CN101074442A - 百日咳疫苗保护性抗原的重组表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过基因工程方法从百日咳杆菌CS菌株克隆PRN、FIM2和FIM3基因，并利用表达载体获得的原核表达重组蛋白。将从百日咳杆菌CS菌株克隆得到的PRN、FIM2、FIM3基因分别亚克隆入表达载体中，并构建FIM2－FIM3融合基因表达质粒，分别在大肠杆菌中进行诱导表达。结果显示，四种重组蛋白均具有良好的免疫保护性和免疫原性，显示重组PRN和/或FIM2、FIM3可作为百日咳疫苗抗原的活性成分。

Description

百日咳疫苗保护性抗原的重组表达及其应用

发明领域

本发明涉及生物工程领域，具体地说涉及通过基因工程方法获得百日咳杆菌保护性抗原蛋白，并将其用于百日咳疫苗的生产。

背景技术

百日咳是由百日咳杆菌引起的一种严重呼吸系统传染病，百日咳疫苗是预防百日咳最有效和最经济的手段。据世界卫生组织(WHO)统计报道，现在全世界每年仍有3500万的百日咳患者，其中高达32.5万的儿童死于百日咳及其并发症，且90％的病例来自不发达国家和发展中国家。近年来，在即使疫苗覆盖率很高的国家，仍然存在发病率上升的趋势，局部还有爆发性的流行，成人和青少年的百日咳病例数也急剧增加，被称为“百日咳再现(re-emerge)”。

传统的全细胞疫苗由于其较严重的副作用而促进了新一代百日咳疫苗——无细胞疫苗(APV)的发展，无细胞百日咳疫苗自身具有免疫效果好且副反应小的优点，由此决定无细胞百日咳疫苗必将逐渐替代全细胞疫苗。WHO推荐的无细胞疫苗包括PT、FHA(丝状血凝素)、PRN、FIM2和FIM3五种抗原，其中，百日咳毒素(PT)为APV的主要成分。

理想的百日咳疫苗应是由抗原成分明确，具有良好的免疫原性及保护效果而无毒性作用的百日咳抗原组成。1981年，日本Sato首先研制成功含PT和FHA两种组分的无细胞百日咳疫苗(APV)并在日本推广使用至今，预防效果良好。美国于1992年从日本引进该疫苗用于2岁以上儿童的加强免疫接种。我国何长民等继日本之后，于1989年研制成含PT和FHA两种主要免疫原的APV。近十多年来，英、美、瑞典、意大利、加拿大等国家均对APV中各种保护性抗原PT、FHA、PRN和FIM的致病机理及免疫保护效果展开深入研究。

近年的研究显示，百日咳致病和免疫机理复杂，体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫都在百日咳的免疫中都发挥着重要的作用。据Mills报道，APV免疫后的早期免疫效果是有多种抗原抗体介导的，可限制细菌定居范围，并减轻对上皮细胞和免疫细胞的毒性损害。但后期细菌的清除必须依赖B细胞及其产物的产生的细胞免疫反应。自然感染百日咳可引起血清和局部分泌性免疫应答，说明局部的粘膜免疫在百日咳免疫中也起着重要的作用，但是接种疫苗后只能引起血清免疫应答却不产生分泌性抗体。

研究百日咳疫苗生产菌株的基因背景，增加APV中有效抗原成分并系统地评价其免疫保护作用，以及建立灵敏特异的血清学检定方法用于疫苗生产过程的质量控制和临床效力评价，不仅是百日咳基础研究的热点，同时也是自主发展我国疫苗必须解决的关键点。目前国内外对重组PRN和FIM的免疫保护性研究较少，国内还没有关于重组FIM的研究报道。采用基因工程技术开发的新一代百日咳基因工程疫苗，不仅是科技发展的必然趋势，而且对最终控制和消灭百日咳具策略意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从百日咳杆菌CS菌株中分离的，利用基因工程方法获得的重组PRN，具有良好的免疫原性及保护效果。

本发明的另一目的，采用基因工程技术开发生产的百日咳基因工程疫苗，含有上述的重组PRN，以及重组FIM2、FIM3，可以解决用百日咳培养物上清液纯化抗原制备方法中的有效成分的产量有限，纯化工艺比较复杂，抗原变异等问题。

百日咳杆菌CS菌株是我国50年代自己分离的，也是目前我国用于APV生产的唯一菌株。APV(无细胞百日咳疫苗)产生的特异性抗体谱窄于WPV(全细胞百日咳疫苗)，因此，对APV所包含抗原的基因背景的研究关系到APV的长期保护性评价。

本发明人从百日咳杆菌CS菌株分离了APV中的三种保护性抗原组分PRN、FIM2和FIM3基因。PRN的基因序列是2031bp，其中可显示，发生T-C的突变，Regionl多态区含5个GGXXP，Region2多态区含4个PQP。

   1 GACTGGAACA ACCAGTCCAT CGTCAAGACC GGTGAGCGCC AGCATGGCAT CCATATCCAG

  61 GGCTCCGACC CGGGCGGCGT ACGGACCGCC AGCGGAACCA CCATCAAGGT AAGCGGCCGT

 121 CAGGCCCAGG GCATCCTGCT AGAAAATCCC GCGGCCGAGC TGCAGTTCCG GAACGGCAGT

 181 GTCACGTCGT CGGGACAGTT GTCCGACGAT GGCATCCGGC GCTTTCTGGG CACCGTCACC

 241 GTCAAGGCCG GCAAGCTGGT CGCCGATCAC GCCACGCTGG CCAACGTTGG CGACACCTGG

 301 GACGACGACG GCATCGCGCT CTATGTGGCC GGCGAACAGG CCCAGGCCAG CATCGCCGAC

 361 AGCACCCTGC AGGGCGCTGG CGGCGTGCAG ATCGAGCGCG GCGCCAATGT CACGGTCCAA

 421 CGCAGCGCCA TCGTCGACGG GGGCTTGCAT ATCGGCGCCC TGCAGTCATT GCAGCCGGAA

 481 GACCTTCCGC CCAGCCGGGT GGTGCTGCGC GACACCAACG TGACCGCCGT GCCCGCCAGC

 541 GGCGCGCCCG CGGCGGTGTC TGTGTTGGGG GCCAGTGAGC TTACGCTCGA CGGCGGGCAC

 601 ATCACCGGCG GGCGGGCAGC GGGGGTGGCG GCCATGCAAG GGGCGGTCGT GCATCTGCAG

 661 CGCGCGACGA TACGGCGCGG GGACGCGCCT GCC GGCGGTG CGGTTCCCGG CGGTGCGGTT

                                                   Region 1

 721 CCCGGTGGTG CGGTTCCCGG CGGCTTCGGT CCCGGCGGCT TCGGTCCCGT CCTCGACGGC

 781 TGGTATGGCG TGGACGTATC GGGCTCCAGC GTGGAGCTCG CCCAGTCGAT CGTCGAGGCG

 841 CCGGAGCTGG GCGCCGCAAT CCGGGTGGGC CGCGGCGCCA GGGTGACGGT GTCGGGCGGC

 901 AGCTTGTCCG CACCGCACGG CAATGTCATC GAGACCGGCG GCGCGCGTCG CTTTGCGCCT

 961 CAAGCCGCGC CCCTGTCGAT CACCTTGCAG GCCGGCGCGC ATGCCCAGGG GAAAGCGCTG

1021 CTGTACCGGG TCCTGCCGGA GCCCGTGAAG CTGACGCTGA CCGGGGGCGC CGATGCGCAG

1081 GGCGACATCG TCGCGACGGA GCTGCCCTCC ATTCCCGGCA CGTCGATCGG GCCGCTCGAC

1141 GTGGCGCTGG CCAGCCAGGC CCGATGGACG GGCGCTACCC GCGCGGTCGA CTCGCTGTCC

1201 ATCGACAACG CCACCTGGGT CATGACGGAC AACTCGAACG TCGGTGCGCT ACGGCTGGCC

1261 AGCGACGGCA GCGTCGATTT CCAGCAGCCG GCCGAAGCTG GGCGGTTCAA GGTCCTGACG

1321 GTCAATACGC TGGCGGGTTC GGGGCTGTTC CGCATGAATG TCTTCGCGGA CCTGGGGCTG

1381 AGCGACAAGC TGGTCGTCAT GCAGGACGCC AGCGGCCAGC ACAGGCTGTG GGTCCGCAAC

1441 AGCGGCAGCG AGCCGGCCAG CGCCAACACC CTGCTGCTGG TGCAGACGCC ACTAGGCAGC

1501 GCGGCGACCT TTACCCTTGC CAACAAGGAC GGCAAGGTCG ATATCGGTAC CTATCGCTAT

1561 CGATTGGCCG CCAACGGCAA TGGGCAGTGG AGCCTGGTGG GCGCGAAGGC GCCGCCGGCG

1621 CCCAAGCCCG CGCCGCAGCC GGGT CCCCAG CCGCCGCAGC CGCCGCAGCC  GCAGCCGGAA

                                      Region 2

1681 GCGCCGGCGC CGCAACCGCC GGCGGGCAGG GAGTTGTCCG CCGCCGCCAA CGCGGCGGTC

1741 AACACGGGTG GGGTGGGCCT GGCCAGCACG CTCTGGTACG CCGAAAGCAA TGCGTTGTCC

1801 AAGCGCCTGG GCGAGTTGCG CCTGAATCCG GACGCCGGCG GCGCCTGGGG CCGCGGCTTC

1861 GCGCAACGCC AGCAGCTGGA CAACCGCGCC GGGCGGCGCT TCGACCAGAA GGTGGCCGGC

1921 TTCGAGCTGG GCGCCGACCA CGCGGTGGCG GTGGCCGGCG GACGCTGGCA CCTGGGCGGG

1981 CTGGCCGGCT ATACGCGCGG CGACCGCGGC TTCACCGGCG ACGGCGGCGG C

本发明以百日咳杆菌CS菌株基因组为模板，采用PCR方法，扩增APV中的三种保护性抗原组分PRN、FIM2和FIM3基因，克隆入T载体，构建重组克隆质粒并转化入大肠杆菌。阳性菌株经PCR和双酶切方法鉴定，下一步进行体外表达，表达产物免疫学活性分析及基因工程疫苗的研究，都将奠定良好的基础。

本发明利用基因工程技术，分别构建了PRN、FIM3、FIM2和FIM2-FIM3融合基因的原核表达质粒转入大肠杆菌，IPTG诱导表达目的蛋白PRN、FIM2、FIM3和FIM2-FIM3融合蛋白，继而纯化目的蛋白并用免疫印迹和ELISA方法检测所获蛋白的抗原性。

采用小鼠鼻腔攻击和脑腔攻击试验对四种重组蛋白的免疫保护性进行了评价，检测免疫后小鼠血清总IgG抗体产生情况，外周血细胞因子浓度及通过CD4+和CD8+T淋巴细胞表型分析来评价四种重组蛋白免疫原性。结果证实：重组PRN具有良好的免疫保护性，重组FIM2、FIM3和FIM2-FIM3具有一定的免疫保护性；四种重组蛋白都具有良好的免疫原性，都可以诱导免疫后小鼠产生高滴度的特异性抗体；四种重组蛋白都可诱导细胞免疫反应，刺激小鼠体内产生较高水平IL-2的和低水平的TNF-α，CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群和佐剂对照组相比都有增高。

将PRN、FIM2和FIM3三种重组蛋白的一种或同种按一定浓度比例配比作为具有免疫性的抗原成分加入到疫苗中，可以得到良好的免疫原性和保护性。三种组分的浓度比是PRN∶FIM2∶FIM3＝(2～10)∶(1～5)∶(1～5)；还可以将PRN、FIM2、FIM3和FIM2-FIM3重组蛋白作为疫苗的抗原组分。

本发明为我国的APV增加PRN、FIM2和FIM3抗原组分，提高我国APV的免疫保护效果，符合百日咳疫苗发展趋势。利用基因工程方法制备PRN、FIM2和FIM3抗原成分，可以解决用百日咳培养物上清液纯化抗原制备方法中的有效成分的产量有限，纯化工艺比较复杂，抗原变异等问题。

附图说明

图1是本发明pGEM-T Easy-目的基因重组克隆质粒构建示意图。

图2是本发明的重组蛋白的重组表达质粒构建示意图；其中图2-1是PQE-30-PRN重组质粒构建示意图；图2-2是pET-3a(+)-FIM2重组质粒构建示意图；图2-3是pQE-30-FIM3重组质粒构建示意图；图2-4是pET-30a(+)-FIM2-FIM3重组质粒构建示意图。

图3是本发明PRN的SDS-PAGE凝胶扫描分析图；图中，

1.携带pQE-30空载体的E.coli溶解产物)；2.未诱导的携带pQE-30/Prn的E.coli溶解产物；3.携带pQE-30/Prn的E.coli诱导后溶解产物4.携带pQE-30/Prn的E.coli诱导后超声和离心后上清；5.携带pQE-30/Prn的E.coli诱导后超声和离心后沉淀6.纯化后重组蛋白。

图4是本发明FIM2的SDS-PAGE凝胶扫描分析图；其中图中，

1.携带PET-30a(+)空载体的E.coli溶解产物

2.未诱导的携带PET-30a(+)/FIM2的E.coli溶解产物

3.携带PET-30a(+)/FIM2的E.coli诱导后溶解产物

4.携带PET-30a(+)/FIM2的E.coli诱导后超声和离心后上清

5.携带PET-30a(+)/FIM2的E.coli诱导后超声和离心后沉淀

6.纯化后重组蛋白。

图5是本发明FIM3的SDS-PAGE凝胶扫描分析图；其中图中，

1.携带PQE-30空载体的E.coli溶解产物；2.未诱导的携带PQE-30/FIM3的E.coli溶解产物；3.携带PQE-30/FIM3的E.coli诱导后溶解产物；4.携带PQE-30/FIM3的E.coli诱导后超声和离心后上清；5.携带PQE-30/FIM3的E.coli诱导后超声和离心后沉淀；6.纯化后重组蛋白。

图6是本发明FIM2-FIM3的SDS-PAGE凝胶扫描分析图；其中，图中

1.低分子量蛋白Marker；2.携带pET-30a空载体的E.coli溶解产物；3.未诱导的携带pET-30a(+)/FIM2-FIM3的E.coli溶解产物；4.携带pET-30a(+)/FIM2-FIM3的E.coli诱导后溶解产物；5.携带pET-30a(+)/FIM2-FIM3的E.coli诱导后超声和离心后上清；6.携带pET-30a(+)/FIM2-FIM3的E.coli诱导后超声和离心后沉淀；7.纯化后重组蛋白。

图7是本发明重组蛋白的Western Blot(免疫印迹法)鉴定结果；其中，1，3，5，7：预染蛋白Marker；2：重组蛋白FIM2与抗FIM2单抗特异结合；4：重组融合蛋白FIM2-FIM3与抗FIM2单抗特异结合；5：重组融合蛋白FIM2-FIM3与抗FIM3单抗特异结合7：重组蛋白PRN与抗PRN单抗特异结合。

图8是FIM2、FIM3、PRN的ELISA鉴定结果。

图9是FIM2-FIM3的ELISA鉴定结果。

图10是小鼠鼻腔攻击保护力试验(^*P＜0.05)。

图11是小鼠细胞因子的测定(^*P＜0.05)。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是要对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容的技术特征所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1.、PRN、FIM2和FIM3基因的克隆

1.1PRN、FIM2和FIM3基因的扩增

用全基因组DNA提取试剂盒(Promega公司)从百日咳杆菌CS菌株(中国药品生物制品检定所血清室保存)提取百日咳基因组DNA。采用PrimerPremier 5.0软件设计引物，根据GeneBank报道的百日咳PRN、FIM2和FIM3基因序列(GenBank登录号分别为J04560、Y00527、X51543)：分别设计3对引物如表1：

表1

基因	引物序列(5’-3’)	位置(nt)	长度(bp)
				PRNFIM2701FIM3	上游5′-ATGGCGGGCGTCTGCTCTCCACCTG-3′下游5-ACCTTGAAGTCATTCTCCAGGCGGC-3′上游5′-ACCCATGCAAATCCCTTTCCAACGC-3′下游5′-GTATGTTGGCGATTTCCAGTTTCTC-3′上游5′-TTATCTTTGCCGCCTCGCCCGTACTG-3′下游5′-TGGCTCFIMGGTAGACGACGGAAAAG-3′	113-1372360-2384853-877373-398929-954	2272177-201582

由北京赛百盛生物公司合成引物。

进行PCR扩增反应，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离，获得特异的4条片段。切取含有目的片段的凝胶块，并用DNA胶回收试剂盒(OMEGA公司)回收。扩增产物的分子量大小与预期相近。PRN，2272bp；FIM2，701bp；FIM3，582bp。

1.2PCR产物的克隆

将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体(Promega公司)连接。

pGEM-T Easy-目的基因重组克隆质粒构建示意图见图1。构建的重组质粒DNA转化大肠杆菌DH5α(中国药品生物制品检定所血清室保存)，挑取阳性克隆，用质粒提取试剂盒(博大泰克公司)提取质粒，经酶切确定阳性克隆。

将克隆所得CS的PRN基因读码框架(2031bp)的序列分析结果显示：它与和GeneBank中相应18株百日咳杆菌基因序列strain Tohama、strainCZ、strain HAV、strain B391(PRN1)、strain B345(PRN2)、strain B343(PRN3)、strain B705(PRN4)、strain B935(PRN5)、strain 18323(PRN6)、strain B567(PRN7)、strain B1092(PRN8)、strain B1679(PRN9)、strainCN5476、strain 99K45、strain DCH132的同源性为99.6～99.9％。推导的氨基酸同源性为99.4～99.7％，与strain B391(PRN1)的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9％和99.7％。

将克隆所得CS的FIM2基因读码框架(543bp)的序列分析结果显示：它与和GeneBank中的百日咳杆菌gi33564552(Tohama I)和Y00527(FIM2-1)的核苷酸和氨基酸的同源性均为100％，与AJ420988(FIM2-2)的同源性分别为99.8％和99.5％。与支气管败血症百日咳杆菌RB50(gi33577672)的同源性分别为72.9％和75％，与副百日咳杆菌12822(gi33574803)的同源性分别为72.6％和73.1％。

将克隆所得CS的FIM3基因(416bp)的序列分析结果显示：它与和GeneBank中相应5株百日咳杆菌基因序列X51543(FIM3A)、AY464179(FIM3A*)、AY464180(FIM3B)、AY464181(FIM3C)、gi33564552(TohamaI)、gi3171725(FIM3)同源性为99.5～100％，与6株支气管败血症百日咳杆菌的同源性为95.7％～98.1％，与1株副百日咳杆菌同源性分别为97.6％。

推导的氨基酸同源性为CS与5株百日咳杆菌同源性为97.8～99.3％，与6株支气管败血症百日咳杆菌的同源性分别为93.5％～95.7％。

实施例3.重组表达质粒的构建

PCR扩增目的基因，根据GeneBank报道的百日咳PRN，FIM2和FIM3基因序列(GenBank登录号分别为J04560、Y00527、X51543)，分别设计相应的引物。应用设计的引物分别扩增PRN，FIM2和FIM3基因，构建PRN，FIM2、FIM3和FIM2-FIM3融合基因相应的表达质粒。参见图2-1、2-2、2-3、2-4，其中，构建原核表达质粒为PRN-PQE30、FIM3-PQE30、FIM2-PET30a和FIM2-FIM3-PET30a。

实施例4.重组蛋白在大肠杆菌中的表达

分别将构建好的重组质粒导入大肠杆菌诱导表达，即将重组质粒PRN-PQE30、FIM3-PQE30转入大肠杆菌M15中，FIM2-PET30a和FIM2-FIM3-PET30a转入在大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达目的蛋白PRN、FIM2、FIM3和FIM2-FIM3融合蛋白，继而纯化目的蛋白；然后进行SDS-PAGE分析。

4.1重组蛋白FIM2、FIM2-FIM3、FIM3和PRN的表达水平

对表达产物进行SDS-PAGE凝胶扫描分析，ImageMaster TotalLab软件分析测定蛋白表达水平。目的蛋白PRN、FIM2和FIM2-FIM3的表达量占菌体总蛋白的40％以上，FIM3的表达量为25％。见图3、4、5、6。

4.2表达产物在菌体内的存在形式

将诱导表达后的菌体离心收集后，用裂解液洗涤3次后，悬浮，超声破碎菌体，于4℃、12000rpm离心30min，分别将沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳分析，以确定表达产物的存在形式。结果发现，四种重组蛋白大部分都存在于沉淀中，上清中几乎没有，说明四种重组蛋白都主要以包涵体的形式存在于菌体中。

实施例5.表达产物的纯化

5.1包涵体的初步提纯和裂解

经IPTG诱导4-6小时，4℃，8000rpm离心10min收集菌体。取5g菌体用PBS溶液洗涤3次，以20ml的PBS溶液重新悬浮，冰浴超声破碎菌体，4℃，12000rpm，离心30min，弃上清，沉淀用TE+0.5％Triton X-100溶液洗涤3次，再用PBS溶液洗去Triton X-100，最后将沉淀溶解于20ml上样缓冲液(pH7.4，8M尿素，20mM phosphate，0.5M NaCl，10mM imidazole)中，室温放置2小时，4℃，12000rpm，离心30min，取上清用0.45um的滤膜过滤后进行后续纯化。

5.2融合蛋白的分离纯化

取上清上样至阴离子交换柱，重组蛋白吸附浓缩到阴离子凝胶柱，NaCl梯度洗脱，收集目的蛋白峰，SDS-PAGE检测。向目的蛋白峰内加入硫酸铵到终浓度为lmol/L，上疏水凝胶柱纯化，梯度降低硫酸铵浓度洗脱蛋白，收集目的蛋白峰，SDS-PAGE检测。四种重组蛋白根据其理化性质不同，纯化条件分别进行优化。

实施例6重组蛋白的抗原性检测

以纯化好(90％以上)的重组蛋白进行活性分析。

6.1Western Blot检测

结果可见图7，重组蛋白FIM2、FIM3和PRN与相应的单克隆抗体有特异性印迹反应，FIM2-FIM3与FIM2单克隆抗体和FIM3单克隆抗体都发生反应。分别在22KD，22.5KD，44.5KD和69KD处有显色条带，空载体对照无明显显色带，说明表达的蛋白具有一定的抗原活性。

6.2重组蛋白的ELISA鉴定

按常规间接ELISA方法分别将PRN、FIM2和FIM3三种重组蛋白抗原按一定梯度稀释度包被，封闭后加入相应的抗体(抗PRN单抗、抗FIM2单抗或抗FIM3单抗)，洗涤后再加入酶标二抗，最后底物显色检测。结果表明(图8和9)重组蛋白PRN、FIM2和FIM3与相应的单克隆抗体存在特异反应，融合蛋白FIM2-FIM3与FIM2 mAb和FIM3 mAb都存在特异的免疫反应，说明表达的蛋白具有一定的抗原活性。

实施例7.免疫保护性评价

7.1脑腔攻击试验：

将实验动物分为七组，每组分为三个稀释度，每个稀释度NIH小鼠20只，雌雄各半，腹腔注射0.5ml/只。

1)参考百日咳菌苗组2)无细胞百日咳疫苗原液组(阳性对照)

3)PRN组 4)FIM2组 5)FIM3组 6)FIM2-FIM3组 7)Prn，Fim2和Fim3混合组8)无细胞百日咳疫苗原液组+PRN 9)无细胞百日咳疫苗原液组+Prn，Fim2和Fim3混合组

同时设立毒力对照组(阴性对照)：共50只小鼠，10只一小组，分别用攻击菌80000、8000、800、80、8个攻击。

实验程序为：

1)稀释：

A.参考苗(18IU/ml)用生理盐水稀释成1.0IU/ml、0.2IU/ml、0.04IU/ml。

B.纯化重组蛋白释成400μg/ml。

C.无细胞百日咳原液(阳性对照疫苗，北京生物制品研究所)，稀释成浓度为6.12μg/ml。

D.攻击菌用蛋白胨水稀释成每0.03ml含菌80000，做为实验组的攻击菌液。然后再连续稀释，使每0.03ml含菌8000、800、80和8个菌，用上面5个稀释度菌液作为对照组的攻击菌液，用于测定攻击菌液的LD50。

2)吸附：将400μg/ml的重组蛋白与3.06μg/ml无细胞百日咳原液分别与2mg/ml的Al(OH)3等体积混合，4℃磁力搅拌过夜。然后分别进行连续5倍稀释。使重组蛋白成为200μg/ml、40μg/ml和8μg/ml，无细胞百日咳原液成为蛋白氮为3.06μg/ml、0.612μg/ml、0.1204μg/ml。三种重组蛋白按浓度比例配比，即PRN∶FIM2∶FIM3＝(2～10)∶(1～5)∶(1～5)总浓度为200μg/ml的重组蛋白与2mg/ml的Al(OH)3等体积混合，也连续5倍稀释，应用上述已稀释的无细胞百日咳原液与200μg/ml PRN混合后再与与Al(OH)3混合乳化后，也连续5倍稀释成为三个浓度的稀释度。同样，应用上述已稀释的无细胞百日咳原液与PRN∶FIM2∶FIM3三种重组蛋白混合后再与Al(OH)3混合乳化后，也连续5倍稀释成为三个浓度的稀释度。

3)免疫：。用不同稀释度的重组蛋白样品、参考苗和阳性对照疫苗腹腔免疫小鼠，每稀释度20只(雌雄各半)每只腹腔注射0.5ml。同时饲养100只健康小鼠作为对照组。

4)攻击：免疫21天后，每只小鼠脑腔攻击80000个细菌/0.3ml菌液。同时进行小鼠毒力对照攻击，每个稀释度攻击10只。

5)观察：于攻毒后第三天将动物挑成每组16只小鼠，每天观察动物死亡情况并纪录。

6)统计结果：于攻毒后第14天统计动物死亡数据。凡有麻痹、头部肿胀、弓背及明显松毛的小鼠均按死亡计算。

7)效力计算：使用计算机专用软件，按平行线法计算重组蛋白的效价。

8)实验成立条件

A.标准和待检样品的ED50应在最大和最小之间。

B.待检样品和标准疫苗的剂量反应曲线在平行性及直线性上无明显偏差。

C.按Reed-Muench法计算LD50，一个LD50的菌数应不高于800个菌，不低于80个菌。

D.攻击毒力的范围应在100-1000LD50之间。

毒菌攻击14天后，小鼠存活数量统计如表2所示：用攻击菌80000个细菌/0.3ml的攻击剂量攻击的对照组小鼠均全部死亡，而PRN组、Prn，Fim3、Fim2和Fim3混合试验组、无细胞百日咳疫苗原液组、无细胞百日咳疫苗原液组+PRN、无细胞百日咳疫苗原液组+Prn，Fim2和Fim3混合实验组动物均有存活，说明重组抗原具有一定的保护性。其中无细胞百日咳疫苗原液组+PRN、无细胞百日咳疫苗原液组+Prn，Fim2和Fim3混合实验组动物存活数较无细胞百日咳疫苗原液实验组多，证明混合多种抗原的实验组的免疫保护性效果好一些。

表2.试验动物脑腔攻击实验结果

抗原	免疫剂量	稀释度	小鼠总数	存活数
					参苗5#APV原液组Prn组FIM2FIM3FIM2-FIM3APV原液组+PRNAPV原液组+Prn，FIM2和FIM3混合组Prn，FIM2和FIM3混合组毒力对照LD50＝140	1.0IU/ml0.5IU/ml0.04IU/ml3.06μg/ml0.612μg/ml0.1204μg/ml100μg20μg4μg100μg20μg4μg100μg20μg4μg100μg20μg4μg3.06μg/ml+100μg0.612μg/ml+20μg0.1204μg/ml+4μg3.06μg/ml+100μg0.612μg/ml+20μg0.1204μg/ml+4μg100μg20μg4μg8000080008008080	123123123123123123123123123	1616161616161616161616161616161616161616161616161616161616161616	1462149273142121131014115151158420141012

7.2鼻腔攻击试验

将实验动物分为5组，每组分为2个稀释度(稀释度2和3)，每个稀释度NIH小鼠10只，雌雄各半，腹腔注射0.5ml/只。

1)PRN组；2)FIM2组；3)FIM3组；4)FIM2-FIM3组；5)Prn，Fim2和Fim3混合组；6)无细胞百日咳疫苗原液组；7)无细胞百日咳疫苗原液组+PRN；8)无细胞百日咳疫苗原液组+Prn，Fim2和Fim3混合组，同时设立阴性对照10只小鼠，雌雄各半。

实验程序为：

1)稀释：

A.按上述方法稀释纯化重组蛋白和无细胞百日咳疫苗原液。

B.吸附：按上述方法将已稀释重组蛋白或无细胞百日咳疫苗原液与2mg/ml的Al(OH)3等体积混合，4℃磁力搅拌过夜。然后分别进行连续5倍稀释。但实验组的稀释度保持2和3两个稀释浓度。

2)免疫：用不同稀释度的重组蛋白样品分别在第0天和第14天，腹腔免疫小鼠。

3)攻击：两周后用浓度为2×107CFU/ml百日咳杆菌18323鼻腔攻击小鼠。每只50μl。

4)攻击一周后，在无菌条件下取每组5只小鼠肺，并进行研磨成悬液，应用有限稀释法进行计算每只小鼠的肺部细菌克隆数，结果进行统计分析。

如图10所示，结果显示PRN组、Prn，Fim2和Fim3混合试验组、无细胞百日咳疫苗原液组、无细胞百日咳疫苗原液组+PRN、无细胞百日咳疫苗原液组+Prn，Fim2和Fim3混合组与对照组之间有显著性差异，说明重组抗原具有一定的保护性。其中无细胞百日咳疫苗原液组+PRN、无细胞百日咳疫苗原液组+Prn，Fim2和Fim3混合实验组小鼠肺部的细菌克隆数较无细胞百日咳疫苗原液组少，证明混合多种抗原的实验组较含有PT和FHA的无细胞百日咳疫苗原液实验组的免疫保护性效果好一些。

实施例8.重组蛋白免疫原性评价

血清抗体ELISA检测方法的建立

将重组蛋白以20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml和2μg/ml的浓度包被酶标板，单克隆抗体稀释为1∶100、1∶1000和1∶5000，做间接ELISA进行棋盘滴定。由P/N比值大于2.1的最高稀释度确定合适的包被浓度。

表3重组抗原包被浓度的确定

包被抗原	包被浓度(μg/ml)	阴性血清OD(N)	阳性血清OD(P)
				PRN	201052	0.1350.1140.1060.098	1.1751.5491.2991.041
FIM2	201052	0.1280.1150.1040.095	1.0340.8890.7750.625
				FIM3	201052	0.3070.1450.1040.098	1.4521.2161.1340.928

最终根据结果确定四种重组蛋白的最合适的包被浓度为2μg/ml。

8.1总IgG抗体的测定

将小鼠分为4组，每组30只，四种抗原与佐剂吸附好后，PRN组、FIM2组、FIM3组、FIM2-FIM3组和Prn，Fim2和Fim3混合组，每只小鼠腹腔分别免疫100μg、20μg和4μg纯化蛋白，每个稀释度免疫十只小鼠，分别在0天和14天免疫两次，同时设定阴性对照佐剂Al(OH)3组5只小鼠。第二次免疫小鼠一周后，内眦取血，用以上建立的ELISA检测方法检测血清总IgG抗体，四种重组都可刺激小鼠产生高滴度的抗体，其中PRN和FIM2产生的中和抗体滴度高于FIM3，FIM2-FIM3融合蛋白产生的抗FIM2中和抗体滴度高于产生的抗FIM3中和抗体，这可能与FIM2的抗原反应性高于FIM3有关。经加强免疫的小鼠抗体滴度高于免疫一次的小鼠，而且在一定范围内，抗体滴度随免疫剂量的增加而增加。

表4不同免疫剂量组小鼠血清抗体滴度

免疫剂量
				实验组PRNFIM2FIM3FIM23FIM23/2FIM23/3混合组-PRN混合组-FIM2混合组-FIM3	200μg/ml1∶2560001∶640001∶160001∶640001∶320001/4001∶5120001∶1280001∶32000	40μg/ml1∶1280001∶640001∶160001∶640001∶320001/4001∶1280001∶640001∶32000	8μg/ml1∶320001∶320001∶160001∶320001∶160001/2001∶320001∶640001∶16000

8.2小鼠外周血细胞因子的检测

将小鼠分为7组，每组5只，分别为与佐剂吸附后的PRN组、FIM2组、FIM3组、FIM2-FIM3组、Prn，Fim2和Fim3混合组和佐剂Al(OH)3组，其中PRN组、FIM2组、FIM3组、FIM2-FIM3组和Prn，Fim2和Fim3混合组中，每只小鼠腹腔免疫20μg纯化蛋白，第21天(攻毒前)，取血并分离血清，用ELISA方法检测细胞因子IFNγ、IL-2IL-4和TNF-α。

采用深圳晶美生物工程公司的小鼠细胞因子ELISA检测试剂盒进行检测。具体方法如下：

1)确定本次实验检测所需的已知包被抗体的酶标板孔数目，并增加一孔TMB空白显色空。

2)将2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。直接加不同培养时间取出的脾细胞培养上清，100μl/孔。

3)酶标板加盖，37℃反应120分钟，反应后吸弃酶标板内的液体，不洗。

4)将准备好的生物素抗小鼠白介素2抗体工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)。37℃反应60分钟。0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。

5)将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)。37℃反应30分钟。0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。

6)按每孔90μl依次加入TMB显色液，37℃避光反应25-30分钟。按每孔100μl依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。

7)酶标仪在450nm测定OD值，根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。

如图11的结果显示，PRN、FIM2、FIM3、FIM2-FIM3、Prn，Fim2和Fim3混合组的重组蛋白都可诱导细胞免疫反应，刺激小鼠体内产生较高水平IL-2的和低水平的TNF-α。

8.3流式细胞仪检测免疫小鼠后外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞表型

取NIH雌性小鼠30只，随机分为5组，6只/组。按分组情况分别腹腔注射吸附好佐剂的重组蛋白PRN(20μg)、FIM2(20μg)、FIM3(20μg)、FIM2+FIM3(20μg)，Prn、Fim2和Fim3混合组和Al(OH)3佐剂。在注射后的第7天取内眦静脉血，检测T淋巴细胞表型的变化。实验步骤如下：

1)小鼠摘眼球采血，取2ml加入含有EDTA的抗凝管中，振荡摇匀。

2)荧光抗体标记：取抗凝血25μl加入PE管中，样品管中分别加入抗鼠CD4:FITC/CD3:RPE双标记抗体和抗鼠CD8:FITC/CD3:RPE双标记抗体各5μl，充分混匀，室温避光孵育30分钟。同时做未免疫的正常小鼠外周血的同型对照，以消除非特异反应。

3)各管中分别加入红细胞裂解液1ml，室温避光放置15分钟，充分裂解红细胞。1000rpm离心5min，尽弃上清。

4)加入2ml PBS洗液重悬细胞，1000转/分，离心5分钟，弃上清。同法再洗涤两次。洗3次后，用0.5ml PBS重悬。

5)流式细胞仪测定10000个细胞。

表5免疫后小鼠外周血细胞CD4+和CD8+T细胞亚群测定

分组	T细胞亚群百分数
			CD4+T	CD8+T
	PrnFIM2FIM3FIM2-FIM3Prn-Fim2-Fim3混合组佐剂组	34.0124.9926.8736.2236.129.05			15.3810.3310.4414.6415.569.58

用流式细胞仪直接免疫荧光测定CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群，结果显示，小鼠在免疫7天后，外周血中PRN组、FIM2组、FIM3组、FIM2-FIM3组和混合实验组小鼠的CD4+及CD8+T细胞亚群和佐剂对照组相比都有增高，均能增强小鼠的免疫反应。

据Storsaeter等报导，疫苗的保护效果也与血清中PRN、FIM2和FIM3的IgG抗体显著相关。在我们的研究中，四种重组蛋白都可刺激小鼠产生高滴度的中和抗体，其中PRN和FIM2产生的中和抗体滴度高于FIM3，FIM2-FIM3融合蛋白产生的抗FIM2中和抗体滴度高于产生的抗FIM3中和抗体，这可能与FIM2的抗原反应性高于FIM3有关。Prn，Fim2和Fim3重组抗原混合实验组的结果显示刺激小鼠的产生抗体水平也较高。百日咳的免疫不仅仅是体液免疫，细胞免疫也起着举足轻重的作用。PRN、FIM2、FIM3、FIM2-FIM3、Prn，Fim2和Fim3混合实验组的结果显示均可诱导一定的细胞免疫反应，刺激小鼠体内产生较高水平IL-2的(P＞0.05)和低水平的TNF-α。实验动物CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群的测定结果显示，外周血中PRN组、FIM2组、FIM3组、FIM2-FIM3组和混合实验组小鼠的CD4+及CD8+T细胞亚群较佐剂对照组相比均有增高，增强了小鼠T细胞的免疫反应能力。

脑腔攻击免疫保护性实验结果显示应用重组抗原免疫的小鼠在使用致死量的百日咳攻击菌攻击后仅有小鼠存活，而对照组小鼠却全部死亡。说明重组抗原具有一定的免疫保护性。在无细胞百日咳疫苗原液+重组PRN实验组小鼠的存活率(62.5％)和无细胞百日咳疫苗原液+重组PRN，Fim2和Fim3混合组的存活率(64.5％)均高于无细胞百日咳疫苗原液组(52.08％)。

综合以上试验结果说明，所得重组PRN、FIM2、FIM3和FIM2-FIM3都具有良好的免疫原性，重组PRN免疫保护性良好，重组FIM2、FIM3和FIM2-FIM3具有一定的免疫保护性。

由于国产无细胞百日咳疫苗原液内主要成分为PT和FHA，可能仅含有极微量的PRN，因此在疫苗中增加重组PRN和/或Fim2和Fim3，可以提高无细胞疫苗的保护效力，且保护效力不会被无细胞疫苗原液中的PT和FHA所覆盖。在百日咳疫苗中增加重组蛋白PRN和/或FIM2、FIM3、FIM2-FIM3作为抗原成份，其生产工艺为现有技术，在此不做具体描述。

Claims (7)

1、一种重组蛋白，其编码的基因是从百日咳杆菌CS菌株中分离的PRN，其基因序列是：

  1  GACTGGAACA ACCAGTCCAT CGTCAAGACC GGTGAGCGCC AGCATGGCAT CCATATCCAG

  61 GGCTCCGACC CGGGCGGCGT ACGGACCGCC AGCGGAACCA CCATCAAGGT AAGCGGCCGT

 121 CAGGCCCAGG GCATCCTGCT AGAAAATCCC GCGGCCGAGC TGCAGTTCCG GAACGGCAGT

 181 GTCACGTCGT CGGGACAGTT GTCCGACGAT GGCATCCGGC GCTTTCTGGG CACCGTCACC

 241 GTCAAGGCCG GCAAGCTGGT CGCCGATCAC GCCACGCTGG CCAACGTTGG CGACACCTGG

 301 GACGACGACG GCATCGCGCT CTATGTGGCC GGCGAACAGG CCCAGGCCAG CATCGCCGAC

 361 AGCACCCTGC AGGGCGCTGG CGGCGTGCAG ATCGAGCGCG GCGCCAATGT CACGGTCCAA

 421 CGCAGCGCCA TCGTCGACGG GGGCTTGCAT ATCGGCGCCC TGCAGTCATT GCAGCCGGAA

 481 GACCTTCCGC CCAGCCGGGT GGTGCTGCGC GACACCAACG TGACCGCCGT GCCCGCCAGC

 541 GGCGCGCCCG CGGCGGTGTC TGTGTTGGGG GCCAGTGAGC TTACGCTCGA CGGCGGGCAC

 601 ATCACCGGCG GGCGGGCAGC GGGGGTGGCG GCCATGCAAG GGGCGGTCGT GCATCTGCAG

 661 CGCGCGACGA TACGGCGCGG GGACGCGCCT GCCGGCGGTG CGGTTCCCGG CGGTGCGGTT

 721 CCCGGTGGTG CGGTTCCCGG CGGCTTCGGT CCCGGCGGCT TCGGTCCCGT CCTCGACGGC

 781 TGGTATGGCG TGGACGTATC GGGCTCCAGC GTGGAGCTCG CCCAGTCGAT CGTCGAGGCG

 841 CCGGAGCTGG GCGCCGCAAT CCGGGTGGGC CGCGGCGCCA GGGTGACGGT GTCGGGCGGC

 901 AGCTTGTCCG CACCGCACGG CAATGTCATC GAGACCGGCG GCGCGCGTCG CTTTGCGCCT

 961 CAAGCCGCGC CCCTGTCGAT CACCTTGCAG GCCGGCGCGC ATGCCCAGGG GAAAGCGCTG

1021 CTGTACCGGG TCCTGCCGGA GCCCGTGAAG CTGACGCTGA CCGGGGGCGC CGATGCGCAG

1081 GGCGACATCG TCGCGACGGA GCTGCCCTCC ATTCCCGGCA CGTCGATCGG GCCGCTCGAC

1141 GTGGCGCTGG CCAGCCAGGC CCGATGGACG GGCGCTACCC GCGCGGTCGA CTCGCTGTCC

1201 ATCGACAACG CCACCTGGGT CATGACGGAC AACTCGAACG TCGGTGCGCT ACGGCTGGCC

1261 AGCGACGGCA GCGTCGATTT CCAGCAGCCG GCCGAAGCTG GGCGGTTCAA GGTCCTGACG

1321 GTCAATACGC TGGCGGGTTC GGGGCTGTTC CGCATGAATG TCTTCGCGGA CCTGGGGCTG

1381 AGCGACAAGC TGGTCGTCAT GCAGGACGCC AGCGGCCAGC ACAGGCTGTG GGTCCGCAAC

1441 AGCGGCAGCG AGCCGGCCAG CGCCAACACC CTGCTGCTGG TGCAGACGCC ACTAGGCAGC

1501 GCGGCGACCT TTACCCTTGC CAACAAGGAC GGCAAGGTCG ATATCGGTAC CTATCGCTAT

1561 CGATTGGCCG CCAACGGCAA TGGGCAGTGG AGCCTGGTGG GCGCGAAGGC GCCGCCGGCG

1621 CCCAAGCCCG CGCCGCAGCC GGGTCCCCAG CCGCCGCAGC CGCCGCAGCC GCAGCCGGAA

1681 GCGCCGGCGC CGCAACCGCC GGCGGGCAGG GAGTTGTCCG CCGCCGCCAA CGCGGCGGTC

1741 AACACGGGTG GGGTGGGCCT GGCCAGCACG CTCTGGTACG CCGAAAGCAA TGCGTTGTCC

1801 AAGCGCCTGG GCGAGTTGCG CCTGAATCCG GACGCCGGCG GCGCCTGGGG CCGCGGCTTC

1861 GCGCAACGCC AGCAGCTGGA CAACCGCGCC GGGCGGCGCT TCGACCAGAA GGTGGCCGGC

1921 TTCGAGCTGG GCGCCGACCA CGCGGTGGCG GTGGCCGGCG GACGCTGGCA CCTGGGCGGG

1981 CTGGCCGGCT ATACGCGCGG CGACCGCGGC TTCACCGGCG ACGGCGGCGG C

2、一种百日咳疫苗，其特征在于：其中的抗原成分含有权利要求1所述的具有免疫活性的重组蛋白PRN和/或FIM2、FIM3。

3、如权利要求2所述的百日咳疫苗，其特征在于，还含有具有免疫活性的融合蛋白FIM3-FIM3。

4、如权利要求2所述的百日咳疫苗，其特征在于，所述的三种抗原组分的浓度比是：PRN∶FIM2∶FIM3＝(2～10)∶(1～5)∶(1～5)。

5、如权利要求2所述的百日咳疫苗，其特征在于，所述的PRN蛋白和FIM3蛋白的PRN、FIM3基因从百日咳杆菌CS菌株中分离，连接入表达载体PQE30，将重组质粒转入大肠杆菌M15中；然后用IPTG诱导表达后，经亲和层析纯化得到所需的高纯度目的蛋白。

6、如权利要求2所述的百日咳疫苗，其特征在于：所述的FIM2蛋白的基因从百日咳杆菌CS菌株中分离，以PET-30a(+)为表达载体，将重组质粒转入BL21(DE3)中；然后用IPTG诱导表达后，经亲和层析纯化得到所需的高纯度目的蛋白。

7、如权利要求3所述的百日咳疫苗，其特征在于：所述的FIM2-FIM3融合蛋白的基因从百日咳杆菌CS菌株中分离，以PET-30a(+)为表达载体，将重组质粒转入BL21(DE3)中；然后用IPTG诱导表达后，经亲和层析纯化得到所需的高纯度目的蛋白。

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