HU228709B1 - Lyme combination compositions and uses - Google Patents

Description

A találmány tárgyát Lyme-kór elleni (Sorrelia bargdorZerí antigén) készítmények képezik, közelebbről kombinációs készítmények, valamint ezek előállítása és alkalmazásai, közelebbről állatgyógyászati alkalmazásai.

A találmány szerinti készítmények a Sörrelia burgdorf'eri antigén vagy antigének mellett tartalmazhatnak más patogénnek megfelelő antigént is, például kutya, ló vagy macskaféle-patogénnek megfelelő antigént, így például az alábbiak közűi legalább egyből származó antigént: veszettség vírusa, kutya szopornyica vírus, adenovírus, koronavírus, parainfiuenza vírus, parvovírus, Fe.LV, macskafélék herpeszvírusa, lő influenza vírus, lő herpeszvírus és más hasonlók,

A találmány szerinti készítmények előnyösen immunológiai választ indukálnak Lyme-kóros (Sorrelía burgdor.fe.ri) fertőzések ellen, valamint a készítményben található bárAktaszámunk: 9QS80-2709/PÁ mely más antigén ellen amikor gazdaszervezetnek beadjuk. A készítmények hosszú időtartamú immunitást (választ) hoznak létre Lyme-kórt okozó Sörrelϊa burgdorf'eri ellen állatokban# beleértve lovakat és kutyákat# és védelmet biztosítanak vagy immunológiai választ hoznak létre az állatokban. A találmány szerinti kombinációs készítményekben nem alakul ki a hatékonyságot befolyásoló interferencia.

A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások ilyen készítmények előállítására és alkalmazására.

A találmány tárgyát képezik továbbá a készítmények által kiváltott antitestek# amelyeket a különböző eseteknek megfelelően állatból vagy sejttenyészetből izolálunk# amelyek alkalmazhatók diagnosztikai reagenskészlet, teszt vagy vizsgálati eljárás létrehozására# amely alkalmas Bőrrel!a burgdorferi antigén vagy Lyme-kór kimutatására vagy további patogén további antigénjének kimutatására vagy további patogén kimutatására.

A leírásban az 5#582#930 és 5#523#089 lajstromszámú US szabadalmakra és a PCT/US95/0768b# PCT/US32/G8972# W093/08306# WO93/08299# PCT/VS92/08897, PCT/ÜS95/07709# WO35/35119 és WO9O/O4411 azonosítási számú szabadalmi bejelentésekre és közzétételi iratokra hivatkozunk# ezek mindegyike teljes egészében a kltanitás részeként tekintendő. A leírásban számos egyéb dokumentumot is idézünk - esek elérhetőségét pontosan megadjuk# ahol említésre kerülnek vagy a szabadalmi igénypontokat megelőző ”Irodalomjegyzék” részben - és az idézett dokumentumok teljes egészükben a kltanitás részének tekintendők.

A Lyme-kór több rendszerben fellépd betegség, amelyet sz Txodes ricinus komplexbe tartozó kullancsok közvetítenek. A Lyme-kór etiológiaí ágense a Borrelia burgdorferi spírocéta sensu lato, amely kór jelenleg a leggyakrabban előforduló Ízeltlábúak hordozta betegség az Egyesült Államokban és endémikus Kőzép-Eurőpában (Barbour és mtsai.: (1993)) . Bár korai szakaszaiban antibiotikum kezeléssel gyógyítható, ha a Lyme-kórt hagyjuk előrehaladni, szív, neurológiai és izületi rendellenességek léphetnek fel. Jelenleg vizsgálatok vannak folyamatban a Lyme-kór elleni humán vakcina kifejlesztésére. Ilyen vakcina kifejlesztésére a Borrelia burgdorferi OspA külső felületi lipoproteinje a jelenlegi fő molekula jelölt. A rekombináns OspA lipoproteinről (rOspA) ismert, hogy védőhatású immunválaszt vált ki egerekben fertőző B. burgdorferi mikroorganizmussal történő összehozás hatásával szemben [Fikrig és mtsai.: (1990); Érdile és mtsai.: (1993); USSN 08/373,455). Az OspA jelenleg külső humán kipróbálás alatt van az Egyesült Államokban, mint szubkután beadható vakcina [Keller és mtsai,:

(1994)).

A NO93/08299 és FCT/ÜS92/Ö869? fentebb idézett szabadalmi bejelentések tárgyát rekombináns OspA (rOspA.) vakcinák képezik, közelebbről lipídezett rOspA képezi, valamint OspA-fc kódoló DBS expressziójára szolgáló eljárások és a lipídezett rOspA izolálására szolgáló eljárás képezi, A fentebb idézett 5,582,990 és 5,523,089 lajstromszámú U5 szabadalmak és a KO90/04411 szabadalmi bejelentés tárgyát

OspA-t kódoló DNS képezi, továbbá az OspA aminosav szerven ** cíája * beleértve az rOspA-t és azoknak lipidezett formáit - szintetikus OspA - beleértve as rOspA-t és azoknak lipídezett formáit - és OspA-t vagy szintetikus OspA-t tartalmazó készítmények képezik, valamint az ilyen készítmények alkalmazáséra szolgáló eljárások képezik. Továbbá a többi fentebb idézett szabadalmi bejelentés tárgyát olyan DNS képezi, amely más Sörrella antigéneket vagy más Osp-kat kódol, vagy olyan DNS képezi, amely OspA vagy más Osp-ok alkalmazható fragmenseít kódolja, azok amínosav szekvenciái képezik, olyan készítmények képezik, amelyek ilyen fragmenseket vagy más Osp-kat tartalmaznak, valamint az ilyen készítmények alkalmazására szolgáló eljárások képezik. Az itt idézett dokumentumokban leírt, Sörrel í a burgdorf'eri-hez kapcsolódé DNS alkalmazható az 5,582,990 és 5,523,089 lajstromszámű US szabadalmak vagy a WO9G/04411 szabadalmi, hej elöntés szerinti eljárásokban OspA, más Sörrelia antigének vagy Osp-k, vagy azok fragmenseínek termelésére, a találmány szerinti alkalmazásokra. A találmány szerint alkalmazható DNS és antigénekkel kapcsolatban a következő publikációra hasonlóképpen hivatkozunk: Moiecular Mierobíology 3 479 (1989}].

A technika állása szerint speciális problémát jelent háziállatok fertőződése Sörrelia burgdorferi-vel kullancs csípésektől. így például a kutyák és a lovak fogékonyak a kullancs csípések következtében Lyme-kórra és gazdáik nem veszik észre a fertőződést mígnem tűi késő (az egyértelmű körkörös gyűrű a kullancs csípés helyén nem vehető észre a szőr miatt és a kutya vagy a ló képtelen szóban kifejezni » ¢4 ♦ * ♦ ♦ » *** *

X * *

J. »» * >r X « « » * * * olyan# a fertőzésből eredő panaszokat# Mint például fájdalmas Ízületek# stb.# vagy az olyan gazdák esetében is észrevehetetlen# akik nem figyelnek fel a betegség halvány jeleire állatokban). További aggódásra ad okot az emberekre történő lehetséges átvitel.

A technika állása szerint további problémát jelentenek a vakcínálási stratégiák. Közelebbről# amikor háziasított állatokat oltunk be# előnyös többféle antigén bejuttatása egyetlen. ^fikoktélban” vagy multivalens készítményben; ezzel például csökkentve az oltások számát és csökkentve az állatorvos felkeresésének gyakoriságát.

Jelenleg nem ismert vagy nem áll rendelkezésre Lyme-kór kombináció vagy koktél” vagy multivalens vakcina vagy immunológiai vagy immunogén készitmény (Borrelia burgdorferi antigén más antigénekkel kombinációban egy készítményben, közelebbről meghatározva kutyák számára)„

A technika állása szerint egy még további problémát képez - különösen a multivalens készítmény vonatkozásában - a hatékonysági interferencia”# nevezetesen egy vagy több antigén kudarca kombinációs készítményben abban, hogy fenntartson vagy elérjen bizonyos hatékonyságot. Feltételezhetően ez betudható a beadott antigénnek a többi antigének jelenlétének következtében létrejövő interferenciájával az adott antigén immunológiai# antigén# antitest vagy védőhatásü válasz stimulálásáhan a gazdaszervezetben# például kutyában . szettség interfér így például más antigénekkel kombinációban a elleni antigének interferenciát szenvednek éneiét okoznak immunológiai# antigén# antitest vevagy vagy δ

X XX

X X * X # * *

X « χ« *

«XX

X * * védőhatású válásζ stimulálásában az ilyen készítményben jelen levő további antigénekkel szemben, közelebbről meghatározva amikor a készítményt kutyáknak beadjuk. Még közelebbről meghatározva antigének, mint például veszettség antigének és Leptospira antigének, amikor egy vagy több további antigénnel kerülnek beadásra, interferenciát hozhatnak létre azon antigének által kiváltott válasszal. Valóban, a Leptospíra antigének okozhatnak interferenciát OspA-val szemben. Azonban más gazdaszervezetek esetében - mint például macskák - ismertek kombinációs vakcinák< Talán - anélkül, hogy bármely egyedüli elmélethez kötődjünk - a hatékonysági interferencia” a kutya biológiai rendszerének valamely különlegességének tudható be, vagy a kutya biológiai rendszere reakciójának tudható be jelenleg ismert, antigénekkel vagy azok kombinációjával szemben.

Az elmélettől függetlenül a feltaláló ismeretei szerint mindmostanáig nincs további olyan, ismert antigén készítményekkel kombinált Lyme-kór kombináció - közelebbről kutyákban történő alkalmazásra - amely nem mutat hatékonysági interferenciát. Szükség van tehát Lyme-kór elleni kombinációra, közelebbről meghatározva kutyákban történő alkalmazáshoz. Valóban meglepő, váratlan és nem-nyilvánvaló azon ké»: pesség, hogy Lyme-kór kombinációs (más antigénekkel) készítményt alakítunk ki, amely kutyákban nem mutat hatékonysági interferenciát, közelebbről meghatározva azért, mert ahogy ezt a jelen ismereteink és a hatékonysági interferencia mutatja, nem kombinálhatunk egyszerűen ”antigén készítményeket”, hogy alkalmazható kombinációt vagy ”koktél” készitményt hozzunk létre,

Továbbá előnyös lenne# ha egy ilyen Lyme-kór antigén koktél készítmény hosszú távú védelmet biztosíthatna a kutyák számára és hasonlóképpen védelmet biztosíthatna a kölykök számára a Lyme-kór elleni anyai immunitással. Ahogyan ez a szakember számára egyértelmű# az anyai immunitás *# * *·

X ♦« * olyan immunitás# amelyet az újszülött a szülés előtt ésZvagy szopás útján anyjától szerez# amely immunitás egy bizonyos időtartam után az újszülöttben lecsökken# Így tehát az újszülöttet védelem nélkül hagyja. Továbbá az anyai antitestek jelenléte az újszülöttben megakadályozza, hogy az újszülöttben védőhatású válasz jöjjön létre# amikor annak antigén készítményt - azaz vakcinát - beadunk# ezzel azt jelentve, hogy az újszülött keresztül kell menjen nem létező, vagy kismértékű immunitás egy szakaszán - azaz az újszülött veszéllyel szembeni fogékonyságát jelenti - mielőtt antigén vagy vakcina készítmény beadását megfontolhatjuk. Az anyai immunitás kérdésében az 5,338,683 iajstromszámú US szabadalomra hivatkozunk (megadás dátuma; '1994. augusztus .16,)# amely teljes egészében a kltanitás részének tekintendő.

így tehát alternatív vakcinaiásí stratégiákra van szükMég előnyösebb, meglepőbb és váratlanabb az# amikor a Borreiia burgdorferi antigén rekombináns antigén - amely alkalmazható szitmény nem.

alkalmazható kombinációs koktél* készítményben, amely kémutat hatékonysági interferenciát kutyákban iiven készítménvhen más oazdaszervezetek ess8

X «♦* * * * * * * * * ♦ * «

XX *» * ♦ « ít 4 * χ *» X * χψ *· > ♦ ♦ χ * X ♦ * χ *** tében, mint például macskafélék, lovak és más hasonlók, és amely hosszú távú védelmet biztosit kutyákban és hasonlóképpen kölykökben az anyai immunitásnak megfelelően.

Közelebbről, ismereteink szerint mindmostanáig nem került publikációra vagy nem javasoltak a technika állása szerint olyan kombinációs készítményt, amely Borrelia burgdorferi antigént, például OspA-t tartalmaz, emlős gazdaszervezetnek történő beadásra ~ közelebbről háziasított állatoknak, mint például kutyáknak, macskáknak, lovaknak történő beadásra, amelyek fogékonyak Lyme-kórra; közelebbről meghatározva a találmányi szerinti kombinációs készítményt »

Bemutatjuk, hogy monovalens Lyme-kór elleni (Borrelia burgdorferi) vakcinával (elnevezése Ly) történő immunizálás biztonságos és hatékony kutyákban, ahogyan ez meghatározható mind szerokonverziós arány és Borrelia burgdorferi fertőzéssel szemben nyújtott védelem alapján.

Tanulmányok segítségével most már kimutatták, hogy 10 pg/ml OspA-t tartalmazó Lyme-kór vakcina (előállítása a WO93/0B2S9 azonosító számú közzétételi, irat valamint az 5,582,990 és 5,523,089 lajstromszámú USA-beli szabadalmak alapján, amelyek teljes egészükben a kitanltás részének tekintendők) kutyákban jelentős mértékű védelmet biztosit kullanccsal történő összehozás esetén, amely értékelhető mind a spirocéta proliíerácio csökkenése alapján és klinikai betegség megelőzése alapján. Továbbá ez a vakcinaindukálta immunitás még a vakcináiás után öt-hat hónappal végrehajtott, antigénnel történő összehozás esetén ís je9

X *« * * *

lentős mértékű, A monovalens vakcináról azt is kimutattuk, hogy különlegesen biztonságos; a Lyme-kór klinikai tüneteit mutató kutyák esetében nem tapasztaltuk a betegség súlyosbodását, amikor az OspA vakcina ismételt, magas dózisaival oltottuk be az állatokat.

Azonban a technika állása szerint egy még jelentősebb előrelépés lehetne biztonságos és hatékony kombinációs Lyme-kór vakcina előállítása. Jelentősebb előrelépés lenne az OspA vakcina interferencia mentessége, amikor más kutya antigénekkel együtt kerül beadásra. Az itt ismertetett eredmények bemutatják, hogy szubkután vakcináiások - időközükkel beadva - jelentős mértékű szerokonverziőt eredményeznek. Az ezen beoltottakban indukált antitest szintje hasonló azokhoz, amelyeket a monovalens vakcinát kapott kutyákban figyeltek meg; olyan szintek, amelyekről, kimutatták, hogy a beoltottakat hosszú távon védeni képesek Borrelia-fertőzött kullancsok alkalmazásával, antigénnel történő összehozás hatásával szemben.

Mivel bizonyíték van arra, hogy a lovak természetes körülmények között ügyszintén fogékonyak Sörrelía hürgdor.fsr.i fertőzésre, az is jelentős előrelépés ienhetne, ha ló Lymekór vakcinákat lennénk képesek előállítani, amely vakcinák jelentős mértékű Borral!a öurgdoríeri antigén, mint például OspA elleni antitest termelést hoznak létre lovakban.

A találmány tárgyát képezi továbbá kombinációs Bőrrel!a burgdo.rfer! - mint például OspA - vakcina biztosítása vagy antigén sajátosságú készítmény, közelebbről meghatározva olyan készítmény létrehozása, amely védelmet Indukál ku10 ί # ♦ * * ♦ fr?* « ♦ tyákban# lovakban vagy más háziasított állatokban,

A találmány tárgyát képezi továbbá még kombinációs Lyme-kór vakcina illetve immunológiai vagy antigén sajátosságú készítmény létrehozása# amelyben nincs jelentős mértékű hatékonysági interferencia az antigének között a kombinációban .

A találmány tárgyát képezi továbbá még Lyme-kór vakcina illetve immunológiai vagy antigén sajátosságú készítmény létrehozása szerológiai válasz kiváltásához kutyákba# io~ vakba vagy más háziasított állatba történő beadás következtében.

Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi immunológiai# antigén sajátosságú vagy vakcina készítmény# amely izolált# tisztított Sorrelia huirgdorX'ez'i antigént tartalmaz# legalább egy további Borrelía hargdor/eri-tői különböző# emlőspatogén antigénjét tartalmazza és adott esetben gyógyászatilag vagy állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz.

A készítményben az izolált# tisztított Sörrelía burg<lo.r.feri antigén tartalmazhat izolált# tisztított OspAt.

Továbbá a készítményben az izolált# tisztított OspA. izolált# tisztított# lípidezett rekombináns OspA lehet# amely lényegében mentes a lipo-poliszacharidoktől és lényegében mentes további bakteriális fehérjéktől.

A készitmény létrehozható bármiféle immunogenítást erősítő adjuváns nélkül.

II 4 *χ 4 * S * * ί

* « X 4 * «

* * ♦ «*** ♦ X ♦ « 4*4 *

»<£ * * * *

A készítményben a további antigén az alábbiak bármelyike lehet; kutyapatcgén antigénje, lőpatogén antigénje és macskafélék patogénjének antigénje.

A találmány bizonyos előnyős megvalósítási módja szerint a készítményben további antigénként kutyapatcgén eredetű antigént vagy iópatogén eredetű antigén választunk.

A további antigén az alábbiak bármelyike lehet: veszettség vírusa antigén, kutya szopornyica antigén, adenovírus antigén, koronavírus antigén, parainfIuenza antigén, parvovírus antigén és ezek keverékei.

A találmány bizonyos előnyös megvalósítási módja szerint a készítményben további antigénként a veszettség vírusa antigénjét választjuk; vagy további antigénként kutya szopornyica antigént választunk, vagy adenovírus antigént, koronavírus antigént, paraínfluenza antigént és parvovírus antigént választunk.

A további antigén lehet módosított vagy legyengített élő vírus, mint például legyengített CDV, CAV - .mint például CAV₂ - koronavírus, parainfIuenza vírus és/vagy parvovírus lehet.

ovábbá eljárás immuno fogékony emlősben

A találmány tárgyát képezi t válasz kiváltására Lyme-kórra lőgía és

Bőrrel ia b?zrg'dorferí-tői különböző emlöspatogén ellen, amelynek során az emlősnek a fentebb említett készítményeket beadjuk.

Az emlős lö is lehet és a további antigén lőpatogén

Az emlős lehet felnőtt kutya vagy antigén kutyapatcgén eredetű antigén eredetű antigén lehet kölyök ís és a további ♦ * **** *

> ❖ ·>

lehet,

A találmány tárgyát képezi még továbbá eljárás iraunológíaí válasz kiváltására lóban Borrelia burgdor.ferí allén,, amelynek során a lónak izolált, tisztított Borrelia hurgdorferí OspA-t tartalmazó készítményt adunk be.

A találmány tárgyát képezi még továbbá eljárás immunológiai válasz kiváltására felnőtt kutyában vagy kölyökfoen Borrelia burgdorferi ellen, amelynek során a felnőtt kutyának vagy köiyöknek izolált, tisztított Borrelia burgdorferl OspA-t tartalmazó készítményt adunk be,

Ezekben az eljárásokban az OspA izolált, tisztított lípidezett rekombináns OspA lehet, amely lényegében lipopoliszacharid mentes és lényegében mentes más bakteriális eredetű fehérjéktől. Úgyszintén, ezekben az eljárásokban a készítmény nélkülözhet bármiféle immunogenítást erősítő adjuvánst,

A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a fentebb említett készítmények előállítására, amelynek során a további antigént liofílizált formában állítjuk elő, a Bőrrel1a burgdorr'eri antigént folyékony formában állítjuk elő és a további antigént a Bőrrelia bargdorferi antigénnel rehídráijuk,

A Borrelia burgdorferi OspA előállítható oly módon, hogy gazdaszervezetet transzformálunk a teljes hosszúságú vad-típusú Bőrrelia hurgdorferi OspA lipoproteint kódoló gént tartalmazó plazmíddal és rekombináns Borrelia burgdorferí OspA lipoproteint állítunk elő, majd a rekombináns Borrelia hurgdorferi OspA lipoproteint más bakterié **·♦ * '***♦ *

* A

A ·> '

X *** <r« *

lís eredetű fehérjéktől és lipo-poliszaoharídoktől lényegében mentesre tisztítjuk nem-denatúráló körülmények között, a gazdaszervezet liráturnéból kiindulva.

így például a találmány megvalósítása sarán alkalmazható olyan izolált lipoprotein, amely tisztított rekombináns Borrelia burgdorbaru OspA lipoproteint tartalmaz - amely megtartotta lipídezettségét - és lényegében mentes más bakteriális eredetű fehérjéktől és lényegében lipo-poliszacharid mentes, valamint a tisztított rekombináns Borrelia burgdorferi OspA lipoproteint az alábbiak szerinti eljárással állítjuk elő:

gazdaszervezetet transzformálunk a teljes hosszúságú vad-típusú Sorrelia burgdorferi OspA lipoproteint kódoló gént. tartalmazó plazmiddai és rekombináns Sörrel i a burgdor/erl OspA lipoproteint állítunk elő;

majd a rekombináns Borrelia burgdorferí OspA lipoproteint más bakteriális eredetű fehérjéktől és lipo-poliszacharidoktói lényegében mentesre tisztítjuk nem-denatúráié körülmények között a gazdaszervezet 1 izét urnából kiindulva é.s így tisztított rekombináns Bőrrelie burgdorferi lipoproteint állítunk elő, amely megtartotta lipídezettségét és immunogén sajátossággal rendelkezik emlős gazdaszervezettel szemben amikor az emlős gazdaszervezetnek beadjuk,

A rekombináns Bőrrelía burgdorferí OspA tisztítása az alábbiak szerint végezhető el:

a gazdaszervezet sejtjeit emésztjük, hogy ezzel íizált sejteket állítsunk elő;

1.4 * ♦ «««>«« »» * ♦ i «« »« ♦♦··♦· a lizált sejteket felületaktív anyaggal kezeljük, amely szelektív módon szolubílizáija a Borrelia burgdorferi OspA lipoproteint bakteriális és más fehérjék előtt és amely képes fázis szétválasztást megvalósítani detergens fázis képződésével mérsékelt hőmérsékleti viszonyok alkalmazásával körülbelül 35-40 °C között, hogy ezzel kezelt, lizált sejteket kapjunk;

fázis szétválasztás során a kezelt, lizált sejteket detergens fázisra választjuk szét - ami tartalmazza a szolubilizált Borrelia burgdorferi OspA lipoproteint -, vizes fázisra választjuk szét, amely bakteriális és más fehérjéket tartalmas, valamint sejt maradékokat tartaimaző szilárd fázisra választjuk szét?

elválasztjuk a detergens fázist a vizes és a szilárd fázistól?

a detergens fázist kromatográfiás oszlopra visszük olyan körülmények között, amelyek biztosítják a Borrelra burgdorferi OspA lipoproteintől különböző fehérjék megkötődését a kromatográfiás oszlopon? és az első kromatográfiás oszlopon átfolyatva visszanyerjük a Bőrrel:La burgdorferi OspA lipoproteint, a megkötött fehérjéktől megszabadítva.

A rekombináns Borr&lia burgdorferi OspA tisztítását oly módon hajtjuk végre, hogy a detergens fázist a kromatográfiás oszloppal körülbelül pH 7,5 értéknél érintkeztetjük.

Alternatív módon az OspA előállítható olyan eljárás során is, amikor teljes hosszúságú vad-típusú Borrelia OspA gén által kódolt izolált és tisztított rekombináns OspA

IS « * ♦ ♦ X « lipoproteint termelünk az alábbiak szerint;

Borreiia OspA lipoprotein indukcióját hajtjuk végre az OspA gént tartalmazó plazmáddal transzformált gazdaszervezetben;

a gazdaszervezet sejtjeit lizaljuk#’ a lizált sejteket felületaktív anyaggal kezeljük# amely szelektív módon szolubilizálja a Sörrel1a OspA lipoproteint bakteriális és más fehérjék előtt és amely képes fázis szétválasztást megvalósítani detergens fázis képződésével mérsékelt körülmények között;

fázis szétválasztást hajtunk végre detergens fázisra ami tartalmazza a szolubilízált Sorreiia OspA. lipoproteint -# vizes fázisra# amely bakteriális és más fehérjéket tartalmaz# valamint sajt maradékokat tartalmazó szilárd fázisra választjuk szét;

elválasztjuk a detergens fázist a szilárd fázistól és a vizes fázistói; és a detergens fázist megtisztítjuk a Bőrrel!a OspA lipo~ proteintől különböző más fehérjéktől és lipo-poilszacharídóktól oly módon# hogy;

(a) a detergens fázist első kromatográfiás oszloppal érintkeztekjük olyan körülmények között, amelyek a Aorreiia OspA lipoproteintől különböző fehérjék kötődését eredményezik az első kromatográfiás oszlopra;

(fo) visszanyerjük a megkötött fehérjéktől megtisztított Bőrrel!a OspA lipoproteint tartalmazó átfolyó anyagot az első kromatográfiás oszlopról;

« * 4 9X ♦ « * (c) az első kromatográfiás oszlopról as átfolyó anyagot második kromatográfiás oszloppal érintkeztetjuk olyan körülmények között, amelyek a Borrelia OspA lipoproteín megkötődését eredményezik a második kromatográfiás oszlopon bármely visszamaradó szennyező fehérje és lipo-poliszaeharid előtt, amelyek a második kromatográfiás oszlopon ker e s z tü1£ο1ynak;

(d) a második kromatográfiás oszlopot eluenssel érintkeztet ják olyan körülmények között, amelyek között a kötött Borrelia OspA lipoproteín eluáiódík a második kromatográfΙό s osζ1oprő1; és (e) összegyűjtjük a Borrelia OspA lipoproteint tartalmazó eluálódó anyagot a második kromatográfiás oszlopról.

Továbbá ebben az eljárásban az átfolyó anyag érintkeztetése a második kromatográfiás oszloppal körülbelül pH 5, 7 alatti értéknél hajtható végre és a Borrelia OspA lipoproteint megkötését a második kromatográfiás oszlophoz olyan eluenssel végezzük, amelynek pH értéke körülbelül 5,7 értékig és felette van, és a megkötött Borrelia OspA llpoprotein elűciőját a második kromatográfiás oszlopról ezzel az eluenssel végezzük.

Továbbá még ebben az eljárásban a detergens fázis érintkeztetése az első kromatográfiás oszloppal végrehajtható körülbelül pH 7,5 értéknél is, az átfolyó anyag érintkeztetése a második kromatográfiás oszloppal végrehajtható körülbelül pH 4,2 értéknél és a második kromatográfiás oszlop érintkeztetése az eluenssel végrehajtható körülbelül pH értéknél.

» X * « * * «τ »

A találmány tárgyát képesík továbbá as antitestek, amelyeket a találmány szerinti készítmények és eljárások létrehoznak,

Heglepő módon nem figyeltünk meg jelentős mértékű hatékonysági interferenciát a találmány szerinti készítmények és eljárások hatásáraAz OspA mellett, vagy annak alternatívájaként alkalmazott más Sörrelia antigének a fentebb említett készítményekben, eljárásokban és folyamatokban intér aiía értendők, ahogyan ezek az itt hivatkozott szabadalmi bejelentésekben és dokumentumokban részletesen ismertetésre kerülnek, a Kapcsolódó szabadalmi bejelentések* fejezetben, beleértve az ezen további antigének előállítására szolgáló eljárásokat,

A találmány tárgya és megvalósítási módjai as alább következő részletes leírásban kerülnek ismertetésre vagy ezen részből nyilvánvalóak lesznek.

Az itt következő részletes leírás során az alábbi ábrákra hivatkozunk, amelyek mindegyike teljes egészében a kítanítás részének tekintendő az alábbiak szerint:

Az 1, ábra a B31, ACAI és IpSÖ teljes hosszúságú B. burgdor/eri OspA gén pET9a expresszíós vektorba történő klónozásánál alkalmazott PCR olígonukleotidokat mutatja be;

a 2, ábra mutatja be a klónozás! stratégiát a teljes hosszúságú OspA gén pST9a expresszíós vektorba történő beillesztése esetén, hogy az OspA gént a T? Φ10 promoter szabályozása alá helyezzük és ezzel a B31-génből kiindulva a pöAl, az ACAi-génből kiindulva a pOA9 és az Ip90~génből ♦ « ♦ * * « «

A ♦ * * · ♦ « X » * « ♦ ♦ X * * * « * « * » *

A « « ifr* K X ** kiindulva a pOAlO vektort hozzuk létre;

a 3. ábra a pöAl-plazmíd előre jelezhető restrikciós térképét mutatja he;

a 4. ábra a pOAl-plazmíd különböző restrikciós emésztéseinek az eredményeit mutatja be, ezekkel igazolva, hogy az összes előre jelezhető restrikciós hely jelen van (Sí ~ markerek (ΦΧ 174 DNS HaelII segitségével emésztve} ; B BamHI; E =» EcoRI; H = HindiiI; íí - Ndel);

az 5. ábra a B31, ACA1 és Ip90 teljes hosszúságú B, burgdorferi OspA gén pCSÍBl expresszíós vektorba történő klónozásánál alkalmazott PCR oligonukleotidokat mutatja be;

a 6. ábra mutatja be a klónozás! stratégiát a teljes hosszúságú OspA gén pCMBl expresszíós vektorba történő beillesztése esetén, hogy az OspA-gént a Trc-promóter szabályozása alá helyezzük és ezzel a 831-génből kiindulva a pöAS, az AGAI-génből kiindulva a pQA7 és az Ip90-génből kiindulva a pOA8 vektort hozzuk létre;

a 7A. 7B. és 7C. ábrák az OspA IPTG-indukálásának időfüggését mutatja be két pOAl-vektort tartalmazó gazdatörzsben (7A, ábra), pOA5~vektort tartalmazó gazdatörzsfoen (78, ábra) és pOA6-vektort tartalmazó gazdatörzsben (7C. ábra);

a 8A._f 88. és 8C. ábrák folyamatábrák, amelyek sorrendben megfeleltetve a sejttenyésztést és a lízist, a detergens extrakcíót és a tisztítás.! lépéseket mutatják be, amelyeket B, coJi-ból származó, rekombináns teljes hosszúságú OspA termelésére és tisztítására alkalmazunk a találmány egy megvalósítási módja szerint; és

4 4 * X- 4 *

4β4 X 4

X 4 » 4 4 4 4 X

4*444 4 4 X * *

V 4 4 *♦ 44 X *44 a 9, ábra a pCMBl- és pCMBS-pIazmídok termelését mutatja be.

Ahogyan ezt a fentiekben tárgyaltuk a találmány tárgyát képezik Sorrelia bnrgdorferí antigént tartalmazó készítmények, közelebbről meghatározva háziasított állatokban történő alkalmazásra, mint például, felnőtt kutyák, kölykök macskák, macskakölykök, lovak és más hasonlók részére. A készítmények előnyösen koktél” vagy multivalens készítmények, Azaz a készítmények előnyösen más patogénekből származó további vagy más” antigéneket ís tartalmaznak.

A Borrelia óorgdorferí antigén lehet egy antigén számunkra fontos epitőpja; és az antigén előnyösen OspA. Az OspA előnyösebben rekornbináns - mint például JB. coli expressziós terméke, Az OspA előnyösen lipidezett és igy az OspA. előnyösebben lipidezett rekornbináns OspA, A Borrelia hurgdorferí antigén, mint például az OspA bármely megfelelő eljárás segítségével előállítható, így például Bor.re.lia burgdorberi tenyészetekből történő izolálással; vagy előnyösen a rekornbináns lipidezett OspA előállítható as 5,582,990 és 5,523,089 lajstromszámű VS szabadalmak alapján és a WO93/08299 azonosító számú leközölt eljárások segítségével, egészükben a kitanítás részének szabadalmi bejelentésben amely referenciák teljes tekintendők, A Borreiia hurgdorferí ant i gének sok vonatkozásában rán alkalmazhatók - a és az előállításukra szolgáló eljáró amelyek a találmány megvalósítása so Kapcsolódó szabadalmi bejelentések tt fejezetben említett dokumentumokra és az azokban referenciákra hivatkozunk, araiható ♦

* > * «♦ * « ·» »* *

* *

A találmány szerinti készítmények - mint például immunológiai# antigén sajátosságú vagy vakcina készítmények vagy gyógyhatású készítmények# beleértve multivalens# koktél” vagy kombinációs készítményeket - beadhatók parenterálisan (íntradermáiis# intramuszkuláris vagy szubkután), Az ilyen bejuttatás lehetővé teszi szisztémás immunválasz létrejöttét.

Általánosságban a találmány szerinti antigén sajátságé# immunológiai vagy vakcina Bőrrel!a hurgdorferi antigén készítmények előállíthatok a gyógyászati vagy állatgyógyászati területen dolgozó szakember számára a technika szerint ismertnek feltételezhető standard eljárások állása segítségével. Az ilyen készítmények az területen dolgozó szakember számára orvosi vagy állatorvosi ismertnek feltételezhető dózisokban és eljárások segítségével beadhatók# figyelembe véve olyan faktorokat# mint az adott páciens életkora# neme# súlya# faja és állapota# valamint a beadás útja. A Bőrrel!a burgdorfer! antigén beadható önmagában# vagy más antigénekkel együtt illetve sorba rendezve is beadható# vagy beadható más” immunológiai# antigén sajátosságú vagy vakcina készítményekkel# így tehát, a találmány szerinti koktél” vagy kombinációs készítményeket illetve beadásokat létrehozva és az azokat alkalmazó eljárásokat megvalósítva.

'más antigénén vagy sajátosságú vagy vakcina készítmények lehetnek epítőpo vagy ilyen antigének kívánt epltópjaí# vagy epítópot illet ve ilyen antigének kívánt epitópjaít tartalmazó nyék.

készitmé » * ί * Ο ♦ ♦

X « » X X X Λ ί * « X « * x * « < Λ>κ χ« « X XX

Ilyen ”további készítmények magukba foglalhatnak izolált és/vagy tisztított antigéneket bármely állati eredetű patogéhhől mint például háziasított állatból származó patogén antigénje, azaz például kutyából, maeskafélékből, lóból vagy más hasonlóból származó patogén bármely antigénje, Így például az alább felsoroltakból bármely antigén: kntyapatogén antigénje vagy antigénjei; mint például veszettség vírusa, azaz veszettség vírus glíkoproteín G; kutya szopornyica vírus antigén, azaz CDV HA és/vagy F giikoproteinek, kutya adenovirus 2. tipusű antigén, kutya koronavirns antigén, kutya parainfiuenza antigén, kutya parvovirus antigén, őeptospira Canicola-Xcterohemorrhagía bakterin antigén, ezen antigének bármely kombinációja; macskaféle-patogén antigénje vagy antigénjei, mint például macskafélék leukémia vírus antigénjei, macskafélék immundefícíenoia vírus antigénjei, veszettség, macskafélék herpeszvírus antigénje, vagy ezen antigének bármely kombinációja; lópatogén antigénje, mint például ló influenza és/vagy lő herpeszvírus és/vagy veszettség vírusa antigénje. Ezek a “további” antigének származhatnak, az ilyen antigének expressziójából rekombináns úton, mint például poxvírus vagy más vektor rendszer in vitro; vagy az Ilyen “más” készítmények magukba foglalhatnak rekombínánst, mint például poxvirust vagy poxvítusokat, amelyek az antigént (antigéneket) in vivő expresszálják.

Vektor vagy rekombináns előállítására szolgáló eljárások - amelyek alkalmasak OspA vagy annak kívánt epítőpja expressziójára, vagy “más'* antigén vagy annak kívánt epi™ ~ 22

Φ*Χ« *♦♦X ♦ χ χ * *

Φ * Φ X « * φ φ φ « χ « XX» χ* Φ ♦ tápja expresszlójára a találmány szerinti alkalmazásban ~ előállíthatők az alábbi publikációkban ismertetett vagy azokkal analóg eljárások segítségével:

4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683,

5,494,807 és 4/722,848 lajstromszámű OS szabadalmak; Paoletti; Proc. Kati. Acad, Sci. USA 93 11349 (1996); Moss: Proc. Natl. Acad, Sci, USA 33 11341 (1996); Smith és mtsai.: 4,745,051 lajstromszámil US szabadalom (rekombináns baculovirus); Aichardson, C.D, (szerk,): Methods in Molecular Biology 39, kötet, Baculovirus Bxpressicn Prctocols”, Humana Press Inc», (1995); Smith és mtsai.: Molecular and Cellular Biology 3 2156 (1983); Pennock és mtsai.: Molecular and Cellular Biology 4 399 (1984); EFA 0 370 573 azonosító számú szabadalmi bejelentés; 920,197 so~ rozatszámű US szabadalmi bejelentés, nyilvántartásba vétel: 1986, október IS-én; 265785 azonosító számú SP közzétett szabadalom; 4,769,331 lajstromszámű US szabadalom (rekombináns berpeszvlrusok); Rcizman; Proc, Natl. Acad. Sci. USA 93 11307 (1996); Andreansky és mtsai.: Proc. Matt, Acad. Sor. USA 93 11313 (1996); Robertson és mtsai.: Proc.

Kati. Acad. Sci. USA 93 1.1334 (1996); Frolov és mtsai.:

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 11371 (1996); Kítson és mtsai.; J. Viroi. 65 3068 (1991); 5,591,439 és 5,552,143 lajstromszámú US szabadalmak; Grunhaus és mtsai.: Adenovirus as CIoning Vectors” ín: Seminars in Virology,

3. kötet, 237-52. oldalak, (1993); Baliay és mtsai..: EMBO Journal 4 3861; Graham: Tibtech 8 85 (1990); Prevec és mtsai,: ű, Gén, Viroi, 70 429; W091/1I525 PCT; Felgner és mis a:

J, Si<

Chem, (550 (1994); Science 259 1745

Λ 9 $ » * * « φ * «

X ❖ * ,4 «»» * (1993) valamint McClements és mtsai.; Proc. Natl. Acad,

Bei. USA 93 11414 (1996) valamint az 5,591,633, 5,589,466 és 5,580,859 lajstromszámű US szabadalmak, amelyek inter alia DNS expressziós vektorokra vonatkoznak.

Megismételjük, hogy az összetevők és a bejuttatás útja (egymást követő vagy együttes beadás), és épp így az adagolás meghatározható az olyan faktorok figyelembe vételével, mint életkor, nem, testsúly, faj és az adott páciens állapota, valamint a bejuttatás útja, Ebben a vonatkozásban hivatkozunk az 5, 503,834, 5,529,780, 5,482,713 és 5,494, 807 lajstromszámű US szabadalmakra, amelyek kitanítást adnak kutya, maoskaféle- és Iópatogének antigénjeiről, rekombinánsokról, amelyek ezeket az antigéneket expresszáljak, valamint az ezen rekombinánsokat tartalmazó készítményekről, és hasonlóképpen hivatkozunk az alábbi elbírálás alatt levő bejelentésekre: a 08/413,118 azonosító számú szabadalmi bejelentés, benyújtás dátuma: 1995, március 29,, amelynek tárgya: kutya herpeszvirus antigének nukleotid és aminosav szekvenciái, azokból származó rekombínánsok és azok alkalmazásai; a 08/224,657 azonosító számú szabadalmi bejelentés, benyújtás dátuma; 1994. április 6, és a 08/416,616 azonosító számú szabadalmi bejelentés, benyújtás dátuma: 1395, április 5., amelyek tárgya: poxvirus-kutya szopornyica vírus (CDV) rekombínánsok és készítmények, valamint az ezen rekombinánsokat alkalmazó eljárások; a 08/675,556 azonosító számú szabadalmi bejelentés, benyújtás dátuma; 1996.

július 3,, amelynek tárgya: expressziós kazetták, promőte24 *«·* * *φ » * X * * fe'fc X 4 4 * rek és rekombínánsok, beleértve kutya adenovírus rekombínánsokat állatgyógyászati alkalmazásra; a 08/746,668 azonosító számú szabadalmi bejelentés, benyújtás dátuma: 1996, november 14,, amelynek tárgya: macskafélék immundefieíeneía vírusának kívánt epitópjait expresszáló rekoaibinánsok; és a 08/486,969 azonosító számú szabadalmi bejelentés, benyújtás dátuma: 1995, június 7<, amelynek tárgya: rekombináns pózvírus ™ veszettség vírusa készítmények, beleértve kombinációs készítményeket és azok. alkalmazásait, A fentebb felsorolt szabadalmak és szabadalmi bejelentések mindegyike teljes egészében a kitanítás részének tekintendő, különös tekintettel az ott ismertetett rekomfoinánsokra, azokból származó expressziós termékekre és az ezen szabadalmi bejelentésekben ismertetett nukleínsav kódolások alkalmazhatók a találmány szerinti koktél”, multivalens vagy kombinációs készítményekben vagy beadásokban vagy azok rekombinánsalbán, így például a kutya szopornyica vírus - 2. típusú adenovírus - koronavírus ~ paraínfluenza - parvovírusxx,, módosított élő vírus (termék kód: 1491,21) terméknek számit. Nagymértékben előnyös lehetne Borrelia bsrgdozd'erí antigén

- mint például OspA - és ezen termék összefogása egyetlen egység kiszerelésben - mint például kombinációs készítményben; - vagy az, hogy a megfelelő gazdaállatnak - mint például kutyának - az állatorvosi rendelő egyszeri felkeresése során mind az DACPiPxj, és a Borrelia burgdoz'beri, antigént beadjuk.

Φ X Φ 4 * # φ « 4 * *** * φ X Φ Φ* * * *

Φ XX φ»* Φ Φ Φ ’

A találmány szerinti készítményekre például szolgálhatnak a testnyílások számára elkészített folyékony preparátumok, mint például orális, nazális, anális, vagínális, perorális, intragasztrális, stb. készítmények; ezek bejuttatása, mint szuszpenzíők, szirupok vagy elíxirek; és parente.ralis, szubkután, íntradermálís, intramuszkuláris vagy intravénás bejuttatások (azaz injektálható beadási módok) számára szolgáló készítmények, mint például steril szuszpenzlők vagy emulziók. Az ilyen készítményekben az antigén (antigének) keverékben lehetnek megfelelő hordozóval, hígítóval vagy exoípienssel, mint például steril viz, fiziológiás sőoidat, glükóz és más hasonlók, A készítmények hasonlóképpen iiofilízálhatók is. A készítmények tartalmazhatnak kiegészítő anyagokat, mint például nedvasitőszerefcet és emuigeáió ágenseket, pH puf férőié ágenseket, adjuvánsokat, gélesítő vagy viszkozitást növelő adalékokat, tartósítószereket, ízesítőszereket, színezékeket, és más hasonlókat, a bejuttatás útjától és a kívánt készítménytől függően. Standard kézikönyvek# mint például ”Asmington/s Pharmaceutical Soienoe”, 17. kiadás, (1985) - amely teljes egészében a kitanítás résznek tekintendő - szükségtelen kísérletezés nélkül is útmutatást adhatnak a megfelelő készítmények előállításához. A megfelelő adagolás az alább leírásra kerülő példák alapján megállapítható. A Borrelia burgdorferi antigén tipikus kutya dózisai 5-25 gg/ml közé esnek, mint például 13 gg/mí OspA; és a Borrelia burgdorferi antigén tipikus lovaknak szánt adagolása .15-150 gg/dőzis közé esik, mint például 100 gg/dózis OspA önmagában, 30 gg/dózis OspA χ X <· * * « **♦ X x

tx * # χ χ-« önmagában vagy 30 pg/dósis OspA további antigénnel kombinációban, mint például veszettség antigénnel (az Xmr&b például egy kereskedelemben beszerezhető veszettség elleni vakcina, amellyel a Borrelia bnrgdorferi antigén kombinálható) ,

Ahogy a fentiekben említettük, az antigén sajátosságú, immunológiai vagy vakcina készítmények tipikus esetben tartalmazhatnak adjuvánst és az antigén (antigének) olyan mennyiségét, amely a kívánt választ létrehozza. Bizonyos alkalmazások esetén alum (alumínium foszfát vagy alumínium hídroxid) alkalmazható, mint tipikus adjuváns. Szaponin és ennek tisztított komponense, Quíi A, Freund-féle teljes adjuváns és további adjuvánsok alkalmazhatók állatgyógyászati esetekben,

Azonban iipldezett rekombínáns OspA védőhatású választ tud kiváltani adjuváns hozzáadása nélkül is. Kémiailag jellemezhető készítmények, mint például muramil-dipeptid, mono-foszforílezett lipid-A, foszfolipíd konjugátumok, mint például Goodman-Snitkoff és munkatársai által leközölt konjugátumok [Goodman-Snitkoff és mtsai,: J, Immunoi, 147 410 (1991), amely publikáció teljes egészében a kítanítás részének tekintendő], a fehérje kapszulába zárása proteoilposzőmában, ahogyan est Miller és munkatársai leközölték (Miller és mtsai,: J. Exp. Med. 17$ 1739 (1992), amely publikáció teljes egészében a ki tanitás részének tekintendő], és a fehérje kapszulába zárása lipid vetikulúrnőkben, mint például Rovásomé®* lipid vezi.knl.umok (Micro Yescular Inc,, Nashua, NH) úgyszintén alkalmazhatók.

oysrems,

2?

* ♦*» « ·» ♦ » ♦*

A találmány szerinti készítmény csomagolható egyetlen dózis formájában Immunizálás céljára parenterális (azaz intramuszkulárís, intradermálís vagy szubkután) bejuttatáshoz, vagy testnyílásokon át történő beadáshoz, mint például perlxngválís (azaz orális)_f íntra-gasztríkus; nyálkahártyán keresztül történő bejuttatásra, beleértve íntra-orálís, xntra-anáiis, intra-vaginális és más hasonló bejuttatás.! módokat. Ismét megállapíthatjuk, hogy a hatékony adagolás és a bejuttatás útja meghatározható a készítmény természete alapján és ismert faktorok alapján, mint például fajta és faj szerint, életkor, nem, testsúly, állapot és a gazdaszervezet természete szerint, valamint hasonlóképpen az LD_Sf érték és más szkrínelésí eljárás alapján, amelyek a technika állása szerint, ismertnek tekinthetők és nem igényeinek szükségtelen kísérletezést. Az adagolás általánosságban néhánytól néhány száz mikrogrammig terjedhet, igy például S-500 μ-g az egyes antigénekből. További megfelelő hordozók vagy hígítók lehetnek a következők: viz vagy pufferolt fiziológiás sóoldat, tartósítószerrel vagy anélkül. Az antigén (antigének) líofillzálhatők a beadáskor történő újra-szuszpendáláshoz vagy lehetnek oldatban is.

A hordozó lehet polimer természetű késleltetett felszabadulása rendszer is. A szintetikus polimerek különösen jól alkalmazhatók olyan készítmény formulázására, amely szabályozott felszabadulást biztosit. Ennek korai példája volt metli-metakríiát polimerizálása gömbökké, - amelyek átmérője egy mikronnál kevesebb volt - hogy úgynevezett nanorészöcskéket alakítsunk ki, amelyeket Kreuter publikált;

_Λ *4'·$ φΧ- jt 4 Ό· X X » * * 4 * 4

X- ·> ν #> « ^ν ¢1» »fr*4 ·< < .. * * ·*

Φ ΛΓΑ· ¢,¼ * Χ-φ^

Kreuter, J.: Microcapsu2.es and Nanoparfcicles in Medicine and Pharmacology, 125-148. oldalak, szerk.; Donbrow, M«,

CRC Press.

Mlkro-enkapszulazást alkalmaztak mikro-enkapszulázott gyógyhatású készítmények Injektálásához, hogy szabályozott felszabadulást érjenek el. Számos faktor járul hozzá egy adott polimer kiválasztásához mikro-enkapszulázás céljaira.

A polimer szintézis és a mikro-enkapszulázási eljárás reprodukálhatósága, a mikro-enkapsznlázáshoz használt anyagok és folyamatok költségei, a toxikológiai profil, a változtatható felszabadulási kinetika szükségletei, valamint a polimer és az antigének fizikai-kémiai összeférhetősége mind olyan faktorok, amelyeket figyelembe kell venni. Az alkalmazható polimerekre példaként szolgálhatnak polikarbonátok, poliészterek, poliuretánok, poli-ortoészfcerek és políamidok, közelebbről meghatározva a biológiailag lebonthatók.

Gyógyhatású készítményekhez gyakran választják hordozóként - és újabban antigénekhez Is - a poli-(d, 1-iaktid-coglíkolid)~t (PLGA). Ez olyan biológiailag lebontható poliészter, amelynek története messzire nyúlik vissza az orvosi alkalmazásokban, mint felszívódó varratok, csontrögzítd lapok és más ideiglenes prosztetikumok, ahol az anyag nem mutatott semmiféle toxicitást. Gyógyhatású készítmények széles körét ~ beleértve peptidekefc és antigéneket - formulázták PLGA míkrokapszulákba. Adatok tömege gyűlt össze a PLGA alkalmazásáról például antigének szabályozott felszabadítására, ahogyan ezt Eldridge és munkatársai összefoglalták

V Φ * Φ

Φ * 4 ♦ Φ φ X X < #6 ν Φ [Eldrídge és mtsai.; Current Topics in Microbíology and Immunology 146 59 (1989) j> As antigének bezárásáról átmérőjükben l-lö mikron nagyságú PLGA mikrogömbökbe kimutatták, hogy figyelemre méltó adjuváns hatással rendelkeznek, amikor orális úton történik a bejuttatás, A. PLGA mikroenkapszuiázásí eljárás víz-olajban emulzió fázis szétválasztását alkalmazza, A kívánt vegyületet vizes oldatként állítjuk aló és a PLSA-t megfelelő szerves oldószerekben oldjuk, mint például metilén-klorid és etíl-acefcát, Ezt a két vegyíthetetlen oldatot nagysebességű keverés segítségével együttesen emuigeáljuk, Ezt követően a polimer számára oldószerként nem alkalmazható folyadékot adunk hozzá, ami a polimer kiválását okozza a vizes cseppecskék körül és így embrionális mikro kapszulákat hoz létre, A mikrokapszulákat összegyűjtjük és a rendelkezésre álló ágensek (poliviníialkohol (FVA), zselatin, aiginátok, poiivinil-pírrolidőn (PVP), metíl-celluióz) egyikével stabilizáljuk, majd az oldószert vákuumban történő szárítással vagy oldószeres a x t r a k c i óv a1 eltávolítjuk,

A míkro-enkapszulázás, késleltetett felszabadulási rendszer és például ahogy fentebb ismertettük, az enkapszulázas! eljárások alkalmazásra kerülhetnek, akikor késleltetni kívánjuk egy vagy több antigén prezentálását az immunrendszer felé egy kombinációs készítményben, így tehát folyadék - beleértve injaktáiásos vagy más beadásokat - és hasonlóképpen szilárd - beleértve szilárd anyagot tartalmazó folyadék, folyadék és gél (beleértve gél kapszulákat) készítmények egyaránt elképzelhetők.

* X « ♦ « « « « « « «« « * * « * > * ♦ * ««««« χ» ♦ 4 A > «φ *X 4 φ * 4 <<t

Továbbá a találmány szerinti készítmények alkalmazhatók közvetlenül állatokban immunválasz stimulálására. Az így létrejövő immunválasz lehet antitest válasz; és ennek következtében ezekből az antitestekből - a technika állása szerint ismertnek feltételezhető eljárások alkalmazásával monoklonálís antitestek állíthatók elő, és ezen monoklonálís antitestek alkalmazhatók a technika állása szerint jól ismert antitest kötődési vizsgálati eljárásokban, diagnosztikai reagens-készletekben vagy tesztekben kívánt antigén (antigének) jelenlétének vagy hiányának megállapítására. Ezen monoklonálís antitestek úgyszintén alkalmazhatók immunadszorpciós kromatográfla céljaira, hogy ezzel antigéneket nyerjünk ki vagy izoláljunk.

Monoklonálís antitestek, előállítására szolgáló eljárások és a monoklonálís antitestek alkalmazása a szakember számára ismertnek tételezhető fel. Ezek alkalmazhatók diagnosztikai eljázásokban, reagens-készletekben, tesztekben, vagy vizsgálati eljárásokban és hasonlóképpen anyagok viszszanyerésére immunadszorpciós kromatográfia vagy immunprecipítáció útján.

A monoklonáiis antitestek olyan iirnnunglobulinok, amelyeket hibridóma sejtek termelnek. A monoklonálís antitest egyetlen antigén sajátosságú determinánssal, reagál és nagyobb specifítást biztosít, mint a hagyományos, szérumból származó antitest. Továbbá, nagyszámé monoklonálís antitest szkrinelése lehetővé teszi, hogy kívánt specifítással, aviditássai és izotípussal rendelkező egyedi, antitestet válasszunk ki. A hibridóma sejtvonalak állandó, olcsó fórrá♦ φ * * * φ > * ♦ ♦ « χ « « « χ* χ χ * * * *·.* φ * ·♦ sát biztosítják a kémiailag azonos antitesteknek és az ilyen antitestekből előállított készítmények könnyen standardizálhatok. A szakember számára ismertnek tételezhetők fel a monokionális antitestek előállítására szolgáló eljárások# mint például; Koprowski és munkatársai: 4,196,265 lajstromszámú US szabadalom, megadás dátuma; 1989. április

1.# amely teljes egészében a kitanitás részének tekintendő.

A monokionális antitestek alkalmazása ismert. Az egyik ilyen alkalmazás diagnosztikai eljárásokban a következő: Dávid és Greene; 4#376# llö lajstromszámú US szabadalom# megadás dátuma: 1983, március 8,# amely teljes egészében a kitanitás részének tekintendő. Monokionális antitesteket alkalmaztak anyagok visszanyerésére is immunadszorpcíós kromatográfia útján# mint például: Milstein: Scientific American: 243 70 (1988)# amely teljes egészében a kitanitás részének tekintendő.

Ennek megfelelően a találmány szerinti készítmények számos, a fentiekben kifejtett alkalmazhatósággal . rendelkeznek. A találmány szerinti megoldás más módokon is alkalmazható .

A találmány és sok előnyének jobb megértése következik majd a következő példákból, amelyek nem korlátozó értelemben# csupán bemutatás céljából kerülnek ismertetésre.

Rekombináns

A rekombináns OspA előállítását az alábbi dokumentumokban leírtak szerint végeztük; az 5,523,089 és 5#582,990 ♦*« •4 4 44 4 4

4 4 4 X •4 * 4XV 444 «X* lajstromszámú US szabadalmak, WO93/08299 és PCT/US92/08697 azonosító számú szabadalmi bejelentések, valamint Erdile és mtsai.: (1993) publikációja. Röviden összefoglalva:

A 8. hurgdcrferi B31 törzs klónozott OspA génjét (ahogyan ez a fentebb említett W090/04411 azonosító számú szabadalmi bejelentésben leírásra került; N~terminális régió;

1. azonosítási szám szerinti szekvencia; C-terminálís régió; 2, azonosítási szám szerinti szekvencia; a szekvencia fennmaradó részét a W090/Ö4411 azonosító számú szabadalmi bejelentés ismerteti) alkalmaztuk, mint templátot (pTRH44;

(Howe és mtsai.: Infectíon and Xmmunity 54 207 (1986);

Howe és mtsai.: (198S)]) és specifikusan tervezett oligonukleotid prímereket (8ET-XH (COlj, 3. azonosítási szám szerinti szekvencia; valamint nosításí szám szerinti szekvencia) láncreakcióban (PCR), hogy a vadPET-273C [C03), 4, arcaiba Ima ztunk po.l ímeráz típusú OspA gén teljes egészét amplifikéijuk, ahogyan ez bemutatásra került az 1.

ábrán.

Hasonló módon a B, burgdorfori AGAI és Ip90 törzseinek klónozott OspA génjét (leírásra került: (Johnsson és mtsai.: Xnfect. Iwuq. 60 1845 (1992)]; az AGAI és 1ρ90 Nterminális régiója az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia; az AGAI C-terminális régiója az 5, azonosítási szám szerinti szekvencia; az XpSO C-terminális régiója a 8, azonosítási szám szerinti szekvencia) alkalmaztuk PCR reakcióban az alábbi oligonukleotid primer párokkal: (a) OspN2 (7. azonosítási szám szerinti szekvencia) és .821 (8, azonosítási szám szerinti szekvencia) valamint (b) OspN2 (7, azonoX 8 9 * * Φ « X * * * *

X » « V * * * X * X » X X * * ♦ * ♦ XX «X XXX XX* sítási szám szerinti szekvencia) és pK4 {9. azonosítási szám szerinti szekvencia), sorrendben megfeleltetve az Nterminális és a C-termináiis végeken, hogy kialakuljon a megfelelő amplifikált fragmens, ahogyan ezt az 1. ábrán bemutatjuk.

Olígonukleotid primerek alkalmazásával a kívánt megcélzott nukleinsav szekvencia amplífikálásának alapvető eljárása a technika állása szerint ismertnek tételezhető fel és a 4,683,202 és 4,800,150 lajstromszámú US szabadalmakban került leírásra. Ezen szabadalmakra hivatkozhatunk az alkalmazott eljárásokkal kapcsolatban.

Az eredményül kapott fragmenseket a pETO-plazmíd vektor Ndeí és SamHI restrikciós helyeibe klónoztuk, hogy az OspA gént T? promoter szabályozása alá helyezzük és hatékony transzlációs íníciációs szignálokat kapjunk a T7 bakteriofágból, ahogyan ez a 2. ábrán látható. A pET9- és physSplazmidok, a klónozásra szolgáló bakteriális gazdaszervezetek, a tenyésztési táptalaj és a klónozott gének T7 RNSpolimeráz segítségével történő expressziójának irányítására alkalmazott eljárások korábban már leírásra kerültek a 4,952,496 lajstromszámú US szabadalomban és ennek leírásához ezen szabadalomra hivatkozunk. Míg a T7 promoter rendszer a találmány egy előnyösen alkalmazható expressziös rendszere, a teljes hosszúságú OspA gén expresszíója megvalósítható más olyan expressziős rendszerek alkalmazásával is, amelyek a gazdaszervezettel összeférhetők,

A pET9 expressziös vektort alkalmaztuk, mert ez kan gént tartalmaz mint szelekciós markert bla gén helyett, En34 « « * » XX « * * ** * « « Κ * ♦ *' X ♦íí* ♦ «« « * « «Φ *v «♦ * * ** nek következtében nem alkalmaztunk ampícíllint a sejtek tenyésztése során és ennél fogva nem áll fenn annak lehetősége, hogy immunogén ampicílloii/OspA target fehérje konjugátum alakuljon ki. Feltételezések szerint az ilyen konjugátumok a fő antigén determinánsok a penicillin allergiában és bonyolíthatják az immunológiai vizsgálatokat.

Az eredményül kapott plazmidok a pOAl, pOAS és pOAlO elnevezést kapták és sorrendben megfeleltetve a B. burgdorferi S31, ACA1 és Ip90 törzseiből származó OspA gént tartalmazzák. A pOAl-piazmid közel azonos a Dunn által leírt pET9-preOspA plazmiddal [Dunn és mtsai.: Protein Expression and Purifícation 1 159 (1990)], azzal a különbséggel, hogy a PCR-reakcióban alkalmazott oiigonukleotidok különböztek a két esetben. A pOA.l-plazmid előre jelezhető restrikciós térképét mutatjuk be a 3, ábrán, mig a 4. ábra a pOAl-plazmid különböző restrikciós emésztéseinek az eredményét tartalmazza, ezzel, bizonyítva, hogy az összes előre jelezhető restrikciós hely jelen van.

Fehérje termeléshez a pOAl-, pOA9- és pOAlO-piazmidokat az A. coli expressziós törzsbe transzformáltuk, előnyösen az A. coli expressziős törzs az A. coli T7 expressziós törzs, ahogyan ez a fentebb említett 4,952,496 lajstromszámú US szabadalomban leírásra került. Közelebbről meghatározva a törzs a BL21(DE3)(pLysS) A. coli expressziós törzs lehet, ahogyan ez a fentiekben leírásra került vagy a EMS174(DE3)(physS) A. coli törzs lehet. A transzformált gazdaszervezetet tenyésztettük és a fehérjét izopropll-β-Dtiogalaktoziddal (IPTö) indukáltuk, A 7A. ábrán mutatjuk be φ* <

ΦΦ Φ

Φ Φ φ X * ΦΦφ * φ φ χ φ «φ φ Φ

Φ φφ ΦΦ ΦΦ* φχ* az OspA indukciójának ídöfüggését a pOAl-piazmidbői az 1PTG hozzáadását kővetően. A pOAl esetében tapasztalt eredményekkel azonosakat kaptunk pOA9 és pOAlO alkalmazásával. Az OspA fehérje szintézise a pOAl-plazmidböl. az indukció után körülbelül egy órával megszűnt, ami a fehérje valamilyen mértékű toxicifását jelzi az A. colí-val szemben. Mindemellett a fehérje termelés elfogadható szinten volt# körülbelül 10 mg/I sejttenyészet koncentrációval.

A pOAl-, pOA9“ és pOAlO-plazmidok biztosi fásán és a T7 promőter alkalmazásával az OspA lipoprotein A, coli-bán történő expresszáiásán túl, további piazmidokat szerkesztettünk meg, amelyek a teljes hosszúságú 831, AGAI és Ip90 OspA géneket tartalmazták eltérő promőter szabályozása alatt és lipoprotein expresszióját értük el. Ebben a vonatkozásban pÖAS- és pOAó-plazmidokat állítottunk elő oly módon, hogy a B31-törzsbői az OspA PCR-amplifikált fragmensét a pCMBI- és pCMB2~plazmiá expressziős vektorok Mcoi és BamHI restrikciós helyeibe klónoztuk, míg a pOA'7~ és pOA8plazmidok előállításához az ACAl-törzsbői (pQA?) és az IpPO-törzsből (pOAS) PCR-amplífikáit fragmenst klónoztunk a pCMBI expressziós vektor Ncol és BamHI restrikciós helyeibe (lásd a 6. ábrán, a pOAS~, pöA?~ és pOA.8-plazmidok esetében) .

Ahogyan az 5. ábrán .látható, a B, burgdorferi 831, AGAI és Ip90 törzsek klónozott OspA. génjeit PCB-reakcióvai ampli fikái tűk a következő oügonukieotid primer párokat alkalmazva: (a) PH3 (10. azonosítási szám szerinti szekvencia) és CO3 (3. azonosítási szám szerinti szekvencia); (b) PK3 κ *· * χ »

X·* * * ♦ χ 0 0 X 4 « 0X000 0 X 0 X 0

X Χφ φ» φφφ 400 (10. azonosítási szám szerinti szekvencia) és BZ1 (8. azonosítási szám szerinti szekvencia); valamint (c) PK3 (10. azonosítási szám szerinti szekvencia) és PK4 (9. azonosítási szám szerinti szekvencia) - sorrendben megfeleltetve - a megfelelő gének. N-terminális és C-termináiis végein, hogy ezzel a megfeleld amplifikált fragmenseket alakítsuk ki.

A pCMB.l- és pCMS2-plazmídok elkészítéséhez pTrc99a~ plazmidot (Pharmacia katalógus szám: 27-5007-01) és kanamloin rezisztencia gént (Pharmacia katalógus szám; 27-489701) emésztettünk, a kapott fragmenseket együttesen izolálva (9, ábra) . A pTrc39a~p.lazmid - 4197 bázispár nagyságú erős promőtert tartalmaz egy többszörös klónozó hely szomszédságában# amit erős transzkripciós termináló szignál követ <rrnB). A target gén expresszlőja a gazdasejt RNSpolimerázt használja fel# így lehetővé téve az alkalmazását az A. coli törzsek széles skálájában. Az expresszlő a laktő z szupresszor gén (laclg) szigorú szabályozása alatt van# amely gént a vektor hordozza, A laktöz represszor fehérje megakadályozza a target gén transzkripcióját az XPTG indukálószer hiányában, A kanamiein rezisztencia gén lineáris kettős-szálú 1282 bázispár (bp) hosszúságú DNS-fragmens, amely a TnS03 transzporon génjét tartalmazza restrikciós enzim hasitó-helyekkel határolva és az amínogiikozíd 3^ffoszfotranszferáz enzimet kódolja, amely kanamicin és neomicin rezisztenciát közvetít, pCMBl - 5# 5 kb nagyság - tartalmazza a kanami cin rezisztencia gént olyan irányítottságban# hogy transzkripciója ugyanabban az Irányban történik# mint ami a Trc promö37 *** * ♦’i·· # « y* * * « « * »$ <· * * « * * * * Φ ♦*** * > « * * Φ í *♦ ΦΦ »Φ* XX* térből indul, mig a pCMB2 a kanamicin rezisztencia gént az ellentétes irányítottságban tartalmazza oly módon, hogy a rezisztencia gén és a kívánt gén transzkripciója a Trc promóter szabályozása alatt konvergáló transzkriptnmokat eredményez. A pCMBi és pCM82 restrikciós enzimes hasításai az Smal, KindlII és Basái! * Mool restrikciós enzimeket alkalmazva az előre jelzett pontos mérető fragmenseket mutatta,

A pOAS- és pOA6~plazmldokat az &, coll expressziós törzsbe vagy más megfelelő élő szervezetbe transzformáltuk, előnyösen DHSa kompetens sejtekbe, A transzformált gazdaszervezeteket tenyésztettük és fehérjét Indukáltunk 1FTG segítségével, Az indukálás Időgörbéje pOA5 esetében (78, ábra) hasonló volt a pOAl esetében tapasztalt görbéhez (7A> ábra), mig a pOA6 által termelt OspA szintek többszörösen alacsonyabbak voltak PC, ábra). A pöAS esetében kapott eredményekkel azonos eredményeket kaptunk pOA7 és pOA8 alkalmazásával.

A rekombináns teljes hosszúságú OspA termelésében és tisztítása során alkalmazott lépéseket mutatjuk be vázlatosan a 8A-8C, ábrákon. Itt tüntetjük fel a folyamat specifikus körülményeit, ahogyan ezt az alábbi példákban megadjuk.

A sejttenyésztési lépést és a fehérje indukáiását követően (8A, ábra) a sejteket fagyasztásos-felengedéses lizísnek vetjük alá, A llzátumot detergenssel kezeljük, amely szelektív az OspA fehérje szolubllízálásra, a lisatumban található egyéb bakteriális fehérjékkel szemben. Azt találtuk, hogy Triton X-114 szelekt.lv módon szoiübilizál egv 31 *·«* * *·«·*

X kilodalton molekulatömegű fehérjét, amelyről ímmunblottolás segítségével kimutattuk, hogy megegyezik az OspA fehérjével ,

A találmány szerinti eljárás nem korlátozódik Triton X114 alkalmazására, hanem egyértelműen magába foglal más olyan anyagokat is, amelyek hasonló szelekt.lv szolubilitásfc mutatnak OspA esetében és hasonlóképpen a fázis szétválasztásos tulajdonság esetében az alábbiakban hivatkozott mérsékelt körülmények között.

A szelektív detergens hozzáadását kővetően a keveréket mérsékelt hőmérséklet emelkedésnek tesszük ki, körülbelül 35-40 °C-ra melegítve, amelynek hatására az oldat opálos lesz, ahogy a fázis szétválás létrejön,

Az opálos keverék centrífugálása a keverék szétválását okozza három fázisra, nevezetesen egy detergens fázisra, amely az OspA fehérje 50%~át vagy többet tartalmazza és a bakteriális fehérjék kis mennyiségét (körülbelül 5 súlyszázalékát) tartalmazza; egy vizes fázisra, amely a bakteriális fehérjék többi részét tartalmazza; és a fehérje maradékok szilárd üledékére. A detergens fázist elválasztjuk a vizes fázistól és a szilárd üledéktől.

Az OspA szempontjából szelektív detergenssel történő kezelési lépésekkel és a detergens fázis ezt követő fázis szétválasztásával az ÖspA lényegében teljes elválasztása érhető el a bakteriális eredetű fehérjéktől. Csupán az OspA végső tisztítása marad hátra a. visszamaradt bakteriális fehér j éktől, amelyek a detergens fázisban még megtalálhatók.

* «.« » * * X· *

X *

χ. * * * * X

X X ♦ * > £ν« χ. «

Φ X X

X XX·*

X *

ΦΦΧ· « Φ Φ

A fehérje befejező tisztítását olyan kromatográfiás oszlopon végezzük, amely szelektív módon képes a bakteriális fehérjéket megkötni, de nem köti meg az OspA-t, közelebbről meghatározva DEAE-Sephacel, DEAE-Sepharose vagy más ezekkel egyenértékű kromatográfiás anyag, A detergens fázist az oszlopra visszük és a keresztülfolyó anyagot, amely az összes tisztított OspA-t tartalmazza, összegyűjtjük, A kötött frakció tartalmazza a detergens fázisban található összes bakteriális eredetű fehérjét. A további tisztítást követően, amikor S-Sepharose-t vagy azzal egyenértékű kromatográfiás anyagot alkalmazunk, azon túl, hogy az átfolyó frakció mentes a szennyező fehérjéktől, lényegében mentes Iipo-poiiszacharidtől is (LPS), amit a pirogenltás hiánya jelez, ahogyan ez limnlusz amóbooita lízátummal (LAld meghatározható, Az OspA nagytisztaságú oldata fagyasztva szárítható vagy más úton feldolgozható.

Kő zelebbről meghatározva a fentebb leírtak szerint és sára alkalmaztuk {(BI<21(DE3) sS)

A transzformált E pOAl-plazmidot állítottunk elő B. coll törzsek transzformáld(pLysS) (pOAl) és HMS174(DS3) ooll-t LB táptalaj ra oltottuk - amit kiegészítettünk 25 pg/ml kanamloínszulfátlal és 25 pg/ml kiöramfenlkollal - 12 mi oltóanyagot alkalmazva a tenyészet minden literére, A tenyészetet éjszakán át növesztettük lombik rázóasztalon körülbelül 37

C-on,

A rákövetkező reggel 10 ml szakán át növesztett tenyészetet kanamicin vittünk át 1 1 LB táptalajba, amely 25 pg/ml szulfátot tartalmazott ás a tenyészetet lombik «ΦΦΧ Φ X Φ Φ

ΧΦ X φ * * X ΦΦ

Φ X Φ « « φ X

Φ X φ φ' φ ΦΦΦ rázőasztalon növesztettük körülbelül 3? °θοη 0Σ> « 0,6 szintig (bár 0X5 ~ 1,5 tenyészet is elérhető) körülbelül három óre alatt.

A tenyésztő táptalajhoz izopropil-tiogalaktozidot (XFTG) adtunk 0,5 MM végső koncentrációig és a tenyészetet ováhbi két órán át növesztettük körülbelül 37 C-on. Ezen időtartam végén a tenyésztáptalajt körülbelül 4 ^a€~ra lehűtött ük és centrifugáltuk (1000 g, 10 percig). A felülúszót eldobtuk, mig a sejt üledéket egytízed térfogatnyí PBS-ben újra-szuszpendáituk, A sejt szuszpenziót folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és kívánt esetben korlátlan ideig tárolható -70 ^aC-on.

A sejt szuszpenzíö lefagyásztását követően a sejteket szobahőmérsékletre hagytuk felmelegedni (körülbelül 20-25 '^:C-ra) ami a sejtek lizísét okozza. A felengedett anyaghoz DNáz-l-t adtunk 1 pg/ml koncentrációban és a keveréket 30 percig ínkubáltuk szobahőmérsékleten, rifásának csökkenéséhez vezetett.

ami az anyag viszkoAz inkubált anyagot jégen lehűtöktűk .10 ^ÖC hőmérséklet alá és Triton Χ-114-t adtunk hozzá 10 tömegszásaiékos törzsoldat formájában 0,3-1,0 tömegszázalék végső koncentrációig. A keveréket jégen tartottuk 20 percig. A lehűtött keveréket ezt kővetően felmelegítettük körülbelül 37 °C-ra és ezen a hőmérsékleten tartottuk 10 percig.

Az oldat erősen ©pálossá vált, ahogy a fázis szétválás hekövetkezett. Az opálos keveréket ezt. követően centrífutok (12x000 g, körülbelül 20 *C~on, 10 percig) ami a keverék szétválását, okozta egy alsó detergens fázisra és egy ~ 41

Φ «ΦΦΦ »**♦ Φ «*** φ φ * * * *

4 X Α « ♦ X «

Φ Φ Φ Φ Φ Φ χ χ * * φ «« φφ φφ « φφφ felső átlátszó vizes fázisra, valamint szilárd üledékre. A detergens fázist elválasztottuk a másik két fázistól és 4 °C-ra hűtöttük az Üledék felkavarása nélkül, Puffer A-t 50 mM Trísz, pH 7,5; 2 mM EDTA és 10 mM NaCl - adtunk a lehűtött detergens fázishoz, hogy azt az eredeti térfogat egyharmadára állítsuk he, A kapott oldat lefagyasztható és tárolható későbbi feldolgozásra az alább leírtak szerint vagy rögtön feldolgozható ezek szerint,

DEAE-Sepharose CL-SB oszlopot készítettünk 1 ml/10 ml detergens fázis térfogataránnyal és £ térfogat puffer C~vel ~ 50 ssM Trisz, pH 7,5; 2 mH EDTA; 1 N NaCl és 0,3 tömegszázalék Triton X-100 - mostuk és utána 4 térfogat puffer Bvel ~ 50 mii Trísz, pH 7,5; 2 mM EDTA és 0,3 tömegszázalék

Triton X-100 - mostuk,

A detergens fázist ezt követően az oszlopra felvittük és az OspA-t tartalmazó átfolyó anyagot összegyűjtöttük. Az oszlopot 1 térfogat puffer 3~vel mostuk, és az átfolyó anyagot ismét összegyűjtöttük, A kombinált átfolyó anyag tisztított OspA vizes oldata volt, amely tárolás céljára lefagyasztható.

Az oszlopot ismételt felhasználáshoz megszabadíthatjuk a bakteriális fehérjéktől oly módon, hogy 2 térfogat puffer

Övei eluáljuk.

A DEAE-Sepharose oszlopról az átfolyó anyag további és végső tisztítása kromatográf iá val történt, S-Sepharose Pást Plow kromatográf iával. A DEAE-Sepharose oszlopról az átfolyó anyagot először pH 4,2 értékig savanyítottuk 0,1 M citromsav hozzáadásával. Az S-Sepharose Pást Plow oszlopot

Φ »Φ+Χ *<«» X *« Φ · χ « X Jt* X «X Φ Μ * * » * χ «Φ V ♦ Φ Φ Φ 9 Φ

Φ »Λ ΦΦ »*Φ ΦΦ* alaposan mostuk puffer C-vel, amit citromsavval pH 4,2 értékre állítottunk be.

Nagymértékben tisztított OspA-t eluáltunk as oszlopról puffer C-t alkalmazva, amelynek pH-ját 5,7 értékre állítottuk citromsavval. Az eluátum pH-ját rögtön visszaállítottuk pH 7,5 értékre 2 M Trisz bázis hozzáadásával.

A mindkét kromatográfiás eljárással nagymértékben tisztított OspA vizes oldatát Coomassie-festett géleken analizáltuk és igazoltuk, hogy OspA-t tartalmaznak, nagymértékben tisztított formában. Az utóbbi kromatográfiás eljárással előállított termék tisztasága nagyobb volt, mint amit az előbbi kromatográfiás eljárással kaptunk, nagyon alacsony endotoxin szinteket mutatva.

A pöAS- és pOA6~plazmidokat a fentebb leírtak szerint állítottuk elő és a DHSa A. coli törzs transzformálásához alkalmaztuk. Az 1. példában alkalmazott fehérje expressziós eljárást ismételtük meg és az OspA lipoprotein expressziójának időgörbéje a pOA5 esetében azonos volt azzal, amit a pOAl esetében figyeltünk meg, míg az OspA expresszíója a pOA6~plazmiddal többszörösen alacsonyabb volt, mint pOA5 esetében (7B. és 7C. ábrák). Az OspA fehérje tisztítását csak pOA5 expresszáló sejtekben folytattuk.

Az ezen az úton a Tre expressziós rendszerrel termelt B31 OspA lipoproteínt az 1. példában leírttal azonos eljárás szerint tisztítottuk, azzal a kivétellel, hogy 0,1 mg/'ml lizozimot adtunk a sejt üledékhez a begyűjtés után és a sejteket 30 percig szuszpendáltuk szobahőmérsékleten lefagyasztás előtt.

$ Φ φ X φ Φ Φ φ κ ϊ- * * φ * φ *

Φ φ X- Φ Φ ΦΦ Φ * φφ φφ

ΦΦ * φ < φ φ φ φ

ΦΑφ Φ φ«

A DEAE-Sepharosa oszlopról nyert átfolyó anyag OspA lípoproteint tartalmazott, nagymértékben tisztított formában»

Megismételtük a pOAl~plazmid (pST promoter) és a pöASplazmid (TRC promóter) elkészítésének eljárásait - ahogyan ezt fentebb leírtuk - a B, burgder/eri ázsiai törzs (IpSO) kiónozott OspA génjével, hogy létrehozzuk a gént tartalmazó pOAS- (Trc promoter) és pŰAlÖ- ípET promoter) plazmidokat. Ezeken a plazmidokon restrikciós emésztést hajtottunk végre, ami megmutatta# hogy az összes előre jelzett restrikciós hely jelen van.

Az eljárásokat úgyszintén megismételtük a 8, burgdnrferí európai törzs (ACA1) klónozott OspA génjével.

hogy létrehozzuk a gént tartalmazó pOA7- (Trc promóter) és pOA9~ (pET promóter) plazmidokat. Ezeken a plazmidokon restrikciós emésztést hajtottunk végre, ami megmutatta, hogy az összes előre jelzett restrikciós hely jelen van.

A pOA7 és pOAS expressziós törzsek tenyésztése és indukciója a pOAS törzzsel azonos módon ment végbe, míg a pQA9 és pOAlÖ expressziós törzsek tenyésztése és indukciója a pOAl törzzsel azonos módon ment végbe.

Az ezen műveletek során kapott ACA1 és Xp90 lipoproteIneket a fentebb leírt .831 (pOAl) OspA lipoproteinnel azonos módon tisztítottuk, A DEAE-Sepharose oszlop átfolyó anyaga OspA lipoprotelnt tartalmazott nagymértékben tisztított formában,

A rekombináns lipidezett 831 OspA ~ a fentebb leírtak szerint előállítva - az alább következő példák formulázásaíban került alkalmazásra; azonban a kitanítás szerint, más * χ χ * x χ * * * X X * X * X χ X X * ** ** ♦·* « XX* törzsekből származó rekombináns OspA úgyszintén alkalmazható, különösen Európa vagy Ázsia háziasított állatai esetében.

Ahogyan Appel és munkatársai által leírásra került (Appel és mtsaí.: J. Infecfc. Dis. 16? 651 (1993)}, a kutyák fogékonyak Lyme-kórra és aggodalomra ad okot a kutyákról emberre történő átvitel lehetősége, ami kívánatossá teszi a kutyák vakoinálást Lyme-kór (Borrelia burgdorferi) ellen.

Előzetes hatékonysági tanulmányok:

kutyát alkalmaztuk a kísérletben: 4 kutyát oltottunk he bakterin alacsony koncentrációjával (lőj) ; 4 kutyát oltottunk be bakterin magas koncentrációjával CIO⁹} / négyet adjuvánssal kiegészített OspA formulázással és 2 kutyát tartottunk meg, mint kontroll állatokat. Természetes úton megfertőzödött kullancsokat alkalmaztunk a kutyák antigénnel történő összehozásában. Az összes beoltott kutya teljes mértékben védett volt fertőzés ellen és bizonyítható volt antí-B, burgdorferi, anti-OspA ELXSA antitestek jelenléte éppúgy, mint növekedést gátló antitestek jelenléte. Mindkét kontroli állat fertőződött.

WWW * tó -

♦ íít * í $ »l <

♦ s

X X\\ ΛίΑ· * X Λ 4» * «'

X V * *» *

X » * :♦ * ♦ * χ t* 5» » 4 χ *

4* >X* *v*

Jxodes daminni-t gyűjtöttünk be oly módon, hogy fehér zászlókat vonszoltunk végig erdős területeken Westchester megyében (New York állem), az antigénnel történő Összehozás előtt egy héttel. Az ezen területről gyűjtött kullancsok több mint 60%-a általában fertőzött.

A kullancsokat fejlődési állapot és nemek szerint osztályoztuk és alkalmazásukig 98% relatív nedvességtartalom mellett tartottuk. Az antigénnel történő éríntkeztetés idején 15 felnőtt nőstényt és 7 felnőtt hímet helyeztünk az egyes kutyák megnyirt bal horpaszára műanyag sapka alá, amelyet egy hétig tartottunk a helyén rugalmas szalaggal lekötözve. Ez az Időtartam elegendőnek bizonyult, hogy a kullancsok vérbőségét érjük el.

Mintagyűjtés:

Bőr blopsziákat (4 mm ^>? lyukas ztásos biopszla) hajtottunk végre az antigénnel történő éríntkeztetést követően egy, kettő és három hónappal és a boncolás idején a kullancs befúrődási helyéről és Bőrrel ia burgdorTeri izolálásához tenyésztettük.

Vérmintákat gyűjtöttünk hetente BO naptól az antigénnel történő éríntkeztetés napjáig (D42), ezután kéthetente a boncolásig. Szérum antitesteket vizsgáltunk az alább leírtak szerint,

Boncolást hajtottunk végre körülbelül 100 nappal (97109) az antigénnel történő összehozást követően. Izom és izületi tok anyagot gyűjtöttünk a bal és jobb térdkalácsból, mellső izomból, hátsó izomból, könyökből és vállból és Borralia burgdor/eri izolálásához tenyésztettük.

♦ 4 «·>> * jt ·* 9 * * * ♦ *·

-βίί «*>*««

Tenyésztési módszerek:

A mintákat BSKII táptalajban megőrültük és BSKII táptalajt tartalmazó csövekbe oltottuk. A csöveket 34 ^öC-on inkubáltuk δ hétig, Az egyes csövekből hetente mintát vettünk és B. burgdorferi megjelenésére szkrineltük sötét látómezejű mikroszkóppal. A B. bargdor/ezd bármely megfigyelését pozitívnak vettük.

Szerológiaí módszerek:

RM ELISA:

Ez az eljárás közvetett EliSA. Az antigén Franciaországban kullancsokból izolált Bb212 B, burgdorferd törzs mosott szonlkátuma. A konjugátum kecskében előállított kutya elleni IgG. A szubsztrát tefcra-metil-henzidin (TMB). A litereket mint 450 nm~nél és 620 nm~nél mért különbségi OD értéket adjuk meg a szérum minta i/100 arányú hígításánál.

Corneil ELISA:

Est a vizsgálati eljárást Appel (Appel és mtsai.: lásd fentebb] leírása és referenciái alapján hajtottuk végre. Ez az eljárás közvetett EL1SA. Az antigén Westchester megyében gyűjtött X. dammdnd-bói izolált alacsony passzáiás! fokú 8. bargdorferd mosott french-press” iizátuma. A konjugátum és a szubsztrát a fentiekkel azonos. A litereket mint kinetikus E'L'XSA egységeket fejezzük ki.

OspA ELISA:

Ennek a közvetett EL1SA vizsgálatnak a végrehajtásához laphoz kötött antigénként rOspA-t alkalmazunk. A konjugátum alkalikus foszfatáz kecskében termeit kutya-elleni IgG. A. szubsztrát signa 104 foszfatáz szubsztrát (NA 0200). A ♦ * * * V * Φ *

X* « * * Φ * ν * ·> * * * »* « Φ Φ ♦ ♦ $ X φ Φ* ί » » « t Φ titereket mint a legnagyobb hígítás log^e értékét, fejezzük ki, amely hígítás 405 nm-nél nagyobb mint 0,1 ÖD értéket mutat.

Növekedés gátlás! vizsgálati eljárás:

Ezt a vizsgálati eljárást Sadziene (Sadziene és mtsai.:

0. Xnfecfc. Dis. 167 165 (1993)] leírása alapján hajtottuk végre. A szérumot sorozatosan kihígítottuk és B, burgrforf'erí organizmussal inkubáltuk 62-55 órán keresztül két hemolítíkus egység tengerimalac eredetű friss komplement jelenlétében. Erre az Időre a fenolvörös szín indikátor a SSKXI tenyésztési táptalajban rózsaszínről sárgára változott azokban a lyukakban ahol jelen voltak splrocéták,. Ehhez a ponthoz képest mindegyik oldalról három lyukat vizsgáltunk meg sötét látómezejű mikroszkóp segítségével annak a hígításnak az igazolására, ahol az életképes sejtek száma 90%-kal lecsökkent. A litereket mint ezen hígítás log^ö értékét fejezzük ki.

Eredmények:

Bőr bíopszíák:

Az eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be. A kontroll kutyákat pozitívnak találtuk mindegyik mintában. Nem találtunk pozitív mintát a 12 beoltott kutya egyikében sem.

« X * ♦ » X ΐ

X M

X ΐ ♦ « > X X X <x ♦ « ’xx <x i XXX X X * X X X X X * A * «« « * ♦ ♦ ♦

V « ♦ X » * » ♦ » ♦ # ♦

Boncolás - tenyésztési eredmények:

Ezeket az eredményeket részleteikben a 3, táblázaton mutatjuk be» Mindkét kontroll kutya pozitív tenyészeteket adott különböző szervekből bármelyik oldalon, Az izolálások aránya nem tűnik gyakoribbnak a bal oldalon (kullancsokkal történt összehozás helye) mint a jobb oldalon.

ny ör vakéi sí

hő beadás során, tajfets* Ml,

4<XX

X *XX

X

X X X X X 44

X X » 4 * » x

XX * 4

XX <<

X X<X 4 » » ♦ X X

X

X Φ Φ « Φ φ' *9 Φ Φ χ ΦΧΦ

Φ Φ 9 Φ 9 X φ Φ φ 9

Φ Φ 9 «X φφ Φ φ ΦΦ

KM EL1SA;

Az eredményeket a 4. táblázatban mutatjuk be. Az OspA vakcina vagy a bakterinek bármelyikével történő vakcináiást követően a legtöbbjük észlelhető emelkedést mutatott a Literekben egy injekció után, jelentős mértékű gyorsító hatással a második vakcinálásból.

At érintkeztetést követően a vakcináit kutyák titere! stabilok maradtak, de a kontroli kutyák esetében fokozatosan növekedett egy kéthónapos időtartam alatt.

í t Κ ί ♦ ♦ φ ♦ *** ί

φ

vakcina «ss· pert

állatok «4»

vakcin

IIÍS 2

irts eltelt napok

,2‘

. 8

| u

(21*

: 28

1

U*

* 81

75

»

183

ns

1

?

Mi

ss

? tó

, tó„

mB

tó

83$

......MJ,

838

tt

H

a

tó

w

' W

M

831

tó

......tó,;

kontrollok

Márts

833

tó

tó

tó

tó

MJ

tó

«

: 81

átlag St11

í 0?

481

8.8?

tó

w

tó

8,8?

884

w

A

1

88

83$

O

81

tó

tó

tó

tó

«

ms

OspA

2

88

838

$31

8.44

81

«1

tó

tó

tó

„ ,2.«

,B

________________J................ í: 8«

88

831

tó

tt

81

tó

tó

81

8.4?

83?'

i 2 F 31024

í

ω

88

tó

848

w?,

tó

5.44

w

tó

j «>

tó

. tó

«zárás

au ;

838

835

83?

44

83?

tór

.. B

844

átlag

ω

8$

tt

83Í

tó ,

83?

tó

MS

tó

tt

8.88

! 8

3

tt

838

838

tt

tó ·

838

tó

tt

838 ,

Ml

tó

j Bacterin

4

ω

tó

tó

tt

tó

tó

Ml ,

8.4?

tó

uöh

M

tó

4»

tó

W í

Mi

W '

tó' ’

844,

tt

B,

tó

.......H8„

Π

tó.

41« Ϊ

8.88

tó'

tó

tó

tó

tó

tóln

tó

m

15 A 830

«árts

838

tó

8$'

,tó '

838

tó ·

8,48

8.44

B,

tó

átlag St1

tó

0?

tt :

tó '

w

«Sí

tói

Μ»

8,84

8,8$

tó

C

5

838

Br'

yi

83?

$,$;

w

454

M

83?

34..

tó

1

r Bacterin

6

,F

w !

w :

tt

8Ϊ

M

tó

tó

tó

, tó

81

uo’í

............. Π .

&sr,

8?^,

838

W i

Ml

tó

tón

83?

MJ

tó

.....5,

n

ω

tó'

8,2? ,

tó

31......

31

tó

w ,

M

Mt

w

15 A 850

szórás 1

tó

tt '

tó

83?

$

»

w

33?

tór

tó [

838

átlag St* f

tó t

tt

81

3« !

Í.88 $

338

3.88

3.88

tt

tó 1

X * * 4 4

4X 44 4 X4 * 4

X4t 4 4 *

4 X

Λ *4*

Cornell BUSA:

Az eredményeket a 5. táblázatban mutatjuk be.

Az antitest növekedési eloszlás csaknem azonos az RM

BUSA esetében kapott eredményekkel.

Az összes vakcináit jelentős mértékű emelkedést mutat a literekben egy injekciót követően és gyorsító hatást mutat a második vakcináiás hatására. Az antigénnel történő összehozást követően a titerek stabilok maradnak.

A kontrollok fokozatos emelkedést mutatnak a literekben három hónapos időtartamon keresztül.

vakcina csoport	állatik süm	....... . vakdnáüs után eltelt i	apók
5*	8	(;H	JP	,28	35 12“	.«1	25	' 83	103	1«	131	Hl
1	1	$	N8	3Í	47'	35	44	43	80	73?	278	327	, 11	' 437	w
	H	2$	KO	24	30	38'	43	M	52	703	234	203	355	. 323	B
kontrollok	szórás	32		37	33	Λ 34	'72	30	55	757	223	377	383	478	307
	átlag Stj ;	$		3	3	0	3.	5	4	3?	77	23	3	$	7
A	1	4?	NO	a	»	$3		,«	W	5?	52?	a	47?	452	:a
3spA	2	$3	NO	73	742	533	455	485		257	2!S	204	104	174	80
	8	3? ,	NO	70?	303	»	8?3	$3.	383	5®	5«	842	47?	455·	420
2 F 31024	?		NO	304	323 '	57?	'520'	ΐ M	5® ’	« ' -n	<	a	4A4	3»	NS L ' .ri^
	szórás	$ ,	<L		#4	'«	587		588	455	447	423	385	w
		.74		78?		25 ,	;' <8		2........	735	785	18	737	732
B	3	74	74	330	453	515	51	3??	w	570	832	«	573	8?3	Sffi
B&ctexift	i	$	0?	331	275	50?	553	553	8«	02 :	«	505	<	840	: 042
ilö'}	10	§	23	no	332;	§8?	m	555	«55	442	504	«	485	e	401
	11	70	33	IÖ?	«(	©	»	5«	50?		420	430	433	442	40?
15 A m	szórás	20	«8	g	352	325'	m	374	w .	574		' 454	.«	}	502
	átlag St11	,33	33	73	20	27 „	30	$	43	50	® ,	. JSjf.....	'	78	JL
c	5	$	»	271	347	O	w	525	§77	sss	5«	»t	w	488	474
Mottón	5	J5	133	oss	®	520	038	58	SÍN	405	518	« ,	870	,40?	358
SW’í	12	n			.2??	®	$'83	»1	484	3!/	3»	»	3«S	20	284
	13	IJ	41	,350	47?	545	545	53!'	«	004	«		403	444	a
15 A 850	stóds		03	Í8	2?3	553	503			«	487	438	Λ	424	300
		34	33	??	75,	40	55	53 ,	72 '	703 ,	05	03	82	K	8 Lwi

* mx *XX

X 4 4 4 4 4 4 « 44

4 4 4 ί X 4

44

♦ 4 *4X44

X 444 ί ί ♦ 4 4 4

X χ * * ΦΦ Φ

Φ Φ φ χ y * * Φ χ Φ « χ « Φφ Φ ν Φ

Φ φφ φ* ΦΦ» ΦΦ*

OspA SLISA;

Az eredményeket a 6. táblázatban mutatjuk be,

Mindkét bakterin hasonló anti-OspA ellenanyag szinteket indukál.

Az OspA vakcina jelentős mértékű homológ antitest választ indukál.

Az eloszlás hasonló a teljes sejt lizátumokon végzett ALISA során kapotthoz: emelkedés egy Injekció után, gyorsítás második injekcióval.

Növekedés gátlás:

Az eredményeket a 6. táblázatban mutatjuk be.

Mindkét bakterín és az OspA vakcina B. burgdor.fe.ri gátló antitestek magas szintjeit indukálta az összes beoltott kutyában.

ΦΦ * *

5/ rsb*· összehozás esetén kutyákban, t a végpont hígítás tízes alapú logantwsa foraájábas fejezzük ki).

	állatok száma	ELISA	I. C.
i30	D21	M2	M2
! 1	7	1,7	U	1,7	< 0,9
kontrollok
A	<A>	2,3	2,9	> 3,8	-— 3,3
OspA	2	1,7	2,0	3,2	3,0
2 F 31024	8	1 7	2,9	3,8	3,5
	3	2,0	2,9	> 3,8	2,7
δ	3	2	2,9	> 3,8	3,5
) Sacterin	á	Λ £	2,3	> 3,8	2,8
Í1O;)	10	1,7	2,3	>3,8	2,7
15 A 030	n	1,7	*ϊ Q &f v?	>3,8	2,7
C	5	2,3	2,8	> 3,8	3
Bacterin	δ	2	2,5	3,2	2,9
ίΐή	12	2,3	2,3	*1 Λ 3/Z	2,7
15 A SSö	13	2	2,9	>3,8	3

í 4i * í í í » í ♦ * jí *»««* ♦ Oí < ί ! x ♦ ♦ ί í « φ φ X Φ φ X φ * ♦ φ X Φ Φ * φ JÍÍ ♦« * φ

κΦ*

Antigénnel történő összehozás:

Az alkalmazott összehozás! módszer különböző előnyökkel rendelkezik más leközölt antigénnel történő összehozás! módszerekhez képest, amelyek S. bnrgdorferl tűvel történő beadásán alapulnak.

- Az antigénnel történő összehozásra alkalmazott vektor és bejuttatás! útvonal a természetes körülményeket utánozza »

- A fertőzés in vivő nyomon követhető bőr biopszia segítségével.

Továbbá az antigénnel történő összehozás (Amerikai Egyesült Államokból származó kullancsok) heterológnak tekinthető a két hakterinre (francia törzs).

A klinikai jelek hiánya korlátozást jelent, de ahogy ezt Appei és munkatársai leközölték, es teljes mértékben elvárható Ilyen életkorú kutyák esetében,

Ezen körülmények között az eredmények - azaz az összes kontroll fertőződött és a 12 vakcináit közül egyik sem fertőződött - azt mutatják, hogy mind a bakterinek magas vagy alacsony koncentrációknál és az OspA vakcina teljes mértékben megvédte a kutyát az antigénnel történő összehozás hatásától .

A három vakcina hasonló eredményeket adott az összes alkalmazott eljárásban; emelkedés egy injekció után, gyorsító hatás a második injekciótól, ♦ φ· φ φ * φ # * * * φ **Φ

Κ Φ* χ Φ * φ * X *

Φ ΦΦ »*· φΧ.Φ

Érdekes megfigyelni a magas fokú korrelációt az alkalmazott két lizátum ELISA között (RM ELISA, Cornell ELISA) az antigén termelésére szolgáló törzsben fennálló különbség és az eredmények különböző kifejezése ellenére (3. ábra; r'^: ~ 0,8«, E = 935, ct = 0,001).

Azt is fontos megfigyelni, hogy a vakclnálás során indukált antitestek;

erőteljesen reagálnak OspA-vai, amely a B. öurgdorberi fő külső membrán fehérjéje;

- erőteljesen gátolják.a B, burgdorberi növekedését.

Következtetések:

Kis dózisé (10') vagy nagy dózisé (10⁹) B, bergdorberi elölt sejteket tartalmazó bakterinek teljes mértékben megvédtek a kutyákat amelyeket természetes úton (kullancsoknak kitéve) hoztuk Össze az antigénnel.

Azonos eredményeket kaptunk az OspA-val mint adjuvánssai kiegészített vakcinával.

Az összes vakcina jelentős mértékű és hasonló jellegű növekedést mutatott antitest literekben, amely antitestek felismerték as OspA lipoproteint és gátolták a Β» burgdorberz növekedését.

Harminchárom (33) beagle-t két csoportba osztottunk. Az első csoport (20 kutya) monovalens vakcina (10 pg/dőzls OspA rekombináns 831, az 1. példában ismertetett eljárással előállítva) két SO dózisát kapta 3 vagy 4 hetes vakcínációs .M. Μ» * *♦♦*♦**♦ .♦«*♦*

S? φ X Φ Φ Φ Φ ♦ Φ * * ***

Φ9 Φ« » Φ χ 9 * * φ Φ χ ΦΦ ΦΦ φ X ΦΦ időközzel, A második csoportot {13 kutya) nem kezeltük. Az Összes kutyát kullancs fertőzésnek tettük ki 5-6 hónappal a második vakcináiást követően, Rendszeres időközökben antitest szinteket határoztunk meg ELISA segítségével, A vakcina hatékonyságának értékeléséhez ismételten spírocétákat izoláltunk az összehozás után egy vagy két hónappal később. Hasonlóképpen az állatokat a kutyák Lyme-kórját (LD) jelző klinikai tünetekre is megfigyeltük.

Biztonságosság; nem figyeltünk meg káros helyi vagy általános reakciókat a vakcina injektálását követően.

A monovalens Ly OspA vakcina:

- védelmet biztosit kutyafélék LD-je esetében, ahogyan ezt mind spirocéta újra-izolálás alapján és klinikai tünetek alapján értékelhető;

- ez a védőhatás hatékony legalább öt hónappal a vakcinái ást követően;

X X X X χ X χ χ

X XX * « χχ χχ χ jt x X » χ X XX χ χ χ χ χ XX X X

X x* XX XXχ »xx ~ védelmet biztosít spirocéta fertőzés ellen (90%) és klinikai tünetek ellen természetes úton antigénnel történő Összehozás esetén.

Harminchároxa beagle-kölyök (bármely nembői; kilen-tíz hónapos korúak; negatív Lyme és Leptospíra vakcinálásra} került beszerzésre a Ridglan Farms (Mount Horeb, WI) cégtől. A kölyköket random módon két csoportba osztottuk és beoltottuk.

csoport	kutya	beadás útja	kezelési protokoll |
1	10	SC	Ly; 4 hetes időköz j — j
2	10	SC	Ly; 3 hetes időköz |
3	13		kezeletlen kontroli j

Vakcina előállítás:

Az OspA monovalens vakcinát (elnevezése Ly) oly módon állítottuk elő, hogy az 1, példában leírtak szerint előállított B31 OspA tisztított fehérje törzsoldat koncentrációját kihlgítottuk, A törzsoldat koncentrációja 465 gg OspA/mi volt. A Lyme vakcina előállításához a törzsoldat koncentrációját steril hígítóval kihlgítottuk 10 μσ/ml OspA koncentrációra és a vakcinát kisebb egységekbe szétosztottuk egyszeri és többszörös alkalmazásra szolgáló fiolákba (sorrendben megfeleltetve 1 ml és 10 ml). A vakcinát kielégítő eredménnyel vizsgáltuk meg sterilitásra.

* «*** «00* * **** 0 < JÍ X* Λ * fi χ * χ «*« ««00« «0 0 0 0 0 0« 0« «* « «»*

Vakoinálási protokoll:

A kutyák a vakcina két dózisát kapták (dózisonként 1 ml szubkután beadva# háromhetes (1. csoport) vagy négyhetes (2. csoport) időközökben). Megfigyeltük az anafilaxia tüneteit - beleértve a légzési nehézségeket, viszketést és ödémát - az injekciót követő kezdeti 15 percben, A továbbiakban a kutyákat folyamatosan figyeltük a vakcinálást követő első órában és utána rendszeres időközökben az egyes injekciókat követő 14 napig. A megfigyelt tünetek közé tartoztak az alábbiak: duzzadás, fájdalom, érzékenység és vakaródzás az injekció helyén. A második injekció beadását megelőzően az elsődleges vakcinálás helyét tapintással megvizsgáltuk duzzadásra és érzékenységre.

Vért vettünk titer meghatározásra az egyes vakcínálások előtt és azt követően hónapos időközökben. Az OspA litereket ELISA segítségévei határoztuk meg.

Antigénnel történő összehozás:

Az összes kutyát összehoztuk A, bargdorferi-vel természetes úton megfertőzött kullancsokat alkalmazva, Appel és munkatársai antigénnel történő összehozás! eljárásának megfelelően. A végső vakcinálás és az összehozás közötti időtartam 24 hét volt az 1. csoport esetében és 21 hét volt a

2. csoport esetében. A kullancsokat New York államban, VSestchester megyében gyűjtöttük be, amely terület a Lymekorra endemikus és az antigénnel történő összehozást Appel és munkatársai eljárása szerint hajtottuk végre. Ezen kul4 444* <

44 4# fe * X 4 4 4 * *

4*444 *4 4 4 4 * 4 4 ** fe* 4 4 * * lancsok esetében a Borrelia hurgdorferi fertőzöttségi arány

60% volt.

Bor bíopszía és spirooéta újra-ízoXálás;

Az összes kutyán biopsziát hajtottunk végre az antigénnel történő Összehozást követően egy és két hónappal, A bőrt a kullancs befúródási helye környékén Xeborotváltuk, Betadine sebészeti törlőkendővel előkészítettük, intradermálisan injektált 2% lidokainnal érzéstelenítettük és lyukasztásos biopsziát hajtottunk végre Baker-féle bőr lyukasztót alkalmazva. A bőr mintákat renyásztáptalajt (BSK táptalaj hővel inaktivált nyúl szérum és antibiotikumok) tartalmazó csövekbe helyeztük és átvittük a laboratóriumba, A csöveket további táptaiajmennyiséggei kiegészítettük és üveghengerbe helyeztük. Az üveghengert hat hétig ínkubáltuk, A csöveket hetente megvizsgáltuk spirocéták jelenlétére sötét látómezőjű mikroszkópot alkalmazva. Legalább tíz látómezőt vizsgáltunk meg 4Gx objektív alkalmazásával, mielőtt a mintát negatívnak tekintettük.

Klinikai jelek és tünetek;

A fertőzést követően nem vártuk a kutya félék Lymekórjának klinikai tüneteit, a betegség változó természetének megfelelően, ezért a vakcinák hatékonyságát elsősorban a

Bőrrel!a burgdorf'e.ri spirocéták bőr hiopszía mintákból történő űjra-izolálhatósága alapján értékeltük. Azonban az Összes kutyát megfigyeltük az LB-re utaló tünetek megjele64 * 4 * ** φ « V φ * Jf «Φ X ♦ * S* * Φ φ « Φ * ♦ «-# *< ΊφΛ· X **>

nésére. Fájdalom és érzékenység, testhőmérséklet# bénaság# ataxia# levertség és étvágytalanság volt a tünetek között, amelyekre a kutyákat megfigyeltük. Becslés szerint a természetes úton Sörrel!a burgdorferi-vei fertőzött kutyák közül csak 10-15% mutatott klinikai tüneteket.

Vakcina biztonságosság:

Az összes beoltott kutyát megfigyeltük kóros reakciókra (beleértve az anafilaxiát) a vakcinálást követő első 15 percben és két hétig az egyes vakcinálásokat követően. Nem találtunk kóros reakciót semmilyen időpontban a Lyme mono™ valens vakcina bármely injekcióját követően. Továbbá nem. észleltünk duzzadást# fájdalmat# érzékenységet vagy viszketést az injekciós helyen a vakcinálást követő kéthetes időtartamban .

Az OspA elleni antitesteket ELISA segítségével határoztuk meg. A 7. táblázatban tüntetjük fel az ELISA értékeket. A kullanccsal történő összehozás idején a monovalens vakcinával (10 pg OspA) beoltott kutyák legtöbbje még mindig jelentős mértékű OspA antitest titereket mutatott. Egyetlen kutya - FÁS - nem volt képes jelentős mértékű antitest válasz produkálni az OspA ellen.

x <* $ * fr «Λ - ΐ » ν * fr* fr ♦ X * 9 fr * * * »Χ»ψ· fr « fr fr * * «fr fr fr* t frfrV

Spirocéta újra-izolálás (lásd a 7. táblázatot):

Bőr biopsziát hajtottunk végre az összes kutya esetében az antigénnel történő összehozást követően egy és két hónappal. A blopsziákat hat hétig tenyésztettük és megvizsgáltuk spirocéta üjra-izolálás céljából. Spirocétákat tudtunk újra-izolálni a tizenkét kontroll kutya közül hétből az első biopsziánál (58%), Egy mintát nem tudtunk értékelni, mert szennyeződés miatt elvesztettük öt hetes tenyésztés után. A kontroll kutyákból származó mind a 13 minta (100%) spirocétákra pozitív volt a második biopszla idejére .

Az eredmények azt mutatják, hogy a monovalens Lyrne vakcinával beoltott kutyák közül csak kettő (HVT és DXT) volt pozitív spirocétákra; az újra-ízolálás aránya 10%.

Kutyafélék Lyme-kórjának klinikai tünetei (lásd a 6. ás

7. táblázatokat):

Öt hónappal az antigénnel történő összehozást követően a 13 foeoltatlan kontroliból öt (39%) esetében tapasztaltunk LD-nek betudható tüneteket; két kutya esetében (HXT és JCT) többszöri előfordulást tapasztaltunk. A húsz vakcináit közül egy (5%) esetébexi is tapasztaltuk a bénaság egyetlen előfordulását.

Megbeszélés:

A vakcina hatékonyságának felméréséhez meghatároztuk a vakcina azon képességét, hogy megakadályozza-e mind a spírocéták szóródását és a klinikai tüneteket rövid távon és az immunitás! vizsgálatok ideje során. Kutyákban az LD lét66 $

Φ Φ ♦ φ ♦ * ♦ * Φ * » **·♦ «»«« $ S» « « *· χ* *’ «Λ.* ΦΦ⁵* rejötte gyakran nem eredményezi klinikai betegség megjelenését [Levy és Magnareiií: JAVMA 200 344 (1992)], ezért a klinikai tünetek feljegyzésén túl a vakcina hatékonyságát a kísérleti készítmények azon képességére alapoztuk, hogy megelőzik-e a spírocéták proliferációját, amit spírocéták újra-ízolálásával vizsgálhattunk bőr híopszíákfoől. A spírocéták űj ra-íseiáiása a legfontosabb és a legmeggyőzőbb figyelésibe vehető fényező, amikor vakcina hatékonyságát értékeljük, Amennyiben vakcinálás lecsökkenti vagy megszünteti ezt a szóródást, az állatban nem fognak klinikai tünetek kialakulni, A Dy vakcináról kimutattuk, hogy a páciensek több mint 90%-áfc megvédi a spírocéta proliferáciőtól a rövid távú hatékonysági vizsgálatban, ahogy ezt fentebb ismertettük, Ebben az immunitás! időtartam tanulmányban (Dől), amikor a kutyákat a vakcinálás után 5-6 hónappal hoztuk össze az antigénnel, a kezeletlen kontrollok 100%-a volt pozitív spirocétákra a második biopszia idejére. Ezzel ellentétben spirocétákat a beoltottak közül csak kettő esetében tudtunk űjra-izolální (.10%) „

A kutyákat a fertőzés eredményeként fellépő klinikai tünetekre is megfigyeltük. A megfigyeléseket as állatokat gondozó technikusok végezték, akik nem ismerték az egyes kutyák oitottsági állapotát. A fentebb tárgyait rövid távú hatékonysági tanulmány során a kezeletlen kontrollok 25%-a mutatta a kutyaféiék Lyme-kórjára (LD) jellemző tüneteket, főleg bénaságot, míg a beoltottak között nem figyeltünk meg tüneteket, Ebben a DÓI vizsgálatban a kutyák közül hat mutatott ilyen tüneteket; Öt heoltatlan kontroll volt (39%)

ΦΦ φ φ és egy kutya volt vakcináit (5%). A bénaság első előfordulását körülbelül két hónappal az antigénnel történő összehozás után észleltük; azt követően a kezeletlen kutyák közül kettő CJRT és IÁT) mutatott újabb előfordulásokat.

Egy vakcináit - HPS - esetében duzzadást és enyhe bénaságot észleltünk a jobb mellső lábon körülbelül 2 hónappal az antigénnel történő összehozást követően. Az állat sohasem volt pozitív a splrocéta izolálás során, bár az adott kutyából származó tenyésztéseket egyedileg megvizsgáltuk a bénaság előfordulását szem előtt tartva. Elképzelhető, hogy ez az előfordulás nem a kutyafélék 1-D-jének az eredménye volt, hanem más okoknak tudható be (sérülés, stb.). Azonban a kutyát, mint klinikai tünetekre pozitív egyedet vettük figyelembe annak érdekében, hogy a vizsgálatot a lehető legszigorúbb kritériumok szerint végezzük.

Az antitest titer eredmények azt mutatják, hogy a monovale.ns vakcinával beoltott összes kutya egy kivételével (FÁS) szero-konvertálódofct a vakclnálás után, ahogyan ez meghatározható volt a vérvétel előtti és antigénnel történő összehozás előtti fciterek különbségéből legalább két hígítás esetében. Ez 95%-os szerokonverziős arányt jelent. Az antigénnel történő összehozás idejére kettő kivételével (FÁS és HVT) az összes beoltott még mindig jelentős mértékű títereket mutatott. A kontroll kutyák közül egyik sem mutatott fennmaradó megnövekedést az OspA antitest szintekben, bár három kontroli esetében előfordult alacsony antitest színt, ahogy az antigénnel történő összehozást megelőző vérvétel során feljegyeztük.

XX φ

XX « X X *♦*

X φ« φ * * * * * * χ χ χ Φ Φ χ .X χ Φ Φ *

A Ly monoválens vakcina biztonságosságát ezen kísérlet eredményei szintén igazolják, Nem észleltünk kóros hatásokat a vakcináiás idején, vagy az egyes injekciókat követé kéthetes időtartam során. A 10 pg OspA/dózis mennyiséget az összes kölyök jól tolerálta. Mivel ez a vakcina nem tartalmaz adjuvánst, még a legtöbb adjuvánssal kombinált készítménnyel történő vakcináidéra jellemző enyhe és átmeneti granulomatózisos válasz sem jelent meg,

Következtetés:

A monovaiens vakcina, amely 10 pg OspA/dózis mennyiséget tartalmaz;

- biztonságosan alkalmazható 9-10 hetes kölykökben;

- nagymértékben antigén jellegű és a páciensek 95%-ban szerokcnverziöt indukál;

- olyan immunválaszt vált ki, amely a beoitottakat megvédi a spírocéta fertőzéstől. (90%) és a klinikai tünetek ellen a vakcínálást követően öt-hat hónapig, amikor a kontrollok 100%-a mutat spírocéta fertőződést és 39%-a mutat klinikai tüneteket a kullanccsal történő összehozást követően.

Ez a példa azt is alátámasztja, hogy a találmány szerinti vakcina védőhatást biztosít egy teljes Lyme-kór szezonra .

7, táblázat. OspA elleni antitest titerek, spirocéta újra-izolálás és klinikai tünetek eredményei az immunitás időtartama vizsgálat során CDOX).

Κ * X «* » ♦

Az összes kutyán biopsziát hajtottunk végre az antigénnel történő összehozást követően 1, 2 és 3 hónappal (lásd anyagok és eljárások fejezet). A bőr mintákat BSK táptalajban tenyésztettük {antibiotikumokkal és 10% nyál szérummal kiegészítve) 6 hétig; a csöveket hetente megvizsgáltuk sötét látómezejű mikroszkópot alkalmazva, legalább tíz látómezőt megvizsgálva, mielőtt a mintát negatívnak tekintettük.

C±) jelölés; a minta szennyeződés következtében elveszett .

8. táblázat. Kutyafélék Lyme-kórjának klinikai tünetei öthónapos antigénnel történő összehozás során

meg j egyzés bénaság (összes végtag), afcaxia, levert, étvágytalan kontroll béna (bal mellső)

jdott béna (bal mellső); az Összes előfordulás j spontán felszívódott béna (bal mellső); az előfordulás spontán felszívódott

béna (hátsó lábak); spontán telsz ivódott béna ( jobb mellső); spontán felszívódott bén a (j óbb me11sö); spontán felszívódott béna (bal mellső); spontán felszívódott •b mellső); spontán felszívó- | ♦ « > * Φ X «

A kutyákat 1 ml Ly vakcinával oltottuk be szubkután (SQ) három- vagy négyhetes időközökben. Az antigénnel történő összehozást 5-6 hónapra végeztük. A kutyákat az állatokat gondozó technikusok kettős vak. módszerrel figyelték meg a klinikai tünetek megjelenésére.

3. példa

Kombinációs készítmények kialakítása, amelyek nem mutatnak hatékonysági interferenciát

Sz a példa azt bizonyltja, hogy nincs interferencia a kutya szopornyica, 2~típusú adenovirus, koronavírus, parainfluenza, parvovírus és a Sorreiia burgdorferü OspA antigén között.

Rövidítések:

komponens; rövidítés kutya szopornyica vírusa,

Rockborn (CDV_R) vagy

Onderstepoort (CDV₀) D kutya adenovirus, 2, típus (CAV₂) A kutya koronavírus, MLV (CCVJ C kutya parainfluenza, 2. típus (CPi) Pi kutya parvovírus, {CFV_XJ P_XI>

Ezeket a komponenseket módosított élő vírusból állítottuk elő (beszerezhető a Rhone Merieux Inc. cégtől, Athens,

ΧΦ Φ Φ φ φ φφ

Georgia# Amerikai Egyesült Államok). A vakcinákban a komponenseket az alább következők szerint formuiáztuk:

komponens;

Ü

A

C titér/ml (bogiid

S,2 vagy 5,4 (CDV& ** 5,2; CDV<

7, 4 5, 6

7,5

5,3

5,4)

A vakcinát, mint két külön komponenst állítottuk elő;

Az első komponens a kutya szopornyica - adenovlrus 2. típus - koronavírus - parainfluenza ~ parvövirusxí,# módosított élő vírus - amelyre a továbbiakban mint DACPiP_XI. hivatkozunk - amelyet egy fiolában iiofilizáltunk és nem tartalmazott semmiféle adjuvánst. A második komponens Borrelia burgdorferi volt. A 831 külső felületi membrán fehérje A-t (OspA) rekombináns technológia segítségévei termeltük, ahogyan azt az 1. példában leírtuk (elnevezése Ly vagy OspA).

A második komponens volt a folyékony komponens, amelynek segítségével a vakcina Iiofilizált komponenseit rehidráltűk a beoltás előtt. Az OspA frakció nem tartalmazott semmiféle adjuvánst.

A Iiofilizált DACPiPxb vakcinát kielégítő eredménnyel vizsgáltuk vírus azonosságra és titérre, Myoppiasma jelenlétére és biztonságosságra, anyagot Ly hozzáadásával rehidráltuk, amely tartalmazott. Az OspA vakcinát sterilitásra sterilitásra,

A Iiofilizált 13 ,ug/ml OspA- t vizsgáltuk.

X X Φ X Φ φ X

Χφ Φ φ* Φ Φ Φ * * * φ-ΧΦΦΧ ΦΦ φ · ..

χ ν Φ X* X *·>*'* ♦

Az OspA hígító oldat interferencia mentességét a vakcina liofilizált komponenseivel szemben In vltro viricid vizsgálattal határoztuk meg, amelyet a Szövetségi Regulációk Szabályaiban (9 C.F.R 113,35) magadott irányelvek szerint végeztünk el.

A liofilizált vírus frakció az OspA hígító oldattal szemben int er f e renc í a mént e s s é gé t úgy határoztuk meg, hogy összehasonlítottuk a szerolőglai litereket a kombinációs vakcinával (DACFiPxt * OspA) beoltott kutyák esetében és az OspA-val önmagában beoltott kutyák esetében (lásd a 2. példát) .

Mivel

DACPiPu,

OspA két különálló vakcina kombíná dójának az volt, amelyeket korábban már kiterjedt hatékonysági vizsgálatoknak vetettünk, alá, csak. kis számú kutyát kezeltünk annak kimutatására, hogy a vakcina liofilizált vírus komponense nem ínterferál az OspA frakció által a Lyme-kórral szemben kiváltott védelemmel és vice versa,

Húsz kutyát randomizáltunk életkor, származás és nem szerint és együtt helyeztük el, Tíz kutyát, oltottunk be a DACPiPxb + OspA kombinációs vakcinával, öt kutyát oltottunk be az ÖspA-vai önmagában (ahogyan ezt a 2, példában leírtuk) és Öt kutya szolgált, mint kezeletlen kontroll,

A kutyák a vakcina két dózisát, kapták (1 ml/kutya) szubkután beadva (SC) háromhetes időközzel, az alábbi elrendezés szerint:

X XX X ♦ ** χΧ *

XX χ X *** »8 X X X ♦ ♦ *

A kutyáktól vért vettünk mindegyik vakcinálás előtt (0. es 21, nap), az antigénnel történő összehozás előtt (35. nap) és mindegyik biopsziát megelőzően. Az OspA elleni speciális antitesteket SLISA vizsgálati eljárás segítségével mutattuk ki, Antí-OspA-t mutattunk ki olyan kutyákban, amelyek OspA-t vagy DACPiF>x * OspA-t kaptak.

Az összes kutyát a vakcinálás után közvetlenül megfigyeltük kedvezőtlen reakciók fellépésére, beleértve az anafílaxiát. A továbbiakban a kutyákat az állatokat gondozó technikusok naponta megfigyelték helyi vagy szisztémás kedvezőtlen vakcina reakciókra, beleértve az alábbiakat; láz, étvágytalanság, hányás vagy letargia. A második injekciót megelőzően a korábbi vakeinációs helyet tapintással megvizsgáltuk mindenféle rendellenes reakcióra, beleértve granulóma kialakulását. Nem figyeltünk meg kedvezőtlen reakci ókat.

Az összes kutyát antigénnel második vakcinálást követően burgdorferi-ve1 megfértő ződött hoztuk össze két héttel a természetes úton Sörrelia kullancsokat alkalma zva (lásd a 2. példát).

A X φ φ X Φ X X Φ Φ ♦* * * χ X φ Φ * *

X Φ φ -X χ Φ X Φ χφφΧφφΧ * Φ ♦

Φ χ χ Φ * ♦ X Φ Φ * *

Bőr lyukasztásom* feiopsziát hajtottunk végre a kutyákon az antigénnel történt összehozást követően egy, kettő és három hónappal. A biopszia során nyert anyagot spirocéták újra-ízolálásához tenyésztettük a 2, példában körvonalazott protokoll szerint.

Az OspA hígító oldat Interferencia mentességét a kombinációs vakcina liofilizált vírus frakciójával szemben a spirocéta újra-ízoiálási arányának összehasonlításával vizsgáltuk vakcináit kutyákban és kezeletlen kontroliokban.

Annak kimutatására, hogy az OspA frakció nem befolyásolja kedvezőtlenül a liofilizált vírus komponenseket a kombinációs Lyme vakcinában, a virieíd jelleg vizsgálatát végeztük el. Az összes víruskomponenst megtítráltuk az Lyvei történő rehidrálás után és ezeket a titrálási értékeket olyan titrálásí értékekkel hasonlítottuk össze, amelyeket steril vízzel történt rehidrálást követően kaptunk.

In vivő és in vitro eredmények értelmezése:

A kombinációs vakcina hatékonyságát in vivő határoztuk meg szeroiógíai titerek segítségével és spirocéta ujra-ízolálási eredmények alapján; in vitro pedig viricid hatás vizsgálatával. A kombinációs vakcinával (DACPiPxt φ Ly) beoltott kutyákban OspA antitest szinteket és spirocéta újraizolálás! eredményeket hasonlítottunk össze csak Ly-vel önmagában vakcináit kutyákban kapott eredményekkel és kezeletlen kontrollok eredményeivel.

A kombinációs vakcinát hatékonynak tekinthetjük az alábbiak alapján:

X φ φ > Φ * * Φ

X

X Φ Φ 4 * *

Φ

Φ' » * Φ-Φ « Φ* # * φ Φ * φ -Φ* * * * >· ν Φ * X * (X) A kombináltan beoltottakban az antitest szintek hasonlóak voltak azon kutyákban mért szintekkel, amelyek monovalens Ly vakcinát kaptak. A beoltottakban az antitest szintek ugyanakkor jelentősen magasabbak voltak, mint a kezeletlen kontroliokban mért szintek;

(2) a beoltott kutyák 100%-a negatív volt splrocéta űjra-Izolálásra, míg a kezeletlen kontrollok 80%-a (4/5) volt pozitív spirocétákra; és (3) nincs veszteség a vírus literben, amikor a liofilizált vírus anyagot xehidráljuk a Ly hígító oldattal, steril vízzel összehasonlítva.

Az ereumán a 9. táblázatban mutatjuk be.

Φ φφ « φ φ κ φ

9, táblásat; Kutya kombinációs hatékonysági tanulmányok

Antí-öspA ELISA szintek

X

X Φ φ φ φ X φ φ * * φ * *

X φ* «φ * * X

-φφφ #

φ XX

összes kutya két szubkután beoltást kapott háromhetes időközzel.

Ly - Lyme OspA; DACPién, - kutya szopornyica, adenovírus, koronavírus, parainfiuenza és parvovírus, módosított élő vakcina.

Értékek 50 felett; jelentős mértékű OspA antitest szintek.

7S

4. példa

OspA vakcinák hatékonysága lovakban

Tíz lovat alkalmaztunk a tanulmány során. Számozásuk a következő; 74, 75, 76, 77, 93, 95, 96, 97, 98 és 99.

A monovalens vakcinákat (elnevezésük Ly; 100 pg/dózis OspA; és 30 pg/dózis) rekombináns technológia segítségével állítottuk elé, ahogyan ez az 1. példában leírásra került (B3I), A kombinációs vakcina (elnevezése veszettség/Ly) a következőket tartalmazza; Imrab (beszerezhető a Rhone Merieux Inc. cégtől, Afchens, Georgia) plusz 30 pg/ml B31 OspA, amelyet az '1. példa szerint állítottunk elő (B31).

Az összes lovat infcramuszkulárisan vakclnáltuk (IM) két vakcina dózissal, kéthetes időközzel beadva, az alább következő kísérleti elrendezés szerint;

csoport áiiatszám vakcina ve kombinációs (30 pg/mi)

100 pg/ml Ly 30 pg/hy

A lovaktól minden egyes vakclnálás előtt egy, két és három, héttel a második vakclnálás után vért vettünk. A sze

Φ X * * φ *«» » * * χ Φ χ φ* *

* Φ X

4ΦΦ φ» X # rológiai eredményeket ELISA segítségével határoztuk meg (módosítva a lé antίszérum alkalmazásával) « Meghatároztuk a veszettség vírusa elleni antitest Litereket a kombinációs készítménnyel beoltott lovak esetében mivel az OspA szereiógía eredményei biztatóak voltak.

Az összes lovat 30 perctói egy óráig terjedő időtartamban megfigyeltük az egyes vakcinálásokat követően az anafilaxiára jellemző tünetek megjelenésére. A kezdeti megfigyelési időszakot követően ellenőriztük a vakcínácíós helyeket a második oltás beadása előtt a helyi injekciós reakciók megjelenésére (csomók, stb.). A továbbiakban mindegyik lovat naponta megfigyeltük kedvezőtlen vakcina reakciók megjelenésére (láz, levertség, étvágytalanság, stb.). Az őszszes naponként történő megfigyelést a végső vakcinálás után még egy hétig folytattuk. Nem észleltünk kedvezőtlen reakciókat .

A vakcinák hatékonyságát az antí-OspA ellenanyagok szintjeinek mérésével értékeltük beoltott lovakban és ezeket a szinteket hasonlítottuk össze a vérvétel előtti szintekkel .

Az eredményeket a 10. táblázatban mutatjuk be. Az eredmények jelzik, hogy lovak megvédhetek a Lyme-kórral szemben akár a monovaiens, akár a multivalens OspA vakcina alkalmazásával; és azt is kimutattuk, hogy a multivalens vakcina esetében nexn figyelhető meg hatékonyságot befolyásoló interferencia.

fr X fr ψ X fr *»«

10. táblázat; Lö Lw.e vakcinálás! vizsgálatok. Anti-OspA ELISA szintek.

állat #	vakcina j 0. hét	1. hét	4. hó	5. hó	6. hó
96	OspA	25	xí fr lo»	200	800	200
99	30 pg/ml	< 25	n.b.	< 25	800	100
76		n.b.	n.b.	800	3200	1600
74	OspA	n.b.	| 400	12, 8k	6400
95	100 pg/ml	25	n.b.	50	1600	4 00
75		n.b.	100	400	3200	800
.93	OspA 30 pg/mi	< 25	n.b.	400	25, 6k	6400
98		n.b.	200	800	6400	1600
97	Imrab lót	< 25	n.b.	400	6400	1600
77	#12160	25	n.b.	800	6400	1600

As összes ló két íntramuszkuláris injekciót kapott háromhetes időközzel. Imrab - kereskedelemben beszerezhető adjuvánssal kiegészített inaktívált veszettség! vakcina.

n.b. ~ vérvétel nem történt (nőt bleed) ; az 50 feletti értékek jelentős mértékű OspA antitest szinteket jeleznek.

5. példa

Kutya Lyme: Biztonságosság, hatékonyság és interferencia mentesség Lyme kombinációs vakcinában

Ebben a példában tovább vizsgáljuk egy Lyme kombinációs vakcina biztonságosságát, hatékonyságát és interferencia mentességét (recDACPíP_Xb + OspA) .

φ *>»« * ** * * λ χ » χ * X ; , »:·*.,··»* -ί«

Harmincnégy (34) beagle-t random módon két csoportba osztottunk (22 beoltott és 12 kontroll), A beoltottak kombinációs vakcina (recDACPiPxj, e OspA) két dózisát kapták szubkután, míg a kontrollókat a vírus komponenssel önmagában oltottuk be (recDACFiPxt) ♦ Az Összes kutyát 7 héttel a második vakcinaiást követően természetes úton megfertőzött kullancsokkal hoztuk Össze, A kutyákat OspA antitestekre vizsgáltuk EU.SA szerolőgía segítségévei rendszeres időközökben, A vakcina hatékonyságának igazolására Sorrelia burgdorferi-vel történő összehozás esetében a kutyákon biopsziát hajtottunk végre és bőr mintákat tenyésztettünk splrocéta újra-.Izolálás céljából. Továbbá interferencia mentességet vizsgáltunk és viricid hatás vizsgálati eljárásokat végeztünk annak megerősítésére, hogy az OspA hígító oldatnak nincs káros hatása, a vírus vakcina komponensekre, biztonságoaság:

Nem figyeltünk meg kedvezőtlen helyi vagy általánosan előforduló reakciókat az injekciót követően bármely Időpontban ,

ΦΦ *·* φ

Φ Χφ Φ ΦΦΦ¹·* φ

» * X* φφ ** ΦΦ * φ

φ φ·φ

Hatékonyság összefoglalása:

11, táblázat

* egy kutyától nem vettünk vért Interferencia mentesség;

Mind a virlcid hatásra irányuló vizsgálatok és az interferencia mentességének vizsgálata azt mutatta# hogy az OspA hígító oldat nem hoz létre káros hatást a vírus komponensek esetében a kombinációs vakcinában.

így tehát a Lyme kombinációs vakcina {recDACPiPj- r OspA) ;

- biztonságos 8-10 hetes korú kölykökben;

- nagymértékben antigén sajátságot mutat és OspA szerekonverziót indukál a beoltott kutyák 100%-ban;

- a beoltottakat megvédi splrocéta fertőzéstől és a spirocéták szóródásától természetes körülmények között létrehozott kullanccsal történő éríntkeztetést követően; és

- nem mutat interferenciát liofilizált vírus vakcina komponensekkel szemben, ahogyan ezt in vivő igazoltuk interferencia mentességi vizsgálatban vagy in vitro viricid hatás vizsgálati eljárásokban.

vakcina komponens; rövidítés külső felületi fehérje A Borreüa burgdor.feri' OspA bői (OspA, lásd az előző példákat) kutya szopornyica vírus;

Canarypox vektor (recCDV) D kutya adenovírus, 2, típus (CAV?) A kutya paraínfluenza vírus (CPÍ) Pl kutya parvovirus, (Ρχύ Fxt kutya koronavírus (CCV) C

Olyan kombinációs vakcina, amely képes kutyákat immunizálni Lyme-kór ellen és ezzel egyidejűleg védelmet biztosit más kntyapatogénekkel szemben, az állatorvosoknak fontos alternatívát kínál a fertőző betegségek megelőzésében.

A leírás szerint kísérleteket végeztünk a találmány szerinti kombinációs vakcina biztonságosságának, hatékonyságának és interferencia mentességének meghatározására. A kombinációs vakcina a következőket tartalmazta: OspA hígító oldat (elnevezése OspA) és liofilizált virusanyag, amely rekombináns kutya szopornyica vírus - adenovirus 2. típus koronavírus - paraínfluenza - parvovirus kombinációt tartalmaz (elnevezése recDACPiP>_:._t.) tartalmazza.

*·«*» * * •X * _Λ Α Λ

S&'·*

V ***

Harmincnégy beagle kölykök (mindkét nemből; nyolchetes életkor; negatív Lyme antitestekre (Borrelia bnrgdor/eri és teptoapira antitestek) szereztünk be a Ridglan Farms cégtől (Mount Horeb, WI) . A kölyköket randám módon két csoportba osztottuk és az alábbi elrendezés szerint vakcináitok:

Oltóanyag elkészítése:

Az OspA vakcinát az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő. A liofíiizált vírus komponenst, mint engedélyezés előtti sorozatot szereztük be. A liofíiizált anyag tit™ ráiásí eredményei a következők voltak:

A kutyák minden egyes vakcinából két dózist kaptak (1 ml/kutya) szubkután három hetes időközzel z anafilaxia tüneteit figyeltük - beleértve légzési nehézségeket, visz !□ * φ φ* φ «φ ««« ketést és ödémát - az injekciót követő első 15 percben. A. továbbiakban az állatok gondozói figyelték meg a kutyákat folyamatosan a beoltás utáni első órában és ezt követően napi gyakorisággal tizennégy napon keresztül az egyes injekciókat kővetően. A figyelemmel kísért tünetek magukba foglalták a következőket: duzzadás, fájdalom, érzékenység és vakaródzás az injekció helyén. A második injekció beadását megelőzően az elsődleges injekció helyét tapintással megvizsgáltuk duzzadásra és érzékenységre.

Vért vettünk, szerológia céljára az egyes beoltások előtt és hónapos időközökben utána. Az OspA ti tere két ELISA segítségével határoztuk meg.

Az interferencia mentesség vizsgálata:

Annak érdekében, hogy igazoljuk az OspA hígító oldat interferencia mentességet a vírus komponensekkel szemben a kombinációs vakcinában, szérum centralizációs Litereket határoztunk meg és összehasonlítottuk az I. csoport (vakcínálás recDACPíPx), *· OspA kombinációval) GMT értékét a II. csoportban (vakcináíás recDACPiPjm-vel Önmagában) mért Literekkel .

In vifcro viricid hatás vizsgálata:

Annak érdekében, hogy kimutassuk az OspA hígító oldat interferencia mentességét a vírus komponensek Literével szemben a kombinációs vakcinában, ín vítro viricíd hatás > » « ί ί X « ♦ φφ * vizsgálatokat végeztünk a (113.35) .

CFR irányelveknek megfelelően

Annak igazolására, hogy a vírus komponensek nem intertaráinak a kombinációs vakcina OspA frakciója által kiváltott védőhatással, az összes kutyát összehoztuk S. burgdor/eri-vel a beoltás után hét héttel. Ehhez az összehozáshoz természetes úton megfertőzött kullancsokat alkalmaztunk, amelyeket Lyme-kőrra endésiikus területről gyűjtöttünk. Ezen kullancsok esetében meghatározásunk szerint a Borrelia burgdorberi fertőzöttség 60% volt.

Bőr biopszía és splrocéta űjra-izolálás:

Az összes kutyán bíopsziát hajtottunk végre as összehozás után egy és két hónappal. A bőrt a kullancs befúródási helye környékén 1©borotváltűk, Betadíne sebészeti törlőkendővel előkészítettük, intradenaálisan injektált 2% lidokaínnal érzéstelenítettük és lyukasztáson bíopsziát hajtottunk végre Baker-féle bőr lyukasztót” alkalmazva. A bőr mintákat tenyésztáptalajt (SSK táptalaj hővel inaktiváit nyúl szérum és antibiotikumok) tartalmazó csövekbe helyeztük és átvittük a laboratóriumba. A csöveket további tápbalajmennyíséggel kiegészítettük és üveghengerbe helyeztük. Az üveghengert hat hétig inkubáltuk. A csöveket hetente megvizsgáltuk spirocéták jelenlétére sötét látómezőjű mikroszkópot alkalmazva. Legalább tíz látómezőt vizsgáltunk meg 40x objektív alkalmazásával, mielőtt a mintát negatív87

Φ««« X♦»* nak tekintettük.

Vakcina biztonságosság:

Az összes beoltott kutyát a kísérlet vezetője figyelte meg kedvezőtlen reakciókra (beleértve az anafilaxiát) a beoltást követő első 15 percben és az állatgondozók végezték a megfigyelést a következő tizennégy napig az egyes vakcinálásokat követően, Nem tapasztaltunk kedvezőtlen szisztémás reakciót semmilyen időpontban a Lyme kombinációs vakcinával történt beoltást követően. Továbbá nem tapasztaltunk duzzadást, fájdalmat, érzékenységet vagy viszketést az injekciós helyen a beoltást követő kéthetes időtartamban.

OspA antitest ti terek (lásd a 12. táblázatot):

Az OspA elleni antitesteket BUSA segítségével határoztuk meg. Vért vettünk a 0. napon (véreztetés előtt; az első vakcinálás elvégzését megelőzően); a 14. napon (a második oltás beadása előtt); a 42» napon (az antigénnel történő összehozást megelőzően); és est követően egyhónapos időközökkel .

A 12. táblázatban tüntetjük fel az ELISA értékeket. Az első vakcinálást követően a huszonegy beoltott és véreztetetfc közül tizenkettő (57,1%) szerokonverfcált, amit az OspA antitest szintek legalább négyszeres megemelkedéséből határoztunk meg. Két héttel a második vakcinálás után mind a huszonkét (100%) recDACP.iPxi.-vel Önmagában vakcináit kutya szero-konvertálódott OspA-hoz, A beoltottak többsége még mindig jelentős mértékű OspA. antitest titereket mutatott az

Φ * φφ φ φ antigénnel történő összehozást megelőzően (19/22 »» 86,4%). A kontrollok - recbACPiP_:<x.-vel önmagában beoltva - egyike sem volt képes szerolőgiaí választ produkálni az OspA antigén ellen.

Mindkét csoportban az antitest szintek nagyon kismértékben emelkedtek a kullanccsal történő összehozást követően. OspA antitestek nem expresszálődnak Lyme-kórban szenvedő emberekben csak a később a fertőzés folyamán ás úgy tűnik, hogy ugyanez igaz természetes úton megfertőződött kutyák esetében.

Interferencia mentesség vizsgálata (lásd a 13, táblázatot) :

szérumot gyűjtöttünk kutyákból a ö. napon (az első vakcinálást megelőzően) és a 35, napon a vakcináiást kővetően. Szérum neutrallzálásos Litereket határoztunk meg a kombinációs vakcinában a vírus eredetű antigénekre az egyes kutyák esetében mindkét időpontra. Mértani átlag Litereket (geometria mean titer, CMT) és standard deviációt számoltunk ki a recDACPíPxi..-veI önmagában beoltott csoport esetében és összehasonlítottuk a Lysae kombinációs vakcinát (reePACPiP_:<j, 6 OspA) kapott csoport GMT értékeivel,

A kísérletek során alkalmazott kölykök negatívak voltak hyme-kórra vagy Aeptospíra vakcinálásra vagy expozícióra, de nem specifikus patogén mentes körülmények között kerültek felnevelésre. Ennek következtében a véreztetés előtti eredmények a ö< napon mutattak títereket vírus komponensekkel szemben a vakcina liofílizált frakcióiban. A vakcinálást kővetően az összes komponens Literei megemelkedtek a φ Φ χ Φ Χ*Ψ* várakozásnak megfelelően.

Az egyes titerek Összehasonlítása (analízis a Studentféle t-teszttel, szignifikánsnak tekintve a p < 0,05 értéket) nem mutatott különbségeket a szérum neutrálisaié literekben a recDACPíPxj, * OspA kombinációval beoltott kutyákban és a recDACPíPxi-t önmagában kapott kutyákban mért literekkel összehasonlítva. Ennek következtében nincs jelentős mértékű interferencia az OspA hígító oldattal a vakcina bármely víruskomponensére nézve, ín vitro viricid hatás vizsgálata (lásd a 14, táblázatot) ;

Γη vitro viricid hatás vizsgálat során az OspA hígító oldattal rehidrált virus vakcina egyes komponenseire mért titereket hasonlítottunk össze olyan títerekkel, amelyeket a vakolna steril vízzel történő rehidrálása során kaptunk.

Az ezen titerek összehasonlítása azt mutatta, hogy a variációk az egyes virus komponensek esetében az elfogadható határokon beiül voltak a Lyme kombinációs vakcinában (kevesebb, mint 0,5 lóg különbség a Literben).

Bőr biopsziát hajtottunk végre az összes kutya esetében az antigénnel történő Összehozást, követően egy és két hónappal. A biopsziákat hat hétig tenyésztettük és megvizsgáltuk spirocéta újra-izolálás céljából, Az eredmények azt mutatják, hogy a kombinációs Lyme vakcinával beoltott kutyák közül csak egy (XB'íj volt pozitív spírocétákra (4,5%), és ez a kutya csak az első biopszia idejében volt pozitív.

A X 4

4 4

4

X4 4

A * *

X 4 4 * * * *

4 4· * *

A recbACPilSa *· OspA kombinációval vakcináit huszonkét kutya közül egy sem (Oá) volt pozitív spirocétákra a második bíopszia idejére.

Spirocátákat tudtunk újra-izolálni blopszla mintákból a tizenkét kontroll kutyából három esetében egy hónappal az antigénnel történő összehozást követően (25%), mig a kontrollok közül kilenc volt pozitív a második hiopszía idejére (7S%) .

A patogén spírocéta, Borrelía burgdor'.ferí okozta Lymekór (LD) jelenleg a legközönségesebb kullancs hordozta betegség emberekben. Továbbá, kutya LD-t egyre gyakrabban jeleznek, ahogy az állatorvosok egyre nagyobb figyelmet fordítanak a fertőzésre kutyákban.

Ismert, hogy a Bőrrelía burgdorferl egyik fő külső felületi fehérjéje - elnevezése OspA - erős immunogén és védelmet biztosit spírocéta fertőzés ellen különféle állatokban, A tisztított OspA fehérje, amelyet rekombinációs technológia segítségével bőséges mennyiségben állítanak eiö, két humán vakcina alapjául is szolgál, amelyek jelenleg klinikai kipróbálás alatt vannak.

Olyan kombinációs vakcina, amely képes kutyákat Lymekór ellen immunizálni és ezzel egyidejűleg védelmet képes biztosítani más kutyapatogének ellen, az állatorvosoknak fontos alternatívát nyújt a fertőző betegségek megelőzésében .

Ezen példa célja az volt, hogy meghatározzuk az ilyen kombinációs vakcina hatékonyságát, biztonságosságát és interferencia mentességét. A vakcina iiofiiízált vírus anya9

ΦΦΦ φ ΧΦΦ * φφ φ *

Φ *

X φ φ <* ** • φ φ φ * « ♦ φ * • φ V * ♦ * got tartalmazott - amelyben rekombináns kutya szopornyica vírus - 2, típusú andenovírus - koronavlrus - parainfluenza vírus - parvovírus található (elnevezése recDA€PíP_Kjj - és rehidráiása OspA hígító oldattal történt. Huszonkét kölyköt oltottunk he a kombinációs vakcinával (recDACH.iP._XI, + OspA), mig tizenkét kontrollt a steril vízzel rehídráit liofíiizált virusanyaggal (recDACPiPja.) oltottunk be. As összes kölyök két szubkután beoltást kapott, háromhetes időközzel, és ezután Borrelia bargdorferí-vel fertőzött kullancsokkal hoztuk össze.

A természetes eredetű, modelljét alkalmaztuk e:

kullancsokkal történd összehozás t a példában. Az összehozást követően az összes kutyán bíopsziát hajtottunk végre az őszszehozás után egy és két hónappal és a mintákat spirocéta üjra-ízolá.lása céljából tenyésztettük. Az eredmények azt mutatták, hogy a Lyme kombinációs vakcinával beoltott kölykök közül csak egy volt átmenetileg pozitív spirocéta újraizolálás szempontjából, mert ez a kutya és az összes többi kombinációs vakcinával beoltott kölyök negatív volt a spirocéta szóródás szempontjából a második híopszia idején. Ezzel szemben spírocétákat tudtunk újra-izolálni a x'ecD&CPiBsx-vel önmagában beoltott kutyák 75k-ból a második bíopszia idejében.

OspA antitest eredményeket határoztunk meg az összes kutya esetében. Az összes ezen kombinációs vakcinával beoltott kölyök (recDACPiPxx. t OspA) szero-konvertálődott két injekció beadása, után, bár a kontrollok közül egyik sem mutatott emelkedést az OspA antitest szintekben a Iiofilizált ♦ fr* frfr frfr X * ♦ frfr * vírus komponensekkel önmagában történő vakcinélást követően .

A kontroll állatokban - amelyekről a biopszla kimutatta a ferfcőzöttséget - az OspA literek nem emelkedtek jelentős mértékben a kullancsokkal történő összehozást követően. Emberekben ismert, hogy OspA antitestek nem jelennek meg a Lyme-kór korai szakaszában; az eredmények ebből a kísérletből azt jelzik, hogy ugyanez lehet a helyzet kutyák fertőzése esetén is.

Ez a tanulmány igazolta az OspA kombinációs vakcina biztonságosságát ís. Nem tapasztaltunk kedvezőtlen szisztémás vagy helyi reakciókat a vakcinálás idején, vagy az egyes injekciókat követő kéthetes időtartamban.

A találmány szerinti Lyme kombinációs vakcina (recDACEiPxi + OspA) :

- biztonságos 8-10 hetes kölykőkben;

- nagymértékben antigén sajátosságú és OspA szerokonverziót hoz létre a beoltott kutyák 100%-ban;

- a beoltottakat megvédi a spirocéta fertőzéstől és szóródástól természetes eredetű kullancsokkal történő őszszehozás után, ahogyan ezt a spirocéta újra-izolálásí eredmények mutatják; és

- nem mutat interferenciát liofilizált vírus vakcina komponensekkel, ahogyan ezt in vivő interferencia mentességi vizsgálatok és ín vívó viricid hatás vizsgálatok igazolják.

χ χ * ♦ * * * <

12. táblázat: OspA elleni antitest fciterek eredményei κ-χ * * χ »*·»

X Φ φ φ φ *» φ* φ ♦ ί· *

13, táblázat. Széna antitest szintek: λ Ijk hígító oldat interferencia aenfcessége koabínácíós > * φ φ φ Φ X φ* φ φ X Φ ί * φ φ

antigén	vakcina	8. : M	',ap‘ SD	35, M	nap i ι SB
recCDV ................................	r^cDACPíPxi OspA	MS	0,3?	1,78	0,46
	recDACFíPa	1,01	8,35	1,06	0,65
QV	rscDACPíPa + OspA	2,24	3,25	2,48	3,27
	recBACPÍP»	2,17	0,13	2,33	0,23
CPI	recDACPí?£	1,52	0,33	2,12	0,18
	re«PÍ?£	1,52	0,31	2,10	0,16
Fa	recDACPíFa í OspA	2,08	0,08	3,72	0,78
	recDAOPÍPa	2,88	0,00	3,68	8,62
CCV	recDACPÍ?a + OspA ..........................·'·'·· Λ...................................	1,51	0,23	2,53	0,40 1..............................................>
[............... ......... í 5	recOACFíPxi,	1,31	0,48	2,78	................................i 0,42 i

At első oltás ideje, steril hígító oldattal rehidrálva

SÍT: titerek sértaní kdzépértéke; SP: standard deviáció

AV as

Két ismétlés átlaga ^! liofiiizált vakcina - steril higitö oldattal rehidrálva

15, táblázat. OspA szerekoffrerzió és az összehozást kővetően spirocéta újra-ízolálás eredményei.

vakcina	1 szerotosverzió	spirocéta úímzolálás
1, iniekcié JwM.. · · · · ma- v......................·.·.·	2. injekció A	1, biopszia	2, biopszia
! recDACPiPa	12/21* * 57,11	22/22 = 100%	1/22«	| 0/22 » δ,01
1 recMiPxí, + OspA	0/11* « Ö,Ö5	G/12 0,S%	3/12 « 25$	ί 9/12 * 751

* egy kutyától na vettünk vért —

Φ Φ φφφ *

-φφι Φ *

Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a megelőzöekben ismertetett specifikációk, megvalósítási módok és példák csupán a találmány jobb megérthetőségét szolgálják és nem korlátozó értelemben kerültek bemutatásra. Számos más, a fentiekkel egyenértékű módosítás illetve változtatás hajtható végre, és az ilyen módosítások nem térnek el a találmányi gondolattól és a csatolt szabadalmi igénypontok által meghatározott igényelt oltalmi körűn belülinek tekintendők.

~ 97 ~ $ * ** *

REFERENCÍA11STA

1- B&rbour, A,G, and Fiah, D. The biological and sociel phenomenon of Lyma Disease. Science, 1993, 268, 1610-1615,

2. Fikrig, B,, BarthoXd, S.W,, Kantor, F.S, and FXaveXX, &.&, Frofcecfcion of nice againat the byma diseaaa agant by immunising with recombinant OspA, Science, 1998, 2S8, S53-S56,

3. Brdile, b,f., Brandt, Μ», Marakomski, D,d,, Weetrack, O.d,, Sadaiene, A«, Barbour, A,G. and Maya, d,P. RoXe of attached lipid in iasannogeniciby of Serrel!a burgdorferi ÖspA, Infecfc. Immun, 1993, SÍ, 81-90, Bee alsó VSSM 09/373,455,

4. Kell&r, D., Kistér, F.T,, Marka, D,K,, Boaback, Ρ,, Br&iXe, L,F, and Maya, J„P, 8afety and immunoganicity of a recombinant outer surf ace protein A Lyma vaccine. <J. Am, Med, Asaoc, 1994, 271, 1764,

IoOíMQOÍ

Claims (19)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Immunológiai készítmény, amely lényegébe» a következőkből áll: (i) Izolált, tisztított &»re/«r ó«rgd<»/é« antigénből, amely lényegében az GspA-ből áll, vagy az antigént expresszáló vektorból és (il) legalább egy további, a &wre//« burgdor/ferí-tól különböző, emlős-patogén tnríígértjétrtll vagy a további legalább egy antigént expresszáló vektorból és adott esetben (isi) gyógyászati vagy állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozóból; ahol a legalább egy további antigén egy rabies vírus antigén; vagy a legalább egy további antigén lényegében a következők kombinációjából áll: egy szopornyica (canine distemper) antigén és egy adenovirasantigén, egy kmenavlrns-antigén, egy parasaíhíenza-antsgén és egy parvovöus-andgén; vagy a legalább egy további antigén lényegében a kővetkezők kombinációjából áll: egy rabies-antigén, egy szopornyica-antigén, egy adermvínrs-antigén, egy koronavkxts-amigén, egy parainfinenza-antigén és egy psrvovírus-antigán.
2. 2. immunológiai készítmény, amely lényegében a kővetkezőkből éli: (i) izolált, tisztított Bemsfte ótórgdot/m antigénből, amely lényegében az OspA aatigéa-béi áll, vagy az OspA antigént expresszáló vektorból és (ii) legalább egy további, a RomTár őnrgafor/árteől külő»bözö, emlős-patogén antigénjéből vagy a további legalább egy antigént expresszáló vektorból, és adott esetben (Isi) gyógyászati vagy állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozóból; ahol a legalább egy további antigén lényegében a következők bármelyikéből áll; egy rabies vírus antigén, egy szopornyica antigén, egy adenovirus-antigén, egy korcntáviras-aniigén, egy písrainilnenza-antigén, egy parvevirus-antigén vagy ezek bármely kombinációja.
3. 3. Immunológiai készítmény, amely a következőket tartalmazza: (t) izolált, tisztított őömdiö AurgoWArt antigént, amely lényegében az OspA-ból áll vagy az antigént expresszáló vektort és (ii) legalább egy további, a tordií s5ío-g-<?őt/éA-sÖi különböző, emlős-patogén antigénjét vagy a további legalább egy antigént expresszáló vektort, és adott esetben (itt) gyógyászati vagy állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozót; ahol a legalább egy további antigén egy rabies vírus antigén; vagy a legalább egy további antigén a kővetkezők kombinációját tartalmazza: egy szopornyica (canine distemper) antigén és egy adenovirus-antigén, egy koronavírasantigén, egy paralnőuenza-antigén és egy pas'vnvlras-antrgén; vagy a legalább egy további antigén a következők kombinációját tartalmazza: egy rabies-antigén, egy szopornyica-antigén, egy adenoviras-aotigén, egy koronavifös-astigén, egy paminftuenza-aníigén és egy parvovlras-antrgén; és a legalább egy további nnligén egy, az OspA-val interferáió iepíospiroantlgéntői különböző antigén.
4. 4. Immunológiát készítmény, amely a következőket tartalmazza; (I) izolált, tisztított BorreAo őm-gdezArt antigént, amely lényegében az OspA antigén-böl áll, vagy az OspA antigént expresszáló vektort és (ii) legalább egy további, a őorre/hr ó«rg<for$»?-fÖI különböző, emlős-patogén antigénjét vagy a további legalább egy antigént expresszáló vektort, és adod esetben (ni) gyógyászati vagy állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozót; ahol a legalább egy további antigén & következők bármelyike; egy rabies vírus antigén, egy szopomyicaaatígén, egy adenovirus-antigén, egy koronaviras-antígén, egy parahsUuenza-antigén, egy parvovíros-andgén vagy ezek bármely kombinációiig és a legalább egy további antigén egy, az OspA-val interferáió /.tíotos^Aoantigéntöl kölönbözö antigén,
5. 5. immunológiai készítmény, amely lényegében a következőkből sík (1.1 izolált, tisztított őorrafte ósrgdojym' antigénből, amely lényegében az OspA-bői áll, vagy az OspA antigént expresszáló vektorból és (ii) legalább egy módosított, életképes vírusból, amely a következők bármelyike; szopomyica-viras, kutya. 99 adestovirus, kutya-koronavtrns, kutya-paraínfluensavfcus, fculya-parvovirus vagy ezek bármely kombinációja; ás adotí esetben (iíi) gyógyászati vagy állatgyógyászati szempontból elfogadható hordozóból.

   ő. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti immunológiai készítmény, amelyben az (?) pont szerinti antigétt sz izolált, tisztított Sorre/m hurgdorferi OspA antigén.
6. 7. A ó. igénypont szerinti immunológiai készítmény, amelyben az izolált, tisztított OspA izolált, tisztított, lipitiezett OspA.
7. 8. A 7. igénypont szerinti immunológiai készítmény, amely únmunogenitást fokozó adjuvánsoktól mentes.
8. 9. Az 1-3, Igénypontok bármelyike szerinti immunológiai készítmény, amelyben az (i) pont szerinti antigén egv izolált, tisztított BorreZíö burgdorferi OspA antigént expresszáló vektor.
9. 10. Az 1. igénypont szerinti immunológiai készítmény, amelyben a (ii) pont szerinti legalább egy további antigén lényegében egy, a legalább egy további antigént expresszáló vektorból áll.
10. 11. Az 1. igénypont szerinti immunológiai készítmény, amelyben & (ii) pont szerinti legalább egy további antigén egy, a So/re/fo óprgzfesym-töl különböző patogénböl származik.
11. 12. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti immunológiai készítmény, amelyben a legalább egy további antigén egy rabiesvirus-antigén.
12. 13. Az 1. igénypont szerinti immunológiai készítmény, amelyben a legalább egy további antigén lényegében a következők kombinációjából áll: egy szopornyica-antigén, egy adenovírus-antigén, egy koronavirusantigén, egy parainfiuenza-antigén és egy parvovíros-antígen.
13. 14. Az 1. vagy 3, igénypont szerinti készítmény, tyme-kórra és a legalább egy további Borreiia burgderferítöí különböző emlös-patogényre fogékony emlősben megnyilvánuló immunválasz kiváltására történő alkalmazásra.
14. 15. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti immunológiai készítmény, kutyában vagy kutyakölyökben megnyilvánuló immunválasz kiváltására tőrt éttő alkalmazásra.

    lő. Az 1-4, igénypofitok bármelyike szerinti immunológiai készítmény, lóban megnyilvánuló immunválasz. kiváltására történő atkaljnazásra.
15. 17. Az 2. vagy 4, igénypont szerinti immunológiai készítmény, amelyben az (1) pont szerinti andgénm lényegében az izolált, tisztított OspA-antigénből áll, és a (ii) pont szerinti legalább egy további antigén egy, a Borrelia bttrgdorferft&l különböző patogénböl származó antigén,

    IS. Az 1. igénypont szerinti immunológiai készítmény, amelyben a legalább egy további antigén lényegében a következők kombinációjából áll: egy rabíes-antigén, egy szopornyica-antigén, egy adenoviros-antigéa, egy koronavirus-antigén, egy paramfluenza-amígén és egy parvovítus-antígés.
16. 19. A 3, igénypont szerinti immunológiai készítmény, amelyben a legalább egy további antigén a következők kombinációját tartalmazza: egy rabies-antígén, egy szopomyíca-mttigén, egy adenovírus-antigén, egy koronavirus-antigén, egy pammfluenza-antigén és egy parvovöus-antígén.
17. 20. A 3. igénypont szerinti immunológiai készítmény, amelyben a legalább egy további antigén a következők kombinációját tartalmazza: egy szopornyica-antigén, egy adenovírus-antigén, egy koronavirus-antigén, egy parainíluenza-antigón és egy parvovírus-antlgén.
18. 21. A 3. igénypont szerinti immunológiai készítmény, amelyben a (ii) pont szerinti legalább egy további antigén lényegében egy, a legalább egy további antigént expresszáló vektorból áll.

    *φ « » ί »»*

    - 10022. Az Μ. igénypontok bármelyike szerinti immunológiai készítmény, macskában megnyilvánuló Immunválasz kiváltására történő alkalmazásra.
19. 23. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti immunológiai készítmény, amely ímmunogenitást fokozó adjuvánst is tartalmaz.