CN110467654B

CN110467654B - 口蹄疫病毒样颗粒抗原、其制备的疫苗组合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110467654B
Application number: CN201810451438.XA
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 肖燕; 逄文强; 孙进忠; 张许科
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: CN110467654A

Abstract

本发明提出了一种口蹄疫病毒样颗粒抗原，所述口蹄疫病毒样颗粒抗原由O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白组装而成。本发明还提供了包括免疫量的所述口蹄疫病毒样颗粒抗原的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物及其制备方法和应用。经免疫原性和免疫原性对比试验证明，该口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物具有很好的保护力，能同时防控多种拓扑型O型口蹄疫感染。

Description

口蹄疫病毒样颗粒抗原、其制备的疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域。更具体地，本发明涉及一种口蹄疫病毒样颗粒抗原、其制备的疫苗组合物及其制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)为一种急性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病，是哺乳类动物中感染性最强的疾病，其中偶蹄类动物染病更会造成全球重大的经济损失。遭受口蹄疫危害的动物包括牛、羊和猪。致病因子，口蹄疫病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asia l、SAT1、SAT2和SAT3型)，其中O型口蹄疫病毒流行最为广泛。按遗传分类，我国目前主要流行三种遗传拓扑型(Topotype)的O型口蹄疫病毒，分别属于CATHAY型(中国型)、ME-SA型(中东-南亚型)和SEA型(东南亚型)。疫苗免疫是控制此病、保护家畜免受危害的有效措施。然而，O型口蹄疫各拓扑型之间没有交叉保护作用，目前的单一O型口蹄疫疫苗不能针对多种拓扑型O型口蹄疫病毒提供有效的免疫保护，加之各拓扑型O型口蹄疫交叉或混合感染，使得FMDV不能彻底被消灭。目前使用的疫苗防控已不能适应当前畜牧业的健康发展，迫切需要能同时防控多种拓扑型O型口蹄疫感染的新型疫苗。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种口蹄疫病毒样颗粒抗原，其中，所述口蹄疫病毒样颗粒抗原由O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白组装而成。所述口蹄疫病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，能提供对口蹄疫病毒的完全保护。

本发明还涉及一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物，其中，所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物包括免疫量的所述口蹄疫病毒样颗粒抗原和药学上可接受的载体。

本发明的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物其免疫效力良好，不仅能对东南亚型O型口蹄疫提供保护，还能对中国型O型口蹄疫提供保护。

本发明的另一个目的在于提供制备所述口蹄疫病毒样颗粒抗原的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因克隆到同一载体，所述O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因分别如序列SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示；步骤(2)将所述步骤(1)获得的载体经转化重组获得含有所述VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因的重组质粒；步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述含有VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，串联表达所述VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白；以及步骤(4)分离由所述VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白组装而成的所述口蹄疫病毒样颗粒抗原。

本发明利用大肠杆菌表达系统生产口蹄疫病毒样颗粒，具有产量高、生产成本低、免疫原性好、无生物安全风险等优点。本发明制备的病毒样颗粒疫苗组合物能同时防控多种拓扑型O型口蹄疫感染，不仅对东南亚型O型口蹄疫提供保护活性，还能对中国型O型口蹄疫提供保护活性。并且相比于现有的商品化全病毒灭活苗，不仅抗体产生快，抗体水平高，而且免疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护。

本发明的再一目的在于提供所述口蹄疫病毒样颗粒抗原在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒导致的疾病的药物中的应用。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

本发明涉及一种口蹄疫病毒样颗粒抗原，其中，所述口蹄疫病毒样颗粒抗原由O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白组装而成。

“病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的口蹄疫病毒样颗粒抗原中，所述O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因分别如序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所示。

本发明的口蹄疫病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，其制备的疫苗组合物能对口蹄疫提供完全保护。

本发明还涉及一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物，其中，所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物包括免疫量的所述的口蹄疫病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体。

本发明的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中所包括的口蹄疫病毒样颗粒抗原为口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1的自我装配体，其能提供良好的免疫原性。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有口蹄疫病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对口蹄疫的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中，所述的口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160-240μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中，所述的口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为200μg/ml。

本发明的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中口蹄疫病毒样颗粒抗原含量可以任意选自160μg/ml、165μg/ml、170μg/ml、175μg/ml、180μg/ml、185μg/ml、190μg/ml、195μg/ml、200μg/ml、205μg/ml、210μg/ml、215μg/ml、220μg/ml、225μg/ml、230μg/ml、235μg/ml、240μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体为佐剂；所述佐剂含量为5％-60％V/V，优选从30％-60％V/V，更优选50％V/V。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除口蹄疫病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

作为本发明的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；

优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；

优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其

特别是L121))；

优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；

优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；

优选地，所述佐剂为ISA206佐剂(法国赛比克公司)，其用于制备水包油包水乳剂；

所述佐剂的浓度范围是从5％-60％V/V，优选从30％-60％，更优选50％V/V。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。

作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明还涉及一种制备所述的口蹄疫病毒样颗粒抗原的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因克隆到同一载体，所述O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因分别如序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4所示；步骤(2)将所述步骤(1)获得的载体经转化重组获得含有所述VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因的重组质粒；步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述含有VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，串联表达所述VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白；以及步骤(4)分离由所述VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白组装而成的所述口蹄疫病毒样颗粒抗原。

本发明还涉及所述的口蹄疫病毒样颗粒抗原在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒导致的疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的应用中，所述口蹄疫病毒为东南亚型O型口蹄疫病毒和/或中国型O型口蹄疫病毒。

本发明所述的制备预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的药物的施用对象包括猪。

术语“预防和/或治疗”在涉及口蹄疫病毒感染时是指抑制口蹄疫病毒的复制、抑制口蹄疫病毒的传播或防止口蹄疫病毒在其宿主体内定居，以及减轻口蹄疫病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1口蹄疫病毒样颗粒的表达

1.表达载体的构建

由金唯智公司合成序列表SEQ ID NO.1所示的VP4基因片段、序列表SEQ ID NO.2所示的VP2基因片段、序列表SEQ ID NO.3所示的VP3基因片段、序列表SEQ ID NO.4所示的VP1基因片段，分别与pBLUE-T Vector载体连接，将连接成功的重组克隆分别经BamH I/EcoR I、PstI/XbaI、Sac I/Sal I、Hind III/Xho I酶切消化后得到的片段，与经过相同的酶切的pET28a载体连接，得到插入O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-VP4-VP2-VP3-VP1。将连接好的质粒转化到用CaCl₂制备的DH5α感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基上，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取重组质粒。

2.表达菌株的构建

将上述的插入O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-VP4-VP2-VP3-VP1转化40μl以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可见时，挑取单克隆至含4ml卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃，230转/分振荡培养12小时，从中取1ml菌液于-80℃冻干保存。

3.蛋白的表达及鉴定

从-80℃中取出带有重组质粒pET28a-VP4-VP2-VP3-VP1的大肠杆菌菌种接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，37℃，230转/分振荡培养12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃大量表达，等OD600值达到0.6后，加入0.1mM的IPTG，诱导蛋白表达，20℃过夜。

使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将5L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到OD600大约10左右时将培养温度降至25℃，加入4gIPTG诱导培养12小时。终浓度大约为40左右(OD600)下罐，离心收集菌体。

重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体4次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过15％SDS-PAGE电泳检测，此时上清中四个串联表达的蛋白其各自表达量均在20％左右。采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。

通过磷钨酸负染及电镜观察可见口蹄疫蛋白形成了病毒样颗粒，并且形成的病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置3个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的病毒样颗粒。

实施例2口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的制备

取实施例1制备的病毒样颗粒缓缓加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物。具体配比见表1。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本实施例中，选用佐剂ISA206(法国赛比克公司)。

表1口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物成分配比

	疫苗1	疫苗2	疫苗3
				口蹄疫抗原(μg/ml)	160	200	240
ISA 206佐剂(V/V％)	50％	50％	50％

实施例3口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的免疫原性试验

选取O型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架仔猪20头，随机分为4组，每组5头。1-3组分别为本发明实施例2制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫组，第4组为对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后第21日进行第2次免疫，两次免疫后均分别于第7日、14日、21日采血。

对采集的血清使用东南亚型O型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第14日均能达到1:128以上，2次免疫后第7日均能达到1:720以上。对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表2。

表2东南亚型O型口蹄疫ELISA抗体水平

表明本发明制备的病毒样颗粒能快速形成高水平的特异性抗体，能对东南亚型O型口蹄疫起到很好的免疫保护作用。

同时，对上述采集的血清使用中国型O型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第14日均能达到1:128，2次免疫后第7日均能达到1:720。对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表3。

表3中国型O型口蹄疫ELISA抗体水平

上述结果表明本发明制备的病毒样颗粒能快速形成高水平的特异性抗体，能对中国型O型口蹄疫起到很好的免疫保护作用。

综上可知，本发明制备的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物能同时防控多种拓扑型O型口蹄疫感染，不仅针对东南亚型O型口蹄疫，还同时针对中国型O型口蹄疫起到很好的免疫保护作用，解决了现有疫苗针对不同拓扑型O型口蹄疫病毒交叉或混合感染的保护性较差的问题。

实施例4口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物的免疫原性对比试验

选取O型口蹄疫病毒抗原、抗体均为阴性的体重40kg左右的健康易感架子猪15头，随机分为3组，每组5头。第5组为本发明实施例2制备的疫苗2免疫组，第6组为商品化灭活苗(O/Mya98/XJ/2010株+O/GX/09-7株)免疫组，第7组为对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射2ml，对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头猪采血，免疫后第21日采血并进行第2次免疫，2次免疫后分别于第7日、14日、56日、84日、112日采血。

对采集的血清使用东南亚型O型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第21日疫苗2免疫组能达到1:128以上，商品苗免疫组不能达到1:128；2次免疫后第7日两组均能达到1:128，但疫苗2免疫组抗体水平远高于商品苗免疫组；2次免疫后第112日，疫苗2免疫组依然维持较高的抗体水平，而商品苗免疫组抗体水平接近1:128免疫保护临界值。对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表4。

表4东南亚型O型口蹄疫ELISA抗体水平比较结果

表明本发明制备的病毒样颗粒疫苗组合物与商品化全病毒灭活苗相比，对东南亚型O型口蹄疫不仅抗体产生快，抗体水平高，而且免疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护。

同时，对采集的血清使用中国型O型口蹄疫抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有猪只的抗体均为阴性，1次免疫后第21日疫苗2免疫组能达到1:128以上，商品苗免疫组不能达到1:128；2次免疫后第7日两组均能达到1:128，疫苗2免疫组抗体水平远高于商品苗免疫组；2次免疫后第112日，疫苗2免疫组依然维持较高的抗体水平，而商品苗免疫组抗体水平接近1:128免疫保护临界值。对照组猪只抗体为阴性，无变化。具体结果见表5。

表5中国型O型口蹄疫ELISA抗体水平比较结果

表明本发明制备的病毒样颗粒疫苗组合物与商品化全病毒灭活苗相比，对中国型O型口蹄疫不仅抗体产生快，抗体水平高，而且免疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护。

综上可知，本发明制备的病毒样颗粒疫苗组合物能同时防控多种拓扑型O型口蹄疫感染，不仅对东南亚型O型口蹄疫提供保护活性，还能对中国型O型口蹄疫提供保护活性。并且相比于现有的商品化全病毒灭活苗，不仅抗体产生快，抗体水平高，而且免疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 口蹄疫病毒样颗粒抗原、其制备的疫苗组合物及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 255

<212> DNA

<213> Foot-and-mouth disease virus

<400> 1

ggtgctggtc agtcttctcc ggctaccggt tctcagaacc agtctggtaa caccggttct 60

atcatcaaca actactacat gcagcagtac cagaactcta tggacaccca gctgggtgac 120

aacgctatct ctggtggttc taacgaaggt tctaccgaca ccacctctac ccacaccacc 180

aacacccaga acaacgactg gttctctaaa ctggcttctt ctgctttctc tggtctgttc 240

ggtgctctgc tggct 255

<210> 2

<211> 654

<212> DNA

<213> Foot-and-mouth disease virus

<400> 2

gacaaaaaaa ccgaagaaac caccctgctg gaagaccgta tcctgaccac ccgtaacggt 60

cacaccacct ctaccaccca gtcttctgtt ggtatcaccc acggttacgc taccgctgaa 120

gacttcgttt ctggtccgaa cacctctggt ctggaaaccc gtgttatcca ggctgaacgt 180

ttcttcaaaa cccacctgtt cgactgggtt acctctgacc cgttcggtcg ttaccacctg 240

ctggaactgc cgaccgacca caaaggtgtt tacggttctc tgaccgactc ttacgcttac 300

atgcgtaacg gttgggacgt tgaagttacc gctgttggta accagttcaa cggtggttgc 360

ctgctggttg ctatggttcc ggaactgtgc tctatcgaac gtcgtgaact gttccagctg 420

accctgttcc cgcaccagtt catcaacccg cgtaccaaca tgaccgctca catcaaagtt 480

ccgttcgttg gtgttaaccg ttacgaccag tacaaagttc acaaaccgtg gaccctggtt 540

gttatggttg ttgctccgct gaccgttaac accgaaggtg ctccgcagat caaagtttac 600

gctaacatcg ctccgaccaa cgttcacgtt gctggtgaat tcccgtctaa agaa 654

<210> 3

<211> 660

<212> DNA

<213> Foot-and-mouth disease virus

<400> 3

ggtatcttcc cggttgcttg ctctgacggt tacggtggtc tggttaccac cgacccgaaa 60

accgctgacc cggtttacgg taaagttttc aacccgccgc gtaacatgct gccgggtcgt 120

ttcaccaacc tgctggacgt tgctgaagct tgcccgacct tcctgcactt cgacggtgac 180

gttccgtacg ttaccaccaa aaccgactct gaccgtgttc tggctcagtt cgacctgtct 240

ctggctgcta aacacatgtc taacaccttc ctggctggtc tggctcagta ctacacccag 300

tactctggta ccatcaacct gcacttcatg ttcaccggtc cgaccgacgc taaagctcgt 360

tacatgatcg cttacgctcc gccgggtatg gaaccgccga aaaccccgga agctgctgct 420

cactgcatcc acgctgaatg ggacaccggt ctgaactcta aattcacctt ctctatcccg 480

tacctgtctg ctgctgacta cgcttacacc gcttctggtg ctgctgaaac caccaacgtt 540

cagggttggg tttgcctgtt ccagatcacc cacggtaaag ctgaaggtga cgctctggtt 600

gttctggctt ctgctggtaa agacttcgaa ctgcgtctgc cggttgacgc tcgtcagcag 660

<210> 4

<211> 639

<212> DNA

<213> Foot-and-mouth disease virus

<400> 4

accacctcta ccggtgaatc tgctgacccg gttaccgcta ccgttgaaaa ctacggtggt 60

gaaacccagg ttcagcgtcg tcaccacacc gacgtttctt tcatcctgga ccgtttcgtt 120

aaagttaccc cgaaagactc tatcaacgtt ctggacctga tgcagacccc gccgcacacc 180

ctggttggtg ctctgctgcg taccgctacc tactacttcg ctgacctgga agttgctgtt 240

aaacacaaag gtgacctgac ctgggttccg aacggtgctc cggaagctgc tctggacaac 300

accaccaacc cgaccgctta ccacaaagct ccgctgaccc gtctggctct gccgtacacc 360

gctccgcacc gtgttctggc taccgtttac aacggtaact gcaaatacgc tggtggttct 420

ctgccgaacg ttcgtggtga cctgcaggtt ctggctcaga aagctgcttg gccgctgccg 480

acctctttca actacggtgc tatcaaagct acccgtgtta ccgaactgct gtaccgtatg 540

aaacgtgctg aaacctactg cccgcgtccg ctgctggctg ttcacccgtc tgctgctcgt 600

cacaaacaga aaatcgttgc tccggttaaa cagtctctg 639

Claims

1.一种口蹄疫病毒样颗粒抗原，其特征在于，所述口蹄疫病毒样颗粒抗原由O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白组装而成；

所述O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因分别如序列SEQ ID No. 1、SEQID No. 2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。

2.一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物，其特征在于，所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物包括免疫量的根据权利要求1所述口蹄疫病毒样颗粒抗原以及药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物，其特征在于，所述口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为160-240μg/ml。

4.根据权利要求3所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物，其特征在于，所述口蹄疫病毒样颗粒抗原含量为200μg/ml。

5.根据权利要求4所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为佐剂；所述佐剂含量为5％-60％V/V。

6.根据权利要求5所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂含量为30％-60% V/V。

7.根据权利要求6所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂含量为50％V/V。

8.根据权利要求5所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为佐剂ISA 206。

9.一种制备根据权利要求1所述口蹄疫病毒样颗粒抗原的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤（1）将O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因克隆到同一载体，所述O型口蹄疫病毒VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因分别如序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示；

步骤（2）将所述步骤（1）获得的载体经转化重组获得含有所述VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因的重组质粒；

步骤（3）将所述步骤（2）获得的所述含有VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白的基因的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，串联表达所述VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白；以及

步骤（4）分离由所述VP4、VP2、VP3、VP1抗原蛋白组装而成的所述口蹄疫病毒样颗粒抗原。

10.根据权利要求1所述口蹄疫病毒样颗粒抗原在制备预防和/或治疗口蹄疫病毒导致的疾病的药物中的应用。

11.根据权利要求10所述应用，所述口蹄疫病毒为东南亚型O型口蹄疫病毒和/或中国型O型口蹄疫病毒。