CN1589901A - 一种口蹄疫双价多肽疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种由基因工程方法产生的双价多肽疫苗及其制备方法和用途。所述疫苗含有2n-1个串连的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列所编码的多肽，其中，n为1－5的整数。本发明的疫苗安全性好，免疫效价高，适于大规模生产，能够有效地防治口蹄疫，并且可用于区分感染动物和免疫动物。

Description

一种口蹄疫双价多肽疫苗及其制备方法和用途
发明领域
本发明涉及一种新型的口蹄疫疫苗，特别是一种由基因工程方法产生的双价多肽疫苗及其制备方法和用途。
背景技术
口蹄疫(FMD)是畜牧业中传染性很强的一种疾病，偶蹄目动物如牛、猪、羊、骆驼等易受感染。迄今为止，世界各国除北美、澳大利亚之外，都曾爆发过口蹄疫的大规模流行，这种疾病的流行曾对德国(1937-38)、欧洲(1951-52)、土耳其(1964-65)、英国(1967-68)、奥地利(1973)、法国(1974)、韩国(2002)等国家造成巨大的经济损失。
口蹄疫的病原是一种细小RNA病毒，即口蹄疫病毒(FMDV)。病毒颗粒中含有一条正链极性的、由8500个核苷酸组成的单链RNA。病毒颗粒的囊膜包括包绕单链RNA的四种结构蛋白VP1(分子量34,000)、VP2(30,000)、VP3(26,000)、VP4(13500)。四种结构蛋白每种60个分子构成一个二十面体病毒粒子。二十面体的顶点由结构蛋白VP1组成。VP1蛋白的抗体能中和病毒、阻止口蹄疫的感染，但其中和病毒的能力低于完整病毒粒子产生的抗体。进一步研究表明结构蛋白VP1的免疫决定簇区域为141-160区域和200-213区域。这二个区域的多肽片段与载体蛋白经化学连接后产生的抗体能中和病毒粒子(Nature，1982， 298 30-33)。
通过呼吸道的感染后，FMDV的初级复制是在咽部，然后感染临近的淋巴结并且进入血流，进而扩散到各种器官和组织中。大多数情况下，动物感染2-14天出现临床症状。较年长的动物感染FMDV后很少出现死亡，但动物的生殖能力、生长和健康受到很大影响。而且，虽然有些动物感染FMDV后，体内出现较高的抗体滴度，但是这些健康动物有可能分泌FMDV并感染其它动物。
FMDV具有显著的抗原多样性，现已发现的FMDV有7种血清型，每一种血清型还可以继续分成多种亚型，详见下表：
             FMDV的血清型
    A     32个亚型     A1-32
    O     11个亚型     O1-11
    SAT1     (1-7)
    SAT2     (1-3)
    SAT3
    Asia1     (1-3)
    C     (1-5)
由于口蹄疫病毒易于传播，具有感染多种动物的能力以及具有多种抗原形式，使得口蹄疫难以控制。
研制疫苗对动物进行免疫是控制FMDV的有效方法之一。传统的灭活FMDV疫苗是通过大量培养动物细胞，然后感染口蹄疫病毒，经过培养、分离病毒，再用化学试剂使病毒失活后制成的。法国Merieux公司是最大的灭活FMDV疫苗生产厂家，巴西、阿根廷、俄罗斯等国家也应用同样技术生产这种疫苗，保护效果很好。但是，制备灭活FMDV疫苗的缺点是需要建立一个严格封闭的环境，以防止泄露并污染周围环境，这种潜在的危险限制了这种疫苗的使用。而且，灭活FMDV疫苗的效价变动较大，特别是疫苗中残存的痕迹活病毒能引起疾病的流行和大规模爆发。此外，疫苗需要在冷藏条件下保存和输送，增加了成本。最后，使用灭活的FMDV疫苗虽然不常发生过敏性休克或昏迷，但一旦发生就足以造成严重后果。
口蹄疫基因工程多肽疫苗经过十多年历程的研究，取得了很好的应用效果，使用大肠杆菌作为寄主细胞发酵培养时间只需20个小时，周期比用动物细胞生产灭活FMDV疫苗短得多，基因工程疫苗对环境没有污染，没有泄漏的危险，非常安全，而且生产出来的疫苗在贮藏、运输和使用过程中不需要冷藏，效价稳定。但是，多肽疫苗的保护效果比全病毒疫苗低，例如，合成VP1蛋白141-160的氨基酸，制备的多肽疫苗的免疫原性低于相应量的灭活FMDV疫苗的100-1000倍。而且，目前的FMDV疫苗，不论是灭活FMDV疫苗或者是多肽疫苗，都不能通过血清学实验分辨被免疫动物和已感染动物，而被免疫动物与已感染动物混淆会给市场进出口造成极大影响。
因此，制备出免疫效价提高而且可用于分辨被免疫动物和已感染动物的基因工程口蹄疫疫苗，是不断追求的目标。
发明概述
本发明人根据O、A二种类型FMDV的VP1免疫决定簇的氨基酸序列，设计寡核苷酸片段，将基因串连后在大肠杆菌中表达，得到具有理想的免疫原性的多肽。而且，将FMDV中VP1免疫决定簇多肽的氨基酸序列反转(从N端至C端)表达后，进行免疫试验，获得很好的效果，产生中和抗体的时间大为延长，多肽在体内的半衰期也得到延长。用本发明的多肽制备成疫苗，可以防治O、A二种类型的口蹄疫，而且可以方便地区别测定免疫动物和感染动物。
本发明的一个目的是提供一种新型的基因工程口蹄疫多肽疫苗。
本发明的又一目的是提供所述口蹄疫疫苗的构建方法。
本发明的又一目的是提供能够表达所述口蹄疫多肽疫苗的基因工程菌株。
本发明的又一目的是提供所述口蹄疫疫苗在防治口蹄疫疾病中的用途。
本发明的再一目的是提供所述口蹄疫疫苗在区分感染动物和被免疫动物中的用途。
本发明一方面提供了一种新型的口蹄疫基因工程多肽疫苗，其含有2n-1个串连的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸序列所编码的多肽，其中，n为1-5的整数。SEQ ID NO.1含有O型和A型口蹄疫病毒VP1蛋白免疫决定簇的编码序列，其可以编码正向表达的A型和O型口蹄疫病毒的抗原决定簇，其表达产物可以刺激产生抗A型和O型口蹄疫的抗体；而SEQ ID NO.2则可以编码反向表达的A型和O型口蹄疫病毒的抗原决定簇，其表达产物也可刺激产生抗A型和O型口蹄疫的抗体。
优选的，本发明的疫苗含有2n-1个串连的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所编码的多肽，其中，n为2-4的整数。
更优选的，本发明的疫苗含有2n-1个串连的SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所编码的多肽，其中，n为3。
最优选的，本发明的疫苗含有4个串连的SEQ ID NO：2所编码的多肽。
在一个优选实施方案中，本发明的疫苗含有菌株CGMCC No.0893中携带的质粒所表达的蛋白。所述质粒含有4个串连的SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
在另一个优选实施方案中，本发明的疫苗含有菌株CGMCC No.0894中携带的质粒所表达的蛋白。所述质粒含有4个串连的SEQ ID NO.2所示的核酸序列。
为了提高生物利用率、增强免疫效果等目的，本发明的疫苗还可以含有药学上可接受的载体、辅料和/或免疫佐剂等物质。
免疫佐剂是一种可以增强免疫反应的物质，其能够与抗原混合使用，不仅有助于注射物质的沉积或汇集，而且能够增强抗体反应。
可以作为免疫佐剂的物质有：①微生物及其产物，常用的微生物如分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖，自分枝杆菌的提取物质胞壁酰二肽等。②多聚核苷酸，如多聚肌苷酸：胞苷酸(poly I:C)，多聚腺苷酸(poly I:A:u)等。③福氏佐剂(Freund’s adjuvant)，包括不完全福氏佐剂(将抗原水溶液与油剂(石蜡油或植物油)等量混合，再加乳化剂(羊毛脂或吐温80)制成的油包水抗原乳剂)和完全福氏佐剂(在不完全佐剂中加入分枝杆菌，如卡介苗)。④无机物，如明矾及氢氧化铝等。
近年来，发现以下物质也可以作为免疫佐剂，包括：①细菌毒素，例如霍乱毒素(CT)和大肠杆菌热不稳定性肠毒素(LT)；②CT和LT的减毒衍生物或变异体；③人内生性免疫调节因子，如IL-2，IL-12，GM-GSF；④激素；⑤脂肽；⑥皂角苷，皂角苷衍生物QS-21；⑦含有CpG motif的合成的寡核苷酸片段(CpG ODN)；⑧类脂A的衍生物，例如脂多糖衍生物单磷酰脂A(MPL)；⑨胞壁酰二肽(MDP)的衍生物。
此外，某些具有内在的免疫刺激活性的递送系统也可以作为免疫佐剂用于疫苗构建，这些递送系统包括但不限于：脂质体，乳剂，螺状体(cochleate)，病毒颗粒，微粒子和免疫刺激复合物(ISCOMs)。
上文所述各种类型的免疫佐剂均可用于本发明。佐剂可以合适的剂量与本发明具有免疫原性的多肽配合使用，形成本发明的疫苗。
优选的，本发明的疫苗含有不完全福氏佐剂或Al(OH)3，更优选的，本发明的疫苗含有不完全福氏佐剂作为免疫增强剂。不完全福氏佐剂中羊毛脂和石蜡油的比率随季节的变化而稍有不同，例如，春、夏、秋季羊毛脂和石蜡油的比率约为3∶7；冬季二者的比率约为1.5∶8.5。
本发明又一方面提供了一种制备所述的基因工程多肽疫苗的方法，包括将2n-1个串连的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸序列克隆入载体并在合适的表达系统中进行表达的步骤，其中n为1-5的整数。
优选的，将2n-1个串连的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸序列进行表达，其中，n为2-4的整数。
更优选的，将4个串连的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸序列进行表达，制备本发明的疫苗。
最优选的，将4个串连的SEQ ID NO.2所示的核酸序列进行表达，制备本发明的疫苗。
本发明SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列，可以直接合成，也可先合成若干个寡核苷酸片段，连接后产生如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列。为了后续操作的方便，在设计寡核苷酸片段时，可以将合适的酶切位点引入序列两端，以便将靶序列克隆入合适的载体。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明人设计合成4个寡核苷酸片段，连接后产生的序列F1(+)含有SEQ ID NO：1所示的核酸序列和合适的限制性内切酶切点。利用基因工程的手段将F1(+)克隆入载体，然后，通过酶切后具有互相匹配的粘末端的限制性内切酶，将F2(+)(含有2个串连的F1(+)序列)克隆入载体，表达后的多肽含有2个正向连接的O型和A型FMDV的免疫决定簇。按照类似的方法，可以依次将F4(+)、F8(+)、F16(+)克隆入载体，它们依次含有4个、8个、16个串连的F1(+)序列，在合适的表达系统中进行表达后，得到的多肽分别含有4个、8个、16个正向连接的O型和A型FMDV的免疫决定簇。
在本发明的又一个优选实施方案中，本发明人设计合成4个寡核苷酸片段，连接后产生的序列F1(-)含有SEQ ID NO：2所示的核酸序列和合适的限制性内切酶切点。利用基因工程的手段将F1(-)克隆入载体，然后，通过酶切后具有互相匹配的粘末端的限制性内切酶，将F2(-)(含有2个串连的F1(-)序列)克隆入载体，表达后的多肽含有2个反向连接的O型和A型FMDV的免疫决定簇。按照类似的方法，可以依次将F4(-)、F8(-)、F16(-)克隆入载体，它们依次含有4个、8个、16个串连的F1(-)序列，在合适的表达系统中进行表达后，得到的多肽分别含有4个、8个、16个反向连接的O型和A型FMDV的免疫决定簇。
在本发明的制备方法中，用于多肽表达的表达系统可以是原核表达系统，还可以是真核表达系统。表达系统包括合适的宿主细胞，以及能够在宿主细胞中复制并稳定存在的质粒或载体。
可以作为宿主细胞的例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌等；真菌细胞：如酵母等。
可以使用的载体可以包括染色体来源的、非染色体来源的、及合成的DNA序列。例如：噬菌体DNA、杆状病毒、细菌质粒、酵母质粒、以及由质粒、噬菌体和病毒DNA组合衍生的载体。
优选的，在原核表达系统中表达本发明的多肽。更优选的，可以将本发明的多肽克隆入高效率的表达载体(例如市售的表达载体)，与载体蛋白进行融合表达。
本发明还涉及一种基因工程菌株，其携带的质粒含有2n-1个串连的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸序列，其中n为1-5的整数。
优选的，所述工程菌携带的质粒含有2n-1个串连的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸序列，其中n为2-4的整数。
更优选的，所述工程菌携带的质粒含有2n-1个串连的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核酸序列，其中n为3。
在本发明的优选实施方案中，含有4个串连的SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示核酸序列的基因工程菌株按照《用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约》的规定，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。保藏日期为2003年2月25日，保藏号分别为CGMCC No.0893和CGMCC No.0894。
保藏物CGMCC No.0893是由质粒pEZZ18/F4(+)转入大肠杆菌HB101后制备的。pEZZ18/F4(+)是用EcoRI和HindIII酶切pUC18/F4(+)后，回收F4(+)片段，再克隆入经同样酶切处理的pEZZ18载体(GenBankAccess ion No.M74186)制得的。pEZZ18/F4(+)中含有4个正向串连的编码A型和O型FMDV抗原决定簇的核酸序列，即4个串连的SEQ IDNO.I，其表达产物含有4个正向串连的A型和O型FMDV抗原决定簇。
保藏物CGMCC No.0894是由质粒pEZZ18/F4(-)转入大肠杆菌HB101后制备的。pEZZ18/F4(-)是用EcoRI和HindIII酶切pUC18/F4(-)后，回收F4(-)片段，再克隆入经同样酶切的pEZZ18载体制得的。pEZZ18/F4(-)中含有4个反向串连的编码A型和O型FMDV抗原决定簇的核酸序列，即4个串连的SEQ ID NO.II，其表达产物含有4个反向串连的A型和O型FMDV抗原决定簇。
保藏物是为了充分公开本发明，为本领域的技术人员提供方便。任何制造、使用或者销售保藏物的行为需要经过发明人的许可，在此并未给予这样的许可。
本发明还提供了所述基因工程多肽疫苗在预防和治疗口蹄疫中的用途。可以将本发明的疫苗注射给动物，刺激动物体内产生特异性的抗O型和A型口蹄疫的抗体，从而达到预防和治疗的目的。
本发明提供了所述基因工程多肽疫苗在区分感染动物和被免疫动物中的用途。由于自然感染口蹄疫的动物通常只产生单一抗体(一种血清型)，而本发明的疫苗注射给动物，刺激动物体内产生特异性的抗O型和A型口蹄疫的抗体，故本发明的疫苗可以用于区分免疫接种动物和感染动物。
使用本发明的疫苗具有以下优点：①安全性好，本发明的疫苗是基因工程产品，不是灭活疫苗，不存在因痕量活病毒泄露而引起疾病爆发的危险。在动物实验中，以较高剂量的疫苗对小鼠和豚鼠进行皮下注射，在较长的观测期内，实验动物健康存活，而且体内产生了特异性抗体。②本发明的疫苗适于用基因工程的方法大规模生产，降低了成本。③利用本发明的疫苗易于区分感染动物和免疫动物。在自然界中，感染A型口蹄疫的动物，其体内会产生A型口蹄疫抗体，而感染O型口蹄疫的动物则产生O型口蹄疫的抗体。本发明的疫苗既有A型抗原又有O型抗原的免疫决定簇，免疫注射后，动物体内产生抗体既有A型又有O型，可以藉此区分感染动物和免疫动物，避免给动物进出口造成混乱。④本发明的疫苗含有A型和O型FMDV中VP1免疫决定簇串连后反转(从N端至C端)表达的多肽，其在免疫试验中获得良好的效果，多肽在体内的半衰期延长，其产生中和抗体的时间也大为延长。
为了更清楚地理解本发明，现参照以下附图和实施例对本发明进行解释，但附图和实施例对本发明没有任何限制意义。
附图的简要说明
图1是合成的4个寡核苷酸片段P1+P2与P3+P4连接后产生的片段F1(+)，能够编码产生正向连接的O型和A型口蹄疫病毒的免疫决定簇。
图2是合成的4个寡核苷酸片段P1’+P2’与P3’+P4’连接后产生的片段F1(-)，能够编码产生反向连接的O型和A型口蹄疫病毒的免疫决定簇。
图3质粒pUC8/F1的构建过程示意图。
图4是由质粒pUC8/F1构建质粒pUC8/F8的示意图。
图5是将质粒pUC8/F4中的基因串联片段克隆到表达载体pGEX-6P-3中的构建示意图。
图6是pGEX-6P-3/F4(-)转入大肠杆菌后，融合蛋白的SDS-PAGE图谱。其中，1为pGEX-6p-3载体蛋白(对照)，2-6为pGEX-6p-3/F4(-)的融合表达产物，即pGEX-6p-3携带的载体蛋白与F4(-)进行融合表达的产物，7为分子量标准。
图7是含pGEX-6P-3/F4(-)的工程菌在发酵过程中的生长图谱。
图8是双价多肽疫苗(O型)的检测结果。
1为“+”试剂(阳性对照)，8为“-”试剂(阴性对照)；
2-5为用TE缓冲液对pGEX-6P-3/F4(-)表达产物作倍比稀释的样品，依次分别为×1，×2，×4，×8倍稀释；
9-12为用TE缓冲液对胍处理的上清液作倍比稀释的样品，依次为×1，×2，×4，×8稀释；
6-7，13-14为检测试剂所提供的稀释液，对pGEX-6P-3/F4(-)表达产物作倍比稀释的样品，依次为×1，×2，×4，×8稀释。
图9是双向免疫扩散反应(抗原抗体反应)的测定结果。
图9A中：
抗原为1和2，其中，1为pGEX-6P-3/F4(-)表达产物纯化后得到的多肽，2为pGEX-6P-3/F4(+)表达产物纯化后得到的多肽；
抗体为A，是购自兰州兽医所提供的A型FMD琼扩阳性血清，×1为原液，×5为5倍稀释液；
Figure A0315075100151
为空白对照。
图9B中：
抗原为兰州兽医所的A型FMD琼扩抗原，×1为原液，×5为5倍稀释液；
抗体为A和F，其中，A为pGEX-6P-3/F4(-)表达产物纯化后的多肽免疫豚鼠得到的血清，F为pGEX-6P-3/F4(+)表达产物纯化后的多肽免疫豚鼠得到的血清。
图9C中：
抗原为1和2，其中，1为为pGEX-6P-3/F4(-)表达产物纯化后得到的多肽，2为pGEX-6P-3/F4(+)表达纯化后得到的多肽；
抗体为A和D，其中，A为pGEX-6P-3/F4(-)表达产物纯化后的多肽免疫豚鼠得到的血清，D为pGEX-6P-3/F4(+)表达产物纯化后的多肽免疫豚鼠得到的血清；
为O型水疱病抗原“+”(兰州兽医所提供)，
Figure A0315075100162
为空白对照。
图10是用免疫电泳技术的检测结果。
图10A中：
抗体B为pGEX-6P-3/F4(-)表达产物纯化后的蛋白免疫豚鼠后制得的抗血清，抗原为兰州兽医所提供的O型“+”试剂。
图10B中：
抗体A为FMDV琼扩阳性血清(兰州兽医所提供)，抗原为pGEX-6P-3/F4(+)表达产物纯化后得到的多肽。
图10C中：
抗体A为A型FMD琼扩阳性血清(兰州兽医所)；抗原为pGEX-6P-3/F4(-)表达产物纯化后得到的多肽。
图10D中：
抗体E为pGEX-6P-3/F4(+)表达产物纯化后的多肽免疫豚鼠得到的血清，抗原为兰州兽医所提供的O型“+”试剂。
具体实施方式
实施例1、
编码正向排列的O型和A型抗原决定簇的质粒pUC8/F1(+)的构建
根据O型和A型口蹄疫病毒VP1蛋白的141-160位氨基酸序列，合成四个寡核苷酸片段，经连接后克隆入载体，形成含有正向排列的O型和A型抗原决定簇的重组质粒pUC8/F1(+)。
1.寡核苷酸片段的制备
根据O型和A型口蹄疫病毒VP1蛋白的141-160位氨基酸序列，设计以下寡核苷酸片段，由赛百盛公司合成。
P1：5′-AAT TCC ATG AGA TCT GGT TCT GGT GTT CGT CGT
GAT TTC GGT TCT CTG GCG CCG CGT GTT GCG CGT CAG CTG A-3′
P2：5′-T GTT GGT CAG CTG ACG CGC AAC ACG CGG CGC
CAG AGA ACC GAA ATC ACG ACG AAC ACC AGA ACC AGA TCT CAT GG-3′
P3：5′-CC AAC AAC GTT CGT GGT GAT CTG CAG GTT CTG
GCG CAG AAA GCG GAA CGT ACC CTG CCG GGA TCC TAG A-3′
P4：5′-AG CTT CTA GGA TCC CGG CAG GGT ACG TTC CGC
TTT CTG CGC CAG AAC CTG CAG ATC ACC ACG AAC GT-3′
将浓度为A260nm＝20D的4个寡核苷酸片段分别溶于40μl无菌去离子水。溶解后的P1和P2各取2.5μl，置于1支0.5ml的离心内；P3和P4各取2.5μl，置于另1支0.5ml的离心管内。分别向2支离心管中加入1μl的T4多核苷酸激酶(Promega公司)，1μl的10×T4多核苷酸激酶缓冲液，1μl浓度为0.1mol/L的ATP(BoehringerMannheim公司)，2μl去离子水。37℃保温1小时后，置于92℃水浴退火，然后自然冷却至室温。
向含有退火的核苷酸片段混合物P1和P2、P3和P4的离心管内加入2μl的T4 DNA连接酶(Promega公司)，2.5μl的T4 DNA连接酶缓冲液，0.5μl去离子水。16℃保温1-2小时，4-8℃保温12-16小时。经15％PAGE电泳分离，以фx174/HaeIII酶切分子量标准(Promega公司)为对照，割取118-194bp之间的凝胶，浸泡，用酚、氯仿抽提，无水乙醇沉淀，再用70％乙醇洗涤、干燥后备用。
连接后产生的序列如图1所示，用F1(+)表示，其含有1个正向排列的O型FMDV和A型FMDV的抗原决定簇。
2.克隆
重组质粒pUC8/F1(+)的构建过程如图3所示。操作步骤如下：
取pUC8载体1μl(1ug/μl)，用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，透析回收其中的大片段。用酚、氯仿抽提，回收液相，用无水乙醇沉淀，再用70％乙醇洗涤，干燥备用。
将F1(+)基因片段与酶切后的载体片段进行连接。分别用4μl无菌去离子水完全溶解目的基因片段与载体片段，将溶解后的DNA片段混合，加入T4 DNA连接酶1μl，T4 DNA连接酶缓冲液1μl。16℃保温1-2小时，然后在4-8℃保温12-16小时。
挑取保存于甘油管中的大肠杆菌JM103菌株，在LB培养皿上划线，37℃培养过夜。第二天挑取单菌落接种于100ml LB液体培养基，待细菌生长至A600nm＝0.6时，终止培养，于4℃，6000rpm离心4分钟。收集菌体，用20ml预冷的0.1mol/L的氯化钙溶液重新悬浮菌体。冰上放置30分钟。4℃，6000rpm离心4分钟。然后用2ml预冷的0.1mol/L氯化钙溶液重新悬浮菌体，分装至无菌小管，每管100μl，加入加甘油使最终浓度为15％后于-84℃保存备用。
将连接产物加入到感受态细胞，混匀，冰上放置30分钟，42℃放置2分钟，再置于冰上冷却2分钟。加入120μl新鲜的LB培养基，37℃振荡1小时。将转化液涂布于LB培养皿(含100ug/ml氨苄青霉素)，37℃培养过夜。第二天，挑取平皿上的单菌落，置于2ml LB培养液(含100ug/ml氨苄青霉素)。按照分子克隆描述的方法抽提质粒，得到pUC8/F1(+)。
3.酶切鉴定
取6μl DNA抽提物加2μl Mμlti-core 10x缓冲液0.5μl限制性内切酶EcoRI和0.5μl限制性内切酶HindIII，0.2μl BSA，10.8μl无菌去离子水，37℃保温酶切1小时后，用15％PAGE电泳检测。以фX174/Hae III为分子量标准检测。结果检测到约141bp的DNA片段。
以BglII、BamHI、EcoRI、HindIII限制性内切酶作单酶切，可见其均为单一切点。
4、DNA序列分析
用PE公司377型核苷酸序列分析仪，采用四色萤光法进行核苷酸序列测定。测序结果与预期相符。
实施例2、
编码反向排列的O型和A型抗原决定簇的质粒pUC8/F1(-)的构建
根据O型和A型口蹄疫病毒VP1蛋白的141-160位氨基酸序列，合成四个寡核苷酸片段，经连接后克隆入载体，形成含有反向排列的O型和A型抗原决定簇的重组质粒pUC8/F1(-)。
根据O型和A型口蹄疫病毒VP1蛋白的141-160位氨基酸序列，设计以下寡核苷酸片段，由北京赛百盛公司合成。
P1’：5′-AAT TCC AGA TCT CCG CTG ACC CGT GAA GCG AAA CAG GC G
CTG GTT CAG CTG GAT GGT CGT GTT AAC AAC A-3′
P2’：5′-G CAG GGT GTT GTT AAC ACG ACC ATC CAG CTG AAC CAG CGC
CTG TTT CGC TTC ACG GGT CAG CGG AGA TCT GG-3′
P3’：5′-CC CTG CAG CGT GCG GTT CGT CCG GCG CTG TCT GGT TTC
GAT CGT CGT GTT GGT TCT GGT GGA TCC TAG A-3′
P4’：5′-AG CTT CTA GGA TCC ACC AGA ACC AAC ACG ACG ATC GAA ACC
AGA CAG CGC CGG ACG AAC CGC ACG CT-3′
将4个合成的寡核苷酸片段5’磷酸化后，进行连接，产生的序列如图2所示，用F1(-)表示，其含有1个反向排列的O型FMDV和A型FMDV的抗原决定簇。
参照实施例1的操作，将连接后的核酸片段克隆入pUC8载体，构建pUC8/F1(-)重组质粒。构建过程如图3所示。
实施例3、基因的串联及克隆
如图4所示，以限制性内切酶BamHI和HindIII对pUC8/F1(+)或pUC8/F1(-)(以下简称pUC8/F1)进行双酶切，回收大片段；再以限制性内切酶BglII和HindIII对基因单体pUC8/F1作双酶切，回收小片段。
由于BglII的酶切位点切口为A↓GATC↑T，经BglII酶切后得到一个粘性末端A或GATCT；而BamHI的酶切位点为G↓GATC↑C，经用BamHI酶切后得到粘性末端G或GATCC。两个酶酶切后，产生的切口恰好互补配对。
用T4连接酶将回收的两个片段进行连接。连接产物转化JM103感受态细胞，并鉴定所得转化子的质粒DNA，可得到2个单体串联的连接物pUC8/F2，其含有2个正向或反向排列的O型FMDV和A型FMDV的抗原决定簇。
重复上述步骤，可以制备成pUC8/F4、pUC8/F8和pUC8/F16，其分别含有4个、8个和16个正向或反向排列的O型FMDV和A型FMDV的抗原决定簇。
实施例4、F4在表达载体pGEX-6P-3中的克隆和表达
选用pharmacia biotech公司的pGEX-6P-3作为表达载体。pGEX-6P-3含有可诱导的tac启动子，用于在E.coli中表达的lacIq基因，以及用于裂解融合蛋白(GST和目的蛋白的融合表达产物)的PreScission酶的识别位点。
如图5所示，将pUC8/F4(±)克隆入pGEX-6P-3，构建成pGEX-6P-3/F4(+)和pGEX-6P-3/F4(-)重组质粒(以下用pGEX-6p-3/F4表示)。其中，M为人工合成的接头，具有以下序列和多克隆位点：
EcoRI         BglII                            BamHI                     SmaI  SalI
↓             ↓                               ↓                        ↓    ↓
Figure A0315075100211
                                              SalI
将重组质粒pGEX-6p-3/F4转入大肠杆菌BL21，在37℃培养，以终浓度为0.2mmol/L-0.5mmol/L的IPTG进行诱导。
按照《分子克隆》实验手册(第二版)(金冬雁、黎孟枫译，科学出版社出版)描述的方法，进行融合蛋白的SDS-PAGE电泳，配制12％的分离胶(H2O 3.3ml，30％的丙烯酰胺4.0ml，1.5mol/L的Tris(pH8.8)2.5ml，10％的SDS 0.1ml，10％的过硫酸铵0.1ml，TEMED0.004ml，总体积10ml)以及相应的浓缩胶(H2O 2.7ml，30％的丙烯酰胺0.67ml，1.0mol/L的Tris(pH6.8)0.5ml，10％的SDS 0.004ml，10％的过硫酸铵0.004ml，TEMED 0.004ml，总体积4ml)。上样量约50μg，电流10-15mA，电压100V，电泳1-1.5个小时，染色，观察结果。
图6为pGEX-6p-3/F4(-)转入大肠杆菌后，融合蛋白的表达情况。1为pGEX-6p-3对照，2-6为pGEX-6p-3/F4(-)的融合表达产物，即pGEX-6p-3携带的载体蛋白与F4(-)进行融合表达的产物，7为分子量标准。
由图可见，pGEX-6p-3载体蛋白的分子量约为26Kd，而目的蛋白与载体蛋白融合后(pGEX-6p-3/F4(-))，融合蛋白的分子量约为43Kd。
实施例5、发酵
250ml种子培养液(1000ml种子培养液含有蛋白胨10g，酵母抽提粉5g，0.02mol/L的磷酸缓冲液20ml，pH7.0)置于1000ml三角瓶中，120℃灭菌20分钟，冷却后加入20％的葡萄糖溶液5ml。将1ml低温保存于甘油中的菌株加入上述溶液，再加氨苄青霉素至终浓度为50μg/ml，37℃，200rpm培养12-14小时作为扩大培养的种子菌。
1000ml种子培养液含有蛋白胨20g，酵母抽提粉10g，0.2mol/L的磷酸缓冲液20ml，pH7.0，以及微量元素CaCl2、NiNO3、CoCl3、MgSO4、FeCl3各1mg，120℃灭菌20分钟，冷却至37℃后，加氨苄青霉素至终浓度为50mg。加入种子培养菌20ml，再加20％的葡萄糖溶液5ml，维持表中所列条件进行发酵。
    发酵罐     35L
    温度     37℃
    搅拌速度     700rpm
    通气量     35L/min
    pH     7-7.5
间隔一定时间各取1ml发酵液置于2个塑料离心管中，8000rpm离心10分钟，除去上清液，称取菌体重量为湿重(g/L)。
如图7所示，在发酵12-15小时之后，细菌浓度达到峰值。
发酵后，4000rpm离心(BeckmanJ6-HC离心机)30分钟收集菌体。
菌体以1000克/3升的比例悬浮于含1％的氯化钠、1mmol/L EDTA、20mmol/L的磷酸钾pH7.0的溶液中。在悬浮液中加入1克溶菌酶，室温搅拌1小时，以破碎细胞。菌体悬浮液于10,000rpm离心30分钟，弃上清。
将上述沉淀以250克/升的比例加入6mol/L的盐酸胍溶液。搅拌、抽提过夜。20,000rpm离心30分钟，取上清，装透析袋以水透析。
经对水透析有沉淀产生。以10,000rpm离心30分钟，取沉淀，用无菌水制成匀浆，备用。
实施例5、口蹄疫双价多肽疫苗(O型)的检测
1.试剂
O型猪水泡病冻干正向血凝诊断液，购自中国农科院兰州兽医研究所。诊断液包括：①血球制剂，②阳性试剂“+”，③阴性试剂“-”。
2.样品
含pGEX-6P-3/F4(-)的菌株经发酵后，离心收集菌体，破碎细胞，用6M盐酸胍抽提，离心后分别收集沉淀和上清液，依次作×1，×2，×4，×8稀释。
3.方法
将血球试剂摇匀，加入96孔板(丹麦NUNC公司)，每孔50ul。
按照预先的设计，在上述含血球制剂的孔中，分别加入3ul O型口蹄疫“+”液作为阳性对照(样品1)，3ul O型口蹄疫“-”液作为阴性对照(样品8)。并依次加入10ul用TE缓冲液作×1，×2，×4，×8倍稀释的待测样品，即发酵、破碎细胞、用6M盐酸胍抽提、离心后收集到的融合蛋白和上清液。
结果：如图8所示，各种稀释倍数的融合蛋白与O型血球制剂均发生抗原抗体反应，而上清液中不含有融合蛋白，故对O型血球制剂不发生反应。
实施例6、FMDV疫苗的抗原-抗体反应
利用蛋白质在半固体基质(如凝胶)上扩散时，抗原和抗体可以在浓度比合适的部位产生沉淀带或沉淀环的原理，采用双向免疫扩散法进行本发明疫苗免疫原性的测定。
1.抗原：
标准品：①O型猪水泡病冻干正向血凝诊断液，②A型FMD琼扩精制抗原，购自中国农科院兰州兽医所。
测试品：本发明的pGEX-6P-3/F4(-)和pGEX-6P-3/F4(+)表达纯化后得到的蛋白。
2.抗体：
标准品：①O型猪水泡病冻干正向血凝诊断剂，②A型FMD琼扩阳性血清，均由中国农科院兰州兽医所提供。
测试品：由本发明的pGEX-6P-3/F4(-)和pGEX-6P-3/F4(+)表达纯化得到的蛋白1mg，与1ml福氏佐剂形成油包水乳剂，皮下注射给豚鼠，3周后采血制取的血清。
3.双向免疫扩散实验
用20mmol/L pH7.1的磷酸钠缓冲液和琼脂糖配制成浓度为1.0％的凝胶，加热融化后，铺于干净的载玻片上(约3ml/块)。冷却后，用打孔器打上小孔后，再以少许热的琼脂溶液补上载玻片与孔之间的缝隙。将不同稀释(或不稀释)抗原、抗体分别加入小孔中，每孔约20μl。自然扩散24小时，观察其结果。
结果：本实验中，观察到的抗原、抗体扩散相遇时所发生的沉淀带如图9所示。
在图9A中，以本发明的pGEX-6P-3/F4(-)和pGEX-6P-3/F4(+)表达产物纯化后的蛋白为抗原，A型FMDV抗血清(标准品)为抗体，观察到正向表达和反向表达的F4蛋白与A型FMDV抗体均发生免疫沉淀反应。
在图9B中，以A型FMD琼扩抗原(标准品)为抗原，本发明的pGEX-6P-3/F4(-)和pGEX-6P-3/F4(+)表达产物纯化后，免疫豚鼠后制取的血清为抗体，观察到抗原和抗体之间发生免疫沉淀反应。
在图9C中，以O型猪水泡病冻干正向血凝诊断液抗原为O型抗原的阳性对照，未添加试剂的孔为空白对照，以本发明的pGEX-6P-3/F4(-)和pGEX-6P-3/F4(+)表达产物纯化后的蛋白为待检测抗原，并以本发明的pGEX-6P-3/F4(-)和pGEX-6P-3/F4(+)表达产物纯化后，免疫豚鼠后制取的血清为抗体，待测抗原与抗体之间发生免疫沉淀反应。
以上结果表明本发明的FMDV疫苗与O型和A型抗体均呈免疫交叉反应。
实施例7、区分感染动物与免疫动物
本发明制备的基因工程多肽疫苗同时具有A型FMDV和O型FMDV的抗原决定簇，免疫注射后所产生抗体既抗A型又抗O型口蹄疫。因此，可用于区分感染动物和免疫动物。
在对流免疫电泳技术实验中，用0.05mol/L(pH8.6)巴比妥钠-盐酸缓冲液配制1.5％琼脂糖溶液，加热融化后铺于载玻片上，冷却后打孔，用热琼脂糖溶液补孔。在中间孔加入抗体，双侧孔内加抗原。将载玻片置于电泳槽内，注明+、-极，以10mA电流电泳1小时。
终止电泳后，以0.9％氯化钠溶液浸泡数小时后，直接观察沉淀带，或者以氨基黑染色后观察沉淀带。
实验结果如图10所示，该结果表明本发明的FMDV疫苗可以诱导O型和A型两种抗体，而自然感染口蹄疫的动物通常只产生单一抗体(一种血清型)，故本发明的疫苗可以用于区分免疫接种动物和感染动物。
实施例8、疫苗的安全性实验
1.豚鼠实验
雄性豚鼠6只，每只体重约200g，由中国科学院上海动物中心提供。
取1mg纯化的抗原蛋白用1ml无菌水悬浮，并加入0.1％的SDS促进蛋白溶解，边研磨边滴加到1ml油包水的福氏不完全佐剂中(羊毛脂∶石蜡油＝3∶7)，制备成疫苗，经皮下注射入豚鼠皮下。在1个月内对豚鼠进行持续观察，并采集血清进行检测。
注射疫苗后豚鼠没有发生昏迷。而且，在1个月的观测期内，6只豚鼠全部存活，血液中检测到既抗O型又抗A型口蹄疫病毒的抗体。
2.小鼠实验
雄性昆明种小鼠3只，每只体重约20g，由中国科学院上海动物中心提供。
取1mg纯化的抗原蛋白用1ml无菌水悬浮，并加入0.1％的SDS促进蛋白充分溶解。取100μl溶液，对小鼠进行皮下注射。在1周内对小鼠进行观察，并采集血清进行检测。
在1周的观测期内，3只小鼠全部存活。
                            序列表
<110>上海华谊生物技术有限公司
<120>一种口蹄疫双价多肽疫苗及其制备方法和用途
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据O型和A型FMDV免疫决定簇设计的、正向表达的多肽
<400>1
ggttctggtg ttcgtcgtga tttcggttct ctggcgccgc gtgttgcgcg tcagctgacc    60
aacaacgttc gtggtgatct gcaggttctg gcgcagaaag cggaacgtac cctgccg       117
<210>2
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<222>DNA
<223>根据O型和A型FMDV免疫决定簇设计的、反向表达的多肽
<400>2
ccgctgaccc gtgaagcgaa acaggcgctg gttcagctgg atggtcgtgt taacaacacc    60
ctgcagcgtg cggttcgtcc ggcgctgtct ggtttcgatc gtcgtgttgg ttctggt       117

Claims (22)

1、一种口蹄疫双价多肽疫苗，其含有2n-1个串连的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列所编码的多肽，其中n为1-5的整数。
2、根据权利要求1所述的双价多肽疫苗，其含有2n-1个串连的SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列所编码的多肽，其中n为2-4的整数。
3、根据权利要求2所述的双价多肽疫苗，其含有：2n-1个串连的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列所编码的多肽，其中n为3。
4、根据权利要求3所述的双价多肽疫苗，其含有4个串连的SEQ IDNO：1所示的核酸序列所编码的蛋白。
5、根据权利要求3所述的双价多肽疫苗，其含有4个串连的SEQ IDNO：2所示的核酸序列所编码的蛋白。
6、根据权利要求4所述的双价多肽疫苗，其含有菌株CGMCC No.0893中携带的质粒所表达的蛋白。
7、根据权利要求5所述的双价多肽疫苗，其含有菌株CGMCC No.0894中携带的质粒所表达的蛋白。
8、根据权利要求1-7任一项所述的双价多肽疫苗，其中所述的疫苗还包括药学上可接受的载体、辅料和/或免疫佐剂。
9、根据权利要求8所述的双价多肽疫苗，其中所述的免疫佐剂是福氏不完全佐剂。
10、根据权利要求8所述的双价多肽疫苗，其中所述的免疫佐剂是Al(OH)3。
11、一种权利要求1所述的双价多肽疫苗的制备方法，包括将2n-1个串连的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列克隆入载体并在表达系统中进行表达的步骤，其中n为1-5的整数。
12、根据权利要求11所述的制备方法，其包括将2n-1个串连的SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列克隆入载体并进行表达的步骤，其中n为2-4的整数。
13、根据权利要求12所述的制备方法，其其包括将2n-1个串连的SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列克隆入载体并进行表达的步骤，其中n为3。
14、根据权利要求11-13任一项所述的方法，其中所述核酸序列在原核表达系统中进行表达。
15、根据权利要求11-13任一项所述的方法，其中所述核酸序列在真核表达系统中进行表达。
16、一种基因工程菌株，其携带的质粒含有2n-1个串连的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列，其中n为1-5的整数。
17、根据权利要求16所述的菌株，其携带的质粒含有2n-1个串连的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列，其中n为2-4的整数。
18、根据权利要求17所述的菌株，其携带的质粒含有2n-1个串连的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸序列，其中n为3。
19、根据权利要求18所述的菌株，其为保藏号为CGMCC No.0893的基因工程菌。
20、根据权利要求18所述的菌株，其为保藏号为CGMCC No.0894的基因工程菌。
21、权利要求1所述的疫苗在预防和治疗A型和O型口蹄疫中的用途。
22、权利要求1所述的疫苗在区分感染动物和被免疫动物中的用途。
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Denomination of invention: The invention relates to a foot-and-mouth disease bivalent polypeptide vaccine and a preparation method and application thereof

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