CN1252730A - 莱姆氏结合组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开和要求权利保护的是含布氏疏螺旋体抗原的组合物以及制备和使用该组合物的方法。抗原可以是OspA。此组合物可包含至少一种额外的来自除布氏疏螺旋体以外的病原体的抗原。此组合物可用于在对莱姆氏疏螺旋体病和除布氏疏螺旋体以外的哺乳动物病原体易感的宿主哺乳动物体内诱发免疫反应。适当的宿主哺乳动物包括狗、小狗、马,并且额外的抗原可以是犬、马或猫病原体,例如狂犬病毒、犬瘟热、腺病毒、冠形病毒、副流感病毒及细小病毒。未观察到明显的效能干扰。

Description

莱姆氏结合组合物及其用途
相关申请
参照了美国专利5,582,990，5,523,089及申请系列PCT/US95/07665、PCT/US92/08972、WO93/08306、PCT/US95/07665、WO93/08299、PCT/US92/08697、PCT/US95/07709、WO95/3519及WO90/04411，其中每一个在此引用作为参考。在此申请中或在权利要求前冠以“参考文献”的目录中引用了几篇文献，引用了其全部；并且每篇文献在此引用作为参考。
发明领域
本发明涉及莱姆(Lyme)氏疏螺旋体病(布氏疏螺旋体抗原)组合物，尤其是结合组合物及制备和应用该组合物的方法，特别是用于兽医。除了一种或多种布氏疏螺旋体抗原外，此组合物可包括一种额外的病原体抗原如犬、猫或马病原体，例如来自下列至少之一的抗原：狂犬病毒、犬瘟热病毒、腺病毒、冠形病毒、副流感病毒、细小病毒、FeLV、猫疱疹病毒、马流感病毒、马疱疹病毒等。当此组合物施用于宿主时，它们优先诱导针对莱姆氏疏螺旋体病(布氏疏螺旋体)感染及组合物中其它抗原的免疫反应。组合物在包括马和狗的动物内诱发针对莱姆氏疏螺旋体病布氏疏螺旋体的长期免疫反应(应答)并对动物提供保护或诱发免疫反应。结合组合物中无效能干扰。
本发明进一步涉及制备和应用这样的组合物的方法。
本发明另外涉及由此组合物诱发的，从动物或细胞培养物中分离到的用于制备诊断试剂盒的抗体，用于检测布氏疏螺旋体抗原或莱姆氏疏螺旋体病或另一种病原体抗原或另一种抗原的实验。
发明背景
莱姆氏疏螺旋体病是由Ixodes ricinus复合体的蜱传播的多系统疾病。螺旋体布氏疏螺旋体sensu lato是莱姆氏疏螺旋体病的病原体，该病是美国最常见的节肢动物传播的疾病并在中欧流行(Barbour等，1993)。尽管在早期可通过抗生素疗法治疗，若任其发展，则出现心脏、神经和关节异常。现在正进行莱姆氏疏螺旋体病人疫苗的研究。布氏疏螺旋体的外表面脂蛋白OspA是目前发展疫苗最重要的候选分子。已知重组OspA脂蛋白(rOspA)可在小鼠内针对布氏疏螺旋体攻击诱发保护性免疫反应(Fikrig等，1990；Erdile等，1993；USSN08/373,455)。在美国OspA目前作为皮下施用的疫苗正进行人体实验(Keller等，1994)。
上文引用的申请WO93/08299和PCT/US92/08697涉及重组OspA(rOspA)疫苗，尤其是脂化的rOspA以及表达编码OspA的DNA并分离脂化rOspA的方法。上文引用的美国专利5,582,990和5,523,089及申请WO90/04411涉及编码OspA的DNA、包括rOspA及其脂化形式OspA的氨基酸序列、包括rOspA及其脂化形式的合成OspA、含OspA或合成OspA的组合物及使用该组合物的方法。并且，其它上文引用的申请涉及编码其它疏螺旋氏体或其它OspA的DNA、编码有用的OspA或其它Osp片段的DNA、其氨基酸序列、包含这样片段或其它Osp的组合物以及使用这些组合物的方法。来自此处引用的涉及布氏疏螺旋体文件的DNA可用美国专利5,582,990和5,523,089或PCT/US92/08697的方法制备用于本发明的OspA，其它疏螺旋氏体抗原或Osp或其片段。用于本发明的DNA和抗原也参照分子微生物学(1989)；3(4)，479-486。
本领域的具体问题涉及由于蜱叮咬引起的家畜的布氏疏螺旋体感染。例如，狗和马很容易受蜱叮蛟引起莱姆氏疏螺旋体病，其主人在太晚的时候才意识到感染(由于皮毛，蜱叮咬伤口周围说明问题的圆环不被察觉、狗和马不能抱怨由感染引起的关节疼痛等，或主人注意不到动物的症状。另外，担忧它可能传播给人。
本领域进一步的问题涉及接种策略。更具体地，当接种家畜时，优选地在一个“鸡尾酒”或多价组合物中施用多种抗原，例如减少注射和看兽医的次数。
目前没有或未听说过莱姆氏疏螺旋体结合或“鸡尾酒”或多价疫苗或免疫性或免疫原性组合物(在一种组合物中结合布氏疏螺旋体抗原和其它抗原，具体地对于犬的)。
本领域的进一步的问题，尤其是关于多价组合物涉及“效能干扰”，即结合组合物中的一种或多种抗原不能维持或获得效能。据认为由于其它抗原的存在，导致了当施用时，干扰了抗原在宿主如狗体内的刺激免疫的、抗原的、抗体或保护反应。例如，与其它抗原结合的狂犬病毒抗原受到了或干扰了此组合物中其它抗原免疫的、抗原的、抗体或保护反应，尤其是当组合物施用于狗时。更具体地，诸如狂犬病毒抗原和钩端螺旋体抗原与其它一种或多种抗原共同施用时将干扰由这些抗原诱发的反应。钩端螺旋体确实能干扰OspA。然而，对于其它宿主，如猫，有已知的结合疫苗。也许，不希望被任何理论约束，“效能干扰”产生的原因是犬生物系统的独特性或由目前已知的抗原或由其结合引起的猫生物系统反应。
不管这些理论，据本发明人所知，以前没有已知的含其它抗原组合物的，尤其是用于犬且不表现出效能干扰的莱姆氏疏螺旋体病结合。需要尤其是犬用的莱姆氏疏螺旋体病结合。如果制备在犬中无效能干扰的莱姆氏疏螺旋体病结合(与其它抗原)，确实令人惊奇，意想不到且不明显，尤其因为如目前知识和效能干扰所显示的，不可能简单地合并“抗原组合物”来制备有用的结合或“鸡尾酒”组合物。
另外，如果这样的莱姆氏疏螺旋体病抗原鸡尾酒组合物给犬提供长期保护；以及通过母源性免疫给小狗提供对莱姆氏疏螺旋体病保护，将是有益的。如熟练技术人员所知的，母源性免疫是新生一出生从母体获得或通过护理获得的免疫，这种免疫经过一段时间后从新生几体内消逝，从而使新生儿易感。而且，新生儿体内存在母源性抗体使新生儿接受抗原组合物如，疫苗时不获得保护反应，这意味着在考虑施用抗原或疫苗组合物前，新生儿必需进入一段无免疫或免疫很少的时期，即对危险的易感性。至于母源性免疫，参照1994年8月16日授予的美国专利5,338,683，在此引用作为参考。
因此，选择性接种策略是可取的。
如果用于在犬中无效能干扰的结合“鸡尾酒”组合物的、可用于其它宿主如猫、马等的组合物并且在狗中及尽管母源性免疫在小狗中也能提供长期保护的布氏疏螺旋体抗原是重组抗原，将更有利、更令人惊奇、更意想不到。
具体地，据认在本领域以前没有教过或建议过给对莱姆氏疏螺旋体病易感的哺乳动物细胞-尤其是家畜如狗、猫或马施用含布氏疏螺旋体抗原如尤其如在此公开的OspA结合组合物。发明目的和概述
通过抗体产生速度和对布氏疏螺旋体感染的保护评估，表明用单价莱姆氏疏螺旋体病(布氏疏螺旋体)疫苗(命名为Ly)接种狗是安全有效的。
研究表明，含有10μg/ml OspA的莱姆氏疫苗(根据WO93/08299及美国专利5,582,990和5,523,089制备的，在此引用作为参考)给狗提供了针对蜱攻击的明显保护，这是通过螺旋体增殖减少和临床疾病的阻止评估的。而且当接种后五至六周攻击时，疫苗诱导的免疫反应仍然明显。已证明单价疫苗十分安全，用高剂量的OspA疫苗重复接种有莱姆氏疏螺旋体病临床病症的狗，疾病不会恶化。
然而，本领域更为显著的进展是提供了安全有效的结合莱姆氏疫苗。与另一种犬抗原同时施用时，OspA疫苗无干扰是更为显著的进展。此处的结果表明间隔进行的皮下接种导致显著的抗体产生。被接种疫苗者体内诱导的抗体水平与接受单价疫苗的狗中的相似；此水平可以保护被接种疫苗者，包括长期的对抗疏螺旋体感染的蜱攻击。
因为证据表明马对布氏疏螺旋体感染天然易感，提供在马中产生明显的针对布氏疏螺旋体抗原如OspA的抗体的马莱姆氏疫苗是显著的进展。
本发明的一个目标是提供结合布氏疏螺旋体如OspA疫苗或免疫性的或抗原组合物，尤其是此组合物在狗，马或其它家畜中诱导保护。
本发明的另一个目标是提供组合莱姆氏疏螺旋体病疫苗或免疫性或抗原组合物，其中结合中的抗原不产生明显的效能干扰。
本发明进一步的目标是提供一施用给狗、马或其它家畜就产生血清反应的莱姆氏疏螺旋体病疫苗或免疫性的或抗原组合物。
相应地，本发明提供含分离纯化的布氏疏螺旋体抗原、至少一种额外的布氏疏螺旋体以外的哺乳动物病原体抗原的以及最佳地药学或兽医学上接受的载体的免疫性抗原或疫苗组合物。
在组合物中，分离纯化的布氏疏螺旋体抗原包含分离纯化的OspA。
进一步地，组合物中的分离纯化的OspA是基本上不含脂多糖和其它细菌蛋白的分离纯化的，脂化的重组OspA。
组合物可以不含任何免疫原性的增强佐剂。
组合物中额外的抗原选自群体：犬病原体抗原、马病原体抗原和猫病原体抗原。
在某些优选的实施方案中，组合物中额外的抗原是犬病原体或马病原体抗原。
额外的抗原可选自群体，狂犬病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、腺病毒抗原、冠形病毒抗原、副流感病毒抗原、细小病毒抗原及其混合物。
在组合物的某些优选实施方案中，额外的抗原是狂犬病毒抗原；或额外的抗原含犬瘟热病毒抗原、腺病毒抗原、冠形病毒抗原、副流感病毒抗原和细小病毒抗原。
额外抗原可以是修饰的或减毒的活病毒，如，减毒的CDV、CAV和CAV2，冠形病毒、副流感病毒和/或细小病毒。
本发明进一步包含了给哺乳动物施用前述的组合物，在对莱姆氏疏螺旋体病和布氏疏螺旋体以外的哺乳动物病原体易感的哺乳动物内诱发免疫反应的方法。
哺乳动物可以是马，额外抗原是马病原体的。哺乳动物可以是狗或小狗，额外抗原是犬病原体的。
进一步地，本发明提供了诱发马针对布氏疏螺旋体免疫反应的方法包括给马施用含分离纯化的布氏疏螺旋体OspA的组合物。
更进一步地，本发明提供了诱发针对布氏疏螺旋体免疫反应的方法，包括给狗或小狗施用含分离纯化的布氏疏螺旋体OspA的组合物。
在这些方法中，OspA是基本上不含脂多糖和其它细菌蛋白的分离纯化的脂化的重组OspA。并且，在这些方法中，组合物可以不含任何疫原性的增强性佐剂。
本发明也包含制备前述组合物的方法，包括制备冷干形式的额外抗原、制备液态的布氏疏螺旋体抗原及用布氏疏螺旋体抗原重新水化额外抗原。
用含编码全长野生型布氏疏螺旋体OspA脂蛋白基因的质粒转化宿主生物并制备重组布氏疏螺旋体OspA脂蛋白，然后在非变性条件下从该宿主生物的裂解液中纯化基本上无其它细菌蛋白和脂多糖的该重组布氏疏螺旋体OspA脂蛋白从而获得布氏疏螺旋体OspA。
例如，用于本发明的是含纯化的、保持脂化的重组布氏疏螺旋体OspA脂蛋的分离的脂蛋白；基本上无其它细菌蛋白和脂多糖，并且纯化的重组布氏疏螺旋体OspA脂蛋白是通过包括下列步骤的方法得到的：
用含编码全长野生型布氏疏螺旋体OspA脂蛋白基因的质粒转化宿主生物并制备重组布氏疏螺旋体OspA脂蛋白。
在非变性条件下从该宿主生物的裂解液中纯化基本上无其它细菌蛋白和脂多糖的重组布氏疏螺旋体OspA脂蛋白以得到脂化的且当施用于哺乳动物宿主时对其有免疫原性的纯化的重组布氏疏螺旋体脂蛋白。
重组布氏疏螺旋体OspA的纯化可通过下列步骤进行：
裂解宿主生物细胞以得到裂解的细胞；
用比细菌和其它蛋白更优先选择性地溶解布氏疏螺旋体OspA脂蛋白并在约35℃至40℃的温和温度条件下使去污剂相分离的表面活性物质处理溶解的细胞以得到经处理的裂解细胞；
通过分相将经处理的裂解细胞分成含溶解了布氏疏螺旋体OspA脂蛋白的去污剂相。含细菌和其它蛋白的液相及含细胞残渣的固相；
将去污剂相与固相和液相分开；
在使布氏疏螺旋体OspA脂蛋白以外的蛋白与层析柱结合的条件下使去污剂相与层析柱接触；并且
回收含有无结合蛋白的布氏疏螺旋体OspA脂蛋白的经过第一个层析柱的流过液。
通过使去污剂相与层析柱在约pH7.5时接触可纯化重组布氏疏螺旋体OspA。
选择性地，通过制备由全长野生型疏螺旋体opsa基因编码的分离纯化重组OspA脂蛋白的方法获得OspA，它包括：
从转化了含OspA基因质粒的宿主生物诱导疏螺旋体OspA脂蛋白，
裂解宿主生物细胞，
用比细菌和其它蛋白更优先选择性地溶解布氏疏螺旋体OspA脂蛋白且在温和条件下使去污剂相分离的表面活性物质处理裂解的细胞，
将相分成含溶解了布氏疏螺旋体OspA脂蛋白的去污剂相、含细菌和其它蛋白的液相及含细胞残渣的固相，
将去污剂相与固相和液相分开，并且
通过下列方法纯化无疏螺旋体OspA脂蛋白以外蛋白和脂多糖的去污剂相：
(a)在使用布氏疏螺旋体OspA脂蛋白以外的蛋白与第一个层析柱结合的条件下使去污剂相与第一个层析柱接触；并且
(b)回收含有无结合蛋白的布氏疏螺旋体OspA脂蛋白的经过第一个层析柱的流过液。
(c)在比流过第二个层析柱的任何残留的污染蛋白和脂多糖优先使疏螺旋体OspA脂蛋白与第二个层析柱结合的条件下，使经过第一个层析柱的流过液与第二个层析柱接触，
(d)在从第二个层析柱上洗脱结合的疏螺旋体OspA脂蛋白的条件下用洗脱液与第二个层析接触，并且
(e)收集含有来自所述第二个层析柱的疏螺旋体OspA的洗脱液。
进一步地，在此过程中，在pH5.7以下可实现流过液与第二个层析柱的接触，pH达到或超过5.7时实现疏螺旋体OspA脂蛋白与带有洗脱液的第二个层析柱的有效结合并且有效地从第二个层析柱上洗脱结合的疏螺旋体OspA脂蛋白。
并且，更进一步地，在此过程中，约pH7.5时实现去污剂相与第一个层析柱的接触，约pH4.2时实现流过液与第二个层析柱的接触；约pH5.7时实现第二个层析柱与洗脱液的接触。
本发明进一步包含了由此组合物和方法诱发的抗体。
令人惊奇地是，发明的组合物和方法中未观察到明显的效能干扰。
OspA以外添加或替代OspA用于前述的组合物、方法和过程的其它疏螺旋体抗原为尤其是在“相关申请”中用的申请和文件，包括制备这些抗原的方法。
下文详细描述中公开了其它目标和实施方案或使它们很明显。
附图简述
在详细描述中参照了下图，在此引用作为参考，其中：
图1表示了将布氏疏螺旋体的B-31、ACA1和Ip90全长OspA基因克隆至pET9a表达载体所用的PCR寡核苷酸；
图2图解说明将全长OspA基因插入PET9a表达载体以使OspA基因在T7φ10启动子控制之下以从B31基因构建pOA1、从ACA1基因构建pOA9及从Ip90基因构建pOA10的策略；
图3是预测的质粒pOA1的限制图谱；
图4表示了质粒pOA1经多种限制性消化结果，表明所有预测的位点都存在(M＝标记(用HaeIII消化φX174)；B＝BamHI；E＝EcoRI；H＝HindIII；N＝NdeI)；
图5表示了将布氏疏螺旋体的B-31、ACA1和Ip90全长OspA基因克隆至pCMB1表达载体所用的pCR寡核苷酸；
图6图解说明将全长OspA基因插入pCMB1表达载体以使OspA基因在Trc启动子的控制之以从B31基因构建pOA5、从ACA1基因构建pOA7及从Ip90基因构建pOA8。
图7A、7B和7C表示了用IPTG在两个包含pOA1(图7A)株系及含pOA5的一个宿主株系(图7B)和含pOA6的一个宿主株系(图7C)中诱导OspA的时间进程；
图8A、8B和8C是分别表示根据本发明的一个实施方案从大肠杆菌中制备和纯化重组全长OspA的细胞生长和裂解、去污剂抽提和纯化步骤的流程图；并且
图9图解说明了质粒pCMB1和pCMB2的制备。
发明详述
如上文所述，本发明提供了尤其是用于家畜如狗、小狗、猫、小猫和马等的含有布氏疏螺旋体抗原的组合物。此组合物优选的是“鸡尾酒”或多价疫苗。即，此组合物优选地包含其它病原体的额外或“其它”抗原。
布氏疏螺旋体抗原可以是目的抗原的表位；并且，此抗原优选地是OspA。优选地，OspA是诸如大肠杆菌重组子的表达产物。优选地，OspA是脂化的；因此，更优选地，OspA是脂化的重组OspA。通过任何适当的方法可得到诸如OspA的布氏疏螺旋体抗原，如从布氏疏螺旋体培养物中分离；或优选地，根据在此引用作为参考的美国专利5,582,990和5,523,089及WO931/08299公开的方法获得重组脂化的OspA。至于布氏疏螺旋体抗原及其制备方法，用于本发明的参考包括在“相关申请”中引用的文件及其引用的文件。
本发明的组合物，例如免疫学的、抗原的或疫苗组合物或治疗性组合物，包括多价、“鸡尾酒”或结合组合物的施用方法可通过肠胃外途径(皮内、肌内或皮下)。这样的施用导致系统免疫反应。
更为普遍的，根据药学或兽医领域技术人员熟知的标准技术可制备本发明的抗原的、免疫学的或疫苗布氏疏螺旋体抗原组合物。综合考虑具体病人的年龄、性别、体重、种族、病症及施用途径，用医学和兽医领域技术人员熟知的技术按剂量施用这样的组合物。单独使用布氏疏螺旋体，或将其与“其它”的抗原或“其它”免疫学的、抗原的或疫苗组合物共同或依次施用，由此提供本发明的“鸡尾酒”或结合组合物或施用以及运用它们的方法。“其它”抗原或“其它”免疫学的、抗原的或疫苗组合物可以是目的抗原的一个或多个表位，或含目的抗原一个或多个表位的组合物。
“其它”组合物包含从任何动物病原体分离和/或纯化的抗原如家畜病原体抗原如犬、猫、马等病原体的任何抗原，如下列之一：诸如狂犬病毒的犬病原体的一个或多个抗原如狂犬病毒糖蛋白G、犬瘟热病毒抗原如CDV HA和/或F糖蛋白、犬乙型腺病毒抗原、犬冠形病毒抗原、犬副流感病毒抗原、犬细小病毒抗原、犬钩端螺旋体，黄疸出血菌苗抗原或这些抗原的任何组合、或猫病原体的一个或多个抗原如猫白血病毒抗原、猫免疫缺陷病毒抗原、狂犬病毒、犬疱疹病毒抗原或这些抗原的任何结合、或马病原体的抗原如马流感和/或马疱疹病毒和/或狂犬病毒抗原。这些“其它”抗原可来自重组体如痘病毒或其它体外载体系统这些抗原的表达；或这样的“其它”组合物可包含重组体，如体内表达这些抗原的一种或多种痘病毒。
制备表达，用于本发明的OspA或其目的抗原、或“其它抗原”或其目的表位的载体或重组体的方法可以根据或参照下列文献公开的方法；美国专利4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、paoletti”将痘病毒载体用于接种：最新进展“美国国家科学院院报93：11349-11353，1996年10月；Moss，“用于重组基因表达的遗传工程痘病毒、接种和安全性”，美国国家科学院院报93：11341-11348，1996年10月；Smith等，美国专利4,745,051(重组杆状病毒)，Richarolson，C.D.(编辑)；分子生物学方法39，“杆状病毒表达方案”(1995 Human Press Inc.)、Smith等，“在感染了杆状病毒表达载体的昆虫细胞中制备人β干扰素”，分子和细胞生物学，1983年12月，第3卷12期第2156-2165页；Pennock等，“在感染了杆状病毒载体的昆虫细胞中强而调控表达大肠杆菌β-半乳糖苷酶，”分子和细胞生物学，1984年3月，第4卷第3期第399-406页；EPA0370573、1986年10月16日提交的美国专利申请920,197、欧洲专利公开265785、美国专利4,769,331(重组疱疹病毒)、Roizman，“单纯疱疹病毒基因的功能：用于新型载体遗传工程的引物”，美国国家科学院院报93：11307-11312，1996年10月、Andreansky等，“将遗传工程单纯疱疹病毒用于治疗实验性脑瘤，”美国国家科学院院报93：11313-11318，1996年10月、Robertson等“向B淋巴细胞进行基因转运的Epstein-Barr病毒载体；”美国国家科学院院报93：11334-11340，1996年10月、Frolov等，“以甲病毒为基础的表达载体：策略和应用”，美国国家科学院院报93：11371-11377，1996年10月、Kitson等，病毒学杂志65,3068-3075，1991、美国专利5,591,439、5,552,143、Grunhans等，1992，“作为克隆载体的腺病毒”病毒学研讨会(第3卷)第237-252页，1993、Ballay等，欧洲分子生物学组织杂志；第4卷第3861-65页、Graham，Tibtech 8，85-87，1990年4月、Prevec等，普通病毒学杂志70，429-434、PCT WO91/11525、Felgner等(1994)，生物化学杂志269，2550-2561，科学259：1745-49，1993、McClements等“用编码糖蛋白D或糖蛋白B的DNA疫苗单独或结合免疫诱导单纯疱疹病毒2型疾病动物模型的保护免疫反应”美国国家科学院院报93：11414；11420，1996年10月及尤其涉及DNA表达载体的美国专利5,591,639、5,589,466和5,580,859。
同样，全面考虑具体病人的年龄、性别、体重、种族和病症及施用途径，确定施用的成分和方式(顺序或同时施用)以及剂量。至于这一方面，在下列参考中提及：美国专利5,503,834、5,529,780、5,482,713及5,494,807，它们公开了犬、猫和马病原体抗原、表达这些抗原的重组子及包含这些重组子的组合物，还有共同未决的1995年3月29日提交的申请08/413,118，它针对犬疱疹病毒抗原核苷酸和氨基酸序列，产生它们的重组子及其用途；1994年4月6日提交的申请08/224,657和1995年4月5日提交的08/416,616，它们针对痘病毒犬瘟热病毒(CDV)重组子及利用这些重组子的组合物和方法；1996年7月3日提交的申请08/675,556，针对表达盒、启动子和重组子，包括兽用的腺病毒重组子；1996年11月14日提交的申请08/746,668，包括表达目的猫免疫缺陷病毒表位的重组子；以及，1995年6月7日提交的申请08/486,969，针对重组痘病毒-狂犬病毒组合物，包括结合组合物及其应用。将这些专利和申请中的每一个引用作为参考，尤其是在这些申请中公开的重组子、从中产生的表达及编辑核酸可用于本发明的“鸡尾酒”、多价或结合组合物或施用或其重组子。
例如，犬瘟热-2型腺病毒-冠形病毒-副流感-细小病毒XL，修饰的活病毒(产品号1491.21)是一种产物。如果将布氏疏螺旋体抗原，如OspA和此产物包含在一个单位包装，即，作为结合组合物，或一次看兽医将OACPiPxl和布氏疏螺旋体抗原施用于适当的宿主哺乳动物，是非常有益的。
本发明组合物的例子包括用于口的、鼻的、肛门、阴道、口服的、胃内服用的液体制剂、悬浮液、糖浆或配剂一类的施用方法及用于肠胃外、皮下，皮内、肌内或静脉给药(如注射给药)的制剂如无菌悬浮液或乳浊液。在这样的组合物中，抗原与合适的载体、稀释剂，或赋形剂，如无菌水，生理盐水、葡萄糖等形成混合物。可将组合物冷冻干燥，依给药途径和希望的制剂，组合物中可包含辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、凝胶或粘性增强剂、防腐剂、调味剂、色素等。标准教科书，如“REMINGTON’s PHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985，在此引用作为参考，可用作制备适当制剂的参考，这样可免去不必要的实验。根据下文的实施例确定适当的剂量。典型的犬布氏疏螺旋体抗原剂量为5-25μg/ml，如13μg/mlOspA，典型的马布氏疏螺旋体抗原剂量为15-150μg/剂，如单独100μg/剂OspA，单独30μg/剂OspA，或30μg/剂OspA与诸如狂犬病毒的另一种抗原结合(Imrab是商业上可以得到的可与布氏疏螺旋体抗原结合的狂犬病毒疫苗)。
如上所述，抗原的、免疫性的或疫苗组合物通常包含佐剂和抗原以诱发希望的反应。在某些应用中，铝(磷酸铝或氢氧化铝)是常用的佐剂。皂苷及其纯化组分QuilA、弗氏完全佐剂和其它佐剂用于兽药。
然而，不需添加佐剂，脂化的重组OspA可诱发保护反应。可用化学上确定的制剂如胞壁酰二肽、Goodman-Snitkoff等在免疫学杂志147-415(1991)(在此引用作为参考)中描述的单磷脂A、Miller等在实验医学杂志176：1739-1744(1992)(在此引用作为参考)中描述的在蛋白脂质体中制成胶囊的蛋白以及在脂小泡中NovasomeTM脂小泡(Micro Vescular Systems，Inc.，Nashua，NH)中制成胶囊的蛋白。
本发明组合物可以单个剂量包装以通过肠胃外(即，肌内、皮内或皮下)给药或口给药，如perlingual(即口内)、胃内、粘膜包括口内、肛门内、阴道内等给药进行免疫。同样，给药的有效剂量和途径是由组合物的性质及已知因素如宿主的种族、年龄、性别、体重、病症和性质、LD50及其它已知不需要过多实验的筛选方法决定的。剂量通常从几微克至几百微克，如每种抗原为5-500μg。其它适当的载体或稀释剂可以是有或无防腐剂的水或缓冲盐溶液。抗原可以是冷冻干燥的，在给药时悬浮或存在于溶液中。
载体也可以是高分子缓慢释放体系。合成的高分子对制备控制释放的组合物尤其有用。其中较早的例子是甲基丙烯酸甲酯聚合成直径小于1微米的球以形成所谓的纳颗粒，由Kreuter J.报道，医学和药物学中的微胶囊和纳颗粒，M-Donbrow(编辑)，CRC出版社，第125-148页。
已将微胶囊用于注射微胶囊化的药物以产生控制的释放。多种因素对选择微胶囊化的具体高分子有影响。高分子合成和微胶囊化过程的重复性、微胶囊化材料和过程的成本、毒理学状况、可变释放动力学的需求及高分子和抗原的物理化学相容性都是必需考虑的因素。有用的高分子例子是聚碳酸酯、聚酯、聚氨基甲酸乙酯、Polyorthoesters及聚酰胺，尤其是那些可生物降解的。
最常用的药物载体及最近用作抗原的载体是聚(d，1-lactide-co-glycolide)(PLGA)。它是生物可降解的聚酯，很久以来用于可腐蚀的缝合绒、骨板和其它临时假器官，没有任何毒性。多种药物包括肽和抗原被制成PLGA微胶囊。很多证据表明PLGA适用于抗原的控制释放，例如，如Eldridge，J.H等在Current Topics in Microbiologyand Immunology 1989，146：59-66中所述的。抗原包载于直径1-10微米的PLGA微球中通过口腔用药时有很大的佐剂效应。用油包水乳浊剂的分相加工PLGA微胶囊。目的化合物制备或水溶液而PLGA溶解在诸如甲叉氯化物和乙酸乙酯的适当有机溶剂中。高速搅动使这两种不能混合的溶液共同乳化。然后加入高分子的非溶剂，使高分子沉降在水滴周围形成胚性微胶囊。收集并用试剂(聚乙烯醇(PVA)、明胶剂、藻酸盐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纤维素)之一稳定微胶囊，通过真空干燥或溶剂抽提除去溶剂。
如上所述的微胶囊、缓慢释放体系和胶囊技术用于希望使结合组合物中的一个或多个抗原缓慢呈递于免疫系统。
因此，预期包括通过注射或其它给药方式的液体，以及固体，包括含液体的固体、液体及凝胶(包括“凝胶帽”)组合物。
进一步地，本发明组合物可直接用于刺激动物的免疫反应。它可以是抗体反应，所以，通过本领域熟知的技术，可从这些抗体中制备单克隆抗体，这些单克隆抗体可用于熟知的抗体结合实验、试剂盒或测定以检测特定抗原的存在与否。这些单克隆抗体也可用于免疫吸附层析以回收或分离抗原。
本领域的技术人员已熟知制备单克隆抗体和运用单克隆抗体的方法。它们也可用于检测方法、试剂盒、测定或实验以及通过免疫吸附层析或免疫沉淀回收物质。
单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的免疫球蛋白。单克隆抗体与单一的抗原决定簇反应且比传统的、来自血清的抗体特异性更大。而且，筛选大量的单克隆抗体可选择具有希望的特异性、亲合力和同种型抗体。杂交瘤细胞系提供了恒定的、廉价的化学上同一的抗体源并且制备这样的抗体很容易标准化。制备单克隆抗体的技术为本领域技术人员熟知，如1989年4月1日授予Koprowski，H.等的美国专利4,196,265，在此引用作为参考。
已知单克隆抗体的用途。其中之一是用于诊断方法，如，1983年3月8日授予David，G.和Greene，H.的美国专利4,376,110；在此引用作为参考。单克隆抗体也用于通过免疫吸附层析回收物质，如，Milstein C.1980，科学的美国人243：66，70，在此引用作为参考。
相应地，本发明组合物有此处所述的几种用途。本发明的实施例中也有其它用途。
通过下列解释性的实施例，可以更好地了解本发明及其优点。实施例实施例1-重组OspA的制备
根据美国专利5,523,089和5,582,990，WO93/08299、PCT/US92/08697和Erdile等，1993描述的制备重组OspA。简言之：
如图1所示，克隆的布氏疏螺旋体株系的OspA基因(如上文所述的WO90/04411所述)(N-末端区：SEQ ID NO：1，C-末端区，SEQ IDNO：2。序列的剩余部分示于WO90/04411)用作模板(pTRH44；Howe等，1986，感染和免疫，54：207-212)并且特别设计的寡核苷酸引物(PET-IN[CO1][SEQ ID NO：3)和pET-273C[CO3](SEQ ID NO：4))用于聚合酶链反应(PCR)以扩增野生型OspA基因全长。
相似地，如图1所示，克隆的布氏疏螺旋体株ACAL和Ip90(如Johnsson等1992，感染和免疫60：1845-1853-ACA1和Ip90的N末端区是：SEQ ID NO：1；ACA1的C末端区：SEQ ID NO：5；Ip90的C末端区；SEQ ID NO：6)与分别位于N和C-末端区的寡核苷酸引物对(a)OspN2(SEQ ID NO：7)和BZ1(SEQ ID NO：8)及(b)OspN2(SEQ ID NO：7)和pK4(SEQ ID NO：9)进行PCR反应以形成适当的扩增片段。
用寡核苷酸引物扩增所需的靶核酸序列的基本方法为本领域众所周知并在美国专利4,683,202和4,800,159中得到描述。可参照这些专利有关所用技术的描述。
如图2所示，得到的片段克隆到质粒载体pET9的NdeI和BamHI位点以将ospA基因置于T7启动子及噬菌体T7有效翻译起始信号控制下。pET9和pLysS质粒、克隆用细菌宿主、生长培养基及T7RNA聚合酶指导克隆基因表达的方法曾在美国专利4,952,496中有所描述，其中有关此类描述可用作参考。T7启动子系统是本发明的一种优选表达系统，用与宿主生物相容的其它表达系统可实现全长ospA基因的表达。
采用pET9表达载体因为它用kan基因而不是bla基因作为选择标记。所以，细胞生长过程中不使用氨苄青霉素，也就不会形成免疫原性ampicilloyl/OspA靶蛋白偶联物。这种偶联物是青霉素过敏反应的主要抗原决定簇并可能使免疫学研究复杂化。
含布氏疏螺旋体B31、ACAl和Ip90株ospA基因的质粒分别被命名为pOA1、pOA9和pOA10。pOA1质粒几乎与Dunn等，1990，蛋白质表达和纯化；1：159-168中描述的pET9-preOspA质粒完全一致，只是这两种情况下用于pCR反应的寡核苷酸不同。质粒pOA1预测的限制性图谱示于图3，而图4包括质粒pOA1的各种限制性消化的结果，表明所有预测的位点都存在。
为了制备蛋白，质粒pOA1、pOA9和pOA10转化到大肠杆菌表达株系中，根据前述的美国专利4,952,496，优选的大肠杆菌株系是大肠杆菌T7表达株。具体地，此株系可以是根据上述的大肠杆菌表达株BL21(DE3)(pLysS)或大肠杆菌株HMS174(pLysS)。培养转化的宿主并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。IPTG加入后，从质粒pOA1诱导OspA的时间进程示于图7A。用pOA9和pOA10得到了与pOA1相同的结果。诱导后约1小时从质粒pOA1的OspA蛋白合成终止，暗示了蛋白对大肠杆菌有一定的毒性。然而，蛋白生产处于可接受水平，约10mg/L细胞培养物。
除了提供了质粒pOA1、pOA9和pOA10及在大肠杆菌用T7启动子表达OspA脂蛋白外，进一步构建了含在不同启动子控制下全长B31、ACA1和Ip90 ospA基因的质粒并表达了脂蛋白。将从B31株pCR扩增的ospA片段克隆到质粒表达载体pCMB1和pCMB2的NcoI和BamHI位点制备了质粒pOA5和pOA6，将从ACA1株(pOA7)和Ip90株pCR扩增的OspA片段克隆到表达载体pCMB1的NcoI和BamHI位点制备了质粒pOA7和pOA8(见图6的pOA5、pOA7和pOA8)。
从图5看出，布氏疏螺旋体株B31、ACAL和Ip90克隆的OspA基因是分别用位于各自基因N-和C-未端的寡核苷酸引物对(a)PK3(SEQ ID NO：10)和CO3(SEQ ID NO：3)；(b)PK3(SEQ ID NO：10)和BZ1(SEQID NO：8)及(c)PK3(SEQID NO：10)和PK4(SEQ ID NO：9)通过PCR反应扩增以形成合适的扩增片段。
通过消化质粒pTrc99a(Pharmacia目录号27-5007-01)和卡那霉素抗性基因(Pharmacia目录号27-4897-01)、连接得到的片段，构建质粒pCMB1和pCMB2(图9)。质粒pTrc99a为4197bp，包含与多克隆位点相邻的强启动子，多克隆位点后是强转录终止信号(rrnB)。用宿主细胞RNA聚合酶表达靶基因，使其用于多种大肠杆菌中。载体上的乳糖抑制基因(lacIq)紧密控制表达。无IPTG时，乳糖阻抑物蛋白阻止靶基因转录。卡那霉素抗性基因是1282bp的含来自转座子Tn903基因的线性双链DNA片段，其两侧有限制性酶位点并编码赋予对卡那霉素和新霉素抗性的氨基糖苷3’磷酸转移酶。
pCMB1长5.5kb，包含的卡那霉素基因转录方向与Trc启动子起始的方向一致，pCMB2包含的卡那霉素抗性基因起始方向相反，使得抗性基因的转基与Trc启动子控制下目的基因的转录形成会聚的转录物。用SmaI、HindIII和BamHI+NcoI限制性酶消化pCMB1和pCMB2显示预测的精确大小的片段。
将质粒pOA5和pOA6转化大肠杆菌表达株或其它适当的生物，优选地是DH5α感受态细胞。培养转化的宿主，用IPTG诱导蛋白。pOA5诱导的时间进程(图7B)与pOA1的(图7A)相似，而pOA6(图7C)产生的OspA低几倍。用pOA7和pOA8得到与pOA的结果相同。
图8A-8C以图解方式表示了重组全长OspA制备和纯化步骤。下列实施例中描述了特定的操作条件。
细胞生长和蛋白诱导后(图8A)，冻融裂解细胞。用比裂解液中其它细菌蛋白优先的、选择性溶解OspA蛋白的去污剂处理裂解液。Triton X-114选择地溶解31kd蛋白，免疫印迹证明此蛋白是OspA。
本发明并非限制使用Triton X-114，也清楚地包括其它有相似的OspA选择溶解性及在下文所述的温和条件下有相似分相特征的物质。
加入选择性去污剂后，将混合物加热到约35°至40℃，此时随着分相的出现，溶液成为絮状的。
离心絮乱混合物则使混合物分成三相，即含50％或更多OspA蛋白及少量(约5wt％)细菌蛋白的去污剂相、含细菌蛋白的水相及细胞残渣的固体沉淀。从水相和固体沉淀中分离去污剂相。
通过用OspA的选择去污剂处理随后的去污剂相分相，OspA基本上与细菌蛋白完全分开。仍然需要从去污剂相残留的细菌蛋白中最终纯化OspA。
蛋白的最终纯化是在选择性地结合细菌蛋白而非OspA的层析柱上实现的，具体是DEAE-Sephacel、DEAE-Sepharose或其它相当的材料。将去污剂相加在柱上，收集包含所有纯化的OspA蛋白的流过液。结合的组分包含去污剂相所有的细菌蛋白。经S-Sepharose或相当的层析柱进一步纯化后，除了不污染蛋白外，流通物基本上还应没有脂多糖(LPS)，这是通过鲎变性细胞溶解物(LAL)确定的缺乏致热性显示的。
更特别地，按照上文所述制备质粒pOA1并用于转化大肠杆菌株BL21(DE3)(pLysS)(pOA1)和HMS174(DE3)(pLysS)(pOA1)。以每升制备物12ml培养物的比例将转化的大肠杆菌接种到含25μg/ml硫酸卡那霉素和25μg/ml氯霉素的LB培养基中。培养物在摇瓶中37℃培养过夜。
第二天早上，将10ml过夜培养物转移至含25μg/ml硫酸卡那霉素的1升LB培养基中，培养物在摇瓶中37℃培养约3小时至OD＝0.6(尽管可达OD＝1.5)。
向培养基中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mM，培养基在约37℃继续培养2小时。然后使培养物4℃冷却并以10000xg离心10分钟。弃去上清，以1/10体积的PBS悬浮细胞沉淀。将细胞悬浮液在液氮中冷冻，然后可在-70℃无限期贮存。
细胞悬浮液冷冻后，在室温下融化细胞(约20°-25℃)，使细胞裂解。向融化的材料中加入终浓度为1μg/ml的DNaseI，室温下温育混合物30分钟，这可使材料的粘性降低。
将温育的材料置于冰上使温度到10℃以下，然后加入贮存溶为10wt％的Triton X-114使终浓度为0.3-1wt％。将混合物在冰上放置20分钟。然后将混合物加热至约37℃并于37℃放置10分钟。
随着分相的出现，溶液变成絮状。然后以12,000xg于20℃离心絮状混合物10分钟，这使混合物分成较低的去污剂相、上层清亮的水相及固体沉淀。不触动沉淀的情况下，将去污剂相与其它两相分开并冷却至4℃。将缓冲液A，即50mM Tris，pH7.5，2mMEDTA和10mM NaCl加入到冷却的去污剂相中使体积回复到原来的1/3。冷冻得到的溶液并贮存以后来按下文所述进行处理或立即进行这样的处理。
以1ml/10ml去污剂相的比例准备DEAE-Sepharose CL-6B柱，用2体积缓冲液C，即，50mM Tris pH7.5 2mMEDTA、1M NaCl、0.3wt％Triton X-100洗涤柱，然后用4体积缓冲液B，即50mM Tris pH7.5，2mM EDTA、0.3wt％Triton洗涤柱。
将去污剂相加到柱上并收集含OspA的流过液。用1体积的缓冲液B洗涤柱再次收集流过液。合并的流过液是纯化的OspA水溶液，可冷冻贮存。
用2体积缓冲液C洗脱柱以使柱上无细菌蛋白从而可以再利用。
通过S-Sepharose快流速层析进一步并最终纯化来自DEAE-Sepharose柱的流过液。加入0.1M柠檬酸使从DEAE-Sepharose柱的流过液酸化至pH4.2。用以柠檬酸调节至pH4.2的缓冲液C充分洗涤S-Sepharose快流柱。
用以柠檬酸调节至pH5.7的缓冲液C从柱上洗脱高度纯化的OspA。加入2M Tris碱使洗脱液立即回复到pH7.5。
用考马斯亮兰染胶分析经两个层析步骤得到的高度纯化的OspA水溶液，证实它含高度纯化形式的OspA。由后一种层析步骤得到的产物的纯度比由前一种层析步骤得到的高，有很低水平的内毒素。
根据上文所述制备质粒pOA5和pOA6并用以转化大肠杆菌株DH5α。重复实施例1中所用的蛋白表达步骤，pOA5的OspA脂蛋白表达时间进程与pOA1的相同，而pOA6表达OspA比pOA5的低几倍(图7B和7C)。只在表达pOA5的细胞中继续纯化OspA蛋白。
用与实施例1中所述的方法相同的步骤纯化用这种方式由Trc表达系统产生的B31 OspA脂蛋白，不同之处在于收获后细胞沉淀中加入0.1mg/ml溶菌酶，冷冻前在室温下悬浮细胞30分钟。
DEAE-Sepharose柱流过液中含高度纯化形式的OspA脂蛋白。
根据上文所述，重复制备质粒pOA1(pET启动子)和pOA5(TRC启动子)的步骤，克隆来自布氏疏螺旋体亚洲株(Ip90)的OspA基因以形成含此基因的质粒pOA8(Trc启动子)和pOA10(pET启动子)。对这些质粒进行限制性消化证明所有预测的位点都存在。
再次重复此步骤以将布氏疏螺旋体欧洲株(ACA1)的OspA基因克隆形成含此基因的质粒pOA7(Trc启动子)和pOA9(pET启动子)。对这些质粒进行限制性消化证明所有预测的位点都存在。
pOA7和pOA8表达株的培养和诱导与pOA5株的相同，pOA9和pOA10表达株的培养和诱导与pOA1株的相同。
通过这些操作获得的ACA1和Ip90 OspA脂蛋白的纯化与上文所述的B31(pOA1)OspA脂蛋白的相同。DEAE-Sepharose柱流过液含高度纯化形式的OspA脂蛋白。
如上文制备的重组脂化的B31 OspA用于下列实施例中的制剂；然而，此处公开的其它株的OspA也可特别用于欧洲或亚洲地区的家畜。实施例2-重组OspA对狗有保护作用
如在Appel等，1993，传染病杂志167：651-64中重复的，狗对莱姆氏疏螺旋体病易感，人们担忧它可从狗传播给人，由此希望对狗接种针对莱姆氏疏螺旋体病(布氏疏螺旋体)的疫苗。
最初效率研究：14只狗用于此研究，4只接种低浓度的菌苗(107)、4只接种高浓度的菌苗(109)、4只接种有佐剂的OspA制剂，2只作为对照。用天然感染的蜱攻击狗。所有接种的狗完全受到保护未受感染并表现出抗布氏疏螺旋体、抗-OspA、ELISA抗体以及生长抑制抗体。两只对照皆受到感染。表1  通过狗中攻击研究效能-基本组织
疫苗组 动物数   接种 攻击 活体解剖 尸体解剖(+活体解剖)
  1对照     714      -     D42     D75，D103，D131     D144
  AOspA2 F31024     1289 D0，D21 D42 D75，D103，D131     D137D139D137D139
  B菌苗(107)15 A 830     341011 D0，D21 D42 D74，D102，D130     D150D150D145D145
  C菌苗(109)15 A 850     561213 D0，D21 D42 D74，D102，D130     D145D145D138D138
在攻击前1周从Westchester Country(New-York)森林地区通过拖白旗收集Ixodes daminni。这个地区收集的蜱中60％以上都受到感染。
根据阶段和年龄对蜱分类，用前一直保持在98％相对湿度下。攻击时，将15只成年雌蜱和7只成年雄蜱放在用弹性胶带维持位置一周的塑料帽下并放在每只狗剃去毛的左肋部位。这段时间足以使蜱饱食。
样品收集：攻击后一、二和三个月及尸体剖检时从蜱吸附位点获得皮肤活体解剖(4mm穿孔活体解剖块)并进行培养以获得布氏疏螺旋体。
从D0至攻击(D42)每周取血样一次，然后至尸体剖检时每两周取一次血样。根据下文所述检测血清抗体。
约100天时(攻击后97-109天)进行尸体剖检。从左、右后腿膝盖关节、前部肌肉、后部肌肉、肘、和启收集肌肉和关节囊并进行培养以获得布氏疏螺旋体。
培养方法：在BSKII中研磨样品并将其接种在含BSKII的试管中。试管在34℃培养6周。用暗视野显微术每周检测每管中的样品以检测布氏疏螺旋体的存在。观察到布氏疏螺旋体则为阳性。
血清学方法：
RM ELISA：这是间接ELISA。抗原是从法国蜱中分离的布氏疏螺旋体株的洗涤过的超声物。偶联物是山羊抗犬IgG。底物是四甲基联苯胺(TMB)。用样品稀释100倍时450nm和620nm处的差别吸光值表示滴度。
Cornell ELISA：此检测根据Appel等上文所描述的进行。它是间接ELISA。此抗原是从Westchester County收集的I.dammini低代数的布氏疏螺旋体的洗涤的氟氏压碎器裂解液。偶联物和底物与上文相同。以动力ELISA单位表示滴度。
OspA ELISA：这是用rOspA作为包被(plate)抗原的间接ELISA。偶联物是碱性磷酸酶山羊抗犬IgG。底物是Signa 104磷酸酶底物(NA0200)。用在405nm处O.D.大于0.1的最高稀释高的对数表示滴度。
生长抑制实验：根据SADZIENE等(传染病杂志，1993，167：165-172)描述的进行此实验。在两个溶血单位的新鲜豚鼠补体存在的情况下，系列稀释血清并与布氏疏螺旋体生物温育62-66小时。到那时，有螺旋体的孔BSKII生长培养基中的酚红指示剂由粉红变成黄色。用暗视野显微术检测这一点两侧的三个孔以证实活细胞减少90％的稀释度。用此稀释度的对数表示滴度。
结果：
皮肤活体解剖：结果列于表2。在所有样品中对照狗是阳性的。在12个接种疫苗的狗中未见阳性。表2
  疫苗组   动物数     活体解剖(攻击后月数)*
    1 2     3     3.5**
1对照 714 ++ ++ ++ ++
    AOspA2 F31024     1289     ---- ----     ----     ----
    B菌苗(107)15 A 830     341011     ---- ----     ----     ----
    C菌苗(109)15 A 850     561213     ---- ----     ----     ----
*接种后每周检查培养物，共6周。*攻击时进行的活体解剖。
尸体剖检-培养结果：结果详细列于表3。两只对照狗每侧各种器官培养物皆是阳性。分离的比率在左侧(攻击侧)不比右侧频繁。表3
莱姆氏疏螺旋体病疫苗
通过狗中攻击研究效能
来自尸体解剖时收集的组织的培养结果
疫苗组 动物数     组织
后腿的膝盖关节     肌肉     肘     肩
  左   右 左前 左后 右前 右后   左 右 左   右
    110对照     714   --    -+ +- -- ++ -- ++ -+ ++ ++
    AOspA152F 31024     1289   ----    ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ----
    B菌苗(102)D15A830     341011   ----    ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- ----
C菌苗(109)15A 850     5   -    - - - - - - - - -
    6   -    - - - - - - - - -
    12   -    - - - - - - - - -
13 - - - - - - - - - -
血清学：
RM-ELISA：结果示于表4。用OspA疫苗或菌苗接种后，第二次接种后产生明显的增强效应使滴度明显增加。
攻击后，接种狗的滴度保持稳定，而对照狗的滴度在两个月期间逐渐升高。
表4    莱姆氏疏螺旋体病疫苗
       通过狗中攻击研究效能
       RM ELISA血清学(滴度表示为1/100时的血清O.D.)
疫苗组 动物数                                            接种后天数
   0*     8     14  21*     28     35  42**     61     75     89     103     116
1对照     7   0.16     ND     0.09    0.10     0.08     0.07     0.06     0.15     016     0.28     ND     0.44
    14   0.06     ND     0.07    0.08     0.07     0.15     0.10     0.11     0.14     0.23     ND     0.33
    平均标准差   0.11     0.08    0.09     0.08     0.11     0.08     0.13     0.15     0.26     0.39
  0.07     0.01    0.01     0.01     0.06     0.03     0.03     0.01     0.04     0.08
AOspA2F31024     1   0.09     ND     0.16    0.20     0.69     0.53     0.50     0.51     0.44     0.47     0.43     0.48
    2   0.09     ND     0.10    0.12     0.44     0.36     0.31     0.27     0.28     0.22     0.37     0.34
    8   0.08     ND     0.11    0.15     0.60     0.58     0.56     0.45     0.52     0.47     0.47
    9   0.14     ND     0.18    0.16     0.47     0.41     0.44     0.50     0.40     0.38     0.40     0.45
    平均标准差   0.10     0.14    0.16     0.55     0.47     0.45     0.47     0.39     0.40     0.42     0.44
  0.03     0.04    0.03     0.12     0.10     0.11     0.14     0.08     0.13     0.04     0.06
B菌苗(107)15A830     3   0.09     0.12     0.19    0.32     0.58     0.50     0.50     0.53     0.50     0.51     0.60     ND
    4   0.08     0.09     0.21    0.29     0.47     0.40     0.41     0.47     0.44     ND     ND
    10   0.05     0.08     0.13    0.27     0.51     0.56     0.53     0.44     0.42     0.40     0.38     ND
    11   0.07     0.09     0.14    0.20     0.42     0.44     0.41     0.38     0.41     0.34     0.37     ND
    平均标准差   0.07     0.10     0.17    0.27     0.50     0.48     0.46     0.46     0.44     0.42     0.45
  0.02     0.02     0.04    0.05     0.07     0.07     0.06     0.06     0.04     0.09     0.13
C菌苗(109)15A850     5   0.10     0.16     0.21    0.27     0.51     0.44     0.52     0.42     0.37     0.45     0.36     ND
    6   0.13     0.16     0.30    0.33     0.55     0.45     0.44     0.36     0.34     0.43     0.22     ND
    12   0.06     0.13     0.19    0.19     0.46     0.41     0.35     0.24     0.21     0.23     0.43     ND
    13   0.03     0.09     0.27    0.28     0.60     0.63     0.56     0.45     0.50     0.49     0.36     ND
    平均标准差   0.08     0.14     0.24    0.27     0.53     0.48     0.47     0.37     0.36     0.40     0.10
  0.04     0.03     0.05    0.06     0.06     0.10     0.09     0.09     0.12     0.12
Cornell ELISA：结果示于表5。
抗体升高的方式几乎与RM FLISA得到的相同。
所有的被接种者在第一次注射后及第二次加强接种后滴度明显增加。攻击后，滴度保持稳定。
在3个月期间对照的滴度逐渐增加。
表5     莱姆氏疏螺旋体病疫苗
        通过狗中攻击研究效能
        RM ELISA血清学(滴度表示为K ELISA单位)
疫苗组 动物数                                                                      接种后天数
    0*   6     14 21*     28     35 42**     61     75     89     103     116     131     141
1对照     714     3825   NDND     3724     4126     3830     4440     4334     6862     131183     218234     327295     361365     437393     388386
    平均标准差     329     319     359     346     423     396     654     15737     22611     31123     3633     41630     3871
AOspA2F31024     1289     41683740   NDNDNDND     23673151304     381142287325     583525567571     585498613570     561485593566     541353569560     51257560488     521216569482     498204542446     471194471404     452174455360     437ND426ND
平均标准差 4714 4625 191101 284102 56225 56749 55140 506103 455135 447158 423151 385131 360132
B菌苗10(7)15A850     341011     1456615   74612623     290221113197     453315292409     616601567601     636583592565     611583556547     603540566501     579539442494     582466504426     566505436430     573487465435     573546420442     580542451461
平均标准差 3833 4625 20573 36776 59621 59430 57429 55343 51459 49566 48464 49059 49576 50963
C菌苗(109)15A850     561213     59791113   951256941     211355234356     347383292471     636628562545     644625553546     628596521531     577504404516     556485317504     542518325484     501484304461     509510315463     488481283444     474360284439
平均标准差 4134 8336 28977 37375 59346 59250 56952 50072 466103 46798 43890 44992 42495 38985
*D0，D21： 接种  **D42   攻击的第一天
ND：        未做
OspA ELISA：结果示于表6。
两种菌苗诱导的抗OspA抗体水平相似。
OspA疫苗诱导显著的同源抗体反应。
其方式与整个细胞裂解物ELISA相似：一次注射后，增加二次注射加强。
生长抑制：结果示于表6。
菌苗和OspA疫苗在所有接种狗中诱导高水平布氏疏螺旋体抑制抗体。表6莱姆氏疏螺旋体病疫苗通过狗中攻击、OspA ELISA和生长抑制研究效能(滴度表示为终点稀释度的log10)
疫苗组 动物数                 ELISAD0             D21            D42     I.C.D42
    1对照     7     1.7     1.7     1.7     ＜0.9
    AOSPA2 F31024     1289     2.31.71.72.0     2.92.02.92.9     ＞3.83.23.8＞3.8     3.33.03.52.7
    B菌苗(107)15 A 830     341011     221.71.7     2.92.32.32.9     ＞3.8＞3.8＞3.8＞3.8     3.62.62.72.7
   C菌苗(109)15 A 850     561213     2.322.32     2.62.62.32.9     ＞3.83.23.2＞3.8     32.92.73
攻击：
所用的以布氏疏螺旋体针施用为基础的攻击方法比其它发表的攻击方法有很多优点。
*攻击载体和途径模拟自然状况。
*通过皮肤活体解剖体内跟踪感染。
进一步地，对于两个菌苗(法国株)来说，攻击(美国起源的蜱)是异源的。
缺乏临床病症是局限，但根据Appel等所述，在这个年龄的狗中完全是意料之中的。
在这些条件下，结果-即：所有对照被感染；12个被接种者无一被感染-表明低或高浓度的菌苗以及OspA疫苗完全保护狗免受攻击。血清学：
用所有的方法使用三种疫苗得出相似的结果：第一次注射后增加，第二次注射的加强效应。
尽管用于抗原生产的株系和结果表达不同(表3)，应注意所用的两种裂解物ELISA(RM ELISA，Cornell ELISA)之间有很高程度的相关性(r2＝0.86，F＝935 α＝0.001)。
也应重视由接种诱发的抗体：
*与布氏疏螺旋体的主要外膜蛋白OspA强烈反应，
*强烈抑制布氏疏螺旋体生长。结论
含低剂量(107)或高剂量(109)死布氏疏螺旋体细胞的菌苗完全保护狗免受天然途径(蜱暴露)攻击。
用含有佐剂的OspA疫苗得到相同的结果。
所有疫苗诱发识别OspA脂蛋白和抑制布氏疏螺旋体生长的抗体滴度显著而相似的增加。免疫反应研究的持续
将33只小猎兔犬分成两组。第一组(20只狗)以3或4周的接种间隔接受两剂皮下注射的单价疫苗(如实施例1制备的10μg/剂的重组B31 OspA。第二组未受处理(13只)。第二次接种后5-6个月用蜱攻击所有的狗。通过ELISA在有规律的间隔测定抗体。在攻击后1或2个月重新分离螺旋体以评估疫苗效能。也监测狗的犬莱姆氏疏螺旋体病(LD)的临床病症。总结：
安全性：注射疫苗后未见局部或全身副反应。
 组 狗数 接种后抗体产生     攻击后结果
临床症状 两个月时皮肤活体解剖/螺旋体再分离
莱姆氏病 20 19/20＝95％ 1/20＝5％ 2/20＝10％
对照 13 0/13＝0％ 5/13＝39％ 13/13＝100％
单价莱姆氏疏螺旋体OspA疫苗：*诱发由螺旋体再分离和临床病症评估的对犬莱姆氏疏螺旋体的保护。*这种保护反应在接种后至少5个月有效。*天然攻击后对螺旋体感(90％)和临床病症有保护。
动物：
33只幼小猎兔犬(两种性别皆可；9-10周龄；莱姆氏疏螺旋体和钩端螺旋体接种阴性)来自Ridglan Farms(Mount Horeb，WI)。将小狗随机分成两组接种。
组 狗 途径 处理方案
1 10 皮下 莱姆氏疏螺旋体；4周间隔
2 10 皮下 莱姆氏疏螺旋体；3周间隔
3 13 未经处理的对照
疫苗制备：
稀释按实施例1制备的B31 OspA纯化蛋白贮存液制备OspA单价疫苗(命名为Ly)。贮存液的浓度为465μg OspA/ml。用无菌稀释液将贮存液稀释成10μg/ml OspA并将此疫苗分装在单用和多用小瓶中(分别为1ml和10ml)，检测疫苗确实无菌。
接种方案：
狗以三周(第1组)或四周(第2组)间隔接受皮下给药的两剂疫苗(1ml/剂)。注射后最初15分钟内监测过敏反应，包括呼吸困难、痒和水肿。另外，接种后第1个小时内连续观察狗，然后每次注射后的14天在规则的时间间隔观察。监测的病症包括肿胀、疼痛、脆弱和抓注射位点。在第二个注射位点给药时，第二个接种位点由于肿胀和脆弱而悸动。
血清学：
在每次接种时及随后的每个月取血测定滴度。用ELISA测定OspA滴度。
攻击：
根据Appel等的攻击方法，用天然感染的蜱以布氏疏螺旋体攻击所有的狗。末次接种和攻击之间的间隔在第1组为24周，在第2组为21周。在流行莱姆氏疏螺旋体病的Westchester county，N.Y.收集蜱并根据Appel等的方法进行攻击。这些蜱感染布氏疏螺旋体的比率为60％。
皮肤活体解剖和螺旋体再分离：
攻击后一个和两个月对所有的狗进行活体解剖。剃光蜱吸附位点周围的皮肤、用Betadine手术刷进行手术前准备、用2％lidocanne进行麻醉、皮下注射、用Baker Skin Punch进行打孔活体解剖。将皮肤样品放在含培养基(含热灭活兔血清和抗生素的BSK培养基)的试管中并送到实验室。向试管中补加额外的培养基并将其放在烛罐中。将罐培养6周。用暗视野显微术每周检查试管中螺旋体的存在。用40×物镜检查至少10个视野后才能认为样品为阴性。
临床病症和症状：
由于疾病性质可变，感染后见不到犬莱姆氏疏螺旋体病(LD)的临床病症，所以主要通过从皮肤活体解剖样品中再分离布氏疏螺旋体评估疫苗的效能。然而，监测所有狗中LD病症的出现。要监测的病症有疼痛和脆弱、体温、瘸、共济失调、沮丧和厌食。据估计只有10-15％天然感染了布氏疏螺旋体的狗表现出临床病症。结果：
疫苗安全性：
接种后的第一个15分钟及每次接种后两周监测所有接种狗的副反应(包括过敏反应)。每次接种莱姆氏疏螺旋体单价疫苗后的任何时间都未见副反应。另外，每次接种后的两周内未见注射位点肿胀、疼痛、脆弱或痒。
抗体滴度(见表7)：
用ELISA测定抗OspA抗体。表7列举了ELISA值。在蜱攻击时，大多数接种了单价疫苗(10μg OspA)的狗仍表现出有效的OspA抗体滴度。一只狗，FAS＜未表现出针对OspA的有效的抗体反应。螺旋体再分离(同表7)：
攻击后一个和两个月对所有的狗进行皮肤活体解剖。培养活体解剖组织六周并检查螺旋体再分离。第一次活体解剖时从12只对照狗中的7只再分离到螺旋体(58％)。由于污染，一个样品在培养5周后丢失而不可读。所有13个对照狗的样品在第二次活体解剖时均为螺旋体阳性(100％)。
结果表明只有两只接种了单价莱姆氏疏螺旋体疫苗(HVT和DXT)的狗为螺旋体阳性；再分离率为10％。
犬莱姆氏疏螺旋体病的临床病症(同表6和7)：
攻击后5个月，13只未接种对照中的5只(39％)经历了由LD引起的事件，两只狗(HXT和JCT)中发生了多个事件。20只被接种狗中的一只(5.0％)经历了瘸这一事件。讨论：
通过测定疫苗在短时期内阻止螺旋体扩散和临床病症的能力及免疫实验持续时间评估疫苗效能。LD在狗中不一定导致临床疾病出现(Levy和Magnarelli，1992，JAVMA，200：344-347)，所以除了报道临床病症外，疫苗效能基于实验制剂阻止螺旋体增殖的能力。这是通过从皮肤活体解剖中再分离螺旋体评估的。当评估疫苗效能时，螺旋体再分离是最重要也是最稳定的参数。如果接种使这种扩散减弱或消除，动物则不会出现临床病症。如上所述，Ly疫苗可保护90％以上的受体在短期效能实验中不出现螺旋体繁殖。在此免疫反应(DOI)研究期间，接种后5-6个月攻击的狗，100％未处理对照在第二次活体解剖时为螺旋体阳性。相反，只有在两个被接种者中再分离到螺旋体(10％)。
也观察了狗中由于感染引起的临床病症。不知每只狗接种状况的动物技术人员报告了观察到的现象。在上述短期效能研究中，25％未处理对照表现出了犬莱姆氏疏螺旋体病(LD)的典型病症，主要是瘸，而被接种者中未观察到病症。在这项DOI研究中，狗中的六只有这样的病症；五只是未被接种的对照(39％)，一只狗是被接种者(5％)。约攻击后两个月第一次观察到瘸；自那以后两只未受处理的狗(JRT和IAT)表现出重复发生的事件。
一个被接种者，HPS在攻击后约两个月时在前右脚有肿胀和轻微的瘸。尽管在观察那只狗的培养物特别留意了其瘸的现象，从来未从中分离到螺旋体。这也许不是犬LD的结果，而是由其它原因引起(外伤，等)。然而，将这只狗列为临床病症阳性以提供尽可能严格的试验。
抗体滴度结果表明除了一只(FAS)以外其它的接种了此单价疫苗的狗在接种后产生了抗体，这是通过放血前和攻击前至少两个稀释度滴度的差异测定的。这代表了抗体产生率95％。至攻击时，除了两只(FAS和HVT)以外其它所有的被接种者仍然有有效的滴度。对照狗中没有一只有OspA抗体水平的持续升高，尽管三只对照(HXT、JBT和JIT)的确在攻击前血中有低水平的抗体。
此实验结果也显示了Ly单价疫苗的安全性。接种时和每次注射后的两周内未观察到副反应。所有的小狗都可忍耐10μg OspA/剂。因为该疫苗不含佐剂，未出现大多数有佐剂制剂接种时特征性的温和和瞬时的肉芽肿反应。结论：
含10μg OspA/剂的单价疫苗：
*对于9-10周龄的小狗是安全的。
*抗原性强，使95％受体产生抗体。
*接种后5-6个月诱发保护被接种者免受螺旋体(90％)感染的免疫反应和临床病症，蜱攻击后，100％对照表现出螺旋体感染且39％表现出临床病症。
此实施例也表明发明性疫苗对于整个莱姆氏疏螺旋体病季节都有保护作用。表7在免疫试验期间(DOI)针对OspA的抗体滴度、螺旋体再分离和临床病症的结果
疫苗组 狗   第0月 第1月 第2月 第3月 第4月 第5月 第6月 螺旋体 再分离 临床病症
  预取血 预攻击 尸体解剖1 尸体解剖2
接种的 DVT 50 200 1600 1600 800 800 800 - -
  DWT     ＜25     25    200   200     50    50     200
  DXT     50     100    200   50     50    50     50     +     +
  EBT     ＜25     50    800   800     100    100     200
  ESC     ＜25     100    1800   800     400    200     200     -     -
  EDS     ＜25     800    800   400     200    100     100     -
  EHS     ＜25     100    50   50     50    25     50     -     -
  EIS     200     100    200   100     25    25     50     -
  FAS     ＜25     ＜25    25   25     ＜25    ＜25     ＜25     -     -
  FJS     ＜25     ＜25    200   200     200    100     200
  FKS     ＜25     ＜25    6400   800     400    400     400     -     -
  HPS     ＜25     ＜25    6400   400     100    100     100     -     -     +
  HVT     ＜25     ＜25    800   50     50    ＜25     ＜25     +     +
  HWT     ＜25     ＜25    400   50     255    255     50
  ICS     ＜25     ＜25    12800   1600     400    400     1600     --
  IDS     ＜25     ＜25    1800   400     100    200     400
  IHT     ＜25     ＜25    12800   1600     400    400     1600     -     -
  75     ＜25     ＜25    12800   800     200    400     1800
  LJS     ＜25     ＜25    8400   1600     400    800     800     -     -
  IPT     ＜25     ＜25    12800   800     800    1600
未处理的 HXT ＜25 ＜25 ＜25 ＜25 25 50 100 - + +
  IQS     ＜25     ＜25    50   ＜25     25    ＜25     25
  IVS     ＜25     ＜25    ＜25   25     50    50     50          +
  JES     25     ＜25    ＜25   ＜25     25    ＜25     25     +     +
  ITS     25     ＜25    ＜25   ＜25     ＜25    ＜25     ＜25     +     +
  IUS     ＜25     ＜25    ＜25   ＜25     ＜25    ＜25     ＜25     +     +
  JBT     50     ＜25    ＜25   ＜25     ＜25    ＜25     100     -     +     +
JCT 200 ＜25 200 50 25 50 50 +
JIT ＜25 ＜25 25 ＜25 ＜25 100 100 + +
  LIT     ＜25     ＜25    25   ＜25     ＜25    ＜25     25     -     +
  JKS     25     ＜25    25   ＜25     ＜25    25     ＜25
  JTS     50     ＜25    25   ＜25     ＜25    25     ＜25
  JYS     ＜25     ＜25    50   ＜25     25    25     50     -     +     +
在攻击后1、2和3月对所有狗进行活体解剖(acc材料和方法)。皮肤样品在BSK培养基(加有抗生素和10％兔血清)中培养6周；每周用暗视野显微空间检查试管。在认为样品为阴性前至少检查10个视野。±由于污染丢失的样品。表8攻击5个月的犬莱姆氏疏螺旋体病的临床病症
狗号 组 评论
HXT 对照 瘸(所有四肢)、共济失调、阻丧、厌食
瘸(左前肢)
瘸(左前肢)；所有事件自发消除
JBT 对照 瘸(左前肢)；自发消除
JCT 对照 瘸(右腿)；自发消除
瘸(左前肢)；自发消除
JJT 对照 瘸(右前肢)；自发消除
JYS 对照 瘸(左前肢)；自发消除
HPS 接种的 跛行(右前肢)；自发消除
用1ml Ly疫苗SQ以三周或四周间隔接种狗。5-6个月时进行攻击。由不知接种情况的动物技术人员监测狗的临床病症。实施例3-无效能干扰的结合组合物制剂
此实施例表明犬瘟热病毒-2型腺病毒-冠形病毒-副流感病毒-细小病毒和布氏疏螺旋体抗原OspA之间无效能干扰。缩写组分                                              缩写犬瘟热病毒、Rockborn(CDVR)或Onderstepoort(CDVo)    D犬2型腺病毒(CAV2)                                  A犬冠形病毒，MLV(CCVL)                              C犬II型副流感病毒(CPi)                               Pi犬细小病毒(CPVXL)                                  PXL
这些组分是从修饰的活病毒(来自Rhonx Merieux，Inc.，Athens，Georgia，U.S.A)制备而来。疫苗为含下列组分的制剂。
组分 滴度/ml(Log10)
D 5.2或5.4(CDVR＝5.2，CDV0＝5.4)
A 7.4
C 6.6
Pi 7.5
PXL 5.3
此疫苗以两种独立的组分制备：
第一种组分是犬瘟热病毒-2型腺病毒-冠形病毒-细小病毒XL修饰的活病毒，命名为DACPiPXL，将它冷冻干燥在一个小瓶中不包含任何佐剂。第二种组分是布氏疏螺旋体。根据实施例1中所述的重组技术制备B31外膜蛋白A(0spA)(称为Ly)或OspA。
第二种组分是用于使疫苗冷冻干燥组分在接种前重新水化的液体组分。OspA组分不含任何佐剂。
检测冷冻干燥疫苗DACPiPXL的病毒特性和滴度、无菌性、支原体和安全性令人满意。用含13μg/ml OspA的Ly使冷冻干燥物重新水化。检测OspA疫苗的无菌性。
根据the Code of Federal Regulations，9C.F.R.113，35的标准用体外杀病毒实验测定，OspA稀释剂对疫苗的冷冻干燥组分无干扰。
比较接种了结合疫苗(DACPiPXL+OspA)与单纯接种了OspA(见实施例2)狗的血清滴度确定冷冻干燥的病毒组分对OspA稀释剂无干扰。
由于DACPiPXL+OspA是将两种经过广泛效率检验的独立疫苗合并的结果，只有小量的狗被攻击表明疫苗中冷冻干燥的病毒组分不干扰由OspA组分诱发的针对莱姆氏疏螺旋体病的保护作用，反之亦然。
根据年龄，种和性别随机选20只狗并将其养在一起。十只狗接种了DACPiPXL+OspA结合疫苗，5只狗只接种了OspA(按照实施例2)，5只狗作为未受处理的对照。
根据下列进度表，狗接受了以三周间隔皮下(SC)给药的两剂量疫苗(1ml/狗)。
数目 疫苗 途径 取血日期 攻击
10 DACPiPXL+LY SQ 第0，21，35天 第35天
5 LY SQ 第0，21，35天 第35天
5 DACPiPXL对照 SQ 第0，21，35天 第35天
在每次接种(第0和21天)、攻击前(第35天)和每次活体解剖前取血。通过ELISA检测OspA特异的抗体。在接受了OspA或DACPiPXL+OspA的狗内检测到了抗OspA抗体。
接种后立即观察狗的包括过敏反应的副反应。另外，由动物技术人员每天监测狗的局部和系统副疫苗反应，包括发烧、厌食、呕吐或昏睡。在第二次注射前，前次接种位点由于不正常的反应，包括肉芽肿形成而悸动。未观察到副反应。
二次接种后两周用天然感染了布氏疏螺旋体(见实施例2)的蜱攻击所有的狗。
攻击后第1、2和3个月从狗得到皮肤打孔活体解剖。根据实施例2中列出的程序培养活体解剖材料以再分离螺旋体。
比较被接种狗和未处理对照中螺旋体再分离比率，证明结合疫苗冷冻干燥的病毒组分对OspA稀释液无干扰。
为了表明OspA组分对结合莱姆氏疏螺旋体疫苗中冷冻干燥的病毒成分没有不利影响，进行了杀病毒实验。用Ly水化后检测所有病毒成分的滴度，并将其与用无菌重新水化的病毒成分的滴度比较。
解释体内和体外结果：
通过体内实验血清滴度和螺旋体再分离的结果，体外实验杀病毒实验，测定了结合疫苗的效率。比较了接种结合疫苗(DACPiPXL+Ly)、只接种了Ly及未受处理对照狗中的OspA抗体水平和螺旋体再分离的结果。
认为结合疫苗是有效能的，因为：
(1)接受结合疫苗和单价Ly疫苗的狗中的抗体水平相似。被接种者体内抗体水平比未处理对照的抗体水平明显高；
(2)100％被接种的狗螺旋体再分离阴性，而80％(4/s)的未受处理的对照螺旋体阳性；并且
(3)与无菌水相比，Ly稀释剂重新水化的冷冻干燥病毒块的病毒滴度没有降低。
结果示于表9表9犬结合效能研究抗OspA ELISA水平
动物号     疫苗   第0周(Vax 1)   第2周(Vax 2)   第4周   第8周
 700     ＜25   50     800     400
 711     ＜25   3200     6400     1600
 4D587 Osp A13μg/mllot#041795和DACPiPXLlot#43001     ＜25   25     200     25
 283     ＜25   200     12,800     400
 4D547     ＜25   ＜25     ＜25     100
 904     ＜25   50     3200     100
 4D517     ＜25   400     3200     400
 961     ＜25   ＜25     1600     100
 4D581     ＜25   3200     12,800     1600
 982     ＜25   50     12,800     800
 4E455     Osp A13μg/mllot#041795单独     ＜25   25     800     25
 4E403     ＜25   800     6400     1600
 381     ＜25   800     6400     800
 688     ＜25   400     800     100
 4D515     ＜25   50     6400     800
 449     DACPiPXLlot#43001单独(对照)     ＜25   ＜25     ＜25     ＜25
 844     ＜25   ＜25     ＜25     ＜25
 4E457     ＜25   ＜25     ＜25     ＜25
 4D497     ＜25   ＜25     ＜25     ＜25
 4E439     ＜25   ＜25     ＜25     ＜25
*所有的狗以三周间隔接受两次皮下接种。Ly＝莱姆氏疏螺旋体OspA；DACPiPXL＝犬瘟热病毒、腺病毒、冠形病毒、副流感病毒和细小病毒修饰的活疫苗。值＞50＝有效的OspA抗体水平。实施例4-OspA疫苗在马中的效能
10匹马用于此项研究。其号码为74、75、76、77、93、95、96、97、98和99。
单价疫苗(命名为Ly；100μg/剂OspA和30μg/剂)是根据实施例1(B1)所述的重组技术制备的。结合疫苗(命名为狂犬病毒/Ly)由Imrab)来箱Rhone Merieux，Inc.，Athens，Georgin)和根据实施例1(B31)制备的30μg/ml B31 OspA组成。
根据下列方案，以两周间隔给马肌内接种(IM)两剂疫苗。
组   号   疫苗
1    4    狂犬病毒/Ly结合(30μg/ml)
2    4    100μg/ml Ly
3    2    30μg/ml Ly
在每次接种前及二次接种后1、2和3周时取马血。由ELISA(根据用马抗血清修饰的)测定血清学结果。因为OspA血清学结果令人鼓舞，检测了接种结合疫苗的马中的狂犬病毒抗体滴度。
接种后30分钟至1小时内观察了所有马的过敏反应病症。首次观察阶段后，在第二次接种前，观察接种位点出现的局部注射反应(肿块，等)。另外，每日观察每匹马副疫苗反应的出现(发烧、沮丧、厌食等)。所有的日常观察持续至未次接种后的一周。未观察到副反应。
评价被接种马中的抗OspA抗体水中并与取血前水平比较而估价疫苗的效能。
结果示于表10。结果显示单价或多价OspA疫苗可保护马不受莱姆氏疏螺旋体病侵扰；并且，未观察到多价疫苗中有效能干扰。表10马莱姆氏接种实验抗OspA ELTSA水平
动物号 疫苗 第0周 第1周 第4个月 第5个月 第6个月
96 OspA30μg/ml 25 n.b. 200 800 200
99 ＜25 n.b. ＜25 800 100
76 OspA100μg/ml n.b. n.b.. 800 3200 1600
74 n.b. 400 12.8k 6400
95 25 n.b. 50 1600 400
75 n.b. 100 400 3200 800
93 OspA 30ug/ml+Imrablot#12160 ＜25 n.b. 400 25.6k 6400
98 n.b. 200 800 6400 1600
97 ＜25 n.b. 400 6400 1600
77 25 n.b. 800 6400 1600
*所有的马接受了间隔三周的两次肌内注射。Imrab＝商业上的含佐剂的灭活的狂犬病毒疫苗。*n.b.＝未取血；值＞50代表有效的OspA抗体水平。实施例5-犬莱姆氏疏螺旋体：莱姆结合疫苗的安全性、效能和无干扰
本实施例进一步评价了莱姆结合疫苗(recDACPiPXL+OspA)的安全性、效能和无干扰。
将34(34)只小猎兔犬随机分成两组(22只被接种者和12只对照)。被接种者皮下接受两剂结合疫苗(recDACPiPXL+OspA)，而对照只接种病毒成分(recDACPiPXL)。第二次接种后7周用天然感染的蜱攻去所有的狗。用ELISA血清学在规则的间隔检测狗的OspA抗体。为了证实疫苗针对布氏疏螺旋体攻击的效能，对狗进行活体解剖且培养皮肤样品以再分离螺旋体。另外，进行干扰缺乏实验和杀病毒实验以证实OspA稀释液对病毒疫苗成分无有害的影响。
*安全性：注射后的任何时间都未观察到局部或总体的副反应。
*效能总结：表11
    组 狗数   莱姆氏接种后抗体产生     攻击后螺旋体再分离
第一次注射 第二次注射 第1次活体解剖 第2次活体解剖
recDACPiPXL+OspA 22 12/21*＝57.1％ 22/22＝100％  1/22＝4.8％ 0.22＝0％
recDACPiPXL单独 12 0/11*＝0％ 0/12＝0％  4/12＝33.4％ 9/12＝75％
*一只狗未采血*无干扰：杀病毒实验和无干扰实验表明OspA稀释液对结合疫苗的病毒成分无有害影响。
因此，莱姆结合疫苗(recDACPiPXL+OspA)：
*对于8-10周龄小狗是安全的；
*抗原性强且在100％被接种狗中诱发OspA抗体产生；
*天然蜱攻击后保护被接种者免受螺旋体感染及其传播；并且
*不干扰冷冻干燥的病毒疫苗成分，这是通过体内无干扰试验和体外杀病毒实验测定的。所用的缩写疫苗成分缩写布氏疏螺旋体的外表面蛋白A(OspA)       OspA(见前实施例)犬瘟热病毒；金丝雀痘病毒载体(recCDV)    D2型犬腺病毒(CAV2)                      A犬副流感病毒(CPi)                       Pi犬细小病毒PXL                          PXL犬冠形病毒(CCV)                         C
能够接种狗使其不患莱姆氏疏螺旋体病同时提供对其它犬病原体保护的结合疫苗给兽医提供了重要的预防传染疾病的替代方法。
本研究是为了测定本发明的结合疫苗的安全性、效能和无干扰。此结合疫苗含OspA稀释液(命名为OspA)和包含重组犬瘟热病毒-2型腺病毒-冠形病毒-副流感病毒-细小病毒(命名为(recDACPiPXL)冷冻干燥病毒块。材料和方法：
动物：
34只幼小猎兔犬(两种性别皆有；8周龄；莱姆氏疏螺旋体(布氏疏螺旋体)和钩端螺旋体抗体阴性)来自Ridglan Farms(Mount Horeb，WI)。将小狗随机分成两组；按下列接种：
组 狗数 疫苗 途径 攻击
1 22 recDACPiPXL+OspA 皮下 7周
2 12 recDACPiPXL+无菌稀释剂 皮下 7周
疫苗制备：如实施例1获得OspA疫苗。以prelicense serial获得冷冻干燥的病毒成分。冷冻干燥块的滴度如下：
疫苗 recCDV CAV2 CCV CPI PXL
recDACPiPXL 7.3 5.6 4.5 6.5 5.2
疫苗方案：狗接受了以三周间隔皮下给药的两剂疫苗(1ml/狗)。注射后最初19分钟监测过敏反应病症，包括困难，痒和水肿。另外，照顾动物人员在接种后第1小时连续观察狗，然后每次注射后每天观察一次。监测的病症包括肿胀、疼痛、脆弱和抓注射位点。在第二次注射前，首次接种位点由于肿胀和脆弱悸动。
血清学：
每次接种前及其后的每个月取血进行血清学实验。由ELISA测定OspA滴度。
无干涉实验：
为了表明OspA稀释剂对结合疫苗中的病毒成分无干抚，测定了血清中和滴度，比较了第I组(接种了recDACPiPLX+OspA)的GMT和第II组(单独接种recDACPiPXL)的滴度。
体外杀病毒实验：为了表明OspA稀释液不干扰结合疫苗中病毒成分的滴度，根据9CFR准则(113.35)进行体外杀病毒实验。
蜱攻击：为了证实病毒成分不干扰由结合疫苗中的OspA组分诱发的保护作用，接种后7周用布氏疏螺旋体攻击所有的狗。此攻击用在流行莱姆氏疏螺旋体病地区收集的天然感染的蜱。据测定这些蜱中布氏疏螺旋体感染率为60％。
皮肤活体解剖和螺旋体再分离：
攻击后的1个和2个月对所有的狗进行活体解剖。剃光蜱吸附位点的皮肤，用Betadine手术刷进行手术前处理，皮内注射2％lidocaine麻醉，用Baker Skin Punch进行穿孔活体解剖。将皮肤样品放在含培养基(含热灭活兔血清和抗生素的BSK培养基中)的试管中并将其转移至实验室。向试管中添加培养基并将其放在烛罐中。将罐培养6周。用暗视野显微镜每周观察试管中的螺旋体。用40×物镜检测至少10个视野才能认为样品是阴性。
疫苗安全性：由PI在接种后的第1个15分钟内监测所有被接种狗的副反应(包括过敏反应)，每次接后14天由照顾动物的人员监测。用莱姆氏结合疫苗接种后的任何时间都未观察到副系统反应。另外，在接种后的两周内在注射点未见肿胀、疼痛、脆弱或痒。
OspA抗体滴度(见表12)：用ELISA测定针对OspA的抗体。在第0天(预取血，第1次接种前)；第14天(第二次接受接种前)；第42天(攻击前)及其每月一次取血。
表12列举了ELISA值。第一次接种后，23只被接种者的12只(57％)产生了抗体，OspA抗体水平增加至少4倍。第二次接种后两周，所有的22只(100％)接种了recDACPiPXL有OspA抗体产生。攻击前大多数被接种者表现出有效的OspA抗体滴度(19/22＝86.4％)。单独接种了recDACPiPXL的对照中没有一只表现出对OspA抗原的血清学反应。
攻击后两组中抗体水平升高都很小。只有在感染晚期，莱姆氏疏螺旋体病患者体内才表达OspA抗体，天然感染的犬体内也是如此。
无干扰实验(见表13)：在第0天(第1次接种前)和接种后第35天获得血清。在两个时间检测每只狗中结合疫苗中病毒抗原的血清中和抗体。计算单独接种了recDACPiPXL组的几何平均滴度(GMT)和标准差，并与接受莱姆氏结合疫苗(recDACPiPXL+OspA)的GMT比较。
用于此项研究的小狗莱姆氏疏螺体或钩端螺旋体接种或暴露阴性，但不是在特定的无病原体条件下培养。所以，第0天预取血结果表示了疫苗冷冻干燥组分中的病毒成分的滴度。如预料的，接种后所有成分的滴度都提高了。
比较(用斯氏t检验，p＜0.05则被认为显著)单个个体的滴度表明接种了recDACPiPXL+OspA的狗与单独接种了recDACPiPXL的狗血清中和滴度没有区别。所以OspA稀释液对疫苗任何病毒成分没有显著的干扰。
体外杀病毒实验(见表14)：在体外杀病毒实验中，比较了用OspA稀释液重新水化的病毒疫苗成分的滴度与用无菌水重新水化的疫苗的滴度。这些滴度的比较表明差异在莱姆氏结合疫苗每种病毒成分可接受的限度内(低于滴度差对数值的0.5)。
螺旋体再分离(见表15)：攻击后1个和两个月对所有的狗进行皮肤活体解剖。培养活体解剖6周并检测螺旋体再分离。结果表明只有1只接种了组合莱姆氏疫苗(XBY)的狗为螺旋体阳性(4.5％)，且那只狗只有在第一次活体解剖时是阳性的。在第二次活体解剖时，23只接种了recDACPiPXL+OspA的狗中没有一只是螺旋体阳性的(0％)。
攻击后1个月时从12只对照狗中的3只活体解剖样品中再分离到了螺旋体(25％)，第二次活体解剖时9只对照是阳性的75％)。
由病原螺旋体布氏疏螺旋体导致的莱姆氏疏螺旋体病(LD)是目前人类最常见的蜱传播疾病。另外，兽医报道犬LD是最常见的狗感染。
已知布氏疏螺旋体主要外表面蛋白之一：OspA是强有力的免疫原并在多种动物中提供对螺旋体感染的保护。以重组技术大量生产的纯化OspA蛋白也是两种正在进行临床实验的人类疫苗的基础。
可以免疫狗对抗莱姆氏疏螺旋体病并同时对其它犬病原体提供保护的结合疫苗给兽医提供了预防传染疾病的重要替代方法。
本实施例的目的是测定结合疫苗的效能、安全性和无干扰。包含重组犬瘟热病毒-2型腺病毒-冠形病毒-副流感病毒-细小病毒(命名为(recDACPiPXL)冷冻干燥病毒块的疫苗由OspA稀释液重新水化。用结合疫苗(recDACPiPXL+OspA)接种22只小狗，用无菌水重新水化的冷冻干燥病毒块(recDACPiPXL)接种12只对照。隔三周皮下接种两次所有小狗,然后用布氏疏螺旋体感染的蜱攻击。
天然蜱攻击模式用于此实施例。攻击后在1和两个月对所有的狗进行活体解剖并培养样品以再分离螺旋体。结果显示只有1只接种了莱姆氏结合疫苗的狗瞬时螺旋体再分离阳性，因为这只狗及其它所有接种了比结合疫苗的小狗在第二次活体解剖时螺旋体传播为阴性。相反，第二次活体解剖时从75％单独接种了recDACPiPXL的狗中再分离到了螺旋体。
测定了所有狗中的OspA抗体结果。所有接种了结合疫苗(recDACPiPXL+OspA)的小狗在接受两次注射后都产生了抗体，而单独接种了冷冻干燥病毒成分的对照中没有一个的OspA抗体水平升高。
对照动物中的OspA滴度是由活体解剖感染的，蜱攻击后没有明显的升高。已知人体内莱姆氏疏螺旋体病早期不出现OspA抗体；这项研究的结果暗示犬感染的情况也许也是如此。
此项研究也表明了OspA结合疫苗的安全性。接种时或每次接种后的两周内都未见系统或局部副反应。
本发明的莱姆氏结合疫苗(recDACPiPXL+OspA)：
*在8-10周龄小狗中是安全的；
*抗原性很强并诱导100％被接种狗产生抗体；
*由螺旋体再分离表明，天然蜱攻击后，保护被接种者不受螺旋体感染及其传播，并且
*由体内无干扰实验和体内杀病毒实验表明不干扰冷冻干燥病毒疫苗组分。表12针对OspA的抗体滴度的结果
疫苗组   动物    预取血     V2    预攻击 尸体解剖1 尸体解剖2 第155天 第232天
   第0天   第14天   第28天    第42天   第92天    第126天
rOACPiPXL+OepA     WIX     ＜25    50     12.8K     800     200     50     25     ＜25
    XBY     ＜25    NB     1600     200     100     ＜25     ＜25     ＜25
    XDY     NB    ＜25     200     100     100     50     NB     NB
    XCY     ＜25    25     1600     400     25     ＜25     ＜25     ＜25
    XAY     ＜25    200     6400     600     200     NB     50     100
    XGY     ＜25    50     6400     50     50     ＜25     ＜25     ＜25
    XHY     ＜25    100     3200     400     100     ＜25     ＜25     ＜25
    XIY     ＜25    50     3200     400     50     ＜25     ＜25     ＜25
    XJY     ＜25    200     6400     400     100     ＜25     ＜25     ＜25
    XKY     ＜25    50     800     NB     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25
    WXW     ＜25    ＜25     1600     400     50     ＜25     25     ＜25
    WYW     ＜25    25     3200     800     200     25     100     100
WTX ＜25 ＜25 3200 800 400 100 50 100
    WUX     ＜25    50     3200     200     50     100     25     25
    WVX     ＜25    50     800     100     50     ＜25     25     25
    WWX     ＜25    400     12.6K     1600     400     100     50     50
    WSX     ＜25    50     25.6K     1600     800     200     200     200
WLX ＜25 ＜25 800 100 NB ＜25 ＜25 ＜25
    WOW     NB    ＜25     400     100     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25
    WPW     25    ＜25     400     50     50     ＜25     ＜25     ＜25
    WOW     NB    ＜25     800     100     100     ＜25     ＜25     50
    WRW     ＜25    50     3200     100     ＜25     ＜25     ＜25     50
rOACPiPXL单独     VVX     ＜25    ＜25     50     ＜25     50     ＜25     ＜25     ＜25
    VXW     ＜25    ＜25     ＜25     50     100     ＜25     ＜25     ＜25
VYW ＜25 ＜25 ＜25 25 100 ＜25 ＜25 25
    WBX     ＜25    ＜25     ＜25     ＜25     50     ＜25     ＜25     ＜25
    WCX     ＜25    ＜25     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25
    WDX     ＜25    ＜25     ＜25     ＜25     50     ＜25     ＜25     ＜25
    WAX     ＜25    ＜25     25     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25
    WEX     ＜25    ＜25     25     ＜25     25     ＜25     ＜25     ＜25
    WZZ     ＜25    ＜25     25     ＜25     25     ＜25     25     ＜25
    WGX     NB    ＜25     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25     ＜25
    WFX     ＜25    NB     50     25     25     ＜25     25     25
    WHX     ＜25    ＜25     ＜25     50     50     25     50     100
表13血清抗体水平：莱姆稀释液对组合疫苗的病毒成分无影响
  抗原     疫苗     第0天     第35天
    GMT     SD     GMT     SD
    recCDV  recDACPiPXL+OspA     1.05     0.37     1.78     0.46
 recDACPiPXL     1.01     0.35     1.65     0.65
    CAV  recDACPiPXL+OspA     2.24     0.25     2.48     0.27
 recDACPiPXL     2.17     0.19     2.33     0.29
    CPI  recDACPiPXL     1.52     0.33     2.12     0.18
 recDACPiPXL     1.62     0.31     2.10     016
    PXL  recDACPiPXL+OspA     2.00     0.00     3.72     0.78
 recDACPiPXL     2.00     0.00     3.68     0.62
    CCV  recDACPiPXL+OspA     1.51     0.29     2.53     0.40
 recDACPiPXL     1.31     0.49     2.78     0.42
1第一次接种的日期    GMT：几何平均滴度
 用无菌稀释液再水化    SD：标准差表14  有和无莱姆氏稀释液的冷冻干燥病毒成分的滴度(杀病毒效应)
疫苗     病毒组分的滴度1
recCDV CAV2 CCV CPi PXL
 recDACPiPXL 2 7.6 6.2 4.6 6.0 5.3
 recDACPiPXL+OspA 7.7 5.7 4.4 5.8 5.1
1两次重复的平均2用无菌稀释液再水化的冷冻干燥疫苗表15攻击后OspA抗体产生和螺旋体再分离的结果
疫苗     抗体                产生     螺旋体再分离
第一次注射 第2次注射 第1次活体解剖 第2次活体解剖
recDACPiPXL 12/21*＝57.1％ 22/22＝100％ 1/22＝4.5％ 0/22＝0.0％
recDACPiPXL+OspA 0/11*＝0.0％ 0/12＝0.0％ 3/12＝25％ 9/12＝75％
一只狗未取血
由此，详细的优选实施方案中描述了本发明，应当理解由附属的权利要求书确定的本发明不被上文描述的特定细节限制，因为在不脱离其精神或范围的情况下可对其进行改动。
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Claims (19)

1.一种免疫组合物，包含分离纯化的布氏疏螺旋体抗原或表达此抗原的载体和额外的除布氏疏螺旋体以外的哺乳动物病原体或表达额外抗原的载体，以及选择性地药学或兽医学上可接受载体。
2.根据权利要求1所述的免疫组合物，其中分离纯化的布氏疏螺旋体抗原包括分离纯化的OspA。
3.根据权利要求2所述的免疫组合物，其中分离纯化的OspA是基本上不含脂多糖和其它细菌蛋白的分离的、纯化的和脂化的OspA。
4.根据权利要求3所述的免疫组合物，不含任何免疫原性增强佐剂。
5.根据权利要求3所述的免疫组合物，其中的额外抗原选自犬病原体抗原、马病原体抗原和猫病原体抗原。
6.根据权利要求5所述的免疫组合物，其中的额外抗原是犬病原体抗原。
7.根据权利要求5所述的免疫组合物，其中的额外抗原是马病原体抗原。
8.根据权利要求3所述的免疫组合物，其中的额外抗原选自狂犬病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、腺病毒抗原、冠形病毒抗原、副流感病毒抗原、细小病毒抗原及其混合物。
9.根据权利要求8所述的免疫组合物，其中的额外抗原是狂犬病毒抗原。
10.根据权利要求8所述的免疫组合物，其中的额外抗原包括犬瘟热病毒抗原、腺病毒抗原、冠形病毒抗原、副流感病毒抗原和细小病毒抗原。
11.根据权利要求10所述的免疫组合物，其中的额外抗原是修饰的活病毒。
12.一种在对莱姆氏疏螺旋体病和除布氏疏螺旋体以外的哺乳动物病原体易感的哺乳动物体内诱发免疫反应的方法，包括给此哺乳动物施用如权利要求1中所述的组合物。
13.一种在狗或小狗中诱发免疫反应的方法，包括施用根据权利要求1-6、8或10中的任意一项所述的组合物，其中的额外抗原是犬病原体的。
14.一种在马中诱发免疫反应的方法，包括施用根据权利要求1-5、7或9中的任意一项所述的组合物，其中的额外抗原是马病原体的。
15.一种在马中诱发针对布氏疏螺旋体的免疫反应的方法，包括给马施用含有分离纯化的布氏疏螺旋体OspA的组合物。
16.一种在狗或小狗中诱发针对布氏疏螺旋体的免疫反应的方法，包括给狗或小狗施用含有分离的、纯化的布氏疏螺旋体OspA的组合物。
17.根据权利要求14或15中的任意一项所述的方法，其中OspA是基本上不含脂多糖和其它细菌蛋白的分离的、纯化的脂化重组OspA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中组合物不含任何免疫原性增强佐剂。
19.一种制备根据权利要求1所述的组合物的方法，包括以冷冻干燥形式制备额外抗原、以液体形式制备布氏疏螺旋体抗原、并且用布氏疏螺旋体抗原使额外抗原重新水化。
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