KR100906486B1 - 돼지파보바이러스 및 돈단독균 복합 불활화 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 동시에 예방할 수 있는 복합 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돈단독불활화 균체항원, 돈단독 분비단백 항원 및 돼지파보항원이 특정비율로 혼합되어 최적의 면역원성을 나타내며, 백신 접종시 안전하고, 체내에서 면역학적 상호간섭이 없는 복합 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따른 복합 백신은 돼지 번식장애를 유발하는 돼지파보바이러스와 돈단독균을 동시에 예방하여 백신접종 시 발생하는 노동력을 줄이고, 기존 사용되고 있는 돈단독생균백신의 단점인 항생제 동시사용 금지의 한계를 극복할 수 있으며, 높은 면역원성을 나타내어 축산생산성 향상에 이바지할 수 있다.

돼지파보바이러스, 돈단독균, 복합 백신

Description

돼지파보바이러스 및 돈단독균 복합 불활화 백신{COMBINED VACCINE AGAINST Porcine Parvovirus and Erysipelothrixrhusiopathiae}

본 발명은 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 동시에 예방할 수 있는 복합 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돈단독불활화 균체항원, 돈단독 분비단백 항원 및 돼지파보항원이 특정비율로 혼합되어 최적의 면역원성을 나타내며, 백신 접종시 안전하고, 체내에서 면역학적 상호간섭이 없는 돼지파보바이러스 및 돈단독균 복합 불활화 백신에 관한 것이다.

돈단독(swine erysipelas)은 모든 양돈장은 아니더라도 대부분의 양돈장에서 발견되는 에리시펠로트릭스 루시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae) 세균에 의해서 발생한다.

에리시펠로트릭스 루시오페티에(Erysipelothrix rhusiopathiae)는 크기가 작은 그람양성의 간균으로, 주로 돼지, 칠면조와 같은 조류, 설치류에서 단독을 일으키며, 다른 동물이나 사람에서도 빈도는 적으나 질병을 유발한다. 돼지, 비둘기, 쥐, 칠면조 순으로 감수성이 크며 경구적인 감염이 가능 하고 감염 후, 편도나 림프절에 기생하다가 개체의 면역력이 떨어지면 질병을 발현하는 '지발성 감염증'을 유발한다.

돈단독균은 타액, 분변 또는 소변을 통해서 배출되기 때문에 돼지 또는 환경에 항상 존재하고, 돼지 밖에서 수 주 동안 생존할 수 있으며 경토에서 보다 오래 생존할 수 있다. 따라서 무리로부터 이를 제거하는 것은 불가능하다. 특히 육성사 및 비육사에서는, 감염된 분변이 주로 감염의 주요 근원이다. 세균만으로 질병이 발생할 수 있지만 인플루엔자와 같은 동시적 바이러스 감염이 급증을 유발할 수 있다. 초유를 통해서 암퇘지로부터 모체 항체에 의해 제공된 보호로 인해서 질병이 8 내지 12주령 이하의 돼지에서는 상대적으로 드물고, 가장 감염되기 쉬운 동물은 육성돈, 백신접종을 받지 않은 미경산돈 및 분만경력 4회 이하의 암퇘지이다.

돈단독균은 체내에서 증식하고, 혈류에 침입하여 패혈증을 일으키며, 다이아몬드 피부병이라고도 하는 두드러기 모양의 피부병, 심내막염, 다발성 관절염 등의 ·피부심장관절 등의 만성병변을 유발할 수 있다.

돈단독을 예방하기 위하여 약독화한 생균백신이 일반적으로 사용되어 왔는데, 대개의 접종시기가 이유시 돈방을 옮기는 때이다. 그러나 이 시기는 돼지의 사육환경이 바뀌는 상황을 극복하기 위한 항생제클리닉과 시기적으로 비슷한 시기로서 선 접종된 생균백신에 후 접종된 항생제에 의한 간섭현상이 나타나게 되므로, 돈단독예방이라는 효과를 달성하지 못하게 되는 문제, 즉 항생제 동시사용 금지(백신 접종 전후 7일)의 한계가 존재한다.

이러한 문제를 해결하기 위하여 돈단독균을 포르말린으로 불활화한 사균백신을 접종하는 경향이 있으나, 완벽한 방어가 되고 있지 않아 돈단독이 아직까지도 농장에서 근절되지 못하고 있다.

돼지 파보 바이러스 감염증은 작은 DNA 외피 비보유(non-enveloped) 바이러스인 돼지파보바이러스병(porcine parvovirus)에 의하여 발생하는 돼지에서 생식 문제를 일으키는 것이 특징인 질병이다. 모돈(성돈) 및 자돈에서는 특별한 임상증상을 볼 수가 없는 반면 초임돈에 한하여 유산, 사산 및 미이라산의 증상을 나타내며, 임신 초기에 감염될 경우 태아가 사망하고 모체에 흡수되어 재발정이 잦거나 산자수가 적어진다.

효과적인 치료방법은 없으며, 예방으로는 돼지파보바이러스 비활성 백신을 수정(受精) 2주 전의 모돈에 접종하고 있으나, 단일백신으로 접종되기 때문에 다른 질환의 예방백신을 별도로 접종하여야 하는 번거로움이 있으며, 백신의 면역원성을 증가시킬 필요가 있다.

이에 본 발명자들은 돼지 번식장애를 유발하는 간단하면서도 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 동시에 예방하는 복합백신을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 돈단독불활화 균체항원, 돈단독 분비단백 항원 및 돼지파보항원을 특정비율로 혼합할 경우, 최적의 면역원성 및 높은 안정성을 나타내고, 체내에서 면역학적 상호간섭이 없는 것을 발견하여, 백신접종 시 발생하는 노동력을 줄이고, 농가에서 사료에 첨가하는 항생제 및 음수용 항생제, 그리고 모돈에 분만 후포유 중 사용하게 되는 모든 항생제에 대해 자유로울 수 있음으로 인하여 돈단독생균백신의 단점인 항생제 동시사용 금지의 한계를 극복할 수 있는 복합백신을 완성하였다.

본 발명의 목적은 돈단독불활화 균체항원, 돈단독 분비단백 항원 및 돼지파보항원을 특정비율로 혼합하여 고면역원성 및 체내안정성을 나타내고, 종래의 항생제 동시사용 금지의 한계를 극복할 수 있는 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 동시에 예방할 수 있는 복합 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 특정비율로 혼합된 돈단독불활화 균체항원, 돈단독 분비단백 항원 및 돼지파보항원을 포함하는 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 동시에 예방할 수 있는 복합 백신을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 복합백신은 바람직하게는 2500HA~3000HA unit/㎖의 돼지파보항원, 50~60억 CFU/㎖의 돈단독균체 배양액, 250~350㎍/㎖의 돈단독분비단백을 포함하며, 더욱 바람직하게는 2500HA unit/㎖의 돼지파보항원, 50억 CFU/㎖의 돈단독균체 배양액, 250㎍/㎖의 돈단독분비단백을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 복합 백신은 수산화알루미늄겔이 최종적으로 총 벌크의 20부피%가 되도록 제조될 수 있다.

본 발명에 사용된 돼지파보항원, 돈단독균체 배양액, 돈단독분비단백을 수득하는 방법, 불활화 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 모든 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 형질전환된 Recombinant Baculovirus VP2-BV strain를 Sf-9 세포에 감염시킨 뒤 돼지파보항원을 수득하였으며, 돈단독용으로는 불활화된 Erysipelothrix rhusiopathiae T2주를 사용하여 돈단독균 생산용 배지에서 배양하였으며, 불활화를 위하여 0.2%의 포르말린을 사용하였다.

돈단독 분비단백을 얻기 위해 돈단독 균체벌크를 원심분리하여 상청액을 취하여, 이를 10K 의 카셋필터를 사용해 한외여과를 실시하였으며 원 볼륨의 1/10정도가 될 때까지 이를 실시하였다.

본 발명에 따른 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 동시에 예방할 수 있는 복합 백신은 접종동물에 대하여 안정성을 나타내며, 체내 면역학적 상호 간섭을 실험한 결과 두 가지 항원을 혼합한 백신과 혼합 전 단일 항원의 백신과는 2%이하의 면역학적 간섭이 발생하는 것으로 나타나, 체내에서 면역학적 상호 간섭작용은 거의 없는 것으로 판단되었고, 각 항원의 함량을 달리하여 면역원성을 시험한 결과, 2500HA unit/㎖의 돼지파보항원, 50억 CFU/㎖의 돈단독균체 배양액, 250㎍/㎖의 돈단독분비단백이 95%의 생존률을 보임으로써 양 감염증의 복합백신으로 간편하면서도 우수하게 기능할 수 있음을 실험적으로 입증하였다.

본 발명에 따른 복합 백신의 목적동물에 대한 방어능 시험을 위해 후보돈 6마리(접종군 4, 대조군 2)를 사용하여 백신접종 후 종부시켜 임신 25일과 40일 째에 돼지단독과 돼지파보바이러스를 각각 공격접종한 후 관찰한 결과 대조군에서는 침울, 피부병변, 식욕절폐 등의 임상증상을 보였으나, 돼지단독그룹에서의 접종군은 어떠한 임상증상도 나타나지 않았다. 또한, 돼지파보그룹의 모돈을 공격접종한 후 4주 뒤 부검을 실시하여 태반 내의 태아를 적출하여 살펴본 결과, 접종군 2두에 서 적출된 태아 22마리에서는 돼지파보바이러스 검출에 대해 모두 음성을 나타내었으나 대조군 태아에서는 9마리 중 3마리가 양성을 나타내 접종군과는 달리 태반감염이 성립되었음을 실험적으로 확인하였다.

이에 더하여, 본 발명의 고면역원성 및 체내안정성을 가지는 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 동시에 예방할 수 있는 복합 백신의 면역 지속능을 자돈 23두를 대상으로 실험한 결과, 돈단독 20주, 돼지파보 25주까지 면역이 유지되어 상기 복합 백신이 약 15 주 내지 25주 동안 면역능을 유지하는 것을 실험적으로 확인하였다. 따라서 본 발명에 의한 복합백신의 경우 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 한 번에 예방하면서도, 고면역원성을 가지고 장기 지속 가능하면서도 안전한 복합 백신을 완성하였다.

본 발명에 따른 복합 백신은 돼지 번식장애를 유발하는 돼지파보바이러스와 돈단독균을 동시에 예방하여 백신접종 시 발생하는 노동력을 줄이고, 기존 사용되고 있는 돈단독생균백신의 단점인 항생제 동시사용 금지의 한계를 극복할 수 있으며, 높은 면역원성 및 체내안정성을 나타내어 축산생산성 향상에 이바지할 수 있다.

본 발명은 돈단독불활화 균체항원, 돈단독 분비단백 항원 및 돼지파보항원을 특정비율로 혼합하여 고면역원성 및 체내안정성을 나타내고, 종래의 항생제 동시사용 금지의 한계를 극복할 수 있는 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 동시에 예방할 수 있는 복합 백신을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 돼지파보바이러스 및 돈단독균 복합 불활화 백신의 제조

1-1. 공시균주 및 공시단백

돈단독용으로는 불활화된 Erysipelothrix rhusiopathiae T2주를, 돼지파보용 항원으로는 Recombinant Baculovirus VP2-BV strain를 Sf-9 세포에 접종한 뒤 채독하여 원심된 세포를 일정 압력으로 세포파쇄한 후 불활화한 것을 사용하였다.

1-2. 돈단독 균체항원 및 돈단독 분비단백 생산

먼저 돈단독 균체항원의 경우 펄멘터를 이용하여 메인 컬쳐용 배지를 멸균하고 여기에 순수시험을 거친 종균을 일정량 접종한 뒤 37℃에 18시간 배양하였다. 배지조성은 하기 표 1에 나타내었다. 이때 pH는 7.4를 유지할 수 있도록 자동설정 해주었으며, 불활화를 위해서는 0.2%의 포르말린을 사용하였다. 돈단독 분비단백을 얻기 위해 돈단독 균체벌크를 원심분리하여 상청액을 취하였다. 이를 10K 의 카셋필터를 사용해 한외여과를 실시하였으며 원 볼륨의 1/10정도가 될 때까지 이를 실시하였다.

돈단독 균체항원 배지조성

조 성	용 량
BHI broth	37 g
Yeast extract	10 g
Tween 80	1 ㎖
말 혈 청	100 ㎖
Glucose	적당량
증 류 수	1,000 ㎖

1-3. 돼지파보 바이러스 항원생산

돼지파보용 항원생산은 Recombinant Baculovirus VP2-BV strain를 Sf-9 세포에 접종한 뒤 채독하여 2,500rpm, 15분 원심 후 침전된 세포를 부유하여 일정 압력으로 세포파쇄하고 2,500rpm, 15분간 원심분리하여 분리된 상청액을 불활화한 것을 사용하였다. 이 때, 배지조성은 하기 표 2에 나타내었다.

돼지파보 바이러스 항원 배지조성

조 성	함 량
Grace medium	900 ㎖
Fetal Bovine Serum	100 ㎖
Streptomycin	100 ㎍/㎖
Lipid mixture	적당량
Penicillin	100IU/㎖
Kanamycin	100 ㎍/㎖
AmphotericinB	2.5 ㎍/㎖
증 류 수	1,000 ㎖

1-4. 복합 백신 제작

멸균된 공병에 불활화시킨 돼지파보항원을 ㎖당 2500HA unit, 돈단독균체 배양액은 ㎖당 50억 CFU, 단독분비단백이 ㎖당 250~350㎍이 되도록 멸균인산완충액으로 희석하여 혼합하였다. 그리고 수산화알루미늄겔이 최종적으로 총 벌크의 20부피%가 되도록 혼합하여 2시간 이상 충분히 교반하여 시험백신을 제조하였다.

<실험예 1> 복합 백신의 체내 면역학적 상호 간섭효과 조사

돈단독 균체항원 및 돈단독 분비단백 항원만을 함유한 시험백신①과 돼지파보단백항원만을 함유한 시험백신②, 그리고 이 두 가지를 혼합한 후 만들어진 시험백신③ 3가지를 공시하여 체내에서의 면역학적 상호 간섭작용의 유무를 조사해보았다.

그 결과는 아래의 표 3에 나타내었으며, 그 결과는 아래의 표 3에 나타내었으며, 두 가지 항원을 혼합한 백신과 혼합 전 단일 항원의 백신과의 면역원성 및 유효성의 차이를 비교해보면, 돈단독항원에 대해서는 혼합 후 0.5% 감소, 돼지파보항원에 대하여는 혼합 후 1.92% 증가한 것으로 나타나 두 항원의 혼합으로 인한 면역원성 및 유효성의 유의적인 변화는 발견하지 못했다. 따라서 면역학적 상호 간섭작용이 거의 없는 복합백신으로 적합한 것으로 판단되었다.

단일, 복합백신의 면역학적 상호간섭 실험 결과

샘플별	sample ①	sample ②	sample ③
항 원 구성별	단독균체 50억/㎖ 단독단백 200㎍/㎖ RehydraGel 20부피%	돼지파보 2500HAU RehydraGel 20부피%	단독균체 50억/㎖ 단독단백 200㎍/㎖ 돼지파보 2500HAU RehydraGel 20부피%
돼지파보HI titer (10log2)	해당없음	5.2	5.6
마우스 방어효과(%)	85%	해당없음	84.6%

<실험예 2> 복합백신의 면역원성 향상을 위한 백신 조성 비율 최적화

돈단독 균체항원 및 돈단독 분비단백 항원함량을 달리 한 후 시험백신을 제조하여 돈단독에 대한 면역원성 비교시험을 실시해보았다. 즉 돼지파보항원에 단독균체와 단독분비단백이 혼합된 2종류의 샘플과 돼지파보항원에 단독균체만 혼합된 샘플, 그리고 돼지파보항원에 분비단백만 혼합된 샘플, 이렇게 총 4가지의 샘플을 공시한 뒤 마우스에 0.2㎖씩 피하접종하고 2주 뒤 공격접종을 실시해보았다.

그 결과는 표 4에 나타난 바와 같이, 단독균체와 단독분비단백(250㎍/㎖)이 함유된 샘플의 마우스 방어능이 95%, 단독균체 없이 분비단백(250㎍/㎖)만이 함유된 샘플의 경우 83%, 단독균체만 함유된 샘플의 경우 22%로 각각 나타남에 따라, 타 실험 복합백신보다 그 면역원성에 있어서 최고 4.3배가 뛰어난, 마우스방어능이 95%에 이르는 샘플 ⑤의 조성을 가지는 복합 백신 조성물이 최적의 고면역원성을 가짐을 실험적으로 확인하였다.

복합 백신 조성 비율에 따른 면역원성 비교

샘플별	sample ④	sample ⑤	sample ⑥	sample ⑦
항 원 구성별	단독균체 50억/㎖ 단독단백 125㎍/㎖ 돼지파보 2500HAU RehydraGel 20부피%	단독균체 50억/㎖ 단독단백 250㎍/㎖ 돼지파보 2500HAU RehydraGel 20부피%	단독균체 50억/ ㎖ 돼지파보 2500HAU RehydraGel 20부피%	단독단백 250㎍/㎖ 돼지파보 2500HAU RehydraGel 20부피%
공격량	5×108 CFU/0.2㎖	5×108 CFU/0.2㎖	5×108 CFU/0.2㎖	5×108 CFU/0.2㎖
마우스 방어효과	60* (12/30)**	95 (2/40)	22 (23/30)	83 (5/30)

* 생존율 ** 폐사수/공시수

<실험예 3> 복합 백신의 안전성 시험

샘플 ⑤와 동일한 조성을 가진 시험품 3로트를 제조 후 실험동물 및 목적동물에 대한 안전시험을 실시하였다. 접종량은 마우스는 0.2㎖(1/10dose), 기니픽 2㎖(1dose), 목적동물에는 4㎖(2dose)였으며 표 5 및 표 6에서 나타난 바와 같이, 접종 결과 모두 특별한 이상 없이 생존하여 시험품에 대한 안전성을 확인할 수 있었다.

복합 백신의 안정성 시험 결과

vaccine	Group		route	Volume	No.	관 찰 일 자 별 (생존두수)														결 과
						1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
sample ⑤-1	마우스	injection	SC	0.2㎖	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	이상 없음
		control	-	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
	기니픽	injection	SC	2㎖	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	-	-	-	-
																				이상 없음
		control	-	-	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	-	-	-	-
sample ⑤-2	마우스	injection	SC	0.2㎖	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20
																				이상 없음
		control	-	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
	기니픽	injection	SC	2㎖	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	-	-	-	-	이상 없음
		control	-	-	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	-	-	-	-
sample ⑤-3	마우스	injection	SC	0.2㎖	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20	이상 없음
		control	-	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
	기니픽	injection	SC	2㎖	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	-	-	-	-	이상 없음
		control	-	-	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	-	-	-	-

시험백신의 자돈 및 모돈에 대한 안전성 시험 결과

Test vaccine	Experimental animal	Pig No	Inoculum (㎖)/route	Clinical sign
				Temperature		dyspnea	depression	vomiting
				Pre-vac	After 1hr
sample ⑤-1	Sow	525	4/IM	37.2℃	37.5℃	-	-	-
		524	〃	36.5℃	36.7℃	-	-	-
	Piglet	1	〃	37.3℃	38.0℃	-	-	-
		2	〃	38.3℃	38.3℃	-	-	-
sample ⑤-2	Sow	24-195	〃	37.8℃	37.4℃	-	-	-
		24-197	〃	38.0℃	38.3℃	-	-	-
	Piglet	3	〃	39.0℃	39.3℃	-	-	-
		4	〃	38.5℃	38.2℃	-	-	-
sample ⑤-3	Sow	25-9	〃	38.0℃	38.3℃	-	-	-
		25-10	〃	37.5℃	37.9℃	-	-	-
	Piglet	5	〃	38.7℃	38.8℃	-	-	-
		6	〃	38.9℃	38.6℃	-	-	-

<실험예 4> 복합백신의 면역원성 시험

공시된 시험백신과 동일한 항원 조성을 가진 타 외국회사의 백신을 공시한 뒤 비교시험을 실시해보았다. 즉 시험백신와 외국백신(에리파보, intervet 사, 네델란드)를 각각 마우스에 접종한 후 2주 뒤 병원성 단독균을 피하로 0.2㎖씩 공격 접종하였다. 공격접종 후 10일간 각 그룹의 폐사율을 살펴본 결과 시험백신 그룹은 52%의 생존율을 외국 백신의 생존율은 0%로 나타나 시험백신의 방어력이 우수함을 실험적으로 확인하였다.

공시 백신별 돈단독 공격접종 후 방어능 결과

	공시수	돈단독 공격접종 후 일자별 폐사현황										총폐사수	폐사율 (%)
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
시험백신	50				22		2					24	48
외국백신	45				24	6	3		3		9	45	100
대조군	20		2		14	4						20	100

<실험예 5> 공격접종을 통한 유효성 시험

5-1. 시험군 구분 및 조건

돼지파보바이러스에 대한 항체가가 10배 이하이며, 돼지단독균에 대한 항체가가 8배 이하인 후보돈 6두를 공시한 후, 접종군 4마리, 대조군 2마리로 구분하였다.

백신접종은 접종군 4두를 대상으로 종부예정일 5주전에 1차 접종을, 종부예정일 2주전에 2차 접종을 실시하였다. 인공수정은 이틀 연속 2회 실시하였으며 초음파임신진단기를 이용해서 수정 후 3주째 임신여부를 확인한 결과 6두 모두 임신이 확인되었다.

5-2. 공격접종

접종군 2, 대조군 1마리를 돼지파보바이러스군으로 둔 뒤 수정 후 40일 뒤 준비한 강독바이러스(HA 512/50㎕)를 접종군 2마리와 대조군 1마리에 각각 접종하였다. 접종경로는 이정맥을 통한 정맥접종을 실시하였으며 접종량은 각각 5㎖로 하였다. 나머지 3마리는 돼지단독군으로 둔 뒤 수정 후 약 25일 뒤 준비한 병원성 돼지단독균을 1×10⁹CFU/㎖ 되도록 조정한 후 접종군 2마리와 대조군 1마리에 5㎖씩 이정맥을 통해 접종하였다.

공시된 후보돈에 대한 돼지파보바이러스 및 돼지단독 공격 접종 방법

	PPV group		SE group
	vaccination	control	vaccination	control
No. of gilt	2	1	2	1
Date of challenge	after 45 days gestation	after 45 days gestation	after 25 days gestation	after 25 days gestation
Inoculum for challenge	5㎖/head (HA 512/50㎕)	5㎖/head (HA 512/50㎕)	5×109/head	5×109/head
Challenge route	IV	IV	IV	IV

5-3. 공격 후의 임상증상 관찰

돼지파보군에서 병원성돼지파보바이러스(K-1 strain)를 공격접종한 후 7일간 임신돈의 임상증상을 관찰한 결과 3마리의 대조군, 접종군 모두 특별한 임상증상을 발견하지 못했다.

돼지단독군의 경우, 공격접종 전 2일부터 접종 후 7일까지(10일간) 임신돈의 체온을 측정하고, 공격접종 후 4주까지 임상증상을 매일 관찰하였다. 그 결과 병원성 돈단독균을 공격접종한 후 3일 뒤부터 대조군 모돈의 체온이 40℃ 이상으로 오르면서 발열반응을 보였으며 돼지단독의 특징적 증상 중의 하나인 피부 발적을 보였다. 발적은 어깨, 등, 둔부에서 보였으며 크기는 2~15㎝ 정도로 다양하였다. 이와 함께 원기소실, 침울, 식욕절폐 및 설사 등의 증상을 보이다가 일주일 뒤 증상이 조금씩 완화되면서 발적도 서서히 사라지기 시작했다. 증상발현 2주 뒤부터는 회복상태로 접어들었으며 시험종료 시기인 한달 뒤에는 정상적인 상태를 보였다. 공격접종 뒤 유산의 징후는 특별히 발견하지 못하였다. 이에 반해 접종군 모돈 2마리의 경우는 공격접종 뒤에도 특별한 임상증상을 보이지 않았다. 피부, 소화기, 호흡기, 관절, 식욕 등 모두 정상적이었으며 발열반응도 보이지 않았다.

병원성돈단독균을 공격 접종한 모돈의 공격접종 전 3일부터 공격접종 후 15일간의 체온변화는 도 1에 나타내었다.

5-4. 부검 후의 태아상태 확인 및 HA와 PCR을 통한 돼지파보 항원 검출

공격접종 4주 뒤 돼지파보군 3두 모두를 마취 후 부검하여 태아의 상태를 확인하고 태아의 신장, 간, 폐, 비장을 무균적으로 적출하였으며, 흉수와 복수를 각각 채취하였다. 접종군 2두에서는 각각 12, 10마리의 태아를, 대조군 1두에서는 9마리의 태아를 적출하였다. 적출한 태아의 crown rump length는 접종군 태아 22마리의 경우 17~21㎝, 대조군 태아 9마리의 경우 14~18㎝ 사이로 나타났으며, 접종군 태아는 모두 생존한 반면 대조군에서는 태반감염으로 인해 폐사한 태아와 발육장해로 보이는 태아가 동시에 관찰되었다.

적출한 태아에서 무균적으로 채취한 흉수 및 복수를 이용하여 HA를 실시하였다. 채취한 흉수와 복수는 5,000rpm에서 15분간 원심분리 후 상층액을 취하였으며 혈구는 PBS에 부유시킨 0.5% 기니픽 RBC를 이용하였다. 그 결과 접종군 태아에서는 모두 2배 이하의 결과를 보였으며 대조군에서는 9마리의 태아 중 3마리에서 양성의 결과를 보였다. 개체별로 보면 각각 1,024배, 512배, 64배의 HA titer를 나타냈다.

태아에서 채취한 간, 비장, 신장, 폐조직 유제액으로 PCR을 통한 항원검사도 실시하였다. 즉, 동결된 태아(fetuses)의 조직을 세절하여 PBS로 10~20%의 현탁액을 만든 후 proteinase K와 PCI(Phenol, Chloroform, Isoamyl alcohol) 등을 이용해 DNA를 추출하였다. 주형 DNA 2㎕와 10 pmole/㎕ 의 전방 프라이머(forward primer) 및 역 프라이버(reverse primer) 각각 1㎕와 증류수 16㎕를 PCR premix에 첨가 혼합한 후, 94℃에서 5분간 프리히팅(preheating)시키고 변성(denaturation) 95℃ 30초, 재조합(annealing) 53℃ 30초, 확장(extension) 72℃ 45초씩으로 하여 30 회(cycles) 수행한 후 72℃에서 7분간 최종 확장(final extension)하였다. PCR 결과는 HA 결과와 동일하게 나타나 접종군에서는 모두 음성, 대조군에서는 9두 중 3마리에서만 양성을 보였다. 따라서 접종군의 경우 돼지파보바이러스 공격접종 시 백신의 효과로 인한 방어가 가능했으나 대조군의 경우 태반감염이 성립되었음을 확인할 수 있었다.

태아 HA와 PCR을 통한 돼지파보 항원 검출

Gilt no.	Number of fetuses	HA*	PCR	crown rump length (㎝)
Fetuses from vaccinated gilts
2	12	0/12**	0/12	17 ~ 21
6	10	0/10	0/10	17 ~ 19
total	22	0/22	0/22
Fetuses from non-vaccinated gilts
4	9	3/9	3/9	14 ~ 18

* 1:32 이상의 HA titer를 양성이라고 간주함.

** 양성을 보인 태아의 수/총 실험 태아의 수.

<실험예 6> 시험 백신의 면역지속기간 테스트

6-1. 돈단독의 면역지속기간 설정 시험

6-1-1. 백신접종

공시된 돼지는 5~6주령의 자돈 18두로 파보 및 돼지단독 항체 음성이었다. 먼저 18마리 자돈 중 14마리 자돈에 권장접종법대로 3주 간격으로 시험백신을 2회 접종하였으며 나머지 4마리는 생리식염수를 접종 후 대조군으로 사용하였다.

6-1-2. 면역지속에 대한 시험 방법

① 3주 면역지속에 대한 시험

시험백신 접종 3주 뒤 접종군 6마리와 대조군 2마리에 병원성이 있는 E. rhusiopathiae (T2 strain) 균주 0.1㎖을 피내에 공격 접종하였으며 주사부위에 돈단독의 전형적인 증상의 하나인 피부 병변 형성여부를 7일간 관찰하였다. 이 방법은 유럽약전인 'European Pharmacopoeia'를 참고로 하였다.

② 15주 면역지속에 대한 시험

시험백신 접종 15주 뒤 접종군 4마리와 대조군 1마리에 병원성이 있는 E. rhusiopathiae (T2 strain) 균주 0.1㎖을 피내에 공격 접종하였으며 주사부위에 돈단독의 전형적인 증상의 하나인 피부 병변 형성여부를 7일간 관찰하였다. 이 방법은 유럽약전인 'European Pharmacopoeia'를 참고로 하였다.

③ 20주 면역지속에 대한 시험

시험백신 접종 20주 뒤 접종군 4마리와 대조군 1마리에 병원성이 있는 E. rhusiopathiae (T2 strain) 균주 0.1㎖을 피내에 공격 접종하였으며 주사부위에 돈단독의 전형적인 증상의 하나인 피부 병변 형성여부를 7일간 관찰하였다. 이 방법은 유럽약전인 'European Pharmacopoeia'를 참고로 하였다.

6-1-3. 면역지속기간 설정 시험 결과

백신접종 3주, 15주, 20주 뒤에 병원성이 있는 E. rhusiopathiae (T2 strain) 균주 0.1㎖을 피내에 공격 접종한 결과 3주 뒤 접종한 접종군과 대조군은 각각 0%와 100%의 임상증상을 보였으며 15주 뒤 역시 이와 동일하였다. 하지만 백신접종 20주 뒤 공격접종한 접종군와 대조군은 각각 25%와 100%의 임상증상을 보여 15주 전보다 면역력이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 대조군은 80% 이상 피부 병변을 나타내어야 하고, 백신 접종군은 80% 이상 주사 부위에 병변이 없어야 하는 'European Pharmacopoeia'의 판정기준을 근거로 볼 때 이 백신의 돈단독에 대한 면역지속기간은 최대 20주 정도로 인정되었다.

시험백신의 접종 3주, 15주, 20주 후 방어능 시험 결과

Group	Clinical sign (%)
	3주뒤	15주뒤	20주뒤
Vaccination	0 (0 / 6)*	0 (0 / 4)	25 (1 / 4)
Control	100 (2 / 2)	100 (1 / 1)	100 (1 / 1)

* 발병두수(피부병변) / 접종두수

6-2. 돼지파보의 면역지속기간 설정 시험

6-2-1. 백신접종

공시된 돼지는 5~6주령의 자돈 5두로 파보 및 돼지단독 항체 음성이었다. 먼저 5마리 자돈 중 4마리 자돈에 권장접종법대로 3주 간격으로 시험백신을 2회 접종하였으며 나머지 1마리는 생리식염수를 접종 후 대조군으로 사용하였다.

6-2-2. 채혈 및 혈청분리

기초접종 1차 전과 2차 전, 2차 접종 3주 후, 6주 후, 10주 후, 15주 후, 20주 후, 25주 후에 채혈하였으며, 혈청을 분리한 뒤 56℃, 30분간 비동화를 실시하였다.

6-2-3. 접종 후 일정 시간 경과에 따른 돼지파보바이러스에 대한 항체가 변화

접종 전 공시된 자돈의 항체가는 10배 이하이었으며 2차 접종 후 최대 640배에 달하였다. 접종군의 평균 항체가는 최고 320배였으며 이 후로부터 점점 떨어져 25주후에는 평균 23.8배의 항체가를 보였다. 이 결과를 참고하여 항체가가 거의 음성으로 떨어지는 25주를 재접종 시기로 잡고 이 백신의 면역지속기간은 25주로 설정하고자 하였다.

시험백신 접종 후 경과된 시간별 돼지파보바이러스 HI 항체가 조사 결과

Farm	Pig No.	HI titer
		접종전	2차접종	2차3주후	2차6주후	2차10주후	2차15주후	20주후	25주후
춘천	vaccinate
	PL1	<10	40	320	320	160	80	40	40
	PL2	<10	80	320	320	160	80	80	20
	PL3	<10	80	640	640	160	160	160	40
	PL4	<10	80	160	160	40	40	40	10
	Geometric Mean	<10	67.2	320.0	320.0	113.1	80.0	67.2	23.8
	control
	PL5	10	10	10	10	10	10	10	10

결론적으로 돈단독에 대하여는 20주, 돼지파보바이러스에 대하여는 25주까지 면역이 유지되어 상기 복합 백신이 약 15 주 내지 25주 동안 면역능을 유지하는 것을 실험적으로 확인할 수 있다.

도 1은 병원성돼지단독균 공격접종 전후의 접종군, 대조군의 체온변화를 나타낸 것이다.

도 2는 병원성돼지단독균 공격접종 후의 대조군의 피부병변을 나타낸 것이다.

도 3은 시험백신 접종 후 수정시킨 후보돈에 병원성 돼지파보바이러스를 공격접종 하고 수정 75일 후에 적출한 태아를 나타낸 것이다.

Claims (7)

1. 면역학적 활성성분으로 돈단독불활화 균체항원, 돈단독 분비단백 항원 및 돼지파보항원을 포함하는, 돼지파보바이러스 및 돈단독균을 동시에 예방할 수 있는 복합 백신에 있어서, 돼지파보항원은 2500HA~3000HA unit/㎖, 돈단독균체 항원은 50억 CFU/㎖, 단독분비단백은 250㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 복합 백신.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 돼지파보항원은 2500HA unit/㎖인 것을 특징으로 하는 복합 백신.
4. 제3항에 있어서, 상기 복합백신은 5×10⁸ CFU/0.2㎖의 돈단독균 공격접종시 90% 이상의 마우스방어능을 나타내는 것을 특징으로 하는 복합 백신.
5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 수산화알루미늄겔이 최종 벌크의 20부피%가 되도록 혼합한 것을 특징으로 하는 복합 백신.
6. 삭제
7. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 복합 백신은 15 주 내지 25주 동안 면역능을 유지하는 것을 특징으로 하는 복합 백신.

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