JP2022513734A - 口蹄疫ウイルス様粒子抗原及びそのワクチン組成物並びに調製方法及び応用 - Google Patents

口蹄疫ウイルス様粒子抗原及びそのワクチン組成物並びに調製方法及び応用 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を提供する。前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原であり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質から組み立てられて成る。前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、免疫原性が良好で、調製されたワクチンで一回免疫することで、免疫後１４日目にＯ型口蹄疫ウイルスに対する完全な保護を産生でき、産生された抗体力価は商業不活化ワクチンの滴定濃度よりも高く、免疫保護期間が少なくとも１３３日間維持されることができる。本発明は、調製されたワクチン組成物及びその調製方法並びに応用を更に提供する。

Description

本発明は、ウイルス性抗原及び当該抗原の医薬調剤に属する。具体的に、本発明は、口蹄疫ウイルス様粒子抗原及びそれより調製されたワクチン組成物並びにその調製方法及び応用に関する。
口蹄疫（ｆｏｏｔ-ａｎｄ-ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ、ＦＭＤ）は、急性で、接触伝染性が高く、急速に遠距離伝播可能な動物疾患であって、哺乳類動物間で感染性が最も強い疾患であり、その中でも、偶蹄類動物が該疾患にかかる場合、全世界に重大な経済的損失をもたらすことになる。口蹄疫の危害に遭う動物には、牛、羊、豚が含まれる。病原体は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）であり、ｍｉＲＮＡウイルスファミリーの口内炎ウイルスである。当該ウイルスは、７つの血清型(Ａ、Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ l、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２及びＳＡＴ３型)に分けられるが、そのうち、Ｏ型口蹄疫ウイルスが最も広範囲に流行する。遺伝的分類によると、中国では、現在、主に３つの遺伝的トポロジー型（Ｔｏｐｏｔｙｐｅ）のＯ型口蹄疫ウイルスが流行しているが、それぞれＣＡＴＨＡＹ型（中国型）、ＭＥ-ＳＡ型（中東-南アジア型）及びＳＥＡ型（東南アジア型）に属する。ワクチン免疫は、この病気を制御し、家畜を危害から保護するための効果的な措置である。
しかしながら、Ｏ型口蹄疫ウイルス不活化抗原は、抗原性が弱く、既存のＯ型口蹄疫ウイルス不活化ワクチンは、往々にして２回の接種を受けて初めて保護を産生できる。ウイルス様粒子(ＶＬＰs)は、体外及び体内で発現される時に自発的にウイルスシェル構造にパッケージング可能なウイルス様粒子であって、ウイルスと類似したシェル構造を有するが、ウイルス複製能力を持たない偽ウイルスである。ＶＬＰsワクチンは、体が抗感染や抗腫瘍免疫を生み出すよう効果的に刺激できる。ウイルス様粒子に基づいて設計されたワクチンは、比較的理想的なワクチン形態を呈する。しかしながら、現在、Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンの実際応用に関する報道はまだなされていない。
また、中国で流行しているＣＡＴＨＡＹ型変異株は、その抗原に比較的大きな変異が発生し、元のワクチンでは、保護力が明らかに低下し、加えて、自体免疫原性が比較的弱く、動物の体が十分な免疫力を産生するように誘導できない。したがって、理想的な毒株配列をスクリーニングしてウイルス様粒子を調製することは、当面の急務であり、中国が提案する重大な動物疫病を効果的に予防及び管理し、畜産の健全で持続可能な発展を確保するというニーズにも合致する。
従来技術におけるＯ型口蹄疫ウイルス不活化ワクチンの免疫原性が強くないという欠陥を解決するために、本発明は、Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を提供する。前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原であり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質から組み立てられて成る。
前記口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、免疫原性が良好であり、単に１回の接種を受けて口蹄疫ウイルスに対する完全な保護を提供できる。前記口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、安定性が良好であり、４℃で３ヶ月間放置してから、再びリンタングステン酸ネガティブ染色及び電子顕微鏡によって観察したところ、ウイルス様粒子は依然として膨らんで、凝集現象がないことが分かる。
本発明の一実施形態として、本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原において、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ３抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ１抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３又はその縮重配列に示されるようである。
前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、現在の流行株に由来し、現在の流行性野生毒株に対して完全な保護を産生することができる。
本発明は、Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンを更に提供する。前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンは、免疫量の前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原と、薬学的に許容される担体とを含む。
本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンは、接種を受けた後１４日目に１:１２８以上の抗体力価に達することができ、長期間の高抗体力価を維持でき、肥育期間全体に亘って保護を産生することができる。
本発明の一実施形態として、本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンにおいて、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、１６０～２４０μｇ／ｍｌである。
ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、１６０μｇ／ｍｌ、１７０μｇ／ｍｌ、１８０μｇ／ｍｌ、１９０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２１０μｇ／ｍｌ、２２０μｇ／ｍｌ、２３０μｇ／ｍｌ、２４０μｇ／ｍｌから選択され得る。
たとえＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量が僅か１６０μｇ／ｍｌであっても、免疫を受けた後１４日目に１:１２８以上の抗体力価に達することができ、長期間の高抗体力価を維持することができる。
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンにおいて、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、２００μｇ／ｍｌである。
本発明の一実施形態として、本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンにおいて、前記薬学的に許容される担体は、アジュバントを含み、前記アジュバントは、（１）鉱物油、アルミニウムゲルアジュバント、サポニン、アブリジン、ＤＤＡ、（２）油中水型エマルション、水中油型エマルション、水中油中水型エマルション、或いは（３）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体、及びＲＩＢＩアジュバントシステム、ブロック共重合体（Ｂｌｏｃｋ ｃｏ-ｐｏｌｙｍｅｒ）、ＳＡＦ-Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）脂質？アミンアジュバント、大腸菌易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、ムラミルジペプチド、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ２０６、Ｇｅｌアジュバントのうち１つ又は複数を含み、好ましくは、サポニンは、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ-２１、ＧＰＩ-０１００である。
前記アジュバントの含有量は、５％～６０％Ｖ／Ｖであり、好ましくは３０％～６０％Ｖ／Ｖであり、より好ましくは５０％Ｖ／Ｖである。
本発明の一実施形態として、前記薬学的に許容される担体は、薬物、免疫刺激剤、抗酸化剤、界面活性剤、着色剤、揮発性油、緩衝剤、分散剤、推進剤及び防腐剤を含む。前記免疫刺激剤は、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ-ＣＳＦ）及びインターロイキン２（ＩＬ２）を含む。
このような組成物を調製するために、当該技術分野において一般的に周知の方法が使用され得る。
本発明の一実施形態として、本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンにおいて、前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンは、免疫量のＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を更に含む。
本発明に係るワクチンにＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を加えることで、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫和ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫に対して免疫保護を産生することができる。
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンにおいて、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質により組み立てられて成る。
本発明に係るＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、免疫原性が良好で、ワクチン免疫後１４日目に１:１２８以上のＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫抗体力価に達することができる。前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、良好な安定性を有し、４℃で３ヶ月間放置してから、再びリンタングステン酸ネガティブ染色及び電子顕微鏡によって観察したところ、ウイルス様粒子は依然として膨らんで、凝集現象がないことが分かる。
本発明の一実施形態として、本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンにおいて、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ４抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ２抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ３抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ１抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７又はその縮重配列に示されるようである。
本発明の一実施形態として、本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンにおいて、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、１６０～２４０μｇ／ｍｌである。
ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、１６０μｇ／ｍｌ、１７０μｇ／ｍｌ、１８０μｇ／ｍｌ、１９０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２１０μｇ／ｍｌ、２２０μｇ／ｍｌ、２３０μｇ／ｍｌ、２４０μｇ／ｍｌから選択され得る。
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係るＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンにおいて、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、２００μｇ／ｍｌである。
本発明は、また、前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンを調製する方法に関する。前記方法は、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質の遺伝子をそれぞれ増幅し、同一タンデム発現ベクターにクローニングして、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質遺伝子を含有する組換え発現ベクターを得るステップ（１）と、前記ステップ（１）で得られたＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質遺伝子を含有する組換え発現ベクターを宿主形質転換又は形質導入して、前記組換え発現ベクターを含有する組換え体を得るステップ（２）と、前記ステップ（２）で得られた組換え体を培養し、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質をタンデム発現させ、発現された前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質が自己組み立てられて、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を形成するステップ（３）と、前記ステップ（３）で得られた前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を精製、アジュバントを加えて、前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンを得るステップ（４）とを含む。
本発明は、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス的ＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質を発現することにより、安定した自己組み立てられたウイルス様粒子を得ることができ、その免疫効果により豚に対する完全な保護を実現できる。本発明は、Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質をタンデム発現することで、発現された活性タンパク質がＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原に自己組み立てられ、後続の抗原の精製及び分離に有利である。
本発明の一実施形態として、本発明に係る方法において、前記ステップ（１）における前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ３抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ１抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３又はその縮重配列に示されるようであり、前記ステップ（２）における宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉであり、前記ステップ（３）における発現された前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質は、細胞内可溶性タンパク質である。
本発明は、大腸菌発現システムを利用して口蹄疫ウイルス様粒子を製造し、収量が高く、製造コストが低く、免疫原性が良好で、生物学的安全性リスクのないといった利点を有する。本発明によって調製されたウイルス様粒子ワクチン組成物は、Ｏ型口蹄疫に対して保護活性を提供できるだけでなく、既存の商品化された全粒子不活化ワクチンに比べ、迅速に抗体を産生するだけでなく、抗体産生レベルが高く、且つ免疫持続期間が著しく増え、より長い期間の免疫保護を維持できる。
本発明は、また、Ｏ型口蹄疫を予防及び／又は治療する薬物の調製における前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンの応用に関する。
本発明に係る口蹄疫ウイルス感染を予防及び／又は治療する薬物を調製するための投与対象には豚が含まれる。
以下、本発明の実施形態について説明することにする。
定義
「口蹄疫ウイルス」は、ピコルナウイルス科、口蹄疫ウイルス属に属する。当該ウイルスには、Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３（即ち、南アフリカ口蹄疫ウイルス１、２、３型）及びＡｓｉａ１（アジア１型）の７つの血清型があり、各類型間に交差保護反応がなく、各類型内には、さらに、複数の亜類型がある。ウイルスの中心は、約８０００個の塩基からなる一本鎖プラス鎖ＲＮＡであって、感染と遺伝の基礎となる。周囲はタンパク質に包まれて、ウイルスの抗原性、免疫性、血清学的反応能力が決定される。ウイルスカプシドは、対称性のある２０面体である。口蹄疫ウイルスは、偶蹄類動物間伝染性の高い疾患である口蹄疫の病原である。国際獣疫事務局は、口蹄疫を「動物伝染病分類リストのＡ類”のうち第１位に組み入れ、中国は口蹄疫を「入国動物検疫伝染病の第１類」に組み入れ、中国の口蹄疫に対する予防及び治療は、主にワクチン注射接種によってなされており、口蹄疫が発生したものは捕殺される。
「抗原（Ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、体に免疫応答を引き起こさせるように誘導できる物質を指し、即ち、Ｔ／Ｂリンパ球表面の抗原レセプター（ＴＣＲ／ＢＣＲ）により特異的に識別及び結合可能であり、Ｔ／Ｂ細胞を活性化することで、増殖・分化させて、免疫応答産物（感作リンパ球又は抗体）を産生させ、対応する産物と体内外で特異的な結合を引き起こし得る物質を指す。
「ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ-ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、ＶＬＰs）」は、１つ又は複数のウイルス構造タンパク質から組み立てられた粒子であり、ウイルス粒子に類似した外部構造及び抗原性を有するが、ウイルス遺伝子を含まない。
「口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質」：ＦＭＤＶ構造タンパク質前駆体タンパク質Ｐ１は、プロテアーゼ３Ｃにより触媒されて、ＶＰ０、ＶＰ１及びＶＰ３に加工される。これら３つのタンパク質は、二十面体のウイルスカプシドに自己集合する。ＶＰ０タンパク質は、Ｐ１がプロテアーゼ３Ｃにより分解を経た後の中間体であって、ウイルス粒子形成の最後の段階にあり、ＶＰ０は、成熟してＶＰ２とＶＰ４とに分解される。
本発明で使用される用語「ワクチン」及び「ワクチン組成物」とは、口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有する薬物組成物を指し、当該薬物組成物は、口蹄疫に対する豚の免疫反応を誘発、刺激又は増強することができる。
用語「免疫量」とは、「免疫有効量」として理解されるべきであり、免疫保護量又は免疫応答を引き起こす有効量とも称され、レシピエントの体内で免疫応答を効果的に誘導可能な抗原量である。当該量は、健康への悪影響又はその合併症を含む、疾患の徴候又は症状を予防又は改善するのに十分である。前記免疫応答は、診断目的又はその他の試験に十分であり得、或いは、病原体による感染によって引き起こされる不利な健康結果又は合併症を含む、疾患の前兆又は症状の予防に適し得る。体液免疫力又は細胞媒介性免疫或いはその両方とも誘導され得る。免疫原性組成物に対する動物の免疫応答は、例えば、抗体力価の測定やリンパ球増殖分析によって間接的に評価されるか、或いは、野生型毒株でのチャレンジ後の前兆又は症状のモニタリングによって直接評価され得る。当該ワクチンにより提供される保護性免疫力は、例えば、死亡率、発病率の低下、温度数値、被験者の全体的な生理学的状況及び全体的な健康及び表現といった被験者の臨床前兆を測定することによって評価され得る。前記免疫応答は、細胞性及び／又は体液性免疫力の誘導を含み得るが、これらに限定されない。
用語「薬学的に許容される担体」とは、本発明に係るワクチン組成物のうち口蹄疫ウイルス抗原を除く他の全ての成分を指し、生体を刺激せずかつ使用される化合物の生物学的活性及び特性を妨げないベクター又は希釈剤であって、好ましくアジュバントである。用語「アジュバント」とは、アルミニウムゲルアジュバント、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ-２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＧＰＩ-０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＡＬ）といったサポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）、油中水型エマルション、水中油型エマルション、水中油中水型エマルション、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル（alkenyl）誘導体との共重合体から選択される化合物を含み得る。用語「エマルション」は、特に軽質液体パラフィン油（欧州薬局方タイプ）、アルケンのオリゴマー化によって生成されるソプレノイド油（ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｏｉｌ）、例えばスクアラン（ｓｑｕａｌａｎｅ）又はスクワランオイル（squalene oil）、特にイソブテン又はデセン、酸又はアルコールの線状アルキル含有エステル、より特に、植物油、オレイン酸エチル、ジ（カプリル／カプリン酸）ＰＧ、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル又はオレイン酸ＰＧ、分岐鎖脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルに基づく。油は、エマルションを形成するように、乳化剤と組み合わせて使用される。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ）のエステル（例えば無水ソルビタンオレエート）、脂肪族グリコール（ｇｌｙｃｏｌ）のエステル、ポリグリセリン（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ）のエステル、プロピレングリコールのエステル及びオレイン酸のエステル、イソステアリン酸のエステル、リシノール酸のエステル又はヒドロキシステアリン酸のエステルであり、これらは任意選択的にエトキシル化される。また、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロック共重合体、特にＰｌｕｒｏｎｉｃ製品、特にＬ１２１である。Ｈｕｎｔｅｒ等によって書かれた「Ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔｓ（アジュバントの理論と実際の応用）」（DES Stewart-Tull編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９９５：５１-９４）及び、Ｔｏｄｄ等によって書かれた「Ｖａｃｃｉｎｅ（ワクチン）」（１９９７、１５：５６４-５７０）を参照し得る。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ＭとＮｅｗｍａｎ Ｍとによって書かれた「Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ, ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｉｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ（ワクチン設計、サブユニット及びアジュバントアプローチ）」（プレナムプレス、１９９５）の第１４７ページに記述されて
いるＳＰＴエマルション及び第１８３ページに記述されているＭＦ５９エマルションを使用し得る。用語「アクリル酸又はメタクリル酸の重合体」は、好ましくは、架橋されたアクリル酸又はメタクリル酸重合体、特に糖（ｓｕｇａｒ）のポリアルケニルエーテル又はポリオールと架橋され、これら化合物は、カルボマー（Ｃａｒｂｏｍｅｒ、商品名Ｃａｒｂｏｐｏｌ）と称されて知られている（Ｐｈａｍｅｕｒｏｐａ、１９９６、８(２)）。当業者は、さらに、米国特許ＵＳ２９０９４６２を参照し得るが、該特許には、この種のアクリル酸重合体が記載されているが、該アクリル酸重合体は、ポリヒドロキシル化された化合物と架橋され、前記化合物は、少なくとも３つのヒドロキシル基、好ましくは８つ未満のヒドロキシル基を有し、そのうち少なくとも３つのヒドロキシル基の水素原子は、少なくとも２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカル（ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｒａｄｉｃａｌ）に取って代わる。好ましい基は、それら２つ乃至４つの炭素原子を含有する基、例えば、ビニル基、アリル基及びその他のエチレン性不飽和基（ｅｔｈｙｌｅｎｉｃａｌｌｙ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）である。前記不飽和基自体は、メチル基といった他の置換基を含み得る。これらの製品は、カーボポール（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）という名義で販売されており、特に適している。それらは、アリルスクロース又はペンタエリトリトールアリルエーテル（ａｌｌｙｌ ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）と架橋される。そのうち、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐが言及され得、最も好ましくは、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７１Ｐが使用される。用語「無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体」としては、無水マレイン酸とエチレンとの共重合体ＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）が考慮され得る。これらの重合体は水に溶解されて酸性溶液を生成し、中和を経て、好ましくは生理学的ｐＨに中和させて、免疫原性、免疫原性又はワクチン性組成物自体を混入可能なアジュバント溶液を生成するようにする。用語「アジュバント」は、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉbｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ブロック共重合体（Ｂｌｏｃｋ ｃｏ-ｐｏｌｙｍｅｒ）（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＳＡＦ-Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）脂質－アミンアジュバント、大腸菌易熱性エンテロトキシン（組換え又はその他）、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、ムラミルジペプチド、Ｇｅｌアジュバント等を更に含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記アジュバントは、鉱物油、アルミニウムゲルアジュバント、サポニン、油中水型エマルション、水中油型エマルション、水中油中水型エマルション、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル（ａｌｋｅｎｙｌ）誘導体との共重合体、ＲＩＢＩアジュバントシステム、ブロック共重合体（Ｂｌｏｃｋ ｃｏ-ｐｏｌｙｍｅｒ）、ＳＡＦ-Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）脂質－アミンアジュバント、大腸菌易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、ムラミルジペプチド、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ２０６或Ｇｅｌアジュバントのうち１つ又は複数を含む。
「縮重配列」：分子生物学において、同一アミノ酸が２つ以上のコドンを有する現象をコドン縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）と称され、このような配列は縮重配列と呼ばれる。
「遺伝子組換え」：異なる性質を制御する遺伝子の組換えを指す。現代の遺伝子工学技術は、試験管内で人工設計に従って、組換えＤＮＡとしても知られている遺伝子組換えを実施する。その目的は、個々の細胞内のゲンを異なる性質を持つ別の個々の細胞内のＤＮＡ分子に移して、遺伝子変異を引き起こすことである。ドナーからの標的遺伝子がレシピエント細菌に移入された後、遺伝子産物の発現を行うことができ、したがって通常の方法では得にくい製品が得られる。
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、外来ＤＮＡの自動取得又は人工供給により、細胞又は培養されたレシピエント細胞が新しい遺伝的表現型を得るようにすることを指す。
「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」とは、ウイルスが感染された（ドナー）細胞から放出されて再び別の（レシピエント）細胞を感染させた時に、ドナー細胞とレシピエント細胞の間で発生されるＤＮＡ転移及び遺伝子組換えを指す。
用語「予防及び／又は治療」は、口蹄疫ウイルス感染に言及する場合、口蹄疫ウイルスの複製を抑制すること、口蹄疫ウイルスの伝播を抑制すること、或いは口蹄疫ウイルスがその宿主体内で定着するのを防止すること、及び口蹄疫ウイルス感染の疾患又は病症の症状を軽減させることを指す。
以下では、具体的な実施例と併せて本発明をさらに説明することにする。本発明の利点及び特徴は、説明とともにより明確になるだろう。但し、これらの実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲に対するいかなる制限も構成しない。当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本発明の技術方案の詳細及び形態を修正又は置き換え得るが、これらの修正及び置き換えは、本発明の保護範囲に収まることを理解すべきである。
本発明の実施例で使用される化学試薬は、いずれも分析用グレードであり、中国国家医薬集団（シノファームグループ）から購入されている。
本発明をより理解しやすくするために、以下では、具体的な実施例と併せて本発明をさらに記述することにする。本発明に係る実験方法は、特に明記しない限り、いずれも従来の方法である。記載される生物材料は、特に明記しない限り、いずれも商業的ルートから入手され得る。
実施例
材料及び方法
ベクターの構築及び形質転換
ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１遺伝子を含有する組み換えベクターｐＥＴ２８ａ-ＶＰ０-ＶＰ３-ＶＰ１
ジーンウィズ（ＧＥＮＥＷＩＺ）社により合成された配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるＶＰ０遺伝子断片、配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２に示されるＶＰ３遺伝子断片、配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３に示されるＶＰ１遺伝子断片をそれぞれｐＢＬＵＥ-Ｔ Ｖｅｃｔｏｒベクターと連結させ、連結に成功した組換えクローンをそれぞれＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｈｏ Ｉで消化し、酵素消化を経て得られた断片を同じ酵素で消化したｐＥＴ２８ａベクターに連結させる。
連結産物をＣａＣｌ2で調製されたＤＨ５αコンピテントセルに形質転換させ、カナマイシン耐性の固体ＬＢ培地に塗布し、シングルコロニーがはっきりと見えることになった時、シングルコロニーを、カナマイシンを含有するＬＢ液体培地に選び取り、３７℃、２３０回転／分で１２時間一晩培養して、組換えプラスミドｐＥＴ２８a-ＶＰ０-ＶＰ３-ＶＰ１を抽出する。
上記のＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１遺伝子が挿入されている組換えプラスミドｐＥＴ２８a-ＶＰ０-ＶＰ３-ＶＰ１を、カルシウムによって調製された４０μlのコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換させ、カナマイシン耐性の固体ＬＢ培地に塗布し、３７℃で１０～１２時間静置培養して、シングルコロニーがはっきりと見えることになった時、シングルコロニーを４ｍｌのカナマイシン耐性の液体ＬＢ培地の試験管に選び取り、３７℃、２３０回転／分で１２時間振盪培養し、そこから１ｍｌの菌液を取って-８０℃で凍結乾燥して保存する。
ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１遺伝子を含有する組み換えベクター
ジーンウィズ（ＧＥＮＥＷＩＺ）社により合成された配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるＶＰ４遺伝子断片、配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５に示されるＶＰ２遺伝子断片、配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６に示されるＶＰ３遺伝子断片、配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.７に示されるＶＰ１遺伝子断片で、ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１遺伝子をタンデム発現可能な、組換えプラスミドｐＥＴ２８a-ＶＰ４-ＶＰ２-ＶＰ３-ＶＰ１付き大腸菌発現菌株を構築して、-８０℃で凍結乾燥して保存する。
抗原タンパク質の発現及びＯ型口蹄疫ウイルス様粒子パーティクルの鑑定
ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原及びウイルス様粒子パーティクル
-８０℃から取出組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ-ＶＰ０-ＶＰ３-ＶＰ１付き大腸菌菌種を取り出して、カナマイシン耐性の５０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、２３０回転／分で１２時間振盪培養した後、１ＬのＬＢ液体培地へ転移し、３７℃で培養して、発酵用の種子液を調製する。
使用される発酵槽は、中国上海保興生物会社の５０Ｌ発酵槽である。３０Ｌ培地を調合して発酵槽に入れ、１２１℃で３０分間滅菌する。翌日、５Ｌの種子液を発酵槽に接続させ、培養菌液濃度が、ＯＤ600が約１０前後に達したら、培養温度を２５℃に下げ、４ｇのＩＰＴＧ誘導剤を加えて１２時間培養させる。最終濃度は、約４０（ＯＤ600）であり、発酵槽を取り外し、遠心によって菌体を収集する。
菌体を再懸濁し、ホモジナイザーを利用して８００ｂａｒ圧力で菌体を４回破砕する。１３５００ｒｐｍで４０ｍｉｎ遠心して、上清を取り残し、１５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動によって検出する。硫酸アンモニウム分別沈殿法によりタンパク質を粗精製し、その後、クロマトグラフィー純化を行い、精製後のタンパク質にＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動をかける。
リンタングステン酸ネガティブ染色及び電子顕微鏡によってＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子を観察する。
ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原及びウイルス様粒子パーティクル
-８０℃から組換えプラスミドｐＥＴ２8ａ-ＶＰ４-ＶＰ２-ＶＰ３-ＶＰ１付き大腸菌菌種を取り出して、カナマイシン耐性の５０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、上記のＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原に類似した調製条件に従って培養してから、１ＬのＬＢ液体培地へ転移し、３７℃で培養する。
５０Ｌ発酵槽を使用して、上記のＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原に類似した調製条件に従ってＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原を大規模に発酵及び発現させる。
上記のＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原に類似した調製条件に従って、菌体中のタンデム発現された４つのＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原を分離、精製及び同定する。
リンタングステン酸ネガティブ染色及び電子顕微鏡によってＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子を観察する。
Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成の調製
ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物
調製されたＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原をゆっくりアジュバントに加え、加える過程で絶えず回転速度が８００ｒｐｍである乳化機で１２ｍｉｎ間攪拌し、均一に混ぜて、４℃で保存すると、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物になる。本発明での使用に適したアジュバントは、当業者に知られているアジュバントであり得る。本発明では、アジュバントＩＳＡ ２０６（フランスセピック社）を選んで使用する。
ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原及びＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物
調製されたＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原及びＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を取って、上記のＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物を調製する方法に従ってワクチン組成物を調製する。本発明での使用に適したアジュバントは、当業者に知られているアジュバントであり得る。本発明では、アジュバントＩＳＡ ２０６（フランスセピック社）を選んで使用する。
Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の免疫原性分析
ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の免疫原性
免疫化後の豚血清中の抗体のＥＬＩＳＡ抗体レベルによってワクチン組成物中の抗原の免疫原性を検出する。
Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原及び抗体がいずれも陰性である体重４０ｋｇ前後の健康で感染しやすい肉つきのいい豚を選び取って、調製されたＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物で免疫する。免疫経路としては、頸部筋肉に２ｍｌ注射し、ブランク対照群は、等量のＰＢＳで免疫する。ワクチン免疫前に各豚に対して採血し、免疫後、それぞれ７日目、１４日目、２１日目、２８日目に採血する。採集された血清に対して、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫抗体ＥＬＩＳＡテストキットを使用して抗体の検出を行う。
ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の免疫持続期間実験
免疫化後の豚血清中の抗体のＥＬＩＳＡ抗体レベルによってワクチン組成物中の抗原の免疫の持続時間を検出する。
Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原及び抗体がいずれも陰性である体重４０ｋｇ前後の健康で感染しやすい肉つきのいい豚を選び取って、調製されたＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物で免疫する。免疫経路としては、頸部筋肉に２ｍｌ注射し、ブランク対照群は、等量のＰＢＳで免疫し、いずれも一回免疫し、ワクチン免疫前に各豚に対して採血し、免疫後、それぞれ２１日目、２８日目、３５日目、７７日目、１０５日目、１３３日目に採血する。
商品化された不活化ワクチン（O／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０株+O／ＧＸ／０９-７株）免疫群を対照群とする。免疫経路としては、頸部筋肉に２ｍｌ注射し、そのブランク対照群は、等量のＰＢＳで免疫する。ワクチン免疫前に各豚に対して採血し、免疫後２１日目に採血して、２回目の免疫を行い、２回目の免疫後、それぞれ７日目、１４日目、５６日目、８４日目、１１２日目に採血する。
ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原及びＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物における抗原免疫原性
免疫化後の豚血清中の抗体のＥＬＩＳＡ抗体レベルによってワクチン組成物中の抗原の免疫原性を検出する。
Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原及び抗体がいずれも陰性である体重４０ｋｇ前後の健康で感染しやすい肉つきのいい豚を選び取って、調製されたＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原及びＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物で免疫する。免疫経路としては、頸部筋肉注射に１ｍｌ注射し、対照群は、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物で免疫するか、或いは、ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物で免疫する。免疫経路としては、頸部筋肉に２ｍｌ注射し、ブランク対照群は、２ｍｌのＰＢＳで免疫する。ワクチン免疫前に豚に対して採血し、免疫後、それぞれ７日目、１４日目、２１日目、２８日目に採血する。
実施例１ ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子
抗原タンパク質を発現する菌体を再懸濁し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動で検出する。この時、上清中の３つのタンデム発現されたタンパク質のそれぞれの発現量はいずれも２０％前後である。精製されたタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動にかけたところ、標的タンパク質がいずれも精製及び濃縮されていることを示している。
リンタングステン酸ネガティブ染色及び電子顕微鏡によって観察すると、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫タンパク質によりウイルス様粒子が形成され、かつ形成されたウイルス様粒子は膨らんで、組み立て効率が高くて、凝集現象がないことが分かる。口蹄疫ウイルス様粒子を４℃で３ヶ月間放置してから、再びリンタングステン酸ネガティブ染色及び電子顕微鏡によって観察したところ、ウイルス様粒子は依然として膨らんで、凝集現象がないことが分かる。これは、本発明により選別された配列によって調製された口蹄疫タンパク質が安定したウイルス様粒子を形成したことを示している。
実施例２ ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の調製
調製されたワクチン中の各組成成分の具体的な比率を表１に示す。
Figure 2022513734000001
実施例３ ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物の免疫原性試験
Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原及び抗体がいずれも陰性である体重４０ｋｇ前後の健康で感染しやすい肉つきのいい豚２０匹を選び取ってランダムに４つの群に分け、各群を５匹とする。第１群乃至第３群は、それぞれ本発明の実施例２で調製されたワクチン１、ワクチン２、ワクチン３の免疫群であり、第４群はブランク対照群である。免疫群の免疫経路としては、頸部筋肉に２ｍｌ注射し、対照群に対して等量のＰＢＳで免疫する。
抗体力価の結果は、ワクチン免疫前に全ての豚の抗体が陰性であり、一回免疫後１４日目にいずれも１：１２８以上に達し得ることを示している。ブランク対照群の豚の抗体は陰性であり、変化がなかった。具体的な結果を表２に示す。
Figure 2022513734000002
これは、本発明により調製されたウイルス様粒子は、高レベルの特異的抗体を迅速に形成でき、たとえ抗原の含有量が１６０μｇ／ｍｌであっても、免疫後１４日目にＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫に対して非常に良好な免疫保護役割を果たすことができることを示している。
実施例４ ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を含有するワクチン組成物の免疫原性比較試験
Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原及び抗体がいずれも陰性である体重４０ｋｇ前後の健康で感染しやすい肉つきのいい豚２０匹を選び取ってランダムに４つの群に分け、各群を５匹とする。第５群は、本発明の実施例２で調製されたワクチン２の免疫群であり、第７群は、商品化された不活化ワクチン（O／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０株+O／ＧＸ／０９-７株）免疫群であり、第６群及び第８群は対照群である。第５群の免疫群の免疫経路としては、頸部筋肉に２ｍｌ注射し、第６群の対照群は、等量のＰＢＳで免疫し、いずれも一回免疫し、ワクチン免疫前に各豚に対して採血し、免疫後２１日目、２８日目、３５日目、７７日目、１０５日目、１３３日目に採血する。第７群の免疫群の免疫経路としては、頸部筋肉に２ｍｌ注射し、第８群の対照群は、等量のＰＢＳで免疫し、ワクチン免疫前に各豚に対して採血し、免疫後２１日目に採血して２回目免疫を行い、二回目の免疫後、それぞれ７日目、１４日目、５６日目、８４日目、１１２日目に採血する。
結果は、ワクチン免疫前に全ての豚の抗体がいずれも陰性であり、一回目の免疫後、２１日目に、ワクチン２の免疫群は１:１２８以上に達し得るのに対して、商品化ワクチン免疫群は、１:１２８に達することができず、商品化ワクチンの免疫群は、二回目の免疫後７日目になって初めて１:１２８に達することができ、ワクチン２の免疫群が一回目の免疫後１３３日目にも依然として比較的高い抗体レベルを維持するのに対して、商品化ワクチン免疫群は、二回目の免疫後１１２日目に抗体レベルが１:１２８免疫保護臨界値に近いことを示している。対照群豚の抗体は陰性であり、変化がなかった。具体的な結果を表３に示す。
Figure 2022513734000003
上記の実験は、本発明によって調製されたウイルス様粒子ワクチン組成物は、商品化全粒子不活化ワクチンに比べ、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原に対して高速に抗体を産生するだけでなく、抗体レベルが高く、単に1回の免疫だけでも非常に良好な免疫保護役割を果たすことができ、かつ免疫持続期間が著しく長くなって、より長い期間の免疫保護を維持できることを示している。
実施例５ ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子
タンパク質抗原を発現する菌体を再懸濁し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動によって検出する。この時、上清中の４つのタンデム発現されたタンパク質のそれぞれの発現量はいずれも２０％前後である。精製されたタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動にかけたところ、標的タンパク質がいずれも精製及び濃縮されていることを示している。
リンタングステン酸ネガティブ染色及び電子顕微鏡で観察すると、ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫タンパク質によりウイルス様粒子が形成され、且つ、形成されたウイルス様粒子は、膨らんで、組み立て効率が高く、凝集現象がないことが分かる。口蹄疫ウイルス様粒子を４℃で３ヶ月間放置してから、再びリンタングステン酸ネガティブ染色及び電子顕微鏡によって観察したところ、ウイルス様粒子は依然として膨らんで、凝集現象がないことが分かる。これは、本発明により選別された配列によって調製された口蹄疫タンパク質が安定したウイルス様粒子を形成したことを示している。
実施例６ Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の調製
調製されたワクチン中の各組成成分の具体的な比率を表４に示す。本実施例では、アジュバントＩＳＡ ２０６（フランスセピック社）を選んで使用する。
Figure 2022513734000004
実施例７ Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の免疫原性試験
Ｏ型口蹄疫ウイルス抗原及び抗体がいずれも陰性である体重４０ｋｇ前後の健康で感染しやすい肉つきのいい豚３０匹を選び取ってランダムに６つの群に分け、各群を５匹とする。第９群乃至第１３群は、それぞれ本発明の実施例６で調製されたワクチン４、ワクチン５、ワクチン６、ワクチン７及び実施例２で調製されたワクチン２の免疫群であり、第１４群はブランク対照群である。第９群、第１０群、第１１群（ワクチン４、ワクチン５、ワクチン６の免疫群）の免疫経路としては、頸部筋肉に１ｍｌ注射する。第１２？（ワクチン７の免疫群）及び第１３群（ワクチン２の免疫群）の免疫経路としては、頸部筋肉に２ｍｌ注射し、対照群は、２ｍｌのＰＢＳで免疫する。ワクチン免疫前に各豚に対して採血し、免疫後それぞれ７日目、１４日、２１日、２８日に採血する。
採集された第９群、第１０群、第１１群、第１３群及び第１４群の血清に対して、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫抗体ＥＬＩＳＡテストキットを使用して関連する抗体の検出を行う。結果は、ワクチン免疫前に全ての豚の抗体がいずれも陰性であり、一回目の免疫後１４日目にいずれも１:１２８以上に達することができ、２価のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の免疫量１ｍｌ（通常の処用量２ｍｌの半分）での抗体レベルが依然として１価のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の免疫量２ｍｌでの抗体レベルに達するか又はそれを超えることを示している。ブランク対照群豚の抗体は、陰性であり、変化がなかった。具体的な結果を表５に示す。
Figure 2022513734000005
採集された第９群、第１０群、第１１群、第１２群及び第１４群の血清に対して、ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫抗体ＥＬＩＳＡテストキットを使用して関連する抗体の検出を行う。結果は、ワクチン免疫前に全ての豚の抗体がいずれも陰性であり、一回目の免疫後１４日目にいずれも１:１２８以上に達することができ、２価のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の免疫量１ｍｌ（通常の処用量２ｍｌの半分）での抗体レベルが依然として１価のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン組成物の免疫量２ｍｌでの抗体レベルに達するか又はそれを超えることを示している。ブランク対照群豚の抗体は陰性であり、変化がなかった。具体的な結果を表６に示す。
Figure 2022513734000006
上記の実験は、本発明によって調製された２価のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子が高レベルの特異的抗体を迅速に形成でき、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫及びＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫に対して非常に良好な免疫保護役割を果たし得ることを示している。同時に、２価のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子が、１価のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子に比べ、より速く、より良く免疫応答を引き起こすことができ、比較的低い免疫用量（通常の用量の半分又は半分未満の用量）で比較的良好な免疫効果を達成できることも示している。
上記は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、いかなる形態においても本発明を限定するものではない。本発明が上記のように好ましい実施例により開示されているが、本発明が限定されることを意図するものではない。この技術分野を熟知している技術者であれば、本発明の技術方案の範囲から逸脱することなく、上記のように開示された技術内容を利用して同等の変更としての等価実施例に変更又は修飾することができるが、本発明の技術方案から逸脱することなしに本発明の技術的実質に基づいて上記の実施例に対して行われた任意の単純な修正、同等の変化及び修飾は依然としてすべて本発明の技術方案の範囲内に属する。

Claims (15)

  1. Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原であって、
    前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原であり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質から組み立てられて成る、Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原。
  2. 前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ３抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ１抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３又はその縮重配列に示されるようである、請求項１に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原。
  3. Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンであって、
    前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンは、免疫量の請求項１から２のいずれか一項に記載のＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原と、薬学的に許容される担体とを含む、Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  4. 前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、１６０～２４０μｇ／ｍｌである、請求項３に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  5. 前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、２００μｇ／ｍｌである、請求項３に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  6. 前記薬学的に許容される担体は、アジュバントを含み、
    前記アジュバントは、（１）鉱物油、アルミニウムゲルアジュバント、サポニン、アブリジン、ＤＤＡ、（２）油中水型エマルション、水中油型エマルション、水中油中水型エマルション、又は（３）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体、及びＲＩＢＩアジュバントシステム、ブロック共重合体（Ｂｌｏｃｋ ｃｏ-ｐｏｌｙｍｅｒ）、ＳＡＦ-Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）脂質－アミンアジュバント、大腸菌易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、ムラミルジペプチド、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ２０６、Ｇｅｌアジュバントのうち１つ又は複数を含み、
    前記アジュバントの含有量は、５％～６０％Ｖ／Ｖである、請求項３に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  7. 前記サポニンは、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ-２１、ＧＰＩ-０１００であり、
    前記アジュバントの含有量は、３０％～６０％Ｖ／Ｖである、請求項６に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  8. 前記アジュバントの含有量は、５０％Ｖ／Ｖである、請求項６に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  9. 前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンは、免疫量のＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を更に含み、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原は、ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質により組み立てられて成る、請求項３に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  10. 前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ４抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ２抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ３抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ１抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７又はその縮重配列に示されるようである、請求項９に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  11. 前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、１６０～２４０μｇ／ｍｌである、請求項９に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  12. 前記ＳＥＡ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原の含有量は、２００μｇ／ｍｌである、請求項９に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチン。
  13. 請求項３に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンを調製する方法であって、
    前記方法は、
    ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質の遺伝子をそれぞれ増幅し、同一タンデム発現ベクターにクローニングして、ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質遺伝子を含有する組換え発現ベクターを得るステップ（１）と、
    前記ステップ（１）で得られたＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質遺伝子を含有する組換え発現ベクターを宿主形質転換又は形質導入して、前記組換え発現ベクターを含有する組換え体を得るステップ（２）と、
    前記ステップ（２）で得られた組換え体を培養し、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質をタンデム発現させ、発現された前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質が自己組み立てられて、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を形成するステップ（３）と、
    前記ステップ（３）で得られた前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子抗原を純化し、アジュバントを加えて、前記Ｏ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンを得るステップ（４）とを含む方法。
  14. 前記ステップ（１）における前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ３抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２又はその縮重配列に示されるようであり、前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ１抗原タンパク質の遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３又はその縮重配列に示されるようであり、前記ステップ（２）における宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉであり、前記ステップ（３）における発現された前記ＣＡＴＨＡＹ型Ｏ型口蹄疫ウイルスＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１抗原タンパク質は、細胞内可溶性タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
  15. Ｏ型口蹄疫を予防及び／又は治療する薬物の調製における、請求項３から１２のいずれか一項に記載のＯ型口蹄疫ウイルス様粒子ワクチンの使用。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111434677B (zh) * 2019-01-15 2022-08-12 普莱柯生物工程股份有限公司 口蹄疫病毒样颗粒抗原、及其疫苗组合物、制备方法和应用
CN114921418B (zh) * 2022-06-23 2023-08-18 金河佑本生物制品有限公司 一株o型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3及试剂盒和检测方法
CN117304277B (zh) * 2023-09-26 2024-03-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒vp4蛋白t细胞表位多肽及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105624124A (zh) * 2014-11-07 2016-06-01 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗o型口蹄疫的疫苗组合物及其制备方法和应用
CN105821011A (zh) * 2015-01-07 2016-08-03 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗o型口蹄疫的疫苗组合物及其制备和应用
CN106148290A (zh) * 2015-04-17 2016-11-23 普莱柯生物工程股份有限公司 口蹄疫病毒样颗粒、制备方法、疫苗组合物和应用
CN106479986A (zh) * 2016-10-31 2017-03-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途
CN106540248A (zh) * 2015-09-21 2017-03-29 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗口蹄疫的疫苗组合物及其制备方法和应用
CN107236747A (zh) * 2017-08-01 2017-10-10 中牧实业股份有限公司 口蹄疫病毒重组病毒样粒子及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107029226B (zh) * 2016-10-31 2020-07-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105624124A (zh) * 2014-11-07 2016-06-01 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗o型口蹄疫的疫苗组合物及其制备方法和应用
CN105821011A (zh) * 2015-01-07 2016-08-03 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗o型口蹄疫的疫苗组合物及其制备和应用
CN106148290A (zh) * 2015-04-17 2016-11-23 普莱柯生物工程股份有限公司 口蹄疫病毒样颗粒、制备方法、疫苗组合物和应用
CN106540248A (zh) * 2015-09-21 2017-03-29 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗口蹄疫的疫苗组合物及其制备方法和应用
CN106479986A (zh) * 2016-10-31 2017-03-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途
CN107236747A (zh) * 2017-08-01 2017-10-10 中牧实业股份有限公司 口蹄疫病毒重组病毒样粒子及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VET RES. (2014) VOL.45, ARTICLE NUMBER: 90, JPN6022028565, ISSN: 0004966216 *
VIRUS GENES. (2012) VOL.44, ISSUE 1, P.80-88, JPN6022028567, ISSN: 0004966218 *
獣医疫学雑誌 (2011) VOL.15, NO.1, P.74-75, JPN6022028566, ISSN: 0004966217 *

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