、ATGコドンの5’位置は、5’RACE PCR産物の配列決定により確認された(データ示さず)
配列決定したところ、ネコCD28遺伝子はウサギ及びヒト配列と極めて近く、全体的な同一性を示した(図25)。マウスcDNAとの相同性も高かったが、ニワトリ配列との同一性には、ウサギ配列と他の哺乳動物遺伝子間の変動と同程度の変動があった。
配列決定したところ、ネコCD28遺伝子はウサギ及びヒト配列と極めて近く、全体的な同一性を示した(図25)。マウスcDNAとの相同性も高かったが、ニワトリ配列との同一性には、ウサギ配列と他の哺乳動物遺伝子間の変動と同程度の変動があった。
アミノ酸ペプチド配列は前記同様にして核酸配列より得られた。他の公開遺伝子より得られたアミノ酸配列との同一性は、ヌクレオチドレベルの同一性と同等であった。ペプチドのシグナル配列は5’メチオニンから残基19までの範囲であった。ネコ分子では、他のクローン化CD28ポリペプチド同様に、残基19−153の範囲に単一の細胞外IgSF可変様ドメインがあると考えられた。疎水性の膜内ドメインは続く27残基の範囲であり、そしてそれに41アミノ酸の細胞質テールが続く。ヒトCD28分子同様に、ネコポリペプチドも5ヶ所の潜在的N−結合糖化部位を持っている(図26)。
ネコ及びヒトCD28タンパク質の推定アミノ酸配列の比較は、相同域にも幾つかの違いがあることを示した(図27)。変化の多くは膜貫通ドメイン及びシグナル配列、そしてNH3末端ドメインに認められた。最も高い相同性は、中央部のIgSF V−様ドメインと細胞質テール内に認められた。
ネコCD28分子とCD28/CTLA−4のヒト及びマウスメンバーの推定アミノ酸配列との比較からは、このグループのメンバー間の全体相同性は25%に過ぎないが、特定領域及び残基は維持されていることが示された。MYPPPYモチールはこのグループの全てのメンバーで維持されていた。ネコ分子内には、多くの保存システイン残基を含む構造保全に取って重要と思われる残基も保持されていると考えられた(図28)。
ネコCD28分子の細胞質ドメインは、他の公開配列、特に哺乳動物の配列に比べ緩やかに保存されていた(図29)。レセプターの細胞外部分の交叉結合の結果、様々な細胞内シグナル伝達経路が伝達されると考えられている(HutchcroftとBierer、1995)。
ネコCD28の推定アミノ酸配列の親水性プロットは、ヒトポリペプチドの同様のプロットと比べると、それぞれのタンパク質が同様の構造上の完全性を保持している可能性を示した。しかし、アミノ酸配列内に変化が起こっている場合でも分子の親水性には大きな変化は起こっておらず、従ってアミノ酸配列内の変化は大部分が相同的であると考えられる。ネコ及びヒトペプチドの相同性が75%に過ぎない疎水性膜内ドメインでさえ極めて似た親水性プロフィールを有することは注目に値する(図30)。
[考察]
クローン化CD28分子の配列は全て、進化的に中程度に保存されていることを示した。T細胞伝達免疫の活性化及び伝達に於ける分子の役割は、より高等な様々な脊椎動物、フクロウから齧歯類、肉食動物、そしてより高等な霊長類でも保持されていると考えられている。
クローン化CD28分子の配列は全て、進化的に中程度に保存されていることを示した。T細胞伝達免疫の活性化及び伝達に於ける分子の役割は、より高等な様々な脊椎動物、フクロウから齧歯類、肉食動物、そしてより高等な霊長類でも保持されていると考えられている。
それぞれの分子の推定アミノ酸配列を比較すると、リガンド結合に関係すると考えられている細胞外ドメイン、及び細胞内シグナル伝達の促進に関係すると考えられている細胞内領域では相同性は中度である。全体としては、ネコポリペプチド中の残基118−123からのIgVドメイン内に存在する、リガンド結合部位、MUPPPYの周辺領域で最も相同性は高い。
ペプチドのシグナル配列と思われる領域は、5’メチオニンから残基19までである(Aruffoら、1987)。単量体のCD28が、残基19−153の範囲にある単一細胞外IgSP可変域−様ドメインの中に含まれている(Aruffoら、1987)。疎水性の膜内ドメインは続く27残基の範囲であり、これに41アミノ酸よりなる細胞質テールが続く(Aruffoら、1987)。ネコタンパク質は、5ヶ所の潜在的N−結合糖化部位をヒトタンパク質に見られる場合と同一位置に持っている。興味深いことに、ネコタンパク質の残基105にある糖化部位はNQSであるが、ヒトではNQTである。このアミノ酸の変動は、分子間には配列の変化はあるものの全体構造の特徴は保持されていることを反映している。
タンパク質に認められる相同性のレベルから推測される様に、ネコ及びヒトのCD28の親水性プロットの比較からは分子が部分的に似た立体構造のパターンを持つことが示された。しかし、それは残基が変化する場合、その変化が一般的に相同的であることも意味している。
膜貫通ドメインは最も低い保存性を持つ分子域であり、求められる親水性の特性を単純に保持し、feCD28分子の細胞質ドメインは他の公表配列を中程度に保存している。レセプターの細胞外部分の交叉結合を介して様々な細胞内シグナル伝達経路が伝達されると考えられており、CD28ポリペプチドの細胞内部分には本質的な酵素活性はないが、リガンド結合により細胞内エフェクター分子の活性化をもたらす(Aruffoら、1987)。チロシンリン酸化の潜在部位として4ヶ所の保存されたチロシン残基(Y173、Y188、Y191及びY200)がある(Luら、1992)。更に、ネコ分子の残基193より始まるMNM配列は、ヒト及びマウスタンパク質に於けるSH2ドメイン部位であると言われている(Prasadら、1995)。プロテインキナーゼCによりリン酸化される潜在部位はS185に保持されており、一方セリン/スレオニンキナーゼ活性に対するErk1又はErk2プロリンはT202と考えられている(HutchcroftとBierer、1996)。既に考察した様に、CD28レセプターのシグナル伝達機能は多面的であり、従ってペプチドの細胞質テールが複数の潜在的シグナル伝達因子をもつっていても不思議ではない。
ネコCD28の別の応用としては、レセプターの表面発現、及びFIVの様なウイルスに感染した後のCD28の発現をモニタリングする手段の開発が含まれる。タンパク質検出に適した手段が既存のメッセージ検出法と組み合わせることができれば、感染中の発現レベルに関する有益な情報た得られるだろう。慢性FIV感染の経過中のCD28発現パターンの更なる関連性は、ネコシステムをヒトに於けるHIV感染の不良例として例証し、両システムに於ける感染経過に関しより明確な回答をもたらすだろう。
[例7]
[CD28/CD80タンパク質発現]
[序]
免疫系に於ける連絡は多くは液性因子により伝達されるが、霊長類及び齧歯類の一次T細胞反応の開始は、細胞と細胞の直接接が必要であることが判明している(Mescher、1992)。元来、この相互作用にはT細胞上のTCRと抗原提示細胞上のMHCとの間の相互作用のみ関与すると考えられていたが、T細胞の完全な活性化にはアクセサリー分子間の結合も必要であることが明らかになった(Schwartz、1992)。考察した様に、CD28とCD80間の相互作用がこのアクセサリーシグナルのメディエイターであることが支持する証拠がある(Linsleyら、1991a)。
[CD28/CD80タンパク質発現]
[序]
免疫系に於ける連絡は多くは液性因子により伝達されるが、霊長類及び齧歯類の一次T細胞反応の開始は、細胞と細胞の直接接が必要であることが判明している(Mescher、1992)。元来、この相互作用にはT細胞上のTCRと抗原提示細胞上のMHCとの間の相互作用のみ関与すると考えられていたが、T細胞の完全な活性化にはアクセサリー分子間の結合も必要であることが明らかになった(Schwartz、1992)。考察した様に、CD28とCD80間の相互作用がこのアクセサリーシグナルのメディエイターであることが支持する証拠がある(Linsleyら、1991a)。
脊椎動物に於ける重要なレセプター及びリガンドの多くはIgSFサブファミリーのメンバーである(Springer、1990)。分子は、通常分子の細胞外部分にある免疫グロブリン様領域の存在により特徴付けられている(Buck、1992)。保存性は様々であるが、Ig折りたたみ構造の形成に必要とされる残基にのみ保存性が限定されることが多い(Beale、1985)。Igドメインの特徴には、保存トポロジーに続く、ループにより結合された2本の近接し、随伴する逆平行β鎖がある(WilliamsとBarclay、1988)。このファミリーのメンバー間には共通する構造特性があるが、このファミリーには特徴的な結合相互作用及びシグナル伝達の配列の多様性がある(Andersonら、1988)。
IgSFファミリーのメンバーとして、CD28及びCD80は共にその細胞外ドメインにある程度の構造類似性を有している。CD28はジスルフィド結合ヘテロダイマーとして発現されるが、単一の細胞外V領域を有している(Aruffoら、1987)。CD80分子の細胞外領域はV−様ドメインとC型ドメインの両方を持つが、モノマーとして発現される(Freedmanら、1989)。IgSFファミリーメンバーは構造特性を共有することから、結晶化されていない関連分子の3次元構造の考えを確立には鋳型が限定ベースで利用される(Bajorathら、1993)。CD28あるいはCD80ポリペプチドは共に結晶化されていないため、類似の細胞外ドメインを持つ分子であるCD2Friscollら、1991)及びCD8(Leahyら、1992)がX−線結晶学で検証され、IgSFグループの関連メンバーの構造について幾つかの考えが提出されている(Linsleyら、1995a)。
前述の如く、CD80及びCD86はCD28及びCTLA−4に対し類似の結合力を有している。しかし、CD28はこのリガンドに関する低親和性レセプターであるのに対し、CTLA−4は両分子に対し高い親和性を有している(Linsleyら、1994a)。可能性のあるメカニズムが提出されてはいるもののCD28により保持されている様な迅速な解離速度を持つ低親和性レセプターがどの様にしてT細胞の発生に必要な共刺激シグナルを供給できるのかは不明である(Linsleyら、1995a)。T細胞表面上のCD28のCD80結合は産出架橋(productive cross−linking)およびシグナル供給を容易にするレセプターの多量化を促進すると仮定する(Linsleyら、1995a)。CD28は活性化されたT細胞上に均一に分布していることから、分子はT細胞が結合した後に膜上を移動すると言われている(Damleら、1994)。高濃度の多量化CD28は細胞:細胞接触域内の遊離型CD28の最結合を促進するため、解離速度が早くともシグナル供給を促進すると考えられている(Linsleyら、1995a)。CD28/CD80の相互作用については直接観察されてはいないものの、相互キャッピングと呼ばれるこのプロセスは同様の細胞:細胞接触が求められる他のレセプターについて提示されている(Singer、1992)。
CD28/CD80相互作用はT細胞を介した免疫反応の発効にとって重要であることが示されているが、このシグナル伝達経路の正確なメカニズムについては不明な点が多い(Linsleyら、1993a)。この相互作用に於いて2種類のレセプター及び2種類のリガンドの存在からT細胞の活動にそれぞれた果たす役割に関し疑問が生じる(Linsleyら、1992b)。CTLA−4はより強く結合するものの、それは活性化後より遅れて発現され、またCD28に関してもシグナル伝達経路が提言されているが、シグナルがリガンドのCTLA−4との結合により供給されるか否かは決定されていない(Linsleyら、1995a)。
[材料と方法]
[挿入体の調整]
以下のプライマーを使用し、発現ベクターへの挿入するためのネコCD28及びCD80遺伝子の全オープンリーディングフレームを増幅した:
feCD80 5’:CGC GGA TCC GCA CCA TGG GTC ACG CAG CAA AGT GGA AAA C
feCD80−960:CCT AGT AGA GAA GAG CTA AAG AGG C
feCD28 5’:CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG
feCD28 3’:CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G。
[挿入体の調整]
以下のプライマーを使用し、発現ベクターへの挿入するためのネコCD28及びCD80遺伝子の全オープンリーディングフレームを増幅した:
feCD80 5’:CGC GGA TCC GCA CCA TGG GTC ACG CAG CAA AGT GGA AAA C
feCD80−960:CCT AGT AGA GAA GAG CTA AAG AGG C
feCD28 5’:CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG
feCD28 3’:CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G。
5’CD80プライマー及び両CD28プライマーはBamHI部位と複数のクローニング部位内への挿入を促進する適当なリンカーを使い作製された。3’BamHI部位はTAクローニングベクターを消化し、CD80配列上に構築された。5’プライマーは共にコザックボックス及び5’ATGも含む。何れの場合もプライマーを使い、前述の如くTAベクローニングクター内に前もってクローン化された各遺伝子の全配列をコードする以外より増幅した。あるいは各プラスミド約10ナノグラムをTaqポリメラーゼをベースとしたPCR増幅に利用した(95℃、5分間1サイクル;95℃、30秒、60℃、30秒、68℃、45秒を30サイクル、68℃、7分間1サイクル)。増幅産物は前述同様にアガロースゲル上に電気泳動し、視覚化した後TAクローニングベクター(インビトロジェン社、サンジェゴ、カリフォルニア)内に接続した。前述と同様に、接続反応体を用いInvαF’コンペテント細胞を形質転換し、陽性クローンをスクリーング、選別した。
[pSI中へのクローニング]
COS−7細胞の形質転換に使用するpSIベクターへのクローニングのために、プラスミドをEcoRIで消化し、続いて酵素をマイクロピュアEZカラム(アミコン、バーバリー、マサチューセッツ)を用いて除いた。酵素除去後、プラスミドをフェノール:クロロフォルムで処理し、残存タンパク質を除き、アルコールで沈殿した。挿入体を接続しているベクター中に見いだされるEcoRI部位を利用し、適当な挿入体を持つTAクローニングベクターを含むクローンより50μgのQIAGEN精製プラスミドDNA(Qiagen、チャットワース、カリフォルニア)から挿入体を消化し得た。100μlの消化体を1.5%アガロースゲル上で電気泳動し、消化された断片を切り出した。次にゲルネブライザーとミクロコンフィルター(アミコン、バーバーリー、マサチューセッツ)を使い挿入体をアガロースゲルより精製した。EcoRI消化されたpSIのアルカリフォスファターゼ処理は、ベクターの自己連結の機会を減らす。1時間、37℃にて0.1U/μgのウシ小腸アルカリフォスファターゼ(CIP)で処理し、ベクターの消化末端を脱リン酸化した。CIPを65℃、30分熱変性して除き、さらにMicropureEZスピンカラム(アミコン、バーバーリー、マサチューセッツ)を使いスピン精製した。挿入体は、T4DNAリガーゼを使い、16℃、一晩にて切断され脱リン酸化されたpSIベクター内に直接接続された。ベクターと接続体とのモル比はおよそ3:1であり、pSI0.1μgに対しCD28又はCD80挿入体0.05μgであった。接続反応液1μlを使ってInvαF’コンペテント細胞を形質転換した。細胞を50μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上に線条接種した。プレートは一晩、37℃にて培養され、翌日コロニーは100μg/mlのアンピシリンを含む5mLのLB培地に接種された。37℃、一晩、220rpmによる振盪インキュベーションの後、プラスミドDNAをアルカリ融解により抽出し、DNAをフェノール:クロロフォルム抽出にて精製し、2倍量の95%エタノールで沈殿させた。DNAをRNaseで処理した後、10UのEcoRIで消化した。消化体を1%アガロースゲル上で視覚化し、陽性クローンを特定した。続いてプラスミドDNAを、陽性クローンの一晩培養体5mlよりQIAprepスピンカラムを用い抽出した(QIAGEN、チャットワース、カリフォルニア)(図31)。次に精製DNAを、内部3’プライマーを使った色素ターミネーターサイクルシークエンシングを用いて配列決定し、プラスミド内の挿入体の方向を決定した。プライマーはクターと挿入体の間の接続部を越えて配列決定できる位置にあり、方向が正確でることが確認された。次に適切な方向にプラスミドを持つ各遺伝子クローンを100mlの培養液柱に増殖し、プラスミドをQIAGEN(チャットワース、カリフォルニア)maxi−prepカラムを使い抽出した。
COS−7細胞の形質転換に使用するpSIベクターへのクローニングのために、プラスミドをEcoRIで消化し、続いて酵素をマイクロピュアEZカラム(アミコン、バーバリー、マサチューセッツ)を用いて除いた。酵素除去後、プラスミドをフェノール:クロロフォルムで処理し、残存タンパク質を除き、アルコールで沈殿した。挿入体を接続しているベクター中に見いだされるEcoRI部位を利用し、適当な挿入体を持つTAクローニングベクターを含むクローンより50μgのQIAGEN精製プラスミドDNA(Qiagen、チャットワース、カリフォルニア)から挿入体を消化し得た。100μlの消化体を1.5%アガロースゲル上で電気泳動し、消化された断片を切り出した。次にゲルネブライザーとミクロコンフィルター(アミコン、バーバーリー、マサチューセッツ)を使い挿入体をアガロースゲルより精製した。EcoRI消化されたpSIのアルカリフォスファターゼ処理は、ベクターの自己連結の機会を減らす。1時間、37℃にて0.1U/μgのウシ小腸アルカリフォスファターゼ(CIP)で処理し、ベクターの消化末端を脱リン酸化した。CIPを65℃、30分熱変性して除き、さらにMicropureEZスピンカラム(アミコン、バーバーリー、マサチューセッツ)を使いスピン精製した。挿入体は、T4DNAリガーゼを使い、16℃、一晩にて切断され脱リン酸化されたpSIベクター内に直接接続された。ベクターと接続体とのモル比はおよそ3:1であり、pSI0.1μgに対しCD28又はCD80挿入体0.05μgであった。接続反応液1μlを使ってInvαF’コンペテント細胞を形質転換した。細胞を50μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上に線条接種した。プレートは一晩、37℃にて培養され、翌日コロニーは100μg/mlのアンピシリンを含む5mLのLB培地に接種された。37℃、一晩、220rpmによる振盪インキュベーションの後、プラスミドDNAをアルカリ融解により抽出し、DNAをフェノール:クロロフォルム抽出にて精製し、2倍量の95%エタノールで沈殿させた。DNAをRNaseで処理した後、10UのEcoRIで消化した。消化体を1%アガロースゲル上で視覚化し、陽性クローンを特定した。続いてプラスミドDNAを、陽性クローンの一晩培養体5mlよりQIAprepスピンカラムを用い抽出した(QIAGEN、チャットワース、カリフォルニア)(図31)。次に精製DNAを、内部3’プライマーを使った色素ターミネーターサイクルシークエンシングを用いて配列決定し、プラスミド内の挿入体の方向を決定した。プライマーはクターと挿入体の間の接続部を越えて配列決定できる位置にあり、方向が正確でることが確認された。次に適切な方向にプラスミドを持つ各遺伝子クローンを100mlの培養液柱に増殖し、プラスミドをQIAGEN(チャットワース、カリフォルニア)maxi−prepカラムを使い抽出した。
[SFV内へのクローニング]
SFVベクターへの挿入のために、挿入体とプラスミドを殆ど同様の方法で処理した。SFVベクター100μgを37℃にて1時間、120UのBamHIで処理した(図32)。マイクロピュターEZフィルターを通し遠心して、消化体より酵素を除いた(アミコン、バーバリー、マサチューセッツ)。次にプラスミドをCIP処理した。CIPは加熱し不活性化されてから、プラスミドは再度マイクロピュアEZフィルターにかけられた。挿入体はBamHI消化により精製されたTAクローニングベクターDNAより抽出された。挿入体は前述の如くにして精製され、ベクター内に結合された。InvαF’コンペテント細胞の形質転換に続いて、前述同様にしてプラスミドの挿入及びその方向は色素ターミネーターサイクルシークエンシングにより決定された。各遺伝子について、陽性クローンを利用し大規模プラスミドが調整された。
SFVベクターへの挿入のために、挿入体とプラスミドを殆ど同様の方法で処理した。SFVベクター100μgを37℃にて1時間、120UのBamHIで処理した(図32)。マイクロピュターEZフィルターを通し遠心して、消化体より酵素を除いた(アミコン、バーバリー、マサチューセッツ)。次にプラスミドをCIP処理した。CIPは加熱し不活性化されてから、プラスミドは再度マイクロピュアEZフィルターにかけられた。挿入体はBamHI消化により精製されたTAクローニングベクターDNAより抽出された。挿入体は前述の如くにして精製され、ベクター内に結合された。InvαF’コンペテント細胞の形質転換に続いて、前述同様にしてプラスミドの挿入及びその方向は色素ターミネーターサイクルシークエンシングにより決定された。各遺伝子について、陽性クローンを利用し大規模プラスミドが調整された。
[pSIタンパク発現]
真核細胞のpSI形質転換のために、COS−7細胞を米国標準株コレクション(ATCC)より得た。凍結ストックを15mlのDMEMに10%胎児ウシ血清(FCS)を加えたものに再懸濁した。次に培養体をT−75フラスコ内で単層培養した。トランスフェクションする前の晩に、細胞を0.25%トリプシンEDTA液で処理した後にPBSで洗浄しフラスコより取り出した。次に細胞を集密度〜20%で100mm組織培養皿に接種し、集密度〜50%まで翌日中培養した。トランスフェクトする皿毎に、5mlのDMEM−NuSerum(コラボレイティブバイオメディカルプロダクツ、ベ−スラインドフォールド、マサチューセッツ(Collaborative Biomedical Products、Bedford、MA)を0.2mlのDEAE−デキストラン/クロロキン液と混合した。次に、精製されたpSIプラスミド10μg/mlを混合液に加えた。培地をCOS細胞より吸引し、DMEM−NuSerum/DEAE−デキストラン/クロロキン/DNA液を細胞に加えた。培養体を3.5時間、5%CO2インキュベーター内でインキュベーションし、続いて培地を除き、5mlの10%DMSOのPBS液に交換した。2分後、この液を吸引して除き、細胞を一晩5mlのDMEM/10%FBS中で培養した。翌日、細胞を2枚の100mm培養皿に分けた。3日後、培地を吸引し、形質転換した細胞をPBS/0.5μM EDTAで除いた。PBS/EDTA混合液を細胞に加え、それらを15分間37℃でインキュベーションした。上清を除き、続くPBS洗浄液と合わせた。次に上清と洗浄液を遠心分離した。得られた沈殿をDMEM/FBSに再懸濁し、COS細胞数を測定した。
真核細胞のpSI形質転換のために、COS−7細胞を米国標準株コレクション(ATCC)より得た。凍結ストックを15mlのDMEMに10%胎児ウシ血清(FCS)を加えたものに再懸濁した。次に培養体をT−75フラスコ内で単層培養した。トランスフェクションする前の晩に、細胞を0.25%トリプシンEDTA液で処理した後にPBSで洗浄しフラスコより取り出した。次に細胞を集密度〜20%で100mm組織培養皿に接種し、集密度〜50%まで翌日中培養した。トランスフェクトする皿毎に、5mlのDMEM−NuSerum(コラボレイティブバイオメディカルプロダクツ、ベ−スラインドフォールド、マサチューセッツ(Collaborative Biomedical Products、Bedford、MA)を0.2mlのDEAE−デキストラン/クロロキン液と混合した。次に、精製されたpSIプラスミド10μg/mlを混合液に加えた。培地をCOS細胞より吸引し、DMEM−NuSerum/DEAE−デキストラン/クロロキン/DNA液を細胞に加えた。培養体を3.5時間、5%CO2インキュベーター内でインキュベーションし、続いて培地を除き、5mlの10%DMSOのPBS液に交換した。2分後、この液を吸引して除き、細胞を一晩5mlのDMEM/10%FBS中で培養した。翌日、細胞を2枚の100mm培養皿に分けた。3日後、培地を吸引し、形質転換した細胞をPBS/0.5μM EDTAで除いた。PBS/EDTA混合液を細胞に加え、それらを15分間37℃でインキュベーションした。上清を除き、続くPBS洗浄液と合わせた。次に上清と洗浄液を遠心分離した。得られた沈殿をDMEM/FBSに再懸濁し、COS細胞数を測定した。
[SFVタンパク発現]
SFVベクターによるトランスフェクションをベビーハムスター腎臓(BHK)細胞にて実施した。精製されたプラスミド30μgをSPeIにより1時間、37℃にて消化した。次に酵素をマイクロピュアEZフィルター(アミコン、バーバリー、マサチューセッツ)により除去し、2.5倍量の95%EtOHでDNAを沈殿させた。次に1.5μgのプラスミドをSp6を使ったイン・ビトロ転写用の鋳型として使用した。要約すると、DNAを1時間、37℃にて以下と共にインキュベーションした:転写緩衝液,100mMDTT、10mMG(5’)ppp(5’)G、rNTP混合体、水、RNasin及びSp6RNAポリメラーゼ60U。転写後、反応液を一部取り出し、サンプルを1%アガロースゲル上で目視確認した。転写反応液55μlを使い、T−75フラスコ内に於いて集密度〜80%にてBHK細胞をトランスフェクトした。GMEM培地に10%FCSを加えた培地を細胞より吸引し、Opti−MEM培地と交換した。2分のインキュベーション後、この培地をOpti−MEM培地/9μg/mlのリフォフェクチン/転写RNAと交換した。培養体を2時間、37℃にて5%CO2内で頻繁に手で振盪しながらインキュベーションした。2時間後、培地を取り除き、GMEM−10%FCSと交換した。培養体を7−9時間インキュベーションし、次に細胞をトリプシン処理して除いた。
SFVベクターによるトランスフェクションをベビーハムスター腎臓(BHK)細胞にて実施した。精製されたプラスミド30μgをSPeIにより1時間、37℃にて消化した。次に酵素をマイクロピュアEZフィルター(アミコン、バーバリー、マサチューセッツ)により除去し、2.5倍量の95%EtOHでDNAを沈殿させた。次に1.5μgのプラスミドをSp6を使ったイン・ビトロ転写用の鋳型として使用した。要約すると、DNAを1時間、37℃にて以下と共にインキュベーションした:転写緩衝液,100mMDTT、10mMG(5’)ppp(5’)G、rNTP混合体、水、RNasin及びSp6RNAポリメラーゼ60U。転写後、反応液を一部取り出し、サンプルを1%アガロースゲル上で目視確認した。転写反応液55μlを使い、T−75フラスコ内に於いて集密度〜80%にてBHK細胞をトランスフェクトした。GMEM培地に10%FCSを加えた培地を細胞より吸引し、Opti−MEM培地と交換した。2分のインキュベーション後、この培地をOpti−MEM培地/9μg/mlのリフォフェクチン/転写RNAと交換した。培養体を2時間、37℃にて5%CO2内で頻繁に手で振盪しながらインキュベーションした。2時間後、培地を取り除き、GMEM−10%FCSと交換した。培養体を7−9時間インキュベーションし、次に細胞をトリプシン処理して除いた。
[pQE内へのクローニング]
バクテリア性発現ベクターpQEもネコCD80及びCD28遺伝子を使い構築した。前述同様に調整、精製された切断されCIP処理されたpQEプラスミドをT4DNAリガーゼを使い、50ngのゲル精製されたCD28又はCD80と挿入体:プラスミドモル比1:4で接続された。接続対は16時間、16℃でインキュベーションされた。次に2μlの接続反応液を使いINVαF’コンペテント細胞をトランスフォームした。陽性クローンを選別し、配列決定して挿入方向を確認した。精製プラスミドの大規模調整を実施し、これを用いて塩化ルビジウム処理により反応化されたM15 pREP4細胞をトランスフォームした。形質転換した細胞は50μg/mlのカナマイシン及びアンピシリンを含むLPプレート上で増殖され、これらコロニー中にpQE及びヘルパーpRE4プラスミドが保持されているか確認した。次に陽性クローンをアルカリ融解mini−prep及びBamHI制限消化によりスクリーニングした。挿入体が確認されたコロニーは、将来の利用に備え50%グリセロールストック液内に凍結された。
バクテリア性発現ベクターpQEもネコCD80及びCD28遺伝子を使い構築した。前述同様に調整、精製された切断されCIP処理されたpQEプラスミドをT4DNAリガーゼを使い、50ngのゲル精製されたCD28又はCD80と挿入体:プラスミドモル比1:4で接続された。接続対は16時間、16℃でインキュベーションされた。次に2μlの接続反応液を使いINVαF’コンペテント細胞をトランスフォームした。陽性クローンを選別し、配列決定して挿入方向を確認した。精製プラスミドの大規模調整を実施し、これを用いて塩化ルビジウム処理により反応化されたM15 pREP4細胞をトランスフォームした。形質転換した細胞は50μg/mlのカナマイシン及びアンピシリンを含むLPプレート上で増殖され、これらコロニー中にpQE及びヘルパーpRE4プラスミドが保持されているか確認した。次に陽性クローンをアルカリ融解mini−prep及びBamHI制限消化によりスクリーニングした。挿入体が確認されたコロニーは、将来の利用に備え50%グリセロールストック液内に凍結された。
[結合アッセイ]
ネコCD80及びネコCD28を発現しているトランスフェクト細胞に関し、Linsleyら、1994a既述のプロトコールに従い結合アッセイを実施した。トランスフェクション1日後、CD28を発現するCOS−7細胞をトリプシン−EDTA処理によりT−75フラスコから外した。細胞を24ウェルプレート中に1×105細胞/mlの濃度で接着させた。2日後、feCD80/pSIトランスフェクトCOS−7細胞をPBS/0.5μMEDTAによりT−75フラスコから取り外した。次にこれら細胞を、0.5MのカルセインAM(モレキュラープローブ、ユージン、オレゴン(Molecular Probes、Eugene、OR))の滅菌PBS/1%BSA液を用い、30分間、37℃にて蛍光標識した(AkesonとWoods、1993)。模擬トランスフェクトCOS−7細胞も同様に標識された。次に標識細胞をDMEMに10%FCSを加えた液で3回洗浄し、取り込まれなかった標識体を除き、測定し、単層に直接加えた。2つの細胞集団を1時間、37℃で相互作用させた。単層細胞をDMEM+10%FCSで穏やかなに3回洗浄し、非接着細胞を除いた。洗浄後、各ウェルの蛍光をマイクロプレートフルオロメーター上で定量化した。トランスフェクトされた集団を含むウェルの蛍光を、pSIプラスミド単独でトランスフェクトされたCOS−7細胞にCD80発現細胞を加えたウェルの蛍光と比較された。
ネコCD80及びネコCD28を発現しているトランスフェクト細胞に関し、Linsleyら、1994a既述のプロトコールに従い結合アッセイを実施した。トランスフェクション1日後、CD28を発現するCOS−7細胞をトリプシン−EDTA処理によりT−75フラスコから外した。細胞を24ウェルプレート中に1×105細胞/mlの濃度で接着させた。2日後、feCD80/pSIトランスフェクトCOS−7細胞をPBS/0.5μMEDTAによりT−75フラスコから取り外した。次にこれら細胞を、0.5MのカルセインAM(モレキュラープローブ、ユージン、オレゴン(Molecular Probes、Eugene、OR))の滅菌PBS/1%BSA液を用い、30分間、37℃にて蛍光標識した(AkesonとWoods、1993)。模擬トランスフェクトCOS−7細胞も同様に標識された。次に標識細胞をDMEMに10%FCSを加えた液で3回洗浄し、取り込まれなかった標識体を除き、測定し、単層に直接加えた。2つの細胞集団を1時間、37℃で相互作用させた。単層細胞をDMEM+10%FCSで穏やかなに3回洗浄し、非接着細胞を除いた。洗浄後、各ウェルの蛍光をマイクロプレートフルオロメーター上で定量化した。トランスフェクトされた集団を含むウェルの蛍光を、pSIプラスミド単独でトランスフェクトされたCOS−7細胞にCD80発現細胞を加えたウェルの蛍光と比較された。
相互作用の特異性を示すために、CTLA−4 Ig及びCD80 Ig融合タンパク質(P.Linsley、Bristol−Meyers Squibbから好意により提供された)を使い細胞/細胞相互作用を阻止する競業的結合アッセイを計画した。カルセイン標識後で、CD80発現細胞を単層に加える前に、1μg/mlの濃度のCTLA−4 IgのDMEM/FCSを30分間標識感染細胞とインキュベーションした。細胞は2回DMEM/FCSで洗浄され、単層に加えられた。あるいは、単層中のCD28発現細胞を30分間、CD80と1μg/mlの濃度のDMEM/GCS液中にインキュベーションし、洗浄後蛍光標識されたCD80発現細胞が加えられた。融合タンパク質による結合の阻害は、これらウェル中の蛍光を競合体無しのウェルに観察された結合と比較することで測定された。
[RT−PCR]
トランスフェクトされたCOS細胞は、RT−PCRによりmRNA転写についてもアッセイされた。3日後、RNAがFeCD28、feCD80でトランスフェクトされた、または挿入体なしにトランスフェクトされた細胞より抽出された。RNAは無RNaseDNaseで処理され、DNA汚染の可能性が除かれた。次にオリゴdTプライマー及びMuMLV逆転写酵素を利用して、RNA0.5μgをcDNAに逆転写した。次に各cDNAサンプルはCD28、CD80,及びG3PDHに対し特異的なプライマーのセットといかの温度サイクルにより増幅された:95℃、5分1サイクル;95℃、30秒、55℃、30秒、72℃、30秒;30サイクル;72℃5分、1サイクル。次に各反応体20μlを1%アガロースゲル上で視覚化した。
トランスフェクトされたCOS細胞は、RT−PCRによりmRNA転写についてもアッセイされた。3日後、RNAがFeCD28、feCD80でトランスフェクトされた、または挿入体なしにトランスフェクトされた細胞より抽出された。RNAは無RNaseDNaseで処理され、DNA汚染の可能性が除かれた。次にオリゴdTプライマー及びMuMLV逆転写酵素を利用して、RNA0.5μgをcDNAに逆転写した。次に各cDNAサンプルはCD28、CD80,及びG3PDHに対し特異的なプライマーのセットといかの温度サイクルにより増幅された:95℃、5分1サイクル;95℃、30秒、55℃、30秒、72℃、30秒;30サイクル;72℃5分、1サイクル。次に各反応体20μlを1%アガロースゲル上で視覚化した。
ネコCD28及びCD80に関する遺伝子は3種類のタンパク質発現ベクター(pSI、SFV及びpQE)中に上手く挿入された。各ベクター内に接続された後、遺伝子を利用してINVαF’コンペテント細胞を形質転換した。図33−38は、適当なcDNA挿入体を持つベクターを示す。
結合アッセイを実施し、機能的タンパク質が発現できることが示された。初期アッセイを実施し、CD28とCD80トランスフェクトCOS−7及びCD28トランスフェクト並びに模擬トランスフェクトCOS−7細胞の結合間の関連が決定された。蛍光標識された非接着CD80トランスフェクト細胞が加えられたウェル中の蛍光は、初期2回希釈のコントロールウェルに比べると高かった。相互作用は容量反応的であり、初期2回希釈後の蛍光保持率は接着細胞が模擬トランスフェクトコントロールと同様に表面細胞を発現しているウェルの率と同じであった(図39)。
この相互作用が阻害可能であるか示すために、混合前にトランスフェクトされた細胞株を対応する可溶性レセプターとインキュベーションした。5×105及び1×105細胞の濃度では、CD28及びCD80発現COS細胞を含むウェル中の蛍光は、前回の実験で観察されたものに近いものであった。接着細胞を混合前にCD80Ig対応レセプターとインキュベーションしたウェルでは、蛍光保持率はコントロールの模擬トランスフェクトウェルのものと同等であたあった。しかし、CD80pSIでトランスフェクトされたCOS細胞を、CD28 pSIトランスフェクト細胞に曝される前に可溶性CTLA−4とインキュベーションすると、蛍光は完全には阻害されなかった。レベルは非阻害群に見られる程十分ではないものの、コントロール又はその他の実験群に比べると明らかに大きかった(図40)。
RT−PCRをpSI−CD28、pSI−CD80で形質転換された、及び模擬トランスフェクトされたCOS−7細胞のRNAについて実施し、細胞株中に各遺伝子に特異的なmRNAが存在していることを示した。図32は、各細胞株の1%アガロースゲルを示す。G3PDHの遺伝子は各セットで増幅されており、RNAが保全されていること、そして模擬トランスフェクトセットが陽性コントロールとなることが示された。CD80 pSIトランスフェクトCOS−7細胞はCD80mRNA及びG3PDHメッセージを発現したが、CD28pSIトランスフェクトCOS−7細胞は、CD28とGPDHの遺伝子を発現した。模擬トランスフェクト細胞はG3PDHのみを発現した(図41)。
[考察]
好適な抗体を欠くことは、ペプチド発現を示す直接アッセイが実施できないことを意味する。市販の抗−huCD28及び抗−huCD80モノクローナル抗体を分離されたリンパ細胞上で試験し、交叉反応性があるか調べた。細胞上の抗体を用いたFACS分析はPCRにより確認され、いずれの表面タンパク質に関するメッセージも発現されていなかった。このことを抗体がpSIトランスフェクトした細胞上の表面発現を認識しないという事実を考え合わせると、これら抗体は交叉反応的でないと結論される。CD80抗体は交叉反応することは期待できなかった。ヒトとネコのCD80分子の間の相同性は限定的であることは、モノクローナルな抗体の交叉反応性の可能性を制限するだろう。しかし、抗−huCD28は交叉反応的でないことはいささか以外であった。クローン化されたCD28分子間には高い保存性があるにも関わらず、市販の抗−huCD28抗体はマウスタンパク質と交叉反応を示さなかった。抗−huCD80抗体同様、huCD28モノクローナル抗体の試験は失敗した。即ち、ペプチドが発現される可能性を示すことができるだけでなく、それが機能的であり相互作用できることも示すアッセイを考案する必要があった。
好適な抗体を欠くことは、ペプチド発現を示す直接アッセイが実施できないことを意味する。市販の抗−huCD28及び抗−huCD80モノクローナル抗体を分離されたリンパ細胞上で試験し、交叉反応性があるか調べた。細胞上の抗体を用いたFACS分析はPCRにより確認され、いずれの表面タンパク質に関するメッセージも発現されていなかった。このことを抗体がpSIトランスフェクトした細胞上の表面発現を認識しないという事実を考え合わせると、これら抗体は交叉反応的でないと結論される。CD80抗体は交叉反応することは期待できなかった。ヒトとネコのCD80分子の間の相同性は限定的であることは、モノクローナルな抗体の交叉反応性の可能性を制限するだろう。しかし、抗−huCD28は交叉反応的でないことはいささか以外であった。クローン化されたCD28分子間には高い保存性があるにも関わらず、市販の抗−huCD28抗体はマウスタンパク質と交叉反応を示さなかった。抗−huCD80抗体同様、huCD28モノクローナル抗体の試験は失敗した。即ち、ペプチドが発現される可能性を示すことができるだけでなく、それが機能的であり相互作用できることも示すアッセイを考案する必要があった。
ネコCD80及びCD28のcDNAは一連の発現ベクター内に上手く挿入された。pSIベクターは結合アッセイに求められる全ての条件を満たしたが、他のベクターは今後のタンパク発現を促進するだろう。
トランスフェクション後、COS−7形質転換細胞株によるCD28及びCD80mRNAの発現はRT−PCRにより確認された。PCR反応前のRNAに対するDNase処理は、ゲノミック又はプラスミドDNAの汚染の確立を有意に下げるだろう。更にCOS−7細胞が天然にいずれのリガンドも発現するとは思われず、これは模擬トランスフェクトコントロールではいずれの表面タンパク質のメッセージも欠いていたことにより更に確認された。トランスフェクトされた細胞のRNAからの適当なメッセージの増幅は、細胞内にpSIの鋳型が存在しており、そしてプラスミドによりコードされたメッセージが転写されることを示していると考えられる。
Peter Linsleyにより実施された結合アッセイに従い実施アッセイをモデル化し、ヒトCD80及びCD86が同様の結合力を持つことを示した(Linsleyら、1994a)。改良されたフォーマットを使い、表面に発現されたネコCD28が表面に発現されたCD80と結合すること、そして相互作用が可溶性レセプターにより阻害されることを示した。結合のレベルは特異的ウェル中の蛍光標識細胞の保持率より推測できた。蛍光プレートリーダーを使用したことから、蛍光測定前に細胞を融解する必要はなかった。
初期アッセイは、蛍光標識されたCD80−pSIトランスフェクトCOS細胞の保持率は、接着細胞が模擬トランスフェクトされたウェルに比べ接着細胞がCD28−pSIでトンランスフェクトされたウェルでより大きいことを示した。コントロール細胞、挿入体を欠いたpSIでトランスフェクトされた模擬COS細胞により、ベクターの存在、トランスフェクションのプロセスそのもの、あるいは細胞の接着特性だけではCD80及びCD28を発現する表面間の相互作用により伝達されう細胞間の接着を生じないことを示した。1×106細胞の初期希釈では、細胞がCD28を発現しているウェル中の蛍光は、蛍光標識されたCD80トランスフェクト細胞が模擬トランスフェクト細胞を含むウェルに加えられたウェルの蛍光に比べて約5倍高いかった。5×105細胞では、蛍光は細胞数の減少により有意に低下したが、そのレベルはまだコントロールの蛍光に比べ有意に高かった。1×105細胞の濃度では、実験とコントロールとの差は統計的に識別できず、1×104ではそれらはほぼ同一であった。このアッセイは、相互作用がCD80トランスフェクト細胞とCD28トランスフェクト細胞間で起こっており、その結果蛍光標識CD80トランスフェクト細胞がウェル中に保持されたことを示している。しかし、接着細胞が表面タンパク質を発現しない場合には、CD80トランスフェクト細胞は穏やかな洗浄により除かれた。この作用は滴定可能であり、1×104細胞ではウェル中の蛍光は実質同一であった。相互作用が起こっているか確認するために、可溶性れせぷたーを導入しCD28/CD80相互作用を阻害した。
第2アッセイは、接着相手との相互作用を阻害することを目的とした、各ペプチドに対応したレセプターの可溶型の導入が含まれた。2種類の細胞を混合する前に、CD80の可溶性レセプター、huCTLA−4Ig及びCD28の可溶性レセプター、huCD80−Igを、各分子に対応するレセプターを発現しているトランスフェクトされたCOS細胞とインキュベーションした。可溶性タンパク質はネコ起源ではないが、ヒト分子に提案されている結合領域と、ネコ分子の類似領域との間の保存性のレベルより十分に交叉反応性があると考えられた。更に、ヒト融合パートナーはマウスの該当レセプターと結合する(P.Linsley、私信)。アッセイに必要な細胞の数から、1×106細胞を使ったアッセイの実施は不可能であった。第1濃度は5×105細胞であり、CD28/CD80トランスフェクト細胞単独では前回の実験で観察されたと同様の平均蛍光を示した。なぜ可溶性CD80レセプターとインキュベーションした接着細胞が模擬トランスフェクトされたコントロールに近い蛍光を示し、非接着CD80トランスフェクト蛍光標識細胞が可溶性CTLA−4とインキュベーションされた場合に約2ないし3倍高い蛍光をしめすのかは不明である。可溶性レセプターのタイプにより差はあるものの、レセプターが存在しないウェル中に比べて可溶性レセプターが導入されたウェルでは、蛍光量は大きく減少した。これまでのアッセイにより示された相互作用は、細胞を混合する前に適当な可溶性の相手方レセプターを導入することで阻害できた。
表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、一般にはこのタイプのアッセイに好適であるが、適当な試薬が存在しない場合、機能的な相手方レセプターがある場合に可能なフォーマットであることを意味している。競合的結合アッセイと組み合わせた初期結合アッセイの結果より、機能的ネコCD80及びCD28cDNAが分離されたことが確認され、更にメッセージにより発現されたタンパク質が機能的に無傷であることも確認された。このタイプの結合アッセイの応用性には限界があるものの、機能的表面発現及び相互作用の可能性を示す有効なシステムである。
[例8]
[感染]
[序]
Lwoffはウイルスを”感染期を有する厳密に細胞内及び強力な病原体にあって、1)1種類の核酸を有し、2)その遺伝的材料の形状を複製し、3)2分裂で増殖及び分裂できず、そして4)Lippmannシステムから外れるもの”と定義した(Lwoff、1957)。ウイルスは自然界では非細胞性であり、そのゲノムはRNA又はDNAであり、感染宿主細胞によりビリオン粒子の合成を方向付ける(LuriaとDarnell、1968)。ウイルス疾患は、B7/CD28シグナル伝達複合体の実務的応用を示すことができる興味深いシステムである。レトロウイルスの中では、ヒトに於けるHIV感染及びネコに於けるネコ免疫不全ウイルス(FIV)が、CD4+T細胞の排除を通し生ずると仮定されている正常免疫機能の破壊をもたらす(Fauciら、1984;Pedersenら、1987)。CD28/CD80シグナル伝達複合体は病気にある役割を持ち、レセプター発現の操作により感染を軽減できると考えられている(Harlanら、1995)。
[感染]
[序]
Lwoffはウイルスを”感染期を有する厳密に細胞内及び強力な病原体にあって、1)1種類の核酸を有し、2)その遺伝的材料の形状を複製し、3)2分裂で増殖及び分裂できず、そして4)Lippmannシステムから外れるもの”と定義した(Lwoff、1957)。ウイルスは自然界では非細胞性であり、そのゲノムはRNA又はDNAであり、感染宿主細胞によりビリオン粒子の合成を方向付ける(LuriaとDarnell、1968)。ウイルス疾患は、B7/CD28シグナル伝達複合体の実務的応用を示すことができる興味深いシステムである。レトロウイルスの中では、ヒトに於けるHIV感染及びネコに於けるネコ免疫不全ウイルス(FIV)が、CD4+T細胞の排除を通し生ずると仮定されている正常免疫機能の破壊をもたらす(Fauciら、1984;Pedersenら、1987)。CD28/CD80シグナル伝達複合体は病気にある役割を持ち、レセプター発現の操作により感染を軽減できると考えられている(Harlanら、1995)。
FIVはヒトに於けるHIVに極めて良く似た一連の臨床及び臨床下症状を起こす、飼いネコにとって重大な臨床問題である(Pedersenら、1987)。FIVに関する情報が集まるにつれ、これがヒトAIDSの動物モデルとして相応しいことが明らかとなり、ヒトに於ける病気の進行を極めてよく模擬する非霊長類モデルであることが明らかになった(Siebelink、1990)。分子、生物学及び病理学的類似性からも、HIV研究で得られた情報の多くがネコに於けるFIV感染の理解を促進することを示唆された。
まず、HIV感染はセロコンバージョン時期付近の症状に似た単核細胞症の発生を伴う一過性の白血球減少により顕在化する(Clarkら、1991)。短期のCD4+T細胞集団の減少とCD8+T細胞の増加、その結果としてCD4:CD8比の減少が起こり、これが病気の無症候性気管中の病気の進行をもたらす(Cooperら、1984)。AIDS関連症状の出現まで、CD4+T細胞集団は大きく損なわれ、病気が終末期に進行すると全リンパ細胞集団は劇的に減少する(Fauciら、1984)。初期のリンパ細胞減少症はおそらく他のウイルス疾患に見られるものと同じコルチコ−ステロイド誘導による免疫細胞集団のシフトによるものであるが、その後のCD4+T細胞の消失とCD8+T細胞の増加はウイルス増殖及び病理発生に関係すると考えられている(FauciとDale、1975;Fauciら、1984)。適当なモデルシステムの開発は、感染及びウイルス誘導疾患のメカニズムをさらに推測する上で重要なステップである。
FIV、Tリンパ栄養性レトロウイルスはまず繰り返し慢性感染症を起こすカリフォルニアのネココロニーで報告された(Pedersenら、1987)。病気それ自体はヒトでのHIVに似た様式で発症し、分類学的には遠く関連するものであるが、抗原性としてはヒトのAIDS原因因子とは異なるものである(Siebelinkら、1990)。感染の伝播はHIV同様に感染した体液を開始起こるが、性的感染が一次感染経路であったHIVとは異なり、FIVでは感染の大部分は噛みつきによる唾液を介し起こる(Yamamotoら、1989)。感染経路に違いはあるものの、免疫不全症状が起こることはヒトに於ける関連疾患の最善のモデルの1つである(Siebelinkら、1990)。
FIVの臨床進行はHIVに似ており、病気は5つの臨床段階に分類される。初期段階は発熱、悪寒そしてリンパ性疾患により特徴つけられ、感染後長期間の無症状期が続き、体重減少や2次及び日和見感染が多発する最終の3段階まで進行する(Englishら、1994)。細胞性の感染の経路も同一であるかは不明であるが、FIVはCD4+T細胞及びCD8+T細胞を指向している(Brwonら、1991)。ウイルス感染した動物は、おそらく融合細胞形成と細胞融解によるCD4+T細胞活性の減少を経験する(SIebelinkら、1990)。感染の最終段階の開始に一致して、重大なCD4+T細胞の消失と、CD4:CD8比の低下が起こる(Novotneyら、1990)。HIV及びFIVが誘導する疾患は同様の様式でCD4+T細胞消失を起こすものではないが、生じる表現形及び免疫系の破壊は極めて類似した様式にて表現される。
CD4+T細胞へのHIVの感染は正常免疫反応の発生に有害な作用を及ぼすことは明らかであるが、免疫不全をもたらす相互作用の正確なメカニズムについては結論されていない。感染後期では、CD4+T細胞の減少をもたらす事象は特定されない(Connorら、1993)。細胞融合体の形成、アポトーシスの誘導、CTLによる排除は全てHIV感染に於けるT細胞集団を低下することが示されている(SchattnerとLaurence、1994;Fouchierら、1996)が、CD28を介したメカニズムについても提言されている(Haffarら、1995)。感染T細胞株は同種抗原刺激を受けるとタンパク質及びmRNAの両レベルにおいてCD28の発現をダウンレギュレーションすることが示されている(Haffarら、1995)。これまでに考察した様に、CD28交叉結合はT細胞反応の成熟化にとって重要な刺激である(Linsleyら、1991a)。もしHIV感染がCD28の表面発現のダウンレギュレーションをもたらすのであれば、提示された抗原を認識する感染T細胞は感染に活性化されるのではなくアポトーシスを起こすだろう(SchattnerとLaurence、1994)。アポトーシスはHIV感染細胞死の正常メカニズムであるが、この経路は随伴性T細胞の排除の追加寄与因子でもある(Brinchmannら、1994)。
CD8+CTLは、AIDS感染個体中に見られる長期無進行を伴う高レベルCTLを有するHIV長期生存例の発生に関係している(Landayら、1994)。逆に、液性免疫はレンチウイルス関連疾患の治療においては一般に無効であるばかりでなく、抗体も実際には病気を増悪化することが示されている(Lombardiら、1994;Siebelinkら、1995)。HIV感染と随伴する免疫不全の最終臨床段階の発生は、多くの患者において細胞性の1型反応から液性の2型反応への切り替えに関連している(SchttnerとLaurence、1994)。これに一致して、CD8+CTLを介した抗ウイルス活性の低下に関係する健康な状態からAIDSへの進行が観察される(Lewisら、1994)。CD8+CTL上でのCD28の発現も抗ウイルス活性に関係しており、感染患者の中のCD8集団でのCD28の発現には強いCTLを介した抗ウイルス活性が伴うと考えられている。(Landayら、1993)。
HIV抵抗性の促進に必要なメディエイターとされているCD28の表面発現は、感染及び悲感染T細胞が存在する状態においてHIVにより有害な影響を受ける(Carusoら、1994)。HIV感染の無症候期の開始、CD28を有するCD4+及びCD8+T細胞の割合の低下が認められる(Lewisら、1994)。これは感染初期に見られるサイトカイン分泌パターンの異常(Carusoら、1994)及び、後期段階に於けるCD8+T細胞反応の変化(Zanussiら、1996)によると考えられている。、CD28発現CD8+T細胞がIL−2に反応し増殖することから、HIV感染個体では初期段階のCD8+T細胞の増殖低下はCD28のダウンレギュレーションに関連すると考えられている(Brinchmannら、1994)。残念なことに、感染個体ではCD28−、CD28+T細胞はCD8+集団の75%を構成しているのに対し、正常個体ではそれらは集団の25%に過ぎない(Sakkonenら、1993)。即ち、CD8+集団は感染個体中に正常に保持されてはいるが、感染初期においてさえこれら集団では効果的な抗ウイルス免疫反応を生じることができる集団の有効性に有害な作用が及んでいる(Carusoら、1994)。
研究は、CD28シグナル伝達もウイルスの活動に関係することを示している(Asjoら、1993;Smithgallら、1995)。抗CD3及び抗CD28によるHIV感染末梢血CD4+T細胞の共刺激は、抗CD3単独による刺激に比べより高いウイルス複製をもたらす(Smithgallら、1995)。この反応はCD80レセプターの可溶型であるCTLA−4を添加することで無効にでき、抗−IL−2により軽減される(Smithgallら、1995)。感染CD4+T−リンパ細胞を用いた別の研究は、患者の40%に於いて、追加刺激を必要とせずCD28結合のみでウイルス生産がアップレギュレーションされることを示した(Asjoら、1993)。
リンパ細胞集団をHIV表面糖タンパクgp120で前処理すると、APC表面上のCD80のダウンレギュレーションが起こる(Chirmule、1995)。T細胞上でのCD28の発現はHIV感染によりダウンレギュレーションされると思われるが、これら細胞上でのCD80の発現はアップレギュレーションされる(Haffnerら、1993)。これは感染が未感染T細胞に伝播するメカニズムが、未感染T細胞上のCD28と感染T細胞上のCD80間の相互作用が細胞と細胞の接触を促進してウイルスの移動を起こすものであることを提言している(Haffarら、1993)。
HIVに於けるCD28の効果が調べられる一方で、FIVに於ける表面タンパクの役割については識別されていない。もしネコについてヒトシステムに観察されたものと同様の結果が示されれば、ネコのレトロウイルスモデルとしての有用性が更に確認されるだろう。
[材料と方法]
[イン・ビボ感染]
3匹の成体特異的無病原体(SPF)メスネコに、FIVウイルスのメリーランド株、1×105のTCID50を静脈注射した。2匹の同様の雌ネコにウイルスを含まない血清で疑似感染し、コントロールとして利用した。感染前及び7週間毎週1飼い血液を抽出した。感染第一週では、ネコは毎日2飼いモニターされ、注射による初期反応がおきていないことを確認した。感染が進行した場合、動物は毎日モニターされた。臨床的疾患の急性期では、毎週5−10mlの血液を採取しCBC測定及びPBMC分離を行った。CBCはディップ−クイック血液スメアー中の細胞型を計測し、決定した(ジョルゲンセンラブ、ラブランド、コロラド(Jorgensen Lab、Loverland、CO)。
[イン・ビボ感染]
3匹の成体特異的無病原体(SPF)メスネコに、FIVウイルスのメリーランド株、1×105のTCID50を静脈注射した。2匹の同様の雌ネコにウイルスを含まない血清で疑似感染し、コントロールとして利用した。感染前及び7週間毎週1飼い血液を抽出した。感染第一週では、ネコは毎日2飼いモニターされ、注射による初期反応がおきていないことを確認した。感染が進行した場合、動物は毎日モニターされた。臨床的疾患の急性期では、毎週5−10mlの血液を採取しCBC測定及びPBMC分離を行った。CBCはディップ−クイック血液スメアー中の細胞型を計測し、決定した(ジョルゲンセンラブ、ラブランド、コロラド(Jorgensen Lab、Loverland、CO)。
PBMCはヒストパーク勾配(シグマ、セントルイス、ミズリー)上に分離し、血液より抽出された。アルスエバー(Alsever)液で初回洗浄した後、〜5×105細胞を取り出し、48ウェルプレートの5つのウェルに分割して入れた。細胞は500μlの完全RPMIに懸濁され、続いてCD4又はCD8に対し作製された抗体で標識された。1時間室温にて、緩やかに揺すりながらインキュベーションした後、細胞を2回PBSで洗浄した。
洗浄後、2次抗体、ヤギ抗マウスIgG(H+L)FITC標識(KP&L、ガイサーブルグ、メリーランド)を1:500の濃度で加え、室温にて緩やかに揺すりながら1時間インキュベーションした。続いて細胞を3回PBSで洗浄し、3.7%のフォルムアルデヒドにて固定した。次に蛍光標識した集団をFACSCaliburフローサイトメターター上で定量化した。
残ったPBMCを更に1回、10mlのアルスエバー液で洗浄した。遠心分離後、上清を取り出し、RNA抽出用のULTRASPEC(バイオテックス、ヒューストン、テキサス)を1ml加えた。RNAは前述同様にして精製、沈殿した。次に、分光光度計にて260nmの吸光度を測定し、定量化した。続いてRNAを50μlのDEPC処理水に再懸濁し、使用時まで−70℃に凍結した。
[半定量的RT−PCR]
サンプルのRNAをPCR増幅する前に、最終瀉血ネコより60mlの血液を歳出した。PBMCは前述同様に単離された。細胞はヘマサイトメーターを用い計測され、5×105細胞/mlの濃度で4つのフラスコに分けられた。前記同様に遠心分離し、ULTRASPECを用いて細胞沈殿よりRNAを抽出する前に細胞はConAにより0、8、16及び24時間刺激を受けた。RT−PCRはRNA1.5μgからMMLV逆転写酵素と3’プライマーを使いcDNAを転写し、実施した。RNA、dTプライマー及びDEPC処理dH2Oを5分間、70℃でインキュベーションしRNAの2次構造を取り除き、プライマーをアニーリングできるようにした。次に転写緩衝液、MgCl2,dNTP及びDTTを加え、混合液を2時間、42℃でインキュベーションした。次に逆転写酵素1μlを加え、反応をさらに30分間続けさせた。25μlのRT反応液の中の4μlを次にCD80増幅用のチューブ3本及びCD28増幅用のチューブ3本にそれぞれ加えた。
サンプルのRNAをPCR増幅する前に、最終瀉血ネコより60mlの血液を歳出した。PBMCは前述同様に単離された。細胞はヘマサイトメーターを用い計測され、5×105細胞/mlの濃度で4つのフラスコに分けられた。前記同様に遠心分離し、ULTRASPECを用いて細胞沈殿よりRNAを抽出する前に細胞はConAにより0、8、16及び24時間刺激を受けた。RT−PCRはRNA1.5μgからMMLV逆転写酵素と3’プライマーを使いcDNAを転写し、実施した。RNA、dTプライマー及びDEPC処理dH2Oを5分間、70℃でインキュベーションしRNAの2次構造を取り除き、プライマーをアニーリングできるようにした。次に転写緩衝液、MgCl2,dNTP及びDTTを加え、混合液を2時間、42℃でインキュベーションした。次に逆転写酵素1μlを加え、反応をさらに30分間続けさせた。25μlのRT反応液の中の4μlを次にCD80増幅用のチューブ3本及びCD28増幅用のチューブ3本にそれぞれ加えた。
次に10×PCR緩衝液、dNTP及びCD28又はCD80特異的プライマーの混合液をcDNAに加えた。CD80用プライマーは次の取りである:
B7−S220 5’プライマー:5’ CAT GTC TGG CAA AGT ACA AG
B7−284 3’プライマー:TTA TAC TAG GGA CAG GGA AG。
B7−S220 5’プライマー:5’ CAT GTC TGG CAA AGT ACA AG
B7−284 3’プライマー:TTA TAC TAG GGA CAG GGA AG。
一方CD28用プライマーは次の通りである:
CD28 5’スタート:CGC GGA TTC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG
CD28−239 3’:ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC。
CD28 5’スタート:CGC GGA TTC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG
CD28−239 3’:ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC。
次に、各産物のチューブ3本を95℃で5分間でインキュベーションした後、2.5μlのTaqポリメラーゼを含む水10μlを各チューブに加えた。反応液を以下の温度プロフィールのサイクルにかけた:95℃、30秒、55℃、30秒、そして72℃、30秒。チューブを20、25及び30サイクル時にそれぞれ取り出した。各反応体より20μlを1%アガロースゲル上で視覚化した。アガロースゲルの写真を撮影し、産物が出現するサイクル数を決定した。この様な予備実験の後、前もって感染動物及びコントロール動物から抽出しておいたRNAを同様にして増幅した。
[イン・ビトロ感染]
イン・ビトロにてFIV感染T細胞株をConAにより0時間、及び16時間刺激し、CD28及びCD80の発現を判定量的RT−PCR法を利用しアッセイした。FETJ細胞株は増殖培地中にIL−2が無くとも増殖する混合T細胞集団である。これら細胞の独立した亜集団をFIVウイルスのメリーランド株及びペタルマ(Petaluma)株に暴露した。約2000万個の正常FETJ、ペタルマ感染FETJ及びメリーランド感染FETJを、8μg/mlのConAにより0及び16時間刺激した。インキュベーション後、これら細胞からULTRASPEC RNA抽出試薬(バイオテックス、ヒューストン、テキサス)を使いRNAを抽出し、前述同様に精製した。
イン・ビトロにてFIV感染T細胞株をConAにより0時間、及び16時間刺激し、CD28及びCD80の発現を判定量的RT−PCR法を利用しアッセイした。FETJ細胞株は増殖培地中にIL−2が無くとも増殖する混合T細胞集団である。これら細胞の独立した亜集団をFIVウイルスのメリーランド株及びペタルマ(Petaluma)株に暴露した。約2000万個の正常FETJ、ペタルマ感染FETJ及びメリーランド感染FETJを、8μg/mlのConAにより0及び16時間刺激した。インキュベーション後、これら細胞からULTRASPEC RNA抽出試薬(バイオテックス、ヒューストン、テキサス)を使いRNAを抽出し、前述同様に精製した。
MCH5.4は慢性的にFIVに感染される株ではないが、繰り返しFIVに感染したコロニーのネコに由来するT細胞株である。約2000万個のMHC5.4細胞を遠心して沈殿し、5mlの濃FIV感染上清中に再懸濁した。細胞をこの濃度で5%CO2中に30分間インキュベーションして、その後濃度を〜5×105細胞に調整し、24時間培養した。正常及び感染したMHC5.4を、8μg/mlのConAにより0及び16時間刺激した。インキュベーション後、これら細胞からULTRASPEC RNA抽出試薬(バイオテックス、ヒューストン、テキサス)を使いRNAを抽出し、前述同様に精製した。
[ノーザンブロッティング]
ノーザンブロッティング分析のために、260nmの分光光度分析によりRNA濃度を決定した。各RNAサンプル15μlを3μg/μlの濃度に濃縮し、3倍量のサンプルローディングバッファー中に再懸濁した。次にサンプルを70℃で15分間加熱し、RNAを変性して2次構造をトリの自他。サンプル20μl量を1%の変性アガロースゲルにかけ、70ボルト、2.5時間、ブロモフェノールブルーがゲル底部の2cm以内に達するまで電気泳動した。次にRNAをゲルからジーンスクリーン(Genescreen)ナイロン膜(Dupont NEN、Boston、MA)に下方毛細管作用を利用し転写した。RNAは低強度のUV光で3分間処理し膜上にUV交叉結合され、続いてUVシャドウイングを利用して各レーンについてリボソーマルバンド強度を視覚化した。
ノーザンブロッティング分析のために、260nmの分光光度分析によりRNA濃度を決定した。各RNAサンプル15μlを3μg/μlの濃度に濃縮し、3倍量のサンプルローディングバッファー中に再懸濁した。次にサンプルを70℃で15分間加熱し、RNAを変性して2次構造をトリの自他。サンプル20μl量を1%の変性アガロースゲルにかけ、70ボルト、2.5時間、ブロモフェノールブルーがゲル底部の2cm以内に達するまで電気泳動した。次にRNAをゲルからジーンスクリーン(Genescreen)ナイロン膜(Dupont NEN、Boston、MA)に下方毛細管作用を利用し転写した。RNAは低強度のUV光で3分間処理し膜上にUV交叉結合され、続いてUVシャドウイングを利用して各レーンについてリボソーマルバンド強度を視覚化した。
ネコCD28特異的プローブをランダムプライムcDNA標識を利用し作った。完全長のCD28分子をTAクローニングベクターより、フランキングEcoRI部位を利用して切り出された。断片はゲル電気泳動及により精製され、アミコンゲルネブライザー(アミコン、バーバリー、マサチューセッツ)を使いアガロースより抽出された。精製産物25ngをランダムデカマーと5分間、95℃でインキュベーションし2次構造を除いた(アンビオン、オースチン、テキサス)。反応液を液体窒素中で急激凍結し、dATPを架空dNTP及びP32αdATPを混合液に加えた。37℃で1分間インキュベーションした後、クレノーDNAポリメラーゼを1μl加え、混合液を30分間インキュベーションした。反応は0.5MのEDTAを1μl加え停止し、続いてセファデックスG−50スピンカラム(シグマ、セントルイス、MO)にて精製し取り込まれていない放射標識ヌクレオチドを除いた。反応液1μlは1mlのシンチレーション液中に希釈され、プローブの活性をシンチレーションカウンターにより決定した。ブロットは5mlのRapid Hybハイブリダイゼーション液(アマシャムライフサイエンス、クリーブランド、オハイオ)中に、15分間、65℃で前ハイブリダイゼーションされた。3−5×106cpm/μlの濃度のプローブを5μlを各ブロットに加え、回転しながら1.5時間、65℃にてインキュベーションした。プローブを取り除き、ブロットを室温において2回、1%のSSC/0.1%SDSを用いて15分間、洗浄した。次にブロットをガイガーカウンターでスキャンし、必要に応じて65℃で再度洗浄を行った。標識はBetaGenスキャニング装置上で定量測定された。65℃、15分の最終洗浄を行い、ブロットを増感スクリーンと共にフィルムの上、16−24時間、−70℃で置いた。オートラジオグラフを現像し、バンドをデンシトメーターで定量化した。RNAの保全性と濃度は、同様の方法により標識しハイブリダイズされたG3PDH特異的プローブ(J.Piedrahita教授、テキサスA&M大学、より好意により提供された)を使い確認された。
[イン・ビトロ感染細胞からの半定量的RT−PCR]
CD28の存在は、さらに半定量的PCRにより測定された。前述の如く、抽出されたRNAの濃度は260nmに於ける分光光度測定値より推定された。RNA2μg(最終容積25μl)をオリゴdTプライマーとMMLV逆転写酵素を使い、前述同様にしてcDNAに転写した。次にRT反応液3.5μlを7本のPCRチューブに移した。3本のチューブはCD80特異的プライマーを用いて増幅され、3本はCD28特異的プライマーを用い増幅され、残りの1本のチューブはG3PDH特異的プライマーを使い増幅された:
G3PDH 5’:CCT TCA TTG ACC TCA ACT ACT ACA T
G3PDH 3’:CCA AAG TTG TCA TGG ATG ACC。
CD28の存在は、さらに半定量的PCRにより測定された。前述の如く、抽出されたRNAの濃度は260nmに於ける分光光度測定値より推定された。RNA2μg(最終容積25μl)をオリゴdTプライマーとMMLV逆転写酵素を使い、前述同様にしてcDNAに転写した。次にRT反応液3.5μlを7本のPCRチューブに移した。3本のチューブはCD80特異的プライマーを用いて増幅され、3本はCD28特異的プライマーを用い増幅され、残りの1本のチューブはG3PDH特異的プライマーを使い増幅された:
G3PDH 5’:CCT TCA TTG ACC TCA ACT ACT ACA T
G3PDH 3’:CCA AAG TTG TCA TGG ATG ACC。
前述の如く、チューブは20、25及び30サイクル時に取り出された。各サンプル20μlを1%アガロースゲル上で視覚化した。更に、特定T細胞に由来するサイトカインの存在についても、FETJ及びMHC5.4細胞由来のRNAと同様にしてアッセイされた。以下の特異的プライマー;
IL−2 5’:CCA CCC CAA ACT CTC CAG GAT G
IL−2 3’: GGT CAG CGT TGA GAA GAT GCT TTG
IL−4 5’:TAT TAA TGG GTC TCA CCT ACC
IL−4 3’:TTG GCT TCA TTC ACA GAA CAG
IFNγ 5’:GGG TCG CTT TTC GTA GAC ATT TTG
IFNγ 3’:CAG GCA GGA CAA CCA TTA TTT C
を使い、1.25μgのRNAよりcDNAを増幅した。転写反応の20%は各サイトカインのために増幅された。残りのcDNAはG3PDH特異的プライマーを使い増幅された。cDNAは以下のパラメータにより30サイクル増幅された:95℃5分、1サイクル;95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒、30サイクル;72℃5分1サイクル。次に反応液20μlを1%アガロースゲル上で視覚化した。
IL−2 5’:CCA CCC CAA ACT CTC CAG GAT G
IL−2 3’: GGT CAG CGT TGA GAA GAT GCT TTG
IL−4 5’:TAT TAA TGG GTC TCA CCT ACC
IL−4 3’:TTG GCT TCA TTC ACA GAA CAG
IFNγ 5’:GGG TCG CTT TTC GTA GAC ATT TTG
IFNγ 3’:CAG GCA GGA CAA CCA TTA TTT C
を使い、1.25μgのRNAよりcDNAを増幅した。転写反応の20%は各サイトカインのために増幅された。残りのcDNAはG3PDH特異的プライマーを使い増幅された。cDNAは以下のパラメータにより30サイクル増幅された:95℃5分、1サイクル;95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒、30サイクル;72℃5分1サイクル。次に反応液20μlを1%アガロースゲル上で視覚化した。
[感染を決定するRT−PCR]
FETJ及びMCH5.4細胞の感染はgag特異的配列のRT−PCR増幅により確認された。1.25μgの濃度のRNAを前述のパラメターに従い、MMLV RT及びgag特異的3’プライマーを使用しcDNAに転写した。RT反応液10μlは以下のパラメータによるホットスタートPCRにより増幅された。95℃5分;95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒、30サイクル;72℃5分。増幅後、各反応液20μlを1%アガロースゲル上で視覚化された。
FETJ及びMCH5.4細胞の感染はgag特異的配列のRT−PCR増幅により確認された。1.25μgの濃度のRNAを前述のパラメターに従い、MMLV RT及びgag特異的3’プライマーを使用しcDNAに転写した。RT反応液10μlは以下のパラメータによるホットスタートPCRにより増幅された。95℃5分;95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒、30サイクル;72℃5分。増幅後、各反応液20μlを1%アガロースゲル上で視覚化された。
[結果]
CD28発現に及ぼすイン・ビボに於ける急性感染の効果を調べる為に、ネコAU04、AUU3及びOAC2にはウイルスを静脈注射し感染させ、一方ネコAWG3及びOAE6には培地のみを注射した。FACS分析は、実験動物とコントロールとのCD4:CD8比には幾つかの違いがあることを示す。コントロール動物は全体としてほぼ1:2の比を保っていたのに対し、実験系では若干のふらつきが認められ、1動物では比は1;1まで低下していた(図3)。
CD28発現に及ぼすイン・ビボに於ける急性感染の効果を調べる為に、ネコAU04、AUU3及びOAC2にはウイルスを静脈注射し感染させ、一方ネコAWG3及びOAE6には培地のみを注射した。FACS分析は、実験動物とコントロールとのCD4:CD8比には幾つかの違いがあることを示す。コントロール動物は全体としてほぼ1:2の比を保っていたのに対し、実験系では若干のふらつきが認められ、1動物では比は1;1まで低下していた(図3)。
CD80及びCD28RNA発現の時間経過を追うことで各分子のメッセージが存在していること、そしてConA刺激後0、8、16及び24時間の時点でPCRにより増幅できることが示された。この半定量的PCR法は、視覚的にバンドが検出できる最低の増幅サイクルを探し、それよりメッセージの相対量を推測するものである。実験群では、CD80特異バンドはいずれの感染時期においても20及び25サイクルでは出現しなかったが、30サイクルでは何れの時期ついてもゲル上にCD80のメッセージを視覚的に確認することができた(図42)。CD28メッセージも、25サイクルでは16時間で僅かに視認できるバンドがあったが、30サイクルでは何れの時点についても視覚確認できた(図43)。
同様のプロトコールをFIV感染及び悲感染ネコのPBMCより抽出されたRNAについて実施した。CD28及びCD80特異的RNAのRT−PCR増幅を利用して、各ペプチドに関し転写されたメッセージ量の相対的アイディアを示した。時間経過実験で既に行われた様に、サンプルを20、25及び30サイクル時に取り出した。CD80及びCD28産物は25サイクルでは視認できたが、20サイクルではメッセージは検出できなかった(表4)。実験群とコントロール群の間では、いずれのメッセージの発現についても差は示されなかった。いずれのサブセットについても、産物が視認できた増幅サイクル点には変動が認められた。
FIVgag特異的プライマーを用いたFETJ及びMCH5.4細胞株のmRNAのPCR増幅は、MCH5.4細胞株が感染可能であり、活動的感染を示したのに対し、FETJ細胞株はgag特異的RNAの増幅を起こさないことを示した。FIV特異的産物は、感染MCH5.4サンプルより抽出されたRNAから容易に増幅できるが、非感染コントロールから同様に抽出されたRNAからは増幅されなかった(図44)。同様の反応を、FIVペタルム及びメリーランド株に曝したJETJ細胞株より抽出されたRNAについて行ったが、同様の条件においては視認できる産物は得られなかった(データ未提示)。
CD28メッセージを検出するためのノーザンブロッティングと半定量的PCRを、正常FETJ及びMCH5.4細胞株について実施した。MCH5.4細胞株は感染した実験群及び非感染コントロールを有していたが、FETJ細胞株は非許容T細胞コントロールとして利用された。
半定量的PCRは、各細胞株がCD28メッセージを生ずることができることを示した。FETJ非感染コントロールでの増幅からは、発現パターンが前記のCD28に関する時間経過でのパターンに似ていることが示された。刺激後0時ではバンドは30サイクルまで視認できないが、刺激後16時間目では25サイクルによりバンドは視認できた(図45)。興味深いことに、感染MCH5.4細胞株は、いずれのコントロールとも異なるパターンを示した。実験群では、メッセージは30サイクルまで0又は16時間にいずれにつてもバンドは認められなかった。G3PDHメッセージはコントロールとして増幅され、RNAの保全性と濃度は確認された(図46)。感染はCD28RNAメッセージの発現に影響すると考えられた。
ノーザンブロット分析は、半定量的RT−PCR技術を利用し発見されたデータの確認に利用された。16時間ConA刺激された未感染MCH5.4細胞からのRNAは、最も強いプローブハイブリダイゼーションを示した。未感染株の未刺激サンプルは、刺激された、又は刺激されていない感染MCH5.4細胞株Rなのいずれよりも強いハイブリダイゼーション率を示した(図47)。
オートラジオグラフに加えて、BetaGen上に放射活性が測定された。CD28ハイブリダイゼーションの生測定値は、続けて行われたブロットのGAPDHプローブから得た数値により正規化された(図48)(表5)。
MHC5.4細胞株のサイトカインRNAのRT−PCRからはIL−2に関するメッセージのみが増幅可能であることが示された。IL−4、IL−6又はIFNγは30サイクルにおいても増幅されなかったが、IL−2メッセージは容易に検出された(図49)。
[考察]
CD28メッセージをイン・ビボ及びイン・ビトロ感染で測定し、CD28発現がアッセイできるか、又レテロウイルスによる感染がメッセージ発現を変えるか調べた。CD28メッセージの測定は十分な量のRNAが回収できればノーザンブロッティングにより、回収が限られている場合には半定量的RT−PCRアッセイにより測定された。
CD28メッセージをイン・ビボ及びイン・ビトロ感染で測定し、CD28発現がアッセイできるか、又レテロウイルスによる感染がメッセージ発現を変えるか調べた。CD28メッセージの測定は十分な量のRNAが回収できればノーザンブロッティングにより、回収が限られている場合には半定量的RT−PCRアッセイにより測定された。
イン・ビボ実験に続いて、前述の如くにFIVのメリーランド株を3匹の動物に感染させ、これら感染動物と非感染コントロールからの血液より分離されたPBMCから抽出されたRNAよりCD28及びCD80特異的メッセージが増幅された。ノーザンブロッティングによる測定が好ましいが、細胞数及び利用可能なRNA量に限りがあることから半定量的RT−PCRが使用された。ネコは毎週定期的に採血され、最大10mLの血液が各実験に利用できた。
感染動物より得たPBMCのCD4/CD8比に関するFACS分析は8週間にわたり減少を示したのに対し、非感染動物では比は比較的一定に保たれていた。2つの実験群の間に差が認められた。CD4/CD8比は感染対非感染動物で異なる様に見えるが、CBC又はCD80及びCD28発現に真の差は認められなかった(データ示さず)。
CD28発現を至適に測定するには、純粋なT細胞が必要である。PBMCより分離されるものは、平均して細胞の40%が真のT細胞であろう。これら細胞の内のほぼ半数がCD8+T細胞であり、CD4+T細胞と同濃度にはCD28を発現しない。このことと、別の種ではCD28が休止中のT細胞(循環しているT細胞の大部分を構成する)では高レベルに発現されていないという事実と考え合わせ、ノーザンブロッティングではなくむしろPCR決定を使用することにした。PBMCから抽出したRNA20μgよりCD28メッセージを検出しようと試みた予備実験は成功しなかった。半定量的RT−PCR反応はCD28をコードするRNAの存在を検出しなかった。この技術はCD80に対し特異的なメッセージの増幅にも利用された。
CD28メッセージがノーザンブロッティングにより検出されたイン・ビトロ細胞株がRNAを提供した。MCH5.4はT細胞株として全ての細胞がCD28メッセージを発現する可能性を持ち、既に誘導株が慢性ウイルス感染を起こしていることから選択された。最後のメリットは、細胞株として、単一動物より得られる血液のリンパ細胞から入手できるRNAに比べてはるかに大きなRNAリザーバーになることである。
ノーザンブロッティングによりCD80メッセージを検出する試みも行われた。CD80は休止中のB−細胞及び単核細胞に低濃度で存在するものの、刺激を受けた単核細胞及びマクロファージ中には最高レベルの発現が認められた。ネコ抗原を提示する細胞株は無く、T細胞は通常ペプチドを低レベルでのみ発現している。PBMCから抽出されたRNAよりCD80特異的メッセージを検出する実験は不成功であったが、これはCD28のところで考察したのと同様の理由によるものであろう。これとは別に、判定量PCRを感染動物に由来する細胞についても行い、CD80とCD28メッセージを示した。メッセージの量に関しては明確な答えは得られなかったものの、このアッセイはメッセージが存在すること、そしてその量の相対的に提示した。
ネコT細胞株のCD28メッセージのノーザンブロット分析は成功しなかった。CD28に関するメッセージを感染細胞と非感染細胞について比較すると、発現パターンに差が認められた。CD28メッセージはConAに16時間曝された非感染細胞に置いて最も豊富であった。メッセージは非刺激及び非感染細胞にも検出された。メッセージは刺激された、及び刺激されていないFIV感染細胞のRNAにも検出可能であったが、レベルは非感染細胞に比べ極めて小さかった。このデータはRT−PCR検出技術を利用した同様の所見と良く相関した。
CD28メッセージを検出する能力は、CD80分子について認められたものと同じ限界による妨害は受けない。しかし、CD80を発現する細胞の大集団が分離できれば、ノーザンブロッティングによりメッセージの検出も実行的になる。ペプチド特異的モノクローナル抗体がこれら表面タンパク質に対し開発されれば、これらペプチドに関する表面発現量とメッセージレベルとを相関させることは興味深いだろう。
サイトカインcDNAが増幅され、感染された株と非感染株に差がないことが確認された。感染状態に関わらず、各群からIL−2が増幅された。他のサイトカインのメッセージは増幅されなかった。
ノーザンブロットは、mRNAレベルでのCD28発現はイン・ビトロではFIVの存在によりダウンレギュレーションされることを示している。本所見は表面タンパク質の発現を測定することで確認されなければならないが、イン・ビトロでのFIV感染はHIV感染したヒトT細胞で示されたようにCD28発現に影響するだろう(Brinchmannら、1994)。
[結論]
ネコシステムのCD28及びCD80シグナル伝達複合体をコードするcDNAのクローニング及び配列決定は、他のシステムより分離された分子に同類な断物をもたらした。ネコタンパク質の推定アミノ酸は、ヒト及びマウスポリペプチドに対し同一性が相対的に低いこと、これまでにクローン化された分子間相同性の比較、特徴的残基が保持されていること、そして表面リガンドがシグナル伝達機能を持たないと考えられることを示し、分離された産物が実際にCD80のネコアナログであると結論するに至った。これに対し、ネコCD28分子は核酸及び推定アミノ酸レベルのいずれに於いても中度の同一性を保っており、他種でクローン化された分子に類似していた。
ネコシステムのCD28及びCD80シグナル伝達複合体をコードするcDNAのクローニング及び配列決定は、他のシステムより分離された分子に同類な断物をもたらした。ネコタンパク質の推定アミノ酸は、ヒト及びマウスポリペプチドに対し同一性が相対的に低いこと、これまでにクローン化された分子間相同性の比較、特徴的残基が保持されていること、そして表面リガンドがシグナル伝達機能を持たないと考えられることを示し、分離された産物が実際にCD80のネコアナログであると結論するに至った。これに対し、ネコCD28分子は核酸及び推定アミノ酸レベルのいずれに於いても中度の同一性を保っており、他種でクローン化された分子に類似していた。
分子の性質は結合アッセイに於いて相互作用が示されたことにより更に同定された。他種類似タンパク質に対し作られたモノクローナル抗体が発現したネコタンパク質とは反応できなかった。即ち、結合アッセイのセットを計画し、相互作用が起こること、そして相互作用が可溶性レセプターにより阻害されることが示された。これらアッセイでは、結合は蛍光標識された細胞が保持されること、そしてこれが可溶性の対応レセプターの導入により阻害されることにより示された。これらアッセイは、ネコCD80及びCD28に関するタンパク質が発現できるだけでなく、表面発現分子が相互作用できることも示した。
活動性の感染に於ける分子の発現も特徴付けられた。CD28及びCD80の発現はFIVウイルスに曝されたイン・ビボ及びイン・ビトロシステムでアッセイされた。HIVウイルスに感染したヒト細胞で変化することが示されいてる(Asjoら、1993)CD28及びCD80の発現も、ネコT細胞のFIV感染により有害な影響を受けた。病気の進行に於けるこれら分子それぞれの発現に関する更なる情報により、ネコシステムはレトロウイルス感染の重要なモデルとして確立されるだろう。
これら分子の長期応用は大きな可能性を持っている。免疫システムのヒトシステムからの進化的多様化について理解することにより、初めてヒトに於けるシステムの機能をより完全に理解することができるだろう。更に、ネコ種のレトロウイルス感染のモデルとしての重要性は明瞭に確立されている(Siebelinkら、1990)。CD80は抗レトロウイルスワクチンに於いてメモリーCTLを誘導する潜在的アジュバントとして提言されている。ネコシステムは、該システムの有効性を検証する例外的なモデルであろう。
Claims (45)
- ネコCD80リガンド又はネコ可溶性CD80リガンドをコードする単離された核酸。
- ネコCD86リガンド又はネコ可溶性CD86リガンドをコードする単離された核酸。
- ネコCD28レセプター又はネコ可溶性CD28レセプターをコードする単離された核酸。
- ネコCTLA−4レセプター又はネコ可溶性CTLA−4レセプターをコードする単離された核酸。
- 前記ネコCD80リガンドが図1Aに示すメチオニンから開始しスレオニンで終結する配列(配列番号1)を有する、請求項1の核酸。
- 前記ネコCD86リガンドが図3Aに示すメチオニンから開始しイソロイシンで終結する配列(配列番号5)を有する、請求項2の核酸。
- 前記ネコCD86レセプターが図4Aに示すメチオニンから開始しセリンで終結する配列(配列番号7)を有する、請求項3の核酸。
- 前記ネコCTLA−4レセプターが図5Aに示すメチオニンから開始しアスパラギンで終結する配列(配列番号9)を有する、請求項4の核酸。
- 前記核酸がDNA又はRNAである請求項1〜4の何れか1項に記載の核酸。
- 前記DNAがcDNA又はゲノミックDNAである請求項9の核酸。
- 請求項1〜4の何れか1項に記載の核酸中に存在するユニークな配列に対し相補的な配列を有する少なくとも12ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。
- 長さが少なくとも15または16ヌクレオチドである請求項11のオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドが検出可能に標識されている請求項11又は12のオリゴヌクレオチド。
- 前記検出可能な標識が放射性同位体、蛍光体、又はビオチンである請求項13のオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドが選択的にメチル化されている請求項11又は12のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1の核酸を含むベクター。
- PSI−B7−1/871−35(ATCC受託番号209817)と称される請求項16のプラスミドベクター。
- 請求項2の核酸を含むベクター。
- B7−2#19−2/011298(ATCC受託番号209821)と称される請求項18のプラスミドベクター。
- 請求項3の核酸を含むベクター。
- PSI−CD28#7/100296(ATCC受託番号209819)と称される請求項20のプラスミドベクター。
- 請求項4の核酸を含むベクター。
- CTLA−4#1/091997(ATCC受託番号209820)と称される請求項22のプラスミドベクター。
- 核酸に作用可能に結合したプロモーターを含む請求項16〜23の何れかのベクター。
- 請求項16〜24の何れかのベクターを含む宿主細胞。
- 宿主細胞が真核細胞又は原核細胞である請求項25の宿主細胞。
- 宿主細胞が、E.Coli、酵母、COS細胞、PC12細胞、CHO細胞、及びGH4C1細胞をからなる群から選択される請求項26の宿主細胞。
- 請求項1の核酸によりコードされるポリペプチド。
- 請求項2の核酸によりコードされるポリペプチド。
- 請求項3の核酸によりコードされるポリペプチド。
- 請求項4の核酸によりコードされるポリペプチド。
- ポリペプチドを発現する宿主細胞を培養することと、生産されたポリペプチドを回収することとを具備する請求項28〜31の何れかのポリペプチドを製造する方法。
- 有効量の請求項28〜30の何れか1項に記載のポリペプチドと適切な担体を含むワクチン。
- 前記有効量が用量当たり約0.01mgないし約100mgの量である請求項33のワクチン。
- 前記有効量が約0.25mg/kgネコ体重ないし約25mg/kbネコ体重の量である請求項33のワクチン。
- 更に病原体由来の免疫原を含む請求項33−35のワクチン。
- 前記病原体が、ネコ病原体、狂犬病ウイルス、クラミジア、トキソプラズマ原虫、イヌ糸状虫、ノミ、又は細菌性病原体である請求項36のワクチン。
- 前記ネコ病原体がネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、ネコ感染性腹膜炎ウイルス(FIP)、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコレオウイルス3型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコシンシチアルウイルス、ネコザルコーマウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコボロナ病ウイルス、又はネコ寄生虫である請求項37のワクチン。
- ネコに請求項36〜38の何れか1項に記載のワクチンを所定量投与することを含むネコに免疫を誘導する方法。
- ネコに請求項36〜38の何れか1項に記載のワクチンを所定量投与することを含むネコの免疫応答を増強する方法。
- 前記ワクチンを皮下、筋肉内、全身、局所、または経口的に投与する請求項39または40の方法。
- 免疫反応を効果的に抑制する量の請求項31に記載のポリペプチドをネコに投与することを含む、ネコの免疫反応を抑制する方法。
- 免疫反応を効果的に抑制する量の請求項28〜30に記載の可溶性ポリペプチドをネコに投与することを含む、ネコの免疫反応を抑制する方法。
- 前記量が約0.25mg/kg体重/日ないし約25mg/kb体重/日である請求項42又は43の方法。
- 前記ネコが自己免疫疾患に罹患しているか、または組織若しくは臓器移植のレシピエントである請求項42又は43の方法。
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