KR101962683B1

KR101962683B1 - Hsv-2 감염 예방 및 치료용 dna 백신

Info

Publication number: KR101962683B1
Application number: KR1020160125149A
Authority: KR
Inventors: 서용복; 신주아
Original assignee: 주식회사 에스엘백시젠
Priority date: 2016-09-28
Filing date: 2016-09-28
Publication date: 2019-03-27
Also published as: CN108419437B; WO2018009047A3; CN108419437A; HK1252391A1; KR20180035092A; TWI697558B; TW201814043A; WO2018009047A2

Abstract

본 발명은 신규 HSV-2 예방 및 치료용 DNA 백신 조성물에 관한 것으로서, 셔플드 UL39 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 상기 벡터를 포함하는 DNA 백신 조성물을 제공한다.

Description

HSV-2 감염 예방 및 치료용 DNA 백신{A DNA vaccine for preventing and treating HSV-2 infection}

본 발명은 신규 DNA 백신에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 HSV-2(herpes simplex virus-2) 감염 예방 및 치료용 DNA 백신에 관한 것이다.

HSV-2(herpes simplex virus-2)는 피부 병소를 일으키는 DNA 바이러스인 Herpetoviridae의 구성원으로 전 세계적으로 5억명의 사람들이 HSV-2에 감염되어 있으며, 매년 2천 3백만명의 신규 감염자가 발생하는 것으로 예측 되고 있다. 미국의 경우에는 성인 5명중 1명이 감염되어 있는 것으로 보고되고 있고, BRIC 국가(브라질, 러시아, 인도, 중국)를 포함한 주요 국가에서도 감염률이 높은 편이다. HSV-2는 점막이나 피부의 손상된 부위를 통해 감염되며, 바이러스 복제 과정에서 감염 부위의 괴사 등의 병증을 유발한다. 구체적인 병증으로 HSV-2는 생식기 궤양의 주요 원인이 되는데, 이 궤양은 작은 액체가 채워진 수포 집합체로, 파열되면 아픈 상처가 생기게 된다. 또한 열 발생, 전반적인 아픈 느낌, 근육 통증, 배뇨통증, 질 분비물 발생 등의 증상이 유발 된다. HSV-2는 감각 신경 세포의 축색돌기를 따라 배근신경절(dorsal root ganglia)까지 들어가면서 잠복하며 몇 년 또는 평생 동안 잠복하면서 재활성을 반복하게 된다. HSV-2는 무증상 중에서도 사람간의 전이가 가능하기 때문에 바이러스 확산 통제에 많은 어려움이 있다는 것에 그 심각성이 있다. 실제로 혈청학적으로 HSV-2 양성인 개인의 확산 정도가 1976년부터 1994년까지 30%정도 증가 하였으며, 추가적인 감염 확산을 막지 못할 경우 2025년까지 남성은 39%, 여성은 49%로 감염률이 증가할 것으로 예측된다. 더욱이, HSV-2에 감염된 여성이 출산한 신생아의 60%는 사망하거나 20%는 신경 또는 눈에 심각한 후유증이 발생되고, HSV-2 감염자는 HIV에 감염될 확률이 3배 더 높다는 사실은 전세계적 공중 보건에 심각한 문제가 된다. 또한 경제적 측면에서도 HSV-2 감염은 막대한 부담이 되고 있다. 실례로 HSV-2 감염 치료를 위한 미국의 1996년 연간 직접 의료비용은 2억 8천 3백만 달러에서 9억 8천 4백만 달러로 예측 되었다.

불행히도 현재까지 HSV-2 감염을 근본적으로 치료 할 수 있는 치료제는 없을뿐더러 증상들에 대한 치료 선택은 제한적이다. 바이러스 DNA 합성을 방해해서 바이러스 복제를 억제하는 항바이러스 약제[예를 들어, 팜시클로버(famciclovir), 발라시클로버(valaciclovir), 또는 아시클로버(acyclovir)]를 사용하지만, 이 또한 감염 초기에 적용할 경우 임상 증상을 완화하거나 바이러스 전이를 줄일 수 있을 뿐 재발 및 전파 감염을 방지 할 수 없고 완치가 어렵다. 이를 테면 아시클로비어는 HSV-2 전염을 감소시킬 수 있지만, 뉴런 신경절(ganglion)의 잠복 감염을 예방하지는 못한다. 더욱이 항바이러스 요법은 욕지기, 구토발생, 그리고 신장 기능 감소가 포함된 많은 부작용을 일으킨다. 기존 항바이러스 약제에 대한 미충족 의료 수요로 인해 HSV-2에 대한 새롭고 다양한 백신을 이용한 예방 및 치료방법이 시도되었지만 모두 소용없었다. 비활성화된 바이러스, 감소된 생바이러스, 변형된 생바이러스, 그리고 세포배양물-유도된 소단위(subunit)가 포함된 기존 방식의 백신은 대개 성공하지 못하거나 효과가 매우 낮았다. 최근의 대표적인 3가지 후보 백신, 즉 Chiron사가 개발한 백신, GlaxoSmithKline(GSK)사가 개발한 백신과 Vical사가 개발한 백신에 대한 임상시도는 그 치료효과가 미미하였다. 보조제(adjuvant) MF59와 복합된 HSV-2의 gD와 gB2의 절단형(truncated form)으로 구성된 Chiron사의 백신은 HSV-2에 대한 고역가 항체를 생성하였지만, 그 효과는 일시적이었다. 보조제 alum 및 MPL와 gD를 포함한 GSK의 백신 또한 HSV-2 감염 예방 및 치료에 실패하였다. 마지막으로 보조제 Vaxfectin과 gD 또는 UL46 및 UL47을 포함하는 Vical사의 백신은 동물실험에선 고역가의 항체를 생성하였지만, 임상에서는 HSV-2 감염 치료에서 대조군과 차이를 보이지 않았다. 앞의 사례에서 HSV-2에 대한 고역가 항체 반응이 HSV-2 감염 전파 방지 및 치료에는 충분한 요소가 아님을 알 수 있으며, 이로 인해 HSV-2 감염에 대한 새로운 면역 기작에 바탕을 둔 치료제 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효과적으로 HSV-2 감염을 예방하고 치료할 수 있는 새로운 DNA 백신을 제조하는 것을 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 상기 목적에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, HSV-2의 UL39 단백질의 아미노산 서열상 14-154 a.a 위치에 상응하는 펩타이드에서 78-104 a.a 위치에 상응하는 막통과 도메인이 결실된 UL39-N1 펩타이드, 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 1117-1142 a.a 위치에 상응하는 UL39-C2 펩타이드, 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 155-227 a.a 위치에 상응하는 UL39-N2 펩타이드, 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 399-1116 a.a 위치에 상응하는 UL39 N4-C1 펩타이드, 및 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 208-398 a.a 위치에 상응하는 UL39-N3 펩타이드가 무작위적으로 섞여있고, 원래의 UL39 단백질의 아미노산 서열은 포함하지 않는 셔플드(shuffled) UL39 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 벡터를 포함하는 단리된 숙주세포가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 재조합 단백질이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, gB, gD, UL39, ICP0 및 ICP4 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 또는 모든 HSV-2 항원 단백질을 발현하도록 상기 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드, 상기 벡터 또는 상술한 발현벡터를 포함하는 DNA 백신 조성물이 제공된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 셔플드 UL39 단백질의 구조를 나타내는 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 셔플드 UL39 단백질을 발현하도록 고안된 플라스미드 DNA를 이용한 동물실험 순서를 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 셔플드 UL39 단백질을 발현하도록 고안된 플라스미드 DNA 및 음성대조군인 mock plasmid DNA를 실험동물에 투여하고 HSV-2를 감염시킨 동물의 생존율을 기록한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA를 통해 발현되는 융합단백질의 구조를 각각 나타낸 개요도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA를 각각 투여한 그룹 및 tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA를 병용투여한 그룹 그리고 음성대조군으로 mock plasmid DNA를 투여한 그룹의 HSV-2 감염 실험 스케쥴을 나타낸 개요도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA를 각각 투여한 그룹 및 tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA를 병용투여한 그룹 그리고 음성대조군으로 mock plasmid DNA를 투여한 그룹의 HSV-2 감염 실험결과를 나타내는 것으로서 생존율(a) 및 병리학 점수(b)를 각각 나타내는 그래프이다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, HSV-2의 UL39 단백질의 아미노산 서열상 14-154 a.a 위치에 상응하는 펩타이드에서 78-104 a.a 위치에 상응하는 막통과 도메인이 결실된 UL39-N1 펩타이드, 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 1117-1142 a.a 위치에 상응하는 UL39-C2 펩타이드, 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 155-227 a.a 위치에 상응하는 UL39-N2 펩타이드, 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 399-1116 a.a 위치에 상응하는 UL39 N4-C1 펩타이드, 및 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 208-398 a.a 위치에 상응하는 UL39-N3 펩타이드가 무작위적으로 섞여있고, 원래의 UL39 단백질의 아미노산 서열은 포함하지 않는 셔플드 UL39 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.

본 문서에서 사용되는 용어 "셔플드(shuffled)"는 특정 단백질 내에 복수의 도메인(domain)이 존재할 경우 이들 도메인의 순서를 뒤섞는 것을 의미한다. 특히, 본 문서에서 사용되는 용어 "셔플드 단백질"은 다른 의미로는 "에피토프 셔플드 단백질"로서 면역 시스템에 의해 인지되는 복수의 에피토프의 활성은 그대로 유지하면서 에피토프의 순서가 무작위로 뒤섞인 재조합 단백질로서 에피토프의 활성은 그대로 유지하되 원래의 단백질의 기능은 상실한 면역원성 단백질이다.

상기 셔플드 UL39 단백질의 제조에 사용되는 UL39 단백질은 표준서열로서 UniProt 등록번호 P89462로 등록된 RIR1_HHV2H가 사용될 수 있으며, 상기 아미노산 위치는 상기 표준 서열을 기준으로 한 것으로서, UL39 단백질의 기능을 보유하고 있는 다른 다양한 변이체, 예컨대, UniProt 등록번호 G91261, A0A0E3Y5Z7, A0A0E3Y7N5, A0A120I2I0, A0A110B8A6, A0A0E3Y758 등 다양한 변이체가 사용되더라도 무방하며, 이들 변이체 중 상기 표준서열과 길이가 상이한 경우에는 상기 표준서열의 위치에 상응하는 위치가 적용될 것이다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 또는 둘 이상의 면역 증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있고, 상기 면역 증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator), CD40 L(리간드) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "면역 증진 펩타이드"는 면역 반응에 관계하는 세포(예를 들어, 수지상 세포 등)를 활성화시켜 면역 반응을 증가시키는 펩타이드를 의미한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 상기 셔플드 UL39 단백질의 세포 밖으로의 분비를 유도하며, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 또는 둘 이상의 제2형 단순포진 바이러스(HSV-2)의 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항원 단백질은 당단백질 B(gB), 당단백질 D(gD), ICP0 또는 ICP4일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 상기 당단백질 B는 1-22 a.a 위치에 상응하는 신호서열 및 772-792 a.a 위치에 상응하는 막통과 도메인이 결실된 것일 수 있고, 상기 당단백질 D는 1-25 a.a 위치에 상응하는 신호서열 및 341-364 a.a 위치에 상응하는 막통과 도메인이 결실된 것일 수 있으며, 상기 ICP0은 510-516 a.a 위치에 상응하는 핵위치화 신호(NLS)가 결실된 것일 수 있고 상기 IPC4는 767-1318 a.a 위치에 상응하는 RS1.3 부위가 결실된 것일 수 있다.

상기 항원 단백질들 역시 표준서열로 gB의 경우 UniProt 등록번호 P08666인 GB_HHV2H, gD의 경우 UniProt 등록번호 Q69467인 GD_HHV2H, ICP0의 경우 UniProt 등록번호 P28284인 ICP0_HHV2H, ICP4의 경우 UniProt 등록번호 P90493인 ICP4_HHV2H를 사용하였으며, 상기 항원 단백질들의 사용 아미노산 위치 역시 상기 표준서열을 기준으로 표시된 것으로, 상기 항원 단백질들의 활성을 유지하고 있는 다양한 변이체 역시 사용이 가능하며, 이들 변이체의 길이가 상기 표준서열과 상이할 경우에는 상기 표준서열의 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치가 적용될 것이다. 상기와 같은 다양한 변이체의 예로는 gB의 경우 UniProt 등록번호 P06763, Q69465, D6QV12, 및 D6QV07 등의 변이체가 사용될 수 있고, gD의 경우 UniProt 등록번호 P03172, T1PZZ0, A0A0Y0QWV3, A0A110AVP3, 및 A0A0Y0RM80 등이 사용될 수 있으며, ICP0의 경우 UniProt 등록번호 G9I221, G9I280, W0NW81, D6PUZ6, 및 D6PUZ3 등이 사용될 수 있고, ICP4의 경우 UniProt 등록번호 G9I282, A0A0E3Y5F0, A0A0Y0RBE8, A0A120I2I2, 및 A0A0Y0RAK6 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환된 것" 또는 "최적화된 코돈"이란 숙주세포 내에서 DNA가 단백질로 전사(transcription) 및 번역(translation)될 때 아미노산을 지령하는 코돈 사이에 숙주에 따라 선호도가 높은 코돈이 존재하는데, 이들 선호도가 높은 코돈으로 치환함으로써 그 핵산이 암호화하는 아미노산 또는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 것을 말한다.

상기 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 상기 UL39-N1 펩타이드는 서열번호 1로 구성되고, 상기 UL39-C2 펩타이드는 서열번호 2로 구성되며, 상기 UL39-N2 펩타이드는 서열번호 3으로 구성되며, 상기 UL39 N4-C1 펩타이드는 서열번호 4로 구성되고, 및 상기 UL39-N3 펩타이드는 서열번호 5로 구성될 수 있다. 아울러 상기 셔플드 UL39는 서열번호 1로 표시되는 UL-39-N1 펩타이드, 서열번호 2로 표시되는 UL39-C2 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 UL39-N2 펩타이드, 서열번호 4로 표시되는 UL39 N4-C1 펩타이드, 및 서열번호 5로 표시되는 UL39-N3 펩타이드를 순차적으로 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 셔플드 UL39 단백질은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 그러나, 상기 각각의 펩타이드들의 순서는 원래의 전장 UL39 단백질의 아미노산 서열과 동일하지 않는 한 바뀌어도 무방하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드가 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하여 숙주세포에서 상기 셔플드 UL39 단백질을 발현하도록 할 수 있는 발현벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.

"작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.

상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 1995, 270: 25739-25745)에 기술되어 있다. 원핵세포내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX27(특허 제1442254호), pX(Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris (1995) Cell 75, 791-803) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham-Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더 서열이다.

또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 HSV-2 항원 단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 DNA 백신 제조용 벡터인 pGX27을 제조하여 사용하였다.

본 발명에서 용어, "융합단백질(fusion protein)"이란 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다. 상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커(linker)가 삽입될 수 있다. 이러한 링커로는 GS₄ 등 다양한 종류의 링커가 알려져 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "숙주세포"란 원핵 또는 진핵 세포를 포함하며, 진핵세포는 진균, 효모 등을 포함하는 하등 진핵 세포뿐만 아니라 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주세포 또는 비-인간 숙주개체는 상기 벡터에 의해 유전적으로 변형된 숙주세포 또는 숙주개체일 수 있다. 본 문서에서 사용되는 용어 "유전적으로 변형된(genetically modified)"이라는 용어는 숙주세포 또는 숙주개체, 또는 선행종(predecessors)/모종(parents) 중 하나로 도입된 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 숙주세포 또는 숙주개체가 자신의 게놈 외에 포함하는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 바람직하게는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 또는 숙주개체 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주세포 또는 숙주개체의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포는 원핵 또는 진핵세포이다. 적당한 원핵세포들은 대장균(E. coli) 또는 고초균(Bacillus subtilis)와 같이 클로닝에 보통 사용되는 세포들이다. 그리고, 진핵세포들은 진균세포(fungus), 식물세포 또는 동물세포들을 포함한다. 적당한 진균세포들의 예로는 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 중의 효모 및 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)일 수 있다. 적당한 동물세포들의 예로는 곤충세포들, 식물세포들, 바람직하게는 포유류 세포들, 예컨대 HEK293, 293T, NSO, CHO, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A를 들 수 있다. 상기 숙주세포들, 가령 CHO 세포는 리더 펩타이드 제거, H(중)쇄 및 L(경)쇄의 중첩 및 조립, 정확한 위치에서의 분자의 당화(glycosylation) 및 기능 분자의 분비를 포함하는, 본 발명의 일 실시예에 따른 항체분자에 대한 번역후 수식(post-translational modification)을 제공할 수 있다. 또한, 당 분야에 알려져 있는 적당한 세포주들은 American Type Culture Collection(ATCC)와 같은 세포주 기탁물로부터 수득할 수 있다. 본 발명에 따라, 1차배양 세포(primary culture cell)/세포 배양액들은 숙주세포들로서 기능할 수 있다고 고려되고 있다. 상기 세포들은 특히 곤충들(초파리 또는 Blatta 속의 곤충) 또는 포유류들(인간, 돼지, 마우스 또는 쥐)로부터 유도된다. 상술한 바와 같이 상기 1차배양 세포는 대식세포(macrophage), 단핵구(monocyte), 과립구(granulocyte), 조혈모 줄기세포, 림포카인 활성화 킬러세포, gd 세포, NKT 세포(natural killer T cell), T 세포 또는 NK 세포(natural killer cell)와 같은 면역세포일 수 있다.

상기 조성물은 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 재조합 단백질이 제공된다.

본 발명의 다른 일관점에 따르면, gB, gD, UL39, ICP0 및 ICP4 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 2종 이상의 또는 모든 HSV-2 항원 단백질을 발현하도록 상기 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터가 제공된다.

상기 발현벡터에 있어서, 상기 gB는 1-22 a.a 위치에 상응하는 신호서열 및 772-792 a.a 위치에 상응하는 막통과 도메인이 결실된 것일 수 있고, 상기 gD는 1-25 a.a 위치에 상응하는 신호서열 및 341-364 a.a 위치에 상응하는 막통과 도메인이 결실된 것일 수 있으며, 상기 ICP0은 510-516 a.a 위치에 상응하는 핵위치화 신호(NLS)가 결실된 것일 수 있고, 상기 IPC4는 767-1318 a.a 위치에 상응하는 RS1.3 부위가 결실된 것일 수 있다.

상기 발현벡터에 있어서, 상기 UL39는 내부의 도메인들이 뒤섞인 셔플드 UL39 단백질일 수 있고, 상기 셔플드 UL39 단백질은 상술한 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나에 의해 암호화될 수 있다.

아울러 상기 발현벡터는 상기 gB, gD, UL39, ICP0 및 ICP4 단백질은 별개의 단백질로 발현되거나 하나의 융합단백질 형태로 발현되도록 제작될 수 있다.

상기 발현벡터에 있어서, 상기 셔플드 UL39 단백질은 상술한 바와 같이 서열번호 1로 표시되는 UL-39-N1, 서열번호 2로 표시되는 UL39-C2, 서열번호 3으로 표시되는 UL39-N2, 서열번호 4로 표시되는 UL39 N4-C1, 및 서열번호 5로 표시되는 UL39-N3이 무작위적으로 섞인 것이나, 서열번호 1 내지 5의 펩타이드가 순차적으로 연결된 것일 수 있다. 다만 이 경우 상기 셔플드 UL39 단백질은 원래의 전장 UL39 단백질은 제외한다.

상기 발현벡터에 있어서, 상기 gB, gD, UL39, ICP0 및 ICP4 단백질은 별개의 단백질로 발현되거나 하나의 융합단백질 형태로 발현될 수 있다.

상기 발현벡터에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있고, 상기 분비 신호서열은 상술한 바와 같이 tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.

상기 발현벡터에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 면역 증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있고, 상기 면역 증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator), CD40 L(리간드) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있다. 상기 면역 증진 펩타이드는 바람직하게는 Flt3 리간드일 수 있고 상기 Flt3 리간드는 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 DNA 백신 조성물은 구체적으로 gB 및 UL39를 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터 및 gD, ICP0 및 ICP4를 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함할 수 있다.

상기 DNA 백신 조성물에 있어서, 상기 제1융합단백질 및/또는 제2융합단백질은 분비 신호서열을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 상술한 바와 같다.

상기 DNA 백신 조성물에 있어서, 상기 제1융합단백질 및/또는 제2융합단백질은 면역 증진 펩타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 면역 증진 펩타이드는 상술한 바와 같다.

상기 DNA 백신 조성물에 있어서, 상기 UL39는 내부의 도메인들이 뒤섞인 셔플드 UL39일 수 있다.

상기 DNA 백신 조성물은 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보조제(adjuvant)를 포함할 수 있다.

본 문서에서 사용되는 "보조제(adjuvant)"는 백신의 면역반응을 향상시킬 목적으로 투여되는 약학적 또는 면역학적 제제를 의미한다.

상기 보조제는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알룸(포타슘 알루미늄 설페이트), MF59, virosome, AS04[알루미늄 하이드록사이드 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)의 혼합물], AS03(DL-α-tocopherol, squalene 및 유화제인 polysorbate 80의 혼합물), CpG, Flagellin, Poly I:C, AS01,AS02, ISCOMs 또는 ISCOMMATRIX일 수 있다.

또한, 본 발명에 일 실시예에 따른 백신 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 피내, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물은 일반적인 전신성 투여 또는 국소성 투여, 예컨대, 근육내 주사 또는 정맥 주사 방식으로 투여될 수 있으나, 가장 바람직하게는 전기천공기(electroporator)를 이용하여 주입될 수 있다. 상기 전기천공기는 시판 중인 DNA 약물 체내 주입용 전기천공기, 예컨대, 이탈리아의 IGEA 사의 Glinporator^TM, 한국의 JCBIO사의 CUY21EDIT, 스위스의 Supertech사의 SP-4a 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 일 실시예에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 투여경로는 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 활막강 내 투여될수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 일 실시예에 따른 백신 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.

상기 백신 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 DNA는 100 ng/체중(kg) - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있고, 10 ㎍, 100 ㎍, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg 또는 100 mg과 같은 단위 용량으로 투여될 수도 있으며, 상기 요소들을 고려하여 투여량이 조절될 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: Shuffled-UL39 plasmid DNA 제조

본 발명자들은 HSV-2 항원 중의 하나인 UL39(ICP10)가 CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포 반응을 유도한다는 선행연구 결과를 바탕으로(Posavad et al., Mucosal Immunol. 8(1): 115-126, 2015), UL39의 내부 도메인을 뒤섞어 놓은 shuffled construct가 면역반응을 유발하는 백신으로서 기능할 수 있는지 여부를 조사하였다.

이를 위해 발현능이 향상 되도록 개선된 pGX27 plasmid vector(특허 제1442254호)을 기반으로 하여 5개의 조각(N1: UL39_{14-154(Δ78-104)}, C2: UL39_1117-1142, N2: UL39_155-227, N4-C1: UL39_399-1116, N3: UL39_208-398)으로 나누어 뒤섞여 배치된 HSV-2의 셔플드 UL-39 항원 및 상기 셔플드 UL-39를 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 플라스미드를 제조하였다.

구체적으로 shuffled-UL39 plasmid DNA는 UL39-N1(서열번호 1), UL39-C2(서열번호 2), UL39-N2(서열번호 3), UL39-N4-C1(서열번호 4), 및 UL39-N3(서열번호 5) 부분으로 나눠진 형태를 기반으로, UL39-N1, UL39-C2, UL39-N2, UL39-N4-C1, 및 UL39-N3 순서로 순차적으로 연결된 형태(서열번호 6)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 7)를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 상기 pGX27 플라스미드 벡터에 삽입함으로써 제작되었다(도 1).

실험예 1: Shuffled-UL39 plasmid DNA에 의한 HSV-2 감염 방어 효능 확인

본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 shuffled-UL39 plasmid DNA가 HSV-2 감염 방어에 효능이 있는 지를 in vivo 감염동물 모델상에서 확인하기 위하여, 상기 plasmid DNA 백신 투여 후에 HSV-2 감염 방어능을 평가 하였다.

구체적으로, C57BL/6 mouse에 대하여 mock plasmid DNA 및 shuffled-UL39 plasmid DNA를 각각 투여한 그룹으로 나누었다. 각 투여 군에 해당 plasmid DNA 4㎍을 2 주 간격으로 2회 in vivo 전기천공(electroporation) 전달 방법으로 근육내 투여 하였으며, 최종 투여 2주 후에 1 x 10⁴pfu의 HSV-2 바이러스를 질내(intravaginal route)로 감염을 시켰다(도 2 및 표 1). 감염 후, 10일간 매일 각 투여군 마우스의 생존여부를 추적 관찰하여 HSV-2 감염 방어능을 평가 하였다(도 3).

그룹	백신	실험동물 수	투여량 (μg)	경로(투여방법)
대조군	mock plasmid	8	4	근육내(전기천공법)
실험군	셔플드 UL-39	8	4	근육내(전기천공법)

그 결과, 도 3에서 확인되는 바와 같이 mock plasmid DNA 투여군에서는 HSV-2 바이러스 감염 8일에 대부분의 마우스가 죽은 반면, shuffled-UL39 plasmid DNA 투여군에서는 10일까지 40%의 생존율을 보여 유의미하게 개선된 생존율을 관찰할 수 있었다.

실시예 2: HSV-2 복합 항원 발현 plamid DNA 제조

본 발명자들은 상기 실험예 1의 결과로부터 UL39의 DNA 백신으로서의 가능성을 확인하여, 다른 항원 단백질과 조합된 플라스미드 DNA를 제조하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 사용한 pGX27 plasmid vector을 기반으로 하여 여러 종류의 HSV-2 항원 즉, 신호서열(gB_1-22) 및 막통과 도메인(gB_772-792)이 제거된 Glycoprotein B(gB_{23-904(Δ772-792)}, 서열번호 10), 및 상기 실시예 1에서 사용한 shuffled UL-39(서열번호 6)가 연결된 tPA-Flt3L-gB-UL39 융합단백질(서열번호 11)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 12)가 포함된 tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA와 신호서열(gD_1-25) 및 막통과 도메인(gD_341-364)이 제거된 Glycoprotein D(gD_{6-393(Δ341-364)}, 서열번호 13), 핵위치화 서열(NLS, ICP0_510-516)이 제거된 infected cell polypeptide 0(ICP0_Δ510-516, 서열번호 14) 및 RS1.3 부분(ICP_767-1318)이 제거된 infected cell polypeptide 4(ICP4_Δ767-1318, 서열번호 15)가 연결된 tPA-Flt3L-gD-IPC0-ICP4 융합단백질(서열번호 16)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 17)가 포함된 tPA-Flt3L-gD-IPC0-ICP4 plasmid DNA를 각각 제작하였다. 상기 두 플라스미드 모두 효율적인 발현을 위하여 코돈 최적화된 tPA 분비 신호서열(서열번호 8)과 면역계 활성 단백질인 FMS-like tyrosine kinase 3 ligand(Flt3L, 서열번호 9)이 N-말단에 부가된 형태의 plasmid DNA이다(도 4).

실험예 2: tPA-Flt3L-gB-UL39 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA에 의한 HSV-2 감염 방어 효능 확인

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제조된 tPA-Flt3L-gB-UL39 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA가 HSV-2 감염 방어에 효능이 있는 지를 in vivo 감염동물 모델상에서 확인하기 위하여, 백신 투여 후에 HSV-2 감염 방어능을 평가 하였다.

구체적으로, C57BL/6 mouse에 대하여 mock plasmid DNA, tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA, 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA를 각각 투여한 그룹과 tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA를 병용투여한 군으로 나누었다. 각 투여 군에 해당 plasmid DNA 4 ㎍(병용투여의 경우 각각 4 ㎍씩 투여함)을 2 주 간격으로 2회 생체내 전기천공법(in vivo electroporation)으로 근육내 투여 하였으며, 최종 투여 2 주 후에 1 x 10⁴pfu의 HSV-2 바이러스를 질내투여(intravaginal route)로 감염시켰다(도 5 및 표 2). 감염 후 20일간 매일 각 투여군 마우스의 생존률 및 병리학 점수(pathology score)를 추적 관찰하여 HSV-2 감염 방어능을 평가 하였다(도 6). 병리학 점수는 Oh 등이 발표한 논문에 기재된 바에 따라 매겼다(Oh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113(6): E762-E771, 2016; 병리학적 점수 '0', 무증상; '1', 약한 정도의 생식기 홍반 및 부종; '2', 중간 정도의 생식기 염증; '3', 화농성 생식기 손상; '4', 뒷다리 마비; '5', 폐사).

그룹	백신	마우스 수	투여량 (μg)	투여경로(투여방법)
대조군	mock	10	8	근육내(전기천공법)
실험군 1	gB-UL39 (BD-02B)	10	4 + 4 (mock)	근육내(전기천공법)
실험군 2	gD-ICP0/ICP4	10	4 + 4 (mock)	근육내(전기천공법)
실험군 3	gD-ICP0/ICP4 + gB-UL39	10	4 + 4	근육내(전기천공법)

그 결과, 도 6a에서 확인되는 바와 같이 mock plasmid DNA 투여군에서는 HSV-2 바이러스 감염 10일째 모든 동물이 폐사하였다. 이와는 반대로 tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA 또는 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA 투여군에서는 상당히 개선된 HSV-2 바이러스에 대한 방어효능을 확인할 수 있었다. tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA에서는 40%의 생존율을 보였으며, tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA 투여군에서는 100%의 생존율을 보였다. tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA 병용 투여군 또한 100% 생존률이 관찰되었다.

아울러, 도 6b에서 확인되는 바와 같이 mock plasmid DNA 투여군에서는 병리학 점수가 매우 높게 나타났고, tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA의 경우 mock plasmid DNA 보다는 현저하게 낮은 병리학 점수를 나타냈으나, tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA 투여군보다는 병리학 점수가 높게 나타났다. 반면, tPA-Flt3L-gB-UL39 plasmid DNA 및 tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4 plasmid DNA 병용 투여 군에서는 각각의 투여군과 비교하여 유의미하게 개선된 병리학 점수가 기록되었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 셔플드 UL39를 항원으로 발현시킬 수 있는 DNA 및 상기 셔플드 UL39 항원과 종래의 HSV-2 항원을 조합시킨 융합단백질을 발현시킬 수 있는 DNA는 HSV-2에 대한 효과적인 감염 방어활성을 나타냈으며, 따라서, HSV-2에 대한 예방 및 치료를 위한 백신으로 매우 효율적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> BioDion Co., LTD. <120> A DNA vaccine for preventing and treating HSV-2 infection <130> PD16-5410 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UL39-N1 <400> 1 Arg Ser Pro Ser Glu Arg Gln Glu Pro Arg Glu Pro Glu Val Ala Pro 1 5 10 15 Pro Gly Gly Asp His Val Phe Cys Arg Lys Val Ser Gly Val Met Val 20 25 30 Leu Ser Ser Asp Pro Pro Gly Pro Ala Ala Tyr Arg Ile Ser Asp Ser 35 40 45 Ser Phe Val Gln Cys Gly Ser Asn Cys Ser Met Ile Ile Asp Gly Asp 50 55 60 Gly Asp Gly Arg Thr Ala Val Val Ala Leu Gly Gly Thr Ser Gly Pro 65 70 75 80 Ser Ala Thr Thr Ser Val Gly Thr Gln Thr Ser Gly Glu Phe Leu His 85 90 95 Gly Asn Pro Arg Thr Pro Glu Pro Gln Gly Pro Gln Ala Val Pro Pro 100 105 110 Pro Pro <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UL39-C2 <400> 2 Tyr Cys Lys Val Arg Lys Ala Thr Asn Ser Gly Val Phe Ala Gly Asp 1 5 10 15 Asp Asn Ile Val Cys Thr Ser Cys Ala Leu 20 25 <210> 3 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Arg 1205 1210 1215 Lys Cys Ala Arg Lys Thr Arg His Ala Glu Gly Gly Pro Glu Pro Gly 1220 1225 1230 Ala Arg Asp Pro Ala Pro Gly Leu Thr Arg Tyr Leu Pro Ile Ala Gly 1235 1240 1245 Val Ser Ser Val Val Ala Leu Ala Pro Tyr Val Asn Lys Thr Val Thr 1250 1255 1260 Gly Asp Cys Leu Pro Val Leu Asp Met Glu Thr Gly His Ile Gly Ala 1265 1270 1275 1280 Tyr Val Val Leu Val Asp Gln Thr Gly Asn Val Ala Asp Leu Leu Arg 1285 1290 1295 Ala Ala Ala Pro Ala Trp Ser Arg Arg Thr Leu Leu Pro Glu His Ala 1300 1305 1310 Arg Asn Cys Val Arg Pro Pro Asp Tyr Pro Thr Pro Pro Ala Ser Glu 1315 1320 1325 Trp Asn Ser Leu Trp Met Thr Pro Val Gly Asn Met Leu Phe Asp Gln 1330 1335 1340 Gly Thr Leu Val Gly Ala Leu Asp Phe His Gly Leu Arg Ser Arg His 1345 1350 1355 1360 Pro Trp Ser Arg Glu Gln Gly Ala Pro Ala Pro Ala Gly Asp Ala Pro 1365 1370 1375 Ala Gly His Gly Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1380 1385 1390 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser 1395 1400 1405 Ala Glu Gln Arg Lys Lys Lys Lys Thr Thr Thr Thr Thr Gln Gly Arg 1410 1415 1420 Gly Ala Glu Val Ala Met Ala Asp Glu Asp Gly Gly Arg Leu Arg Ala 1425 1430 1435 1440 Ala Ala Glu Thr Thr Gly Gly Pro Gly Ser Pro Asp Pro Ala Asp Gly 1445 1450 1455 Pro Pro Pro Thr Pro Asn Pro Asp Arg Arg Pro Ala Ala Arg Pro Gly 1460 1465 1470 Phe Gly Trp His Gly Gly Pro Glu Glu Asn Glu Asp Glu Ala Asp Asp 1475 1480 1485 Ala Ala Ala Asp Ala Asp Ala Asp Glu Ala Ala Pro Ala Ser Gly Glu 1490 1495 1500 Ala Val Asp Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Val Ser Pro Arg Gln Leu 1505 1510 1515 1520 Ala Leu Leu Ala Ser Met Val Asp Glu Ala Val Arg Thr Ile Pro Ser 1525 1530 1535 Pro Pro Pro Glu Arg Asp Gly Ala Gln Glu Glu Ala Ala Arg Ser Pro 1540 1545 1550 Ser Pro Pro Arg Thr Pro Ser Met Arg Ala Asp Tyr Gly Glu Glu Asn 1555 1560 1565 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Arg Asp Ala Gly Arg 1570 1575 1580 Trp Val Arg Gly Pro Glu Thr Thr Ser Ala Val Arg Gly Ala Tyr Pro 1585 1590 1595 1600 Asp Pro Met Ala Ser Leu Ser Pro Arg Pro Pro Ala Pro Arg Arg His 1605 1610 1615 His His His His His His Arg Arg Arg Arg Ala Pro Arg Arg Arg Ser 1620 1625 1630 Ala Ala Ser Asp Ser Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ser 1635 1640 1645 Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser 1650 1655 1660 Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ala Ala Arg Ala Pro Ala Ser Ala Ala 1665 1670 1675 1680 Asp His Ala Ala Gly Gly Thr Leu Gly Ala Asp Asp Glu Glu Ala Gly 1685 1690 1695 Val Pro Ala Arg Ala Pro Gly Ala Ala Pro Arg Pro Ser Pro Pro Arg 1700 1705 1710 Ala Glu Pro Ala Pro Ala Arg Thr Pro Ala Ala Thr Ala Gly Arg Leu 1715 1720 1725 Glu Arg Arg Arg Ala Arg Ala Ala Val Ala Gly Arg Asp Ala Thr Gly 1730 1735 1740 Arg Phe Thr Ala Gly Arg Pro Arg Arg Val Glu Leu Asp Ala Asp Ala 1745 1750 1755 1760 Ala Ser Gly Ala Phe Tyr Ala Arg Tyr Arg Asp Gly Tyr Val Ser Gly 1765 1770 1775 Glu Pro Trp Pro Gly Ala Gly Pro Pro Pro Pro Gly Arg Val Leu Tyr 1780 1785 1790 Gly Gly Leu Gly Asp Ser Arg Pro Gly Leu Trp Gly Ala Pro Glu Ala 1795 1800 1805 Glu Glu Ala Arg Ala Arg Phe Glu Ala Ser Gly Ala Pro Ala Pro Val 1810 1815 1820 Trp Ala Pro Glu Leu Gly Asp Ala Ala Gln Gln Tyr Ala Leu Ile Thr 1825 1830 1835 1840 Arg Leu Leu Tyr Thr Pro Asp Ala Glu Ala Met Gly Trp Leu Gln Asn 1845 1850 1855 Pro Arg Val Ala Pro Gly Asp Val Ala Leu Asp Gln Ala Cys Phe Arg 1860 1865 1870 Ile Ser Gly Ala Ala Arg Asn Ser Ser Ser Phe Ile Ser Gly Ser Val 1875 1880 1885 Ala Arg Ala Val Pro His Leu Gly Tyr Ala Met Ala Ala Gly Arg Phe 1890 1895 1900 Gly Trp Gly Leu Ala His Val Ala Ala Ala Val Ala Met Ser Arg Arg 1905 1910 1915 1920 Tyr Asp Arg Ala Gln Lys Gly Phe Leu Leu Thr Ser Leu Arg Arg Ala 1925 1930 1935 Tyr Ala Pro Leu Leu Ala Arg Glu Asn Ala Ala Leu Thr Gly Ala Arg 1940 1945 1950 Thr Pro Asp Asp Gly Gly Asp Ala Asn Arg His Asp Gly Asp Asp Ala 1955 1960 1965 Arg Gly Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Pro Ser Ala Ala Ala 1970 1975 1980 Ser Pro Ala Asp Glu Arg Ala Val Pro Ala Gly Tyr Gly Ala Ala Gly 1985 1990 1995 2000 Val Leu Ala Ala Leu Gly Arg Leu Ser Ala Ala Pro Ala Ser Ala Pro 2005 2010 2015 Ala Gly Ala Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Ala Gly Gly Gly Gly 2020 2025 2030 Gly Gly Arg Arg Ala Glu Ala Gly Arg Val Ala Val Glu Cys Leu Ala 2035 2040 2045 Ala Cys Arg Gly Ile Leu Glu Ala Leu Ala Glu Gly Phe Asp Gly Asp 2050 2055 2060 Leu Ala Ala Val Pro Gly Leu Ala Gly Ala Arg Pro Ala Ala Pro Pro 2065 2070 2075 2080 Arg Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Ala Pro Pro His Ala Asp Ala Pro 2085 2090 2095 Arg Leu Arg Ala Trp Leu Arg Glu Leu Arg Phe Val Arg Asp Ala Leu 2100 2105 2110 Val Leu Met Arg Leu Arg Gly Asp Leu Arg Val Ala Gly Gly Ser Glu 2115 2120 2125 Ala Ala Val Ala Ala Val Arg Ala Val Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu 2130 2135 2140 Gly Pro Ala Leu Pro Arg Ser Pro Arg Leu Leu Ser Ser Ala Ala Ala 2145 2150 2155 2160 Ala Ala Ala Asp Leu Leu Phe Gln Asn Gln Ser Leu 2165 2170 <210> 17 <211> 6519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding tPA-Flt3L-gD-IPC0-IPC4 fusion protein <400> 17 atggacgcca tgaagagagg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60 agccccagcc acgccaccca ggactgcagc ttccagcaca gccccatcag cagcgacttc 120 gccgtgaaga tcagagagct gagcgactac ctgctgcagg actaccccgt gaccgtggcc 180 agcaacctgc aggacgagga gctgtgcggc ggcctgtgga gactggtgct ggcccagaga 240 tggatggaga gactgaagac cgtggccggc agcaagatgc agggcctgct ggagagagtg 300 aacaccgaga tccacttcgt gaccaagtgc gccttccagc ctccccccag ctgcctgagg 360 ttcgtgcaga ccaacatcag cagactgctg caggagacca gcgagcagct ggtggccctg 420 aagccctgga tcaccagaca gaacttcagc agatgcctgg agctgcagtg ccagcccgac 480 agcagcaccc tgccccctcc ctggagcccc agacccctgg aggccaccgc tcccacagcc 540 cctggcagcg ggtccggaag tgggtctgga tccgggcgcg ccaagtatgc tctggccgac 600 ccaagcctga agatggccga ccctaataga ttccggggca agaacctgcc tgtcctggac 660 cagctgaccg atccccctgg cgtgaagcgc gtctaccaca tccagccttc actggaggac 720 ccattccagc cacccagcat ccctattacc gtgtactatg ctgtcctgga acgcgcatgc 780 cgaagtgtgc tgctgcacgc tccctcagag gcacctcaga tcgtcagagg agcctccgat 840 gaagctagga agcatactta caacctgacc attgcctggt atcggatggg cgacaattgt 900 gctatcccca ttacagtgat ggagtacact gaatgccctt ataacaaatc tctgggcgtc 960 tgtcccattc gaacacagcc tcggtggtcc tactatgatt cattcagcgc cgtgtctgag 1020 gacaacctgg gcttcctgat gcacgctcca gcatttgaaa cagccgggac ttatctgaga 1080 ctggtgaaaa tcaatgattg gaccgagatc acacagttta ttctggaaca tagggcccgc 1140 gctagctgca agtacgcact gccactgagg attcctccag cagcttgtct gaccagtaaa 1200 gcttatcagc agggagtgac agtggactca atcggcatgc tgccacgctt cattcccgag 1260 aaccagcgaa ccgtggcact gtacagcctg aagatcgctg ggtggcacgg acccaaaccc 1320 ccttatacta gcaccctgct gccacccgag ctgtccgata ccacaaatgc cacacagccc 1380 gaactggtgc ctgaggaccc agaagacagc gcactgctgg aggaccctgc cggcactgtg 1440 agctcccaga tccctccaaa ctggcatatc cctagcattc aggacgtggc accacaccat 1500 gcaccagcag caccttccaa tccacggaga agggctcaga tggcaccaaa gcgactgcgg 1560 ctgccccaca ttagagacga tgacgccccc ccttcccatc agcctctgtt ttacggagga 1620 ggaggctccg gaggaggagg atctggaggc gggggaagtg gcgggggagg ctcaggggga 1680 ggcggatcta tggaacccag accaggaact tcaagcagag ccgacccagg accagaaaga 1740 cctccccgac agacaccagg cactcagcca gccgcaccac acgcctgggg catgctgaat 1800 gatatgcagt ggctggccag ctccgactct gaggaggaga cagaggtggg catctccgat 1860 gacgatctgc acagggactc cacaagcgag gccggctcca ccgataccga gatgtttgag 1920 gccggcctga tggacgccgc cacccctcca gcccggcccc cagccgagag gcagggctct 1980 ccaacacccg ccgatgccca gggctcctgc ggcggcggcc ctgtgggcga ggaggaggcc 2040 gaggccggcg gcggcggcga cgtgtgcgcc gtgtgcacag acgagatcgc cccacctctg 2100 agatgccaga gctttccatg tctgcaccca ttctgcatcc catgcatgaa gacctggata 2160 cctctgagga atacctgtcc tctgtgcaat accccagtgg cctacctgat cgtgggcgtg 2220 accgcctctg gctcctttag cacaatcccc atcgtgaacg atcctagaac ccgggtggag 2280 gccgaggccg ccgtgcgggc cggcaccgcc gtggatttca tctggaccgg caacccacgg 2340 acagccccta ggtctctgag cctgggcggc cacaccgtga gagccctgag ccccacaccc 2400 ccttggccag gcacagacga tgaggatgac gacctggccg acgtggatta tgtgccccct 2460 gcccccagaa gagccccccg gagaggcggc ggcggcgccg gcgccacaag aggcacatcc 2520 cagcctgccg ccacaaggcc tgccccacct ggcgccccac ggtcctcctc cagcggcggc 2580 gccccactgc gggccggcgt gggctccggc tccggcggcg gcccagccgt ggccgccgtg 2640 gtgcccagag tggccagcct gcctccagcc gccggcggcg gcagagccca ggccagacgg 2700 gtgggcgagg atgccgccgc cgccgagggc cggacacccc ctgccagaca gccaagagcc 2760 gcccaggagc cccctatcgt gatcagcgac tctccacctc cctccccaag aaggccagcc 2820 ggcccaggcc ctctgtcctt tgtgagctct tcttccgccc aggtgtcttc cggcccaggc 2880 ggcggcggcc tgcctcagtc ctccggcaga gccgccagac cacgggccgc cgtggcccct 2940 agagtgagga gccccccaag ggccgccgcc gccccagtgg tgtccgcctc cgccgatgcc 3000 gccggcccag ccccacccgc cgtgccagtg gacgcccaca gggccccacg gagcagaatg 3060 acccaggccc agaccgatac ccaggcccag agcctgggca gggccggcgc caccgatgcc 3120 agaggctccg gcggcccagg cgccgagggc ggccccggcg tgcccagggg cacaaataca 3180 ccaggcgccg ccccccacgc cgccgagggc gccgccggca gcgattccgg ccctgccgcc 3240 tcctcttctg cctccagcag cgccgcccca cgctctcccc tggccccaca gggcgtgggc 3300 gccaagcggg ccgccccaag acgggcccct gactccgatt ccggcgatcg gggccacggc 3360 ccactggccc ctgcctctgc cggcgccgcc cctcctagcg cctccccaag ctctcaggcc 3420 gccgtggccg ccgccagctc cagctccgcc agctcttcct ctgccagctc ctcctctgcc 3480 tcctcctcct ctgcctcttc cagctctgcc agctctagca gcgcctcctc tagctccgcc 3540 tcttctagcg ccggcggcgc cggcggctcc gtggcctctg cctccggcgc cggcgagaga 3600 agagagacct ctctgggccc aagagccgcc gcccccagag gccctagaaa gtgtgccagg 3660 aagaccaggc acgccgaggg cggcccagag ccaggcgccc gcgaccctgc cccaggcctg 3720 acacggtatc tgccaatcgc cggcgtgagc tctgtggtgg ccctggcccc atatgtgaac 3780 aagacagtga caggcgactg tctgccagtg ctggacatgg agacaggcca catcggcgcc 3840 tatgtggtgc tggtggacca gacaggcaat gtggccgatc tgctgagagc cgccgcccct 3900 gcctggtcca gaaggacact gctgccagag cacgccagaa actgcgtgag accacctgac 3960 tatcccacac cacccgcctc tgagtggaat agcctgtgga tgacaccagt gggcaacatg 4020 ctgtttgatc agggcacact ggtgggcgcc ctggatttcc acggcctgag atcccgccac 4080 ccttggtcca gagagcaggg cgcccccgcc ccagccggcg atgccccagc cggccacggc 4140 gagggcggcg gcggctcagg gggggggggc agcggcggag gtggctcagg aggtggaggt 4200 agcggaggtg gcggatctat gtcagcagaa cagaggaaga agaagaaaac aacaacaact 4260 actcagggaa ggggagcaga agtggcaatg gcagacgagg atggaggcag actgagggcc 4320 gccgccgaga caaccggcgg cccaggctct cctgacccag ccgatggccc accaccaaca 4380 cccaacccag accgcagacc agccgccaga cctggctttg gctggcacgg cggcccagag 4440 gagaacgagg atgaggccga cgatgccgcc gccgatgccg acgccgatga ggccgccccc 4500 gcctccggcg aggccgtgga cgagccagcc gccgacggcg tggtgtctcc tagacagctg 4560 gccctgctgg cctccatggt ggacgaggcc gtgaggacca tcccatctcc tcctccagag 4620 agagatggcg cccaggagga ggccgccagg agcccatccc ccccaagaac ccctagcatg 4680 agagccgact atggcgagga gaacgatgat gacgacgacg atgacgatga tgatgacagg 4740 gacgccggcc gctgggtgcg gggcccagag accacatctg ccgtgagagg cgcctatcct 4800 gacccaatgg cctctctgag cccaagacct cccgccccaa gacggcacca ccaccaccac 4860 caccacagga gacggagggc cccaagaagg cggagcgccg ccagcgactc ctctaagtct 4920 ggctccagca gctctgcctc cagcgccagc tcctctgcca gctcctcctc tagcgccagc 4980 gcctcttcct ccgacgatga tgacgatgat gacgccgcca gggcccctgc ctccgccgcc 5040 gatcacgccg ccggcggcac cctgggcgcc gatgacgagg aggccggcgt gccagccaga 5100 gccccaggcg ccgcccccag gccttctcca ccaagagccg agcccgcccc agccaggacc 5160 ccagccgcca cagccggcag actggagcgg agacgcgcca gagccgccgt ggccggcaga 5220 gatgccacag gcaggtttac cgccggcagg cccagaaggg tggagctgga tgccgatgcc 5280 gcctccggcg ccttttacgc cagatacagg gacggctacg tgagcggcga gccctggcca 5340 ggcgccggcc ctcccccacc tggcagggtg ctgtatggcg gcctgggcga tagcagacct 5400 ggcctgtggg gcgcccctga ggccgaggag gccagagcca gattcgaggc ctctggcgcc 5460 ccagcccccg tgtgggcccc agagctgggc gacgccgccc agcagtacgc cctgatcacc 5520 agactgctgt ataccccaga cgccgaggcc atgggctggc tgcagaaccc tagagtggcc 5580 ccaggcgacg tggccctgga tcaggcctgc ttccggatct ctggcgccgc ccggaacagc 5640 tctagcttta tctccggctc tgtggccaga gccgtgccac acctgggcta cgccatggcc 5700 gccggcaggt tcggctgggg cctggcccac gtagccgccg ccgtggccat gtccagacgg 5760 tatgacagag cccagaaggg ctttctgctg acatctctga ggcgggccta tgcccctctg 5820 ctggccaggg agaatgccgc cctgacaggc gccagaaccc ctgacgacgg cggcgatgcc 5880 aacagacacg atggcgacga tgccagaggc aagccagccg ccgccgccgc ccccctgcca 5940 tccgccgccg cctcccccgc cgatgagaga gccgtgcctg ccggctatgg cgccgccggc 6000 gtgctggccg ccctgggccg gctgtctgcc gccccagcct ccgcccccgc cggcgccgac 6060 gatgatgacg acgatgatgg cgccggcggc ggcggcggcg gcagacgggc cgaggccggc 6120 agggtggccg tggagtgtct ggccgcctgc cgcggcatcc tggaggccct ggccgagggc 6180 tttgatggcg acctggccgc cgtgcccggc ctggccggcg ccagacctgc cgccccacct 6240 agacctggcc ccgccggcgc cgccgccccc cctcacgccg acgccccacg gctgagagcc 6300 tggctgagag agctgagatt cgtgcgggac gccctggtgc tgatgcggct gagaggcgat 6360 ctgcgggtgg ccggcggctc tgaggccgcc gtggccgccg tgagagccgt gtccctggtg 6420 gccggcgccc tgggcccagc cctgcctaga tccccaagac tgctgtcctc cgccgctgcc 6480 gctgccgccg acctgctgtt tcagaaccag agcctgtaa 6519

Claims

HSV-2의 UL39 단백질의 아미노산 서열상 14-154 a.a 위치에 상응하는 펩타이드에서 78-104 a.a 위치에 상응하는 막통과 도메인이 결실된 UL39-N1 펩타이드, 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 1117-1142 a.a 위치에 상응하는 UL39-C2 펩타이드, 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 155-227 a.a 위치에 상응하는 UL39-N2 펩타이드, 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 399-1116 a.a 위치에 상응하는 UL39 N4-C1 펩타이드, 및 상기 UL39 단백질의 아미노산 서열상 208-398 a.a 위치에 상응하는 UL39-N3 펩타이드가 무작위적으로 섞여있고, 원래의 UL39 단백질의 아미노산 서열은 포함하지 않는 셔플드 UL39 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서,
하나 또는 둘 이상의 면역 증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서,
상기 면역 증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator), CD40 L(리간드) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서,
분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
제4항에 있어서,
상기 분비 신호서열은 tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gD(단순포진 바이러스 당단백질 D) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열인, 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서,
하나 또는 둘 이상의 제2형 단순포진 바이러스(HSV-2)의 항원 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
제6항에 있어서,
상기 항원 단백질은 당단백질 B(gB), 당단백질 D(gD), ICP0 또는 ICP4인, 폴리뉴클레오타이드.
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제1항에 있어서,
상기 셔플드 UL39 단백질은 상기 UL-39-N1 펩타이드, 상기 UL39-C2 펩타이드, 상기 UL39-N2 펩타이드, 상기 UL39 N4-C1 펩타이드, 및 상기 UL39-N3 펩타이드가 순차적으로 연결된, 폴리뉴클레오타이드.
제1항 내지 제7항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
코돈 최적화된, 폴리뉴클레오타이드.
제1항 내지 제7항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 UL-39-N1 펩타이드는 서열번호 1,
상기 UL39-C2 펩타이드는 서열번호 2,
상기 UL39-N2 펩타이드는 서열번호 3,
상기 UL39 N4-C1 펩타이드는 서열번호 4, 및
상기 UL39-N3 펩타이드는 서열번호 5로 구성되는, 폴리뉴클레오타이드.
제1항 내지 제7항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 셔플드 UL39 단백질은 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 폴리뉴클레오타이드.
제1항 내지 제7항 및 제12항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
제16항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 발현벡터인, 벡터.
제16항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
제1항 내지 제7항 및 제12항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신 조성물.
제1항 내지 제7항 및 제12항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 재조합 단백질.
ICP4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
gB 단백질을 암호화하하는 폴리뉴클레오타이드, gD 단백질를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 제1항의 폴리뉴클레오타이드, 및 ICP0 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터..
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제21항에 있어서,
상기 ICP4는 767-1318 a.a 위치에 상응하는 RS1.3 부위가 결실된 것인, 발현벡터.
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제21항 또는 제25항에 있어서,
상기 gB 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 gD 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 제1항의 폴리뉴클레오타이드, 상기 ICP0 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 ICP4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 별개의 단백질로 발현되거나 하나의 융합단백질 형태로 발현되는, 발현벡터.
제21항 또는 제25항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 분비 신호서열 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 발현벡터.
제30항에 있어서,
상기 분비 신호서열은 tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열인, 발현벡터.
제21항 또는 제25항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 면역 증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 발현벡터.
제32항에 있어서,
상기 면역 증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator), CD40 L(리간드) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, 발현벡터.
제21항 또는 제25항의 발현벡터를 포함하는 DNA 백신 조성물.
gB 및 제1항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 셔플드 UL39 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터 및 gD, ICP0 및 ICP4를 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하는 DNA 백신 조성물.
제35항에 있어서,
상기 제1융합단백질 및/또는 상기 제2융합단백질은 분비 신호서열을 추가로 포함하는, DNA 백신 조성물.
제36항에 있어서,
상기 분비 신호서열은 tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열인, DNA 백신 조성물.
제36항에 있어서,
상기 제1융합단백질 및/또는 상기 제2융합단백질은 면역 증진 펩타이드를 추가로 포함하는, DNA 백신 조성물.
제38항에 있어서,
상기 면역 증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator), CD40 L(리간드) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, DNA 백신 조성물.