CN1204256C - 用重组口蹄疫疫苗基因表达蛋白建立检测罹病牲畜口蹄疫病毒抗体的技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用一种口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)重组基因表达的蛋白检测罹病牲畜FMDV抗体技术。其特征在于利用体外重组技术克隆或合成具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的FMD疫苗基因，使其在一定表达载体系统中高效表达，产生具有免疫原性的蛋白。经免疫印迹(Western-blotting)分析，其表达蛋白产物能被FMDV阳性血清所识别，显示该蛋白具有免疫学活性，从而可用该重组蛋白作为具有免疫原性的抗原来代替传统的使用病毒转染细胞制备的抗原，这样便可避免传统检测FMDV抗体中制备免疫抗原时容易发生的病毒扩散的危险性，因而更加安全，而且价格低廉。

Description

用重组口蹄疫疫苗基因表达蛋白建立检测 罹病牲畜口蹄疫病毒抗体的技术

1.技术领域

本发明涉及口蹄疫罹病牲畜病毒抗体的检测技术，特别是涉及无口蹄疫病毒参与的检测方法。用一种口蹄疫病毒(FMDV)重组疫苗基因表达的蛋白检测罹病牲畜FMDV抗体的技术。即用体外重组技术克隆或合成FMD疫苗基因，使其在所构建的表达载体系统中高效表达，产生具有免疫原性的蛋白。经免疫印迹(Western-blotting)分析，表达蛋白如显示具有免疫学活性，从而可用该重组蛋白作为抗原来代替传统的使用病毒转染细胞制备的抗原，这样可能避免传统检测FMDV抗体中制备免疫抗原发生的病毒扩散的危险性，而且价格低廉。

2.背景技术

1、口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus，FMDV)感染引起的偶蹄类动物共患的一种急性、烈性传染病，以流行广、传播快、发病率高而著称(殷震，刘景华，动物病毒学[M].第2版.北京：科学出版社，1997)。由于猪、牛、羊等主要家畜均可感染此病并形成全球规模流行，危害性、破坏性极大，故被联合国粮农组织和国际兽医局(IEO)列为必须报告和互相通报、采取措施共同防范的16种A类传染病之首(Wong HT，Cheng SC，Chan EW，et al，Virology，2000 Dec 5，278(1)：27-35.；ChanEW，Wong HT，Cheng SC，et al，Vaccine，2000，19(4-5)：538-546.)。口蹄疫的危害性很大，可严重影响畜牧业生产和动物及其产品的国际贸易，给国民经济造成巨大的损失，故有“政治经济病”之称。由此可知控制和消灭该病的前提—口蹄疫的快速检测就显得尤为重要。最初检测和鉴定FMDV的方法是动物交叉感染试验，随着实验动物(主要是豚鼠和乳鼠)和细胞培养在病毒研究中的应用，建立了许多种FMDV的检测方法，包括补体结合试验、中和试验、凝集试验等(Chan EW，Wong HT，Cheng SC，et al，Vaccine，2000，19(4-5)：538-546.；De prat-Gray G.，Arch BiochenBiphys，1997，34199(2)：360-369)。近年来，随着FMD研究的深入，其诊断技术也有了一定的发展(Kupper H，Keller W，Kerz C，et al.，Nature，1981，Feb.12，vol.289：555-559.；Suryanarayana VVS，et al.E.Coli，ArchVirol，1999，144：1701-1712.；Carland A J.，Vaccine，1999，Mar26：17(13-14)：1760-1766.；Barnett PV，Samuel AR，Statham RJ.，Vaccine，2001，19(15-16)：2107-2117.)。

目前，我国对牲畜FMDV抗体检测的方法中，抗原制备均采用病毒接种细胞培养物制备免疫抗原的途径。这样就存在病毒扩散的危险，并且用于检测的抗原和抗体的获得均需花费很大的人力、物力和财力，还要在密闭的严格的隔离区进行，因而检测试剂盒非常昂贵(Volpina OM，Yarov AV，Zhmak MN，etal.，vaccine，1996，14(14)：1375-1380.)。

经检索，我国专利申请CN1354674A公开了一种“用于口蹄疫的合成肽疫苗”，其主要涉及一种肽组合物作为免疫原的应用，……，用于预防FMDV感染和根除口蹄疫，以及含有一种或多种该肽的免疫分析和/或诊断试剂盒。该申请涉及到口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白的目标抗原位点第134～168片段，以这一片段含有一种T细胞表位，能诱导FMDV专一性的T细胞反应为基础，从其免疫构象入手，建立了笼统的模型和合成抗原文库，但未对口蹄疫VP1蛋白的cDNA序列进行具体的修饰和改造。

其检测方法评价的是目标抗原肽作为免疫原(疫苗)中和FMDV活性的血清学的反应性，得到的也只是“对于抗FMDV感染的保护性免疫是高度可预测的”的笼统结果。从其鉴定已知免疫学状态的畜群的反应性的ELISA结果来看，该申请所述方法很难使本领域的普通技术人员诊断出哪些牲畜感染了口蹄疫病毒。

为了弥补现有技术的不足，迫切需要一种简单易行、效果确切、成本低廉的FMDV抗体的检测技术。

3.发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组口蹄疫多肽基因所表达的蛋白，且该蛋白可作为免疫原性抗原用于检测口蹄疫病毒。

本发明的另一个目的是提供利用此类具有免疫原性的抗原检测口蹄疫病毒的改进的酶联免疫法(ELISA)。

研究表明FMDV VP1功能区包含FMDV的主要抗原位点，特别是在位点1，即第141～160和200～213位氨基酸残基组成FMDV的主要抗原区，能诱导动物产生中和抗体。我们利用基因工程的方法构建了FMDV VP1编码基因的第141～160和200～213位氨基酸多肽疫苗基因，在原核系统中进行表达，进一步纯化表达产物，以这种表达蛋白的免疫原性进行了免疫印迹分析，建立了O型口蹄疫病毒抗体的快速诊断方法。同时，本方法的建立又对进一步研究FMDV结构蛋白VP1的结构和功能以及新型疫苗的研制十分有帮助。

根据研究结果，我们认为该检测方法适用范围广，它不仅可以检测单一型的口蹄疫病毒(比如O型)抗体，而且还可以通过构建表达其它型(例如A、C等型)及多价的口蹄疫病毒重组抗原蛋白用于不同血清型的检测。

本发明还提供了一种利用口蹄疫疫苗基因工程产品为抗原检测口蹄疫病毒的改进的酶联免疫法，包括间接酶联免疫法(Indirective ELISA)、斑点酶联免疫法(Dot blot ELISA法)。该方法包括：

(1)设计与合成O型口蹄疫病毒VP1编码基因的第141～160和200～213位氨基酸多肽片段，将其与绿色荧光蛋白(GFP)串连后与一种载体相连，构建原核表达载体；

(2)将所构建的表达载体导入生产型宿主菌中高效表达，并且纯化后经Western blotting分析筛选阳性产物；

(3)以此阳性产物为免疫原性抗原建立间接和斑点酶联免疫法。

由于ELISA的聚苯乙烯微量反应板(简称酶联板)比较昂贵且不宜反复使用，并需在酶联仪上测读，应用受到限制。Dot blot ELISA法是以硝酸纤维素膜(也可用混合纤维素膜)代替酶联板，价钱便宜，重复性好，具有较高的敏感性，有更强的结合抗原的能力，且有所需样品少、白色背景容易用目测分辨阳性和阴性结果、适合于基层和野外操作等优点。

建立FMD检测的诊断方法，就要考虑用何种方法大量生产诊断抗原。本发明应用分子生物学技术，成功地合成了FMDV VP1基因中具有免疫原性的多肽片段，并将其亚克隆入表达载体pET-28a中，转化大肠杆菌BL21菌株，使合成的多肽疫苗基因与绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)基因形成融合基因，表达出了融合蛋白，纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析，得到了一条分子量为30KD的特异性蛋白带。Western blotting分析表明该蛋白能与FMDV阳性血清发生反应，说明表达产物具有较好的免疫原性。这为建立以口蹄疫基因工程产品为抗原，检测FMDV抗体技术提供了材料，为发展我国拥有自主知识产权的FMDV诊断技术奠定了基础。

4.附图说明

图1.O型口蹄疫多肽与GFP融合基因构建的原核表达载体

5.具体实施方式

实施例1.重组O型口蹄疫多肽疫苗融合基因构建及测序

将O型口蹄疫多肽疫苗基因(由BioAsia上海博亚生物技术有限公司根据O型病毒的O58(GeneBank号：FDI 141469)序列和O86病毒株(GeneBank号：FDI141468)的VP1蛋白的第140-160氨基酸和200-213氨基酸组成的多肽，即O58型和O86型病毒的VP1蛋白的20肽、14肽相串联起来的多肽合成)构建到原核表达载体pET-28a中(Novagen公司)并测序，以确认基因构建的正确性，将O型口蹄疫多肽疫苗基因(200bp)片段经酶切后与酶切的绿色荧光蛋白基因(GFP)相连接于pET-28a中，形成融合基因。

1.提取pEGFP-N1(含GFP基因，来自CLONTECHLaboratories Inc)和pET-28a质粒：

按Sambrook等(1989)碱法制备pET-28a和pEGFP-N1质粒

(1)随机挑取大肠杆菌BL21的单菌落(已导入目的质粒)，分别接种于3mL含卡那霉素100mg/L的LB细菌培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCL 10g/L，pH 7.0)中37℃摇动过夜。

(2)在1.5mL的Eppendorf管中，12000rpm离心2min，重复一次，收集3mL菌体。

(3)加入100μL溶液I(25mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl，pH 8.0，10mmol/L EDTA)，震荡均匀。

(4)加入200μL溶液II(0.2mmol/L NaOH，1％SDS)，颠倒离心管数次混合内容物，放置冰上3min。

(5)加入150μL溶液III(5mmol/L醋酸钾60mL，冰醋酸11.5mL，蒸馏水28.5mL)，混合均匀，放置冰上。

(6)12000rpm离心10min，取上清移至新的Eppendorf管中。

(7)加入等体积酚∶氯仿(1∶1)，充分混合，12000rpm离心5min，取上清。

(8)加入1/10体积3mol/L醋酸钠(pH 5.2)和两倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min。

(9)离心弃上清，冰预冷的70％乙醇洗沉淀两次，充分吹干。

(10)加入50μL TE(pH 8.0)，溶解pET-28a和pEGFP-N1质粒DNA，以待下一步连接之用。

2.绿色荧光蛋白基因(GFP基因750bp大小)的获得：

以pEGFP-N1(内含GFP基因，已成为一种商品化的基因，来自CLONTECHLaboratories Inc.)为模板、利用下列引物，进行PCR扩增，扩增出GFP基因。

     EcoRI

5’GCT GAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT

     SalI

5’GCG GTCGACTTATTATTTGTATAGTTCAT

PCR反应体系：10XPCR缓冲液5μL，10mM dNTP 4μL，Pfu DNA聚合酶2U，引物1(30ng/μL)2μL，引物2(30ng/μL)2μL，pEGFP-N1质粒DNA 0.1μL，加水到总体积至50μL，上述成份均加入到0.5mL PCR管，混均后覆盖一层无菌石蜡油(20-30μL)。

PCR程序为：95℃预变性5min；然后94℃变性1min，65℃复性1min，72℃延伸3min，循环25次。反应结束后取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

对扩增产物进行酚/氯仿抽提纯化。

(1)加入等体积酚∶氯仿(1∶1)，充分混合，12000rpm离心5min，取上清。

(2)加入1/10体积3mol/L醋酸钠(pH 5.2)和两倍体积预冷的无水乙醇，-20℃放置30min。

(3)离心弃上清，冰预冷的70％乙醇洗沉淀两次，充分吹干，得到GFP基因的PCR产物片段。

3.口蹄疫多肽疫苗基因(200bp大小)的获得

根据O型病毒的O58(GeneBank号：FDI 141469)和O86(GeneBank号：FDI141468)序列的编码VP1蛋白的第140-160氨基酸和200-213氨基酸的核苷酸序列(杨永钦等，1997；Dus Santos MJ，2002)，由BioAsia上海博亚生物技术有限公司合成O型口蹄疫多肽疫苗基因，即编码O58型和O86型病毒的VP1蛋白的20肽、14肽相串联起来的多肽的核苷酸序列，获得O型口蹄疫多肽疫苗基因(200bp大小)。

4.融合基因的构建及克隆：

(1)片段及质粒酶切

将上海博亚生物技术有限公司合成的O型口蹄疫多肽疫苗基因片段的PCR产物经检测大小为200bp，即与预期的口蹄疫多肽疫苗基因大小相符合，初步表明它是合成的口蹄疫多肽疫苗基因。用限制性内切酶NcoI和EcoRI酶切。

然后再将GFP基因(为750bp)扩增产物用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切。

将质粒pET-28a利用限制性内切酶NcoI和SalI酶切。

(2)片段电泳回收

为将上述O型口蹄疫多肽疫苗基因PCR扩增后酶切的片段及绿色荧光蛋白基因PCR扩增后酶切的片段进行连接，从电泳的凝胶上切下这些片段，利用玻璃奶回收试剂盒进行。其中合成O型口蹄疫多肽疫苗基因扩增后酶切片段为200bp大小，GFP基因扩增后酶切片段约为750bp大小。

(3)连接

将上述合成的O型口蹄疫多肽疫苗基因扩增后酶切片段和GFP基因的扩增后酶切片段及进行了NcoI和SalI酶切的PET-28a各取1μL加入无菌的0.5mL小离心管中，加入3μL连接缓冲液I(大连宝生生物公司)及T4DNA连接酶混匀，放于-16℃连接过夜，得到合成的O型口蹄疫多肽疫苗基因片段和GFP基因的连接到PET-28a上的连接产物。

(4)转化

(a)转化用感受态大肠杆菌的制备：

挑取BL21的单菌落于10mL液体LB培养基中，37℃250rpm培养过夜。

取1mL培养菌液加到100mL新鲜LB培养基中，37℃300rpm培养3h左右至OD₆₀₀值为0.5-0.6。

冰浴菌液30min，4℃6000rpm离心5min，收集菌体。

弃掉上清，加入10mL冰浴无菌的0.1mol/L CaCl₂溶液中悬浮菌体细胞，冰浴15min。

4℃6000rpm离心5min。

弃掉上清，将菌体重悬于2mL 0.1mol/L CaCL₂溶液中。

分装到预冷的1.5mL无菌Eppendorf管中(200μL/管)，加入15％的无菌甘油于-70℃贮存备用。

(b)大肠杆菌的转化：

将O型口蹄疫多肽疫苗基因片段和GFP基因的连接到PET-28a上的连接产物通过热激法转化感受态大肠杆菌BL21。

取1μL的O型口蹄疫多肽疫苗基因片段和GFP基因的连接到PET-28a上的连接产物加到200μL BL21感受态细胞溶液中，混匀后，冰浴30min。

42℃水浴热激90sec，立即置冰浴中1-2min。

加入800μL LB液体培养基，37℃150rpm摇床培养1h。

在Kan(100mg/L)LB固体平板上，涂布40μL X-gal(20μg/μL)和4μLIPTG(200μg/μL)溶液。

从1mL转化菌液中取100μL菌液涂布于平板上，风干。

37℃培养16小时，平板上出现兰色和白色菌落，挑取白色菌落进行重组克隆的鉴定。鉴定结果表明，带有目的基因的原核表达载体已导入到生产型原核表达宿主菌BL21中，将其命名为pET28a-21(见图1)。

5.转化子鉴定：

(1)电泳法鉴定

按常规碱裂解法提取转化菌落的质粒pET28a-21，通过电泳确定质粒的大小，提取的质粒大于原始的PET-28a质粒，为克隆有目的基因的候选质粒(比对照质粒增大)。

进一步用限制性内切酶NcoI和EcoRI酶切进行验证，电泳检测切出片段在200bp的为含有O型口蹄疫多肽疫苗基因片段的质粒pET28a-21。

(2)测序法鉴定

将含有pET28a-21质粒的菌株用甘油管保存，并交测序公司测序，测序引物为PET-28a质粒上的T7启动子区的引物，即T7引物。得到SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，表明目的基因已正确插入表达载体pET28a(Novagen)中。其中有下划线区域为O58多肽的编码区(正体是第140-160序列20肽，斜体是第200-213序列14肽)，方框区域为O86多肽编码区(正体是第140-160序列20肽，斜体是第200-213序列14肽)，黑色小写为PET载体的序列，其余为GFP基因的序列。所构建的原核表达载体见图1。

实施例2.原核表达产物免疫原性的检测

首先将构建好的pET28a-21原核表达载体进行诱导表达并进行蛋白纯化(方法按pET技术说明书(Novagen公司)进行)，然后检测口蹄疫多肽疫苗及绿色荧光蛋白的融合基因的表达产物的免疫原性。

1.蛋白纯化

(1)将含有pET28a-21的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后培养液在4℃、6500g条件下离心15min，以收集菌体，去上清(大肠杆菌IPTG诱导培养方法参照Sambrook的[分子克隆])。

(2)用原培养液1/10体积的1XIB缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，10mmol/L EDTA，1％TritonX-100)重悬沉淀。

(3)溶菌酶加超声裂解：加入溶菌酶至终浓度100μg/mL，30℃放置15min。搅拌后将样品缓冲液置于冰浴中，利用超声仪(国产新芝牌)，200-300W功率，按1秒钟超声，3秒种间隔的方式进行60-90次。

(4)加入蛋白酶抑制剂(PSMF)。

(5)在4℃下，10000g离心10min。

(6)去上清，用原培养液1/10体积的1XIB缓冲液重悬沉淀。

(7)重复步骤(6)。

(8)重复步骤(6)，将悬液移入已知重的离心管中。

(9)4℃10000g离心10min。彻底去上清。称重，计算产量。

2.SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE电泳检测：对上述表达产物按常规方法进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度8％，考马斯亮兰R-250染色，甲醇-乙酸脱色。

结果表明，上述纯化蛋白大小大于30KD，即大于GFP蛋白的大小，初步确认是含有pET28a-21的大肠杆菌表达的含有O型口蹄疫多肽疫苗基因和GFP基因融合表达的目的蛋白。

3.Western blotting分析

溶液的配制

(1)电转移缓冲液：含39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris·HCL(pH 6.8)，037％SDS，20％甲醇；

配制1000mL：称取甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，SDS 0.37g，溶解于750mL重蒸水后，加入200mL甲醇，定容至1000mL。

(2)洗液溶液：150mmol/L NaCL，50mmol/L Tris HCL pH7.5；

(3)封闭液：10mL PBST+0.3g BSA；

(4)0.5％氨基黑10B染液：称取氨基黑10B 0.5g，加入甲醇45mL，冰乙醇10mL，重蒸水45mL；

(5)氨基黑漂洗液：45mL 95％的乙醇，5mL冰乙酸，50mL无离子水；

(6)底物溶液(30mL)：30mL PBST中溶解15mg的DAB(二氨基联苯胺)和9mg CoCL₂，再加入10μL 30％H₂O₂。

电转移

(1)戴上手套，剪6张与上述检测口蹄疫多肽疫苗及绿色荧光蛋白基因融合表达产物的SDS-PAGE电泳凝胶(用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度8％)大小一致的滤纸及一张NC膜，并用转移缓冲液浸泡3-5min。

(2)依次将海绵、滤纸3张、上述凝胶、NC膜、滤纸3张、海绵放好，然后用筛孔板固定好，插入电转移槽中，加入转移缓冲液，确定凝胶在阴极，NC膜在阳极方向。接通电源，电压为50-100V，4℃下电泳2-3h。

(3)电转移完毕，取出经过电转移的NC膜，用铅笔或剪去一角以标记膜的方向。切下标准分子量Marker，置氨基黑染液浸染5min，取出后用漂洗液脱色，直至蓝色背景脱尽。其余NC膜用PBS冲洗，加10mL封闭液浸泡，室温震荡1-3h，以封闭未吸附蛋白质的位点。

免疫学检测

(1)封闭结束后，将经过电转移的NC膜用PBS漂洗液漂洗4-5次，每次5min。

(2)将经过电转移的NC膜转至一塑料袋内，加入PBST 1∶800稀释的口蹄疫病毒阳性血清10mL(0.1mL/cm²)，封口。37℃轻微震荡结合1.5h，用PBST冲洗4-5次，每次在摇床缓慢摇动。然后加入1∶800稀释的兔抗猪IgG(二抗)，室温下轻摇孵育1h，取出用PBST冲洗3-4次，每次10min。以除去未结合的二抗。

(3)将经过电转移的NC膜转入到底物溶液，室温避光轻摇5-10min，观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液终止反应。室温保存，照相。

4.结果

经Western blotting分析，纯化蛋白能被口蹄疫阳性血清所识别，证明表达产物具有免疫学活性。可以作为免疫性诊断抗原。

实施例3.用重组口蹄疫多肽疫苗基因表达蛋白检测口蹄疫病毒抗体

1.用Dot blot ELISA法检测O型口蹄疫病毒抗体

用Dot blot ELISA法检测口蹄疫病毒，方法简单、快捷，无需昂贵的设备。是一种易于普及的方法。其程序如下：

(1)将硝酸或醋酸纤维素膜用打孔机间隔一定距离打5mm孔径的孔痕。

(2)用制备缓冲液按1∶10-1∶3(w/v)用量稀释纯化抗原(即口蹄疫多肽疫苗与绿色荧光蛋白的融合基因表达蛋白)，滴在圆孔中央，每孔加1滴(约2-4μL)，自然干燥后，于封闭液(含0.25％BSA的PBST)中浸泡30min。

(3)取出膜置于室温下干燥。再浸入适当稀释的被检血清中，室温浸泡1h。

(4)将膜置于PBST中轻微荡洗3次，每次3min。

(5)用稀释液过氧化物酶(HRP)标记的抗种属动物的球蛋白抗体结合物适当稀释，并将膜于此液中浸泡1.5h，同步骤(4)洗涤，于邻苯二胺底物溶液中浸泡5-15min显色，用蒸馏水漂洗2min终止反应。试验时须设阴性血清、阳性血清及空白三种对照。

(6)结果判定：出现颜色判阳性，无色为阴性。

2.用间接ELISA法检测O型口蹄疫病毒抗体

器材

酶标仪，96孔酶标板，滤纸，恒温培养箱

试剂

(1)包被缓冲液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6

(2)洗涤液：0.02mol/L PBST缓冲液，pH7.4

(3)封闭液：称取1g BSA溶于0.01mol/L PBST缓冲液中。

(4)抗原：即口蹄疫多肽疫苗及绿色荧光蛋白的融合基因表达蛋白

(5)酶结合物：即HRP标记的抗种属动物的球蛋白抗体(亦称第二抗体)。

(6)底物溶液：为含有邻苯二胺(Orth-Phenyenediamine，OPD)的pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液。0.2M20μL 0.5mol/L H₂O₂磷酸氢二钠(28.4g/L)溶液25.7mL加0.1M柠檬酸(19.2g/L)溶液24.3mL和蒸馏水50mL。临用前取上述缓冲液100mL加40mg OPD，再加30％过氧化氢(H₂O₂)0.15mL。

(7)终止液：0.5mol/L H₂SO₂

材料待测血清

步骤

(1)包被：在酶标板内每孔中加入100μL溶于包被液的抗原(即重组表达的蛋白)溶液(1-5ng/mL)，4℃过夜或37℃温育3h。

(2)洗涤：弃去包被液，用PBST洗3次，每次200μL。扣干PBST清洗液。

(3)封闭：每孔中加入封闭液200μL，37℃温育30min。

(4)洗涤：同步骤2。

(5)加样：每孔加入用稀释液(PBST)稀释的待测血清100μL，置于37℃1h。每块板同时设阴性、阳性血清对照、试剂空白对照。

(6)洗涤：同步骤2。

(7)加入酶结合物：每孔加入100μL酶结合物，37℃放置1h。

(8)洗涤：同步骤2。

(9)显色：每孔加入底物溶液100μL，盖上酶标板盖，室温放置15min。此时阳性对照应呈绿色。

(10)终止反应每孔加入50μL2mol/LH₂SO₄，轻轻摇动酶标板，终止反应。

(11)在酶标仪上测定波长490nm下的光密度值。

(12)绘制标准曲线，从中查出待测样品的浓度，计算样品含量。以被检样品OD值＞阴性对照平均OD值加2-3个标准差作为阳性结果的阈值。被检样品OD值＞阈值为阳性，＜阈值为阴性。

SEQ ID NO 1的信息

序列特征：

(A)(长度)：952个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)(拓扑结构)：线性

序列描述：SEQ ID NO 1：

attcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccATG GTGACCAAAGTGAGAGGCGATCTGCAGGTGCTGGCGCAG

AAAGCGGCACGCTCTCTGCCGAGACATAAACAGAAGATTGTGGCACCAGGCAAACGCCTGCTG

GAATTCATGAGTAAA

GGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGT

GAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACT

TTCACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTC

AGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCNTTGTTAATAGAATC

GAGTTTAAAAAAGGTATTGGATTTTTAAAAGAAGATGGGGAAACCATTTTTTGGGACACAAAAATTGGGAATACAACTATTAACTTCACA

CCAATGGTATNACATTCATTGGCAAGACNAAAACAAT

其中有下划线区域为O58多肽的编码区(正体是第140-160序列20肽，斜体是第200-213序列14肽)，方框区域为O86多肽编码区(正体是第140-160序列20肽，斜体是第200-213序列14肽)，黑色小写为PET载体的序列，其余为GFP基因的序列。

Claims (4)

1.一种重组口蹄疫疫苗基因，具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

2.一种根据权利要求1所述重组口蹄疫疫苗基因编码的口蹄疫重组抗原蛋白。

3.一种生产如权利要求2所述口蹄疫重组抗原蛋白的方法，其特征在于利用权利要求1所述的重组口蹄疫疫苗基因，构建原核表达载体，导入生产性宿主菌中，使转化菌种中的重组基因表达为蛋白，经蛋白纯化，得到具有免疫原性的口蹄疫重组抗原蛋白。

4.一种利用权利要求2所述口蹄疫重组抗原蛋白检测口蹄疫病毒抗体的方法，其特征在于以表达产物纯化后的重组抗原蛋白，经Western-blotting分析筛选阳性产物，以此阳性产物作为免疫性抗原，建立Dot blot ELISA或间接ELISA酶联免疫检测口蹄疫病毒抗体的方法。

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