PL190989B1 - Kompozycje immunologiczne i ich zastosowanie - Google Patents

Abstract

1. Kompozycja immunologiczna, znamienna tym, ze zasadniczo sk lada si e z: (i) izolowane- go, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi sk ladaj acego si e zasadniczo z OspA, lub wekto- ra wyra zaj acego antygen, (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego ni z Borrelia burgdorferi albo wektora wyra zaj acego co najmniej jeden dodatkowy antygen, i ewen- tualnie (iii) no snika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jednym dodatkowym antygenem jest antygen wirusa w scieklizny, lub co najmniej jeden dodatkowy antygen zasadniczo sk lada si e z kombinacji antygenu psiej zarazy i antygenu adenowirusa, anty- genu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa lub co najmniej jeden dodatkowy antygen sk lada si e zasadniczo z kombinacji antygenu w scieklizny, antygenu psiej zarazy, antyge- nu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa. 2. Kompozycja immunologiczna, znamienna tym, ze zasadniczo sk lada si e z: (i) izolowane- go, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi sk ladaj acego si e zasadniczo z OspA, lub wekto- ra wyra zaj acego antygen OspA i (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego ni z Borrelia burgdorferi albo wektora wyra zaj acego co najmniej jeden dodatkowy antygen i ewentualnie (iii) no snika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jeden dodatkowy antygen sk lada si e zasadniczo z antygenu wybranego z grupy sk ladaj a- cej si e z: antygenu wirusa w scieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu wirusa paragrypy, antygenu parvowirusa i ich mieszaniny. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są kompozycje immunologiczne i ich zastosowanie.

Zgłoszenia pokrewne

Zgłoszenia pokrewne dotyczą patentów USA Nr 5,582,990, 5,523,089 zgłoszeń o numerach PCT/US95/07665, PCT/US92J08972, WO93/08306, PCT/U595/07665, WO93/08299,

PCT/US92/08697, PCT/US95/07709, WO95/35119 i WO90/04411, które załączone są tu jako odnośniki. W niniejszym zgłoszeniu jako odnośniki są włączone cytowane dokumenty, wraz z powoływanymi w nich odnośnikami, albo przedstawione w osobnej liście zatytułowanej „Odnośniki”, znajdującej się przed zastrzeżeniami, oraz każdy dokument cytowany w niniejszym zgłoszeniu.

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy kompozycji przeciwko chorobie z Lyme (antygen Borrelia burgdorferi) zwłaszcza kompozycji złożonych oraz zastosowania, zwłaszcza zastosowania weterynaryjnego. Oprócz antygenu Borrelia burgdorferi kompozycja może obejmować antygen dodatkowego patogenu, takiego jak patogen psi, koci albo koński, przykładowo antygen przynajmniej jednego z takich jak: wirus wścieklizny, wirus zarazy psiej, adenowirus, koronawirus, wirus paragrypy, parvowirus, FeLV, koci wirus herpes, wirus końskiej grypy, koński wirus herpes itp. Kompozycje po podaniu biorcy korzystnie wywołują reakcję odpornościową przeciwko zakażeniom chorobą z Lyme (Borrelia burgdorferi), jak również przeciwko innym antygenom w kompozycji. Kompozycje wywołują długotrwałą odporność (reakcję) przeciwko patogenowi choroby z Lyme Borrelia burgdorferi u zwierząt, w tym koni i psów, i umożliwiają ochronę albo wywołują reakcję odpornościową u zwierząt. W kompozycjach złoż onych nie występuje zakłócenie polegające na braku skuteczności tzw. interferencja skuteczności (ang. efficacy interference).

Wynalazek dalej dotyczy zastosowania takich kompozycji.

Wynalazek umożliwia wytworzenie przeciwciał wywołanych przez kompozycję, wyizolowanych od zwierzęcia albo z hodowli komórkowej, co może być przydatne do wytworzenia zestawu diagnostycznego, testu do wykrywania antygenu Borrelia burgdorferi albo choroby z Lyme albo antygenu innego patogenu albo innego patogenu.

Podstawa wynalazku

Choroba z Lyme jest wieloukładowym schorzeniem przenoszonym przez ugryzienie Ixodes ricinus. Czynnikiem etiologicznym choroby z Lyme, która obecnie jest najczęstszą chorobą przenoszoną przez stawonogi w Stanach Zjednoczonych i endemicznie występuje w Europie Środkowej, jest w szerszym znaczeniu krę tek Borrelia burgdorferi, (Barbour i in., 1993). Jakkolwiek jest ona wyleczalna antybiotykami we wczesnych stadiach, pozostawiona bez leczenia może spowodować powstanie zaburzeń serca, neurologicznych oraz stawów. Badania nad szczepionką dla ludzi trwają. Obecnie głównym kandydatem na taką szczepionkę jest lipoproteina błony zewnętrznej Borrelia burgdorferi OspA. Wiadomo, że rekombinowana lipoproteina OspA (rOspA) wywołuje u myszy ochronną odporność przed ekspozycją na zakaźne B. burgdorferi (Fikrig i in., 1990, Erdile i in., 1993, USSN 08/573,455). OspA jest obecnie poddana w Stanach Zjednoczonych badaniom klinicznym na ludziach, jako szczepionka podawana podskórnie (Keller i in., 1994).

Wyżej wspomniane zgłoszenia WO93/08299 i PCT/US92/08697 dotyczą rekombinowanej szczepionki OspA (rOspA), zwłaszcza lipidowanej rOspA, oraz sposobów ekspresji DNA kodującego OspA i izolowania lipidowanej rOspA. Wyżej cytowane patenty USA 5,582,990 i 5,523,089 oraz zgłoszenie WO 90/04411 dotyczą DNA kodującego OspA, sekwencji aminokwasowej OspA, w tym rOspA i jej lipidowanych postaci, syntetycznej OspA, w tym rOspA i jej lipidowanych postaci, kompozycji zawierających OspA albo syntetyczną OspA, oraz sposobów ich zastosowania. Powyższe zgłoszenia dotyczą DNA kodującego inne antygeny Borrelia burgdorferi i innych Osp, albo DNA kodującego przydatne fragmenty OspA albo innych Osp, ich sekwencji aminokwasowych, kompozycji obejmujących takie fragmenty albo inne Osp, oraz sposobów zastosowania takich kompozycji. Cząsteczki DNA przedstawione w cytowanych dokumentach, dotyczących Borrelia burgdorferi, można zastosować w sposobach według patentów USA nr 5,582,990 i 5,523,089 albo PCT/US92/08697 w celu wytworzenia OspA, innych antygenów Borrelia albo Osp, albo ich fragmentów do zastosowania w niniejszym wynalazku. W odniesieniu do DNA i antygenów przydatnych według wynalazku odnośnikiem jest również Molecular Microbiology (1989), 3(4), 479-486.

Szczególny problem stanowią zakażenia zwierząt domowych Borrelia burgdorferi na skutek ukąszeń przez kleszcze. Przykładowo, psy i konie są podatne na chorobę z Lyme na skutek ukąszePL 190 989 B1 nia przez kleszcza, zaś ich opiekunowie nie zdają sobie sprawy z zakażenia, zanim nie jest za późno (pierścień wokół ugryzienia kleszcza pozostaje niezauważony z powodu sierści, zaś psy czy konie nie są w stanie przekazać informacji o bolących stawach itp. albo opiekunowie nie zauważają pewnych subtelnych objawów choroby u zwierząt). Oprócz tego, istnieją pewne obawy dotyczące możliwości przenoszenia choroby na ludzi.

Dalszy problem dotyczy strategii szczepienia. Konkretnie, przy szczepieniu zwierząt domowych korzystne jest podawanie wielu antygenów w jednym „koktajlu” albo kompozycji poliwalentnej, przykładowo, w celu zmniejszenia liczby iniekcji albo liczby wizyt u weterynarza.

Obecnie nie jest dostępna albo znana kombinacja przeciwko chorobie z Lyme, albo „koktajl” albo szczepionka poliwalentna albo kompozycja odpornościowa albo immunogenna (antygen Borrelia burgdorferi w kombinacji z innymi antygenami w kompozycji, szczególnie dla koni).

Jeszcze inny problem, szczególnie dotyczący kompozycji poliwalentnych, odnosi się do „interferencji skuteczności”, konkretnie niemożności zachowania albo osiągnięcia skuteczności przez jeden albo wiele antygenów złożonej kompozycji. Uważa się, że jest to spowodowane przez wywołaną podaniem interferencję z antygenem pobudzającym odporność, przeciwciałami albo reakcją ochronną gospodarza, np. psa, z powodu obecności innych antygenów. Przykładowo, antygeny wścieklizny w kombinacji z innymi antygenami doznają interferencji przez albo interferują z wywoływaniem reakcji odpornościowej, antygenowej, przeciwciał albo ochronnej przez inne antygeny w kompozycji, zwłaszcza gdy kompozycję podaje się psom. W szczególności, antygeny takie jak antygeny wścieklizny albo Leptospira, po podaniu z jednym albo wieloma antygenami mogą interferować z reakcją wywołaną przez te antygeny. W rzeczywistości, antygeny Leptospira mogą interferować z OspA. Jednakże, dla innych gospodarzy, takich jak koty, znane są szczepionki skojarzone. Prawdopodobnie, nie chcąc się wiązać z żadną teorią, „interferencja skuteczności spowodowana jest pewną odmiennością psiego układu biologicznego, albo reakcją z psim układem biologicznym obecnie znanych antygenów albo przez ich kombinację.

Niezależnie od teorii, według wiedzy niniejszego wynalazcy, nieznane są kombinacje szczepionki przeciwko chorobie z Lyme z innymi kompozycjami antygenowymi, zwłaszcza do stosowania u psów, które nie wykazują interferencji skuteczności. Istnieje zapotrzebowanie na kombinację przeciwko chorobie z Lyme, zwłaszcza do stosowania u psów. Byłoby niespodziewane, nieoczekiwane i nieoczywiste sformuł owanie szczepionki skojarzonej przeciwko chorobie z Lyme (z innymi antygenami), która wykazywałaby brak interferencji skuteczności u psowatych, zwłaszcza, że jak wiadomo z obecnej wiedzy o interferencji skuteczności, nie można po prostu połączyć „kombinacji antygenowej” w celu wytworzenia przydatnej kompozycji złożonej albo „koktajlu”.

Oprócz tego, korzystne byłoby gdyby taka kompozycja antygenowa przeciwko chorobie z Lyme zapewniała psom długotrwałą odporność, jak również ochronę dla szczeniąt przed chorobą z Lyme przekazywaną jako odporność macierzyńską. Jak wiadomo specjalistom, odporność macierzyńska jest rodzajem odporności, którą noworodki nabywają od matki przed porodem i/lub w trakcie karmienia, która to odporność zanika u noworodków po pewnym czasie, pozostawiając je podatnymi na chorobę. Ponadto, obecność przeciwciał matczynych u noworodka uniemożliwia nabycie przez noworodka odporności ochronnej po podaniu kompozycji immunogennej, np. szczepionki, co oznacza, że noworodek musi wejść w okres braku albo słabej odporności, tj. podatności, a więc istnieje zagrożenie, które trwa do podania kompozycji antygenu albo szczepionki. W odniesieniu do odporności macierzyńskiej, powołuje się jako odnośnik patent USA nr 5,338,683, udzielony 16 sierpnia, 1994 i włączony tu jako referencje.

Tak więc, pożądane są alternatywne strategie szczepienia.

Jeszcze korzystniejsze, nieoczekiwane i zaskakujące byłoby, gdyby antygen Borrelia burgdorferi, który można zastosować w kompozycji skojarzonej pozbawionej interferencji skuteczności u psów można by zastosować w takiej kompozycji u innych biorców jak koty, konie itp., i która zapewniałaby długotrwałą ochronę u psów, jak również ochronę dla szczeniąt mimo odporności macierzyńskiej, i ż eby był to antygen rekombinowany.

W szczególności, uważa się, że do tej pory nie opisano i nie sugerowano podawania ssakowi zwłaszcza zwierzęciu domowemu, takiemu jak psy, koty albo konie - podatnemu na chorobę z Lyme, kompozycji skojarzonej, obejmującej antygen Borrelia burgdorferi, np. OspA, zwłaszcza jak to tu ujawniono.

Cel i streszczenie wynalazku

Immunizacja monowalentna szczepionką przeciwko chorobie z Lyme (Borrelia burgdorferi) (określaną tu jako Ly) okazało się być bezpieczne i skuteczne u psów, jak stwierdzono odsetkiem serokonwersji i ochrony przed zakażeniem Borrelia burgdorferi.

PL 190 989 B1

Badania wykazały, że szczepionka przeciw chorobie z Lyme, zawierająca 10 μg/ml OspA (wytworzonej według WO93/08299 i patentów USA 5,582,990 i 5,523,089) zapewniała psom istotną ochronę przed ekspozycją przez ukąszenie, co określono zarówno zmniejszeniem proliferacji krętków, jak i zapobieganiem chorobie klinicznej. Ponadto, odporność wywołana szczepionką wciąż była istotna, gdy ekspozycja miała miejsce w 5-6 miesięcy po szczepieniu. Wykazano, że szczepionka monowalentna jest wyjątkowo bezpieczna, psy wykazujące objawy kliniczne choroby z Lyme nie wykazywały zaostrzenia choroby podczas szczepienia kolejnymi, wysokimi dawkami szczepionki OspA.

Jednakże, byłoby jeszcze bardziej korzystne dostarczenie bezpiecznej i skutecznej skojarzonej szczepionki przeciwko chorobie z Lyme. Byłoby korzystniejsze uzyskanie braku interferencji szczepionki obejmującej OspA podczas podawania psom innych antygenów. Obecne wyniki pokazują, że podskórne szczepienie, podawane w odstępach, daje istotną serokonwersję. Poziom przeciwciał wywołanych u szczepionych jest podobny do obserwowanego u psów otrzymujących szczepionkę monowalentna, poziom, który jak wykazano, chroni szczepione zwierzęta przed ekspozycją na ukąszenia zakażonych Borrelia kleszczy.

Ponieważ istnieją dowody, że konie są również podatne na zakażenia Borrelia burgdorferi, byłoby również istotnym postępem dostarczenie szczepionek dla koni przeciwko chorobie z Lyme, które spowodowałyby wytwarzanie u koni przeciwciał przeciwko antygenowi Borrelia burgdorferi, np. OspA.

Celem wynalazku jest dostarczenie skojarzonej szczepionki albo kompozycji immunologicznej albo antygenowej Borrelia burgdorferi, np. OspA, zwłaszcza takiej kompozycji, która wywołuje ochronę u psów, koni albo innych zwierząt domowych.

Celem wynalazku jest dostarczenie szczepionki skojarzonej albo kompozycji odpornościowej albo antygenowej przeciwko chorobie z Lyme, która nie wykazuje istotnej interferencji skuteczności przez antygeny w kombinacji.

Celem wynalazku jest dostarczenie szczepionki skojarzonej albo kompozycji odpornościowej albo antygenowej przeciwko chorobie z Lyme, do wywoływania reakcji serologicznej po podaniu psom, koniom albo innym zwierzętom domowym.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunologiczna, która zasadniczo składa się z: (i) izolowanego, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi składającego się zasadniczo z OspA, lub wektora wyrażającego antygen, (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego niż Borrelia burgdorferi albo wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen, i ewentualnie (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jednym dodatkowym antygenem jest antygen wirusa wścieklizny, lub co najmniej jeden dodatkowy antygen zasadniczo składa się z kombinacji antygenu psiej zarazy i antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa lub co najmniej jeden dodatkowy antygen składa się zasadniczo z kombinacji antygenu wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa.

Wynalazek dotyczy kompozycji immunologicznej, która zasadniczo składa się z: (i) izolowanego, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi składającego się zasadniczo z OspA, lub wektora wyrażającego antygen OspA i (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego niż Borrelia burgdorferi albo wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen i ewentualnie (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jeden dodatkowy antygen składa się zasadniczo z antygenu wybranego z grupy składającej się z: antygenu wirusa wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu wirusa paragrypy, antygenu parvowirusa i ich mieszaniny.

W zakres wynalazku wchodzi kompozycja immunologiczna, która zasadniczo składa się z: (i) izolowanego, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi składającego się zasadniczo z OspA, lub wektora wyrażającego antygen, i (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego niż Borrelia burgdorferi albo wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen, i ewentualnie (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jednym dodatkowym antygenem jest antygen wirusa wścieklizny, lub co najmniej jeden dodatkowy antygen obejmuje kombinację antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa, lub co najmniej jeden dodatkowy antygen obejmuje kombinację antygenu wirusa wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy, i antygenu parvowirusa, i że co najmniej jednym dodatkowym antygenem nie jest antygen Leptospira, który koliduje

PL 190 989 B1 z OspA, korzystnie (ii) zasadniczo skł ada się z wektora wyraż ają cego co najmniej jeden dodatkowy antygen.

Wynalazek również dotyczy kompozycji immunologicznej, która obejmuje: (i) izolowany, oczyszczony antygen Borrelia burgdorferi składający się zasadniczo z antygenu OspA, lub wektora wyrażającego antygen OspA, i (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego niż Borrelia burgdorferi albo wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen, i ewentualnie (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jeden dodatkowy antygen jest wybrany z grupy składającej się z: antygenu wirusa wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy, antygenu parvowirusa, i ich mieszanki, pod warunkiem, że co najmniej jednym dodatkowym antygenem nie jest antygen Leptospira, który koliduje z OspA.

Wynalazek dotyczy również kompozycji immunologicznej, która składa się zasadniczo z: (i) izolowanego, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi składającego się zasadniczo z antygenu OspA, lub wektora wyrażającego antygen OspA, i (ii) co najmniej jednego zmodyfikowanego żywego wirusa wybranego z grupy składającej się z antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy, antygenu parvowirusa, i ich mieszanki, i ewentualnie (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie.

Korzystne jest jeśli kompozycja immunologiczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że (i) jest wyizolowanym, oczyszczonym antygenem OspA z Borrelia burgdorferi, korzystniej wyizolowanym, oczyszczonym antygenem OspA jest wyizolowany, oczyszczony lipidowany OspA.

Korzystnie kompozycja immunologiczna według wynalazku jest wolna od adiuwantu wzmacniającego immunogenność.

W korzystnym wykonaniu wynalazku kompozycja immunologiczna według wynalazku, charakteryzuje się tym, że (i) jest wektorem wyrażającym izolowany, oczyszczony antygen OspA z Borrelia burgdorferi.

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku kompozycja immunologiczna wedł ug wynalazku charakteryzuje się tym, że (ii) składa się zasadniczo z wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen patogenu ssaka.

W korzystnym wykonaniu kompozycji immunologicznej wedł ug wynalazku, co najmniej jednym dodatkowym antygenem (ii) jest antygen z patogenu innego niż Borrelia burgdorferi.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku kompozycja immunologiczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że co najmniej jednym dodatkowym antygenem jest antygen wirusa wścieklizny.

W korzystnym wykonaniu kompozycji immunologicznej wedł ug wynalazku co najmniej jeden dodatkowy antygen zasadniczo składa się z kombinacji antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy, i antygenu parvowirusa.

Wynalazek dostarcza zastosowania kompozycji immunologicznej według wynalazku do wytwarzania preparatu do wywoływania reakcji immunologicznej u ssaka podatnego na chorobę z Lyme i co najmniej jednego dodatkowego patogenu ssaków, innego niż Borrelia burgdorferi.

Wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji immunologicznej według wynalazku do wytwarzania preparatu do wywoływania reakcji immunologicznej u psa albo u konia albo u kota.

Korzystnie kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że (i) zasadniczo składa się z izolowanego, oczyszczonego antygenu OspA i (ii) ż e co najmniej jeden dodatkowy antygen jest z patogenu innego niż Borrelia burgdorferi.

Korzystne jest, gdy w kompozycji immunologicznej według wynalazku co najmniej jeden dodatkowy antygen zasadniczo obejmuje/składa się z kombinacji antygenu wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa.

Korzystnie kompozycja immunologiczna według wynalazku dodatkowo zawiera wzmacniający immunogenność adiuwant.

OspA Borrelia burgdorferi można otrzymać przez transformowanie organizmu gospodarza plazmidem zawierającym gen kodujący lipoproteinę OspA Borrelia burgdorferi pełnej długości, typu dzikiego, wytworzenie rekombinowanej lipoproteiny OspA Borrelia burgdorferi, oczyszczenie z lizatu organizmu gospodarza rekombinowanej lipoproteiny OspA Borrelia burgdorferi zasadniczo wolnej od innych białek bakteryjnych i lipopolisacharydu w warunkach nieredukujących.

Przykładowo, przydatna w tym wynalazku jest izolowana lipoproteina, obejmująca oczyszczoną rekombinowaną lipoproteinę OspA Borrelia burgdorferi, która zachowała lipidację, i jest zasadniczo pozbawiona innych białek bakteryjnych i lipopolisacharydu, i którą otrzymano w procesie, który obejmuje:

PL 190 989 B1

- transformowanie organizmu gospodarza plazmidem zawierającym gen kodują cy lipoproteinę OspA Borrelia burgdorferi pełnej długości i typu dzikiego i wytworzenie rekombinowanej lipoproteiny OspA Borrelia burgdorferi,

- oczyszczenie z lizatu organizmu gospodarza rekombinowanej lipoproteiny OspA Borrelia burgdorferi zasadniczo wolnej od innych białek bakteryjnych i lipopolisacharydu w warunkach nieredukujących w taki sposób, że izolowana, rekombinowana lipoproteina Borrelia burgdorferi zachowuje lipidację i jest immunogenna dla ssaków po podaniu biorcy będącemu ssakiem.

Oczyszczanie rekombinowanej OspA Borrelia burgdorferi można osiągnąć przez:

- poddanie komórek organizmu gospodarza lizie w celu otrzymania rozłożonych komórek,

- traktowanie rozło żonych komórek surfaktantem, który wybiórczo rozpuszcza lipoproteinę OspA Borrelia burgdorferi, preferencyjnie w stosunku do innych białek bakteryjnych i innych, i który jest zdolny do wywołania rozdziału faz w umiarkowanej temperaturze od około 35°C do 40°C, w celu otrzymania traktowanych rozłożonych komórek,

- rozdzielenie przez rozdział faz traktowanych rozłożonych komórek na fazę detergentową zawierającą rozpuszczoną lipoproteinę OspA Borrelia burgdorferi, fazę wodną zawierającą białka bakteryjne i inne oraz fazę stałą zawierającą resztki komórkowe,

- oddzielenie fazy detergentowej od fazy stałej i fazy wodnej,

- doprowadzenie do kontaktu fazy detergentowej z kolumną chromatograficzną w warunkach, które powodują wiązanie się białek innych niż lipoproteina OspA Borrelia burgdorferi z kolumną chromatograficzną, i

- odzyskanie przesą czu z pierwszej kolumny chromatograficznej, zawierającego lipoproteinę OspA Borrelia burgdorferi uwolnioną od związanych białek.

Oczyszczanie rekombinowanej OspA Borrelia burgdorferi można osiągnąć przez doprowadzenie do kontaktu fazy detergentowej z kolumną chromatograficzną przy pH około 7,5.

Alternatywnie, OspA można otrzymać przez proces wytwarzania izolowanej i oczyszczonej rekombinowanej lipoproteiny OspA kodowanej przez gen ospa pełnej długości i typu dzikiego, który obejmuje:

- wywoł anie indukcji lipoproteiny ospa Borrelia w organizmie gospodarza transformowanego plazmidem zawierającym gen OspA,

- poddanie lizie organizmu gospodarza,

- traktowanie rozło żonych komórek surfaktantem, który wybiórczo rozpuszcza lipoproteinę OspA Borrelia, preferencyjnie w stosunku do innych białek bakteryjnych i innych, i który jest zdolny do wywołania rozdziału faz w umiarkowanej temperaturze,

- wywołanie rozdziału faz na fazę detergentową zawierającą rozpuszczoną lipoproteinę OspA Borrelia, fazę wodną zawierającą białka bakteryjne i inne i fazę stałą zawierającą resztki komórkowe,

- oddzielenie fazy detergentowej od fazy stałej i fazy wodnej,

- oczyszczenie fazy detergentowej wolnej od biał ek innych niż lipoproteina OspA Borrelia i lipopolisacharydu przez:

(a) doprowadzenie do kontaktu fazy detergentowej z kolumną chromatograficzną w warunkach, które powodują wiązanie się białek innych niż lipoproteina OspA Borrelia z pierwszą kolumną chromatograficzną, (b) odzyskanie przesączu z pierwszej kolumny chromatograficznej, zawierającego lipoproteinę OspA Borrelia burgdorferi uwolnioną od związanych białek, (c) doprowadzenie do kontaktu przesączu z pierwszej kolumny chromatograficznej z drugą kolumną chromatograficzną w warunkach powodujących wiązanie lipoproteiny OspA Borrelia z drugą kolumną chromatograficzną preferencyjnie w stosunku do innych pozostałości zanieczyszczających białek i lipopolisacharydu, które przepływają przez drugą kolumnę chromatograficzną, (d) doprowadzenie do kontaktu drugiej kolumny chromatograficznej z eluentem w warunkach wypłukujących związaną lipoproteinę OspA Borrelia z drugiej kolumny chromatograficznej, i (e) zbieranie eluatu zawierającego OspA Borrelia z drugiej kolumny chromatograficznej.

Jeszcze dalej, w tym procesie kontaktowanie przesączu z drugą kolumną chromatograficzną można przeprowadzić w pH poniżej około 5,7 i skutecznie wiązać lipoproteinę OspA Borrelia z drugą kolumną chromatograficzną z eluentem przeprowadza się w pH do i powyżej około 5,7 i skutecznym do wypłukania związanej lipoproteiny OspA Borrelia z drugiej kolumny chromatograficznej.

Jeszcze dalej, w procesie tym kontaktowanie fazy detergentowej z pierwszą kolumną chromatograficzną można przeprowadzić w pH około 7,5, kontaktowanie przesączu z drugą kolumną chromaPL 190 989 B1 tograficzną można przeprowadzić w pH około 4,2, zaś kontaktowanie drugiej kolumny chromatograficznej z eluentem można przeprowadzić w pH około 5,7.

Wynalazek umożliwia uzyskanie przeciwciał wywołanych przez kompozycje i zastosowania.

Nieoczekiwanie, nie obserwuje się interferencji skuteczności przy zastosowaniu kompozycji według wynalazku.

Inne antygeny Borrelia do zastosowania w opisanych kompozycjach, procesach, oprócz albo zamiast OspA są m.in. dyskutowane w zgłoszeniach i dokumentach cytowanych w podrozdziale „Zgłoszenia pokrewne”, w tym sposoby wytwarzania tych innych antygenów.

Inne cele i wykonania są ujawnione w poniższym szczegółowym opisie albo wynikają z niego.

Krótki opis rysunków

W poniższym szczegółowym opisie powołuje się następujące towarzyszące Figury, załączone tu jako odnośniki, w których:

Figura 1 pokazuje oligonukleotydy PCR zastosowane w klonowaniu B-31, ACA1 i Ip90 genu ospA pełnej długości Borrelia burgdorferi do wektora ekspresyjnego pET9a,

Figura 2 pokazuje strategię klonowania w celu wprowadzenia genu ospA pełnej długości do wektora ekspresyjnego pET9a, umieszczając gen ospA pod kontrolą promotora T7 0 10, tworząc pOA1 z genu B31, pOA9 z genu ACA1 i pOA10 z genu Ip90,

Figura 3 jest przewidywaną mapą restrykcyjną plazmidu pOA1,

Figura 4 pokazuje wyniki różnych trawień restrykcyjnych plazmidu pOA1, pokazujące, że występują wszystkie przewidywane miejsca restrykcyjne (M = znaczniki (DNA 0X 174 trawiony Haelll), B = BamHI, E = EcoRI, H = Hindlll, N = Nde I),

Figura 5 pokazuje nukleotydy PCR zastosowane w klonowaniu B-31, ACA1 i Ip90 genu ospA pełnej długości Borrelia burgdorferi do wektora ekspresyjnego pCMBl,

Figura 6 pokazuje strategię klonowania w celu wprowadzenia genu ospA pełnej długości do wektora ekspresyjnego pCMB1, umieszczając gen ospA pod kontrolą promotora Trc, tworząc pOA5 z genu B31, pOA7 z genu ACA1 i pOA8 z genu Ip90,

Figura 7A, 7B i 7C pokazują przebieg czasowy indukcji OspA przez IPTG w dwóch szczepach gospodarzy zawierających pOA1 (Fig. 7A) i pOA5 (Fig. 7B) i pOA6 (Fig. 7C),

Figury 8A, 8B i 8C są schematami pokazującymi, odpowiednio, etapy wzrostu komórek i lizy, ekstrakcji detergentem i oczyszczania, wchodzące w skład procesu wytwarzania i oczyszczania rekombinowanego OspA pełnej długości w E. coli, według jednego z wykonań wynalazku, i

Figura 9 pokazuje wytwarzanie plazmidów pCMB1 i pCMB2.

Szczegółowy opis wynalazku

Jak dyskutowano wyżej, wynalazek dostarcza kompozycji zawierających antygen Borrelia burgdorferi, zwłaszcza do zastosowania u zwierząt domowych, takich jak psy, szczenięta, koty, kocięta i konie itp. Kompozycje korzystnie są „koktajlami albo kompozycjami poliwalentnymi. Oznacza to, że kompozycje korzystnie zawierają dodatkowe albo „inne” antygeny innych patogenów.

Antygen Borrelia burgdorferi może być interesującym epitopem antygenu, zaś antygenem jest korzystnie OspA. OspA jest jeszcze korzystniej produktem rekombinanta, takiego jak E. coli. OspA jest korzystnie lipidowana, zaś jeszcze korzystniej OspA jest rekombinowaną OspA, która jest lipidowana. Antygen Borrelia burgdorferi, np. OspA można otrzymać dowolną przydatną metodą, taką jak izolowanie z hodowli Borrelia burgdorferi, albo, korzystnie rekombinowaną lipidowaną OspA można otrzymać sposobami ujawnionymi w patentach USA nr 5,582,990 i 5,523,089 oraz W093/08299 załączonymi tu jako odnośniki. W odniesieniu do antygenów Borrelia burgdorferi i sposobów ich wytwarzania, przydatnych przy przeprowadzaniu niniejszego wynalazku, powołuje się jako odnośniki dokumenty cytowane w sekcji „Zgłoszenia pokrewne”.

Kompozycje według wynalazku takich jak kompozycje odpornościowe, antygenowe albo szczepionki albo kompozycje terapeutyczne, w tym kompozycje poliwalentne, „koktajle” albo złożone, mogą być podawane drogą pozajelitową (śródskórną, domięśniową albo podskórną). Takie podawanie umożliwia układową reakcję odpornościową.

Ogólniej, antygenowe, odpornościowe albo będące szczepionkami kompozycje immunogenne antygenu Borrelia burgdorferi według wynalazku można wytworzyć według standardowych technik znanych specjalistom w dziedzinie farmacji i weterynarii. Kompozycje takie można podawać w dawkach i dowolną techniką znaną specjalistom w dziedzinie farmacji i weterynarii, biorąc pod uwagę takie czynniki jak wiek, płeć, ciężar ciała, gatunek i stan konkretnego pacjenta oraz drogę podawania. Antygen Borrelia burgdorferi można podawać sam, albo równocześnie albo w kolejności

PL 190 989 B1 z „innym antygenem albo „inną kompozycją odpornościową , antygenową albo szczepionką , otrzymując „koktajl albo kompozycję złożoną według wynalazku, i sposoby wykorzystujące je. „Inne antygeny albo „inne kompozycje odpornościowe, antygenowe albo szczepionki mogą być interesującym epitopem albo epitopami takich antygenów albo kompozycjami obejmującymi interesujący epitop albo epitopy.

Takie „inne kompozycje mogą obejmować izolowane i/lub oczyszczone antygeny od dowolnego patogenu zwierzęcego, takie jak antygen patogenu zwierzęcia domowego, przykładowo, antygen patogenu psiego, kociego, końskiego albo innego, np. jeden z grupy obejmującej antygen albo antygeny patogenu psiego, takiego jak wścieklizna, np. glikoproteina G wścieklizny, antygen wirusa psiej zarazy, np. glikoproteiny CDV HA i/lub F, antygen psiego adenowirusa typu 2, antygen psiego koronawirusa, antygen wirusa psiej paragrypy, antygen psiego parvowirusa, antygen Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae Bacterin, dowolna kombinacja tych antygenów, albo antygen albo antygeny kociego patogenu takiego jak antygeny kociego wirusa białaczki, antygeny kociego wirusa niedoboru odporności, wścieklizny, antygeny kociego wirusa herpes, albo ich dowolna kombinacja, albo antygeny końskiego patogenu, np. wirusa końskiej grypy i/lub końskiego wirusa herpes i/lub antygen wścieklizny. Te „inne antygeny mogą pochodzić z ekspresji takich antygenów przez rekombinację, np. układu wirusa ospy albo innego układu wektora in vitro, albo „inne” kompozycje mogą obejmować rekombinanta, np. wirusa albo wirusy ospy, które wyrażają antygeny in vivo.

Sposoby wytwarzania wektora albo rekombinanta do ekspresji OspA albo interesującego epitopu, albo „innego antygenu albo jego interesującego epitopu do zastosowania według wynalazku mogą pochodzić albo być analogiczne do sposobów opisanych w patentach USA nr 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, Paoletti, „Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, PNAS USA 93:11349-11353, October 1995, Moss, „Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination and safety PNAS USA

93:11341-11348, October 1996, Smith et al., U.S. Patent No. 4,745,051 (recombinant baculovirus),

Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 5 39, „Baculovirus Expression Protocols (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., „Production of Huma Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector, Molecular and Cellular Biology, Dec., 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165, Pennock et al., „Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, No. 3, p. 399-406, EPA 0 370 573, U.S. application Serial No. 920,197, filed October 16, 1986, EP Patent publication No. 265785, U.S. Patent No. 4,769,331 (recombinant herpesvirus), Roizman „The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors, PNAS USA 93:11307 - 11312, October 1996, Andreansky et al., „The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors PNAS USA 93:11313-11318, October 1996, Robertson et al. „Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes PNAS USA 93:11334-11340, October 1996, Frolov et al. „Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications, PNAS USA 93:11371-11377, October 1996, Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991, U.S. Patent Nos. 5,591,439, 5,552,143, Grunhaus et al., 1992, Adenovirus as cloning vectors, Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 429-434, PCT WO91/11525, Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259:1745-49, 1993 and McClements et al., „Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease, PNAS USA 93:11414-11420, October 1996, and U.S. Patents Nos 5,591,639, 5,589,465, and 5,580,859 relating to DNA expression vectors, Interalia.

Ponownie, składniki i sposoby podawania (podawanie kolejne albo równoczesne), jak również dawkowanie można określić biorąc pod uwagę takie czynniki jak wiek, płeć, ciężar ciała, gatunek i stan konkretnego pacjenta oraz drogę podawania. W tym względzie, można wspomnieć patenty USA nr 5,503,834, 5,529,780, 5,482,713 i 5,494,807, obejmujące ujawnienie antygenów patogenów psich, kocich i końskich, rekombinacyjnej ekspresji tych antygenów i kompozycji zawierających te rekombinanty, jak również równolegle rozpatrywane zgłoszenie nr 08/4,13,118, zgłoszone 29 marca, 1995, dotyczące sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych antygenów końskiego wirusa herpes, oraz ich rekombinantów i ich zastosowania, zgłoszenie nr 08/224,657, zgłoszone 6 kwietnia, 1994 i 08/416,616, zgłoszone 5 kwietnia, 1995, dotyczące rekombinantów wirusa ospy-wirusa psiej zarazy (CDV) i kompozycji i sposobów wykorzystania tych rekombinantów, zgłoszenie nr 08/675,556, zgłoPL 190 989 B1 szone 3 lipca, 1996, dotyczące kaset ekspresji, promotorów i rekombinantów, w tym rekombinantów psiego adenowirusa do zastosowań weterynaryjnych, zgłoszenie nr 08/746,668, zgłoszone 14 listopada, 1996, które obejmuje rekombinanty wyrażające interesujące epitopy kociego wirusa niedoboru odporności i zgłoszenie nr 08/486,969 zgłoszone 7 czerwca, 1995 dotyczące kompozycji rekombinantów wirus ospy-wścieklizny w tym kompozycji złożonych i ich zastosowania. Każdy z tych patentów i zgłoszeń jest włączone jako odnośnik, zwłaszcza jeżeli rekombinant, jego produkt ekspresji i kodują cy kwas nukleinowy ujawniony w tych zgłoszeniach moż e być zastosowany w kompozycji „koktajlu, poliwalentnej albo złożonej albo sposobach podawania albo ich rekombinantach według wynalazku.

Przykładowo, produktem jest Canine Distemper-Adenovirus Type2-Coronavirus-ParainfluenzaParvovirusXL Modified Live Wirus (nr produktu 1491.21). Byłoby korzystne włączenie do tego produktu w pojedynczej jednostce opakowania antygenu Borrelia burgdorferi, np. OspA, tj. jako kompozycja złożona, albo podanie odpowiedniemu biorcy, np. psu, w trakcie pojedynczej wizyty u weterynarza zarówno OACPiPXL, jak i antygenu Borrelia burgdorferi.

Przykłady kompozycji według wynalazku obejmują preparaty ciekłe do podawania np. doustnie, donosowo, doodbytniczo, dopochwowo, przezustnie, dożołądkowo itp., jak np. zawiesiny, syropy albo eliksiry, oraz preparaty do podawania pozajelitowego, podskórnego, śródskórnego, domięśniowego albo dożylnego (np. podawanie we wstrzyknięciu) takie jak sterylne zawiesiny albo emulsje. W takich kompozycjach antygeny mogą być domieszane do przydatnego nośnika, rozcieńczalnika albo zaróbki takiej jak sterylna woda, sól fizjologiczna, glukoza itp. Kompozycje mogą być również liofilizowane. Kompozycje mogą również zawierać substancje pomocnicze, takie jak czynniki zwilżające albo emulgujące, czynniki buforujące pH, adiuwanty, dodatki żelujące albo zwiększające lepkość, konserwanty, środki zapachowe i barwiące itp., zależnie od drogi podawania i pożądanego preparatu. W celu wytworzenia odpowiedniego preparatu można odwołać się do standardowego tekstu jakim jest „Remington's Pharmaceutical Science wyd. 17-te, 1985, załączonego tu jako odnośnik, bez niepotrzebnego eksperymentowania. Odpowiednie dawkowanie może również opierać się na poniższych przykładach.

Typowe dawkowanie antygenu Borrelia burgdorferi dla psów wynosi od 5 do 25 μg/ml, np. 13 μg/ml OspA, zaś typowe dawkowanie antygenu Borrelia burgdorferi dla koni wynosi 15 do 150 μg/dawkę, np. 100 μg/dawkę samej OspA, 30 μg/dawkę samej OspA albo 30 μg/dawkę OspA w kombinacji z innym antygenem takim jak antygen wścieklizny (Imrab jest dostępną w handlu szczepionką przeciwko wściekliźnie, z którą można łączyć antygen Borrelia burgdorferi).

Jak wspomniano wyżej, kompozycje odpornościowe, antygenowe albo szczepionki zwykle mogą zawierać adiuwant oraz ilość antygenu (antygenów) zdolną wywołać pożądaną reakcję odpornościową. W pewnych zastosowaniach, alum (fosforan glinu albo wodorotlenek glinu) jest typowym adiuwantem. Saponina i jej oczyszczony składnik, Quil A, kompletny adiuwant Freund'a i inne adiuwany stosowane w weterynarii.

Jednakże, lipidowana rekombinowana OspA może wywołać ochronną reakcję odpornościową bez konieczności dodawania adiuwantu. Można również zastosować chemicznie zdefiniowane preparaty, takie jak muramylodipeptyd, monofosforylo-białko A, koniugaty fosfolipidowe, takie jak opisane przez Goodman-Snitkoff i in., J. Immunol. 147:410-415 (1991) i załączone tu jako odnośnik, zamykanie białka w proteoliposomach, jak to opisano w Miller i in., J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992) i załączone tu jako odnośnik oraz zamykanie białka w pęcherzykach lipidowych takich jak pęcherzyki Novasome™ (Micro Vascular Systems, Inc., Nashua, NH).

Kompozycje według wynalazku można pakować w postaci pojedynczych dawek do immunizacji przez podanie pozajelitowe (tj. domięśniowe, śródskórne albo podskórne), albo podawania doustnego np. doustnego, dożołądkowego, śluzówkowego, w tym doustnego, doodbytniczego, dopochwowego itp. Ponownie, skuteczna dawka i droga podania określana jest przez rodzaj kompozycji, i takie czynniki jak wiek, płeć, ciężar ciała, gatunek i stan konkretnego pacjenta, jak również LD50 i inne znane procedury przesiewowe, które nie wymagają niepotrzebnego eksperymentowania. Dawki ogólnie wahają się od kilku do kilkuset mikrogramów, np. 5 do 500 μg każdego z antygenów. Innymi przydatnymi nośnikami i rozpuszczalnikami może być woda albo buforowany roztwór soli, z dodatkiem konserwantów albo bez. Antygeny mogą być liofilizowane do odtworzenia w momencie podania albo mogą być w roztworze.

Nośnikiem mogą być również polimerowe układy do opóźnionego uwalniania. Syntetyczne polimery są szczególnie przydatne do formułowania kompozycji do kontrolowanego uwalniania. Wczesnym tego przykładem była polimeryzacja metakrylanu metylu w postaci sfer o średnicy poniżej 1 mikrona

PL 190 989 B1 z wytworzeniem tzw. nanocząsteczek, opisane przez Kreuter J., Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology, wyd. Donbrow M., CRC Press, str. 125-148.

Mikrokapsułkowanie zastosowano do wstrzykiwania leków mikrokapsułkowanych osiągając kontrolowane uwalnianie. Na wybór konkretnego polimeru do mikrokapsułkowania składa się wiele czynników. Powtarzalność syntezy polimeru i procesu mikrokapsułkowania, koszt materiałów i procesu mikrokapsułkowania, profil toksykologiczny, konieczność zmiennej kinetyki uwalniania oraz zgodność fizykochemiczna polimeru i antygenów stanowią czynniki, które należy uwzględnić. Przykładami przydatnych polimerów są poliwęglany, poliestry, poliuretany, poliortoestry i poliamidy, w szczególności te, które ulegają biodegradacji.

Częstym nośnikiem dla leków, a ostatnio również dla antygenów jest poli(d,1-laktyd-ko-glikolid) (PLGA). Jest to poliester ulegający biodegradacji o długiej tradycji stosowania w medycynie we wchłanialnych szwach, płytkach kostnych i innych czasowych protezach, w których nie wykazał żadnej toksyczności. Wiele leków, w tym peptydów i antygenów formułowano w mikrokapsułkach PLGA. Zgromadzono znaczne dane dotyczące adaptacji PLGA do kontrolowanego uwalniania antygenu, przykładowo, jako opisano w Elridge i in., Current Topics in Microbiology and Immunology, 1989, 146:59-66. Zamykanie antygenów w mikrosferach PLGA o średnicy od 1 do 10 μm wykazało znaczny efekt adiuwantowy po podaniu doustnym. Proces mikrokapsułkowania w PLGA wykorzystuje rozdział faz emulsji wodno-olejowej. Interesujące związki wytwarza się w roztworze wodnym, zaś PLGA rozpuszcza się w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym takim jak chlorek metylenu i octan etylu. Te dwa niemieszające się roztwory emulguje się przez mieszanie z dużą prędkością. Do polimeru dodaje się substancji nierozpuszczającej go, co powoduje precypitację polimeru wokół kropelek wody z wytworzeniem embrionalnych mikrokapsułek. Mikrokapsułki zbiera się i stabilizuje jednym z wielu czynników (polialkohol winylowy (PVA), żelatyna, alginiany, poliwinylopirolidon (PVP), metyloceluloza), zaś rozpuszczalnik usuwa się przez suszenie pod próżnią albo ekstrakcję rozpuszczalnikiem.

Mikrokapsułkowanie, układu opóźnionego uwalniania i techniki kapsułkowania, przykładowo, jak opisane wyżej, mogą znaleźć zastosowanie, gdy pożądana jest prezentacja układowi odpornościowemu jednego albo wielu antygenów w kompozycji złożonej.

Tak więc, przewiduje się ciekłe kompozycje do podawania przez wstrzyknięcie, jak również stałe, w tym ciecze zawierające ciała stałe, ciecze i żele (w tym kapsułki żelowe).

Dalej, kompozycje według wynalazku można zastosować bezpośrednio do pobudzania reakcji odpornościowej u zwierząt. Taka reakcja odpornościowa może być reakcją przeciwciał, a z tych przeciwciał, dobrze znanymi sposobami, można wytworzyć przeciwciała monoklonalne, zaś te przeciwciała monoklonalne można zastosować w dobrze znanych testach wiązania przez przeciwciała, zestawach diagnostycznych albo testach do określenia obecności albo braku obecności konkretnego antygenu albo antygenów. Te przeciwciała monoklonalne można również zastosować w chromatografii immunoadsorpcyjnej w celu odzyskania albo wyizolowania antygenu albo antygenów.

Sposoby wytwarzania przeciwciał monoklonalnych i zastosowania przeciwciał monoklonalnych są dobrze znane specjalistom. Można je zastosować w sposobach diagnostycznych, zestawach i testach, jak również w celu pozyskiwania materiałów przez chromatografię immunoadsorpcyjną albo immunoprecypitację.

Przeciwciała monoklonalne są immunoglobulinami wytwarzanymi przez komórki hybrydoma. Przeciwciało monoklonalne reaguje z pojedynczą determinantą antygenową i zapewnia większą swoistość niż konwencjonalne przeciwciało pochodzenia surowiczego. Ponadto, badanie przesiewowe wielkiej liczby przeciwciał monoklonalnych umożliwia wybranie konkretnego przeciwciała o pożądanej swoistości, zachłanności wiązania i izotypie. Linie komórkowe hybrydoma zapewniają stałe i niedrogie źródło chemicznie identycznych przeciwciał, zaś preparaty takich przeciwciał można łatwo standaryzować. Sposoby wytwarzania przeciwciał monoklonalnych są dobrze znane specjalistom, np. Koprowski i in., patent USA nr 4,196,265 udzielony 1 kwietnia, 1989, załączone tu jako odnośnik.

Znane jest zastosowanie przeciwciał monoklonalnych. Jednym z takich zastosowań są sposoby diagnostyczne, np. David i Greene, Patent USA nr 4,376,110, udzielony 8 marca, 1983, załączone tu jako odnośnik. Przeciwciała monoklonalne stosuje się również w celu odzyskiwania materiału przez chromatografię immunoadsorpcyjną, np. Milstein, 1980 Scientific American 243:66, 70, załączone tu jako odnośnik.

Tak więc, kompozycje według wynalazku mają kilka opisanych wyżej zastosowań. Dla wykonań wynalazku istnieją inne przydatne zastosowania.

PL 190 989 B1

Na podstawie poniższych przykładów, przedstawionych w celu zilustrowania, możliwe jest lepsze zrozumienie niniejszego wynalazku.

Przykłady

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie rekombinowanej OspA

Rekombinowaną OspA wytworzono jak to opisano w patentach USA nr 5,523,089 i 5,582,990, W093/08299, PCT/US92/08697 i Erdile i in., 1993. Pokrótce:

Klonowany gen ospA Borrelia burgdorferi szczepu B31 (jak opisano w W093/04411) (N-końcowy region: Id. Sekw. nr 1, c-końcowy region: Id. Sekw. nr 2. Pozostałość sekwencji pokazano w WO90/04411) zastosowano jako matrycę (pTRH44, Howe i in., 1986, Infect. Immun. 54:207-212, „Howe i in., 1986) wraz ze specjalnie zaprojektowanymi starterami oligonukleotydowymi (PET-IN [CO1] (Id. Sekw. nr 3) i PET-273C [CO3] (Id. Sekw. nr 4)) zastosowano w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu amplifikacji całości genu ospA typu dzikiego, jak pokazano na fig. 1.

Podobnie, klonowany gen ospA Borrelia burgdorferi szczepu ACA1 i Ip90 (jak opisane w Johnsson i in., 1992, Infect. Immun. 60:1845-1853 - region końca N ACA1 i Ip90: Id. Sekw. nr 1,, region końca C ACA1: Id. Sekw. nr 5,, region końca C Ip90: Id. Sekw. nr 6) zastosowano w reakcji PCR z parą starterów oligonukleotydowych (a) OspN2 (Id. Sekw. nr 7) i pK4 (Id. Sekw. nr 9), odpowiednio dla końców N i C, w celu wytworzenia odpowiednio amplifikowanych fragmentów, jak pokazano na fig. 1.

Podstawowe sposoby amplifikowania pożądanej docelowej sekwencji kwasu nukleinowego z użyciem starterów oligonukleotydowych są ogólnie znane i opisane w patencie USA nr 4,683,202 i 4,800,159. Odnośniki do tych patentów w celu opisania wykorzystywanych technik.

Powstałe fragmenty klonowano w miejsca Ndel i BamHI wektora plazmidowego pET9, umieszczając gen ospA pod kontrolą promotora T7 i wydajnych sygnałów zapoczątkowania translacji z bakteriofaga T7, jak pokazano na fig. 2. Plazmidy pET9 i pLysS, bakteryjni gospodarze do klonowania, pożywki hodowlane i sposoby zastosowane do kierowania ekspresją klonowanych genów przez polimerazę T7 opisano uprzednio w patencie USA nr 4,952,496. O ile układ promotora T7 jest korzystnym układem ekspresyjnym według wynalazku, ekspresję genu ospA pełnej długości można uzyskać z wykorzystaniem innych układów ekspresyjnych zgodnych z organizmem gospodarza.

Zastosowano wektor ekspresyjny pET9, ponieważ posiada on gen kan jako znacznik umożliwiający selekcję zamiast genu bla. W konsekwencji, podczas hodowania komórek nie stosuje się ampicyliny, a stąd nie istnieje możliwość wytworzenia immunogennego koniugatu ampicyloil/OspA białka docelowego. Uważa się, że takie koniugaty są główną determinantą antygenową alergii penicylinowej i mogą komplikować badania immunologiczne.

Powstałe plazmidy zawierające geny ospA ze szczepów Borrelia burgdorferi B31, ACA1 i Ip90 oznaczono, odpowiednio, pOA1, pOA9 i pOA10. Plazmid pOA1 jest niemal identyczny z plazmidem pET9-preOspA, opisanym przez Dunn i in., 1990, Protein Expression and Purification 1:159-168, z takim wyjątkiem, że oligonukleotydy zastosowane do reakcji PGR były inne w obu przypadkach. Przewidywana mapa restrykcyjna dla plazmidu pOA1 pokazana jest na fig. 3, zaś fig. 4 zawiera wyniki różnych trawień restrykcyjnych plazmidu pOA1, pokazujące, że wszystkie przewidywane miejsca są obecne.

Do wytwarzania białka, plazmidy pOA1, pOA9 i pOA10 transformowano do ekspresyjnego szczepu E. coli, korzystnie szczep E. coli jest szczepem ekspresyjnym T7 E. coli, jak opisany w patencie USA nr 4,952,496. Konkretnie, szczep może być szczepem ekspresyjnym BL21 (DE3)(pLysS) E. coli jak opisany wyżej, albo szczepem E. coli HMS174 (DE3)(pLysS). Transformowanego gospodarza hodowano i indukowano białko przy użyciu izopropylo-e-D-tiogalaktozydu (IPTG). Przebieg czasowy indukcji OspA z plazmidu pOA1, po dodaniu IPTG, pokazano na fig. 7A. Identyczne wyniki jak z plazmidem pOA1 uzyskano z pOA9 i pOA10. Syntezę białka OspA z plazmidu pOA1 przerwano około godziny po indukcji, zakładając pewną toksyczność białka wobec E. coli. Mimo to, produkcja białka była na dopuszczalnym poziomie około 10 mg/l hodowli komórkowej.

Oprócz plazmidów pOA1, pOA9 i pOA10 oraz ekspresji lipoproteiny OspA w E. coli z użyciem promotora T7, skonstruowano dalsze plazmidy zawierające gen ospA B31, ACA1 i Ip90 pod kontrolą różnych promotorów i uzyskano ekspresję lipoproteiny. W tym celu, wytworzono plazmidy pOA5 i pOA6 przez klonowanie fragmentu amplifikowanego przez PCR fragmentu ospA ze szczepu B31 w miejsca Ncol i BamHI wektorów ekspresyjnych pCMB1 i pCMB2, zaś plazmidy pOA7 i pOA8 wytworzono przez klonowanie amplifikowanego przez PCR fragmentu ospA ze szczepu ACA1 (pOA7) i Ip90 (pOA8) w miejsca NcoI i BamHI wektora ekspresyjnego pCMB1 (patrz, fig. 6 dla pOA5, pOA7 i pOA8).

PL 190 989 B1

Jak widać z fig. 5, klonowane geny ospA szczepów B31, ACA1 i Ip90 Borrelia burgdorferi amplifikowano przez PCR z użyciem par starterów oligonukleotydowych, odpowiednio, (a) PK3 (Id. Sekw. nr 10) i CO3 (Id. Sekw. nr 3), (b) PK3 (Id. Sekw. nr 10) i BZ1 (Id. Sekw. nr 8), oraz (c) PK3 (Id. Sekw. nr 10) i PK4 (Id. Sekw. nr 9), na końcach N i C odpowiednich genów z wytworzeniem odpowiednich fragmentów amplifikowanych.

Plazmidy pCMB1 i pCMB2 skonstruowano przez trawienie plazmidu pTrc99a (Pharmacia nr kat. 27-4897-01), izolowanie powstałych fragmentów (fig. 9). Plazmid pTrc99a, wielkości 4197 bp, zawiera silny promotor sąsiadujący z wielokrotnym miejscem klonowania, za którym leży silny sygnał przerwania transkrypcji (rrnB). Ekspresja genu docelowego wykorzystuje polimerazę RNA komórki gospodarza, umożliwiając jej zastosowanie w wielu szczepach E. coli. Ekspresja jest ściśle kontrolowana przez gen supresora laktozy (1acIq) włączony do wektora. Białko represora laktozy uniemożliwia transkrypcję genu docelowego pod nieobecność induktora IPTG. Gen oporności na kanamycynę jest liniowym, dwuniciowym fragmentem DNA wielkości 1282 bp, zawierającym gen z transpozonu Tn903 otoczony miejscami restrykcyjnymi i kodujący enzym, 3'-fosfotransferazę aminoglikozydową, który zapewnia odporność na kanamycynę i neomycynę.

pCMB1, wielkości 5,5 kb, zawiera gen oporności na kanamycynę, położony w taki sposób, że jego transkrypcja zachodzi w tym samym kierunku co rozpoczynająca się z promotora Trc, podczas gdy pCMB2 zawiera gen oporności na kanamycynę w odwrotnym położeniu, w taki sposób, że transkrypcja genu oporności i interesującego genu pod kontrolą promotora Trc powoduje powstanie zbieżnych transkryptów. Trawienie enzymami restrykcyjnymi pCMB1 i pCMB2 z użyciem Smal, Hindlll i BamHI+NcoI wykazało fragmenty dokładnie tej samej wielkości co przewidywane.

Plazmidy pOA5 i pOA6 transformowano do szczepu ekspresyjnego E. coli albo innego odpowiedniego organizmu, korzystnie kompetentnych komórek DH5a. Transformowanych gospodarzy hodowano i indukowano białko przy użyciu IPTG. Przebieg czasowy indukcji pOA5 (fig. 7B) był podobny do otrzymanego z pOA1 (fig. 7A), podczas gdy poziomy OspA wytworzonej przez pOA6 (fig. 7C) były kilkakrotnie niższe. Identyczne wyniki jak w przypadku pOA5 otrzymano stosując pOA7 i pOA8.

Etapy związane z wytwarzaniem i oczyszczaniem rekombinowanej OspA pełnej długości przedstawiono schematycznie na fig. 8A do 8C. Konkretne warunki procesów są podane w poniższych przykładach.

Po etapie hodowli komórek i indukcji białka (Fig. 8A), komórki poddano lizie przez zamrażanieodmrażanie. Lizat traktowano detergentem, który jest selektywny do rozpuszczenia białka OspA, preferencyjnie względem innych białek bakteryjnych występujących w lizacie. Stwierdzono, że Triton X-114 wybiórczo rozpuszcza białko wielkości 31 kDa, które okazało się być OspA, w teście immunoblot.

Wynalazek nie jest ograniczony do wykorzystania Triton X-114, ale obejmuje oczywiście inne substancje wykazujące podobną wybiórczą rozpuszczalność dla OspA, jak również właściwości rozdziału fazy w umiarkowanych warunkach określonych poniżej.

Po dodaniu wybiórczego detergentu, mieszaninę podgrzewa się do temperatury około 35°C do 40°C, przy czym roztwór staje się mętny, ponieważ zachodzi rozdział, faz.

Wirowanie mętnej mieszaniny powoduje rozdział mieszaniny na trzy fazy, fazę detergentową zawierającą 50% albo więcej białka OspA i małą ilość (około 5% wagowych) białek bakteryjnych, fazę wodną zawierającą resztę białek bakteryjnych oraz stały osad resztek komórkowych. Faza detergentowa jest oddzielana od fazy wodnej i osadu.

Przez etapy traktowania detergentem wybiórczym dla OspA, a następnie oddzieleniem fazy detergentowej, osiąga się zasadniczo całkowite oddzielenie OspA od białek bakteryjnych. Pozostaje końcowe oczyszczenie OspA z resztek białek bakteryjnych występujących w fazie detergentowej.

Końcowe oczyszczenie białka uzyskuje się na kolumnie chromatograficznej, wybiórczo wiążącej białka bakteryjne z wyjątkiem OspA, konkretnie zawierającej DEAE-Sephacell, DEAE-Sepharose albo inne zamienne złoże chromatograficzne. Fazę detergentową umieszcza się w kolumnie i zbiera się przesącz, który zawiera całe oczyszczone białko OspA. Frakcja związana zawiera wszystkie białka bakteryjne w fazie detergentowej. Po dalszym oczyszczeniu przy użyciu S-Sepharose albo równoważnej kolumny chromatograficznej, oprócz oczyszczenia z zanieczyszczających białek, frakcja przesączu jest zasadniczo wolna od lipopolisacharydu (LPS), na co wskazuje brak pirogenności, co określono testem z lizatem ameby Limulus. Wysoko oczyszczony roztwór OspA można liofilizować albo przetwarzać w inny sposób .

Konkretniej, plazmid pOA1 wytworzono jak to opisano wyżej i zastosowano do transformowania szczepów E. coli BL21(DE3) (pLysS) (pOA1) i HMS174(DE3) (pLysS) (pOA1). Transformowanymi E. coli

PL 190 989 B1 zaszczepiono pożywkę LB z 25 μg/ml siarczanu kanamycyny i 25 μg/ml chloramfenikolu w ilości 12 ml hodowli na litr. Hodowlę prowadzono przez noc w wytrząsanych butelkach w temperaturze około 37°C.

Następnego dnia 10 ml całonocnej hodowli przeniesiono do 1 litra LB zawierającej 25 μg/ml siarczanu kanamycyny i prowadzono hodowlę w wytrząsanych butelkach w 37°C do poziomu 0,6 OD (mimo iż można prowadzić hodowlę do OD = 1,5), przez około 3 godziny.

Do pożywki hodowlanej dodano izopropylotiogalaktozyd (IPTG) w stężeniu końcowym 0,5 mM i hodowano dalej przez dalsze 2 godziny w około 37°C. Pod koniec tego okresu, pożywkę hodowlaną schłodzono do około 4°C i odwirowano przy 10000 xg przez 10 minut. Nadsącz usunięto, zaś osad komórkowy zawieszono w 1/10 objętości PBS. Zawiesinę komórek zamrożono w ciekłym azocie i jeżeli to konieczne, można ją przechowywać przez czas nieograniczony w -70°C.

Po zamrożeniu zawiesiny komórkowej, komórki rozmrożono do temperatury pokojowej (około 20-25°C) co spowodowało rozpad komórek. Do rozmrożonego materiału dodano DNAzę 1 w ilości 1 μg/ml i inkubowano mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, co spowodowało zmniejszenie lepkości materiału.

Inkubowany materiał schłodzono na lodzie do temperatury poniżej 10°C i dodano Triton X-114 w postaci roztworu 10% do stężenia końcowego 0,3% do 1%. Mieszaninę trzymano na lodzie przez 20 minut. Schłodzoną mieszaninę podgrzano do około 37°C i utrzymywano w tej temperaturze przez 10 minut.

Roztwór stał się mętny, ponieważ nastąpił rozdział faz. Mętną mieszaninę odwirowano przy około 20°C przez 10 minut przy 12000 xg, co spowodowało rozdział mieszaniny na dolną fazę detergentową i górną fazę wodną oraz osad. Fazę detergentową oddzielono od pozostałych dwóch faz i schłodzono do 4°C, bez poruszania osadu. Do schłodzonej fazy detergentowej dodano bufor A, a konkretnie 50 mM Tris, pH 7,5, 2 mM EDTA i 10 mM NaCl, w ilości stanowiącej 1/3 początkowej objętości. Powstały roztwór można zamrażać i przechowywać do późniejszej obróbki, jak to opisano niżej albo można przetwarzać od razu.

Kolumnę DEAE-Sepharose CL-6B przygotowano w objętości 1 ml/10 ml fazy detergentowej i płukano 2 objętościami Buforu C, a konkretnie 50 mM Tris, pH 7,5, 2 mM EDTA, 1 mM NaCl, 0,3% Triton X-100, a następnie 4 objętościami buforu B, czyli 50 mM Tris, pH 7,5, 2 mM EDTA, 0,3% Triton X-100.

Następnie fazę detergentową wprowadzono do kolumny i zbierano przesącz zawierający OspA. Kolumnę przepłukano 1objętością Buforu B i ponownie zebrano przesącz. Połączone przesącze stanowiły wodny roztwór oczyszczonej OspA, który można zamrozić w celu przechowywania.

Kolumnę można oczyścić z białek bakteryjnych przez do ponownego użycia przez przepłukanie jej 2 objętościami buforu C.

Dalsze i końcowe oczyszczanie przesączu z kolumny DEAE-Sepharose przez chromatografię na S-Sepharose Fast Flow. Przesącz z kolumny DEAE-Sepharose zakwaszono do pH 4,3 przez dodanie 0,1 M kwasu cytrynowego. Kolumnę S-Sepharose Fast Flow płukano intensywnie Buforem C zakwaszonym do pH 4,2 kwasem cytrynowym.

Wysoko oczyszczoną OspA eluowano z kolumny stosując bufor C, zakwaszony do pH 5,7 kwasem cytrynowym. Eluat natychmiast doprowadzono do pH 7,5 przez dodanie 2 M zasady Tris.

Wodny roztwór wysoko oczyszczonej OspA otrzymany po obu procedurach chromatograficznych analizowano na żelach barwionych Coomassie i stwierdzono, że zawierały OspA w postaci wysoko oczyszczonej. Czystość produktu wytworzonego w tej ostatniej procedurze chromatograficznej była wyższa niż po poprzedniej procedurze chromatograficznej, wykazując bardzo niski poziom endotoksyny.

Plazmidy pOA5 i pOA6 wytworzono jak to opisano wyżej i zastosowano do transformowania szczepu DH5a E. coli. Powtórzono procedurę ekspresji białka zastosowaną w Przykładzie 1, zaś przebieg czasowy ekspresji lipoproteiny OspA przez pOA5 był identyczny jak obserwowany dla pOA1, podczas gdy ekspresja OspA przez pOA6 była kilkakrotnie niższa niż przez pOA5 (fig. 7B i 7C). Oczyszczanie białka OspA przeprowadzono wyłącznie w komórkach wyrażających pOA5.

Lipoproteina OspA B31 wytworzona przez układ ekspresyjny Trc została oczyszczona w oparciu o identyczną procedurę jak opisana w Przykładzie 1, z takim wyjątkiem, że do osadu komórek po zebraniu dodano 0,1 mg/ml lizozymu, zaś komórki zawieszono na 30 minut w temperaturze pokojowej przez zamrożeniem.

Przesącz z kolumny DEAE-Sepharose zawierał lipoproteinę OspA w postaci wysoko oczyszczonej.

Procedury wytwarzania plazmidu pOA1 (promotor pET) i pO-A5 (promotor TRC) powtórzono, jak to opisano wyżej, z klonowanym genem OspA azjatyckiego szczepu (Ip90) Borrelia burgdorferi,

PL 190 989 B1 tworząc plazmidy pOA8 (promotor Tac) i pOA10 (promotor pET) zawierające gen. Przeprowadzono trawienie restrykcyjne, które wykazało obecność wszystkich przewidywanych miejsc restrykcyjnych.

Powtórzono również procedury dla klonowanego genu ospA szczepu europejskiego (ACA1) Borrelia burgdorferi tworząc plazmid pOA7 (promotor Trc) i pOA9 (promotor pET) zawierające gen. Przeprowadzono trawienie restrykcyjne, które wykazało obecność wszystkich przewidywanych miejsc restrykcyjnych.

Wzrost i indukowanie szczepów ekspresyjnych pOA7 i pOA8 przeprowadzono identycznie do szczepu pOA5, zaś hodowlę i indukowanie szczepów ekspresyjnych pOA9 i pOA10 przebiegało identycznie jak dla pOA1.

Lipoproteiny OspA ACA1 i Ip90 otrzymane w wyniku oczyszczono identycznie jak lipoproteinę OspA B31 (pOA1), jak to opisano wyżej. Przesącz przez kolumnę DEAE-Sepharose zawierał lipoproteinę OspA w postaci wysoko oczyszczonej.

Rekombinowaną lipidowaną OspA B31, jak wytworzoną powyżej, zastosowano w formulacjach poniższych przykładów, jednakże, można również zastosować rekombinowaną OspA z innych szczepów, zwłaszcza dla zwierząt domowych w Europie albo Azji.

P r z y k ł a d 2 - Rekombinowaną OspA zapewnia ochronę u psów

Jak donoszą Appel i in., 1993, J. Infect. Dis. 167:651-64, psy są podatne na chorobę z Lyme, jak również istnieje obawa, że możliwe jest przeniesienie choroby z psów na człowieka, co czyni szczepienie psów przeciwko chorobie z Lyme pożądanym (Borrelia burgdorferi).

Początkowe badanie skuteczności: do badania zastosowano 14 psów: 4 szczepiono niską dawką bakteryny (10⁷), 4 szczepiono wysoką dawką bakteryny (10⁹), 4 adiuwantową postacią OspA, zaś 2 pozostawiono jako kontrolę. Do ekspozycji psów zastosowano naturalnie zakażone kleszcze. Wszystkie szczepione psy były całkowicie odporne na zakażenie i wykazywały przeciwciała przeciwko Borrelia burgdorferi w teście ELISA z OspA, jak również przeciwciała hamujące wzrost. Oba zwierzęta kontrolne uległy zakażeniu.

T a b e l a 1

Badanie skuteczności przez ekspozycji psów - Ogólne zasady

Grupa szczepiona	Liczba zwierząt	Szczepienie	Prowokacja	Biopsja	Sekcja (+Biopsja)
1	7	-	D42	D 75,	D144
Kontrole	14			D103,
				D131
A	1	D0, D21	D42	D 75,	D137,
OspA	2			D103,	D139,
2 F31024	8			D131	D137,
	9				D139
B	3	D0, D21	D42	D 74,	D150,
Bakteryna (107)	4			D102,	D150,
10			D130	D145,
15 A 830	11				D145
C	5	D0, D21	D42	D 74,	D145,
Bakteryna (109)	6			D102,	D145,
12			D130	D138,
15 A 850	13				D138

Kleszcze Ixodec daminni zebrano przez przeciąganie białych płacht przez zalesione obszary Westchester County (Nowy York) na tydzień przed ekspozycją. Ponad 60% zebranych na tym terenie kleszczy jest zwykle zakażone.

Kleszcze posegregowano w zależności od płci i stadium rozwojowego i trzymano w 95% wilgotności względnej do momentu użycia. W dniu ekspozycji, 15 dorosłych samic i 7 dorosłych samców umieszczono pod plastikową pokrywką na boku każdego z psów, gdzie pozostały przytwierdzone taśmą plastikową przez tydzień. Czas ten jak stwierdzono wystarcza do przytwierdzenia się kleszczy.

Pobieranie próbek: próbki skóry (4 mm biopsja) pobierano w miesiąc, dwa i trzy miesiące po ekspozycji oraz w momencie sekcji, z miejsc przytwierdzenia się kleszczy i hodowano w celu wyhodowania Borrelia burgdorferi.

PL 190 989 B1

Próbki krwi pobierano co tydzień od dnia 0 do ekspozycji (dzień 42), a następnie co dwa tygodnie do sekcji. Przeciwciała surowicze badano, jak to opisano niżej.

Sekcję przeprowadzono około 100 dni (97 do 109 po ekspozycji). Próbki mięśni i torebki stawowej pobrano z lewej i prawej pęciny, mięśnia przedniego, mięśnia tylnego, łokcia i barku, po czym hodowano w kierunku Borrelia burgdorferi,

Sposób hodowli: próbki rozdrobniono w pożywce BSKII i zaszczepiono probówki zawierające BSKII. Probówki inkubowano w 34°C przez 6 tygodni. Co tydzień, próbki z każdej probówki badano w kierunku obecności Borrelia burgdorferi w mikroskopie z ciemnym polem widzenia. Wszystkie obserwacje Borrelia burgdorferi oceniono jako pozytywne.

Metody serologiczne

RM ELISA: jest to pośredni test ELISA. Antygenem są płukane, sonikowane Borrelia burgdorferi szczepu Bb212 izolowane z kleszczy z Francji. Koniugat stanowią kozie przeciwciała przeciwko psim IgG. Substratem jest tetrametylobenzydyna (TMB). Miana wyrażano jako różnicowa OD przy długości 450 nm i 620 nm w rozcieńczeniu próbki surowicy 1/100.

ELISA Cornell: Test ten przeprowadzono jak w odnośniku Appel i in., wyżej. Jest to pośredni test ELISA. Antygenem są płukane, przepuszczone przez prasę francuską początkowe pasaże Borrelia burgdorferi izolowane z I. dammini zebrane w Westchester County. Koniugat i substraty są takie same jak wyżej. Miano wyrażano w jednostkach kinetycznych ELISA.

Elisa OspA: Ten pośredni test ELISA przeprowadza się stosując rOspA jako antygen. Koniugatem jest fosfataza alkaliczna sprzęgnięta z kozimi przeciwciałami przeciwko psim I-gG. Substrat stanowi substrat fosfatazy 104 Sigma (NA 0200). Miana wyrażone są jako log10 najwyższego rozcieńczenia dającego OD przy 405 nm wyższą niż 0,1.

Test zahamowania wzrostu: Test ten przeprowadza się jak to opisali Sadziene i in., J. Infect. Dis. 1993, 167:165-172). Surowice są rozcieńczane szeregowo i inkubowane z Borrelia burgdorferi przez 62-66 godzin w obecności 2 jednostek hemolitycznych świeżego dopełniacza świnki morskiej. W tym czasie, wskaźnik barwny, czerwień fenolowa, zmienia zabarwienie pożywki BSKII z różowego na żółty w studzienkach gdzie żyją krętki. Badano po trzy studzienki z każdego punktu, pod mikroskopem z ciemnym polem widzenia, w celu potwierdzenia rozcieńczeń, gdzie liczba żywych komórek zmniejszyła się o 90%. Miano wyrażano jako logio tego rozcieńczenia.

Wyniki:

Biopsja skóry: Wyniki przedstawiono w tabeli 2. Stwierdzono, że psy kontrolne były pozytywne we wszystkich próbkach. Nie stwierdzono próbek pozytywnych u żadnego z 12 szczepionych psów.

T a b e l a 2

Grupa szczepiona	Liczba zwierząt	Biopsja (miesiąc po ekspozycji)*
		1	2	3	3,5**
1	7	+	+	+	+
Kontrole	14	+	+	+	+
A	1	-	-	-	-
	2
OspA	8
2 F 31024
	9	-	-	-	-
B	3	-	-	-	-
bakteryna	4	-	-	-	-
(107)	10	-	-	-	-
15 A 830	11	-	-	-	-
C	5
Bakteryna	6
(109)	12
15 A 850	13

* Hodowle badane co tydzień przez 6 tygodni po szczepieniu ** Biopsja przeprowadzona w trakcie ekspozycji.

PL 190 989 B1

Sekcja - Wyniki hodowli:

Wyniki przedstawiono w tabeli 3. U obu psów kontrolnych otrzymano hodowle pozytywne z różnych narządów z obu stron. Częstsze wydają się być hodowle z lewej strony (strona eksponowana) ni ż z prawej.

T a b e l a 3

Szczepionka przeciwko chorobie z Lyme Badanie skuteczności przez prowokację u psów Wyniki hodowli tkanek pobieranych w trakcie sekcji

Grupa szczepiona	Liczba zwierząt	Tkanki
	Mięśnie	Łokieć	Ramię
Lewa	Prawa	Lewa przednia	Lewa tylna	Prawa przednia	Prawa tylna	Lewa	Prawa	Lewa	Prawa
1	7	-	-	+	-	+	-	+	-	+	+
Kontrole	14	-	+	-	-	+	-	+	+	+	+
A OspA	1 2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2 F 31024	8 9	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
B	3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Bakteryna (107)	4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
10	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
15 A 830	11	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
C	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Bakteryna	6	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
(109)	12	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
15 A 850	13	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Serologia:

RM ELISA: Wyniki przedstawiono w tabeli 4.

Po szczepieniu szczepionką OspA albo bakterynami, nie obserwowano istotnego wzrostu miana po jednym wstrzyknięciu z istotnym efektem wzmocnienia po drugim wstrzyknięciu.

Po ekspozycji, miana szczepionych psów pozostały stabilne, zaś miana u psów kontrolnych rosły stopniowo przez okres dwóch miesięcy.

T a b e l a 4

Szczepionka przeciwko chorobie z Lyme Badanie skuteczności przez prowokację u psów Badania serologiczne metodą ELISA RM (miana wyrażane jako O.D. surowicy przy 1/100)

Grupa szczepiona	Liczba zwierząt	Dzień po szczepieniu
0*	8	14	21*	28	35	42**	61	75	89	103	116
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
1	7	0,16	ND	0,09	0,10	0,08	0,07	0,06	0,15	0,16	0,28	ND	0,44
Kontrole	14	0,06	ND	0,07	0,08	0,07	0,15	0,10	0,11	0,14	0,23	ND	0,33
	średnia	0,11		0,08	0,09	0,08	0, 11	0,08	0,13	0,15	0,26		0,39
	odchyl . standard.	0,07		0,01	0,01	0,01	0,06	0,03	0,03	0,01	0,04		0,08
A	1	0,09	ND	0,16	0,20	0,69	0,53	0,50	0,51	0,44	0,47	0,43	0,48
OspA	2	0,09	ND	0,10	0,12	0,44	0,36	0,31	0,27	0,28	0,22	0,37	0,34
2 F 31024	8	0,08	ND	0,11	0,15	0,60	0,58	0,56	0,50	0,45	0,52	0,47	0,47
	9	0,14	ND	0,18	0,16	0,47	0,41	0,44		0,40	0,38	0,40	0,45
	średnia	0,10		0,14	0,16	0,55	0,47	0,45	0,47	0,39	0,40	0,42	0,44
	odchyl. standard.	0,03		0,04	0,03	0,12	0,10	0,11	0,14	0,08	0,13	0,04	0,06

PL 190 989 B1 cd. tabeli 4

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
B	3	0,09	0,12	0,19	0,32	0,58	0,50	0,50	0,53	0,50	0,51	0,60	ND
Bakteryna	4	0,08	0,09	0,21	0,29	0,47	0,40	0,41	0,47	0,44		ND	ND
(107)	10	0,05	0,08	0,13	0,27	0,51	0,56	0,56	0,44	0,42	0,40	0,38	ND
15 A 830	11	0,07	0,09	0,14	0,20	0,42	0,44	0,44	0,38	0,41	0,34	0,37	ND
	średnia	0,07	0,10	0,17	0,27	0,50	0,48	0,48	0,46	0,44	0,42	0,45
	odchyl . standard.	0,02	0,02	0,04	0,05	0,07	0,07	0,07	0,06	0,04	0,09	0,13
C	5	0,10	0,16	0,21	0,27	0,51	0,44	0,52	0,42	0,37	0,45	0,22	ND
Bakteryna	6	0,13	0,16	0,30	0,33	0,55	0,45	0,44	0,36	0,34	0,43	0,43	ND
(109)	12	0,06	0,13	0,19	0,19	0,46	0,41	0,35	0,24	0,21	0,23	0,36	ND
15 A 850	13	0,03	0,09	0,27	0,28	0,60	0,63	0,56	0,45	0,50	0,49	0,10	ND
	średnia	0,08	0,14	0,24	0,27	0,53	0,48	0,47	0,37	0,36	0,40	0,10
	odchyl . standard.	0,04	0,03	0,05	0,06	0,06	0,10	0,09	0,09	0,12	0,12

ELISA Cornell: Wyniki przedstawiono w tabeli 5.

Wzorzec wzrostu przeciwciał jest niemal identyczny z uzyskanym w RM ELISA.

Wszystkie szczepione zwierzęta wykazywały istotny wzrost miana po jednym wstrzyknięciu i efekt wzmocnienia po drugim szczepieniu. Po ekspozycji miana pozostawały stabilne.

Miana u psów kontrolnych rosły stopniowo przez okres trzech miesięcy.

T a b e l a 5

Szczepionka przeciwko chorobie z Lyme Badanie skuteczności przez prowokację u psów Badania serologiczne metodą ELISA RM (miana wyrażane jako O.D. surowicy przy 1/100)

Grupa szczepiona	Liczba zwierząt	Dzień po szczepieniu
0*	8	14	21*	28	35	42**	61	75	89	103	116	131	141
1	7	38	ND	37	41	38	44	43	68	131	218	327	361	437	388
Kontrole	14	25	ND	24	26	30	40	34	62	183	234	295	365	393	386
	średnia	32		31	35	34	42	39	65	157	226	311	363	416	387
	odchyl . standard.	9		9	9	6	3	6	4	37	11	23	3	30	1
A	1	41	ND	236	381	583	585	561	541	51	521	498	471	452	437
OspA	2	68	ND	73	142	525	498	485	353	216	216	204	194	174	ND
2 F 31024	8	37	ND	151	287	567	613	593	569	569	569	542	471	455	428
	9	40	ND	304	325	571	570	566	560	482	482	446	404	360	ND
	średnia	47	45	191	284	562	567	551	506	455	447	423	385	360
	odchyl. standard.	14	25	101	102	25	49	40	103	135	158	151	131	132
B	3	74	74	290	453	616	636	611	503	579	582	566	573	573	580
Bakteryna	4	56	61	221	315	601	583	583	540	539	466	505	487	546	542
(107)	10	6	26	113	292	567	592	556	566	442	504	436	465	420	451
15 A 830	11	15	23	197	409	601	565	547	501	494	426	430	435	442	461
	średnia	38	46	205	367	596	594	574	553	514	495	484	490	495	509
	odchyl. standard.	33	25	73	76	21	30	29	43	59	66	66	59	76	63
C	5	59	95	211	347	636	644	628	577	556	542	501	509	488	474
Bakteryna	6	79	125	355	383	628	625	596	504	485	518	484	510	481	360
(109)	12	11	69	234	292	562	553	521	404	317	325	304	315	283	284
15 A 850	13	13	41	356	471	545	546	531	516	504	484	461	463	444	439
	średnia	41	83	289	373	593	592	569	500	466	467	438	449	424	389
	odchyl. standard.	34	36	7	75	46	50	52	72	103	98	90	92	96	85

* D0, D21: szczepienie ** D42: pierwszy dzień prowokacji

ND: nie wykonane

PL 190 989 B1

ELISA OspA: Wyniki przedstawiono w tabeli 6.

Obie bakteryny wywołują podobny poziom przeciwciał przeciwko OspA.

Szczepionka OspA wywołuje istotnie homologiczną reakcję przeciwciał.

Wzorzec jest podobny do ELISA z pełnym lizatem komórkowym: wzrost po jednym wstrzyknięciu, wzmocnienie po drugim wstrzyknięciu.

Zahamowanie wzrostu: Wyniki przedstawiono w tabeli 6.

Obie bakteryny i szczepionka OspA wywołują wysoki poziom przeciwciał hamujących Borrelia burgdorferi u wszystkich szczepionych psów.

T a b e l a 6

Szczepionka przeciwko chorobie z Lyme Badanie skuteczności przez prowokację u psów OspA metodą ELISA i metodą zahamowania wzrostu (miana wyrażone jako log10 końcowego rozcieńczenia)

Grupa szczepiona	Liczba zwierząt	ELISA	I.C. D42
D0	D21	D42
1 Kontrole	7 14	1,7	1,7	1,7	<0,9
A	1	2,3	2,9	>3,8	3,3
OspA	2	1,7	2,0	3,2	3,0
2 F31024	8	1,7	2,9	3,8	3,5
	9	2,0	2,9	>3,8	2,7
B	3	2	2,9	>3,8	3,6
Bakteryna	4	2	2,3	>3,8	2,6
(107)	10	1,7	2,3	>3,8	2,7
15 A 830	11	1,7	2,9	>3,8	2,7
C Bakteryna	5	2,3	2,6	>3,8	3
(109)	6	2	2,6	3,2	2,9
15 A 850	12	2,3	2,3	3,2	2,7
	13	2	2,9	>3,8	3

Ekspozycja:

Zastosowany sposób ekspozycji ma wiele zalet w stosunku do innych opublikowanych sposobów ekspozycji opartych na podawaniu Borrelia burgdorferi przez igłę.

*Wektor zakażenia i droga naśladują sytuację naturalną.

*Zakażenie można śledzić in vivo przez biopsje skóry.

Ponadto, ekspozycję (kleszcze pochodzące z USA) można uważać za heterologiczną dla dwóch bakteryn (szczep francuski).

Brak objawów klinicznych jest ograniczeniem, ale jak to opisali Appel i in., jest to całkowicie oczekiwane u psów w tym wieku.

W tych warunkach, wyniki, tj. zakażone wszystkie kontrole i żaden z 12 szczepionych psów, wykazują, że szczepionka OspA całkowicie chroni psy przed ekspozycją.

Serologia:

Trzy szczepionki dawały podobne wyniki we wszystkich trzech zastosowanych metodach: wzrost po jednym wstrzyknięciu efekt wzmocnienia po drugim wstrzyknięciu.

Ciekawe, że występował wysoki stopień korelacji pomiędzy dwoma zastosowanymi ELISA z użyciem lizatów (RM i Cornell ELISA) mimo różnic szczepu zastosowanego do otrzymania antygenu i sposobu wyrażenia wyników (fig. 3) (r² = 0,86, F = 935, α = 0,001).

Istotne jest również, że przeciwciała wywołane przez szczepienie:

* reagują silnie z OspA, głównym białkiem błony zewnętrznej Borrelia burgdorferi, * silnie hamują wzrost Borrelia burgdorferi.

Wnioski

Bakteryny zawierające niską dawkę (10⁷) albo wysoką dawkę (10⁹) zabitych komórek Borrelia burgdorferi całkowicie chronią psy eksponowane naturalną drogą (ekspozycja na kleszcze) .

Ten sam wynik otrzymano z adiuwantowaną szczepionką O-OspA.

PL 190 989 B1

Wszystkie szczepionki wywoływały istotny i podobny wzrost miana przeciwciał, które rozpoznawały lipoproteinę OspA i hamowały wzrost Borrelia burgdorferi.

Badanie czasu trwania odporności:

psy rasy Beagle podzielono na dwie grupy. Pierwsza grupa (20 psów) otrzymała dwie dawki monowalentnej szczepionki SC (10 μg/dawkę rekombinowanej OspA B31, jak wytworzona w przykładzie 1) w odstępach 3-4 tygodniowych. Druga grupa pozostała nieleczona (13 psów). Wszystkie psy eksponowano na kleszcze 5-6 miesięcy po drugim szczepieniu. Poziom przeciwciał określano w regularnych odstępach czasu przez ELISA. Skuteczność szczepionki oceniano przez ponowną izolację krętków w miesiąc i dwa miesiące po ekspozycji. Psy monitorowano również pod kątem objawów klinicznych wskazujących na psią chorobę z Lyme (LD).

Podsumowanie:

Bezpieczeństwo: nie obserwowano miejscowych ani ogólnych reakcji po wstrzyknięciu szczepionki.

GRUPA	#PSY	SEROKONWERSJA POSZCZEPIENNA	WYNIKI PO PROWOKACJI
Objawy kliniczne	Biopsja skóry w 2 mies./izolacja krętków
Ly	20	19/20=95%	1/20=5%	2/20=10%
Kontrole	13	0/13=0%	5/13=39%	13/13=100%

Monowalentna szczepionka Ly OspA *wywołuje ochronę przeciwko psiej LD, co oceniono za równo izolacją krętków jak i objawami klinicznymi, *reakcja ochronna jest skuteczna przynajmniej 5 miesięcy po szczepieniu, *chroni przed zakażeniem krętkami (90%) i objawami klinicznymi po naturalnej ekspozycji.

Zwierzęta:

szczenięta rasy Beagle (płci obojga „w wieku 9-10 tygodni” negatywne pod względem szczepienia przeciwko chorobie z Lyme i Leptospira) otrzymano z Ridglan Farms (Mount Horeb, WI). Szczenięta podzielono losowo na dwie grupy i szczepiono.

GRUPA	PIES	DROGA PODANIA	PROTOKÓŁ TERAPII
1	10	SC	Ly,, 4 tydzień przerwa
2	10	SC	Ly,, 3 tydzień przerwa
3	13		Nieleczone kontrole

Wytwarzanie szczepionki:

Szczepionkę monowalentną OspA (oznaczoną Ly) wytworzono przez rozcieńczenie stężonego roztworu oczyszczonego białka OspA B31, wytworzonego jak to opisano w Przykładzie 1. Stężenie roztworu wyjściowego wynosiło 465 μg/ml. Szczepionkę Lyme wytworzono przez rozcieńczenie roztworu wyjściowego jałowym rozcieńczalnikiem do stężenia 10 μg/ml OspA i porcjowano szczepionkę do flakonów jednorazowego i wielokrotnego użycia (odpowiednio, 1 ml i 10 ml). Szczepionkę pomyślnie zbadano na sterylność.

Protokół szczepienia:

Psy otrzymały dwie dawki szczepionki (1 ml/dawkę) podawanej podskórnie w odstępach 3 (grupa 1) albo 4 (grupa 2) tygodni. Przez pierwsze 15 minut po podaniu obserwowano zwierzęta w kierunku objawów anafilaksji, w tym trudności z oddychaniem, wysypki i obrzęku. Oprócz tego, Psy obserwowano przez pierwszą godzinę po szczepieniu, a następnie w regularnych odstępach czasu podczas 14 dni po pierwszym wstrzyknięciu. Badanymi objawami był obrzęk, ból, przeczulica, i drapanie w miejscu wstrzyknięcia. Przed podaniem drugiego wstrzyknięcia miejsce pierwszego wstrzyknięcia badano palpacyjnie w kierunku obrzęku i przeczulicy.

Serologia:

Pobrano krew w celu określenia miana przed każdym wstrzyknięciem, a następnie w odstępach miesięcznych. Miana OspA oznaczano przez ELISA.

PL 190 989 B1

Ekspozycja:

Wszystkie psy eksponowano na Borrelia burgdorferi stosując naturalnie zakażone kleszcze, według procedury opisanej przez Appel i in. Odstępy pomiędzy końcowym szczepieniem i ekspozycją wynosiły 24 tygodnie dla grupy 1 i 21 tygodni dla grupy 2. Kleszcze schwytano w Westchester County, NY, endemicznym obszarze choroby z Lyme, zaś ekspozycję przeprowadzono według procedury Appel i in., Odsetek zakażenia Borrelia burgdorferi wśród kleszczy wynosił 60%.

Biopsja skóry i ponowna izolacja krętków:

Od wszystkich psów pobrano biopsję skóry w miesiąc i dwa miesiące po ekspozycji. Skórę wokół miejsca przytwierdzenia się kleszcza wygolono, odkażono chirurgicznie Betainą, znieczulono 2% lidokainą wstrzykniętą podskórnie i pobrano biopsję stosując Baker Skin Punch. Próbki skóry umieszczono w probówkach zawierających pożywkę hodowlaną (pożywka BSK z króliczą surowicą inaktywowaną cieplnie i antybiotykami) i przetransportowano do laboratorium. Probówki uzupełniono dodatkowo pożywką i umieszczono w słoju. Słój inkubowano przez 6 tygodni. Probówki badano co tydzień na obecność krętków, stosując mikroskop z ciemnym polem widzenia. Badano przynajmniej 10 pól widzenia przy powiększeniu 40X zanim próbkę uznano za negatywną.

Objawy kliniczne

Nie oczekiwano objawów klinicznych choroby z Lyme (LD) po zakażeniu, z powodu zmiennego przebiegu choroby, stąd skuteczność szczepionek oceniano głównie przez izolację krętków Borrelia burgdorferi z próbek biopsji skóry. Jednakże, wszystkie psy obserwowano pod kątem pojawienia się objawów wskazujących na LD. Badano występowanie bólu i przeczulicy, temperaturę, utykanie, ataksję, depresję i anoreksję. Jedynie 10-15% psów zakażonych naturalnie Borrelia burgdorferi wykazywało objawy kliniczne.

Wyniki

Bezpieczeństwo szczepionki:

Wszystkie szczepione psy obserwowano pod kątem niepożądanych reakcji (w tym anafilaksji) przez pierwsze 15 minut po szczepieniu i przez dwa tygodnie po każdym szczepieniu. Nie stwierdzono reakcji niepożądanych w żadnym momencie po wstrzyknięciu monowalentnej szczepionki Lyme. Oprócz tego, nie obserwowano obrzęku, bólu, przeczulicy albo swędzenia w miejscu wstrzyknięcia.

Miana przeciwciał (patrz tabela 7):

Przeciwciało przeciwko OspA oznaczano testem ELISA. Tabela 7 podaje wartości ELISA. W momencie ekspozycji na kleszcze, większość z psów szczepionych monowalentną szczepionką (10 μg OspA) wciąż wykazywało istotne miana przeciwciał OspA. Jeden z psów Fas< nie wytworzył reakcji przeciwciał przeciwko OspA.

Izolacja krętków (patrz tabela 7):

Biopsje skóry pobrano u wszystkich psów w miesiąc i dwa miesiące po ekspozycji. Bioptaty hodowano przez 6 tygodni i badano pod kątem ponownej izolacji krętków. Krętki wyizolowano od 7 spośród 12 psów kontrolnych w pierwszej biopsji (58%). Jednej z próbek nie można było oznaczyć, ponieważ stracono ją po 5 tygodniach w hodowli z powodu zanieczyszczenia. Wszystkie 13 próbek (100%) od psów kontrolnych było pozytywne pod względem krętków przy drugiej biopsji.

Wyniki pokazują, że jedynie dwa psy szczepione monowalentną szczepionką Lyme (HVT i CXT) były pozytywne pod względem krętków,, odsetek ponownej izolacji wynosił 10%.

Objawy kliniczne psiej choroby z Lyme (patrz tabela 6 i 7):

miesięcy po ekspozycji, 5 spośród 13 nieszczepionych kontroli (39%) doznało epizodów, które można przypisać LD,, dwa psy (HXT i JCT) wykazywały liczne objawy. Jeden spośród szczepionych psów (5%) również doznał pojedynczego objawu utykania.

Dyskusja:

Skuteczność szczepionek oceniano zdolnością szczepionki do zapobiegania rozsiewu krętków i objawów klinicznych w krótkim czasie oraz długością czasu trwania odporności. LD u psów często nie powoduje pojawienia się objawów klinicznych (Levy i Magnarelli, 1992, JAVMA, 200:344-347), stąd oprócz opisywanych objawów klinicznych, skuteczność szczepionki opiera się na zdolności badanych preparatów do zapobiegania proliferacji krętków, co ocenia się ponowną izolacją krętków z bioptatów skóry. Ponowna izolacja krętków jest najistotniejszym, i najbardziej powtarzalnym parametrem spośród rozpatrywanych, jeżeli ocenia się skuteczność szczepionki. Jeżeli szczepionka zmniejsza albo eliminuje rozprzestrzenianie się, zwierzę nie rozwinie objawów klinicznych. Okazało się, że szczepionka Ly chroni >90% biorców przed proliferacją krętków w badaniu skuteczności opisanym wyżej. W tym badaniu czasu trwania odporności (DOI), w którym psy eksponowano 5 do 6 miesięcy

PL 190 989 B1 po szczepieniu, 100% nieleczonych zwierząt było pozytywnych pod względem krętków podczas drugiej biopsji. W przeciwieństwie, krętki wyizolowano od jedynie 2 szczepionych psów (10%).

Obserwowano również psy pod względem objawów klinicznych wywołanych infekcją. Obserwacje opisywane były przez techników weterynaryjnych, którzy nie byli poinformowani co do szczepienia danego zwierzęcia. Podczas krótkotrwałego badania skuteczności ponad 25% zwierząt nieszczepionych wykazywało objawy typowe dla choroby z Lyme (LD), głównie utykanie, podczas gdy u zwierząt szczepionych nie obserwowano tych objawów. W trakcie badania DOI 6 spośród tych psów wykazywało takie objawy, 5 stanowiło nieszczepione kontrole (39%) i 1 z psów był szczepiony (5%). Pierwszy epizod utykania zaobserwowano około 2 miesiące po ekspozycji, zaś 2 spośród nieszczepionych psów (JRT i IAT) wykazywało nawracające epizody.

Jeden ze szczepionych, HPS, wykazywał obrzęk i niewielkie utykanie w przedniej prawej łapie w około 2 miesiące po ekspozycji. Zwierzę nie było nigdy pozytywne pod względem krętków, mimo iż hodowle od tego zwierzęcia badane były ze świadomością objawów utykania. Możliwe jest, że epizod nie był wynikiem psiej LD, ale spowodowany był innymi przyczynami (uraz itp.). Jednakże, psa wymieniono jako pozytywnego pod względem objawów klinicznych w celu utrzymania możliwie wysokiej surowości testu.

Wyniki mian przeciwciał pokazują, że wszystkie z wyjątkiem jednego psa (FAS) szczepione szczepionką monowalentną uległy serokonwersji po szczepieniu, jak określono różnicą pomiędzy mianem w próbce wstępnej i próbce po ekspozycji przynajmniej w dwóch rozcieńczeniach. Stanowi to odsetek serokonwersji równy 95%. W momencie ekspozycji wszystkie z wyjątkiem dwóch szczepionych (FAS i HVT) wciąż wykazywały istotne miano przeciwciał. Żaden spośród psów kontrolnych nie wykazywał dłuższego wzrostu przeciwciał przeciwko OspA, jakkolwiek trzy psy kontrolne (HXT, JBT i JIT) wykazywały niskie miano przeciwciał w próbce pobranej przed ekspozycją.

Bezpieczeństwo szczepionki monowalentnej wykazano również dzięki wynikom tego doświadczenia. Nie obserwowano efektów niepożądanych w momencie szczepienia, albo w okresie tygodnia po każdym wstrzyknięciu. 10 μg/dawkę OspA było dobrze tolerowane przez wszystkie szczenięta. Ponieważ szczepionka nie zawierała adiuwantu nie występowały nawet łagodne i przemijające ziarniniaki, charakterystyczne dla większości preparatów szczepionki.

Wnioski:

Szczepionka monowalentna, zawierająca 10 μg OspA na dawkę:

*jest bezpieczna dla 9-10 tygodniowych szczeniąt, *jest bardzo antygenowa i wywołuje serokonwersję u 95% biorców, *wywołuje reakcję odpornościową, która chroni szczepione zwierzęta przez zakażeniem krętkami (90%) i objawami klinicznymi w 5-6 miesięcy po szczepieniu, podczas gdy 100% nieszczepionych wykazuje zakażenie krętkami i 39% wykazuje objawy kliniczne po ekspozycji na kleszcze.

Przykład ten również pokazuje, że szczepionka według wynalazku chroni przez cały sezon przed chorobą z Lyme.

T a b e l a 7

Wyniki mian przeciwciał przeciwko OspA, powtórna izolacja Spirochete i objawy kliniczne w trakcie Badania Immunogenności (DOI)

Szcze- pionka	Psy	mies. 0	mies. 1	mies. 2	mies. 3	mies.4	mies. 5	mies. 6	Spirochete	Powtórna izolacja	Objawy kliniczne
Przed skrwawie- niem						Przed prowo- kacją	Biopsja 1	Biopsja 2
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
szcze- pieni	DVT	50	200	1600	1600	800	800	800	-	-
DWT	<25	25	200	200	50	50	200
DXT	50	100	200	200	50	50	50	+	+
EBT	<25	50	800	800	100	100	200
ESC	<25	100	1500	800	400	200	200	-	-
EDS	<25	800	800	400	200	100	100	-
EHS	<25	100	50	50	50	25	50	-	-
EIS	200	100	200	100	25	25	50	-

PL 190 989 B1 cd. tabeli 7

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	FAS	<25	<25	25	25	<25	<25	<25	-	-
FJS	<25	<25	200	200	200	100	200
FKS	<25	<25	6400	800	400	400	400	-	-
HPS	<25	<25	6400	400	100	100	100	-	-	+
HVT	<25	<25	800	50	50	<25	<25	+	+
HWT	<25	<25	400	50	255	255	50
ICS	<25	<25	12800	1600	400	400	1600	-
IDS	50	<25	1600	400	100	200	400
IHT	<25	<25	12800	1600	400	400	1600	-	-
7S	<25	<25	12800	800	200	400	1600
LJS	<25	<25	6400	1600	400	800	800	-	-
IPT	<25	<25	12800	800	600	1600
Niele- czeni	HXT	<25	<25	<25	<25	25	50	100	-	+	+
IQS	<25	<25	50	<25	25	<25	25
IVS	<25	<25	<25	25	50	50	50	+	-t-
JES	25	<25	<25	<25	25	<25	25	+	+
ITS	25	<25	<25	<25	<25	<25	<25	-t-	+
IUS	<25	<25	<25	<25	<25	<25	<25	+	+
JBT	50	<25	<25	<25	<25	<25	100	-	+	+
JCT	200	<25	200	50	25	50	50			+
JIT	<25	<25	25	<25	<25	100	100	+	+
LIT	<25	<25	25	<25	<25	<25	25	-		+
JKS	25	<25	25	<25	<25	25	<25
JTS	50	<25	25	<25	<25	25	<25
JYS	<25	<25	50	<25	25	25	50	-	+	+

Wszystkim psom wykonywano biopsję w 1, 2 i 3 miesiące po prowokacji (patrz Materiały i Metody). Próbki skóry hodowano w pożywce BSK (uzupełnionej antybiotykami i 10% surowicą króliczą) przez 6 tygodni, probówki badano co tydzień stosując badanie mikroskopowe w ciemnym polu i przynajmniej wtedy badano pola przed uznaniem, że próbka jest ujemna. ± próbka utracona ze względu na zakażenie.

T a b e l a 8

Objawy kliniczne psiej choroby z Lyme w trakcie pięciomiesięcznej prowokacji

Piesi	Grupa	Oznaki
HXT	Kontrola	Utykanie (wszystkie kończyny), ataksja, depresja, brak łaknienia
Utykanie (lewa, przednia kończyna)
Utykanie (lewa, przednia kończyna), wszystkie objawy ustąpiły spontanicznie
JBT	Kontrola	Utykanie (prawa, przednia kończyna), objawy ustąpiły spontanicznie
JCT	Kontrola	Utykanie (prawa, przednia kończyna), objawy ustąpiły spontanicznie
JJT	Kontrola	Utykanie (prawa, przednia kończyna), objawy ustąpiły spontanicznie
JYS	Kontrola	Utykanie (lewa, przednia kończyna), objawy ustąpiły spontanicznie
HPS	Kontrola	Utykanie (prawa, przednia kończyna), objawy ustąpiły spontanicznie

Psy szczepiono 1 ml szczepionki Ly SQ w odstępach co trzy albo cztery tygodnie. Prowokację przeprowadzono w 5 do 6 miesiąca. Psy badano metodami ślepej próby w kierunku objawów klinicznych przez techników weterynaryjnych.

PL 190 989 B1

P r z y k ł a d 3 - Formulacja złożonej kompozycji interferencji skuteczności Przykład ten pokazuje, że nie występuje interferencja pomiędzy Canine Distemper-Adenovirus Type2-Coronavirus-Parainfluenza-Parvovirus i antygenem OspA Borrelia burgdorferi.

Skróty

Składnik Skrót wirus psiej zarazy, Rockborn D (CDVR) albo Onderstepoort (CDV0)

Psi Adenowirus typu 2 (CAV2) A

Psi Koronawirus, MLV (CCVL) C

Psi wirus paragrypy typu 2 (Cpi) Pi

Psi Parvowirus, (CPVXL) PXL

Składniki te wytworzono ze zmodyfikowanych żywych wirusów (dostępnych z Rhone Merieux, Inc., Athens, Georgia, USA).

Szczepionki miały następującą formulację składników.

Składnik	Miano/ml (Log™)
D	5,2 albo 5,4 (CDVr=5,2, CDV0=5,4)
A	7,4
C	6,6
Pi	7,5
Pxl	5,3

Szczepionki wytworzono jako dwa osobne składniki:

Pierwszym składnikiem był Canine Distemper-Adenovirus Type2-Coronavirus-ParainfluenzaParvovirusxL, Modified Live Virus, oznaczony DACPiPXL, który liofilizowano w jednej fiolce i nie zawierał on adiuwanta. Drugim składnikiem był Borrelia burgdorferi. Białko błony zewnętrznej A (OspA) B31 wytworzono techniką rekombinacyjną, jak podana w przykładzie 1 (oznaczona Ly) albo OspA.

Drugi składnik był w stanie ciekłym i zastosowano go do uwodnienia składnika liofilizowanego szczepionki przed zaszczepieniem. Frakcja OspA nie zawierała adiuwanta.

Liofilizowaną szczepionkę DACPiPXL zbadano jako zadowalającą pod względem swoistości wirusowej i miana, sterylności, mykoplazm i bezpieczeństwa. Liofilizowaną peletkę uwodniono przy użyciu Ly, zawierającej 13 μg/ml OspA. Szczepionkę OspA badano pod względem sterylności.

Brak interferencji rozcieńczalnika OspA pod wpływem liofilizowanych składników szczepionki określono przez badanie wirusologiczne przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Code of Federal Regulations, 9 C.F.R. 113.35.

Brak interferencji liofilizowanej frakcji wirusowej pod wpływem rozcieńczalnika OspA określono przez porównanie mian sereologicznych u psów szczepionych szczepionką złożoną (DAC-PiPXL+OspA) z mianami psów szczepionych samą OspA (patrz przykład 2).

Ponieważ DACPiPXL+OspA była wynikiem połączenia dwóch osobnych szczepionek, które zostały poddane już szerokim badaniom skuteczności, jedynie niewielką liczbę psów eksponowano w celu wykazania, że liofilizowany składnik wirusowy nie interferuje z ochroną wywołaną przeciwko chorobie z Lyme przez frakcję OspA i vice versa.

psów rozdzielono według wieku, rasy i płci i trzymano razem. 10 psów szczepiono skojarzoną szczepionką DACPiPXL+OspA, 5 psów szczepiono samą OspA (jak w przykładzie 2), zaś 5 psów służyło jako nieszczepiona kontrola.

Psy otrzymały dwie dawki szczepionki (1 ml/psa), podanej podskórnie (sc) w odstępach trzytygodniowych, według następującego schematu.

LICZBA	SZCZEPIONKA	DROGA PODANIA	DATA POBRANIA KRWI	PROWOKACJA
10	DACPiPxL+LY	SQ	dzień 0, 21, 35	dzień 35
5	LY	SQ	dzień 0, 21, 35	dzień 35
5	Kontrole DACPiPxL	SQ	dzień 0, 21, 35	dzień 35

PL 190 989 B1

Psom pobierano krew przed każdym szczepieniem (dni 0 i 21), przez ekspozycją (dzień 35) i przed każdą biopsją. Swoiste przeciwciała OspA wykrywano testem ELISA. Przeciwciała przeciwko OspA wykrywano u psów otrzymujących OspA albo DAC-PiPXL + OspA.

Wszystkie psy obserwowano bezpośrednio po szczepieniu w kierunku objawów niepożądanych, w tym anafilaksji. Oprócz tego, psy obserwowane były codziennie przez techników weterynaryjnych w kierunku niepożądanych objawów poszczepiennych takich jak gorączka, anoreksja, wymioty albo osowiałość. Przed drugim wstrzyknięciem miejsce poprzedniego wstrzyknięcia badano palpacyjnie w kierunku jakichkolwiek nieprawidłowych reakcji, w tym tworzenia ziarniniaka. Nie obserwowano objawów niepożądanych.

Wszystkie psy eksponowano w dwa tygodnie po drugim szczepieniu na kleszcze naturalnie zakażone Borrelia burgdorferi (patrz przykład 2).

Biopsje skóry pobrano od psów w miesiąc, dwa i trzy miesiące po ekspozycji. Bioptaty hodowano w celu ponownej izolacji krętków według protokołu opisanego w przykładzie 2.

Brak interferencji liofilizowanej frakcji wirusowej w skojarzonej szczepionce, pod wpływem rozcieńczalnika OspA oceniano przez porównanie odsetka reizolacji krętków u psów szczepionych z nieszczepioną kontrolą.

W celu wykazania, że frakcja OspA nie wpływa negatywnie na liofilizowany składnik wirusowy w skojarzonej szczepionce Lyme, przeprowadzono testy wirusologiczne. Wszystkie składniki wirusowe miareczkowano po uwodnieniu przez Ly, zaś miareczkowanie porównywano z miareczkowaniem, kiedy to składnik wirusowy uwodniono sterylną wodą.

Interpretacja wyników in vitro i in vivo:

Skuteczność szczepionki złożonej określono in vivo mianami serologicznymi oraz wynikami ponownej izolacji krętków, oraz testem wirusobójczym in vitro. Poziom przeciwciał przeciwko OspA i wyniki ponownej izolacji krętków u psów szczepionych szczepionką złożoną (DACPiPXL+Ly) porównano z obserwowanymi u psów szczepionych samą Ly oraz z poziomem u nieszczepionych kontroli.

Szczepionkę skojarzoną uznano za skuteczną ponieważ:

(1) Poziomy przeciwciał u szczepionych in combo były podobne do poziomów u psów szczepionych monowalentną szczepionką Ly. Poziomy przeciwciał u szczepionych były również istotnie wyż sze ni ż poziomy u nieszczepionych kontroli, (2) 100% szczepionych psów było negatywnych pod względem ponownej izolacji krętków, podczas gdy 80% (4/5) nieszczepionych psów było pozytywnych pod względem krętków, i (3) Nie występował spadek miana wirusa, gdy liofilizowaną peletkę uwodniono rozcieńczalnikiem Ly w porównaniu ze sterylną wodą.

Wyniki pokazano w tabeli 9.

T a b e l a 9

Badanie skuteczności psiej kombinacji
Zwierzę #	Szczepionka	Tydzień 0 (Vax 1)	Tydzień 2 (Vax 2)	Tydzień 4	Tydzień 8
1	2	3	4	5	6
700	OspA 13 pg/ml seria#041795 i DACPiPxL seria#43001	<25	50	800	400
711	<25	3200	6400	1600
4D587	<25	25	200	25
283	<25	200	12800	400
4D547	<25	<25	<25	100
904	<25	50	3200	100
4D517	<25	400	3200	400
961	<25	<25	1600	100
4D581	<25	3200	12800	1600
982	<25	50	12800	800

PL 190 989 B1 cd. tabeli 9

1	2	3	4	5	6
4E455	sam OspA 13 μg/ml seria #041795	<25	25	800	25
4E403	<25	800	6400	1600
381	<25	800	6400	800
688	<25	400	800	100
4D515	<25	50	6400	800
449	sam DACPiPxL seria #43001 (kontrole)	<25	<25	<25	<25
844	<25	<25	<25	<25
4E457	<25	<25	<25	<25
4D497	<25	<25	<25	<25
4E439	<25	<25	<25	<25

*Wszystkie psy otrzymały dwa podskórne wstrzyknięcia w odstępach trzytygodniowych

Ly = OspA Lyme, DACPiPxL = modyfikowana żywa szczepionka adenowirusowa, koronawirusowa, przeciwko wirusowi paragrypy i parwowirusowa przeciwko psiej zarazie Wartości >50 = znaczące poziomy przeciwciał przeciwko OspA

P r z y k ł a d 4 - Skuteczność szczepionki u koni

Do badania zastosowano 10 koni. Nosiły one numery 74, 75, 76, 77, 93, 95, 96, 97, 98 i 99. Szczepionki monowalentne (oznaczone Ly, 100 μg/dawkę OspA i 30 μg/dawkę OspA, wytworzono techniką rekombinacyjną jak podano w przykładzie 1 (B31)). Szczepionka złożona (oznaczona wścieklizna/Ly) obejmowała Imrab (dostępna w Rhone-Merieux, Inc., Athens, Georgia) z dodatkiem 30 μg/ml B31 OspA, jak wytworzona w przykładzie 1 (B31).

Wszystkie konie szczepiono domięśniowo (im) dwiema dawkami szczepionki, podawanymi w odstępie dwutygodniowym, według następującego schematu:

Grupa	Liczba	Szczepionka
1	4	wścieklizna/Ly (30 μg/ml)
2	4	100 μg/ml Ly
3	2	30 μg/ml Ly

Koniom pobierano krew przed każdym szczepieniem oraz w tydzień, dwa i trzy po drugim szczepieniu. Wyniki serologiczne określono przez ELISA (zmodyfikowanego przez zastosowanie końskiej surowicy odpornościowej). Miano przeciwciał przeciwko wściekliźnie określono u koni szczepionych szczepionką złożoną, ponieważ wyniki serologiczne OspA były obiecujące.

Wszystkie konie obserwowano przez 30 minut do godziny po każdym wstrzyknięciu w kierunku objawów charakterystycznych dla anafilaksji. Po początkowej obserwacji, miejsce szczepienia badano przed podaniem drugiego szczepienia, pod względem miejscowych reakcji (wrzodów itp.). Oprócz tego, każdego z koni obserwowano codziennie w kierunku wystąpienia niepożądanych objawów poszczepiennych (gorączka, depresja, anoreksja itp.). Wszystkie codzienne obserwacje prowadzono przez tydzień po końcowym szczepieniu. Nie obserwowano objawów niepożądanych.

Skuteczność szczepionek oceniano przez badanie poziomów przeciwciał przeciwko OspA u szczepionych koni i porównanie tych poziomów z poziomami przed szczepieniem.

Wyniki pokazano w tabeli 10. Wyniki wskazują, że konie można chronić przed chorobą z Lyme przy użyciu monowalentnej albo poliwalentnej szczepionki OspA, oraz, że w przypadku szczepionki poliwalentnej nie obserwuje się interferencji skuteczności.

T a b e l a 10

Szczepienie koni przeciwko chorobie z Lyme-poziomy ELISA OspA

zwierzę	szczep.	tydz. 0	tydz. 1	tydz. 4	tydz. 5	mieś. 6
1	2	3	4	5	6	7
96	OspA 30 ^g/ml)	25	nb	200	800	200
99	25	nb	25	800	100

PL 190 989 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7
76	Ospa 100 pg/ml	nb	nb	800	3200	1600
74	nb		400	12,8 tys.	6400
95	25	nb	50	1600	400
75	nb	100	400	3200	800
93	OspA 30 μ9/ΐΓΗ + + Imrab #12160	25	nb	400	25,6 tys.	6400
98	nb	200	800	6400	1600
97	25	nb	400	6400	1600
77	25	nb	800	6400	1600

*wszystkie konie otrzymały dwa wstrzyknięcia im. w odst. 3 tyg. Imrab dost. w handlu adiuwantowana szczepionka przeciwko wś ciekliź nie * nb - nie badano, wartość >50 wskazuje istotny poziom przeciwciał OspA

P r z y k ł a d 5 - Psia szczepionka Lyme: Bezpieczeństwo, skuteczność i brak interferencji skojarzonej szczepionki przeciwko chorobie z Lyme

Przykład ten dalej bada bezpieczeństwo, skuteczność i brak interferencji skojarzonej szczepionki przeciwko chorobie z Lyme (recDACPiPXL + OspA).

psy rasy beagle podzielono losowo na dwie grupy (22 szczepione i 12 kontroli). Szczepione otrzymywały dwie dawki szczepionki złożonej (recDACPiPXL + OspA) podskórnie, podczas gdy kontrole szczepiono tylko składnikiem wirusowym (recDAC-PiPXL). Wszystkie psy poddano ekspozycji w 7 tygodni po drugim szczepieniu przy użyciu naturalnie zakażonych kleszczy. Psy badano w kierunku przeciwciał przeciwko OspA w regularnych odstępach czasu metodą ELISA. W celu potwierdzenia skuteczności szczepionki przeciwko ekspozycji na Borrelia burgdorferi, psom pobierano biopsję i hodowano próbki skóry w celu izolacji krętków.

Oprócz tego, przeprowadzano badania braku interferencji oraz testy wirusobójcze, w celu potwierdzenia, że rozcieńczalnik OspA nie wywiera szkodliwego wpływu na wirusowy składnik szczepionki.

* Bezpieczeństwo: Nie obserwowano niepożądanych objawów miejscowych i uogólnionych w żadnym momencie po wstrzyknięciu.

* Podsumowanie skuteczności:

T a b e l a 11

Grupa	Psy	Serokonwersja poszczepienna	Izolacja krętków po ekspozycji
recDACPIPxL+ +OspA recDAACpiPXL	22 12	12/21 0/11	57,1% 0%	22/22 0/12	100% 0%	1/22 4/12	4,8% 33,4%	0/22 9/12	0% 75%

* jednego psa nie skrwawiono * Brak interferencji: zarówno testy wirusobójcze, jak i badania braku interferencji wykazały, że rozcieńczalnik OspA nie wywiera szkodliwego wpływu na składniki wirusowe w szczepionce skojarzonej.

Tak więc, złożona szczepionka przeciwko chorobie z Lyme (recDACPiPXL + OspA):

* jest bezpieczna u 8-10 tygodniowych szczeniąt, * jest bardzo antygenowa i wywołuje serokonwersję OspA u 100% szczepionych psów, * chroni szczepione zwierzęta przed zakażeniem krętkami i rozsiewem po naturalnej ekspozycji przez kleszcze, i * nie interferuje z liofilizowanym wirusowym składnikiem szczepionki, co wykazano in vivo badaniem braku interferencji i testami wirusobójczymi in vitro.

Zastosowane skróty

Składniki szczepionki Skróty

Białko błony zewnętrznej A z Borrelia burgdorferi (OspA) OspA (patrz poprzedzające Przykłady) wirus psiej zarazy, Wektor Canarypox (CDV) D

Psi Adenowirusy typu 2 (CAV2) A

Psi wirus paragrypy typu 2 (Cpi) Pi

PL 190 989 B1

Psi Parvowirus, (CPVxL) PxL

Psi Koronawirus (CCV) C

Szczepionka skojarzona, która może immunizować psy przeciwko chorobie z Lyme i równocześnie zapewnić ochronę przed innymi psimi patogenami, oferuje weterynarzom istotną alternatywę w profilaktyce chorób zakaźnych.

Niniejsze badanie przeprowadzono w celu określenia bezpieczeństwa, skuteczności i braku interferencji skojarzonych szczepionek według wynalazku. Szczepionkę skojarzoną skomponowano z rozcieńczalnika OspA (oznaczonego OspA) i liofilizowanej peletki wirusowej zawierającej Canine Distemper-Adenowirus Type2-Coronavirus-Parainfluenza-ParvovirusxL (oznaczoną recDACPIPxL).

Materiały i metody:

Zwierzęta:

szczenięta beagle (płci obojga, w wieku 8 tygodni, negatywne pod względem szczepienia przeciwko chorobie z Lyme Borrelia burgdorferi i Leptospira) otrzymano z Ridglan Farms (Mount Horeb, WI). Szczenięta podzielono losowo na dwie grupy i szczepiono.

Grupa	Psy	Szczep.	Droga	Ekspozycja
1	22	recDACPiPxL + OspA	sc	7 tyg.
2	12	recDACPiPxL + sterylny rozcieńczalnik	sc	7 tyg.

Wytwarzanie szczepionki:

Szczepionkę monowalentną OspA wytworzono jak to opisano w Przykładzie 1. Liofilizowaną peletkę składnika wirusowego otrzymano jako serię przed rejestracją. Miareczkowanie liofilizowanej peletki wyglądało następująco:

Szczepionka	recCDV	CAV2	CCV	CPI	Pxl
recDACPiPxL	7,3	5,6	4,5	6,5	5,2

Psy otrzymały dwie dawki szczepionki (1 ml/psa) podskórnie w odstępach 3 tygodni. Przez pierwsze 15 minut po podaniu obserwowano zwierzęta w kierunku objawów anafilaksji, w tym trudności z oddychaniem, wysypki i obrzęku. Oprócz tego, psy obserwowano przez pierwszą godzinę po szczepieniu, a następnie w regularnych odstępach czasu podczas 14 dni po pierwszym wstrzyknięciu. Badanymi objawami był obrzęk, ból, przeczulica, i drapanie w miejscu wstrzyknięcia. Przed podaniem drugiego wstrzyknięcia miejsce pierwszego wstrzyknięcia badano palpacyjnie w kierunku obrzęku i przeczulicy.

Serologia:

Pobrano krew w celu określenia miana przed każdym wstrzyknięciem, a następnie w odstępach miesięcznych. Miana OspA oznaczano przez ELISA.

Badanie braku interferencji:

W celu wykazania braku interferencji rozcieńczalnika OspA z wirusowymi składnikami szczepionki skojarzonej, określano miana neutralizujące w surowicy oraz GMT dla grupy I (szczepionej recDACPIPxL + OspA) w porównaniu z mianami grupy II (szczepionej tylko recDACPIPxL).

Badanie wirusobójcze in vitro:

W celu wykazania, że rozcieńczalnik OspA nie interferuje z mianami składników wirusowych szczepionki skojarzonej, przeprowadzono badanie wirusobójcze in vitro według wytycznych 9 CFR (113.35).

Ekspozycja na kleszcze:

W celu sprawdzenia, czy składnik wirusowy nie interferuje z ochroną rozwijaną przez frakcję OspA szczepionki skojarzonej, wszystkie psy eksponowano na Borrelia burgdorferi w 7 tygodni po szczepieniu. Ekspozycja ta wykorzystywała naturalnie zakażone kleszcze schwytane w obszarze endemicznym choroby z Lyme. Odsetek kleszczy zakażonych Borrelia burgdorferi wynosił 60%.

Biopsja skóry i ponowna izolacja krętków:

Od wszystkich psów pobrano biopsję skóry w miesiąc i dwa miesiące po ekspozycji. Skórę wokół miejsca przytwierdzenia się kleszcza wygolono, odkażono chirurgicznie Betainą, znieczulono 2% lidokainą wstrzykniętą podskórnie i pobrano biopsję stosując Baker Skin Punch. Próbki skóry umieszczono w probówkach zawierających pożywkę hodowlaną (pożywka BSK z króliczą surowicą inaktywowaną cieplnie i antybiotykami) i przetransportowano do laboratorium. Probówki uzupełniono dodat28

PL 190 989 B1 kowo pożywką i umieszczono w słoju. Słój inkubowano przez 6 tygodni. Probówki badano co tydzień na obecność krętków, stosując mikroskop z ciemnym polem widzenia. Badano przynajmniej 10 pól widzenia przy powiększeniu 40X zanim próbkę uznano za negatywną.

Bezpieczeństwo szczepionki:

Wszystkie szczepione psy obserwowano pod kątem niepożądanych reakcji (w tym anafilaksji) przez pierwsze 15 minut po szczepieniu i przez dwa tygodnie po każdym szczepieniu. Nie stwierdzono reakcji niepożądanych w żadnym momencie po wstrzyknięciu monowalentnej szczepionki Lyme. Oprócz tego, nie obserwowano obrzęku, bólu, przeczulicy albo swędzenia w miejscu wstrzyknięcia.

Miana przeciwciał przeciwko OspA (patrz tabela 12):

Przeciwciała przeciwko OspA oznaczano przez ELISA. Krew pobierano dnia 0 (przed pierwszym szczepieniem), dnia 14 (przed drugim szczepieniem), dnia 42 (przed ekspozycją), a następnie w miesięcznych odstępach czasu.

Tabela 12 pokazuje wartości ELISA. Po pierwszym szczepieniu, 12 na 21 szczepionych zwierząt (57,1%) uległo serokonwersji, co określono wzrostem poziomu przeciwciał przeciwko OspA co najmniej 4-krotnym. 2 tygodnie po drugim szczepieniu, wszystkie 22 psy (100%) szczepione samą recDACPIPXL uległo serokonwersji w stosunku do OspA. Większość szczepionych wciąż wykazywała istotne miano przeciwciał przeciwko OspA przed ekspozycją (19/22 = 86,4%). Żadne ze zwierząt kontrolnych nie wykazywało reakcji serologicznej wobec antygenu OspA.

W obu grupach poziom przeciwciał narastał bardzo niewiele po ekspozycji na kleszcze. Przeciwciała przeciwko OspA powstają u ludzi z chorobą z Lyme późno w trakcie zakażenia i wydaje się, że jest to również faktem u psów przechodzących naturalne zakażenie.

Badanie braku interferencji (patrz tabela 13):

Surowice otrzymano od psów w dniu 0 (przed pierwszym szczepieniem) i 35 dniu po szczepieniu. Miana neutralizujące surowicy wobec antygenów wirusowych w skojarzonej szczepionce oznaczano u każdego z psów w obu dniach. Średnią geometryczną mian (GMT) i odchylenie standardowe (SD) obliczono dla grupy szczepionej recDACPIPXL samej i porównano z GMT dla grupy otrzymującej szczepionkę skojarzoną przeciwko chorobie z Lyme (recDACPIPXL+OspA).

Szczenięta zastosowane w tym badaniu były negatywne względem szczepień albo ekspozycji na patogen choroby z Lyme albo Leptospira, ale nie były hodowane w warunkach wolnych od swoistych patogenów (SPF). Stąd, wyniki wstępnych próbek krwi z dnia 0 wykazują miana wobec składników liofilizowanej frakcji szczepionki. Po szczepieniu miana wszystkich składników uległy podwyższeniu, jak to oczekiwano.

Porównanie indywidualnych mian (analizowanych z użyciem testu t Studenta, z wartością p< 0,05 uznawaną za istotną), nie wykazały różnic w mianach neutralizujących surowic u psów szczepionych recDACPIPXL+OspA w porównaniu z mianami psów otrzymujących tylko recDACPIPXL. Stąd, nie istnieje istotna interferencja pomiędzy rozcieńczalnikiem OspA i wirusowymi składnikami szczepionki.

Badanie wirusobójcze in vitro (patrz tabela 14):

Badanie wirusobójcze in vitro porównywało miana dla każdego ze składników szczepionki wirusowej uwodnionej OspA z mianami oznaczonymi, gdy szczepionkę uwodniono sterylną wodą. Porównanie tych mian wykazało, że zmienność leżała w dopuszczalnych granicach dla każdego ze składników wirusowych w skojarzonej szczepionce Lyme (różnica w mianach mniejsza niż 0,5 log).

Izolowanie krętków (patrz tabela 15):

Przeprowadzono biopsje skóry u wszystkich psów w miesiąc i dwa miesiące po ekspozycji. Bioptaty hodowano przez 6 tygodni i badano w kierunku izolacji krętków. Wyniki pokazują, że tylko jeden pies szczepiony kombinacją szczepionki Lyme (XBY) był pozytywny pod względem krętków (4,5%) i był pozytywny jedynie w pierwszej biopsji. Żaden z 22 psów szczepionych recDACPIPxL+ OspA nie był pozytywny w trakcie drugiej biopsji.

Krętki ponownie izolowano z próbek pobranych od 3 spośród 12 psów kontrolnych w miesiąc po ekspozycji (25%), zaś w czasie drugiej biopsji 9 psów kontrolnych było pozytywnych podczas drugiej biopsji (75%).

Choroba z Lyme (LD) powodowana przez patogennego krętka Borrelia burgdorferi jest obecnie najpowszechniejszą chorobą przenoszoną przez kleszcze u ludzi. Oprócz tego, częstość psiej LD rośnie, a więc wśród weterynarzy rośnie obawa zakażenia psów.

Wiadomo, że jedno z głównych białek błony zewnętrznej Borrelia burgdorferi określane jako OspA jest silnym immunogenem i zapewnia ochronę przed zakażeniem krętkami u różnych zwierząt.

PL 190 989 B1

Oczyszczone białko OspA, wytworzone w dowolnej ilości techniką rekombinacyjną stanowi również podstawę dwóch szczepionek dla ludzi, przechodzących obecnie badanie kliniczne.

Szczepionka skojarzona, którą można immunizować psy przeciwko chorobie z Lyme i równocześnie zapewnić ochronę przed innymi psimi patogenami, może zaofiarować weterynarzom istotną alternatywę profilaktyki chorób zakaźnych.

Celem tego przykładu było określenie skuteczności, bezpieczeństwa i braku interferencji takiej szczepionki złożonej. Szczepionka zawierała liofilizowaną peletkę wirusową zawierającą Canine Distemper-Adenovirus Type2-Coronavirus-Parainfluenza-ParvovirusXL (oznaczoną recDACPIPXL) i została uwodniona rozcieńczalnikiem OspA. 22 szczenięta szczepiono szczepionką skojarzoną (recDACPIPXL + OspA), zaś 12 kontroli szczepiono liofilizowaną peletką wirusową rozcieńczoną sterylną wodą (recDACPIPXL). Wszystkie szczenięta otrzymały dwa wstrzyknięcia podskórne, w odstępie 3 tygodni, a następnie były eksponowane na kleszcze zakażone Borrelia burgdorferi.

W Przykładzie tym zastosowano naturalny model ekspozycji na kleszcze. Po ekspozycji wszystkim psom pobrano biopsje w miesiąc i dwa miesiące po ekspozycji i hodowano próbki w celu izolacji krętków. Wyniki pokazują, że tylko jedno ze szczeniąt szczepionych skojarzoną szczepionką Lyme było przejściowo pozytywne pod względem izolacji krętków, ale i ten pies, podobnie jak pozostałe szczenięta szczepione skojarzoną szczepionką, były negatywne pod względem rozprzestrzenienia się krętków w drugiej biopsji. W przeciwieństwie krętki wyizolowano od 75% psów szczepionych tylko recDACPIPXL w drugiej biopsji.

Wyniki przeciwciał przeciwko OspA określono dla wszystkich psów. Wszystkie ze szczeniąt szczepionych szczepionką skojarzoną (recDACPIPXL + OspA) uległo serokonwersj i po otrzymaniu dwóch szczepień, jakkolwiek żadna z kontroli nie wykazała wzrostu poziomu przeciwciał przeciwko OspA po szczepieniu samym liofilizowanym składnikiem wirusowym.

Miana przeciwko OspA u zwierząt kontrolnych, które były zakażone, jak wykazała biopsja, nie rosły znacząco po ekspozycji na kleszcze. Wiadomo, że u ludzi przeciwciała przeciwko OspA nie występują we wczesnych stadiach choroby z Lyme, wyniki z niniejszego badania wskazują, że może mieć to również miejsce w przypadku psiego zakażenia.

Bezpieczeństwo skojarzonej szczepionki OspA wykazano również w tym badaniu. Nie zauważono niepożądanych objawów ogólnoustrojowych albo miejscowych w momencie szczepienia albo w okresie dwóch tygodni po szczepieniu.

Skojarzona szczepionka Lyme według wynalazku (recDACPIPXL + OspA):

* jest bezpieczna u 8-10 tygodniowych szczeniąt, * jest bardzo antygenowa i wywołuje serokonwersje OspA u 100% szczepionych psów, * chroni szczepione zwierzęta przed zakażeniem krętkami i rozsiewem po naturalnej ekspozycji przez kleszcze, i * nie interferuje z liofilizowanym wirusowym składnikiem szczepionki, co wykazano in vivo badaniem braku interferencji i testami wirusobójczymi in vitro.

T a b e l a 12

Wyniki mian przeciwciał przeciwko OspA

Szcze- pionka	Zwierzę	Przed skrwawieniem	V2		Przed prowokacją	Biopsja 1	Biopsja 2
dzień 1	dzień 14	dzień 28	dzień 42	dzień 92	dzień 126	dzień 155	dzień 232
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
rDAC- PIPxl+ +OspA	WIX	<25	50	12,8k	800	200	50	25	<25
XBY	<25	NB	1600	200	100	<25	<25	<25
XDY	NB	<25	200	100	100	50	NB	NB
XCY	<25	25	1600	400	25	<25	<25	<25
XAY	<25	200	6400	800	200	NB	50	100
XGY	<25	50	6400	50	50	<25	<25	<25
XHY	<25	100	3200	400	100	<25	<25	<25
XIY	<25	50	3200	400	50	<25	<25	<25

PL 190 989 B1 cd. tabeli 12

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	xjy	<25	200	6400	400	100	<25	<25	<25
	xky	<25	50	800	NB	<25	<25	<25	<25
	wxw	<25	<25	1600	400	50	<25	25	<25
	WYW	<25	25	3200	800	200	25	100	100
	wtx	<25	<25	3200	800	400	100	50	100
	wux	<25	50	3200	200	800	100	25	25
	WVx	<25	50	800	100	NB	<25	25	25
	wwx	<25	400	12, 8k	1600	<25	100	50	50
	wsx	<25	50	25, 6k	1600	50	200	200	200
	wlx	<25	<25	800	100	100	<25	<25	<25
	WOW	NB	<25	400	100	<25	<25	<25	<25
	WPW	25	<25	400	50	50	<25	<25	<25
	WQW	NB	<25	800	100	100	<25	<25	50
	WRW	<25	50	3200	100	<25	<25	<25	50
	vvx	<25	<25	50	<25	50	<25	<25	<25
	vxw	<25	<25	<25	50	100	<25	<25	<25
	VYW	<25	<25	<25	<25	100	<25	<25	25
	wbx	<25	<25	<25	25	50	<25	<25	<25
	wcx	<25	<25	<25	<25	<25	<25	<25	<25
sam Rac-	wdx	<25	<25	<25	50	50	<25	<25	<25
wax	<25	<25	25	<25	<25	<25	<25	<25
-PIPxl
	wex	<25	<25	25	<25	25	<25	<25	<25
	WZZ	<25	<25	25	<25	25	<25	25	<25
	wgx	NB	<25	<25	<25	<25	<25	<25	<25
	wfx	<25	NB	50	25	25	<25	25	25
	whx	<25	<25	<25	50	50	25	50	100

T a b e l a 13:

Poziomy przeciwciał w surowicy:

Brak interferencji rozcieńczalnika Lyme ze składnikiem wirusowym skojarzonej szczepionki

ANTYGEN	SZCZEPIONKA	DZIEŃ 01	DZIEŃ 35
GMT	SD	GMT	SD
recCDV	recDACPiPxL + OspA	1,05	0,37	1,78	0,46
	recDACPiPxL	1,01	0,35	1,66	0,65
CAV	recDACPiPxL + OspA	2,24	0,25	2,48	0,27
	recDACPiPxL	2,17	0,19	2,33	0,29
CPI	recDACPiPxL	1,52	0,33	2,12	0,18
	recDACPiPxL	1,62	0,31	2,10	0,26
Pxl	recDACPiPxL + OspA	2,00	0,00	3,72	0,78
	recDACPiPxL	2,00	0,00	3,68	0,62
CCV	recDACPiPxL + OspA	1,51	0,29	2,53	0,40
	recDACPiPxL	1,31	0,49	2,78	0,42

¹ Data pierwszego szczepienia Uwodniona sterylnym rozcieńczalnikiem GMT: Średnia geometryczna miana SD: odchylenie standardowe

PL 190 989 B1

T a b e l a 14

Miana liofilizowanych składników wirusowych z i bez rozcieńczalnika Lyme (efekt wirusobójczy)

SZCZEPIONKA	MIANA FRAKCJI WIRUSOWYCH1
recCDV	CAV2	ccv	Cpi	Pxl
recDACPiPxL 2	7,6	6,2	4,6	6,0	5,3
recDACPiPxL + OspA	7,7	5,7	4,4	5,8	5,1

¹ Średnia dwóch powtórzeń ² Uwodniona sterylnym rozcieńczalnikiem

T a b e l a 15

Wyniki serokonwersji OspA i ponowna izolacja krętka po prowokacji

SZCZEPIONKA	SEROKONWERSJA	PONOWNA IZOLACJA KRĘTKA
1-wsze WSZTRZYKNIECIE	2-gie WSTRZYKNIĘCIE	1-wsza BIOPSJA	2-ga BIOPSJA
recDACPiPxL 2	12/21 = 57,1%	22/22 = 100%	1/22 = 4,5%	0/22 = 0,0%
recDACPiPxL + OspA	0/11 = 0,0%	0/12 = 0,0%	3/12 = 25%	9/12 = 75%

nie skrwawiono jednego psa

Na podstawie szczegółowego opisu najkorzystniejszych wykonań wynalazku, należy rozumieć, że wynalazek określony przez dołączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do konkretnych szczegółów podanych w powyższym opisie, ponieważ możliwe są liczne odmiany bez oddalania się od ducha i zakresu wynalazku.

Odnośniki

1. Barbour, A.G. and Fish, D. The biological and social phenomenon of Lyme Disease.

Science. 1993, 260, 1610-1616.

2. Fikrig, E., Barthold, S.W., Kantor, F.S. and Flavell, R.A. Protection of mice against tha Lyme disease agent by immunizing with recombinant OspA. Science. 1990, 250, 553-556.

3. Erdile, L.f., Brandt, M., Warakomaki, D.J., Westrack, G.J., Sadziene, A., Barbour, A.G. and Mays, J.P. Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA. Infect. Immun. 1993, 61,81-90. See also USSN 08/373,455.

4. Keller, D., Kister, F.T., Marks, D.H., Hosback, P., Erdile, L.F. and Maya, J.P. Safety and immunogenicity of a recombinant outer surface protein A Lyme vaccine. J, Am. Med. Assoc. 1994, 271, 1764.

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja immunologiczna, znamienna tym, że zasadniczo składa się z: (i) izolowanego, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi składającego się zasadniczo z OspA, lub wektora wyrażającego antygen, (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego niż Borrelia burgdorferi albo wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen, i ewentualnie (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jednym dodatkowym antygenem jest antygen wirusa wścieklizny, lub co najmniej jeden dodatkowy antygen zasadniczo składa się z kombinacji antygenu psiej zarazy i antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa lub co najmniej jeden dodatkowy antygen składa się zasadniczo z kombinacji antygenu wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa.
2. 2. Kompozycja immunologiczna, znamienna tym, że zasadniczo składa się z: (i) izolowanego, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi składającego się zasadniczo z OspA, lub wektora wyrażającego antygen OspA i (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego niż Borrelia burgdorferi albo wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen i ewentualnie

   PL 190 989 B1 (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jeden dodatkowy antygen składa się zasadniczo z antygenu wybranego z grupy składającej się z: antygenu wirusa wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu wirusa paragrypy, antygenu parvowirusa i ich mieszaniny.
3. 3. Kompozycja immunologiczna, znamienna tym, że zasadniczo składa się z: (i) izolowanego, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi składającego się zasadniczo z OspA, lub wektora wyrażającego antygen, i (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego niż Borrelia burgdorferi albo wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen, i ewentualnie (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jednym dodatkowym antygenem jest antygen wirusa wścieklizny, lub co najmniej jeden dodatkowy antygen obejmuje kombinację antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa, lub co najmniej jeden dodatkowy antygen obejmuje kombinację antygenu wirusa wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy, i antygenu parvowirusa, i że co najmniej jednym dodatkowym antygenem nie jest antygen Leptospira, który koliduje z OspA.
4. 4. Kompozycja immunologiczna, znamienna tym, że obejmuje: (i) izolowany, oczyszczony antygen Borrelia burgdorferi składający się zasadniczo z antygenu OspA, lub wektora wyrażającego antygen OspA, i (ii) co najmniej jednego dodatkowego antygenu patogenu ssaka innego niż Borrelia burgdorferi albo wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen, i ewentualnie (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie, przy czym co najmniej jeden dodatkowy antygen jest wybrany z grupy składającej się z: antygenu wirusa wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy, antygenu parvowirusa, i ich mieszanki, pod warunkiem, że co najmniej jednym dodatkowym antygenem nie jest antygen Leptospira, który koliduje z OspA.
5. 5. Kompozycja immunologiczna, znamienna tym, że składa się zasadniczo z: (i) izolowanego, oczyszczonego antygenu Borrelia burgdorferi składającego się zasadniczo z antygenu OspA, lub wektora wyrażającego antygen OspA, i (ii) co najmniej jednego zmodyfikowanego żywego wirusa wybranego z grupy składającej się z antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy, antygenu parvowirusa, i ich mieszanki, i ewentualnie (iii) nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie albo weterynaryjnie.
6. 6. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że (i) jest wyizolowanym, oczyszczonym antygenem OspA z Borrelia burgdorferi.
7. 7. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 6, znamienna tym, że wyizolowanym, oczyszczonym antygenem OspA jest wyizolowany, oczyszczony lipidowany OspA.
8. 8. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 7, znamienna tym, że jest wolna od adiuwantu wzmacniającego immunogenność.
9. 9. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że (i) jest wektorem wyrażającym izolowany, oczyszczony antygen OspA z Borrelia burgdorferi.
10. 10. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 1, znamienna tym, że (ii) składa się zasadniczo z wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen patogenu ssaka.
11. 11. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 1, znamienna tym, że co najmniej jednym dodatkowym antygenem (ii) jest antygen z patogenu innego niż Borrelia burgdorferi.
12. 12. Kompozycja immunologiczna według dowolnego zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że co najmniej jednym dodatkowym antygenem jest antygen wirusa wścieklizny.
13. 13. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 1, znamienna tym, że co najmniej jeden dodatkowy antygen zasadniczo składa się z kombinacji antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy, i antygenu parvowirusa.
14. 14. Zastosowanie kompozycji immunologicznej określonej w zastrz. 1 albo 3 do wytwarzania preparatu do wywoływania reakcji immunologicznej u ssaka podatnego na chorobę z Lyme i co najmniej jednego dodatkowego patogenu ssaków, innego niż Borrelia burgdorferi.
15. 15. Zastosowanie kompozycji immunologicznej określonej w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, do wytwarzania preparatu do wywoływania reakcji immunologicznej u psa.
16. 16. Zastosowanie kompozycji immunologicznej określonej w zastrz.1 albo 2, albo 3, albo 4, do wytwarzania preparatu do wywoływania reakcji immunologicznej u konia.

    PL 190 989 B1
17. 17. Kompozycja według zastrz. 2 albo 4, znamienna tym, że (i) zasadniczo składa się z izolowanego, oczyszczonego antygenu OspA i (ii), że co najmniej jeden dodatkowy antygen jest z patogenu innego niż Borrelia burgdorferi.
18. 18. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 1, znamienna tym, że co najmniej jeden dodatkowy antygen zasadniczo składa się z kombinacji antygenu wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa.
19. 19. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 3, znamienna tym, że co najmniej jeden dodatkowy antygen obejmuje kombinację antygenu wścieklizny, antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa.
20. 20. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 3, znamienna tym, że co najmniej jeden dodatkowy antygen obejmuje kombinację antygenu psiej zarazy, antygenu adenowirusa, antygenu koronawirusa, antygenu paragrypy i antygenu parvowirusa.
21. 21. Kompozycja immunologiczna według zastrz. 3, znamienna tym, że (ii) zasadniczo składa się z wektora wyrażającego co najmniej jeden dodatkowy antygen.
22. 22. Zastosowanie kompozycji immunologicznej określonej w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, do wytwarzania preparatu do wywoływania reakcji immunologicznej u kota.
23. 23. Kompozycja immunologiczna jak określona w zastrz. 1, 2, 3, lub 4, znamienna tym, że dodatkowo zawiera wzmacniający immunogenność adiuwant.