CN1748797A - 抗单纯疱疹病毒-2感染的多表位dna疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属医药和基因工程技术领域,具体为一种抗单纯疱疹病毒-2的多表位DNA疫苗及其制备方法。本发明的DNA疫苗是将HSV-2的gB、gC、gD和即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位区域加间隔序列串连到真核表达载体pcDNA3.1,获得HV-pcDNA3.1。该DNA疫苗可以用于预防和治疗HSV-2感染的疾病如生殖器疱疹等疾病。该疫苗的特点是特异性高、保护性好,制备方法简单。
Description
技术领域
本发明属医药和基因工程技术领域,具体涉及一种新的抗HSV-2多表位DNA疫苗及应用
背景技术
单纯疱疹病毒(HSV)感染是人类比较常见的感染性疾病.。HSV-1主要引起唇疱疹、龈口炎、脑炎、角膜结膜炎等非生殖器感染,而HSV-2引起生殖器感染。大多数生殖器疱疹由HSV-2引起,可呈慢性复发过程,目前尚未有根治的良药。该病在全球的流行情况十分明显,已占性病的10%左右,由HSV-2感染造成的公共卫生问题促使人们研制可预防和控制感染的疫苗。有研究表明,DNA疫苗与常规的灭活苗、减毒苗、亚单位疫苗相比,DNA疫苗不仅可诱导产生特异性免疫球蛋白,且可同时激发机体的细胞免疫反应(尤其是CTL免疫),对病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病预防更为有效。DNA疫苗另一个突出优点是免疫原的单一性。只有编码所需抗原的基因被导入细胞得到表达,载体本身没有免疫原性。而重组活载体疫苗除目的基因的表达外,其本身还具有庞大而复杂的免疫原蛋白。DNA疫苗不仅可用于预防,而且可用于治疗。
本发明从HSV入侵和繁殖的机理及整个生命周期过程角度出发,将HSV-2糖蛋白D、B、C基因(gD免疫原性较强、gB和gC与相应的受体结合能稳定病毒在细胞表面的吸附)和即刻早期蛋白ICP27基因(该基因能启动病毒DNA进入细胞后转录和表达)作为靶基因串连起来插入到pCDNA3.1,首次构建了HSV-2新型多表位DNA疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗及其制备方法。
本发明的技术路线为,首先培养扩增HSV-2病毒,并抽提其基因组DNA,同时用生物信息学方法根据糖蛋白的免疫原性分析,选取所需的抗原表位,设计相应引物,然后用PCR方法分段扩增所需的目的基因,最后把六段基因连接起来先克隆到pGEM-T载体上,再酶切装入pcDNA3.1,得到抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗(HV-pcDNA3.1质粒)。
本发明提出的有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗,其组成如下:将HSV-2病毒胞膜糖蛋白的强免疫原gD、gB、gC和参与病毒复制的即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位区域,以主要保护性抗原gD为中心,选定6段抗原基因加间隔序列AAY串连到真核表达载体pcDNA3.1,得到HV-pcDNA3.1质粒;其中6段抗原基因为ICP27上第377~459氨基酸的一段抗原肽,gD上第1~77、第146~179、第223~306氨基酸的三段抗原肽,gB上第529~606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247~282氨基酸的一段抗原肽。
本发明提出的抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗的制备方法,具体步骤如下:
1.设计引物:根据靶抗原免疫原性分析,以人HSV-2全病毒基因组DNA为(SEQ ID NO.7)模板,设计6对引物(含酶切位点),分别用于扩增三种包膜糖蛋白gD,gB和gC的主要免疫优势区段和ICP27片段,引物序列见表1所列:
表1.DNA疫苗引物序列表
表位名 | 引物序列 |
ICP27 | ICP27-F:5’CAG GAATTCGAAATGGACCCTATCATCGGAACG 3’(EcoRI) |
ICP27-R:5’CTA CTCTTCAGGCAGCCGTCTCGCCGGCCCCAAC 3’(EarI) | |
gD2 | PgD2-F:5’CAG CTCTTCTGCCTACAGCGAGGATAACCTGGGATT 3’(EarI) |
PgD2-R:5’GTC CTCTTCGCGTTGTGTGATCTCCGTCCAGTC 3’(EarI) | |
gD3 | PgD3-F:5’CCA CTCTTCAACGCTTTATCCCCGAAAACCA 3’(EarI) |
PgD3-R:5’CTA CTCTTCTGGCAGCGTGCGGCGCGACGTCCT 3’(EarI) | |
gB4 | PgB4-F:5’TAC CTCTTCTGCCTACCAGAACCACGAGCTGACTC 3’(EarI) |
PgB4-R:5’CTA CTCTTCTAAGCGGCCTGGTCTTCGTACCGAAAG 3’(EarI) | |
gC5 | PgC5-F:5’TAG CTCTTCGCTTACGAGGGCCAGCCGTTTAAGG 3’(EarI) |
PgC5-R:5’GCA CTCTTCTGGCAGCGTGTATCTGGGCCGGATCG 3’(EarI) | |
gD6 | PgD6-F:5’CCA CTCTTCAGCCTACGCCAAATACGCCTTAGCAG 3’(EarI) |
PgD6-R:5’CGA GGTACCAATCATCACTCCGATGGGGCATGTAGGA 3’(KpnI) |
2.抗原靶基因的分段克隆回收:取HSV病毒裂解液,用Taqplus高保真DNA聚合酶分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增。这6段抗原基因分别为:ICP27上第377~459氨基酸的一段抗原肽(SEQ ID NO.1),gD上第1~77(SEQ ID NO.2)、第146~179(SEQ IDNO.3)、第223~306(SEQ ID NO.4)氨基酸的三段抗原肽,gB上第529~606(SEQ ID NO.5)氨基酸的一段抗原肽和gC上第247~282(SEQ ID NO.6)氨基酸的一段抗原肽;
取PCR扩增产物,用琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带,把得到的目的基因片段割胶回收、定量;
3.将六段PCR产物的酶切和连接:将纯化得到的各段HSV抗原片段分别用EarI酶切成粘性末端,然后用T4 ligase把它们按照下述顺序连接(见图1所示):
ICP27上的377~459,gD上的146~179,gD上的223~306,gB上的529~606,gC上的247~282;gD上的1~77,得到完整的抗原表位,用于连接的间隔序列为AAY;
4.将串联后的目的基因构建质粒:将上述得到的完整抗原表位和真核表达载体pcDNA3.1同时双酶切,然后连接起来,构成所需的DNA疫苗:HV-pcDNA3.1。
由本发明制备获得的DNA疫苗,经过对小鼠免疫试验,结果表明该疫苗能有效引起小鼠特异性的体液免疫和细胞免疫应答。然后进行免疫小鼠毒性攻击试验:测定其戚率指标,表明该疫苗免疫的有效性,而且具有特异性高、杀伤力强的优点。
附图说明
图1为多表位DNA复合疫苗抗原示意图。
图2为克隆抗原片断的路线图示。
具体实施方式
下面进一步描述本发明的实施方式。
1.引物设计:参照【图1】设计6对引物,以人HSV-2全病毒基因组DNA为模板,设计引物(含酶切位点)分别扩增三种包膜糖蛋白gD,gB和gC的主要免疫优势区段和ICP27片段。引物序列参见【表1】:
2.抗原靶基因的分段克隆回收:取2ul HSV病毒裂解液,用Taqplus高保真DNA聚合酶分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增。条件如下:
50μl PCR扩增反应体系:ddH2O 9.5μl
10×Buffer 5.0μl
4×dNTP(10mM) 1.0μl
Primer F(10μM) 1.0μl
Primer R(10μM) 1.0μl
Template 2.0μl
Taqplus(5U/μl) 0.5μl
PCR扩增反应条件:
取2μl PCR扩增产物,2.0%琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带。把得到的目的基因片段割胶回收、定量。
3.六段PCR产物的酶切和连接:纯化得到的各段HSV抗原片段分别用Ear I酶切成粘性末端,然后用T4 ligase把它们按照顺序先后联接。参照【图1】
Ear I酶切条件:
2ul Buffer;
1ul EarI;
10ul纯化的PCR片段;
7.5ul ddH2O;
反应Mix于37℃保温3h。
T4 ligase顺序连接各段酶切产物,4℃连接过夜,连接分别如下:
(1)2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul ICP1+8.5ul D2
(2)2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul D3+8.5ul B4
(3)2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul C5+8.5ul D6
把3段联接产物用1.5%琼脂糖电泳观察结果。切下3段连接片段,(1)号联接产物中目的条带为377bp(A),(2)号联接产物中目的条带为503bp(B),(3)号联接产物中目的条带为376bp(II)。回收这些目的片段。
用T4 ligase联接回收的A和B片段,4℃连接过夜,Mix如下:
2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul A+8.5ul B
把A和B的连接产物用1.5%琼脂糖电泳观察结果。切下600~1000bp条带对应的位置,回收DNA,进行用PCR扩增。
50μl PCR扩增反应体系:ddH2O 39.5μl
10×Buffer 5.0μl
4×dNTP(10mM) 1.0μl
Primer ICP-F(10μM) 1.0μl
Primer B4-R(10μM) 1.0μl
Template 2.0μl
Taqplus(5U/μl) 0.5μl
PCR扩增反应条件:
取100μl PCR扩增产物,2.0%琼脂糖凝胶电泳切下880bp条带(I),回收目的片段,再用EarI酶切片段I,条件同前。
T4 ligase连接片段I酶切产物和回收的片段II,4℃连接过夜,Mix如下:
2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul I+8.5ul II
连接产物用1.4%琼脂糖电泳,切下1100~1300bp条带(HV),回收目的片段。PCR检验回收的HV片段是否有6段基因的连接产物:
50μl PCR扩增反应体系:ddH2O 39.5μl
10×Buffer 5.0μl
4×dNTP(10mM) 1.0μl
Primer ICP-F(10μM) 1.0μl
Primer D6-R(10μM) 1.0μl
Template 1.0μl
Taqplus(5U/μl) 0.5μl
PCR扩增反应条件:
共有6段抗原肽表位,分别为ICP27上第377~459氨基酸的一段抗原肽,gD上第1~77、第146~179、第223~306氨基酸的三段抗原肽,gB上第529~606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247~284氨基酸的一段抗原肽。其中不同类型糖蛋白之间用间隔序列(AAY)连接起来,以提高免疫活性并防止N端被破坏,起保护作用。
4.HV连接片段的克隆测序:将上述回收的HV片段连接到pGEM-T载体中,16℃连接过夜:
1ul Progema T4 ligase
1ul pGEMT-vector
5ul 2×Progema T4 ligase Buffer
3ul HV纯化液
HV-pGEMT-vector连接产物,转化到E.coli DH5α感受态细胞,挑选阳性转化子鉴定。分别对阳性转化子和pcDNA3.1空载体用EcoRI和KpnI双酶切,EcoRI单切质粒,37℃保温3h:
3.0ul Buffer H
2.0ul EcoRI
20.0ul质粒
5.0ul ddH2O
纯化得到的EcoRI酶切质粒再用KpnI酶切37℃,3h:
3.0ul Buffer 1
0.3ul 100×BSA
2.0ul KpnI
24.7ul质粒
对于HV-pGEMT-vector双酶切产物切胶1200bp条带;pcDNA3.1空质粒双酶切产物则切胶约5.4kb的条带,分别对其回收定量。HV片段联入pcDNA3.1载体,16℃过夜:
1ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
1ul双切pcDNA3.1回收片段
3ul HV双切回收片段
HV,pcDNA3.1连接产物转化入DH5α感受态细胞,挑选阳性重组子,得HV-pcDNA3.1,并测序验证。
5.免疫小鼠:C57/BL6雌性6周龄小鼠10只,随机分为2组(空载体pcDNA3.1阴性组和HV-pcDNA3.1+IL2-pcDNA3.1实验组),每组5只。方法是初次免疫为10ug质粒和1ug脂质体融合转染C57/BL6小鼠单个核细胞于皮下注射;14天后二次免疫为100ug质粒和10ug脂质体混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中;再过14天后加强免疫一次50ug质粒和5ug脂质体混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中。再过14天后检测。
6.通过以下方法进行HSV-2多表位DNA疫苗的免疫原性鉴定:
(1)特异性IgG抗体ELISA结果 血清稀释400倍时的OD值阴性组为0.113±0.035;实验组为0.288±0.091,效价约为500。
(2)杀伤性T细胞毒分析结果 用LDH法测定CTL杀伤率(%),当效靶比为50∶1时,阴性组为8.301±2.906;实验组为47.913±15.086。
(3)细胞因子检测结果 ELISA测得血清中mIL2和mIFN-γ的含量(ng/L),阴性组mIL2为685.21±104.20,mIFN-γ为547.71±189.33;实验组mIL2为1421.16±220.98,mIFN-γ为1956.19±219.60。
(4)T细胞抗原特异性增殖反应测定结果 MTT法测得的小鼠脾T淋巴细胞刺激指数(SI),阴性组为0.709±0.035;实验组为2.751±0.259。
结论:HSV-2多表位DNA疫苗能有效引起小鼠特异性的体液免疫和细胞免疫应答。
7.具体应用:
根据一系列小鼠免疫指标的测定结果,表明该DNA疫苗构建设计是成功的。然后直接进行HSV-2多表位DNA疫苗免疫小鼠病毒攻击实验,通过测定存活率指标,观察小鼠预防HSV感染的动物试验效果,进一步反应了该疫苗的有效性。
临床应用:小鼠攻毒实验成功后,经临床I、II、III期实验,可作为抗HSV-2病毒的新型DNA疫苗,用于预防和治疗感染HSV-2的疾病,如生殖器疱疹、宫颈癌、新生儿疱疹等疾病。
序列表
SEQ ID NO.1:
DPIIGTAAAVLENLATRLRPFLQCYLKARGLCGLDDLCSRRRLSDIKDIASFVLVILARLANRVERGVSE
IDYTTVGVGAGET
SEQ ID NO.2:
AKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRS
VLLHAPSE
SEQ ID NO.3:
SEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQ
SEQ ID NO.4:
RFIPENQRTVALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPP
NWHIPSIQDVAPH
SEQ ID NO.5:
QNHELTLWNEARKLNPNAIASATVGRRVSARMLGDVMAVSTCVPVAPDNVIVQNSMRVSSRPGTCYS
RPLVSFRYEDQ
SEQ ID NO.6:
EGQPFKATCTAATYYPGNRAEFVWFEDGRRVFDPAQ
SEQ ID NO.7
ATGGACCCTATCATCGGAACGGCGGCCGCCGTGCTGGAAAACCTCGCCACGCGCCTGCGCCCCTT
TCTGCAGTGCTACCTGAAGGCCCGAGGCCTGTGCGGGCTGGACGACCTGTGCTCGCGGCGACGCC
TGTCGGACATTAAGGATATTGCCTCCTTTGTGTTGGTCATCCTGGCCCGCCTCGCCAACCGCGTCGA
GCGCGGCGTGTCGGAGATCGACTACACGACCGTGGGGGTTGGGGCCGGCGAGACGGCCGCTTAC
AGCGAGGATAACCTGGGATTCCTGATGCACGCCCCCGCCTTCGAGACCGCGGGTACGTACCTGCG
GCTAGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATCACACAACGCTTTATCCCCGAAAACCAGCGCACCG
TCGCCCTATACAGCTTAAA AATCGCCGGGTGGCACGGCCCCAAGCCCCCGTACACCAGCACCCTG
CTGCCGCCGGAGCTGTCCGACACCACCAACGCCACGCAACCCGAACTCGTTCCGGAAGACCCCG
AGGACTCGGCCCTCTTAGAGGATCCCGCCGGGACGGTGTCTTCGCAGATCCCCCCAAACTGGCAC
ATCCCGTCGATCCAGGACGTCGCGCCGCACGCTGCCTACCAGAACCACGAGCTGACTCTCTGGAA
CGAGGCCCGCAAGCTCAACCCCAACGCCATCGCCTCCGCCACCGTCGGCCGGCGGGTGAGCGCG
CGCATGCTCGGAGACGTCATGGCCGTCTCCACGTGCGTGCCCGTCGCCCCGGACAACGTGATCGT
GCAGAACTCGATGCGCGTCAGCTCGCGGCCGGGGACGTGCTACAGCCGCCCCCTGGTCAGCTTTC
GGTACGAAGACCAGGCCGCTTACGAGGGCCAGCCGTTTAAGGCGACGTGCACGGCCGCCACCTAC
TACCCGGGCAACCGCGCGGAGTTCGTCTGGTTCGAGGACGGTCGCCGGGTATTCGATCCGGCCCA
GGCTGCCTACGCCAAATACGCCTTAGCAGACCCCTCGCTTAAGATGGCCGATCCCAATCGATTTCG
CGGGAAGAACCTTCCGGTTTTGGACCAGCTGACCGACCCCCCCGGGGTGAAGCGTGTTTACCACA
TTCAGCCGAGCCTGGAGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCATCCCGATCACTGTGTACTACGCAGTGC
TGGAACGTGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTACATGCCCCATCGGAGTGATGA
Claims (2)
1.一种能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗,其特征在于组成如下:将HSV-2病毒胞膜糖蛋白的强免疫原gD、gB、gC和参与病毒复制的即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位区域,以保护性抗原gD为中心,选定6段抗原基因加间隔序列AAY串连到真核表达载体pcDNA3.1,得到HV-pcDNA3.1质粒;其中6段抗原基因为ICP27上第377~459氨基酸的一段抗原肽,gD上第1~77、第146~179、第223~306氨基酸的三段抗原肽,gB上第529~606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247~282氨基酸的一段抗原肽。
2、一种能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗的制备方法,其特征在于具体步骤如下:
(1)设计引物:以人HSV-2全病毒基因组DNA为模板,设计6对引物,分别用于扩增三种包膜糖蛋白gD,gB和gC的主要免疫优势区段和ICP27片段,引物序列见表1所列:
表1.DNA疫苗引物序列表
表位名
引物序列
ICP27
ICP27-F:5’CAG
GAATTCGAAATGGACCCTATCATCGGAACG 3’(EcoR I)
ICP27-R:5’CTA
CTCTTCAGGCAGCCGTCTCGCCGGCCCCAAC 3’(Ear I)
gD2
PgD2-F:5’CAG
CTCTTCTGCCTACAGCGAGGATAACCTGGGATT 3’(Ear I)
PgD2-R:5’GTC
CTCTTCGCGTTGTGTGATCTCCGTCCAGTC 3’(Ear I)
gD3
PgD3-F:5’CCA
CTCTTCAACGCTTTATCCCCGAAAACCA 3’(Ear I)
PgD3-R:5’CTA
CTCTTCTGGCAGCGTGCGGCGCGACGTCCT 3’(Ear I)
gB4
PgB4-F:5’TAC
CTCTTCTGCCTACCAGAACCACGAGCTGACTC 3’(Ear I)
PgB4-R:5’CTA
CTCTTCTAAGCGGCCTGGTCTTCGTACCGAAAG 3’(Ear I)
gC5
PgC5-F:5’TAG
CTCTTCGCTTACGAGGGCCAGCCGTTTAAGG 3’(Ear I)
PgC5-R:5’GCA
CTCTTCTGGCAGCGTGTATCTGGGCCGGATCG 3’(Ear I)
gD6
PgD6-F:5’CCA
CTCTTCAGCCTACGCCAAATACGCCTTAGCAG 3’(Ear I)
PgD6-R:5’CGA
GGTACCAATCATCACTCCGATGGGGCATGTAGGA 3’(Kpn I)
(2)抗原靶基因的分段克隆回收:取HSV病毒裂解液,用Taqplus高保真DNA聚合酶分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增,这6段抗原基因分别为:ICP27上第377~459氨基酸的一段抗原肽,gD上第1~77、第146~179、第223~306氨基酸的三段抗原肽,gB上第529~606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247~282氨基酸的一段抗原肽;
取PCR扩增产物,用琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带,把得到的目的基因片段割胶回收、定量;
(3)六段PCR产物的酶切和连接:将纯化得到的各段HSV抗原片段分别用Ear I酶切成粘性末端,然后用T4 ligase把它们按照下述顺序连接:
ICP27上的377~459,gD上的146~179,gD上的223~306,gB上的529~606,gC上的247~282;gD上的1~77,得到完整的抗原表位,用于连接的间隔序列为AAY;
(4)将串联后的目的基因构建质粒:将上述得到的完整抗原表位和真核表达载体pcDNA3.1同时双酶切,然后连接起来,构成所需的DNA疫苗:HV-pcDNA3.1。
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