JPH02101023A - オーエスキー病のサブユニットワクチン、及び製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ブタヘルペス１ウィルス（以下ＡＤＶと略称
する）により引き起こされるオーエスキー病のワクチン
として有効なサブユニットワクチン、このサブユニット
ワクチンの製造方法に関するものである。

（発明の背景及び従来の技術） オーエスキー病は、ヘルペスウィルス科のアルファヘル
ペス亜科に属する上記ＡＤＶにより引き起こされる伝染
病であり、ブタをはじめとして、ウシ，ヒツジ．ネコ．
イヌなど多種のホ乳動物が感染する疾病として知られ、
経済的には特に養豚業において、このような疾病に対す
る有効な対策が望まれている。すなわち特に生後２０日
までの子豚は木柄に感染すると死亡率か高く、また妊娠
豚が感染すると流産したり生れた子豚の死亡率が高いた
めである。

従来より、家畜等の種々の疾病に対する対策として、免
疫学的に有効なワクチンは種々開発されその使用か行な
われてきており、上記されるオーエスキー病に対する予
防についても、不活化ワクチンや弱毒生ワクチンが提案
されている。しかしながら木屑に対するこれら従来のワ
クチン投与によっては免疫性の付与について必ずしも充
分な効果が得られていないのが実情である。

（発明が解決しようとする課題） そこで本発明者等は従来において有効な対策が確立され
ていないオーエスキー病の予防について鋭意研究を重ね
て木屑の予防に有効なワクチンを開発するに至ったもの
であり、その目的とするところは、ヘルペスウィルス科
のアルファヘルペス亜科に属するＡＤＶによって引き起
こされるオーエスキー病の予防に有効なサブユニットワ
クチンを提供するところにある。

また本発明の他の目的は、かかるサブユニットワクチン
を効率よく精製して製造することができる方法を提供す
るところにある。

木発明者等が上記目的を達成するに有効な本発明を創成
するに至ったのは次のことによる。

すなわち、従来、ＡＤＶの感染防御や中和に係わる構成
抗原としては、このＡＤＶの膜糖蛋白であるｇ　Ｔｌ＋
あるいはｇ　ｐ５０が重要と考えられており、他方これ
らに比べ、同じ＜ＡＤＶの膜糖蛋白として知られるｇ　
ＩＩは感染防御や中和に係わる抗体を誘導する能力が低
いと考えられていた。

しかしながら、上記ｇ　ＩＩは、単純ヘルペスウィルス
１型（Ｈ３Ｖ−１）の構成抗原である膜糖蛋白のｇＢと
の相同性が指摘され、またこのｇ　ＩＩは抗原変異が少
ないことが知られていることから、このｇＩ＋を適当な
アジュバントと組み合わせることで有効なサブユニット
ワクチンを提供できる可能性があると本発明者等は考え
た。特に上記ｇＢが、Ｈ３Ｖ−１に対する補体依存性の
中和活性を誘導しやすい抗原であることはン主目された
。

このような意図の下で、本発明者等が補体依存でＡＤＶ
の中和活性をもつものとして見出した単クローン抗体に
対する生体の免疫応答性を鋭意研究したところ、その認
識する抗原が上記ｇ　ＩＩであり、したがってｇ　ＩＩ
とｇＢとはその構造的な相同性のみならず機能的な面で
も相同性をもっことが示唆されること、また精製したｇ
　ＩＩを接種した動物の免疫応答によフてその免疫原性
が大変強いことが実験的に確認されることなどから、本
発明をなすに至ったのである。

（課題を解決するための手段） 上記目的を実現する本発明の特徴の一つは、ＡＤＶの構
成抗原であるウィルス膜糖蛋白のｇ　ＩＴを抗原とする
オーエスキー病のサブユニットワクチンを提供するとこ
ろにある。

また本発明の他の特徴は、ＡＤＶ感染細胞を可溶化させ
、これを還元あるいは非還元のｇ　Ｉ＋蛋白に特異的な
単クローン抗体を固定したゲルを充填したカラムを用い
てアフィニティクロマトグラフィーにより該ｇ　ＩＩを
精製することで、上記サブユニットワクチンを効率よく
製造する方法にある。

本発明の上記サブユニットワクチンは、例えばフロイン
トのアジュバント、水酸化アルミニウムゲル、リン酸ア
ルミニウムゲル等のアジュバントと共に対象動物に接種
して免疫させることで、効果的な免疫応答を当該対象動
物に獲得させることができる。

本発明のサブユニットワクチンは、代表的には次の■、
■の方法により製造することができる。

■：ローラボトル等で単層培養した培養細胞、例えば公
知のハムスター胎児腎由来の株化細胞であるＢＨＫ２１
細胞にＡＤＶ　（インデイアナ株）を感染させ、細胞変
性のピークで細胞及び培養上清を集めて、細胞を超音波
処理した後、低速遠心分離し、その上清を超遠心分離し
て集めた沈殿を例えばデキストランＴ−１０等の密度勾
配遠心分離にかけて精製ウィルスを得る。

そしてこの精製ウィルスを、例えば５％トリトンＸ　（
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ）−１００等の界面活性剤及び必要に
応じて更に超音波処理で可溶化し、上記ｇ　Ｉ＋蛋白に
特異的な抗体を固定したゲル充填カラムを用いたアフイ
ニテイクロマトグラフィーにより該ｇ　１１を精製する
。

■二上記■と同様に、ＡＤＶを感染させたＢＨＫ２１細
胞の細胞変性が現われる頃に集め、この細胞を例えば５
％トリトンＸや１％ＮＰ４０等の界面活性剤で可溶化し
、これを超音波処理したものを上記と同様のアフィニテ
イクロマトグラフィーでｇ　Ｉ＋蛋白を精製する。

この■による方法の操作手順の代表的−例は模式的には
次のように示される。

ＡＤＶ感染ＢＨＫ２１細胞の培養 ↓ 感染後例えば４８〜７２時間の細胞の収集↓ 例えば１％ＮＰ４０を含む５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐｔ
−ｒａ、ｅ）に浮遊 ↓ 超音波処理による可溶化 遠心分離 ↓ 上清の回収 ↓ ｇ　ＩＩと特異的に結合する単クローン抗体を固定化し
たゲル充填カラムを用いたアフィニティクロマトグラフ
ィーによるｇ　ＩＩ蛋白の精製回収 この方法■による操作は、上記■の操作に比べてより多
くのｇ　ＩＩ蛋白が得られる特徴がある。

（発明の効果） 以上のような本発明のｇ　ＩＩ蛋白を抗原とするサブユ
ニットワクチンによれば、このｇ　ＩＩ蛋白が、補体存
在下での中和活性が高い抗体を誘導しやすい抗原である
ことから、オーエスキー病に対する効果的な感染防御を
確立することができるという効果がある。

また特に、適当なアジュバントと組み合わせて対象動物
にこれを接種する場合には、微量のワクチンを１回接種
するだけの場合にも、このｇ　Ｉ＋蛋白がもつ高い免疫
原性によって優れた防御効果の獲得が得られ、オーエス
キー病の予防ワクチンとしてその効果は極めて大きいも
のがある。

（実施例） 以下本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明がこ
の実施例に限定されるものでないことは言うまでもない
。

［サブユニットワクチンの製造］ 抗原材料の調製 培養面積１１００ｃｍ２のローラボトル３本に、ＢＨＫ
２１細胞（ハムスター胎児腎由来の株化細胞）を単層培
養し、これにＡＤＶのインデイアナ株を感染させ、３７
℃で４８時間培養した。培養後ラバーポリスマンで感染
細胞をガラス壁より剥離し、４℃、１５００ｒｐｍで１
０分間遠心し、遠心後、上清を除去して沈殿の細胞を回
収し、この細胞に体積で３倍量の非イオン性界面活性剤
の１％ＮＰ４０を含む５０ｍ１Ｊｔ−リス塩酸（ｐＨａ
、ｅ）を（約３　ｍ　ｆｔ　／　１木）加えて可溶化し
、水中で２分間超音波をかけ、更に１００００　ｒｐｍ
で２０分間遠心して上清を得た。

この上清を抗原材料とした。

サブユニットワクチンの車前製 まず精製したＡＤＶでＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを免疫
し、そこから、常法により得られたいくつかのＡＤＶに
特異的な単クローン抗体のなかで、補対依存で中和活性
を有する単クローン抗体の一つを選び出した。以下この
単クローン抗体を便宜的に１−２１−２ｌ−１７と称す
る。

ＡＤＶのｇ　Ｉ＋蛋白に特異的に結合する上記単クロー
ン抗体（ｌ−２１−１７ｍ八ｂへを産生ずるハイブリト
ーマ細胞（ＩＸＩＯ’個）を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウ
スの腹腔に注射し、２〜３週間後に腹水を回収し、該腹
水中の抗体を、プロティンＡを結合したセファローズ（
ファルマシア社製）の充填カラムを用いて精製し、これ
を精製抗体とした。

次にこの精製抗体を、シアノーゲンブロマイドで活性化
したセファローズ（前出）に共有結合させてカラムに充
填し、上記により調製した抗原材料を該カラムに通して
行なうアフィニティクロマトグラフィーにより、抗原材
料中のｇ　Ｉｆ蛋白を精製した。蛋白量はローラボトル
当たり約０．３ｍｇであった。

この操作により得られたｇ　１１蛋白を試料とし、還元
剤である２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）を加えて
分離し、クマーシー蛋白染色により可視化した（第１図
のＣ参照）。

なお比較のために、上記■の方法で精製した精製ウィル
スをトリトンＸ−１００で可溶化したもの（第１図のＡ
参照）、及び同様に上記■の方法で精製したｇ　ＩＩ蛋
白蛋白を可溶化したもの（第１図のＢ参照）についても
同様の電気永動の操作を行いその結果を第１図に併記し
た。分子量測定の目安には市販（ファルマシア社製）の
分子量マーカーキットを用いて、これを第１図のＭで示
した。

この第１図の電気泳動の結果から次のことが分かる。す
なわちｇ　Ｉ＋蛋白は、分子量約６０．７０．１３０キ
ロダルトンの三つの蛋白が結合したものであり、この精
製により他のウィルス蛋白（第１図のＡに示される）は
殆ど混入せず、ｇ　Ｉ＋蛋白の精製度が極めて高く得ら
れた。

［精製ｇ　１１の評価試験］ 次に上記により精製したｇ　Ｉ＋蛋白を抗原とするサブ
ユニットワクチンの有効性を評価するために免疫試験を
行なった。免疫試験はウサギ（約４ｋｇ）　　（免疫試
験１）、マウス（６〜８週齢）（免疫試験２）、ブタ（
約８０ｋｇ）　　（免疫試験３）を夫々用いた。

免疫試験１ 上記精製したサブユニットワクチン（ｇ　Ｉ＋　）の１
０μｇを抗原として、フロイントの完全アジュバント（
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　八ｄＪｕｖａｎ
ｔ　；ＣＦＡ、デイフコ（ｔ＋ｒｐｃｏ）社製）と共に
ウサギに免疫し、更に８週間後にサブユニットワクチン
の１０μｇをフロイントの不完全アジュバント（Ｉｎｃ
ｏｍｐｌｅｔｅ　　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　　ＡｄＪｕｖａ
ｎｔ；　　Ｉ　　Ｆ　Ａ　　；同）と共にウサギに追加
免疫した。

上記２回の免疫を行なったウサギから、４週間後に採血
してｇ　Ｉ＋抗原吸着プレートに対するＥＬＩＳＡ、及
び中和における抗体価を測定してその結果を下記表１に
示した。

抗体価の判定は、ＥＬＩＳＡにおいては免疫前の血清の
吸光度との差が０．１以上の最高稀釈倍率を示した。中
和においてはウサギ血清を補体として添加し、あるいは
熱処理で失活させた同補体を添加したときウィルス感染
による細胞変性を起こさなかった最高稀釈倍率で示した
。

表１：精製抗原ｇ　Ｉ＋に対するウサギの応答ａ　：　
ｇ　ＩＩ固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡによる抗体
価 ｂ　ウィルス中和価 上記表から分かるように、熱処理で補体を失活させたＶ
ＮＴｂ（Ｃ−）　ｃでは中和活性が低かったが、本例で
は抗原量が少なかったにもかかわらず、非熱処理の補体
を添加した場合には高い中和活性を示していることが分
かる。また中和価はＥＬＩＳＡ価がその指標になること
が分かる。すなわちｇ　Ｉ＋蛋白に対する抗体の殆どが
中和に係っていると推測される。

免疫試験２ 上記精製したサブユニットワクチン（ｇ　１１　）の１
μｇ、１０μｇを上記したＣＦＡと共にマウスに免疫し
、また１０μｇ、１００μｇの精製ウィルスを同様にＣ
ＦＡと共に別のマウスに免疫し、更に２週間後に同じ量
のサブユニットワクチン及び精製ウィルスを上記ＩＦＡ
と共に対応するマウスに追加免疫した。

上記２回の免疫を行なったマウスから、１週間後に夫々
のマウスから採血してｇ　Ｉ＋抗原吸着プレートに対す
るＥＬＩＳＡ、及び中和における抗体価を測定して、そ
の結果を下記表２に示した。抗体価の判定はＥＬＴＳＡ
においては免疫前の血清の吸光度との差が０．１以上の
最高稀釈倍率を示した。中和においてはウサギの補体添
加あるいは熱処理補体添加のときのウィルス感染による
５０％ブラックリダクションの最高稀釈倍率で示した。

表２ 精製抗原ｇ　１１に対するマウスの応答と量（μｇ） ｇ　ＩＩ固相化プレートを用いたＥＬ による抗体価 ＳＡ Ｃ：ウィルス中和価 ：熱処理補体添加（Ｃ−）、 添加（Ｃ＋） 又は非熱処理補体 ：　　ｎｏｔ ｅｓｔｅｄ この表２の結果から分かるように、免疫期間が異なるた
めウサギで見られるほど中和活性は高くないが、上記サ
ブユニットワクチンが補体存在化で高い中和活性を示し
、かつＥＬＩＳＡ価がその指標となることがこの例から
も分かる。

魚１」１１互 上記精製抗原１μｇ、１０μｇのサブユニットワクチン
（ｇ　Ｉ＋　）を上記したＣＦＡ又は水酸化アルミニウ
ムゲルと共にブタに免疫した。更に４週間後に同じ量の
サブユニットワクチンを、ＩＦＡ又は水酸化アルミニウ
ムゲルと共に、対応するブタに追加免疫した。

上記２回の免疫を行なったブタから、２週間後に夫々採
血してｇ　ＩＴ抗原吸着プレートに対するＥＬＩＳＡお
よび中和における抗体価を測定し、その結果を下記表３
に示した。抗体価の判定はＥＬＩＳＡにおいては免疫前
の血清の吸光度との差が０．１以上の最高稀釈倍率を、
中和においてはウサギの補体添加あるいは熱処理補体添
加のときのウィルス感染による細胞変性を起こさなかっ
た最高稀釈倍率で示した。

表３：精製抗原ｇ　１１に対するブタの応答ウィルス中
和価 ：　　ｎｏｔ ｅｓｔｅｄ この表３の結果から分かるように、フロイントのアジュ
バントを用いた場合にはＥＬＩＳＡ価の大きさと相関し
て補体存在下で高い中和活性が観察されたが、水酸化ア
ルミニウムゲルな用いた場合にはウサギの補体添加では
中和活性は殆どなかった。

また上記試験においては、１００μｇのｇ　１１抗原で
免疫された個体より、抗原接種後１週間毎に採血してＥ
ＬＩＳＡ価を調べ、その結果を第２図に示した。

この第２図の結果から、１回免疫でも４週後には１０’
〜１０５の高い抗体価が得られること、いずれのアジュ
バントを用いた場合にも２回免疫後さらに抗体価が上昇
すること、が分かる。

［感染防御］ 次に上記サブユニットワクチンで免疫した動物の感染防
御を評価するために、ＡＤＶの攻撃試験を行なった。

マウスに対する攻撃試験 １群５匹のマウスを、下記表４に示した抗原、量、アジ
ュバントで１回又は２回免疫し、最終免疫後１週日に、
ＡＤＶにより攻撃した（　２５００倍ＴＣｒＤ５０＝　
１５倍ＬＤ５ＱのＡＤＶ）。なお２回免疫の場合はその
間隔を６週間とした。

その結果は下記表４、及び第３図に示した通りであり、
対照の動物は７日目までにすべて死亡したのに対し、水
酸化アルミニウムゲルをアジュバントとして用いて上記
サブユニットワクチン（ｇ　ＩＩ　）を接種した個体群
については、免疫回数や抗原量に応じて生残率は上昇し
、１０ｕｇで２回免疫した個体では完全に防御した。

またサブユニットワクチン（ｇ　ＩＩ　）と共にフロイ
ントのアジュバントを用いた個体群では、１μｇ、１回
の免疫でも完全に防御した。

なおこれら７日日生残していた個体は、全て試験を終了
した１０日目までの生存が確認された。

表４：マウスを用いた攻撃試験における攻撃後７日目の
生残率 ただし上記表中において ＡＨ吐水酸化アルミニウムゲル 上記免疫試験１で用いたウサギ２羽で攻撃試験（５００
０倍ＴＣＩＤ５ｏのＡＤＶ）を行なったところ、非免疫
対照２羽は４日目で死亡したが、免疫群は１２日目で試
験を打ち切るまで生存していた。

また攻撃後１２日目のウサギの血清中の抗体の特徴をイ
ムノプロシトで調べた。すなわちまず精製ウィルスをＳ
ＤＳポリ・アクリルアミドゲル電気泳動し、ニトロセル
ロース膜に転写し、上記ウサギ血清を反応させ、標識抗
ウサギ抗体を続けて反応させた。この結果によるとｇ　
Ｉ＋蛋白のみが反応していることが分かった。ウサギで
このウィルスが増殖していればｇ　Ｉ！蛋白以外の数十
種あるウィルス抗原に対して抗体ができるはずである。

にもかかわらず、またＡＤＶにおいては数十種類の蛋白
があるにもかかわらず上述の結果が得られたことは、個
体に接種されたウィルスが増殖せずに直ちに排除された
可能性を示唆している。

【図面の簡単な説明】

第１図はアフィニティクロマトグラフィーにより得たＳ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像、第２図は本発
明抗原免疫ブタの免疫後の抗体価と時間経過の関係を示
した図、 第３図 は免疫マウス攻撃後の生残率を示した図である。 第２図 ｇｌｌ抗原免疫ブタの抗体価の推移 （初回）免疫後の時間（？ｉ） 第１図 アフィニティ精１ｇ１ｌのＳＤＳポリアクリルアミド３
６Ｔｈ− 一■Ｌ−−−　ター ＢＭ 藺 図 ｇｌｌ免疫マウスの攻撃後の生残率 ２回免疫された動物のみの結果を示す。 表４に対応している。 攻撃後の時間（日数）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ブタヘルペス１ウィルスのウィルス膜糖蛋白である
   ｇIIを抗原とするオーエスキー病のサブユニットワクチ
   ン。 ２、ブタヘルペス１ウィルス感染細胞を界面活性剤及び
   必要に応じて更に超音波処理で可溶化させ、これをｇI
   I蛋白に特異的な単クローン抗体を固定したゲルを用い
   たアフィニティクロマトグラフィーにより精製すること
   を特徴とする上記請求項１に記載したオーエスキー病の
   サブユニットワクチンの製造方法。