ES2310004T3

ES2310004T3 - Composiciones combinadas para el tratamiento de la enfermedad de lyme y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2310004T3
Application number: ES98908885T
Authority: ES
Inventors: Judy Jarecki-Black
Original assignee: Merial Ltd; Merial LLC
Current assignee: Merial Ltd; Merial LLC
Priority date: 1997-03-05
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: DE69839640D1; EP0988051A4; JP2001513112A; IL131678A; JP4301415B2; PT988051E; CA2283420A1; AU6680798A; WO1998039028A1; EP0988051A1; EP0988051B1; CA2283420C; DK0988051T3; IL131678A0; BR9808821A; AU746185B2; US6368603B1; HUP0001401A3; ATE399021T1; PL190989B1

Abstract

Composición inmunológica que comprende un antígeno OspA purificado y aislado de Borrelia burgdorferi o un vector que lo exprese y al menos un antígeno adicional de un patógeno de mamífero distinto al de Borrelia burgdorferi, o un vector que exprese al menos un antígeno adicional, y opcionalmente un vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable; en donde, el antígeno adicional es un antígeno de adenovirus; o en donde, el antígeno adicional es una combinación de un antígeno del moquillo canino, un antígeno adenovirual, un antígeno de coronavirus, un antígeno de parainfluenza, y un antígeno de parvovavirus.

Description

Composiciones combinadas para el tratamiento de la enfermedad de Lyme y su utilización.

La presente solicitud hace referencia a las patentes americanas U.S. 5.582.990, 5.523.080 y a las patentes internacionales WO 95/35119 y WO90/04411. En la presente solicitud se citan diversos documentos, los cuales se indican completos en cada cita o en el listado encabezado como "Referencias" antes de las reivindicaciones.

Campo de la invención

Se describen aquí composiciones para la enfermedad de Lyme (antígeno de Borrelia burgdorferi), especialmente la combinaciones de éstas y los procedimientos para la preparación y utilización de las mismas, especialmente para uso veterinario. Las composiciones pueden incluir, además de un antígeno o antígenos de Borrelia burgdorferi, un antígeno para un patógeno adicional, como un patógeno canino, felino o equino, por ejemplo un antígeno de al menos: el virus de la rabia, el virus del moquillo canino, el adenovirus, el coronavirus, el virus parainfluenza, el parvovirus, FeLV, el virus herpes felino, el virus influenza equino y similares. Las composiciones provocan de forma ventajosa una respuesta inmunológica contra las infecciones de la enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferi), así como contra cualquier otro antígeno en la composición cuando se administra a un huésped. Las composiciones provocan una inmunidad a largo plazo (respuesta) contra la enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferi) en animales, incluyendo los caballos y los perros y aporta una protección o provoca respuestas inmunológicas en los animales. En las composiciones de combinación existe una ausencia de interferencia con la eficacia.

Se mencionan aquí procedimientos para la realización y utilización de dichas composiciones. Adicionalmente, se mencionan los anticuerpos inducidos por las composiciones, los cuales se han aislado de un animal o cultivo celular como puede ser el caso, que son útiles para la preparación de un equipo diagnóstico, test o ensayo para la detección del antígeno Borrelia burgdorferi o enfermedad de Lyme u otro antígeno de un patógeno distinto u otro
patógeno.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Lyme es una enfermedad multisistémica, transmitida por las garrapatas Ixodes ricinus complex. La espiroqueta Borrelia burgdorferi en sentido amplio es el agente etiológico de la enfermedad de Lyme, que es la enfermedad transmitida por atrópodos más común en los Estados Unidos, y es endémica en Europa Central (Barbour y col., 1993). Aunque curable por antibióticos en sus primeros estadios, si se permite que la enfermedad de Lyme progrese, pueden desarrollarse anomalías cardíacas, neurológicas y de articulaciones. Las investigaciones en el desarrollo de una vacuna humana para la enfermedad de Lyme se hallan en curso. La lipoproteína de superficie externa OspA de Borrelia burgdorferi es la principal molécula candidata actualmente para el desarrollo de una vacuna. La lipoproteína OspA recombinante (rOspA) se sabe que induce una respuesta inmune protectora en ratones contra el riesgo de infección por B. burgdorferi (Fikrig y col., 1990; Erdile y col., 1993). La OspA es actualmente objeto de ensayos clínicos como vacuna de administración subucutánea en los Estados Unidos (Keller y col., 1994).

Las solicitudes citadas anteriormente de patente internacional WO 93/08299 y patente europea EP0620860 hacen referencia a vacunas de OspA recombinante (rOspA, rOspA especialmente lipidada y a los procedimientos para la expresión del ADN que codifica OspA y al aislamiento de rOspA lipidada. Las patentes americanas citadas anteriormente U.S. 5.582.990 y 5.523.089 y la solicitud de patente internacional Wo 90/0411 hacen referencia al ADN que codifica la OspA, la secuencia aminoacídica de OspA incluyendo la rOspA y a las formas lipidadas de lo mismo, la OspA sintética incluyendo la rOspA y las formas lipidadas de los mismo, las composiciones que componen la OspA o la OspA sintética y los procedimientos de utilización de dichas composiciones. Y las solicitudes citadas anteriormente hacen referencia al ADN que codifica los antígenos de Borrelia u otras Osps, o al ADN que codifica los fragmentos de utilidad o de otras Osps, las secuencias aminoacídicas de lo mismo, las composiciones que contienen dichos fragmentos u otras Osps y los procedimientos para la utilización de dichas composiciones. El ADN de los documentos citados aquí que pertenece a Borrelia burgdorferi puede utilizarse en los procedimientos de las patentes americanas U.S. 5.582.990 y 5.523.089 o la patente europea EP060860 para producir OspA, otros antígenos de Borrelia o Osps, o fragmentos de lo mismo, para utilizar en la presente invención. En relación con el ADN y los antígenos de utilidad en esta invención, también se incluye la referencia de Molecular Microbiology (1989), 3(4), 479-486.

Un problema especial en la materia implica la infección de animales domésticos con Borrelia burgdorferi a partir de picaduras de garrapatas. Por ejemplo, los perros y los gatos son susceptibles a la enfermedad de Lyme debido a las picaduras de garrapatas y sus amos no sospechan de la enfermedad hasta que es demasiado tarde (debido al pelaje no se detecta el anillo circular característico alrededor de la picadura de garrapata; y debido a la imposibilidad de que los animales como perros y caballos verbalicen sus quejas causadas por la infección sobre por ejemplo dolor de articulaciones, etc., o debido a la falta de práctica de los dueños en apreciar síntomas sutiles de la enfermedad en los animales). Además, Existe una preocupación respecto a la transmisión posible a humanos.

Otro problema en la materia implica las estrategias de vacunación. Más específicamente, cuando es preferible en la vacunación de animales domésticos la administración de antígenos múltiples en una composición multivalente o "cóctel"; por ejemplo, para reducir el número de inyecciones o las visitas al veterinario.

En la actualidad, no está disponible o no se conoce todavía una vacuna de combinación contra la enfermedad de Lyme o "cóctel" o vacuna multivalente o composición inmunológica o inmunogénica (antígeno de Borrelia burgdorferi en combinación con otros antígenos en una composición, en particular para canes).

Otro problema estriba en que la composición multivalente implica una "interferencia con la eficacia", es decir un fallo en uno o más antígenos, en una composición combinatoria para mantener o lograr la eficacia requerida. Se piensa que ello es debido a la interferencia entre antígenos para provocar una respuesta inmunológica, antigénica, de producción de anticuerpos o protectora en el huésped; por ejemplo, se puede presentar en el perro cuando se administra debido a la presencia de otros antígenos. Por ejemplo, los antígenos de la rabia en una combinación con otros antígenos sufren interferencias de otros antígenos o interfieren ellos mismos en la estimulación de una respuesta inmunológica, antigénica, de anticuerpos o protectora causada por otros antígenos en dicha composición, especialmente cuando la composición se administra a los perros. Más particularmente, los antígenos, como los de la rabia y los de Leptospira, cuando se administran con uno o más antígenos pueden interferir con la respuesta inducida por aquellos antígenos. Incluso, los antígenos de Leptospira pueden interferir con OspA. Sin embargo, para otros huéspedes, como los gatos, es conocida la utilización de las vacunas combinatorias. Quizás, sin pretender abrazar ninguna teoría en particular, "la interferencia en la eficacia" es debida a características peculiares del sistema biológico canino o, a la reacción con el sistema biológico canino al presentar antígenos conocidos o, por una combinación de ambas.

Independientemente de dicha teoría, y según el conocimiento del inventor, para la enfermedad de Lyme no se conoce ninguna combinación conocida que no presente interferencias con la eficacia junto con otra composición antigénica, especialmente para la utilización canina. Existe la necesidad de hallar una combinación para la enfermedad de Lyme, especialmente para utilización canina. Sería sorprendente, incluso inesperado y poco factible poder formular una combinación para la enfermedad de Lyme (con otros antígenos) con ausencia de interferencia con la eficacia en los perros, especialmente porque tal como se demuestra por el conocimiento actual y por la interferencia con la eficacia, no es posible combinar sencillamente "composiciones antigénicas" para preparar una combinación de utilidad o una composición "cóctel".

Adicionalmente, sería ventajoso si tal composición de cóctel antigénico para la enfermedad de Lyme proporcionara una protección a largo plazo para los perros, así como protección para las crías con la inmunidad materna para la enfermedad de Lyme. Tal como sabe el experto en la materia, la inmunidad materna es la inmunidad que el recién nacido adquiere de su madre tras el nacimiento y/o durante el período de lactancia, dicha inmunidad al cabo de un período de tiempo, se interrumpe en el recién nacido, volviéndolo susceptible. Además, la presencia de anticuerpos maternos en el recién nacido previene al recién nacido de obtener una respuesta protectora cuando se administra a una composición antigénica, por ejemplo, una vacuna, lo que significa que el recién nacido debe entrar en un período de poca o ninguna inmunidad, es decir, de susceptibilidad, con el consiguiente peligro para el recién nacido antes de que pueda considerarse la administración de un antígeno o una composición de vacunas. Respecto a la inmunidad materna, véase la referencia de la patente americana U.S. 5.338.683, publicada el 16 de Agosto de 1994.

Por ello, son deseables estrategias alternativas de vacunación.

Incluso sería más ventajoso, sorprendente e inesperado si el antígeno de Borrelia burgdogferi que pudiera utilizarse en una composición "cóctel" o de combinación que no presentara interferencia con la eficacia, y que pudiera utilizarse en dicha composición para otros huéspedes como los felinos, equinos y similares, que proporcionara una protección a largo plazo en perros así como una protección para las crías a pesar de la inmunidad, fuera un antígeno recombinante.

En particular, se estima que hasta el momento no existe conocimiento en la materia respecto a la administración a un huésped mamífero, especialmente un animal doméstico como los perros, gatos o caballos, susceptible de la enfermedad de Lyme, de una composición combinatoria que incluya el antígeno Borrelia burgdorferi, es decir, OspA, especialmente tal como se describe aquí.

La patente americana U.S. 5.523.089 trata de la administración de una vacuna para la inmunización en donde la vacuna comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido como OspA o una o más proteínas presentes en las fracciones B, C y E.

Slavik y col., (1993; Acta Virol 37:449-458 tratan de una formulación compleja que comprende una glicoproteína de la cubierta del virus influenza con proteínas de membrana externa de Neisseria meningitidis o B. burgdorferi.

La patente internacional WO 98/03199 trata de una fórmula de vacuna para el tratamiento de enfermedades del perro, incluyendo al menos dos valencias para la vacuna que incluyen cada una un plásmido que contiene un gen de un patógeno canino capaz de ser expresado in vivo en las células del huésped canino, dicha valencia es una valencia del virus de la enfermedad de Carre (CDV) y la valencia del parvovirus canino (CPV), la patente internacional WO 98/03199 se incluye dentro del Artículo 54(3) EPC.

Objetivos y resumen de la invención

La inmunización con una vacuna monovalente de la enfermedad de Lyme (Borrelia burdgdorferi) (denominada Ly) se demostró que era segura y eficaz en los perros, tal como se demostró por la tasa de seroconversión y protección contra la infección por Borrelia burgdorferi.

Se ha demostrado ahora que una vacuna de Lyme, que contiene 10 \mug/ml de OspA (preparada de acuerdo con la patente internacional WO 937082 y las patentes americanas U.S. 5.582.990 y 5.523.089) proporciona a los perros de una protección significativa contra el riesgo de las garrapatas, valorado tanto por una reducción en la proliferación de espiroquetas como por la prevención de enfermedades clínicas. Además, esta inmunidad inducida por las vacunas es todavía significativa al cabo de 5 a 6 meses después. También se ha demostrado que la vacuna monovalente es excepcionalmente segura; los perros que muestran señales clínicas de la enfermedad de Lyme no muestran un agravamiento de la enfermedad con dosis elevadas y repetidas de la vacuna OspA.

Sin embargo, sería un avance incluso más significativo en la materia el proporcionar una vacuna de Lyme combinatoria más segura y eficaz. Sería un avance no presentar interferencia cuando la vacuna OspA se administra con otros antígenos caninos. Los resultados de la presente invención muestran que las vacunas subcutáneas, dadas a intervalos, resultan en una seroconversión significativa. El nivel del anticuerpo inducido por estas vacunas es similar al observado en perros que recibieron la vacuna monovalente; los niveles que mostraron una protección en los vacunados incluyeron la protección a largo plazo contra garrapatas infectadas por Borrelia utilizadas como estímulo.

Debido a que hay evidencias de que los caballos son también susceptibles de forma natural a la infección por Borrelia burgdorferi, también sería una ventaja significativa el proporcionar vacunas de Lyme en equinos que resultaran en la producción significativa del antígeno Borrelia burgdorferi, por ejemplo OspA, anticuerpo en caballos.

La presente invención proporciona una composición inmunológica que comprende un antígeno OspA de Borrelia burgdorferi aislado y purificado o un vector que expresa el antígeno y al menos un antígeno adicional de un patógeno de mamífero distinto al de Borrelia burgdorferi o un vector que expresa al menos un antígeno adicional, y opcionalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente o para veterinaria;

En donde al menos un antígeno adicional es un antígeno de adenovirus;

O en donde al menos un antígeno adicional es una combinación de un antígeno del moquillo canino, un antígeno de adenovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de parainfluenza y un antígeno de parvovavirus.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunológica que comprende un antígeno OspA de Borrelia burgdorferi aislado y purificado o un vector que expresa el antígeno y al menos un antígeno adicional de un patógeno de mamífero distinto a Borrelia burgdorferi o un vector que expresa el antígeno, y opcionalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente o para veterinaria;

En donde al menos un antígeno adicional es un antígeno de adenovirus;

O en donde al menos un antígeno adicional es una combinación de un antígeno del moquillo canino, un antígeno de adenovirus, un antígeno de coronavirus, un antígeno de parainfluenza y un antígeno de parvovavirus,

Para utilizar como un medicamento.

En otro aspecto, la presente invención proporciona la utilización de una composición inmunológica que comprende un antígeno OspA de Borrelia burgdorferi aislado y purificado o un vector que expresa el antígeno, y opcionalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente o para veterinaria;

En donde al menos un antígeno adicional es un antígeno de adenovirus;

En la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de Lyme.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunológica que consiste en un antígeno OspA de Borrelia burgdorferi aislado y purificado o un vector que expresa el antígeno y antígeno de la rabia o un vector que expresa dicho antígeno.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunológica que consiste en un antígeno OspA de Borrelia burgdorferi aislado y purificado o un vector que expresa el antígeno y antígeno de la rabia o un vector que expresa dicho antígeno para utilizar como un medicamento.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona la utilización de una composición inmunológica que consiste en un antígeno OspA de Borrelia burgdorferi aislado y purificado o un vector que expresa el antígeno y antígeno de la rabia o un vector que expresa dicho antígeno.

Se menciona aquí una combinación de Borrelia burgdorferi, por ejemplo OspA, vacuna o composición inmunológica o antigénica, especialmente tal composición induce una protección en perros, caballos u otros animales domésticos.

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También se ha mencionado aquí una vacuna combinatoria para la enfermedad de Lyme o una composición inmunológica o antigénica en donde no hay interferencia significativa con la eficacia en la combinación por los antígenos.

También se describe aquí una vacuna para la enfermedad de Lyme o una composición inmunológica o antigénica para la producción de una respuesta serológica tras la administración a perros, caballos u otros animales domésticos.

Según ello, se menciona aquí una composición inmunológica antigénica o de vacunas que comprende un antígeno de Borrelia burgdorferi aislado y purificado, al menos un antígeno adicional de un patógeno de mamífero distinto al de Borrelia burgdorferi y opcionalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente o para veterinaria.

Además, en la composición el OspA aislado y purificado puede ser un OspA aislado, recombinante, lipidado y purificado esencialmente desprovisto de lipopolisacáridos y esencialmente desprovisto de otras proteínas bacterianas.

La composición puede producirse sin ningún adyuvante intensificador de la inmunogenicidad.

En la composición, el antígeno adicional puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en: un antígeno de un patógeno canino, un antígeno de un patógeno equino y un antígeno de un patógeno felino.

En ciertas realizaciones preferidas, en la composición, el antígeno adicional es un antígeno de un patógeno canino o de un patógeno equino.

El antígeno adicional puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en: antígeno del virus de la rabia, antígeno del moquillo canino, antígeno de adenovirus, antígeno de coronavirus, antígeno de parainfluenza, antígeno de parvovavirus, y mezclas de lo mismo.

En ciertas realizaciones preferidas de la composición, el antígeno es un antígeno del virus de la rabia; o el antígeno adicional comprende un antígeno de moquillo canino, un antígeno de coronavirus, un antígeno de parainfluenza y un antígeno de parvovavirus.

El antígeno adicional puede ser un virus vivo modificado o atenuado, por ejemplo, un CDV, CAV como el CAV2, un coronavirus, un virus parainfluenza y/o un parvovavirus atenuado.

Se menciona aquí un procedimiento para provocar una respuesta inmunológica en un mamífero susceptible de la enfermedad de Lyme y a un patógeno de mamífero distinto a Borrelia burgdorferi, dicho procedimiento comprende la administración al mamífero de las composiciones mencionadas anteriormente.

El mamífero también puede ser un caballo y el antígeno adicional puede ser un patógeno equino. El mamífero también puede ser un perro o un cachorro y el antígeno adicional puede ser un patógeno canino.

Además, se menciona aquí un procedimiento para provocar una respuesta inmunológica en un caballo contra Borrelia burgdorferi que comprende la administración al caballo de una composición que contiene OspA de Borrelia burgdorferi aislado y purificado.

También se menciona aquí un procedimiento para provocar una respuesta inmunológica en un perro o cachorro contra Borrelia burgdorferi que comprende la administración al perro o el cachorro de una composición que contiene OspA de Borrelia burgdorferi aislado y purificado.

En estos procedimientos, el OspA puede ser un OspA recombinante, lipidado, aislado y purificado que está desprovisto de lipopolisacáridos, y esencialmente desprovisto de otras proteínas bacterianas. Y en estos procedimientos, la composición puede no presentar ningún adyuvante intensificador de la inmunogenicidad.

También se describe aquí un procedimiento para las composiciones anteriores que comprende la preparación del antígeno adicional en una forma liofilizada, la preparación del antígeno de Borrelia burgdorferi en la forma líquida, y la rehidratación del antígeno adicional con el antígeno de Borrelia burgdorferi.

El antígeno OspA de Borrelia burgdorferi puede obtenerse mediante transformación de un organismo huésped por un plásmido que contiene el gen codificante de una lipoproteína OspA de Borrelia burgdorferi de tipo salvaje de tamaño completo y la producción de una lipoproteína de OspA de Borrelia burgdorferi recombinante, seguido de la purificación de dicha lipoproteína de OspA de Borrelia burgdorferi recombinante esencialmente desprovista de cualquier otra proteína bacteriana y de lipopolisacáridos en condiciones no desnaturalizantes a partir de un lisado del mencionado organismo huésped.

Por ejemplo, de utilidad en la presente invención es una lipoproteína aislada que comprende la lipoproteína OspA de Borrelia burgdorferi recombinante purificada que ha retenido la lipidación, y está esencialmente desprovista de cualquier otra proteína bacteriana y de lipopolisacáridos. La lipoproteína OspA de Borrelia burgdorferi recombinante purificada se obtiene por un procedimiento que comprende:

\quad: la transformación de un organismo huésped por un plásmido que contiene un gen que codifica una lipoproteína OspA de Borrelia burgdorferi de tipo salvaje de tamaño completo y

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\quad: la producción de una lipoproteína de OspA de Borrelia burgdorferi recombinante,

\quad: la purificación de dicha lipoproteína de OspA de Borrelia burgdorferi recombinante esencialmente desprovista de cualquier otra proteína bacteriana y de lipopolisacáridos en condiciones no desnaturalizantes a partir de un lisado del mencionado organismo huésped, de modo que se obtiene una lipoproteína de Borrelia burgdorferi recombi- nante que está lipidada y es inmunogénica en un huésped mamífero cuando se administra al huésped mamífero.

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La purificación del Ospa de Borrelia burgdorferi recombinante puede realizarse mediante:

\quad: lisis de células del organismo huésped para obtener las células lisadas;

\quad: tratamiento de las células lisadas con un tensoactivo que solubiliza selectiva y preferentemente la lipoproteína OspA de Borrelia burgdorferi a la bacteriana y a otras proteínas y que es capaz de permitir la separación en fases de una fase de detergente en condiciones de temperatura moderadas de aproximadamente 35ºC a 40ºC, para obtener células lisadas tratadas;

\quad: separación por separación de fases de las células lisadas tratadas en la que se obtiene una fase del detergente que contiene la lipoproteína OspA de Borrelia burgdorferi, una fase acuosa que contiene proteínas bacterianas y otras y una fase sólida que contiene residuos;

\quad: separación de la fase de detergente de las fases sólida y acuosa;

\quad: contacto de la fase de detergente con una columna de cromatografía en condiciones que favorecen la unión de proteínas distintas a la lipoproteína OspA de Borrelia burgdorferi en la columna de cromatografía; y

\quad: recuperación del líquido que pasa a través de la primera columna de cromatografía y que contiene la lipoproteína OspA de Borrelia burgdorferi de las proteínas unidas.

La purificación de OspA de Borrelia burgdorferi puede obtenerse mediante el contacto de la fase de detergente con la columna de cromatografía a un pH de aproximadamente 7,5.

Alternativamente, OspA puede obtenerse mediante un proceso de producción de una lipoproteína OspA recombinante, aislada y purificada codificada por un gen opsa de Borrelia burgdorferi de tipo silvestre de tamaño completo, que comprende:

inducción de la lipoproteína OspA de Borrelia a partir de un organismo huésped transformado por un plásmido que contiene el gen ospa,

lisis de las células del organismo huésped

tratamiento de las células lisadas con un tensoactivo que solubiliza selectivamente preferentemente la lipoproteína OspA de Borrelia de la bacteria y otras proteínas y que es capaz de realizar una separación de fases de una fase de detergente en condiciones moderadas,

separación de fases en una fase de detergente que contiene la lipoproteína OspA de Borrelia solubilizada, una fase que contiene las bacterias y otras proteínas y una fase que contiene los residuos celulares;

separación de la fase de detergente a partir de la fase sólida y la fase acuosa, y

purificación de la fase de detergente libre de proteínas distintas a la lipoproteína OspA de Borrelia y el lipopolisacárido mediante:

(a): contacto de la fase de detergente con una primera columna de cromatografía que resulta en la unión de proteínas distintas a la lipoproteína OspA de Borrelia con la primera columna de cromatografía,

(b): recuperación del fluido que pasa a través de la primera columna de cromatografía y que contiene la lipoproteína OspA de Borrelia desprovista de proteínas unidas,

(c): contacto del fluido que pasa a través de la primera columna de cromatografía con una segunda columna de cromatografía en condiciones que dan como resultado la unión preferente de la lipoproteína OspA de Borrelia con la segunda columna de cromatografía respecto a cualquier proteína contaminante residual y lipolisacárido que pasa a través de la segunda columna de cromatografía,

(d): contacto de la segunda columna de cromatografía con un eluyente en condiciones de elución de la lipoproteína OspA de Borrelia a partir de la segunda columna de cromatografía, y

(e): recolección del eluido que contiene OspA de Borrelia de la segunda columna de cromatografía.

Además, en este proceso el contacto del fluido que pasa a través de la columna con la segunda columna de cromatografía puede realizarse a un pH de aproximadamente 5,7 para unir la lipoproteína OspA de Borrelia con la segunda columna de cromatografía con un eluyente. Ello se realiza a un pH de hasta aproximadamente 5,7 y de este modo se permite la elución de la segunda columna de cromatografía de la lipoproteína OspA de Borrelia unida.

Además, en este proceso el contacto de la fase de detergente con la primera columna de cromatografía puede realizarse a un pH de aproximadamente 7,5, el contacto del líquido que fluye a través de la columna con la segunda columna de cromatografía puede realizarse a un pH de aproximadamente 4,2 y el contacto de la segunda columna de cromatografía con un eluyente puede realizarse a un pH de aproximadamente 5,7.

También se mencionan aquí los anticuerpos inducidos por las composiciones y los procedimientos.

Sorprendentemente, no se observó una interferencia en la eficacia significativa de las composiciones y procedimientos mencionados aquí.

Otros antígenos de Borrelia para utilizar en las composiciones, procedimientos y procesos mencionados anteriormente de forma adicional o alternativa a OspA, son inter alia, tal como se describen en las solicitudes y documentos citados aquí bajo el título "Solicitudes Relacionadas", incluyendo los procedimientos para la preparación de los otros antígenos.

Otros objetivos y realizaciones se describen en la presente o serán obvios a partir de la descripción detallada siguiente.

Descripción resumida de las figuras

En la descripción detallada siguiente, se hace referencia a las siguientes figuras acompañantes, en donde:

La Fig. 1 muestra los oligonucleótidos de la PCR utilizados en el clonaje del gen ospA de tamaño completo B-31, ACA1 y I90 de B. burgdorferi en el vector de expresión pET9a.

La Fig. 2 muestra la estrategia de clonaje para la inserción del gen ospA de tamaño completo en el vector de expresión pET9a para colocar el gen ospA bajo el control del promotor T7 ø 10, para formar pOA1 a partir del gen B31, pOA9 a partir del gen ACA1 y pOA10 del gen Ip90;

La Fig. 3 es un mapa de restricción predicho del plásmido pOA1;

La Fig. 4 muestra los resultados de diversas digestiones de restricción del plásmido pOA1, lo que demuestra que todas las dianas predichas están presentes (M= marcadores (ADN de øX174 digerido con Hae III); B= Bam HI; E= Eco RI; H=Hind III; N= NdeI);

La Fig. 5 muestra los oligonucleótidos de la PCR utilizados en el clonaje del gen ospA de tamaño completo B-31, ACA-1 e Ip90 de B. burgdorferi en el vector de expresión pCMB1;

La Fig 6 muestra la estrategia de clonaje para la inserción del gen OspA de tamaño completo en el vector de expresión pCMB1, para colocar el gen ospA bajo el control del promotor Trc, para formar pOA5 a partir del gen B31, pOA7 a partir del gen ACA1 y pOA8 a partir del gen Ip90;

Las Figs. 7A, 7B y 7C muestran el resultado de la inducción con IPTG a diferentes tiempos de OspA en dos cepas huésped que contienen pOA1 (fig 7A), y una cepa huésped que contiene pOA5 (fig. 7B) y pOA6 (fig. 7C);

Las Figs. 8A, 8B y 8C son esquemas de las etapas del crecimiento y la lisis celular, de las etapas de extracción del detergente y purificación del OspA recombinante de tamaño completo a partir de E. coli de acuerdo con una realización de la invención, respectivamente; y

La Fig. 9 muestra la producción de los plásmidos pCMB1 y pCMB2.

Descripción detallada de la invención

El antígeno de Borrelia burgdorferi puede ser un epitopo de interés de un antígeno; y, el antígeno es preferentemente OspA. El OspA es más preferentemente el producto de expresión de un recombinante, como E. coli. El OspA está preferentemente lipidado y por ello, más preferentemente, el OspA es un OspA recombinante que está lipidado. El antígeno de Borrelia burgdorferi, por ejemplo, Ospa, puede obtenerse mediante cualquier procedimiento adecuado, como por ejemplo aislamiento a partir de cultivos de Borrelia burgdorferi; o, preferentemente el OspA lipidado recombinante puede obtenerse por procedimientos descritos en las patentes americanas U.S. 5.582.990 y 5.523.089, y la patente internacional WO 93/08299. Respecto a antígenos de Borrelia burgdorferi, y los procedimientos para la preparación de los mismos, de utilidad en la práctica de esta invención también se hace referencia a los documentos citados aquí como "Solicitudes Relacionadas" y los documentos citados en ello.

El procedimiento de administración para composiciones de la invención como composiciones inmunológicas, antigénicas o vacunas o composiciones terapéuticas, incluyendo las composiciones multivalentes, "cóctel" o composiciones de combinación, pueden administrarse por vía parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea). Dicha administración permite una respuesta inmune sistémica.

Más generalmente, las composiciones antigénicas, inmunológicas o vacunas con el antígeno de Borrelia burgdorferi descritas aquí pueden prepararse de acuerdo con técnicas estándares bien conocidas por los expertos en la materia en el campo farmacéutico o veterinario. Dichas composiciones pueden administrarse en dosificaciones y por técnicas bien conocidas por los expertos en la materia en clínica o veterinaria teniendo en consideración factores como edad, sexo, peso, especie y condición particular del paciente, así como la vía de administración. El antígeno Borrelia burgdorferi puede administrarse solo o en co-administración o secuencialmente con "otro(s)" antígeno(s), composiciones antigénicas o vacunas, por lo que se proporcionan aquí composiciones "cóctel" o una combinación, y las administraciones y procedimientos a utilizar. El "otro" antígeno(s) u "otras" composiciones inmunológicas, antigénicas o vacunas pueden ser un epitopo o epitopos de interés para tales antígenos, o composiciones que contengan un epitopo o epitopos de interés del mencionado(s) antígeno(s).

Estas "otras" composiciones pueden incluir antígenos aislados y/o purificados a partir de cualquier patógeno animal como un antígeno de un patógeno animal doméstico, por ejemplo, cualquier antígeno de un patógeno canino, felino, equino u otro, por ejemplo: uno de los antígenos puede ser de un patógeno canino como el de la rabia, por ejemplo la glicoproteína G de la rabia, el antígeno del virus del moquillo canino, las glicoproteínas CDV HA y/o F, el antígeno del adenovirus de tipo 2 canino, el antígeno del coronavirus canino, el antígeno del parainfluenza canino, el antígeno del parvovavirus canino, el antígeno de la Bacteria Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae, cualquier combinación de estos antígenos; o un antígeno o antígenos de un patógeno felino como los antígenos del virus de la leucemia felina, los antígenos del virus de la inmunodeficiencia felina, la rabia, el antígeno del herpesvirus felino, o cualquier combinación de estos antígenos; o un antígeno de un patógeno equino, por ejemplo, un virus influenza equino y/o un antígeno del herpes equino y/o el antígeno de la rabia. Estos "otros" antígenos pueden derivarse de la expresión de dichos antígenos por un virus recombinante por ejemplo, un(os) poxivirus u otro sistema in vitro; o, dichas "otras" composiciones pueden incluir un virus recombinante como por ejemplo, un(os) poxvirus que exprese(n) el(los) antígeno(s) in vivo.

Los procedimientos para generar un vector recombinante para la expresión de OspA o un epitopo de interés para lo mismo, o de "otro" antígeno o un epitopo de interés de lo mismo para utilizar tal como se describe aquí, pueden realizarse mediante procedimientos análogos a los descritos en las patentes americanas U.S. 4.603.112, 4.769.330, 5.174.993, 5.505.941, 5.338.683, 5.494.807, 4.722.848. Paoletti, "Aplicaciones de los vectores pox virus para vacunación: una revisión, "PNAS USA 93:11349-11353, Octubre 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination an safety", PNAS USA, 93:11341-11348, Octubre 1996, Smith y col., patente americana U.S. 4.745.051 (baculovirus recombinante), Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expresion Protocols" (1995, Humana Press Inc.,). Smith y col., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, Dec, 1983, vol. 3, no. 12, pp. 2156-2165; Pennock y col., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli - B-galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology Mar. 1998, vol. 4, no. 3, pp. 399-406; EPA 0370 573, patente europea EP 265785, patente americana US 4.769.331 (herpesvirus recombinante), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors", PANS USA 93:11307-11312, Octubre 1996, Andreansky y col., " The Application of genetically herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors", PNAS USA 93:11313-11318, Octubre 1996, Robertson y col., "Epstein-Barr virus vector for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93:11334-11340, Octubre 1996, Frolov y col., "Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications", PNAS Usa 93:11371-11377, Octubre 1996, Kitson y col., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; patentes americanas U.S. 5.591.439, 5.552.143, Grunhaus y col., "Adenovirus as cloning vectors", Seminars in Virology (vol 3), pp. 237-52, 1993, Ballay y col., EMBO Journal, vol. 4, pp. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, Abril, 1990; Prevec y col., J. Gen Virol. 70,429-434, PCT WO91/11525, Felgner y col.,(1994), J. Biol Chem. 269, 2550-2561, Science, 259:1745-49, 1993 y Mc Clements y col., "Immunization with DNA vaccines encoding glyprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models or herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93:11414-11420, Octubre 1996, y las patentes americanas U.S. 5.591.639, 5.589.466 y 5.580.859 que relacionan los vectores de expresión del ADN, inter alia.

De nuevo, los ingredientes y la forma de administración (secuencial o en co-administración), así como las dosificaciones pueden determinarse teniendo en cuenta factores como la edad, el sexo, el peso, la especie y la condición particular del paciente así como la vía de administración. A este respecto, también se mencionan las patentes americanas U.S. 5.503.834, 5.529.780, 5.482.713 y 5.494.807 que incluyen una descripción de antígenos de patógenos caninos, felinos y equinos, vectores recombinantes que expresan dichos antígenos y composiciones que contienen dichos recombinantes, así como la patente americana U.S. 5.688.920 publicada el 29 de Marzo, 1995, dirigida a las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de los antígenos del herpesvirus canino y a las formas recombinantes de lo mismo, así como a sus utilizaciones; la patente americana U.s. 5.756.102, publicada el 6 de Abril de 1994, dirigida a las formas recombinante del virus del moquillo-poxvirus canino (CDV) y a las combinaciones y procedimientos que utilizan dichas composiciones; la patente internacional WO 98/00166 dirigida a casetes de expresión, promotores y recombinantes, incluyendo los recombinantes del adenovirus canino para utilizaciones veterinarias; y, la patente internacional WO 96/40241 dirigida a composiciones del poxvirus de la rabia recombinante, incluyendo composiciones y utilizaciones de lo mismo. Cada una de estas patentes y solicitudes se menciona aquí como referencia, y en especial los productos recombinantes, de expresión y el ácido nucleico codificante en estas solicitudes pueden utilizarse en composiciones "cóctel", multivalentes o de combinación o administraciones o recombinantes de lo mismo aquí mencionado.

Por ejemplo, el virus del moquillo canino-adenovirus de tipo 2-Coronavirus-Parainfluenza-parvovavirus_{XL}, Virus Vivo Modificado, es un producto (código del producto 1491.21). Sería altamente ventajoso incluir un antígeno de Borrelia burgdorferi, por ejemplo, OspA con este producto en un paquete de una sola unidad, es decir, como una composición de combinación; o para administrar conjuntamente a un huésped mamífero adecuado, por ejemplo un perro, el OACOiO_{XL} junto con el antígeno de Borrelia burgdorferi en una sola visita al veterinario.

Ejemplos de composiciones de la invención incluyen las preparaciones líquidas para orificios, por ejemplo administración oral, nasal,vaginal, peroral, intragástrica, etc., la administración como suspensiones, jarabes o elixires; y las preparaciones para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, la administración inyectable) como las suspensiones o emulsiones estériles. En dichas composiciones el antígeno o antígenos pueden hallarse en una mezcla con un vehículo adecuado, diluyente o excipiente como por ejemplo agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones pueden también estar liofilizadas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes de pH, adyuvantes, gelificantes o aditivos intensificadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromáticos y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseadas. Para la realización de preparaciones adecuadas, sin excesiva experimentación, pueden consultarse textos estándares, como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17ª edición, 1985. Las dosis adecuadas también pueden basarse en los ejemplos de más abajo. Las dosis caninas típicas del antígeno de Borrelia burgdorferi pueden ser de 5 a 25 \mug/ml, por ejemplo, 13 \mug/ml de OspA, y las dosis equinas típicas de lo mismo serían de 15 a 150 \mug/dosis, por ejemplo, 100 \mug/dosis de OspA sólo, 30 \mug/dosis de OspA sólo, o 30 \mug/dosis de OspA en combinación con otro antígeno como el de la rabia (Imrab es una vacuna de la rabia disponible comercialmente con la que el antígeno de Borrelia burgdorferi puede combinarse),

Tal como se mencionó anteriormente, las composiciones antigénicas, inmunológicas o las vacunas pueden contener un adyuvante y una cantidad del antígeno(s) para inducir la respuesta deseada. En ciertas aplicaciones, el alumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) es un adyuvante típico. La saponina y su componente purificado QuilA, adyuvante completo de Freund y otros adyuvantes se utilizan en aplicaciones veterinarias.

Sin embargo, el OspA recombinante lipidado puede provocar una respuesta protectora sin necesidad de añadir un adyuvante. También pueden utilizarse preparaciones definidas químicamente como el muramil dipéptido, monofosforil lípido A, los conjugados de fosfolípidos como los descritos por Goodman-Snitkoff y col., J. Immunol. 147:410-415 (1991), la encapsulación de la proteína con un proteoliposoma tal como se describe por Miller y col., J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992), y la encapsulación de la proteína en vesículas lipídicas como las vesículas lipídicas Novasome^{TM} (Micro Vesicular Systems, Inc., Nashua, NH).

La composición de la invención puede empaquetarse en forma de una sola dosis para la inmunización parenteral (es decir, intramuscular, intradermal o subcutánea) o para la administración por orificios, por ejemplo, perlingual (es decir oral), intragástrica, mucosal incluyendo la intraanal, intravaginal, y similares. Y de nuevo la dosis y la vía de administración se determinarán según la naturaleza de la composición y por factores conocidos, como la raza o la especie, la edad, el sexo, el peso, la condición y la naturaleza del huésped, así como LD_{50} y otros procedimientos de cribado que son conocidos y no requieren experimentación excesiva. Las dosis pueden hallarse generalmente en un intervalo que va de unos pocos a unos centenares de microgramos, por ejemplo, de 5 a 500 \mug de cada antígeno. Otros vehículos adecuados o diluyentes pueden ser el agua o una solución salina, con o sin un conservante. El(los) antígeno(s)
pueden liofilizarse para la resuspensión en el momento de la administración o pueden estar en solución.

El vehículo también puede ser un sistema polimérico de liberación retardada. Los polímeros sintéticos son particularmente útiles en la formulación de una composición de liberación controlada. Un ejemplo de ello es la polimerización de metil metacrilato en esferas con diámetros inferiores a una micra para formar las denominadas nano-partículas, reportadas por Kreuter, J., Microcapsules and Nanoparticules in Medicine and Pharmacology, M. Donbrow (Ed). CRC Press, pp. 125-148.

La microencapsulación se ha aplicado a la inyección de microencapsulados farmacéuticos para proporcionar una liberación controlada. Diversos factores contribuyen a la selección de un polímero en particular para la microencapsulación. La reproductibilidad de la síntesis del polímero y del proceso de microencapsulación, el coste de los materiales de microencapsulación y el proceso, el perfil toxicológico, los requerimientos para la cinética de liberación variable y la compatibilidad físicoquímica del polímero y de los antígenos son todos ellos factores a tener en consideración. Un ejemplo de polímeros de utilidad son los policarbonatos, los poliésteres, los poliuretanos, los poliortoésteres y las poliamidas, en particular los biodegradables.

Una elección frecuente de un vehículo para usos farmacéuticos y más recientemente para antígenos es el poli(d-1-láctido-co-glicólido) (PLGA). Éste es un poliéster biodegradable que tiene una larga historia de utilización médica en suturas reabsorbibles, placas óseas y otras prótesis temporales en donde no ha presentado ninguna toxicidad. Una gran variedad de productos farmacéuticos incluyendo los péptidos y los antígenos se han formulado en microcápsulas de PLGA. Muchos resultados se han acumulado en la adaptación de PLGA para la liberación controlada del antígeno, por ejemplo, como se revisa por Eldridge, J.H. y col., Current Topics in Microbiology and Immunology, 1989, 146:59-66. La captura de antígenos en las microsferas de PLGA de 1 a 10 micrones de diámetro ha demostrado tener un efecto de adyuvante remarcable cuando se administra oralmente. El proceso de microencapsulación con PLGA utiliza una separación de fases de una emulsión agua-aceite. El compuesto de interés se prepara como una solución acuosa y el PLGA se disuelve en un solvente orgánico adecuado como el metilén cloruro y el etil acetato. Estas dos soluciones no miscibles se co-emulsionan por agitación a elevada velocidad. A continuación se añade un no-solvente para el polímero, lo que causa la precipitación del polímero alrededor de las gotas acuosas para formar microcápsulas embrionales. Las microcápsulas se recogen y estabilizan con una selección de agentes (polivinil alcohol o PVA, gelatina, alginatos, polivinilpirrolidona (PVP), metil celulosa) y el solvente se elimina mediante secado al vacío o por extracción.

La microencapsulación, el sistema de liberación retardada y las técnicas de encapsulación, por ejemplo, tal como se describió anteriormente, pueden tener una utilidad cuando es deseable retardar la presentación de uno o más antígenos en una composición de combinación con el sistema inmune.

Por ello, son deseables composiciones líquidas, incluyendo las administradas por inyección u otras vías, así como las sólidas, incluyendo las líquidas que contienen sólido, líquido y gel (incluyendo "tapones de gel").

Además, las composiciones de la invención se pueden utilizar directamente para estimular una respuesta inmune en los animales. Dicha respuesta inmune puede ser un anticuerpo de respuesta; y en consecuencia, a partir de estos anticuerpos, mediante técnicas bien conocidas en la materia, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse y, pueden utilizarse aquellos anticuerpos en ensayos de unión de anticuerpos conocidos, equipos de diagnóstico o tests para determinar la presencia o la ausencia de antígeno(s) particulares. Aquellos anticuerpos monoclonales también pueden utilizarse en la cromatografía de inmunoadsorción para recuperar o aislar el antígeno o antígenos.

Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales y para las utilizaciones de anticuerpos monoclonales son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. Pueden utilizarse en procedimientos diagnósticos, equipos, tests o ensayos, así como para recuperar materiales por cromatografía de inmunoabsorción e inmunoprecipitación.

Los anticuerpos monoclonales so inmunoglobulinas producidas por células de hibridoma. Un anticuerpo monoclonal reacciona con un determinante antigénico y proporciona una especificidad superior a la de un anticuerpo convencional derivado del suero. Además, el cribado de un amplio número de anticuerpos monoclonales facilita la selección de un anticuerpo individual con la especificidad, avidez e isotipo deseados. Las líneas celulares de hibridoma proporcionan una fuente constante, no costosa de anticuerpos químicamente idénticos y preparaciones de dichos anticuerpos pueden fácilmente estandarizarse. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales son bien conocidos por aquellos expertos en la materia, por ejemplo, Koprowski, H y col., patente americana U.S. 4.196.265, publicado el 1 de Abril de 1989.

Las utilizaciones de anticuerpos monoclonales son conocidas. Una de estas utilizaciones se halla en los procedimientos diagnósticos, por ejemplo, David, G. y Green, H. patente americana U.S. 4.376.110, publicada el 8 de Marzo de 1983. Los anticuerpos monoclonales también se han utilizado para recuperar materiales por cromatografía de inmunoadsorción, por ejemplo, Milstein, C. 1980, Scientific American 243:66-70.

Según ello, las composiciones de la invención tienen utilidades diversas. Otras utilidades también se derivan de las realizaciones de la invención.

Para un mejor conocimiento de la presente invención y de sus múltiples ventajas se proporcionan los ejemplos siguientes a modo de ilustración.

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Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de OspA recombinante

El OspA recombinante se produjo tal como se describió en las patentes americanas 5.523.089 y 5.582.990, patente internacional WO 93/08299, patente europea EP0620860 y Erdile y col., 1993. En resumen:

El gen OspA clonado de la cepa B. burgdorferi B31 (tal como se describe en la patente internacional anteriormente mencionada WO 90/04411) (región N-terminal: SEC ID NO:1, región C-terminal: SEC ID NO:2. El resto de la secuencia se muestra en la patente internacional WO 90/04411) se utilizó como molde (pTRH44; Howe y col., 1986, Infection and Immunity, 54:207-212, "Howe y col., 1986") y los cebadores de oligonucleótidos diseñados especialmente (PET-IN[CO1](SEC ID NO:3) y PET-273C[CO3](SEC ID NO:4)) se utilizaron en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el gen ospA completo de tipo salvaje, tal como se muestra en la Fig.1.

De modo similar, el gen ospA clonado de las cepas B. burgdorferi ACA1 e Ip90 (tal como se describió por Jonhsson y col., 1992, Infect. Immun. 60:1845-1853- región N-terminal de ACA1 e Ip90 es: SEC ID NO:1; región C-terminal de ACA1:SEC ID NO:5; región C-terminal de Ip90:SEC ID NO:6) se utilizó en una reacción de PCR con parejas de cebadores oligonucleotídicas (a)OspN2 (SEC ID NO:7) y BZ1 (SEC ID NO:8) y (b) OspN2 (SEC ID NO:7) y pK4 (SEC ID NO:9), respectivamente en los extremos N- y C-terminal para formar los fragmentos amplificados adecuados, tal como se muestra en la Fig. 1.

Los procedimientos básicos para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana deseada con los cebadores oligonucleotídicos son bien conocidos en la materia y se describen en las patente americanas U.S. 4.683.202 y 4.800.159. Se debería hacer referencia a dichas patentes para la descripción de las técnicas a utilizar.

Los fragmentos resultantes se clonaron en las dianas NdeI y BamHI del vector plasmídico pET9 para colocar el gen ospA bajo el control de un promotor T7 y las señales de inicio de la traducción eficiente del bacteriófago T7, tal como se observa en la Fig. 2. Los plásmidos pET9 y pLysS, los huéspedes bacterianos para el clonaje, medio de crecimiento y los procedimientos utilizados para dirigir la expresión de los genes clonados por la T7 RNA polimerasa se han descrito previamente en la patente americana U.S. 4.952.496 y por ello se hace referencia a dicha descripción. Aunque un sistema de expresión preferido es el sistema de promotor T7 en la presente invención, la expresión del gen ospA de longitud completa puede lograrse mediante la utilización de sistemas de expresión compatibles con el organismo huésped.

Se utilizó el vector de expresión pET9 ya que contenía un gen kan como marcador de selección en lugar de un gen bla. Por consiguiente, la ampicilina no se utilizó durante el crecimiento celular y por tanto no es posible que pueda formarse un conjugado inmunogénico de proteína diana OspA/ampicilina. Dichos conjugados son determinantes antigénicos principales en la alergia a la penicilina y pueden complicar los estudios inmunológicos.

Los plásmidos resultantes se han denominado pOA1, pOA9 y pOA10, contienen los genes ospA de las cepas B21, ACA1 e Ip90 de B. burgdorferi, respectivamente. El plásmido pOA1 es casi idéntico al plásmido pET9-preOspA descrito por Dunn y col., 1990, Protein Expression and Purification, 1:159-168, excepto que los oligonucleótidos utilizados para la reacción de PCR fueron distintos en los dos casos. Un mapa de restricción predicho para el plásmido pOA1 se muestra en la Fig.3, mientras que en la Fig. 4 muestra los resultados de diversas digestiones del plásmido pOA1, lo que demuestra que todas las dianas predichas están presentes.

Para la producción proteica, los plásmidos pOA1, pOA10 se transformaron en la cepa de expresión de E. coli, preferentemente, la cepa de E. coli es la cepa de expresión T7 de E. coli, tal como se describió más arriba, o E. coli HMS174 (DE3)(pLys).El huésped transformado se creció y la proteína se indujo con isopropil-\beta-D-galactósido (IPTG). En la Fig. 7A, se muestra una curva de inducción-tiempo para OspA a partir del plásmido pOA1, después de la inducción por IPTG. Resultados idénticos a los de pOA1 se obtuvieron con pOA9 y pOA10. La síntesis de la proteína OspA a partir del plásmido pOA1 finalizó al cabo de aproximadamente 1 hora después de la inducción, lo que implicaba cierta toxicidad de la proteína para E. coli. Sin embargo, la producción de proteína alcanzó un nivel aceptable de aproximadamente 10 mg/l de cultivo celular.

Además de la provisión de plásmidos pOA1, pOA9 y pOA10 y de la expresión de la lipoproteína OspA en E. coli con el promotor T7, se han construido otros plásmidos que contienen el gen completo B31, ACA1, e Ip890 OspA bajo el control de un promotor distinto y se ha conseguido una expresión de lipoproteína. A este respecto, los plásmidos pOA5 y pOA6 se prepararon mediante clonaje de un fragmento amplificado por PCR de OspA a partir de la cepa B31 en dianas de clonaje NcoI y BamHI de los vectores de expresión pCMB1 y pCMB2, mientras que los plásmidos pOA7 y pOA8 se prepararon por clonaje de un fragmento de PCR de OspA de la cepa ACA1 (pOA7) y de la cepa Ip90 (pOA8) en las dianas NcoI y BamHI del vector de expresión pCMB1 (véase la Fig. 6 para pOA5, pOA7 y pOA8).

Tal como se aprecia en la Fig. 5, los genes OspA clonados de las cepas B31, ACA1 e Ip90 de B. burgdorferi se amplificaron por PCR con las parejas de cebadores oligonucleotídicas (a) pK3 (SEC ID NO:10) y CO3 (SEC ID NO:3), (b) PK3 y (SEC ID NO:10) y BZ! (EC ID NO:8) y (c) PK3 (SEC ID NO:10) y PK4 (SEC ID NO:9), respectivamente en los extremos N- y C-terminal de los genes respectivos para formar los fragmentos amplificados adecuados.

Los plásmidos pCMB1 y pCMB2 se construyeron mediante digestión del plásmido pTrc99a (Pharmacia, nº de catálogo 27-5007-01) y un gen de resistencia a la kanamicina (Pharmacia nº de catálogo 27-4897-01), aislamiento de los fragmentos resultantes (Fig. 9). El plásmido pTrc99a, 4197 pb, contiene un promotor fuerte adyacente al sitio de multiclonaje, seguido de una señal de finalización de la transcripción fuerte (rrnB). La expresión del gen diana utiliza la RNA polimerasa de la célula huésped, lo que permite su utilización en una gran variedad de cepas de E. coli. La expresión está estrechamente controlada por el gen supresor de la lactosa (laclq) incluido en el vector. La proteína represora de la lactosa evita la transcripción del gen diana en ausencia del inductor IPTG. El gen de resistencia a kanamicina es un fragmento de DNA de doble cadena de 1282 pb que contiene el gen del transposón Tn903 flanqueado por las dianas de restricción y codifica la enzima aminoglicósido 3'-fosfotransferasa, la cual confiere resistencia a la kanamicina y la neomicina.

El plásmido pCMB1 de 5,5 Kb contiene el gen de resistencia a la kanamicina orientado de modo que su transcripción es la misma que la originada a partir del promotor Trc, mientras que pCMB2 contiene el gen de resistencia a kanamicina orientado en la dirección opuesta, de modo que la transcripción del gen de resistencia y del gen de interés bajo el control del promotor Trc resulta en los transcritos convergentes. Las digestiones con enzimas de restricción de pCMB1 y pCMB2 con SmaI, HindIII y BamHI+NcoI mostraron fragmentos de tamaño exacto al predicho.

Los plásmidos pOA5 y pOA6 se transformaron en la cepa de expresión de E. coli u otro organismo adecuado, preferentemente las células competentes DH5\alpha. Los huéspedes transformados crecieron y la proteína se indujo con IPTG. La curva de inducción dependiente del tiempo con pOA5 (Fig. 7B) fue similar a la de pOA1 (Fig. 7A), mientras que los niveles de OspA producidos por pOA6 (Fig. 7C) fue varias veces inferior. Resultados idénticos a los de pOA5 se obtuvieron con pOA7 y pOA8.

Las etapas implicadas en la producción y purificación de OspA de longitud completa recombinante se muestran esquemáticamente en las Figs. 8A y 8C. Las condiciones específicas del proceso se describen aquí en los Ejemplos de más adelante.

Después de la etapa de crecimiento celular y de la inducción de proteína (Fig. 8A), las células se someten a lisis por congelación-descongelación. El lisado se trata con un detergente que es selectivo para la solubilización de la proteína OspA, en preferencia a otras proteínas bacterianas presentes en el lisado. Se halló que el TritonX-114 solubilizaba selectivamente una proteína de 31 kilodaltons, y por inmunotransferencia se demostró que era la OspA.

La invención no se limita al empleo de Triton-X-114 pero también incluye otros materiales que presentan una solubilidad selectiva similar para OspA, así como la la propiedad de separación de fases en las condiciones referidas más adelante.

Después de la adición del detergente selectivo, la mezcla se calentó a una temperatura moderada de aproximadamente 35º-40ºC, momento en que la solución se tornó turbia a medida que tenía lugar la separación de fases.

La centrifugación de la mezcla turbia dió como resultado la separación de la mezcla en tres fases, una fase de detergente que contenía un 50% o más de proteína OspA y una cantidad pequeña (de aproximadamente el 5% en peso) de proteínas bacterianas, una fase acuosa que contenía el resto de proteínas bacterianas y un sedimento sólido de residuos celulares. La fase de detergente se separó de la fase acuosa y del sedimento sólido.

Mediante etapas de tratamiento con un detergente selectivo para OspA y la consiguiente separación en fases de la fase del detergente, se logró una separación completa de OspA de las proteínas de la bacteria. Queda por realizar una purificación final de OspA a partir de la proteína bacteriana residual en la fase del detergente.

La purificación final de la proteína se logró sobre una columna de cromatografía selectiva para proteínas bacterianas de unión pero no para OspA, específicamente DEAE-Sepharose u otro material de cromatografía equivalente. La fase de detergente se cargó en la columna y se dejó fluir a través, recogiéndose toda la proteína OspA purificada. La fracción unida contiene todas las proteínas de la bacteria en la fase del detergente. Después de la purificación con S-Sepharose o una columna de cromatografía equivalente, además de estar libre de proteínas contaminantes, la fracción del eluido de la columna está esencialmente libre de lipolisacáridos (LPS) tal como se indica por la falta de pirogenicidad, según se determinó por el lisado de Limulus amebocyte (LAL). La solución altamente purificada de OspA puede secarse por congelación u otro proceso.

Más específicamente, el plásmido pOA1 se preparó tal como se describió más arriba y se utilizó para transformar las cepas de E. coli BL21 (DE3) (pLysS) (pOA1) y HMS174 (DE3) (pLysS) (pOA1). Las E. coli transformadas se inocularon en medio LB con 25 \mug/ml de sulfato de kanamicina y 25 \mug/ml de cloramfenicol a una tasa de 12 ml de cultivo por cada litro preparado. El cultivo se creció durante la noche en un agitador de frascos de cultivo a aproximadamente 37ºC.

A la mañana siguiente, se transfirieron 10 ml del cultivo nocturno a 1 l de LB con 25 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejó crecer en el agitador de frascos a aproximadamente 37ºC hasta alcanzar una D.O. = 0,6 (aunque una D.O.= 1,5 puede ser suficiente) en aproximadamente 3 horas.

Al medio de cultivo se añadió isopropiltiogalactosidósido (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM y el medio de cultivo se creció durante dos horas más a 37ºC. Al cabo de este tiempo, el medio de cultivo se enfrió a aproximadamente 4ºC y se centrifugó a 10000xg durante 10 min. El sobrenadante se eliminó y se resuspendió el sedimento en 1/10 volúmenes de PBS. La suspensión celular se congeló en nitrógeno líquido y de este modo puede guardarse indefinidamente a -70ºC.

Después de la congelación de la suspensión celular, las células se descongelaron a temperatura ambiente (20-25ºC) lo que causó la lisis celular. Se añadió DNasa I al material descongelado a una concentración final de 1 \mug/ml y la mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, dando como resultado una disminución de la viscosidad en el material.

El material incubado se enfrió en hielo a una temperatura inferior a 10ºC y se añadió Triton-X-114 a partir de una solución madre a 10% en peso a una concentración final de 0,3-1% en peso. La mezcla se mantuvo en hielo durante 20 minutos. La mezcla enfriada se calentó a aproximadamente 37ºC y la temperatura se mantuvo durante 10 minutos.

La solución se volvió turbia mientra se realizaba la separación de fases. La mezcla turbia se centrifugó a 20ºC durante 10 minutos a 12.000xg, separándose así la mezcla en una fase inferior de detergente y una fase superior acuosa clara y un sedimento sólido. La fase de detergente se separó de las otras dos y se enfrió a 4ºC, sin incorporar sedimento. Se añadió tampón A (Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 2 mM y NaCl 10 mM) a la fase de detergente enfriada para reconstituir 1/3 del volumen original. La solución resultante puede ser congelada y guardada para su procesamiento posterior tal como se describe más adelante o puede someterse inmediatamente a dicho procesamiento.

Se preparó una columna de DEAE-Sepharose CL-6B en un volumen de 1 ml/10 ml de fase de detergente y se lavó con dos volúmenes de Tampón C (Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, NaCl 1 M, Trito X-100 al 0,3% en peso) y luego con 4 volúmenes de Tampón B (Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, Trito X-100 al 0,3% en peso).

La fase de detergente se cargó en la columna y se recogió el fluido a través de la columna que contenía OspA. La columna se lavó con 1 volumen de Tampón B y se recogió de nuevo el fluido. Los fluidos combinados correspondieron con una solución acuosa purificada de OspA, que podía congelarse para su almacenamiento.

La columna puede liberarse de las proteínas bacterianas para su reutilización mediante elución con 2.

Se realizó una purificación adicional y final del fluido a través de la columna DEAE-Sepharose mediante cromatografía en S-Sepharose Fast Flow. El fluido a través de la columna DEAE-Sepharose se acidificó en primer lugar a pH 4,2 mediante adición de ácido cítrico 0,1 M. La columna S-Sepharose Fast Flow se lavó extensamente con Tampón C, se ajustó el pH a 4,2 con ácido cítrico.

OspA altamente purificada se eluyó de la columna con Tampón C y se ajustó a pH 7,5 con ácido cítrico. El eluido se ajustó inmediatamente a pH 7,5 mediante adición de Tris base 2M.

La solución acuosa de OspA altamente purificada obtenida por ambos procedimientos de cromatografía se analizó por geles teñidos con Coomassie y se confirmó que contenían OpsA en forma altamente pura. La pureza del producto por el último procedimiento de cromatografía fue mayor que la formada por el procedimiento de cromatografía inicial, y presentaba niveles muy bajos de endotoxina.

Los plásmidos pOA5 y pOA6 se prepararon tal como se describió anteriormente y se utilizaron para transformar la cepa de E. coli DH5\alpha. El procedimiento de expresión de proteínas utilizado en el Ejemplo 1 se repitió y la expresión dependiente del tiempo de la lipoproteína OspA por pOA5 fue idéntica a la observad para pOA1, mientras que la expresión de OspA por pOA6 fue varias veces inferior a la de pOA5 (Figs. 7B y 7C). La purificación de la proteína OspA se continuó en las células que sólo expresaban pOA5.

La lipoproteína OspA B31 producida por el sistema de expresión Trc se purificó de este modo según el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1, excepto que se añadieron 0,1 mg/ml de lisozima al sedimento celular después de recoger el cultivo, las células se resuspendieron durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de su congelación.

El flujo a través de la columna DEAE-Sepharose contenía la lipoproteína OspA en una forma altamente purificada.

Se repitieron los procesos para la producción del plásmido pOA1 (promotor pET) y pO5 (promotor TRC), tal como se describió más arriba, con el gen OspA clonado de la cepa Asian (Ip90) de B. burgdorferi, para formar los plásmidos pOA8 (promotor Trc) y pOA10 (promotor pET) que contenía el gen. Se realizó una digestión de restricción con estos plásmidos, que mostraron todas las dianas predichas.

Los procesos también se repitieron con el gen OspA clonado de la cepa European (ACA1) de B. burgdorferi, para formar los plásmidos pOA7 (promotor Trc) y pOA9 (promotor pET) que contenía el gen. Se realizó una digestión de restricción con estos plásmidos, que mostraron todas las dianas predichas.

El crecimiento y la inducción de las cepas de expresión de pOA7 y pOA10 se realizaron de igual manera que con la cepa pOA6, mientras que el crecimiento y la inducción de las cepas de expresión de pOA9 y pOA10 fue idéntico al de la cepa de pOA1.

Las lipoproteínas de OspA ACA1 e Ip90 obtenidas por las mencionadas operaciones se purificaron de igual manera que con la lipoproteína OspA B31 (pOA1) tal como se describió más arriba. El flujo a través de la columna DEAE-Sepharose contenía la lipoproteína OspA en una forma altamente purificada.

La proteína OspA B31 recombinante y lipidada, preparada tal como se indicó más arriba, se utilizó en las formulaciones de los Ejemplos siguientes; sin embargo, OspA recombinante de otras cepas, tal como se describe aquí, también puede utilizarse, especialmente para animales domésticos en Europa y Asia.

Ejemplo 2 La proteína OspA recombinante es protectora en perros

Tal como se indica en Apple y col col., 1993, J. Infect. Dis. 167:651-64, los perros son susceptibles de la enfermedad de Lyme y por ello existe una preocupación especial sobre la transmisión posible de perros al hombre, con lo que sería deseable poder vacunar a los perros contra dicha enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferi).

Estudio de eficacia inicial: se utilizaron 14 perros en el estudio: 4 se vacunaron con una concentración baja de bacterin (10^{7}), 4 con una concentración alta (10^{9}), 4 con una formulación de Ospa adyuvante y 2 como controles. Se utilizaron garrapatas infectadas para infectar los perros. Todos los perros vacunados estuvieron completamente protegidos contra la infección y mostraron anti-B. burgdorferi, anti-OspA, anticuerpos ELIS así como anticuerpos inhibidores del crecimiento. Los dos controles estaban infectados.

TABLA 1

1

Se recogió Ixodes Damiani mediante arrastre de banderolas blancas en áreas forestales del condado de Westchester (New-York), una semana antes de la infección. Más del 60% de las garrapatas recogidas en esta área estaban infectadas.

Las garrapatas se clasificaron por su estadio y sexo y se mantuvieron en humedad relativa del 98% hasta su utilización. En el momento de la infección, se colocaron 15 hembras y 7 machos adultos sobre el flanco izquierdo previamente pelado de cada perro bajo un tapón de plástico que se mantuvo en el sitio durante una semana con una cinta elástica. Dicho tiempo fue suficiente para obtener una hinchazón de las garrapatas.

Recolección de las muestras: biopsias de piel. Se obtuvieron biopsias de 4 mm al cabo de 1, 2 y 3 meses después de la exposición al estímulo y en la necropsia en el sitio de unión de la garrapata, y se realizó un cultivo para B. burgdorferi.

Se recogieron muestras de sangre semanalmente desde el día D0 a después del estímulo (D42) y luego bisemanalmente hasta la necropsia. Se analizaron los anticuerpos del suero tal como se describió más arriba.

La necropsia se realizó aproximadamente a los 100 días (97 a 109 después del estímulo). Se recogió una muestra de músculo y material de la cápsula de la rodilla derecha e izquierda, músculo de la pata delantera y músculo de la pata trasera, codo y hombro y se cultivaron para B. burgdorferi.

Procedimientos de cultivo: las muestras se crecieron en medio BSKII y se inocularon en tubos que contenían BSKII. Los tubos se incubaron a 34ºC durante 6 semanas. Se analizaron muestras semanalmente de cada tubo para B. burgdorferi mediante microscopía de campo oscuro. Cualquier observación de B. burgdorferi se consideró positiva.

Procedimientos serológicos

ELISA RM: ELISA indirecto. El antígeno es un sonicado de la cepa B. burgdorferi Bb212 aislada de las garrapatas en Francia. El conjugado es una IgG de cabra anti-canina. El sustrato es tetrametilbencidina (TMB). Los títulos se expresaron como la D.O. diferencial a 450 nm y 620 nm a una dilución de 1/100 de la muestra de suero.

ELISA de Cornell: Este test se realiza tal como se describe y está referenciado en Appel y col., supra. Es un ELISA indirecto. El antígeno es un lisado de prensa-francesa lavado de pasajes bajos de B. burgdorferi aislada a partir de I. dammini recogido del condado de Westchester. El conjugado y el sustrato son los mismos que antes. Los títulos se expresan como unidades cinéticas de ELISA.

ELISA OspA: Este ELISA indirecto se realiza con un rOsPA como antígeno de la placa. El conjugado es una IgG anti-canina de cabra con fosfatasa alcalina. El sustrato es el de la fosfatasa 104 (NA 0200). Los títulos se expresan como log_{10} de la dilución más elevada que proporciona una D.O. a 405 nm superior a 0,1.

Ensayo de inhibición del crecimiento: Este ensayo se realizó tal como se describe por SADZIENE & col., (J. Infect. Dis. 1993, 167:165-172). Los sueros son seriados y se incuban con organismos B. burgdorferi durante 62-66 horas en presencia de dos unidades hemolíticas del complemento de cobaya. Durante este tiempo, el indicador de rojo fenol en el medio de crecimiento BSKII ha virado de rosa a amarillo en los pocillos con espiroquetas. Se examinaron tres pocillos de cada uno de los lados de este punto mediante microscopía de campo oscuro para verificar la dilución en la que la viabilidad de las células disminuía al 90%. Los títulos se expresan como log10 de esta dilución.

Resultados

Biopsias de piel: Los resultados se representan en la Tabla 2. Los perros control se hallaron positivos en todas las muestras. No se hallaron muestras positivas en ninguno de los 12 perros vacunados.

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TABLA 2

2

Resultados del cultivo de necropsias: Estos resultados se detallan en la Tabla 3. Los dos perros control dieron positivos en los cultivos de diversos órganos en cada lado. La tasa de aislamiento no parece ser más frecuente en el lado izquierdo (lado estimulado) que en el derecho.

TABLA 3

3

4

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Después de la vacunación con la vacuna OspA o con bacterin, la mayoría presentó un incremento significativo en la titulación después de una inyección con un efecto al estímulo significativo a partir de la segunda vacunación.

Después del estímulo, los títulos de los perros vacunados permanecieron estables pero los de perros controles aumentaron gradualmente durante un periodo de dos meses.

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TABLA 4

5

6

ELISA de Cornell: Resultados se muestran en la Tabla 5.

El aumento en el patrón de anticuerpos es casi idéntico al obtenido con el ELISA RM.

Todos los vacunados mostraron un aumento significativo en los títulos después de un inyección y un efecto de refuerzo de la segunda vacunación. Después del estímulo, los títulos permanecieron estables.

Los controles muestran un aumento gradual en los títulos durante un periodo de 3 meses.

TABLA 5

7

ELISA de OspA: Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Los dos bacterin inducen niveles similares de un anticuerpos anti-OspA.

La vacuna OspA induce una respuesta de anticuerpos homólogos.

El patrón es similar al ELISA de lisado de células: aumento después de una inyección, refuerzo con la segunda inyección.

Inhibición del crecimiento: Los resultado se muestran en la Tabla 6.

Los dos bacterin y la vacuna OspA indujeron niveles altos de anticuerpos inhibidores de B. burgdorferi en todos los perros vacunados.

TABLA 6

8

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Estímulo

El procedimiento de estímulo utilizado presenta diversas ventajas sobre los procedimientos basados en la administración de B. burgdorferi.

*: El vector del estímulo y la vía simulan la situación natural.

*: La infección puede examinarse in vivo mediante biopsias de piel.

Además, el estímulo (garrapatas de origen americano) puede considerarse heterólogo para las dos bacterias (la cepa francesa).

La falta de signos clínicos es una limitación pero, tal como se describe en Appel y col., es lo que se espera en perros de esta edad.

En estas condiciones, los resultados - es decir, todos los controles infectados y ninguno de los 12 infectados vacunados - demostraron que tanto los dos bacterin a baja o elevada concentración como la vacuna OspA protegían completamente al perro contra dicho estímulo.

Serología

Las tres vacunas dieron resultados similares con todos los procedimientos utilizados: aumento después de una inyección, efecto de refuerzo de la segunda inyección.

Es interesante remarcar el grado elevado de correlación entre los dos lisados ELISA utilizados (ELISA RM, ELISA de Cornell), a pesar de una diferencia en la cepa utilizada para la producción antigénica y en la expresión de los resultados (Figura 3) (r^{2}=0,86, F=935, \alpha=0,001).

También es importante remarcar que los anticuerpos inducidos por la vacunación:

*: Reaccionan fuertemente con OspA, la proteína externa más importante de B. burgdorferi.

*: Inhiben fuertemente el crecimiento de B. burgdorferi.

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Conclusión

Los bacterin con una dosis baja (10^{7}) o dosis elevada (10^{9}) de células muertas de B. burgdorferi protegieron completamente a los perros estimulados por vía natural (exposición a garrapatas).

Los mismos resultados se obtuvieron con la vacuna OspA con adyuvante.

Todas las vacunas indujeron un aumento significativo y similar en los títulos de anticuerpo, que reconocían la lipoproteína OspA e inhibieron el crecimiento de B. burgdorferi.

Duración del estudio de inmunidad

Treinta y tres (33) perros Beagles se dividieron en dos grupos. El primer grupo (20 perros) recibió dos dosis SC de una vacuna monovalente (10 mg/dosis de OspA recombinante B31 tal como se preparó en el Ejemplo 1) a un intervalo de vacunación de 3 o 4 semanas. El segundo grupo no se trató (13 perros). Todos los perros fueron estimulados con garrapatas 5 a 6 meses después de la segunda vacunación. Los niveles de anticuerpo se determinaron a intervalos regulares mediante ELISA. La eficacia de la vacuna se valoró por re-aislamiento de espiroquetas al cabo de uno y dos meses después del estímulo. Los perros fueron monitorizados por sus signos clínicos indicativos de la enfermedad de Lyme (LD).

Resumen

Seguridad: No se hallaron reacciones locales o generalizadas adversas después de la inyección de la vacuna.

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10

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La vacuna Ly OspA monovalente

*: provoca una protección contra LD canina valorada tanto por el reaislamiento de espiroquetas como por los signos clínicos.

*: esta respuesta de protección es efectiva al menos 5 meses después de la vacunación.

*: protege contra la infección de espiroquetas (90%) y los signos clínicos después de un estímulo natural.

Animales

Treinta y tres cachorros de Beagle (cualquier sexo, de 9 a 10 semanas de edad; negativos para la vacunación de Lyme y Leptospira) se obtuvieron de Ridglan Farms (Mount Horeb, WI). Los cachorros se dividieron aleatoriamente en dos grupos y se vacunaron.

11

Preparación de la vacuna

La vacuna monovalente OspA (denominada Ly) se preparó mediante dilución de una concentración madre de proteína purificada B31 OspA producida como en el Ejemplo 1. La concentración de la solución madre fue de 465 \mug de OspA/ml. La vacuna de Lyme se produjo mediante dilución de una concentración madre en diluyente estéril a una concentración de 10 \mug/ml de OspA y se alicuotó la vacuna en viales de monodosis y de dosis múltiple (1 ml y 10 ml respectivamente). La esterilidad de la vacuna se analizó y resultó satisfactoria.

Protocoles de vacunación

Los perros recibieron dos dosis de vacuna (1 ml/dosis) administrada subcutáneamente a un intervalo de tres (Grupo 1) o cuatro semanas (Grupo 2). Los signos de anafilaxia, incluyendo dificultad al respirar, picazón y edema se monitorizaron durante los 15 primeros minutos después de la inyección. Adicionalmente, los perros se observaron continuamente durante la primera hora después de la vacunación, y luego a intervalos regulares durante 14 días después de cada inyección. Los signos monitorizados incluyeron hinchazón, dolor, ablandamiento, y prurito en el sitio de la inyección. Antes de la administración de la segunda inyección, el sitio de la primera vacuna se palpó para conocer su hinchazón y sensiblidad.

Serología

Se realizó una extracción de sangre para la determinación del título antes de cada vacunación y a intervalos mensuales a continuación. Se determinaron los títulos de OspA mediante ELISA.

Estímulo

Todos los perros se monitorizaron con B. burgdorferi con garrapatas infectadas de forma natural, según el procedimiento de estímulo de Appel y col. El intervalo entre la vacunación final y el estímulo fue de 24 semanas para el Grupo 1 y de 21 para el Grupo 2. Las garrapatas se recogieron en el condado de Westchester, N.Y, un área endémica para la enfermedad de Lyme, y el estímulo se realizó según el procedimiento de Appel y col. La tasa de infección por B. burgdorferi de estas garrapatas fue del 60%.

Biopsia de piel y reaislamiento de espiroquetas

SE realizó una biopsia a todos los perros al mes y a los dos meses después del estímulo. La piel alrededor del sitio de ataque de la garrapata se rasó, se preparó con un algodón quirúrgico y Betadine, se anestesiaron con lidocaína al 2% inyectada intradérmicamente y se realizó una biopsia mediante una broca con un Baker Skin Punch. Las muestras de piel se colocaron en tubos con medio de cultivo (BK con suero de conejo inactivado por calor y antibióticos) y se transportaron al laboratorio. Los tubos se suplementaron con medio adicional y se colocaron en una palmatoria. Y ésta se incubó durante 6 semanas. Los tubos se examinaron semanalmente para la presencia de espiroquetas, con ayuda del microscopio de campo oscuro. Al menos 10 campos se examinaron con un objetivo de 40X antes de considerar que la muestra era negativa.

Signos y síntomas clínicos

Debido a la naturaleza variable de la enfermedad, no se esperan signos clínicos de la Enfermedad de Lyme canina (LD) después de la infección, por lo que la eficacia de las vacunas se valoró principalmente por el reaislamiento de espiroquetas Borrelia burgdorferi de muestras de biopsias de piel. Sin embargo, todos los perros fueron monitorizados por la aparición de signos indicativos de LD. Dolor y sensibilidad, temperatura, cojera, ataxia, depresión y anorexia son varios de los signos que se controlaron. Únicamente un 10-15% de perros infectados naturalmente con Borrelia burgdorferi presentó signos clínicos.

Resultados Seguridad de la vacuna

Todos los perros vacunados se monitorizaron para reaccione adversas (incluyendo anafilaxis) durante los primeros 15 minutos después de la vacunación y dos semanas después de cada vacunación. No se observaron reacciones adversas en ningún momento después de cualquier inyección de vacuna monovalente de Lyme. Adicionalmente, tampoco se observó hinchazón, dolor, sensibilidad o prurito en el sitio de la inyección durante las dos semanas después de la vacunación. Para los títulos de anticuerpo (véase Tabla 7).

El anticuerpo contra OspA se determinó mediante ELISA, cuyos valores se muestran en la Tabla 7. En el momento de las picaduras de garrapata, muchos de los perros vacunados con la vacuna monovalente (10 \mug de OspA) todavía presentaban títulos de OspA significativos. Un perro, no mostró una respuesta del anticuerpo significativa (FAS, del inglés Failed to Significant Antibody) contra OspA. El resultado de reaislamiento de espiroquetas se muestra en la Tabla 7.

Las biopsias de piel se realizaron para todos los perros al mes y a los dos meses después del estímulo. Las biopsias se cultivaron durante 6 semanas y se examinaron para reaislamiento de espiroquetas. Las espiroquetas se aislaron de 7 de los 12 perros controles en la primera biopsia (58%). Una muestra no pudo ser leída porque se perdió al cabo de 5 semanas en cultivo, debido a la contaminación.

Los resultados muestran que sólo dos perros vacunados con la vacuna monovalente de Lyme (HVT y DXT) fueron positivos para espiroquetas; una tasa de reaislamiento del 10%.

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Signos clínicos de la enfermedad de Lyme canina (véanse las tablas 6 y 7)

Cinco meses después del estímulo, 5 de los 13 controles no vacunados (39%) habían sufrido episodios atribuibles a LD; dos perros (HXT y JCT) habían padecido episodios múltiples. Uno de los 20 vacunados (5,0%) también experimentó un único episodio de cojera.

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Discusión

La eficacia de la vacuna se valoró mediante determinación de la capacidad de la vacuna para prevenir la diseminación de espiroquetas y de signos clínicos a corto plazo y la duración de ensayos de inmunidad. La LD en perros a menudo no aparece con el aspecto típico de una enfermedad clínica (Levy y Magnarelli, 1992, JAVMA, 200:344-347), en consecuencia además de referirse a los signos clínicos, la eficacia de la vacuna está basada en la capacidad de las preparaciones experimentales para prevenir la proliferación de espiroquetas, tal como se valoró por el reaislamiento de espiroquetas a partir de biopsias de piel. El reaislamiento de espiroquetas es el más importante y el más consistente, parámetro a considerar cuando se valora la eficacia de una vacuna. Si la vacunación disminuye o elimina esta diseminación, el animal no desarrollará signos clínicos. La vacuna de Lyme mostró una protección >90% en los receptores contra la proliferación de espiroquetas en un ensayo de eficacia a corto plazo tal como se discutió anteriormente. Durante este estudio de duración de la inmunidad (DOI), perros que fueron estimulados de 5 a 6 meses después de la vacunación, el 100% de los controles no tratados fueron positivos para espiroquetas en la fecha de la segunda biopsia. Por el contrario, las espiroquetas se aislaron de sólo dos de los vacunados (10%).

Los perros también fueron observados por su signos clínicos derivados de la infección. Las observaciones se reportaron por los cuidadores de animales sin conocimiento de su estado de vacunación. En el estudio de eficacia a corto plazo discutido anteriormente, el 25% de los controles no tratados demostraron signos típicos de la enfermedad de Lyme canina (LD), principalmente cojera, mientras que los vacunados no presentaron signos. En este estudio DOI seis de los perros no mostraron signos de la enfermedad; cinco eran controles no vacunados (39%) y un perro había sido vacunado (5%). El primer episodio de cojera se notó aproximadamente a los dos meses después del estímulo; a partir de entonces dos de los perros no tratados (JRT e IAT) presentaron episodios de recurrencia.

Un vacunado, HPS, se reportó con hinchazón y ligera cojera en la pata delantera derecha aproximadamente 2 meses después del estímulo. El animal no fue nunca positivo para aislamiento de espiroquetas, aunque los cultivos de dicho perro se examinaron específicamente teniendo en consideración el episodio de cojera. Es posible que este episodio no sea el resultado de LD canina, sino que sea atribuible a otras causas (trauma, etc.). Sin embargo, el perro se incluyó como positivo para signos clínicos con el fin de proporcionar un test lo más riguroso posible.

El título de anticuerpos mostró que todos excepto uno de los perros (FAS) vacunados con la vacuna monovalente se habían seroconvertido después de la vacunación, tal como se determinó por una diferencia en los títulos pre-sangrado y pre-estímulo de al menos dos diluciones. Ello representa una tasa de seroconversión del 95%. En el momento del estímulo, todos los vacunados excepto dos (FAS y HVT) todavía presentaban títulos significativos. Ninguno de los perros control mostró un aumento prolongado de los niveles de anticuerpo anti-OspA, aunque tres controles (HXT, JBT y JIT) tenían niveles bajos de anticuerpo reportados desde el sangrado anterior al estímulo.

La seguridad de la vacuna monovalente de Ly también se demostró por los resultados de este experimento. No se observaron efectos adversos en el tiempo de la vacunación, o en durante el período de las dos semanas siguientes a cada inyección. La dosis de 10 \mug de OspA fue bien tolerada por todos los cachorros. Ya que dicha vacuna no contiene adyuvante, incluso la respuesta granulomatosa moderada y transitoria característica de la vacunación con la mayoría de preparaciones adyuvantadas estuvo ausente.

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Conclusión Vacuna monovalente que contiene 10 \mug

OspA/dosis

*: es segura en cachorros de 9 a 10 semanas.

*: es muy antigénica e induce una seroconversión en el 95% de los receptores.

*: provoca una respuesta inmune que protege a los vacunados contra la infección de espiroquetas (90%) y los signos clínicos 5 a 6 meses después de la vacunación, cuando el 100% de los controles presentan infección por espiroquetas y el 39% presenta signos clínicos después de la picadura de garrapata.

Esta ejemplo también demuestra que la vacuna es protectora frente la enfermedad de Lyme durante una estación completa.

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TABLA 7 Resultados de los títulos de anticuerpos contra OspA, reaislamiento de espiroquetas y signos clínicos en el ensayo de duración de la inmunidad (DOI)

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TABLA 8 Signos clínicos de la Enfermedad de Lyme Canina en un estímulo al cabo de 5 meses

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Ejemplo 3 Formulaciones de composiciones de combinación que no presentan interferencia con la eficacia

Este ejemplo demuestra que no existe interferencia entre el moquillo canino por Adenovirus tipo 2-Coronavirus-Parainfluenza-Parvovavirus y el antígeno OspA de Borrrelia burgdorferi.

Abreviaciones

16

Estos componentes se prepararon a partir de virus vivos modificados (disponibles de Rhone Merieux, Inc., Athens, Georgia, U.S.A.). Las vacunas tenían la formulación siguiente de componentes.

17

La vacuna se preparó como dos componentes separados:

El primer componente fue el adenovirus tipo 2-Coronavirus-Parainfluenza-Parvovavirus_{XL} del moquillo canino, virus vivos modificados, denominados DACPIP_{XL}, que fueron liofilizados en un vial sin adyuvante. El segundo componente fue Borrelia brugdorferi. La proteína de membrana exterior B3 (OspA) se produjo mediante tecnología recombinante tal como se indica en el Ejemplo (denominada Ly) u OspA.

El segundo componente fue el componente líquido utilizado para rehidratar los componentes liofilizados de la vacuna antes de la inoculación. La fracción OspA no contenía ningún adyuvante.

La vacuna liofilizada DACPIPXL se analizó satisfactoriamente para identificar el virus y titularlo, para esterilidad, presencia de Mycoplasma, y seguridad. La pasta liofilizada se rehidrató ocn Ly, que contenía 3 \mug/ml de OspA. La vacuna OspA se analizó para su esterilidad.

La ausencia de interferencia del diluyente OspA en los componentes liofilizados de la vacuna se determinó in vitro mediante análisis vírico según las normas del Código de las Regulaciones Federales, 9 C.F.R. 3.35. La ausencia de interferencia de la fracción viral liofilizada con el diluyente de OspA se determinó mediante comparación de los títulos serológicos de perros vacunados con la vacuna de combinación (DACPiP_{XL} + OspA) con los títulos de perros vacunados con sólo la OspA (véase el Ejemplo 2).

Ya que DACPiP_{XL} + OspA fue el resultado de combinar dos vacunas que ya habían demostrado separadamente una eficacia amplia, sólo un número de perros se utilizó en el test de estímulo y se demostró que el componente viral liofilizado de la vacuna no interfiere con la protección inducida contra la Enfermedad de Lyme por la fracción OspA, y vice versa.

Veintidós perros escogidos aleatoriamente según edad, raza y sexo fueron estabulados juntos. Diez perros se vacunaron con la vacuna de combinación DACPiP_{XL}+OspA, cinco perros se vacunaron con OspA sólo (como en el Ejemplo 2), y cinco perros sirvieron como controles no tratados.

Los perros que recibieron dos dosis de vacunas (1 ml/perro), administrada subcutáneamente (SC) a un intervalo de tres por semana, según el esquema siguiente:

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Los perros se sangraron antes de cada vacunación (días 0 y 21), antes del estímulo (día 35) y antes de cada biopsia. Se detectó anticuerpo específico contra OspA mediante un test de ELISA. Se detectó anti-OspA en perros que recibían OspA o DACPiP_{XL} + OspA.

Después de la vacunación, todos los perros fueron observados inmediatamente para reacciones adversas, incluyendo anafilaxis. Adicionalmente, los perros se monitorizaron diariamente por los técnicos del estabulario para reacciones locales o sistémicas adversas provocadas por la vacuna, incluyendo fiebre, anorexia, vómitos o letargia. Antes de la segunda inyección, se palpó el sitio de vacunación anterior para explorar la presencia de cualquier reacción anormal, incluyendo formación de granuloma. No se observaron reacciones adversas.

Todos los perros se estimularon dos semanas después de la segunda vacunación con garrapatas infectadas de forma natural con Borrelia burgdorferi (véase el Ejemplo 2).

Las biopsias con troca de piel se obtuvieron de perros al mes, a los dos meses y a los tres meses después del estímulo. El material de biopsia se cultivó para reaislamiento de espiroquetas según el protocolo indicado en el Ejemplo 2.

Se valoró la ausencia de interferencia de la fracción viral liofilizada de la vacuna de combinación, con el diluyente de OspA, mediante comparación de la tasa de aislamiento de espiroquetas en los perros vacunados con la de los controles no tratados.

Para mostrar que la fracción de OspA no afectaba negativamente a los componentes virales liofilizados en la vacuna de combinación de Lyme, se realizaron test virulicidas. Todos los componentes se titularon después de la hidratación con Ly, y la titulación se comparó con una en la que los componentes se rehidrataron con agua estéril.

Interpretación de los resultados in vivo e in vitro

La eficacia de la vacuna de combinación se determinó in vivo mediante los títulos serológicos y por los resultados del reaislamiento de espiroquetas, y por los tests virulicidas in vitro. Los niveles del anticuerpo OspA y los resultados del reaislamiento de espiroquetas, en perros vacunados con la vacuna de combinación (DACPIPXL + Ly), se compararon con los observados en los perros vacunados con sólo Ly, y los niveles en controles no tratados.

La vacuna de combinación se consideró eficaz porque:

(1) Los niveles de anticuerpo en los vacunados con la combinación fueron similares a los niveles en perros que recibieron la vacuna Ly monovalente. Los niveles de anticuerpo en los vacunados fueron también significativamente superiores a los niveles en controles no tratados;

(2) el 100% de los perros vacunados fueron negativos para el reaislamiento de espiroquetas, mientras que el 80% (4/5) de los controles no tratados fueron positivos para espiroquetas; y

(3) No hubo pérdida en el título de virus cuando la pasta viral liofilizada se rehidrató con el diluyente Ly en comparación con el agua estéril.

Los resultados se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9

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\quad: * Todos los perros recibieron dos vacunaciones subcutáneas, a un intervalo de tres semanas.

\quad: Ly = OspA Lyme; DACPiPXL = moquillo canino, adenovirus, corona, parainfluenza, y parvovavirus, vacuna viva modificada.

\quad: Valores >50 = niveles de anticuerpo OspA significativos.

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Ejemplo 4 Eficacia de las vacunas OspA en caballos

Se utilizaron 10 caballos para este estudio. Sus números son el 74, 75, 76, 77, 93, 95, 96, 97, 98 y 99.

Se utilizaron vacunas monovalentes (denominadas Ly; 100 \mug/dosis de OspA; y 30 \mug/dosis, se generaron por tecnología recombinante tal como se describe en el Ejemplo 1 (B31). La vacuna de combinación (denominada rabia/Ly) consiste en Imrab (disponible de Roche Merieux, Inc., Athens, Georgia() más 30 \mug/ml de B31 OspA tal como se preparó en el Ejemplo 1 (B31).

Todos los caballos se vacunaron intramuscularmente (IM) con dos dosis de vacunas, proporcionadas a un intervalo de dos semanas, según el protocolo siguiente:

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Los caballos se sangraron antes de cada vacunación y al cabo de una, dos o tres semanas de la segunda vacunación. Los resultados serológicos se determinaron mediante ELISA (tal como se modificó por la utilización de antisuero de caballo). Los títulos de anticuerpo contra la rabia se determinaron en los caballos vacunados con la combinación, dado que los resultados de la serología de OspA fueron alentadores.

Todos los caballos se observaron durante 30 minutos a una hora después de cada vacunación por signos característicos de anafilaxia. Después del periodo inicial de observación, se chequearon los sitios de vacunación antes de la administración de la segunda vacunación por la aparición de reacciones locales a la inyección (bultos, etc.). Adicionalmente, cada caballo se inspeccionó diariamente para analizar la aparición de reacciones adversas de la vacuna (fiebre, depresión, anorexia, etc.). Todas las observaciones diarias continuaron hasta una semana después de la vacunación final. No se observaron reacciones adversas.

La eficacia de las vacunas se valoró analizando los niveles de anticuerpos anti-OspA en los caballos vacunados y comparándolos con los niveles del pre-sangrado.

Los resultados se muestran en la Tabla 10. Estos resultados indican que los caballos pueden estar protegidos contra la enfermedad de Lyme bien por la vacuna OspA monovalente como por la multivalente; y que al igual que con la vacuna multivalente, no se observó interferencia con la eficacia.

TABLA 10

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\quad: * Todos los caballos recibieron dos inyecciones intramusculares, a un intervalo de tres semanas. Imrab= vacuna de la rabia inactivada con adyuvante comercial.

\quad: n.b. = no son grado; valores >50 indican unos niveles de anticuerpo OspA significativos.

Ejemplo 5 Lyme canina: seguridad, eficacia y ausencia de interferencia de una vacuna de combinación Lyme

Este ejemplo evalúa además la seguridad, la eficacia y la ausencia de interferencia de una vacuna de combinación de Lyme (recDACPiP_{XL} + OspA).

Treinta y cuatro (34) beagles se dividieron aleatoriamente en dos grupos (22 vacunados y 12 controles). Los vacunados recibieron dos dosis de una vacuna de combinación (reCDACPiP_{XL} + OspA) subcutáneamente, mientras que los controles se vacunaron con los componentes virales sólo (reCDACPiP_{XL}). Todos los perros se estimularon 7 semanas después de la segunda vacunación con garrapatas infectadas naturalmente. Los perros se analizaron para anticuerpos OspA a intervalos regulares mediante serología de ELISA. Para confirmar la eficacia de la vacunación contra Borrelia burgdorferi, se realizó una biopsia a los perros y se cultivaron las muestras de piel para reaislamiento de espiroquetas. Adicionalmente, se realizaron ensayos para la ausencia de interferencia y ensayos viricidales para confirmar que el diluyente de OspA no tenía efectos deletéreos sobre los componentes de la vacuna vírica.

* Seguridad: no se hallaron reacciones locales o generalizadas adversas en ningún momento después de la inyección.

* Resumen de la eficacia:

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TABLA 11

26

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Por ello, la vacuna de combinación Lyme (recDACPiP_{XL}+OspA):

*: es segura en cachorros de 8 a 10 semanas;

*: es muy antigénica e induce la seroconversión OspA en el 100% de los perros vacunados;

*: protege los vacunados contra la infección por espiroquetas y la diseminación después de la picadura de garrapatas naturales (estímulo); y

*: no interfiere con los componentes de la vacuna viral tal como se demostró por el análisis de ausencia de interferencia in vivo o por los ensayos virucidales in vitro.

Abreviaciones utilizadas Componente de la vacuna Abreviación

Proteína A de la superficie externa de Borrelia burgdorferi (OspA) OspA

(véanse los Ejemplos anteriores)

Virus del moquillo canino; Vector Canarypox (recCDV): D

Adenovirus tipo 2 canino (CAV2): A

Virus Parainfluenza canino (CPi): Pi

Parvovavirus canino (P_{XL}): P_{XL}

Coronavirus canino (CCV): C

Una vacuna de combinación, que podría inmunizar perros contra la enfermedad de Lyme y que proporciona simultáneamente protección contra otros patógenos caninos, podría ofrecer una importante alternativa veterinaria para la profilaxis de enfermedades infecciosas.

El presente estudio se realizó para determinar la seguridad, la eficacia y la ausencia de interferencia de la vacuna de combinación de la invención. La vacuna de combinación se compuso de un diluyente de OspA (denominado OspA) y una pasta viral liofilizada que contenía el virus del moquillo canino-Adenovirus tipo 2- Coronavirus-Parainfluenza-Parvovavirus (denominada recDACPiP_{XL}).

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Material y métodos Animales

Treinta y cuatro cachorros Beagle (de ambos sexos; 8 semanas de edad; negativos para anticuerpos contra Lyme (Borellia burgdorferi) y Leptospira) se obtuvieron de Ridglam Farms (Mount Horeb, WI). Los cachorros se dividieron aleatoriamente en dos grupos y se vacunaron de la manera siguiente:

27

Preparación de la vacuna: La vacuna OspA se obtuvo como en el Ejemplo 1. El componente viral liofilizado se obtuvo como una serie pre-licencia. Las titulaciones de la pasta liofilizada fueron las siguientes:

28

Protocolo de vacunación: los perros recibieron dos dosis de cada vacuna (1 ml/dosis) subcutáneamente a un intervalo de tres semanas. Se analizaron los signos de anafilaxia, incluyendo dificultada al respirar, picazón y edema durante los primeros quince minutos después de la inyección. Adicionalmente, los cuidadores de los animales observaron los perros continuamente durante la primera hora después de la vacunación, y luego a intervalos diarios durante 14 días después de cada inyección. Los signos monitorizados incluyeron hinchazón, dolor, sensiblidad y rascado en el sitio de la inyección. Antes de la administración de la segunda inyección, el sitio de la primera vacunación se palpó para conocer el estado de hinchazón y sensiblidad.

Serología

Se tomó una muestra de sangre para serología antes de cada vacunación y a intervalos de un mes a continuación. Los títulos de OspA se determinaron mediante ELISA.

Análisis de Ausencia de interferencia: Para demostrar una ausencia de interferencia del diluyente OspA sobre los componentes virales en la vacuna de combinación, se determinaron los títulos de neutralización del suero y el GMT para el Grupo I (vacunados con recDACPiP_{XL} + OspA) comparado con los títulos en el Grupo II (vacunados con recDACPiP_{XL} sólo).

Análisis virucidal in vitro: Para demostrar que el diluyente OspA no interfiere con los títulos de los componentes víricos en la vacuna de combinación, se realizó un análisis virucidal in vitro según las normas 9CFR (113.35).

Estímulo, picadura de garrapata: Para verificar que los componentes virales no interfieren con la protección provocada por la fracción OspA de la vacuna de combinación, todos los perros se estimularon con B. burgdorferi 7 semanas después de la vacunación. Este estímulo utilizó garrapatas infectadas de forma natural recogidas en el área endémica de la Enfermedad de Lyme. La tasa de infección de Borrelia burgdorferi de estas garrapatas se determinó en un 60%.

Biopsia de piel y reaislamiento de espiroquetas

A todos los perros se les realizó una biopsia al mes y a los dos meses después del estímulo. La piel alrededor del sitio de adhesión de la garrapata se rasuró, se preparó con un algodón quirúrgico impregnado de Betadine, se anestesió con lidocaína al 2% inyectada intradérmicamente y se realizó una biopsia con troca con un Baker Skin Punch. Las muestras de piel se colocaron en tubos con medio de cultivo (medio BSK con suero de conejo inactivado por calor y antibióticos) y se transportó al laboratorio. Los tubos se suplementaron con medio adicional y se colocaron en una palmatoria. El bocal se incubó durante 6 semanas. Los tubos se examinaron semanalmente para la presencia de espiroquetas, utilizando un microscopio de campo oscuro. Se examinaron como mínimo 10 campos con un objetivo de 40X antes de considerar que la muestra era negativa.

Seguridad de la vacuna: Todos los perros vacunados se monitorizaron para reacciones adversas (incluyendo anafilaxia) durante los primeros 15 minutos después de la vacunación por el PI, y durante los siguientes 14 días después de la vacunación por los cuidadores de los animales. No se observaron reacciones adversas en ningún momento después de la vacunación con la vacuna de combinación de Lyme. Adicionalmente, no se demostró hinchazón, dolor, sensibilidad, o prurito en el sitio de la inyección durante las dos semanas siguientes a la vacunación.

Títulos de anticuerpo OspA (véase Tabla 12): El título del anticuerpo contra OspA se determinó mediante ELISA. Se obtuvo sangre el día 0 (presangrado: antes de la administración de la primera vacunación); día 14 (antes de recibir una segunda vacunación); día 42 (antes del estímulo); y a continuación a intervalos mensuales.

La Tabla 12 muestra los valores del ELISA. Después de la primera vacunación, 12 de los 21 sangrados vacunados se habían seroconvertido, tal como se determinó por un aumento de los niveles de anticuerpo OspA de al menos cuatro veces. Dos semanas después de la segunda vacunación, los 22 perros (100%) vacunados sólo con recDACPiP_{XL} se había seroconvertido a OspA. La mayoría de los vacunados todavía presentaban títulos de anticuerpo OspA significativos antes del estímulo (19/22 = 86,4%). Ninguno de los controles, vacunados sólo con recDACPiP_{XL}, presentaron un respuesta serológica contra el antígeno OspA.

En ambos grupos, los niveles de anticuerpo se elevaron muy poco después del estímulo con garrapatas. El anticuerpo OspA no se expresa en humanos con la Enfermedad de Lyme hasta mucho más tarde durante el curso de la enfermedad y parece ser que lo mismo ocurre en los cánidos con infección natural.

Análisis de la ausencia de interferencia (véase Tabla 13)

Se obtuvo suero de perros el día 0 (antes de la primera vacunación) y el día 35 después de la vacunación. Los títulos de neutralización de suero de los antígenos virales en la vacuna de combinación se determinaron para cada perro en ambas fechas. Los títulos de la media geométrica (GMT) y la desviación estándar (SD) se calcularon para el grupo de vacunados sólo con recDACPiP_{XL} y se compararon con GMT del grupo que recibió la vacuna de combinación Lyme (recDACPiP_{XL +} OspA).

Los cachorros utilizados en este estudio fueron negativos para la vacunación o exposición a Lyme o Leptospira, pero fueron criados en condiciones Específicas Libres de Patógenos. En consecuencia, los resultados del presangrado el día 0 mostraron títulos contra los componentes virales en las fracciones liofilizadas de la vacuna. Después de la vacunación, los títulos de todos los componentes fueron elevados tal como se esperaba.

La comparación de los títulos individuales (analizados utilizando el test de la t de estudent, con p<0,05 considerada como significativa) no mostraron diferencias en los títulos neutralizantes del suero en los perros vacunados con recDACPiP_{XL} + OspA en comparación con los títulos de los que recibieron recDACPiP_{XL}. En consecuencia, no hay una interferencia significativa del diluyente OspA sobre cualquiera de los componentes virales de la vacuna.

Análisis Virucidal in vitro (véase Tabla 14): El análisis virucidal in vitro comparó los títulos para cada uno de los componentes de la vacuna viral rehidratada con el diluyente OspA con los títulos determinados cuando la vacuna se rehidrató con agua estéril. La comparación de estos títulos mostró que la variación se hallaba dentro de los límites aceptables para cada uno de los componentes virales en la vacuna de combinación de Lyme (inferior a una diferencia de 0,5 log en el título).

Reaislamiento de espiroquetas (véase la Tabla 15): Se realizaron biopsias de piel a todos los perros al cabo de 1 mes y 2 después del estímulo. Las biopsias se cultivaron durante 6 semanas y se examinaron para el reaislamiento de espiroquetas. Los resultados mostraron que sólo un perro vacunado con la vacuna Lyme de combinación (XBY) fue positivo para espiroquetas (4,5%), y que el perro fue únicamente positivo en la fecha de la primera biopsia. Ninguno de los 22 perros vacunados con recDACPiP_{XL} + OspA fue positivo para espiroquetas en la segunda biopsia (0%).

Las espiroquetas se reaislaron a partir de muestras de biopsias de tres de los 12 perros controles al mes después del estímulo (25%), mientras que 9 de los controles fueron positivos en la segunda biopsia (75%).

La Enfermedad de Lyme (LD), causada por la espiroqueta patogénica Borrelia burgdorferi es generalmente la enfermedad causada por garrapatas más común en humanos. Además, la LD canina se ha reportado más frecuentemente ya que entre los veterinarios se ha aumenta la toma de conciencia de la infección en perros.

Se sabe que una de las proteínas principales de superficie externa de Borrelia burgdorferi, denominada OspA, es un inmunógeno potente y proporciona protección contra la infección por espiroquetas en diversos animales. La proteína OspA purificada producida en cantidades grandes mediante tecnología recombinante, es también la base de las vacunas humanas que se desarrollan actualmente en ensayos clínicos.

Una vacuna de combinación, que pudiera inmunizar los perros contra la enfermedad de Lyme y proporcionara simultáneamente protección contra otros patógenos caninos, podría ofrecer a los veterinarios una alternativa importante para la profilaxis de la enfermedad infecciosa.

El propósito de este Ejemplo fue determinar la eficacia, la seguridad y la falta de interferencia de dicha vacuna de combinación. La vacuna contenía una pasta viral liofilizada que incluía el virus del moquillo canino-Adenovirus tipo 2-Coronavirus-Parinfluenza-Parvovavirus (denominado recDACPiP_{XL}) y que fue rehidratada con un diluyente OspA. Veintidós cachorros se vacunaron con la vacuna de combinación (recDACPiP_{XL} + OspA), mientras que 12 controles se vacunaron con la pasta viral liofilizada rehidratada con agua estéril (recDACPiP_{XL}). Todos los cachorros recibieron dos vacunaciones subcutáneas, tres semanas después, y a continuación fueron estimulados con garrapatas infectadas por Borrelia burgdorferi.

El modelo de estímulo natural por garrapatas se utilizó en este Ejemplo. Después del estímulo, se realizó una biopsia a todos los perros el primer y el segundo mes después del estímulo y las muestras se cultivaron para el aislamiento de espiroquetas. Los resultados mostraron que únicamente uno de los cachorros vacunados con la vacuna de combinación de Lyme fue transitoriamente positivo para el aislamiento de espiroquetas, ya que este perro, y todos los cachorros vacunados con la vacuna de combinación, fue negativo para la diseminación de espiroquetas en la segunda biopsia. Por el contrario, las espiroquetas se aislaron del 75% de los perros vacunados con sólo recDACPiP_{XL} en la fecha de la segunda biopsia.

Los resultados del anticuerpo OspA se determinaron para todos los tipos de perros. Todos los cachorros vacunados con la vacuna de combinación (recDACPiP_{XL} + OspA) se seroconvirtieron después de recibir dos inyecciones, aunque ninguno de los controles mostró un aumento en los niveles de anticuerpo OspA después de la vacunación con sólo los componentes virales liofilizados.

Los títulos de los animales controles, que mostraron estar infectados mediante biopsia, no aumentaron significativamente después del estímulo por garrapatas. En humanos, se sabe que los anticuerpos OspA no están presentes en la Enfermedad de Lyme; los resultados de este estudio indican que ello puede también ser el caso en la infección canina.

La seguridad de la vacuna de combinación OspA también se demostró mediante este estudio. No se observaron reacciones adversas locales o sistémicas en ningún momento de la vacunación, ni durante las dos semanas siguientes a cada inyección.

Vacuna de combinación Lyme de la invención (recDACPiP_{XL} + OspA)

*: Es segura en cachorros de 8 a 10 semanas;

*: protege a los vacunados contra la infección y diseminación de espiroquetas después de un estímulo natural por picadura de garrapatas, tal como se demostró mediante reaislamiento de espiroquetas; y

*: no interfiere con los componentes virales de la vacuna liofilizada tal como se demostró mediante el análisis in vivo de ausencia de interferencia y los ensayos virucidales in vitro.

TABLA 12 Resultados de los títulos de anticuerpo contra OspA

280

TABLA 13 Niveles de anticuerpos del suero: ausencia de interferencia del diluyente Lyme sobre los componentes virales de una vacuna de combinación

30

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TABLA 14 Títulos de componentes virales liofilizados con o sin diluyente Lyme (Efecto virucidal)

32

TABLA 15 Resultados de la seroconversión OspA y del reaislamiento de Espiroquetas después del estímulo

33

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado al compilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones, por lo que la EPO declina cualquier responsabilidad a este respecto.

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Claims

1. Composición inmunológica que comprende un antígeno OspA purificado y aislado de Borrelia burgdorferi o un vector que lo exprese y al menos un antígeno adicional de un patógeno de mamífero distinto al de Borrelia burgdorferi, o un vector que exprese al menos un antígeno adicional, y opcionalmente un vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable;

en donde, el antígeno adicional es un antígeno de adenovirus;

o en donde, el antígeno adicional es una combinación de un antígeno del moquillo canino, un antígeno adenovirual, un antígeno de coronavirus, un antígeno de parainfluenza, y un antígeno de parvovavirus.

2. Composición inmunológica que consiste en un antígeno OspA de Borrelia burgdorferi purificado y aislado o un vector que exprese el antígeno y un antígeno de la rabia o un vector que exprese dicho antígeno.

3. Composición inmunológica según la reivindicación 2, en donde dicha composición consiste además en un vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

4. Composición inmunológica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el OspA purificado y aislado es un OspA lipidado purificado y aislado que esencialmente está desprovisto de lipopolisacáridos y esencialmente está desprovisto de otras proteínas bacterianas.

5. Composición inmunológica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la cual no contiene ningún adyuvante intensificador de la inmunogenicidad.

6. Composición inmunológica según cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 o 5, en donde al menos un antígeno adicional es un virus vivo modificado.

7. Composición inmunológica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para utilizar como un medicamento.

8. Composición inmunológica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de Lyme.

9. Utilización según la reivindicación 8, en donde dicho medicamento es para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de Lyme en perros, cachorros y/o caballos.