CN113956335B - 一种o型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法、制备的o型口蹄疫病毒样颗粒抗原及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种O型口蹄疫病毒样颗粒制备方法，该方法将O型口蹄疫病毒VP0基因、VP3基因、VP1基因经重组到pETSUMO载体，与SUMO形成融合蛋白基因，扩增三个融合蛋白基因后，克隆入同一pET28a表达载体，得到重组的表达载体pET28a‑SUMO‑VP0‑SUMO‑VP3‑SUMO‑VP1，将表达载体转化到大肠杆菌中表达融合蛋白，表达的融合蛋白在10U/mL Ulp1蛋白酶浓度条件下，酶切去除SUMO，VP0、VP3、VP1蛋白自我组装形成O型口蹄疫病毒样颗粒。该方法高效制备O型口蹄疫病毒样颗粒，适于产业上大规模生产。

Description

一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法、制备的O型口蹄疫 病毒样颗粒抗原及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和病毒学领域。本发明具体涉及一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法、制备的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原及其应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)为一种急性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病，是哺乳动物中感染性最强的疾病，其中偶蹄类动物染病更会造成全球重大的经济损失。遭受口蹄疫危害的动物包括牛，羊、山羊和猪。致病因子，口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型)，其中O型FMDV流行最为广泛。疫苗免疫是控制此病、保护家畜免受危害的有效措施。传统的疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗，他们虽然具有较好的免疫原性，也确实在FMD的预防和控制中起到了非常重要的作用。但是也存在以下几个缺点：1、病毒必须在高度密封的设备中生产，以防止污染周围环境；生产过程中，病毒有可能没有完全杀死或充分减毒，会导致疫苗中含有高毒性致病物质，进而导致被免疫动物发病而使疾病大规模流行。2、有效期很短，而且常常需要冷冻保存，这增大了疫苗在农村推广使用的难度。3、灭活疫苗免疫与感染FMDV的动物区分不开，限制了动物出口。4、生产依赖于FMDV，所以不能彻底消灭 FMDV。目前使用的灭活疫苗和减毒疫苗防控已不能适应当前畜牧业的健康发展。
病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是一种在体外和/或体内表达时能够自组装成病毒外壳结构的类病毒粒子，它们是具有病毒的相似外壳结构但是不具有病毒复制能力的假病毒。VLPs疫苗能有效地激发机体产生抗感染，抗肿瘤免疫，基于病毒样颗粒设计的疫苗是一种较为理想的疫苗形式，然而病毒样颗粒的组装效率直接影响病毒样颗粒疫苗的免疫效力。
因此，FMDV VLPs的组装和调控机制对于FMDV的相关研究和 FMDV疫苗的生产具有重要的理论和实际指导意义，现实生产中需要对抗原制备中病毒样颗粒组装的效率和影响因素进行研究，以指导工业化生产。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)将O型口蹄疫病毒VP0基因、VP3基因、VP1基因分别重组到不同的pETSUMO 载体，得到重组载体，以所述重组载体为模板，分别扩增 RBS-SUMO-VP0片段、T7-RBS-SUMO-VP3片段和T7-RBS-SUMO-VP1 片段，所述扩增的片段分别酶切，所述酶切的片段依次克隆入同一 pET28a表达载体，得到重组的表达载体pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1；步骤(2)将所述重组表达载体 pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1转化到大肠杆菌，串联表达SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白，纯化所述 SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白；以及步骤(3)将所述纯化的SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白总蛋白浓度调节至1.0mg/mL，在所述SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1 融合蛋白的溶液中添加10U/mL Ulp1蛋白酶，孵育，然后去除酶切产生的SUMO蛋白，得到自我组装的所述O型口蹄疫病毒样颗粒。
本发明通过实验阐明了FMDV VLPs的组装机制，并在此基础上提供了一种用于将FMDV衣壳蛋白或其变体组装成VLPs的方法，即提供了新的制备FMDV VLPs的方法。本发明的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法通过控制SUMO标签的切除速率，进而控制FMDV VLPs的组装进程，从而实现了最好的MDV VLPs的组装效率。
本发明的制备方法选择的串联表达载体还可以是pET28b、pET32a；所述步骤(2)的大肠杆菌还可以是为E.coli BL21(DE3)、Origami B(DE3) pLysS、Rosetta-gami B(DE3)。
根据本发明，大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中所述O型口蹄疫病毒VP0基因如SEQID NO.1或其简并序列所示；所述O型口蹄疫病毒 VP3基因如SEQ ID NO.2或其简并序列所示；以及所述O型口蹄疫病毒VP1基因如SEQ ID NO.3或其简并序列所示。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中所述大肠杆菌的菌株为BL21(DE3)，所述纯化为采用硫酸铵分级沉淀法进行粗纯，随后进行色谱纯化。
本发明通过选择串联表达载体和宿主菌，对VP0、VP3、VP1抗原蛋白进行串联表达，利于后续的抗原分离、纯化，简化了程序。表达、纯化和自我组装成为病毒样颗粒的可溶性蛋白具有生物活性。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤 (2)中在宿主细胞扩增后，加入IPTG，诱导所述蛋白表达。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(3)中所述蛋白溶液为 20mM磷酸氢二钠缓冲液，pH值为7.0-8.0，其中含有0.3-0.5M的 (NH4)2SO4，15℃孵育24h，然后加入镍填料吸附去除SUMO蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(3)中所述蛋白溶液中含有0.5M的(NH4)2SO4，所述蛋白溶液pH为8.0，15℃孵育24h。所述的制备方法制备的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原。
本发明的制备方法通过控制SUMO标签的切除速率，适宜的温度条件下，在特定病毒样颗粒自我组装溶液中，提高了病毒样颗粒的组装效率，病毒样颗粒稳定，该方法可以适用于制备不同血清型的口蹄疫病毒样颗粒。
本发明的制备方法制备的口蹄疫病毒样颗粒，可溶性表达产量高、生产成本低、该口蹄疫病毒样颗粒稳定、免疫原性好、无生物安全风险。
本发明的制备方法还可用于制备A型、Asia1型口蹄疫病毒样颗粒抗原。本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合包含免疫量的所述O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述O型口蹄疫病毒样颗粒含量为 100～200μg/ml。
本发明的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中口蹄疫病毒样颗粒抗原含量可以任意选自100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、 150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml、200μg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，所述O型口蹄疫病毒样颗粒含量为100～150μg/ml。
作为本发明的一种更优选实施方式，所述O型口蹄疫病毒样颗粒含量为150μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂选自：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、 IMS 1314、胞壁酰二肽、MontanideISA206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；优选地，所述佐剂为ISA206 佐剂。
所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选从30％-60％V/V，更优选 50％V/V。
作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体为双相佐剂，所述佐剂含量为5％-60％V/V。
作为本发明的一种优选实施方式，所述佐剂含量为30％-60％V/V。
作为本发明的一种更优选实施方式，所述佐剂含量为50V/V％。
作为本发明的一种优选实施方式，所述双相佐剂是ISA 206佐剂。
作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。
为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗口蹄疫的药物中的应用。
本发明所述的应用中，所述口蹄疫病毒为A型口蹄疫病毒、Asia1 型口蹄疫病毒和/或O型口蹄疫病毒。
本发明所述的制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的药物的施用对象包括猪。
附图说明
图1：纯化后重组FMDV衣壳蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP3和 SUMO-VP1高效液相凝胶过滤色谱(HPSEC)检测结果。
图2：用不同酶活单位的Ulp1处理重组FMDV衣壳蛋白 SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1的蛋白溶液24h，加入镍填料吸附SUMO蛋白后的HPSEC的测定结果。其中，图2A，添加1UUlp1 的HPSEC的测定结果；图2B，添加2U Ulp1的HPSEC的测定结果；图2C，添加5U Ulp1的HPSEC的测定结果；图2D，添加10U Ulp1的 HPSEC的测定结果；图2E，添加20U Ulp1的HPSEC的测定结果。
图3：经5U酶活单位Ulp1蛋白酶处理重组FMDV衣壳蛋白 SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1的蛋白溶液，并加入镍填料吸附SUMO蛋白后DLS检测分析结果。
图4：不同盐离子浓度条件下5U酶活单位Ulp1处理重组FMDV 衣壳蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1的蛋白溶液，并加入镍填料吸附SUMO蛋白后VLPs组装的HPSEC测定结果。其中，图4A，盐离子浓度0.05M(NH4)2SO4；图4B，盐离子浓度0.1M(NH4)2SO4；图4C，盐离子浓度0.2M(NH4)2SO4；图4D，盐离子浓度0.3M (NH4)2SO4；图4E，盐离子浓度0.5M(NH4)2SO4；图4F，盐离子浓度 0.8M(NH4)2SO4；图4G，盐离子浓度1.0M(NH4)2SO4。
图5：不同温度条件下5U酶活单位Ulp1处理重组FMDV衣壳蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1的蛋白溶液，并加入镍填料吸附SUMO蛋白后VLPs组装的HPSEC测定结果。其中，图5A，4℃条件下酶切；图5B，15℃条件下酶切；图5C，25℃条件下酶切；图5D， 30℃条件下酶切。
图6：不同pH值条件下5U酶活单位Ulp1处理重组FMDV衣壳蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1的蛋白溶液，并加入镍填料吸附SUMO蛋白后VLPs组装的HPSEC测定结果。其中，图6A，pH 值6.0条件下酶切；图6B，pH值6.5条件下酶切；图6C，pH值7.0条件下酶切；图6D，pH值7.5条件下酶切；图6E，pH值8.0条件下酶切；图6F，pH值8.5条件下酶切；图6G，pH值9.0条件下酶切。
图7：在各优化条件下FMDV衣壳蛋白VLPs最终组装状态分析。其中，图7A，HPSEC分析结果；图7B，DLS分析结果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
定义
“口蹄疫病毒”属于小RNA病毒科，口疮病毒属，该病毒有O、A、 C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型，各型之间无交叉保护反应，每个类型内又有多个亚型。在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着的蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。口蹄疫病毒是偶蹄类动物高度传染性疾病——口蹄疫的病原，国际兽疫局将口蹄疫列为“A 类动物传染病名单”中的首位，中国把它列为“进境动物检疫一类传染病”，我国对口蹄疫的防治，预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的动物则捕杀。
“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被 T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化 T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。
“病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。
“口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1抗原蛋白”：FMDV结构蛋白前体蛋白P1被蛋白酶3C催化加工成VP0、VP3和VP1，这3种蛋白质能够自我组装成二十面体的病毒衣壳。VP0蛋白是P1经蛋白酶3C裂解后的中间体，在病毒粒子形成的最后阶段，VP0成熟裂解为VP4和VP2。
本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有口蹄疫病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对口蹄疫的免疫反应。
术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除口蹄疫病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation, Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation， Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇 (mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见 Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed. by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和 Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol) (Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利 US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、 Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
“基因重组”：是指控制不同性状的基因重新组合。现代基因工程技术在试管内按人为的设计实施基因重组，也称为重组DNA，目的是将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不同性状的个体细胞内DNA 分子上，使之发生遗传变异。来自供体的目的基因被转入受体细菌后，可进行基因产物的表达，从而获得用一般方法难以获得的产品。
“转化(transformation)”是指通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等。
术语“组装”是指病毒的结构蛋白(例如衣壳蛋白)之间或结构蛋白与核酸之间通过各种相互作用，形成有规则的颗粒状结构的过程，其包括天然病毒颗粒的组装和病毒样颗粒的组装。
根据本发明，宿主细胞的破碎可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。
术语“预防和/或治疗”在涉及口蹄疫病毒感染时是指抑制口蹄疫病毒的复制、抑制口蹄疫病毒的传播或防止口蹄疫病毒在其宿主体内定居，以及减轻口蹄疫病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
术语“SUMO(小泛素相关修饰物)”SUMO标签蛋白是一种小分子泛素相关修饰蛋白，是存在于真核生物中高度保守的参与蛋白质小泛素化相关修饰的一类大蛋白。与GST、MBP或NusA相比，SUMO不仅可以作为重组蛋白表达的融合标签还具备分子伴侣的功能，能促进蛋白的正确折叠，对热和蛋白酶具有耐受性，更有助于保持目的蛋白的稳定性。此外，SUMO标签有着与其配套的蛋白酶(专一性强)，此蛋白酶识别的是SUMO三级结构，切割的特异性极高，不存在任何氨基酸的残留，因此适用于重组蛋白表达。
术语“高效液相凝胶过滤色谱”是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。在高效液相凝胶过滤色谱过程中，蛋白质根据大小不同，在色谱柱中的路径不同而实现分离。
术语“T7”，指T7启动子，启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，T7启动子强大而专一性高，完全专一受控于T7 RNA 聚合酶。
术语“RBS”，核糖体结合位点(ribosomebinding site，简称RBS)，是指mRNA的起始AUG上游约8～13核苷酸处，存在一段由4～9个核苷酸组成的共有序列-AGGAGG-，可被16SrRNA通过碱基互补精确识别的序列。
术语“Ulp1”，指Ubl特异性蛋白酶1(Ubl-specific protease 1,Ulp1)能特异性识别SUMO的空间结构并对其剪切可达到去除融合蛋白中的 SUMO标签的目的,具有SUMO空间结构依赖性。
术语“双相佐剂”，指水包油包水佐剂。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分析化学、生物化学、细胞培养、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
高效液相凝胶过滤色谱检测
采用美国安捷伦的LC1260高效液相色谱层析系统以及TSKGel G4000SWXL柱子进行分子筛层析分析。以2倍柱体积的缓冲液1xPBS 预先平衡层析柱，直至280nm处的吸收值无明显变化。将检测器的吸收值归零，然后由自动进样器进样高效液相检测。
动态光散射测定
使用Malvern公司生产的Zetasizer Nano ZSE型动态光散射仪，使用的算法为Regulation算法。所获得的FMDV VLPs样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。
实施例1重组FMDV衣壳蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP3和 SUMO-VP1的表达
1.1重组质粒的制备和转化
由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表SEQ ID NO.1所示的 O型口蹄疫病毒VP0基因片段、序列表SEQ ID NO.2所示的O型口蹄疫病毒VP3基因片段、序列表SEQ ID NO.3所示的O型口蹄疫病毒VP1 基因片段，分别与pETSUMO载体连接。然后分别以连接成功的重组质粒为模板，扩增含有RBS-SUMO-VP0、T7-RBS-SUMO-VP3和 T7-RBS-SUMO-VP1的片段。分步将经-相应内切酶酶切消化后得到的片段，克隆入同一pET28a表达载体，得到含有SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1的重组质粒。
将连接产物转化到用CaCl2制备的DH5α感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基上，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取重组质粒pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1。
将上述的插入O型口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1基因的重组质粒 pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12 小时至单菌落清晰可见时，挑取单克隆至含卡那霉素的液体LB培养基的试管，37℃，230转/分振荡培养12小时后离心弃去上清，然后加入无菌LB液体培养基重悬菌体并添加终浓度为15％的甘油，震荡混匀后于-80℃保存。
1.2重组蛋白的表达
从-80℃中取出带有重组质粒pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3 -SUMO-VP1的BL21(DE3)大肠杆菌菌种，接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，37℃，230转/分振荡培养12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃培养，制备发酵用种子液。
使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将3L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到OD600值大约10左右时将培养温度降至25℃，加入IPTG 至终浓度为0.5mM诱导培养12小时。发酵密度大约为40左右(OD600) 停止培养，离心收集菌体。
重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体4次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过15％SDS-PAGE电泳检测。采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化。
高效液相凝胶过滤色谱检测纯化后重组衣壳蛋白SUMO-VP0、 SUMO-VP3和SUMO-VP1的状态。测定结果如图1所示。图1显示，纯化后重组衣壳蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1在溶液中呈现单一组分，其保留时间为21.2min，根据标准曲线计算其表观分子量约为115kDa，与由SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1 3种融合蛋白按照1：1：1的比例组成的三元复合物的理论分子量(125kDa) 非常接近。这表明，纯化的重组FMDV衣壳蛋白在溶液中为SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1 3种融合蛋白组成的三元复合物，且SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1的摩尔比约为1：1：1。上述结果说明，纯化后的重组衣壳蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP3和 SUMO-VP1的状态为比例均一的三元复合物，并且无颗粒组分。
实施例2不同酶活单位的Ulp1蛋白酶对衣壳蛋白的组装的影响
2.1不同蛋白酶添加量条件下病毒颗粒的组装
将经过纯化的含有重组FMDV衣壳蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP3 和SUMO-VP1的蛋白溶液稀释至总蛋白浓度为1.0mg/mL，取0.5ml 上述溶液作为一个反应体系，在五个反应体系中分别添加1U、2U、5U、 10U或20U的Ulp1蛋白酶。将各个蛋白样品分别置于4℃孵育24小时，然后加入镍填料吸附SUMO蛋白。处理后，通过高效液相凝胶过滤色谱测定各个反应体系中蛋白的状态。
结果如图2所示，图2A-E分别显示了Ulp1蛋白酶添加量为1U、 2U、5U、10U或20U时酶切，并吸附SUMO蛋白后溶液的高效液相凝胶过滤色谱测定结果。结果显示，通过添加不同用量的Ulp1蛋白酶控制SUMO标签的切除速率，进一步控制FMDV VLPs的组装进程。经过Ulp1蛋白酶的处理，样品呈现出两种不同大小的组份：组装成病毒样颗粒蛋白的组分和未组装成病毒样颗粒蛋白的组分，保留时间分别为 15.2min和22.1min，与实施例1中纯化后未组装的三元复合物蛋白的保留时间21.2min有所区别，这表明SUMO的去除可促使衣壳蛋白形成 VLPs，并且比较图2A-E中保留时间15.2min的峰的面积，可见经过5U Ulp1蛋白酶处理的样品的峰面积最大，组装效率最高，为均一的颗粒。
2.2FMDV衣壳蛋白组装为VLPs的验证
利用动态光散射检测分析2.1中重组FMDV衣壳蛋白SUMO-VP0、 SUMO-VP3和SUMO-VP1经5U酶活单位Ulp1蛋白酶处理、镍填料吸附SUMO蛋白之后的状态。
动态光散射检测结果如图3所示，重组FMDV衣壳蛋白 SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1经Ulp1酶切去除SUMO后，已经形成了直径为26nm左右的颗粒。证明FMDV衣壳蛋白切除SUMO 蛋白后，能够组装为VLPs。
实施例3不同的盐浓度对FMDV VLPs组装的影响
在本实施例中，进一步考察(NH4)2SO4盐浓度对FMDV VLPs组装的影响。具体而言，将未组装的重组FMDV衣壳蛋白SUMO-VP0、 SUMO-VP3和SUMO-VP1加入到含不同浓度(0.05M，0.1M，0.2M， 0.3M，0.5M，0.8M或1.0M)(NH4)2SO4的20mM磷酸氢二钠(pH7.4) 缓冲液中，加入5U Ulp1蛋白酶，并于4℃孵育24小时，然后加入镍填料吸附SUMO蛋白。处理后，高效液相凝胶过滤色谱检测，观察不同盐离子浓度对FMDV VLPs组装的影响。
结果如图4所示，上述不同的盐离子浓度条件下的实验结果分别对应于图4A-G。计算峰面积，结果显示，不同的盐离子浓度影响FMDV VLPs的组装，达到一定的离子强度：0.3M-0.5M，FMDV VLPs组装效率较好，低于0.3M衣壳蛋白主要是较大的聚集体的形式，高于0.5M 溶液中的衣壳蛋白主要为未组装的单体形式。
实施例4不同温度对FMDV VLPs组装的影响
将5U的Ulp1蛋白酶添加至重组FMDV衣壳蛋白SUMO-VP0、 SUMO-VP3和SUMO-VP1溶液中，然后将其分别置于4℃、15℃、25℃和30℃四种温度下孵育24h。高效液相凝胶过滤色谱对不同温度获得的病毒样颗粒蛋白进行测定，以分析FMDV衣壳蛋白颗粒的组装效率。
结果如图5所示，上述不同的温度条件下的实验结果分别对应于图 5A-D。计算峰面积，结果显示，不同温度影响FMDV衣壳蛋白的最终组装率，且存在最优的温度，即15℃孵育条件下，组装效率最高。
实施例5不同pH值对FMDV VLPs组装的影响
在本实施例中，进一步考察缓冲液pH值(pH值6.0-9.0)对FMDV VLPs组装的影响。具体而言，将未组装的重组FMDV衣壳蛋白 SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1加入到含0.5M(NH4)2SO4，不同pH值：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的20mM磷酸氢二钠缓冲液中，加入5UUlp1蛋白酶，并于15℃孵育24小时，然后加入镍填料吸附SUMO蛋白。处理后，高效液相凝胶过滤色谱对不同pH值获得的病毒样颗粒蛋白进行测定，观察不同pH值对FMDV VLPs组装的影响。
结果如图6所示，上述不同的pH条件下的实验结果分别对应于图6A-G。计算峰面积，结果显示，不同pH值影响FMDV VLPs的组装，酸性pH值条件下(pH值6.0和6.5)，FMDVVLPs几乎未组装，当 pH值为7.0-8.0时，FMDV VLPs明显组装，且组装效率较高，当pH值大于8.0，组装效率开始下降。上述结果说明，FMDV VLPs组装的最佳 pH值范围为7.0-8.0。
实施例6FMDV衣壳蛋白最终组装状态
根据上述实施例条件优化结果，将重组FMDV衣壳蛋白 SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1蛋白溶液(20mM磷酸氢二钠缓冲液)在5U/0.5ml Ulp1蛋白酶，0.5M(NH4)2SO4，pH值为8.0的溶液中，15℃下孵育24小时，然后加入镍填料吸附SUMO蛋白，从而得到FMDV VLPs的最终组装状态。使用高效液相凝胶过滤色谱分析和动态光散射分析方法对FMDV VLPs的颗粒性进行研究。
6.1高效液相凝胶过滤色谱分析
结果如图7A所示，FMDV VLPs的保留时间为15.2min。
6.2动态光散射测定
测量结果见图7B。结果显示，FMDV VLPs在溶液中为组分单一的、水化分子动力学直径为26nm的颗粒。
上述实验结果表明，经条件优化后的组装的FMDV VLPs的颗粒呈现典型的FMDVVLPs病毒样颗粒形态。
实施例7O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的制备
取实施例6制备的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原缓缓加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为含O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂为双相佐剂 (水包油包水乳剂)，例如可以是佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。具体配比见表1。
表1 O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物成分配比
组分 疫苗1 疫苗2 疫苗3
口蹄疫抗原(μg/ml) 100 150 200
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％ 50％
实施例8含O型口蹄疫病毒样颗粒抗原的疫苗组合物的免疫原性试验
选取O型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪20头，随机分为4组，每组5头。1-3组分别免疫本发明实施例7制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫组，第4组为空白对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，空白对照组注射等量的PBS。
抗体效价结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第14日均能达到1:128以上。空白对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表2。
表2 O型口蹄疫ELISA抗体水平
表明本发明制备的病毒样颗粒免疫后能快速形成高水平的特异性抗体，能对O型口蹄疫起到很好的免疫保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法、制备的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原
及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 909
<212> DNA
<213> O型口蹄疫病毒(O foot and mouth disease virus)
<400> 1
ggtgctggtc agtcttctcc gaccaccggt tctcagaacc agtctggtaa caccggttct 60
atcatcaaca actactacat gcagcagtac cagaactcta tggacaccca gctgggtgac 120
aacgctatct ctggtggttc taacgaaggt tctaccgaca ccacctctac ccacaccaac 180
aacacccaga acaacgactg gttctctaaa ctggctaaca ccgctttctc tggtctgttc 240
ggtgctctgc tggctgacaa aaaaaccgaa gaaaccaccc tgctggaaga ccgtatcctg 300
accacccgta acggtcacac cacctctacc acccagtctt ctgttggtgt tacctacggt 360
tacgctaccg ctgaagactt cgtttctggt ccgaacacct ctggtctgga aacccgtgtt 420
gttcaggctg aacgtttctt caaaacccac ctgttcgact ggggtaccaa cgactctttc 480
ggtcgttgcc acctgctgga actgccgacc gaccacaaag gtgtttacgg ttctctgacc 540
gactcttacg cttacatgcg taacggttgg gacgttgaag ttaccgctgt tggtaaccag 600
ttcaacggtg gttgcctgct ggttgctatg gttccggaac tgcgttctat caccaaacgt 660
gaactgtacc agctgaccct gttcccgcac cagttcatca acccgcgtac caacatgacc 720
gctcacatca ccgttccgta cctgggtgtt aaccgttacg accagtacaa agttcacaaa 780
ccgtggaccc tggttgttat ggttgttgct ccgctgaccg ttaacaacga aggtgctccg 840
cagatcaaag tttacgctaa catcgctccg accaacgttc acgttgctgg tgaactgccg 900
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<210> 2
<211> 660
<212> DNA
<213> O型口蹄疫病毒(O foot and mouth disease virus)
<400> 2
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accgctgacc cggtttacgg taaagttttc aacccgccgc gtaacctgct gccgggtcgt 120
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acctctttca actacggtgc tatcaaagct gctcgtgtta ccgaactgct gtaccgtatg 540
aaacgtgctg aaacctactg cccgcgtccg ctgctggcta tccagccgtc taccgctcgt 600
cacaaacaga aaatcgttgc tccggctaaa cag 633

Claims (4)

1.一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法，其中，所述制备方法包括：
步骤(1)将O型口蹄疫病毒VP0基因、VP3基因、VP1基因分别重组到不同的pETSUMO载体，得到重组载体，以所述重组载体为模板，分别扩增RBS-SUMO-VP0片段、T7-RBS-SUMO-VP3片段和T7-RBS-SUMO-VP1片段，所述扩增的片段分别酶切，所述酶切的片段依次克隆入同一pET28a表达载体，得到重组的表达载体pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1；
步骤(2)将所述重组表达载体pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1转化到大肠杆菌，串联表达SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白，纯化所述SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白；以及
步骤(3)将所述纯化的SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白总蛋白浓度调节至1.0mg/mL，在所述SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白的溶液中添加10U/mL Ulp1蛋白酶，孵育，然后去除酶切产生的SUMO蛋白，得到自我组装的所述O型口蹄疫病毒样颗粒，
其中，所述步骤(1)中所述O型口蹄疫病毒VP0基因如SEQ ID NO.1或其简并序列所示；
所述O型口蹄疫病毒VP3基因如SEQ ID NO.2或其简并序列所示；以及
所述O型口蹄疫病毒VP1基因如SEQ ID NO.3或其简并序列所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中所述大肠杆菌的菌株为BL21(DE3)，所述纯化为采用硫酸铵分级沉淀法进行粗纯，随后进行色谱纯化。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(3)中所述蛋白溶液为20mM磷酸氢二钠缓冲液，pH值为7.0-8.0，其中含有0.3-0.5M的(NH4)2SO4，15℃孵育24h，然后加入镍填料吸附去除SUMO蛋白。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述步骤(3)中所述蛋白溶液中含有0.5M的(NH4)2SO4，所述蛋白溶液pH为8.0，15℃孵育24h。
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