CN117586360A - 胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物及其应用 - Google Patents

胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及兽药领域，具体提供胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物及其应用。抗原蛋白组合物包括ApxIA截短蛋白、ApxIIA截短蛋白和ApxIIIA截短蛋白；ApxIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；ApxIIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；ApxIIIA截短蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。该组合物具有良好的免疫原性和广谱性，便于生产制备。

Description

胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物及其应用
技术领域
本发明涉及兽药领域，涉及一种胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物及其应用。
背景技术
猪胸膜肺炎(Porcine pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia，APP)引起的猪的一种高度致死性呼吸道传染病，临床症状包括高烧、咳嗽和流鼻涕。
胸膜肺炎放线杆菌属于巴氏杆菌科放线杆菌属，为革兰氏阴性球杆菌。根据APP表面荚膜和脂多糖抗原性的差异，可将其分为15个血清型，不同血清型间交叉保护性低。在我国流行的血清型有1、2、3、4、5、7、8、9、10，而1、2、4、5、7型为我国流行的优势血清型。
目前，疫苗接种是预防APP感染的一个非常重要的措施，然而，本病的病原菌血清型和毒力因子众多，不同血清型间没有或仅有微弱的交叉保护，因此研制高效广谱的基因工程亚单位疫苗是预防控制此病的难点和关键。
APP能够产生多种毒力因子，包括溶血外毒素(Apx)、外膜蛋白、脂多糖、转铁结合蛋白、荚膜、菌毛等，其中Apx被认为是 APP最重要的毒力因子。与此同时，Apx也是APP主要的免疫原。但是由于细菌的毒素蛋白，分子量一般比较大，往往在100kDa以上，人工重组表达纯化往往比较困难，不是不表达、产量低就是形成包涵体，影响免疫原性，且不利于规模化生产。因此，基于毒素蛋白结构域和功能域分析，进行疫苗构建表达策略设计，使其既保留蛋白的免疫原性，又利于表达纯化就至关重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物。
本发明的第二目的在于提供编码上述胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物的DNA片段。
本发明的第三目的在于提供上述胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物的应用。
本发明的第四目的在于提供一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗组合物。
为实现上述目的，本发明提出技术方案如下：
一种胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物，包括ApxIA截短蛋白、ApxIIA截短蛋白和ApxIIIA截短蛋白；
ApxIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
ApxIIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
ApxIIIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
编码上述胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物的DNA片段。
进一步地，编码ApxIA截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
编码ApxIIA截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
编码ApxIIIA截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
上述胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物在制备预防胸膜肺炎放线杆菌感染的药物中的应用。
一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗组合物，包括药学上可接受的载体和本发明的胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物。
进一步地，ApxIA截短蛋白、ApxIIA截短蛋白和ApxIIIA 截短蛋白的质量比为1:1:1。
进一步地，ApxIA截短蛋白的含量为≥50μg/ml，优选为50～200μg/ml；
优选地，ApxIIA截短蛋白的含量为≥50μg/ml，优选为 50～200μg/ml；
优选地，ApxIIIA截短蛋白的含量为≥50μg/ml，优选为 50～200μg/ml。
进一步地，药学上可接受的载体包括佐剂、冻干保护剂、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂中的至少一种；
优选地，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、 IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的至少一种；
皂苷优选为Quil A、QS-21、GPI-0100；
佐剂含量为5％-60％V/V，优选为30％-60％V/V，更优选为 50％V/V；
佐剂优选地为双相佐剂；
优选地，冻干保护剂选自糖、多元醇、聚合物、表面活性剂、盐、胺或氨基酸。
优选地，免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子或白介素2。
进一步地，所述亚单位疫苗组合物的剂型选自溶液型注射剂、混悬型注射剂、注射用粉末、缓释微球制剂、控释微球制剂或缓控释植入剂，优选为溶液型注射剂、混悬型注射剂或注射用粉末，进一步优选为溶液型注射剂或混悬型注射剂。
进一步地，所述亚单位疫苗组合物的给药方式选自皮下注射给药、口服给药、口腔给药、舌下给药、鼻腔给药、肺部给药、结肠给药、直肠给药或透皮给药，优选为皮下注射给药。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
通过利用生物信息学软件对胸膜肺炎放线杆菌的ApxIA、 ApxIIA和ApxIIIA蛋白的结构域、功能域以及疏水性进行分析和预测，分别构建不同长度的截短表达蛋白，通过构建策略和表达条件优化获得可溶性蛋白，通过与特异性抗血清的反应性以及动物评价判断其免疫原性，最终获得兼具可溶性表达和广谱保护效果的抗原蛋白组合物。
本发明提供的抗原蛋白组合物在APP所有血清型高度同源，且包含3种毒素成分，可同时涵盖不同血清型APP菌株的毒素组合范围，因此能够对不同血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌提供交叉保护。
具体实施方式
下面，对本申请的具体实施方式进行详细的说明。
发明人经试验筛选得到胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物，包括ApxIA截短蛋白、ApxIIA截短蛋白和ApxIIIA截短蛋白，其中， ApxIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；ApxIIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；ApxIIIA截短蛋白氨基酸序列如 SEQID NO.6所示。
SAQKAGEYIVTKELKADVKVLKEVVKTQDISVGKTCSE KLEYRDYELSPFELGNGIRAKDELHSVEEIIGSNRKDKFFGSRFTDIF HGAKGDDEIYGNDGHDILYGDDGNDVIHGGDGNDHLVGGNGND RLIGGKGNNFLNGGDGDDELQVFEGQYNVLLGGAGNDILYGSDG TNLFDGGVGNDKIYGGLGKDIYRYSKEYGRHIIIEKGGDDDTLLLS DLSFKDVGFIRIGDDLLVNKRIGGTLYYHEDYNGNALTIKDWFKE GKEGQNNKIEKIVDKDGAYVLSQYLTELTAPGRGINYFNGLEEKL YYGEGYNALPQLRKDIEQIISSTGAFTGDHGKVSVGSGGPLVYNNSANNVANSLSYSLAQAA(SEQ ID NO.2)。
DAFEGGQHQSYDSSVQLDNKNGIINISNTNRKTQSVLFR TPLLTPGEENRERIQEGKNSYITKLHIQRVDSWTVTDGDASSSVDF TNVVQRIAVKFDDAGNIIESKDTKIIANLGAGNDNVFVGSSTTVID GGDGHDRVHYSRGEYGALVIDATAETEKGSYSVKRYVGDSKALH ETIATHQTNVGNREEKIEYRREDDRFHTGYTVTDSLKSVEEIIGSQF NDIFKGSQFDDVFHGGNGVDTIDGNDGDDHLFGGAGDDVIDGGN GNNFLVGGTGNDIISGGKDNDIYVHKTGDGNDSITDSGGQDKLAF SDVNLKDLTFKKVDSSLEIINQKGEKVRIGNWFLEDDLASTVANY KATNDRKIEEIIGKGGERITSEQVDKLIKEGNNQISAEALSKVVNDY NTSKDRQNVSNSLAKLISPVGSFTSSSDFRNNLGTYVPSSIDVSNNI QLARAA(SEQ ID NO.4)。
MSTWSSMLADLKKRAEEAKRQVKKGYDVTKNGLQYG VSQAKLQALAAGKAVQKYGNKLVLVIPKEYDGSVGNGFFDLVKA AEELGIQVKYVNRNELEVAHKSLGTADQFLGLTERGLTLFAPQLD QFLQKHSKISNVVGSSTGDAVSKLAKSQTIISGIQSVLGTVLAGINL NEAIISGGSELELAEAGVSLASELVSNIAKGTTTIDAFTTQIQNFGKL AENAKGLGGVGRQLQNISGSALSKTGLGLDIISSLLSGVTRSFALR NKNASTSTKVAAGFELSNQVIGGITKAVSSYILAQRLRAGLSTTGP AAALIASSISLAISPLAFLRVADNFNRSKEIGEFAERFKKLGYDGDK LLSEFYHEAGTIDASITTISTALSAIAAGTAAASA(SEQ ID NO.6)。
上述三种蛋白组合物，保留了ApxIA、ApxIIA和ApxIIIA 的免疫原性，同时减少了三种蛋白的分子量，更有利于人工重组表达，提高蛋白的表达量和质量。此外，该组合物具有良好的广谱效果，对 1、2、3、4、5、7型血清型均提供良好的保护。
本发明亦保护与上述蛋白组合物相关的生物材料，例如编码三种蛋白的核苷酸片段，含有核苷酸片段的载体(例如克隆质粒和表达质粒等)，含有核苷酸片段的重组细胞。这些生物材料均可作为生物模块直接用于本发明抗原蛋白组合物的生产，具有快速高效的优点。本发明的核苷酸片段可以利用引物从胸膜肺炎放线杆菌中扩增得到，亦可通过人工合成得到，编码ApxIA截短蛋白的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示；编码ApxIIA截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码ApxIIIA截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
TCTGCTCAGAAAGCTGGTGAATACATCGTTACCAAAG AACTGAAAGCTGACGTTAAAGTTCTGAAAGAAGTTGTTAAAAC CCAGGACATCTCTGTTGGTAAAACCTGCTCTGAAAAACTGGAAT ACCGTGACTACGAACTGTCTCCGTTCGAACTGGGTAACGGTATC CGTGCTAAAGACGAACTGCACTCTGTTGAAGAAATCATCGGTTC TAACCGTAAAGACAAATTCTTCGGTTCTCGTTTCACCGACATCT TCCACGGTGCTAAAGGTGACGACGAAATCTACGGTAACGACGG TCACGACATCCTGTACGGTGACGACGGTAACGACGTTATCCACG GTGGTGACGGTAACGACCACCTGGTTGGTGGTAACGGTAACGA CCGTCTGATCGGTGGTAAAGGTAACAACTTCCTGAACGGTGGTG ACGGTGACGACGAACTGCAGGTTTTCGAAGGTCAGTACAACGT TCTGCTGGGTGGTGCTGGTAACGACATCCTGTACGGTTCTGACG GTACCAACCTGTTCGACGGTGGTGTTGGTAACGACAAAATCTAC GGTGGTCTGGGTAAAGACATCTACCGTTACTCTAAAGAATACGG TCGTCACATCATCATCGAAAAAGGTGGTGACGACGACACCCTG CTGCTGTCTGACCTGTCTTTCAAAGACGTTGGTTTCATCCGTATC GGTGACGACCTGCTGGTTAACAAACGTATCGGTGGTACCCTGTACTACCACGAAGACTACAACGGTAACGCTCTGACCATCAAAGAC TGGTTCAAAGAAGGTAAAGAAGGTCAGAACAACAAAATCGAAA AAATCGTTGACAAAGACGGTGCTTACGTTCTGTCTCAGTACCTG ACCGAACTGACCGCTCCGGGTCGTGGTATCAACTACTTCAACGG TCTGGAAGAAAAACTGTACTACGGTGAAGGTTACAACGCTCTG CCGCAGCTGCGTAAAGACATCGAACAGATCATCTCTTCTACCGG TGCTTTCACCGGTGACCACGGTAAAGTTTCTGTTGGTTCTGGTG GTCCGCTGGTTTACAACAACTCTGCTAACAACGTTGCTAACTCTCTGTCTTACTCTCTGGCTCAGGCTGCTTAA(SEQ ID NO.1)。
GACGCTTTCGAAGGTGGTCAGCACCAGTCTTACGACT CTTCTGTTCAGCTGGACAACAAAAACGGTATCATCAACATCTCT AACACCAACCGTAAAACCCAGTCTGTTCTGTTCCGTACCCCGCT GCTGACCCCGGGTGAAGAAAACCGTGAACGTATCCAGGAAGGT AAAAACTCTTACATCACCAAACTGCACATCCAGCGTGTTGACTC TTGGACCGTTACCGACGGTGACGCTTCTTCTTCTGTTGACTTCAC CAACGTTGTTCAGCGTATCGCTGTTAAATTCGACGACGCTGGTA ACATCATCGAATCTAAAGACACCAAAATCATCGCTAACCTGGGT GCTGGTAACGACAACGTTTTCGTTGGTTCTTCTACCACCGTTATC GACGGTGGTGACGGTCACGACCGTGTTCACTACTCTCGTGGTGA ATACGGTGCTCTGGTTATCGACGCTACCGCTGAAACCGAAAAA GGTTCTTACTCTGTTAAACGTTACGTTGGTGACTCTAAAGCTCT GCACGAAACCATCGCTACCCACCAGACCAACGTTGGTAACCGT GAAGAAAAAATCGAATACCGTCGTGAAGACGACCGTTTCCACA CCGGTTACACCGTTACCGACTCTCTGAAATCTGTTGAAGAAATC ATCGGTTCTCAGTTCAACGACATCTTCAAAGGTTCTCAGTTCGA CGACGTTTTCCACGGTGGTAACGGTGTTGACACCATCGACGGTA ACGACGGTGACGACCACCTGTTCGGTGGTGCTGGTGACGACGTT ATCGACGGTGGTAACGGTAACAACTTCCTGGTTGGTGGTACCGG TAACGACATCATCTCTGGTGGTAAAGACAACGACATCTACGTTC ACAAAACCGGTGACGGTAACGACTCTATCACCGACTCTGGTGGT CAGGACAAACTGGCTTTCTCTGACGTTAACCTGAAAGACCTGACCTTCAAAAAAGTTGACTCTTCTCTGGAAATCATCAACCAGAAAG GTGAAAAAGTTCGTATCGGTAACTGGTTCCTGGAAGACGACCTG GCTTCTACCGTTGCTAACTACAAAGCTACCAACGACCGTAAAAT CGAAGAAATCATCGGTAAAGGTGGTGAACGTATCACCTCTGAA CAGGTTGACAAACTGATCAAAGAAGGTAACAACCAGATCTCTG CTGAAGCTCTGTCTAAAGTTGTTAACGACTACAACACCTCTAAA GACCGTCAGAACGTTTCTAACTCTCTGGCTAAACTGATCTCTCC GGTTGGTTCTTTCACCTCTTCTTCTGACTTCCGTAACAACCTGGG TACCTACGTTCCGTCTTCTATCGACGTTTCTAACAACATCCAGCT GGCTCGTGCTGCTTAA(SEQ ID NO.3)。
ATGTCTACCTGGTCTTCTATGCTGGCTGACCTGAAAA AACGTGCTGAAGAAGCTAAACGTCAGGTTAAAAAAGGTTACGA CGTTACCAAAAACGGTCTGCAGTACGGTGTTTCTCAGGCTAAAC TGCAGGCTCTGGCTGCTGGTAAAGCTGTTCAGAAATACGGTAAC AAACTGGTTCTGGTTATCCCGAAAGAATACGACGGTTCTGTTGG TAACGGTTTCTTCGACCTGGTTAAAGCTGCTGAAGAACTGGGTA TCCAGGTTAAATACGTTAACCGTAACGAACTGGAAGTTGCTCAC AAATCTCTGGGTACCGCTGACCAGTTCCTGGGTCTGACCGAACG TGGTCTGACCCTGTTCGCTCCGCAGCTGGACCAGTTCCTGCAGA AACACTCTAAAATCTCTAACGTTGTTGGTTCTTCTACCGGTGAC GCTGTTTCTAAACTGGCTAAATCTCAGACCATCATCTCTGGTAT CCAGTCTGTTCTGGGTACCGTTCTGGCTGGTATCAACCTGAACG AAGCTATCATCTCTGGTGGTTCTGAACTGGAACTGGCTGAAGCT GGTGTTTCTCTGGCTTCTGAACTGGTTTCTAACATCGCTAAAGG TACCACCACCATCGACGCTTTCACCACCCAGATCCAGAACTTCG GTAAACTGGCTGAAAACGCTAAAGGTCTGGGTGGTGTTGGTCGT CAGCTGCAGAACATCTCTGGTTCTGCTCTGTCTAAAACCGGTCT GGGTCTGGACATCATCTCTTCTCTGCTGTCTGGTGTTACCCGTTC TTTCGCTCTGCGTAACAAAAACGCTTCTACCTCTACCAAAGTTG CTGCTGGTTTCGAACTGTCTAACCAGGTTATCGGTGGTATCACC AAAGCTGTTTCTTCTTACATCCTGGCTCAGCGTCTGCGTGCTGGT CTGTCTACCACCGGTCCGGCTGCTGCTCTGATCGCTTCTTCTATC TCTCTGGCTATCTCTCCGCTGGCTTTCCTGCGTGTTGCTGACAAC TTCAACCGTTCTAAAGAAATCGGTGAATTCGCTGAACGTTTCAA AAAACTGGGTTACGACGGTGACAAACTGCTGTCTGAATTCTACC ACGAAGCTGGTACCATCGACGCTTCTATCACCACCATCTCTACC GCTCTGTCTGCTATCGCTGCTGGTACCGCTGCTGCTTCTGCT(SEQ ID NO.6)。
本发明提供的抗原蛋白组合物可以用于制备预防胸膜肺炎放线杆菌感染的相关产品，例如预防感染的疫苗、抗体检测试剂等等。
本发明提供一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗组合物，除了有效成分主要为本发明提供的抗原蛋白组合物外，还可以含有药学上可接受的载体，意在满足实际应用中生产、运输、剂型、给药方式等不同的需求。
在一些实施方式中，亚单位疫苗组合物中含有免疫量的 ApxIA截短蛋白、ApxIIA截短蛋白和ApxIIIA截短蛋白，ApxIA截短蛋白、ApxIIA截短蛋白和ApxIIIA截短蛋白的含量均独立地为≥ 50μg/ml，优选为50～200μg/ml，例如可以但不限于为50μg/ml、55μg/ml、 60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、 95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、 130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml、150μg/ml、155μg/ml、 160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml、175μg/ml、180μg/ml、185μg/ml、190μg/ml、195μg/ml或200μg/ml。
本发明中，猪(传染性)胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物可通过原核表达系统来制备，也可通过真核表达系统、细胞表达系统或化学合成方法来制备。
对本发明中相关术语进行解释：
术语“猪传染性胸膜肺炎放线杆菌”或“猪胸膜肺炎放线杆菌”是指猪胸膜肺炎放线杆菌(APP，Actinobacillus pleuropneumoniae) 属于巴氏杆菌科放线杆菌属，为革兰氏染色阴性的小球杆状菌或纤细的小杆菌，有的呈丝状，并可表现为多形态性和两极着色性。有荚膜，无芽孢，无运动性，有的菌株具有周身性纤细的菌毛。根据APP表面荚膜和脂多糖抗原性的差异，可将其分为15个血清型，最近又报道了新发现的16、17和18型。在我国流行的血清型有1、2、3、4、 5、7、8、9、10，而1、2、4、5、7型为我国流行的优势血清型。APP 的毒力因子很多，包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、溶血外毒素、粘附因子和菌毛等，其中溶血外毒素是引起宿主肺部病变的最主要因素。
术语“猪(传染性)胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxIA蛋白”、“猪(传染性)胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxIIA蛋白”、“猪(传染性)胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxIIIA蛋白”是指猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素，目前为止已经发现猪传染性胸膜肺炎放线杆可以产生4种溶血外毒素，即ApxI、ApxII、ApxIII和ApxⅣ，其中， ApxI、ApxII、ApxIII对于疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变是必需的。如果要产生和分泌具有生物活性的Apx毒素，需要相邻的按一定顺序排列的4个基因，即C、A、B和D。A基因编码结构毒素蛋白，C基因编码激活蛋白，B和D基因编码毒素分泌所必需的、与蛋白质连在一起的膜。
术语“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。
本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌蛋白抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的免疫反应。
术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位蛋白抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。
术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、 QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。
术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squaleneoil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二 -(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practicalapplication ofadjuvants》 (Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,NewYork,1995: 51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccine design,the Subunit and adiuvant approach》(PlenumPress,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。
术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol) (Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical) 取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普 974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。
术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。
术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron, Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine 脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。
在优选的实施方式中，佐剂包括矿物油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI 佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。
术语“冻干保护剂”是指除赋形剂外，给予药物有效成分在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护药物药效的成分。
术语“剂型”是指药物制剂的形态。也指根据药物性质，以及治病和处方的要求制成的药剂(成品药)。合适的剂型是为了发挥药物的最佳疗效，减少毒副作用，以及便于使用、贮存和运输。
术语“注射剂(injection)”是指药物制成的供注入体内的无菌溶液(包括乳浊液和混悬液)以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末或浓溶液，可以是注射水针剂(溶媒为水)、注射油针剂(溶媒为油)；尚有用其它溶媒的注射剂，如乙醇(氢化可的松注射液的溶媒就是乙醇)、甘油、丙二醇(PEG)等。
术语“注射用粉末”是指在无菌环境下将药液冷冻，将原料药“掺”在某些辅料或溶在某些溶媒中，经过一定的加工处理制成不同形式的制剂。
术语“预防”在涉及猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染时是指抑制猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的复制、抑制猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的传播或防止猪传染性胸膜肺炎放线杆菌在其宿主体内定居，以及减轻猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的疾病或病症的症状。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1pCold_APP_ApxIAJD/ApxIIAJD/ApxIIIAJD表达体系的构建
参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(GenBank登录号： X68595.1)的ApxIA基因序列，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(GenBank 登录号：AY736188.1)的ApxIIA基因序列，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(GenBank登录号：L12145.1)的ApxIIIA基因序列，分别对其进行密码子优化，优化后序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9：
优化后ApxIA、ApxIIA和ApxIIIA基因序列送由苏州金唯智生物科技有限公司进行全序列合成，获得包含相应基因密码子优化序列的pUC57-APP-ApxIA/ApxIIA/ApxIIIA质粒。
根据优化后的ApxIA、ApxIIA和ApxIIIA基因序列设计合成寡聚核苷酸引物，扩增ApxIAJD(1116bp，SEQ ID NO.1)、ApxIIAJD (1371bp，SEQ ID NO.3)和ApxIIIAJD(1182bp，SEQ ID NO.5) 区域，引物序列如下：
表1引物序列
以pUC57-APP-ApxIA/ApxIIA/ApxIIIA为模板，使用设计合成的上述引物对扩增ApxIAJD、ApxIIAJD和ApxIIIAJD基因，扩增出的目的基因片段大小为1138bp、1393bp和1204bp。
PCR产物电泳后使用DNA胶回收试剂盒进行纯化，所获得的DNA片段利用Nde I和Xho I双酶切后与相同双酶切处理的pCold 质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆，使用质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒进行测序分析，测序正确的重组质粒命名为pCold_APP_ApxIAJD、pCold_APP_ApxIIAJD和pCold_APP_ApxIIIAJD。
上述阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有50μg卡那霉素的LB培养基中培养过夜，即为 pCold_APP_ApxIAJD、pCold_APP_ApxIIAJD和pCold_APP_ApxIIIAJD表达菌株。
实施例2重组蛋白表达及纯化
将含有实施例1中制备的pCold_APP_ApxIAJD/E.Coli BL21(DE3)、pCold_APP_ApxIIAJD/E.Coli BL21(DE3)和 pCold_APP_ApxIIIAJD/E.Coli BL21(DE3)菌株分别接种到含50-100 μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD600＝0.4-0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1-1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，离心收集菌体。
按每克菌体湿重加10毫升裂解液(20mmol/L Tris缓冲液 (pH值7.0)，0.5mol/LNaCl)的比例重悬菌体，用高压匀质机以800bar 压力破碎菌体3次后离心后收集上清。
向上清液中加入0.02mol/L咪唑，过滤后采用蛋白层析纯化系统进行蛋白亲和层析纯化。层析介质为Ni Sepharose 6Fast Flow，系统流速为90cm/h。上样前层析柱用平衡缓冲液(0.02mol/LTris(pH 值7.0)，0.02mol/L咪唑，0.5mol/L NaCl)进行平衡，上样后用缓冲溶液(0.02mol/L Tris(pH值7.0)，0.05mol/L咪唑，0.5mol/L NaCl) 洗脱杂蛋白，用缓冲溶液(0.02mol/L Tris(pH值7.0)，0.5mol/L咪唑，0.5mol/L NaCl)洗脱目的蛋白，并收集洗脱产物。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，染色后应可见清晰的目的蛋白条带，凝胶经凝胶成像仪扫描，经软件分析目的蛋白的纯度均在85％以上。用BCA法测定蛋白含量猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxIA亚单位蛋白、外毒素ApxIIA亚单位蛋白、外毒素ApxIIIA亚单位蛋白分别为1.4g/L、 1.5g/L、1.4g/L。
实施例3猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗组合物的制备
将实施例2制备得到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外毒素 ApxIA亚单位蛋白、外毒素ApxIIA亚单位蛋白、外毒素ApxIIIA亚单位蛋白加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌 12min，混匀，4℃保存，即为含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌蛋白抗原的亚单位疫苗组合物。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本发明中，选用佐剂为双相佐剂(水包油包水乳剂)，例如可以是佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。制备的疫苗中各组分的具体配比见表2。
表2猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗组合物成分配比
组分 疫苗1 疫苗2 疫苗3
ApxIA(μg/ml) 50 100 200
ApxIIA(μg/ml) 50 100 200
ApxIIIA(μg/ml) 50 100 200
双相佐剂(V/V％) 50％ 50％ 50％
实施例4猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗组合物免疫原性试验
取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、抗体均为阴性的30日龄左右的健康易感仔猪60头，随机分为12组，每组5头。第1组～第3组免疫疫苗1，第4组～第6组免疫疫苗2，第7组～第9组免疫疫苗3，第10组～第12组为对照组。免疫途径为颈部肌肉注射，免疫剂量均为2ml/头，对照组免疫等量的PBS+佐剂。首免后3周按照相同的方式和剂量进行二次免疫。二免后3周，使用各个强毒株进行攻毒评价。
发病判定标准：①试验猪体温升高至40.5℃以上，持续1 日及以上。②试验猪出现精神萎靡/不振，嗜睡，食欲减少，呼吸道症状(咳嗽、气喘或呼吸困难)等临床症状或死亡。③前期死亡猪剖检可见肺部出血，未死亡猪试验结束时(攻毒后14日)剖检肺部可见脓肿等病变。试验猪第①、②项中出现任一项，同时出现第③项判为发病。
免疫组第1组、第4组、第7组，连同条件相同的对照组第10组，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型攻毒菌液，攻毒剂量为1.0×108CFU/头，攻毒后观察14天，对照仔猪5/5发病，疫苗免疫仔猪5/5保护。具体结果见表3。
表3猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型攻毒评价结果
分组 保护率 发病率
第1组 5/5 0/5
第4组 5/5 0/5
第7组 5/5 0/5
第10组 / 5/5
免疫组第2组、第5组、第8组，连同条件相同的对照组第11组，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型攻毒菌液，攻毒剂量为5.0×109CFU/头，攻毒后观察14天，对照仔猪5/5发病，疫苗免疫仔猪5/5保护。具体结果见表4。
表4猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型攻毒评价结果
分组 保护率 发病率
第2组 5/5 0/5
第5组 5/5 0/5
第8组 5/5 0/5
第11组 / 5/5
免疫组第3组、第6组、第9组，连同条件相同的对照组第12组，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型攻毒菌液，攻毒剂量为2.0×109CFU/头，攻毒后观察14天，对照仔猪5/5发病，疫苗免疫仔猪5/5保护。具体结果见表5。
表5猪传染性胸膜肺炎放线杆菌7型攻毒评价结果
由以上结果可见，本发明亚单位疫苗能够对国内流行的血清1型、5型和7型菌株保护率为5/5保护，能够对不同血清型提供良好的保护。
实施例5猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗组合物免疫原性对比试验
取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、抗体均为阴性的30日龄左右的健康易感仔猪15头，随机分为3组，每组5头。第13组免疫疫苗2，第14组免疫商品化的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌三价灭活疫苗(1型、2型和7型)(简称商品灭活疫苗)，第15组为对照组。免疫途径为颈部肌肉注射，免疫剂量均为2ml/头，对照组免疫等量的 PBS+佐剂。首免后3周按照相同的方式和剂量进行二次免疫。二免后3周，使用各个强毒株进行攻毒评价。
发病判定标准：①试验猪体温升高至40.5℃以上，持续1 日及以上。②试验猪出现精神萎靡/不振，嗜睡，食欲减少，呼吸道症状(咳嗽、气喘或呼吸困难)等临床症状或死亡。③前期死亡猪剖检可见肺部出血，未死亡猪试验结束时(攻毒后14日)剖检肺部可见脓肿等病变。试验猪第①、②项中出现任一项，同时出现第③项判为发病。
免疫组第13组、第14组，连同条件相同的对照组第15组，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型攻毒菌液，攻毒剂量为5.0 ×109CFU/头，攻毒后观察14天，对照仔猪5/5发病，疫苗2免疫仔猪5/5保护，商品灭活疫苗免疫仔猪0/5保护。具体结果见表6。
表6猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型攻毒对比评价结果
分组 保护率 发病率
第13组 5/5 0/5
第14组 0/5 5/5
第15组 / 5/5
由以上结果可见，亚单位疫苗能够对不同血清型提供良好的保护；而商品三价灭活疫苗对疫苗血清型以外的不同血清型的攻毒，不能提供保护。
实施例6猪传染性胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗组合物广谱性试验
取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原、抗体均为阴性的30日龄左右的健康易感仔猪30头，随机分为6组，每组5头。第16组～第18组免疫疫苗2，第19组～第21组为对照组。免疫途径为颈部肌肉注射，免疫剂量均为2ml/头，对照组免疫等量的PBS+佐剂。首免后3周按照相同的方式和剂量进行二次免疫。二免后3周，使用各个强毒株进行攻毒评价。
发病判定标准：①试验猪体温升高至40.5℃以上，持续1 日及以上。②试验猪出现精神萎靡/不振，嗜睡，食欲减少，呼吸道症状(咳嗽、气喘或呼吸困难)等临床症状或死亡。③前期死亡猪剖检可见肺部出血，未死亡猪试验结束时(攻毒后14日)剖检肺部可见脓肿等病变。试验猪第①、②项中出现任一项，同时出现第③项判为发病。
免疫组第16组，连同条件相同的对照组第19组，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2型攻毒菌液，攻毒剂量为2.5× 109CFU/头，攻毒后观察14天，对照仔猪5/5发病，疫苗免疫仔猪4/5 保护。具体结果见表7。
表7猪传染性胸膜肺炎放线杆菌2型攻毒评价结果
分组 保护率 发病率
第16组 4/5 1/5
第19组 / 5/5
免疫组第17组，连同条件相同的对照组第20组，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型攻毒菌液，攻毒剂量为2.0× 109CFU/头，攻毒后观察14天，对照仔猪5/5发病，疫苗免疫仔猪5/5 保护。具体结果见表8。
表8猪传染性胸膜肺炎放线杆菌3型攻毒评价结果
分组 保护率 发病率
第17组 5/5 0/5
第20组 / 5/5
免疫组第18组，连同条件相同的对照组第21组，气管注射猪传染性胸膜肺炎放线杆菌4型攻毒菌液，攻毒剂量为1.0× 109CFU/头，攻毒后观察14天，对照仔猪5/5发病，疫苗免疫仔猪4/5 保护。具体结果见表9。
表9猪传染性胸膜肺炎放线杆菌4型攻毒评价结果
分组 保护率 发病率
第18组 4/5 1/5
第21组 / 5/5
由以上结果可见，亚单位疫苗能够对国内流行的血清2型、 3型、4型菌株保护率为4/5～5/5保护，能够对不同血清型提供良好的保护，具有较好的广谱性。
除非另有定义，本申请全文所使用的所有技术和科学术语与本申请所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。如有不一致，以本申请全文中所说明的含义或者根据本申请全文中记载的内容得出的含义为准。另外，本说明中所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。

Claims (10)

1.一种胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物，其特征在于，包括ApxIA截短蛋白、ApxIIA截短蛋白和ApxIIIA截短蛋白；
ApxIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
ApxIIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
ApxIIIA截短蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.编码权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，编码ApxIA截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
编码ApxIIA截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
编码ApxIIIA截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物在制备预防胸膜肺炎放线杆菌感染的药物中的应用。
5.一种胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体和权利要求1所述的胸膜肺炎放线杆菌抗原蛋白组合物。
6.根据权利要求5所述的亚单位疫苗组合物，其特征在于，ApxIA截短蛋白、ApxIIA截短蛋白和ApxIIIA截短蛋白的质量比为1:1:1。
7.根据权利要求5所述的亚单位疫苗组合物，其特征在于，ApxIA截短蛋白的含量为≥50μg/ml，优选为50～200μg/ml；
ApxIIA截短蛋白的含量为≥50μg/ml，优选为50～200μg/ml；
ApxIIIA截短蛋白的含量为≥50μg/ml，优选为50～200μg/ml。
8.根据权利要求5所述的亚单位疫苗组合物，其特征在于，药学上可接受的载体包括佐剂、冻干保护剂、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂中的至少一种；
优选地，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、MontanideISA 206、Gel佐剂中的至少一种；
佐剂含量为5％-60％V/V，优选为30％-60％V/V，更优选为50％V/V；
佐剂优选地为双相佐剂；
优选地，冻干保护剂选自糖、多元醇、聚合物、表面活性剂、盐、胺或氨基酸。
优选地，免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子或白介素2。
9.根据权利要求5所述的亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述亚单位疫苗组合物的剂型选自溶液型注射剂、混悬型注射剂、注射用粉末、缓释微球制剂、控释微球制剂或缓控释植入剂，优选为溶液型注射剂、混悬型注射剂或注射用粉末，进一步优选为溶液型注射剂或混悬型注射剂。
10.根据权利要求5所述的亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述亚单位疫苗组合物的给药方式选自皮下注射给药、口服给药、口腔给药、舌下给药、鼻腔给药、肺部给药、结肠给药、直肠给药或透皮给药，优选为皮下注射给药。
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