CN108419437A - 用于预防和治疗hsv-2感染的dna疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及新的用于预防和治疗单纯疱疹病毒‑2(HSV‑2)感染的DNA疫苗，并提供编码改组UL39蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和包含所述载体的DNA疫苗组合物。

Description

用于预防和治疗HSV-2感染的DNA疫苗
技术领域
根据35 U.S.C. §119，本申请要求2016年9月28日提交的韩国专利申请号10-2016-0125149的优先权，以及从其中产生的所有权益，所述申请的内容通过引用以其整体结合。
本公开内容涉及一种新的DNA疫苗，更具体而言，涉及一种用于预防和治疗单纯疱疹病毒-2 (HSV-2)感染的DNA疫苗。
背景技术
单纯疱疹病毒-2 (HSV-2)为疱疹病毒科(Herpetovirida)的成员，为一种导致皮肤病损的DNA病毒，全世界范围内有5亿人受HSV-2感染，且预计每年将出现两千三百万新感染HSV-2人群。在美国，据报道五分之一的成人受HSV-2感染，且在包括金砖四国(巴西、俄罗斯、印度和中国)在内的大多数国家，感染率亦相对较高。HSV-2通过粘膜或皮肤的损伤区感染，在病毒复制期间在感染区导致诸如病毒性坏死等症状。作为一种特殊病，HSV-2为生殖器溃疡的主要病因，生殖器溃疡为在破裂时导致疮瘢痕的水疱的小型充液聚集物。HSV-2亦导致诸如发热、整体疾病(overall sickness)、肌肉痛、小便疼痛、阴道分泌物等症状。HSV-2沿感觉神经元的轴突侵入背根神经节，并经历达数年或终生的潜伏期以反复再活化。因为即便当其处于无症状状态时，HSV-2亦能在人与人之间传播，所以非常难以控制所述病毒的传播。事实上，血清学HSV-2阳性个体的传播从1976年至1994年增加了30%，除非防止进一步感染的传播，至2025年，感染率对于男性而言将增加至39%，对于女性而言将增加至49%。此外，受HSV-2感染的妇女分娩的新生儿中有60%死亡且其中20%在神经系统或眼中具有严重的后遗症，以及HSV-2感染人群有三倍高的可能性感染HIV，这一事实已成为全球公共卫生的严重问题。另外，HSV-2感染正在变为巨大的经济负担。例如，1996年美国用于治疗HSV-2感染的年度直接医疗费用估计为2.83亿美元至9.84亿美元。
发明内容
技术问题
遗憾的是，至今仍没有可从根本上治疗HSV-2感染的疗法，且对症的治疗选项有限。使用了通过干扰病毒DNA合成来抑制病毒复制的抗病毒剂(例如泛昔洛韦、伐昔洛韦或阿昔洛韦)。当在病毒感染的初期应用这些药物时，临床症状可得到缓解或病毒转移可被减少，然而，不能防止病毒感染的复发和传播且难以治愈。例如，阿昔洛韦可减少HSV-2传播，但其不能防止HSV-2在神经节中的潜伏性感染。此外，抗病毒疗法导致许多副作用，包括恶心、呕吐和肾功能下降。由于现有抗病毒药物未满足医疗需求，尝试了用于预防和治疗HSV-2的新的多种疫苗，但它们均无效。含有灭活病毒、减活病毒(reduced live virus)、改良活病毒和细胞培养物来源的亚单位的常规疫苗通常不成功或有效性极低。最新三种候选疫苗(即Chiron开发的疫苗、GlaxoSmithKline (GSK)开发的疫苗和Vical开发的疫苗)的临床试验结果显示为无效的。Chiron疫苗由与佐剂MF59缀合的HSV-2的截短形式的gD和gB2组成，其显示产生针对HSV-2的高滴度抗体，但Chiron疫苗的效应为暂时的。GSK的疫苗包含作为佐剂的明矾和MPL以及gD，其亦未能预防和治疗HSV-2感染。最后，来自Vical的疫苗包含作为佐剂的佐剂Vaxfectin以及gD或UL46和UL47，其在动物实验中产生高滴度抗体，然而，在临床试验中，HSV-2感染未显示与对照组的任何差异。从前述案例中可以确认的是，对HSV-2的高滴度抗体反应不足以预防和治疗HSV-2感染，因此，需要开发基于抗HSV-2感染的新免疫机制的治疗剂。
针对问题的技术方案
为解决上述各种问题，本公开内容提供能够有效预防和治疗HSV-2感染的新DNA疫苗。
然而，本公开内容不限于此。
根据另一个示例性实施方案，本公开内容提供编码改组UL39蛋白的多核苷酸，所述改组UL39蛋白包含以下五个肽：UL39-N1肽，其对应于HSV-2的UL39蛋白的氨基酸序列的第14-154位氨基酸，其中缺失了对应于第78-104位氨基酸的跨膜结构域；UL39-C2肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第1117-1142位氨基酸；UL39-N2肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第155-227位氨基酸；UL39 N4-C1肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第399-1116位氨基酸；和UL39-N3肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第208-398位氨基酸，其中所述五个肽为随机混合的，但所述改组UL39蛋白不包含所述UL39蛋白的原始氨基酸序列。
根据又另一个示例性实施方案，本公开内容提供包含所述多核苷酸的载体。
根据又另一个示例性实施方案，本公开内容提供包含所述载体的分离的宿主细胞。
根据又另一个示例性实施方案，本公开内容提供包含所述多核苷酸或所述载体或药学上可接受的载体的组合物。
根据又另一个示例性实施方案，本公开内容提供由所述多核苷酸编码的重组蛋白。
根据又另一个示例性实施方案，本公开内容提供一种表达载体，其包含编码两种或更多种或所有HSV-2抗原蛋白的一种或多种多核苷酸，所述HSV-2抗原蛋白选自gB、gD、UL39、ICP0和ICP4蛋白。
根据又另一个示例性实施方案，本公开内容提供包含所述多核苷酸、所述载体或所述表达载体的DNA疫苗组合物。
发明的有益效果
根据本公开内容一个实施方案的DNA构建能够表达改组UL39以及包含所述改组UL39和常规HSV-2抗原的融合蛋白，表现出防御炎症的有效能力，并因此能够非常有效地用作用于预防和治疗HSV-2的疫苗。
附图说明
图1显示阐述根据本公开内容一个实施方案的改组UL39蛋白结构的示意图。
图2显示阐述使用被设计为表达根据本公开内容一个实施方案的改组UL39蛋白的质粒DNA的动物实验程序概述的示意图。
图3显示阐述通过将被设计为表达根据本公开内容的改组UL39蛋白的质粒DNA和作为阴性对照的模拟质粒DNA给予受HSV-2感染的动物的存活率的图表。
图4显示阐述通过根据本公开内容一个实施方案的tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA表达的融合蛋白各自的结构的示意图。
图5显示阐述根据本公开内容一个实施方案在以下各组中HSV-2感染的实验时间表的示意图：分别给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的组；在共同给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的组；和给予模拟质粒DNA作为阴性对照的组。
图6a为显示根据本公开内容一个实施方案的以下各实验动物组的存活率的图表：受HSV-2感染且分别给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA (-)和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的组；共同给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的组；给予模拟质粒DNA作为阴性对照的组；和图6b为显示图6a的实验动物组的病理评分的图表。
具体实施方式
根据本公开内容的一个方面，提供一种编码改组UL39蛋白的多核苷酸，其中所述改组UL39蛋白包含以下五个肽：UL39-N1肽，其对应于HSV-2的UL39蛋白的氨基酸序列的第14-154位氨基酸且缺失了其中对应于第78-104位氨基酸的跨膜结构域；UL39-C2肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第1117-1142位氨基酸；UL39-N2肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第155-227位氨基酸；UL39 N4-C1肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第399-1116位氨基酸；和UL39-N3肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第208-398位氨基酸，其中所述五个肽为随机混合的，但所述改组UL39蛋白不包含所述UL39蛋白的原始氨基酸序列。
本文使用的术语“改组的”是指当在特定蛋白中存在多个结构域时混合结构域的顺序。具体而言，本文使用的术语“改组蛋白”(亦称“表位改组蛋白”)是指这样的重组蛋白，其中将多个表位的顺序进行随机混合，同时保持所述多个表位被免疫系统识别的活性，并且其为丧失作为蛋白的原始功能而保留所述表位的活性的免疫原性蛋白。
用于产生改组UL39蛋白的UL39蛋白可以是作为标准序列的注册为UniProt注册号P89462的RIR1_HHV2H，且可毫无问题地使用具有UL39蛋白功能的各种变体(例如UniProte注册号G91261、A0A0E3Y5Z7、A0A0E3Y7N5、A0A120I2I0、A0A110B8A6和A0A0E3Y758)，当任何变体的长度与标准序列的长度不相同时，将使用与标准序列的位置相对应的位置。
所述多核苷酸可进一步包含编码一种或两种或更多种免疫增强肽的多核苷酸，免疫增强肽可以是CD28的胞质域、可诱导共刺激分子(inducible costimulatory, ICOS)、细胞毒性T淋巴细胞相关的蛋白4 (CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1 (PD1)、B淋巴细胞和T淋巴细胞相关的蛋白(BTLA)、死亡受体3 (DR3)、4-1BB、CD2、CD40、CD30、CD27、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM)、2B4 (CD244)、自然杀伤细胞2族成员D (NKG2D)/ DNAX-活化蛋白12(DAP12)、含T-细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白1 (TIM1)、TIM2、TIM3、TIGIT、CD226、CD160、淋巴细胞活化基因3 (LAG3)、B7-1、B7-H1、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关的蛋白(GITR)、fms样酪氨酸激酶3 (Flt3)配体、鞭毛蛋白、疱疹病毒侵入介体(HVEM)、CD40 L (配体)或者OX40L [CD134(OX40)的配体，CD252]或其两种或更多种的连接肽。
本文使用的术语“免疫增强肽”是指活化与免疫反应相关的细胞(例如树突细胞等)并从而增强免疫反应的肽。
所述多核苷酸可进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸，分泌信号肽诱导改组UL39蛋白的胞外分泌，且可以是用于组织纤溶酶原活化物(tPA)的信号序列、用于单纯疱疹病毒糖蛋白D (HSV gD)的信号序列或者用于生长激素的信号序列。
所述多核苷酸可进一步包含编码2型单纯疱疹病毒(HSV-2)的一种或两种或更多种抗原蛋白的多核苷酸。抗原蛋白可以是糖蛋白B (gB)、糖蛋白D (gD)、ICP0或ICP4。
在上述多核苷酸中，糖蛋白B可以是其中缺失了对应于第1-22位氨基酸的信号序列和对应于第772-792位氨基酸的跨膜结构域的截短形式；糖蛋白D可以是其中缺失了对应于第1-25位氨基酸的信号序列和对应于第341-364位氨基酸的跨膜结构域的截短形式；ICP0可以是其中缺失了对应于第510-516位氨基酸的核定位信号(NLS)的截短形式；和ICP4可以是其中缺失了对应于第767-1318位氨基酸的RS1.3区的截短形式。
同样，就抗原蛋白而言，当标准序列为gB时，使用注册为UniProt注册号P08666的GB_HHV2H；当标准序列为gD时，使用注册为UniProt注册号Q69467的GD_HHV2H；当标准序列为ICP0时，使用注册为UniProt注册号P28284的ICP0_HHV2H；和当标准序列为ICP4时，使用注册为UniProt注册号P90493的ICP4_HHV2H。抗原蛋白的氨基酸位置为基于标准序列指出的位置，亦可使用保留了抗原性蛋白的活性的各种变体，以及当这些变体的长度与标准序列的长度不相同时，将使用与标准序列的氨基酸位置相对应的氨基酸位置。各种变体的实例可包括：在gB的情况下，可使用具有UniProt注册号P06763、Q69465、D6QV12、D6QV07等的变体；在gD的情况下，可使用具有UniProt注册号P03172、T1PZZ0、A0A0Y0QWV3、A0A110AVP3、A0A0Y0RM80等的变体；在ICP0的情况下，可使用具有UniProt注册号G9I221、G9I280、W0NW81、D6PUZ6、D6PUZ3等的变体；在ICP4的情况下，可使用具有UniProt注册号G9I282、A0A0E3Y5F0、A0A0Y0RBE8、A0A120I2I2、A0A0Y0RAK6等的变体。
另外，可使用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子置换所述多核苷酸。本文使用的术语“使用在宿主细胞中有高表达频率的密码子置换的密码子”或“优化的密码子”意指，当DNA在宿主细胞中转录和翻译成蛋白时，在决定氨基酸的密码子中，存在根据宿主具有高偏好性的密码子，且由所述核酸编码的氨基酸或蛋白的表达效率通过置换成具有高偏好性的密码子来提高。
在所述多核苷酸中，UL39-N1肽可包括SEQ ID NO: 1；UL39-C2肽可包括SEQ IDNO: 2；UL39-N2肽可包括SEQ ID NO: 3；UL39 N4-C1肽可包括SEQ ID NO: 4；和UL39-N3肽可包括SEQ ID NO: 5。另外，改组UL39可依序地包含SEQ ID NO: 1的UL39-N1肽、SEQ IDNO: 2的UL39-C2肽、SEQ ID NO: 3的UL39-N2肽、SEQ ID NO: 4的UL39 N4-C1肽和SEQ IDNO: 5的UL39-N3肽，以及在此情况下，改组UL39蛋白可包括SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。然而，各肽的顺序变化可不导致任何问题，只要其与原始全长UL39蛋白的氨基酸序列不相同。
根据本公开内容的另一个方面，提供包含所述多核苷酸的载体。
根据本公开内容一个实施方案，载体可以是表达载体，其包含与调控序列可操作连接的基因构建体，并因此允许所述多核苷酸在宿主细胞中表达改组UL39蛋白。表达载体可以是任何形式的，包括但不限于质粒载体、病毒载体、粘粒载体、噬菌粒载体、人工人染色体等。
本文使用的术语“与……可操作连接”意指，目标核酸序列(例如在体外转录/翻译系统中或在宿主细胞中)以使所述核酸能够表达的方式与调控序列连接。
本文使用的术语“调控序列”意在包括启动子、增强子及其他调控元件(例如多腺苷酸化信号)。调控序列包括：指导靶核酸在许多宿主细胞中的组成型表达的调控序列、指导靶核酸仅在特定组织细胞中表达的调控序列(例如组织特异性调控序列)以及指导由特定信号诱导的表达的调控序列(例如诱导型调控序列)。本领域技术人员将能够理解，表达载体的设计可根据诸如待转化宿主细胞的选择以及所需的蛋白表达水平等因素而变化。可将本公开内容的表达载体引入宿主细胞中以表达融合蛋白。使得能够在真核细胞和原核细胞中表达的调控序列对本领域技术人员而言为众所周知的。如上所述，这些调控序列通常包括负责起始转录的调控序列，以及选择性地包括负责终止转录和稳定转录物的多聚A信号。除转录调控元件之外，另外的调控序列可包括翻译增强因子和/或天然结合的或异源的启动子区。例如，使得能够在哺乳动物宿主细胞中表达的可能的调控序列可包括：CMV-HSV胸苷激酶启动子、SV40、RSV-启动子(弱肉瘤病毒)、人肾成分1 α-启动子(human renalelement 1 α-promoter)、糖皮质激素诱导型MMTV-启动子(Moloney鼠肿瘤病毒)、金属硫蛋白诱导型或四环素诱导型启动子、或者诸如CMV或SV40-扩增剂等的扩增剂。对于在神经元内的表达，认为可使用神经丝-启动子、PGDF-启动子、NSE-启动子、PrP-启动子或者thy-1-启动子。这样的启动子在本领域中为已知的且见述于文献(Charron，J. Biol. Chem. 270:25739-25745，1995)。对于原核表达，已公开许多启动子，包括lac启动子、tac启动子和trp启动子。除能够起始转录的因子之外，调控序列亦可包括转录终止信号，例如根据本公开内容一个实施方案，位于所述多核苷酸下游的SV40-多聚-A或TK-多聚-A位点。在本公开内容中，合适的表达载体在本领域中为众所周知的，它们包括例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1 (Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3 (Invitrogen)、pSPORT1 (GIBCO BRL)、pGX27 (韩国专利号1442254)、pX (Pagano，Science 255，1144-1147，1992)、诸如pEG202和dpJG4-5 (Gyuris，Cell 75，791-803，1995)等酵母双杂交载体或者诸如λgt11或pGEX(Amersham-Pharmacia)等原核表达载体。除本公开内容的核酸分子之外，载体亦可额外地包含编码分泌信号肽的多核苷酸。这种分泌信号肽对本领域技术人员而言为众所周知的。另外，根据使用的表达系统，将可把融合蛋白导向特定胞间细胞器的前导序列与根据本公开内容一个实施方案的多核苷酸的编码序列连接，优选能够直接从其中分泌翻译蛋白到胞浆外周或胞外基质中的前导序列。
此外，本公开内容的载体可通过标准重组DNA技术来制备，标准重组DNA技术可包括例如平末端连接和粘性末端连接、限制酶处理以提供适当的末端、通过碱性磷酸酶处理进行磷酸化以防止不当结合、通过T4 DNA连接酶酶促连接等。本公开内容的载体可通过将编码信号肽的DNA (其通过化学合成或基因重组技术获得)和本公开内容的编码HSV-2抗原蛋白的DNA与包含适当调控序列的载体重组来制备。包含调控序列的载体可市购或制备，以及在本公开内容一个实施方案中，制备并使用用于产生DNA疫苗的载体pGX27。
本文使用的术语“融合蛋白”是指其中将两个或更多个蛋白或蛋白中负责特定功能的结构域连接，使得各蛋白或结构域负责其固有功能的重组蛋白。通常可将具有柔性结构的接头插入两个或更多个蛋白或结构域之间。诸如GS4等多种接头作为这类接头是已知的。
根据本公开内容的另一个方面，提供包含所述载体的分离的宿主细胞。
本文使用的术语“宿主细胞”包括原核细胞或真核细胞，且真核细胞包括高等真核细胞(包括哺乳动物)以及低等真核细胞(包括真菌、酵母等)。
使用根据本公开内容的载体转染或转化的宿主细胞或非人宿主对象可以是被所述载体遗传修饰的宿主细胞或宿主对象。本文使用的术语“遗传修饰的”意指，引入到宿主细胞、宿主对象或先祖/亲代之一中的根据本公开内容一个实施方案的多核苷酸或载体存在于所述宿主细胞、宿主对象或先祖/亲代的基因组之外。此外，根据本公开内容一个实施方案的多核苷酸或载体可作为独立的分子存在于基因组之外，优选为在遗传修饰的宿主细胞或宿主对象中的可复制分子，例如附加体。或者，其可稳定地插入宿主细胞或宿主对象的基因组中。
根据本公开内容一个实施方案的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。合适的原核细胞为常用于克隆的那些细胞，例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。另外，真核细胞包括真菌、植物细胞和动物细胞。合适的真菌细胞的实例为酵母，优选酵母属(Saccharomyces)的酵母，以及最优选酿酒酵母(S. cerevisiae)。合适的动物细胞的实例可包括昆虫细胞和优选的哺乳动物细胞(例如HEK293、293T、NSO、CHO、MDCK、U2-OSHela、NIH3T3、MOLT-4、Jurkat、PC-12、PC-3、IMR、NT2N、Sk-n-sh、CaSki和C33A)。例如CHO细胞等的宿主细胞可提供：根据本公开内容一个实施方案的改组UL39蛋白的翻译后修饰、改组UL39蛋白在精确位置的糖基化以及功能分子的分泌。另外，在本领域中已知的合适细胞系可获自诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)等细胞系保藏库。根据本公开内容，认为原代培养细胞/细胞培养物能够充当宿主细胞。这些细胞尤其来源于昆虫(果蝇属(Drosophila)或蠊属(Blatta)的昆虫)或哺乳动物(人、猪、小鼠或大鼠)。如上所述，原代培养细胞可以是免疫细胞，其包括巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、造血干细胞、淋巴因子活化的杀伤细胞、gd细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、T细胞或自然杀伤细胞(NK细胞)。
根据本公开内容的另一个方面，提供包含所述多核苷酸或载体和药学上可接受的载体的组合物。
除载体之外，组合物可进一步包含药学上可接受的佐剂、赋形剂或稀释剂。
本文使用的术语“药学上可接受的”是指，组合物为生理学上可接受的，且在给予人时一般不会导致诸如胃肠道病症、头晕等变态反应。载体、赋形剂和稀释剂的实例可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、苯甲酸羟基酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。此外，可额外包含填充剂、抗凝血剂、润湿剂、湿润剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
根据本公开内容的另一个方面，提供由所述多核苷酸编码的重组蛋白。
根据本公开内容的另一个方面，提供一种表达载体，其包含编码两种或更多种或全部HSV-2抗原蛋白的一种或多种多核苷酸，所述HSV-2抗原蛋白选自gB、gD、UL39、ICP0和ICP4蛋白。
对于表达载体，gB可以是其中缺失了对应于第1-22位氨基酸的信号序列和对应于第772-792位氨基酸的跨膜结构域的多核苷酸；gD可以是其中缺失了对应于第1-25位氨基酸的信号序列和对应于第341-364位氨基酸的跨膜结构域的多核苷酸；ICP0可以是其中缺失了对应于第510-516位氨基酸的核定位信号(NLS)的多核苷酸；和ICP4可以是其中缺失了对应于第767-1318位氨基酸的RS1.3区的多核苷酸。
在上述表达载体中，UL39可以是混合有内部结构域的改组UL39蛋白，以及改组UL39蛋白可由任何上述多核苷酸编码。
此外，可制备表达载体，使得gB、gD、UL39、ICP0和ICP4蛋白表达为单独的蛋白或者以单一融合蛋白形式表达。
在上述表达载体中，如上所述，虽然改组UL39蛋白为其中SEQ ID NO: 1的UL39-N1肽、SEQ ID NO: 2的UL39-C2肽、SEQ ID NO: 3的UL39-N2肽、SEQ ID NO: 4的UL39 N4-C1肽和SEQ ID NO: 5的UL39-N3肽随机混合的蛋白，但改组UL39蛋白可以是其中SEQ ID NO: 1-5的肽依序连接的蛋白。然而，在此情况下，改组UL39蛋白不包括原始全长UL39蛋白。
在上述表达载体中，gB、gD、UL39、ICP0和ICP4蛋白可表达为单独的蛋白或者以单一融合蛋白形式表达。
在上述表达载体中，所述多核苷酸可进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸，且如上所述，分泌信号肽可以是用于组织纤溶酶原活化物(tPA)的信号肽、用于单纯疱疹病毒糖蛋白D (HSV gD)的信号肽或者用于生长激素的信号肽。
在上述表达载体中，免疫增强肽为CD28的胞质域、可诱导共刺激分子(ICOS)、细胞毒性T淋巴细胞相关的蛋白4 (CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1 (PD1)、B淋巴细胞和T淋巴细胞相关的蛋白(BTLA)、死亡受体3 (DR3)、4-1BB、CD2、CD40、CD30、CD27、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM)、2B4 (CD244)、自然杀伤细胞2族成员D (NKG2D)/ DNAX-活化蛋白12(DAP12)、含T-细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白1 (TIM1)、TIM2、TIM3、TIGIT、CD226、CD160、淋巴细胞活化基因3 (LAG3)、B7-1、B7-H1、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关的蛋白(GITR)、fms样酪氨酸激酶3 (Flt3)配体、鞭毛蛋白、疱疹病毒侵入介体(HVEM)、CD40 L (配体)或者OX40L [CD134(OX40)的配体，CD252]或其两种或更多种的连接肽。免疫增强肽可优选为Flt3配体，且Flt3配体可具有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。
根据本公开内容的另一个方面，提供包含上述多核苷酸、载体或表达载体的DNA疫苗组合物。
具体而言，DNA疫苗组合物可含有：包含第一基因构建体的第一表达载体，其中编码包括gB和UL39的第一融合蛋白的第一多核苷酸与启动子可操作连接；和包含第二基因构建体的第二表达载体，其中编码包括gD、ICP0和ICP4的第二融合蛋白的第二多核苷酸与启动子可操作连接。
在DNA疫苗组合物中，第一融合蛋白和/或第二融合蛋白可进一步包含分泌信号肽，且分泌信号肽与如上所述的相同。
在DNA疫苗组合物中，第一融合蛋白和/或第二融合蛋白可进一步包含免疫增强肽，且免疫增强肽与如上所述的相同。
在DNA疫苗组合物中，UL39可以是其中混合有内部结构域的改组UL39。
DNA疫苗组合物可包含至少一种药学上可接受的佐剂。
本文使用的术语“佐剂”是指以增强疫苗的免疫反应为目的而给予的药学或免疫学物质。
佐剂可以是氢氧化铝、磷酸铝、明矾(硫酸铝钾)、MF59、病毒颗粒、AS04 [氢氧化铝和单磷酰脂质A (MPL)的混合物]、AS03 (DL-α-生育酚、角鲨烯和聚山梨酯80 (其为一种乳化剂)的混合物)、CpG、鞭毛蛋白、聚I:C、AS01、AS02、ISCOM或ISCOMMATRIX。
另外，可使用本领域已知的方法配制根据本公开内容一个实施方案的疫苗组合物，以允许在将其给予哺乳动物之后快速释放或者持续释放或缓释活性成分。制剂包括散剂、颗粒、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软胶囊剂或硬胶囊剂、无菌注射溶液和无菌散剂。
根据本公开内容一个实施方案的疫苗组合物可通过各种途径给予，包括例如口服、胃肠外(例如栓剂、透皮、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鼻内、真皮内和脊柱内途径，且另外地，可使用用于持续释放或反复释放的植入装置来给予。给予的次数可以是在所需范围内的每天一次或数次，但给予时间并不具体限于此。
根据本公开内容一个实施方案的疫苗组合物可通过常规的全身给予或局部给予(例如肌内注射或静脉内注射)来给予，但最优选借助于电穿孔仪来给予。待使用的电穿孔仪可包括用于注射可市购的DNA药物的电穿孔器(例如意大利IGEA的GlinporatorTM、韩国JCBIO的CUY21EDIT或瑞士Supertech的SP-4a等)。
对于给予途径，根据本公开内容一个实施方案的疫苗组合物可经由任何常规途径给予，只要其可到达靶组织。给予途径可以是胃肠外给予(例如腹膜内给予、静脉内给予、肌内给予、皮下给予和滑膜内给予)，但不限于此。
根据本公开内容一个实施方案的疫苗组合物可与常用的药学上可接受的载体一起以合适的形式配制。药学上可接受的载体可包括例如水、合适的油、盐水、用于胃肠外给予的含水载体(例如葡萄糖水溶液、乙二醇水溶液等)等等，并可额外地包含稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂的实例可包括抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和抗坏血酸。合适的防腐剂的实例可包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和三氯叔丁醇。此外，当根据给予方法或制剂而需要时，根据本公开内容的组合物可适当包含助悬剂(suspension)、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、镇痛剂、缓冲剂、抗氧化剂等。适于本公开内容的药学上可接受的载体和制剂(包括上文举例说明的那些)见述于文献[Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Science)，最新版]。
用于患者的疫苗组合物剂量取决于许多因素，包括所述患者的身高、体表面积、年龄、待给予的具体化合物、性别、给予的时间和途径、一般健康状况以及待同时给予的其他药物。可以下述量给予药学上活性的DNA：100 ng/体重(kg)-10 mg/体重(kg)，更优选1 μg/kg-500 μg/kg (体重)，以及最优选5 μg/kg-50 μg/kg (体重)，且可以下述单位剂量给予：10 μg、100 μg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70mg、80 mg、90 mg或100 mg，可考虑上述因素来调整剂量。
实施例
在下文中，通过实施例和实验例在下文更详细地说明本公开内容。然而，本公开内容并不限于下文所述的这些实施例和实验例，而是可以多种其他形式实施，下列实施例和实验例被提供用以向本公开内容所属领域的普通技术人员充分阐述本公开内容的范围。
实施例1：改组UL39质粒DNA的制备
基于发明人先前的HSV-2抗原之一的UL39 (ICP10)诱导CD4+ T细胞和CD8+ T细胞反应的研究(Posavad等，Mucosal Immunol. 126，2015)，本公开内容的发明人研究了混合有UL39的内部结构域的改组构建体能否充当疫苗来诱导免疫反应。
为此，本发明人基于经改良以增强表达能力的pGX27质粒载体(韩国专利号1442254)，设计了作为UL39抗原的5个断裂碎片(N1: UL3914-154(Δ78-104)、C2: UL391117-1142、N2: UL39155-227、N4-C1: UL39399-1116、N3: UL39208-398)的混合蛋白的改组UL39抗原，并制备了包含编码该改组UL39抗原的基因构建体的质粒载体，将该质粒载体命名为改组-UL39质粒DNA。
具体而言，通过将下列基因构建体插入pGX27质粒载体中来制备改组-UL39质粒DNA，该基因构建体包含多核苷酸(SEQ ID NO: 7)，其编码呈UL39-N1、UL39-C2、UL39-N2、UL39-N4-C1和UL39-N3的顺序依序连接的形式(SEQ ID NO: 6)，其基于分成UL39-N1 (SEQID NO: 1)、UL39-C2 (SEQ ID NO: 2)、UL39-N2 (SEQ ID NO: 3)、UL39-N4-C1 (SEQ IDNO: 4)和UL39-N3 (SEQ ID NO: 5)的形式(图1)。
实验例1：通过改组-UL39质粒DNA确认对抗HSV-2感染的防御功效
本公开内容的发明人为了确认根据本公开内容一个实施方案的改组-UL39质粒DNA是否在受感染的动物模型中有效体内防御HSV-2感染，在给予质粒DNA疫苗之后评价了防御HSV-2感染的能力。
具体而言，将C57BL/6小鼠分别分入给予模拟质粒DNA的组和给予改组-UL39质粒DNA的组。通过以2周间隔电穿孔两次将相应的质粒DNA (4 μg)肌内给予各组，且在末次给予之后2周，通过阴道内途径使小鼠感染HSV-2病毒(1 x 104 pfu) (图2和表1)。感染之后，通过监测各组小鼠的存活率持续10天来评价HSV-2感染组的生存力(图3)。
[表1]
组别 疫苗 实验动物的数量 剂量(μg) 途径(给予方法)
对照组 模拟质粒 8 4 肌内(电穿孔)
实验组 改组UL39 8 4 肌内(电穿孔)
结果，如可在图3中确认，在给予模拟质粒DNA的组中，大部分小鼠在HSV-2病毒感染的第8天死亡，而给予改组-UL39质粒DNA的组直到HSV-2病毒感染的第10天仍显示40%的存活率，观察到存活率的显著改善。
实施例2：制备表达HSV-2复合抗原的质粒DNA
本公开内容的发明人已从实验例1的结果确认UL39作为DNA疫苗的可能性，因此，制备了与其他抗原蛋白重组的质粒DNA。
具体而言，基于用于实施例1的pGX27质粒载体，分别制备了：tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA，包含编码tPA-Flt3L-gB-UL39融合蛋白(SEQ ID NO: 11)的多核苷酸(SEQ ID NO:12)，其中将多种类型的HSV-2抗原(即去除了信号序列(gB1-22)和跨膜结构域(gB772-792)的糖蛋白B (gB23-904(Δ772-792)，SEQ ID NO: 10)和用于实施例1的改组UL39 (SEQ ID NO: 6))连接；和tPA-Flt3L-gD-IPC0-ICP4质粒DNA，包含编码tPA-Flt3L-gD-IPC0-ICP4融合蛋白(SEQID NO: 16)的多核苷酸(SEQ ID NO: 17)，其中将去除了信号序列(gD1-25)和跨膜结构域(gD341-364)的糖蛋白D (gD6-393(Δ341-364)，SEQ ID NO: 13)、去除了核定位信号(NLS，ICP0510-516)的感染细胞多肽0 (ICP0Δ510-516，SEQ ID NO: 14)和去除了RS1.3部分(ICP4767-1318)的感染细胞多肽4 (ICP4Δ767-1318，SEQ ID NO: 15)连接。为了有效表达，两种质粒均为其中将经密码子优化的tPA分泌信号肽(SEQ ID NO: 8)和免疫系统活化蛋白FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt3L，SEQ ID NO: 9)添加到N-端的形式(图4)。
实验例2：通过tPA-Flt3L-gB-UL39和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA确认对抗 HSV-2感染的防御功效
为了确认在实施例2中制备的tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA是否具有防御HSV-2感染的能力，本发明人评价了在给予疫苗之后其防御HSV-2感染的能力。
具体而言，将C57BL/6小鼠分别分入给予模拟质粒DNA、tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的组，以及共同给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的组。使用4 μg各相应的质粒DNA (对于共同给予，各自给予4 μg)，通过体内电穿孔以两周间隔对各组肌内给予两次，且在此之后两周，通过阴道内途径使之感染HSV-2病毒(1× 104 pfu) (图5和表2)。在感染之后每天监测各组小鼠的存活率和病理评分持续20天，以评价防御HSV-2感染的能力(图6a和6B)。病理评分是根据出版的文献中的描述来进行评定(Oh等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113(6): E762-E771，2016；病理评分“0”，无症状；“1”，轻度生殖器红斑和水肿；“2”，中度生殖器炎症；“3”，化脓性生殖器损伤；“4”，后肢麻痹；“5”，死亡)。
[表2]
组别 疫苗 小鼠数量 剂量(μg) 给予途径(给予方法)
对照组 模拟 10 8 肌内(电穿孔)
实验组1 gB-UL39 (BD-02B) 10 4 + 4 (模拟) 肌内(电穿孔)
实验组2 gD-ICP0/ICP4 10 4 + 4 (模拟) 肌内(电穿孔)
实验组3 gD-ICP0/ICP4 + gB-UL39 10 4 + 4 肌内(电穿孔)
结果，如可见于图6a，给予模拟质粒DNA的组中的所有动物均在受HSV-2病毒感染的第10天死亡。相比之下，在给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA或tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的组中，确认了显著改善的防御HSV-2病毒的能力。给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA的组中的小鼠显示40%存活率，而给予ICP0-ICP4质粒DNA的组中的小鼠显示100%存活率。共同给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的小鼠亦显示100%存活率。
此外，如可见于图6b，给予模拟质粒DNA的组显示高病理评分，而给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA的组显示显著低于给予模拟质粒DNA的组的病理评分，但显示高于给予tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的组的病理评分。同时，与给予各个质粒DNA的各组相比，共同给予tPA-Flt3L-gB-UL39质粒DNA和tPA-Flt3L-gD-ICP0-ICP4质粒DNA的组显示显著改善的病理评分。
如上所述，可表达根据本公开内容一个实施方案的改组UL39的DNA和可表达组合有改组UL39抗原和常规HSV-2抗原的融合蛋白的DNA表现出有效的防御炎症的能力，并因此它们可非常有效地用作用于预防和治疗HSV-2的疫苗。
尽管参照具体实施方案描述了用于预防和治疗HSV-2感染的DNA疫苗，但其不限于此。因此，本领域技术人员容易理解，在不背离通过随附权利要求所限定的本公开内容的精神和范围的情况下，可对其进行各种修改和变化。
工业应用性
根据本公开内容的多核苷酸可用于制备用于预防和治疗HSV-2感染的DNA疫苗组合物。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1是UL39-N1肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 2是UL39-C2肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 3是UL39-N2肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 4是UL39-N4-C1肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 5是UL39-N3肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 6是改组UL39蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 7是编码改组UL39蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO: 8是tPA分泌信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 9是Flt3配体(Flt3L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 10是gB23-904(Δ772-792)肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 11是tPA-Flt3L-gB-UL39融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 12是编码tPA-Flt3L-gB-UL39融合蛋白的多核苷酸序列。
SEQ ID NO: 13是gD6-393(Δ341-364)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 14是ICP0Δ510-516蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 15是ICP4Δ767-1318蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 16是tPA-Flt3L-gD-IPC0-ICP4融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 17是编码tPA-Flt3L-gD-IPC0-ICP4融合蛋白的多核苷酸序列。

Claims (35)

1.一种编码改组UL39蛋白的多核苷酸，其中所述改组UL39蛋白包含以下五个肽：
UL39-N1肽，其对应于HSV-2的UL39蛋白的氨基酸序列的第14-154位氨基酸，其中缺失了对应于第78-104位氨基酸的跨膜结构域；
UL39-C2肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第1117-1142位氨基酸；
UL39-N2肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第155-227位氨基酸；
UL39 N4-C1肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第399-1116位氨基酸；和
UL39-N3肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第208-398位氨基酸，
其中所述五个肽为随机混合的，但所述改组UL39蛋白不具有所述UL39蛋白的原始氨基酸序列。
2.权利要求1的多核苷酸，其进一步包含编码一种或两种或更多种免疫增强肽的多核苷酸。
3. 权利要求2的多核苷酸，其中所述免疫增强肽为CD28的胞质域、可诱导共刺激分子(ICOS)、细胞毒性T淋巴细胞相关的蛋白4 (CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1 (PD1)、B淋巴细胞和T淋巴细胞相关的蛋白(BTLA)、死亡受体3 (DR3)、4-1BB、CD2、CD40、CD30、CD27、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM)、2B4 (CD244)、自然杀伤细胞2族成员D (NKG2D)/ DNAX-活化蛋白12 (DAP12)、含T-细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白1 (TIM1)、TIM2、TIM3、TIGIT、CD226、CD160、淋巴细胞活化基因3 (LAG3)、B7-1、B7-H1、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关的蛋白(GITR)、fms样酪氨酸激酶3 (Flt3)配体、鞭毛蛋白、疱疹病毒侵入介体(HVEM)、CD40 L (配体)或者OX40L [CD134(OX40)的配体，CD252]或其两种或更多种的连接肽。
4.权利要求1的多核苷酸，其进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸。
5. 权利要求4的多核苷酸，其中所述分泌信号肽为用于组织纤溶酶原活化物(tPA)的信号肽、用于单纯疱疹病毒糖蛋白D (HSV gD)的信号肽或者用于生长激素的信号肽。
6. 权利要求1的多核苷酸，其进一步包含编码单纯疱疹病毒-2 (HSV-2)的一种或两种或更多种抗原蛋白的多核苷酸。
7. 权利要求6的多核苷酸，其中所述抗原蛋白为糖蛋白B (gB)、糖蛋白D (gD)、ICP0或ICP4。
8.权利要求7的多核苷酸，其中所述糖蛋白B为其中缺失了对应于第1-22位氨基酸的信号肽和对应于第772-792位氨基酸的跨膜结构域的截短形式。
9.权利要求7的多核苷酸，其中所述糖蛋白D为其中缺失了对应于第1-25位氨基酸的信号肽和对应于第341-364位氨基酸的跨膜结构域的截短形式。
10.权利要求7的多核苷酸，其中所述ICP0为其中缺失了对应于第510-516位氨基酸的核定位信号(NLS)的截短形式。
11.权利要求7的多核苷酸，其中所述ICP4为其中缺失了对应于第767-1318位氨基酸的RS1.3区的截短形式。
12. 权利要求1的多核苷酸，其中所述改组UL39蛋白为其中所述UL39-N1肽、所述UL39-C2肽、所述UL39-N2肽、所述UL39 N4-C1肽和所述UL39-N3肽依序连接的多肽。
13.根据权利要求1-12中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸为经密码子优化的多核苷酸。
14.根据权利要求1-12中任一项的多核苷酸，其包含：
由SEQ ID NO: 1组成的UL39-N1肽；
由SEQ ID NO: 2组成的UL39-C2肽；
由SEQ ID NO: 3组成的UL39-N2肽；
由SEQ ID NO: 4组成的UL39 N4-C1肽；和
由SEQ ID NO: 5组成的UL39-N3肽。
15. 根据权利要求1-12中任一项的多核苷酸，其中所述改组UL39蛋白为由通过SEQ IDNO: 6表示的氨基酸序列组成的多核苷酸。
16.一种载体，其包含根据权利要求1-12中任一项的多核苷酸。
17.权利要求16的载体，其中所述载体为其中所述多核苷酸与启动子可操作连接的表达载体。
18.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求16或17的载体。
19.一种组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项的多核苷酸或者权利要求16或17的载体以及药学上可接受的载体。
20.一种重组蛋白，其通过根据权利要求1-12中任一项的多核苷酸编码。
21.一种表达载体，其包含编码两种或更多种或所有HSV-2抗原蛋白的一种或多种多核苷酸，所述HSV-2抗原蛋白选自gB、gD、UL39、ICP0和ICP4蛋白。
22.权利要求21的表达载体，其中所述gB为其中缺失了对应于第1-22位氨基酸的信号序列和对应于第772-792位氨基酸的跨膜结构域的截短形式。
23.权利要求21的表达载体，其中所述gD为其中缺失了对应于第1-25位氨基酸的信号序列和对应于第341-364位氨基酸的跨膜结构域的截短形式。
24.权利要求21的表达载体，其中所述ICP0为其中缺失了对应于第510-516位氨基酸的核定位信号(NLS)的截短形式。
25.权利要求21的表达载体，其中所述ICP4为其中缺失了对应于第767-1318位氨基酸的RS1.3区的截短形式。
26.权利要求21的表达载体，其中所述UL39为其中混合有内部结构域的改组UL39。
27.权利要求26的表达载体，其中所述改组UL39蛋白包含以下五个肽：
UL39-N1肽，其对应于HSV-2的UL39蛋白的氨基酸序列的第14-154位氨基酸，其中缺失了对应于第78-104位氨基酸的跨膜结构域；
UL39-C2肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第1117-1142位氨基酸；
UL39-N2肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第155-227位氨基酸；
UL39 N4-C1肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第399-1116位氨基酸；和
UL39-N3肽，其对应于所述UL39蛋白的氨基酸序列的第208-398位氨基酸，
其中所述五个肽为随机混合的，但所述改组UL39蛋白不具有所述UL39蛋白的原始氨基酸序列。
28.权利要求26的表达载体，其中所述改组UL39通过权利要求1的多核苷酸编码。
29.根据权利要求21-28中任一项的表达载体，其中所述gB、gD、UL39、ICP0和ICP4蛋白表达为单独的蛋白或者以一个融合蛋白的形式表达。
30.根据权利要求21-28中任一项的表达载体，其中所述多核苷酸进一步包含编码分泌信号肽的多核苷酸。
31. 权利要求30的表达载体，其中所述分泌信号肽为用于组织纤溶酶原活化物(tPA)的信号序列、用于单纯疱疹病毒糖蛋白D (HSV gD)的信号序列或者用于生长激素的信号序列。
32.根据权利要求21-28中任一项的表达载体，其中所述多核苷酸进一步包含编码免疫增强肽的多核苷酸。
33.根据权利要求21-28中任一项的表达载体，其中所述多核苷酸进一步包含编码免疫增强肽的多核苷酸。
34.一种DNA疫苗组合物，其包含根据权利要求21-28中任一项的表达载体。
35. 权利要求34的DNA疫苗组合物，其包含：
包含第一基因构建体的第一表达载体，所述第一基因构建体包含与启动子可操作连接的编码包括gB和UL39的第一融合蛋白的第一多核苷酸；和
包含第二基因构建体的第二表达载体，所述第二基因构建体包含与启动子可操作连接的编码包括gD、ICP0和ICP4的第二融合蛋白的第二多核苷酸。
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