CN106540248B - 一种抗口蹄疫的疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种口蹄疫病毒样颗粒、制备方法、疫苗组合物和应用。本发明的疫苗组合物由口蹄疫病毒结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1构成的O型口蹄疫病毒样颗粒和/或口蹄疫结构蛋白VP0、VP3、VP1构成的亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒和/或口蹄疫结构蛋白VP0、VP3、VP1构成的A型口蹄疫病毒样颗粒和佐剂组成，结构稳定，组分合理，能快速形成特异性抗体，免疫持续期显著增长，能维持长时间的免疫保护。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域，更具体地，本发明涉及口蹄疫病毒样颗粒、制备方法、由该病毒样颗粒制备的疫苗组合物。
背景技术
口蹄疫(FMD)为一种急性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病，是哺乳类动物中感染性最强的疾病，其中偶蹄类动物染病更会造成全球重大的经济损失。遭受口蹄疫危害的动物包括牛、羊、山羊和猪。致病因子，口蹄疫病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2、和SAT3型)，其中我国主要流行O型、Asia1和A型口蹄疫病毒。疫苗免疫是控制此病、保护家畜免受危害的有效措施。
病毒样颗粒(VLPs)是一种在体外和/或体内表达时能够自主包装成病毒外壳结构的类病毒粒子，它们是具有病毒的相似外壳结构但不具有病毒复制能力的假病毒。VLPs疫苗能有效地激发机体产生抗感染，抗肿瘤免疫，基于病毒样颗粒设计的疫苗是一种较为理想的疫苗形式，然而，不同血清型口蹄疫病毒复制能力及病毒稳定性不一，造成制备的口蹄疫病毒样颗粒结构稳定性不一，进而造成活性降低，不能很好的诱导机体产生有效的免疫反应。
此外，口蹄疫病毒易发生变异，尤其是我国流行的O型口蹄疫病毒CATHAY型变异株，其抗原发生较大变异，原有疫苗对其保护力明显下降，加之自身免疫原性较弱，不能诱导动物机体产生足够的免疫力。因此，筛选理想的毒株序列制备病毒样颗粒是当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病，保障畜牧业健康可持续发展的需要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种抗口蹄疫的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含O型口蹄疫病毒样颗粒和/或亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒和/或A型口蹄疫病毒样颗粒和佐剂，其中，O型口蹄疫病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒由亚洲1型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，A型口蹄疫病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1构成。
优选地，本发明提供的O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ ID NO.1，VP2氨基酸序列为SEQ ID NO.2，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.3，VP1氨基酸序列为SEQ IDNO.4。
优选地，本发明提供的O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ ID NO.5，VP2氨基酸序列为SEQ ID NO.6，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.7，VP1氨基酸序列为SEQ IDNO.8。
优选地，本发明提供的O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ ID NO.9，VP2氨基酸序列为SEQ ID NO.10，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.11，VP1氨基酸序列为SEQ IDNO.12。
优选地，本发明提供的O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ IDNO.13，VP2氨基酸序列为SEQ ID NO.14，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.15，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.16。
优选地，本发明提供的O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4氨基酸序列为SEQ IDNO.17，VP2氨基酸序列为SEQ ID NO.18，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.19，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.20。
优选地，本发明提供的亚洲1型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0氨基酸序列为SEQ IDNO.21，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.22，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.23。
优选地，本发明提供的A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0氨基酸序列为SEQ IDNO.24，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.25，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.26。
优选地，本发明提供的A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0氨基酸序列为SEQ IDNO.27，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.28，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.29。
优选地，本发明提供的A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0氨基酸序列为SEQ IDNO.30，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.31，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.32。
术语“预防”指通过其与FMDV相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与FMDV相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
术语“保护性反应”意为在动物中预防FMDV相关疾病或由FMDV导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。
本发明涉及的FMDV蛋白，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明实施方式的蛋白序列包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
“基本上相同”可以理解为本发明的蛋白优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQID NO.1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。
在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝，皂苷(Saponine)(例如QuilA)，阿夫立定，DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，或(3)疫苗可以以水包油，油包水或水包油包水乳剂形式制成。
尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
优选地，本发明选用佐剂ISA 206(法国赛比克公司)，制备水包油包水乳剂。
在最终疫苗组合物中，佐剂的浓度范围是从10％到60％V/V，优选从30％到50％V/V，更优选50％V/V。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由O型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成，所述病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.3，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由O型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成，所述病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.7，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由O型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成，所述病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.10，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.11，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.12。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由O型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成，所述病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO.13，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.14，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.15，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.16。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由O型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成，所述病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO.17，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.18，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.19，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.20。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成，所述病毒样颗粒由亚洲1型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQ ID NO.21，VP3氨基酸序列为SEQ IDNO.22，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.23。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由A型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成，所述病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQ ID NO.24，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.25，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.26。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由A型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成，所述病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQ ID NO.27，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.28，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.29。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由A型口蹄疫病毒样颗粒及佐剂组成，所述病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQ ID NO.30，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.31，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.32。
在一个实施方式中，本发明提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，由O型口蹄疫病毒样颗粒、亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒、A型口蹄疫病毒样颗粒和佐剂组成；
所述O型口蹄疫病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，其中VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，VP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.3，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.4；
所述亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒由亚洲1型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQ ID NO.21，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.22，VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.23；
所述A型口蹄疫病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，其中VP0的氨基酸序列为SEQ ID NO.24，VP3氨基酸序列为SEQ ID NO.25，VP1氨基酸序列为SEQID NO.26。
本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物的制备方法，包括：
(1)制备口蹄疫病毒样颗粒的步骤；
(2)加入佐剂，乳化的步骤。
本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。例如，本发明的组合物还可以包含试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))，抗氧化剂，表面活性剂，着色剂，挥发性油，缓冲剂，分散剂，推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
优选地，本发明疫苗组合物每种病毒样颗粒含量为50-150μg/ml。
更优选地，所述疫苗组合物每种病毒样颗粒含量为100μg/ml。
本发明具有以下突出的优点：
(1)本发明提供的疫苗组合物制备安全，无减毒疫苗、灭活疫苗可能引起的致病作用；
(2)本发明提供的病毒样颗粒结构，口蹄疫的表位被有效呈递在病毒样颗粒的表面，可以很好地刺激B、T细胞，引起免疫应答；
(3)本发明提供病毒样颗粒疫苗的结构在体内血清中的半衰期长，稳定性好，有效期长，持续刺激免疫反应，尤其是O型口蹄疫病毒Ⅰ、Ⅱ病毒样颗粒，为CATHAY型变异株，解决了CATHAY型变异株一直以来免疫原性较差的问题，能很好地对机体提供免疫保护，可以有效应对CATHAY型变异株的侵袭；
(4)本发明提供的疫苗组合物，由结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1构成的O型口蹄疫病毒样颗粒、结构蛋白VP0、VP3、VP1构成的亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒、结构蛋白VP0、VP3、VP1构成的A型口蹄疫病毒样颗粒组成，不仅温度稳定性及酸性环境稳定性增加，而且意外发现，本发明提供的疫苗组合物免疫持续期比由三种结构蛋白VP0、VP3、VP1构成的病毒样颗粒制备的疫苗组合物或由三种结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1构成的病毒样颗粒制备的疫苗组合物显著增长，能维持更长时间的免疫保护。
序列表中：
序列1为O型口蹄疫病毒ⅠVP4蛋白氨基酸序列；
序列2为O型口蹄疫病毒ⅠVP2蛋白氨基酸序列；
序列3为O型口蹄疫病毒ⅠVP3蛋白氨基酸序列；
序列4为O型口蹄疫病毒ⅠVP1蛋白氨基酸序列；
序列5为O型口蹄疫病毒ⅡVP4蛋白氨基酸序列；
序列6为O型口蹄疫病毒ⅡVP2蛋白氨基酸序列；
序列7为O型口蹄疫病毒ⅡVP3蛋白氨基酸序列；
序列8为O型口蹄疫病毒ⅡVP1蛋白氨基酸序列；
序列9为O型口蹄疫病毒ⅢVP4蛋白氨基酸序列；
序列10为O型口蹄疫病毒ⅢVP2蛋白氨基酸序列；
序列11为O型口蹄疫病毒ⅢVP3蛋白氨基酸序列；
序列12为O型口蹄疫病毒ⅢVP1蛋白氨基酸序列；
序列13为O型口蹄疫病毒ⅣVP4蛋白氨基酸序列；
序列14为O型口蹄疫病毒ⅣVP2蛋白氨基酸序列；
序列15为O型口蹄疫病毒ⅣVP3蛋白氨基酸序列；
序列16为O型口蹄疫病毒ⅣVP1蛋白氨基酸序列；
序列17为O型口蹄疫病毒ⅤVP4蛋白氨基酸序列；
序列18为O型口蹄疫病毒ⅤVP2蛋白氨基酸序列；
序列19为O型口蹄疫病毒ⅤVP3蛋白氨基酸序列；
序列20为O型口蹄疫病毒ⅤVP1蛋白氨基酸序列；
序列21为亚洲1型口蹄疫病毒VP0蛋白氨基酸序列；
序列22为亚洲1型口蹄疫病毒VP3蛋白氨基酸序列；
序列23为亚洲1型口蹄疫病毒VP1蛋白氨基酸序列；
序列24为A型口蹄疫病毒ⅠVP0蛋白氨基酸序列；
序列25为A型口蹄疫病毒ⅠVP3蛋白氨基酸序列；
序列26为A型口蹄疫病毒ⅠVP1蛋白氨基酸序列；
序列27为A型口蹄疫病毒ⅡVP0蛋白氨基酸序列；
序列28为A型口蹄疫病毒ⅡVP3蛋白氨基酸序列；
序列29为A型口蹄疫病毒ⅡVP1蛋白氨基酸序列；
序列30为A型口蹄疫病毒ⅢVP0蛋白氨基酸序列；
序列31为A型口蹄疫病毒ⅢVP3蛋白氨基酸序列；
序列32为A型口蹄疫病毒ⅢVP1蛋白氨基酸序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7.4的PBS，配制方法：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。
实施例1
O型口蹄疫病毒Ⅰ病毒样颗粒(VP4、VP2、VP3、VP1)的制备
1.将序列SEQ ID NO.1、2、3、4所示的O型口蹄疫病毒ⅠVP4、VP2、VP3、VP1氨基酸序列所示基因全长由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所合成的基因片段全长分别为255bp、654bp、660bp、639bp。在此人工合成的口蹄疫基因片段的基础上制备本发明的口蹄疫基因的模板。
2.口蹄疫基因表达载体的构建
以前一步骤所合成的口蹄疫基因模板，分别设计引物(见表1)，扩增获得O型口蹄疫病毒ⅠVP4、VP2、VP3、VP1基因。
表1O型口蹄疫病毒Ⅰ引物表
在PCR仪上按如下条件(见表2)进行PCR反应。
表2PCR扩增条件
分别将扩增得到的VP4、VP2、VP3、VP1基因DNA片段分别与pBLUE-T Vector载体连接，将连接成功的重组克隆分别经BamH I/EcoR I、PstI/XbaI、Sac I/Sal I、Hind III/XhoI酶切消化后得到的片段，与经过相同的酶切的pET 28a载体连接，得到插入O型口蹄疫病毒ⅠVP4、VP2、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-Ⅰ-VP4-VP2-VP3-VP1。将连接好的质粒转化到用CaCl2制备的DH5α感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基上，等单克隆菌落清晰可见时，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃230转/分钟，培养12小时过夜，提取质粒。
3.将上述的插入O型口蹄疫病毒ⅠVP4、VP2、VP3、VP1基因的阳性克隆pET28a-Ⅰ-VP4-VP2-VP3-VP1转化40μl以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可见时，挑取单克隆至含4ml卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃，230转/分振荡培养12小时，从中取1ml菌液于-80℃冻干保存。
4.蛋白的大量表达
从-80℃中取出带有重组质粒pET28a-Ⅰ-VP4-VP2-VP3-VP1的大肠杆菌菌种接种卡那霉素抗性的50ml LB液体培养基，37℃，230转/分振荡培养12小时后，转接入1L LB液体培养基中，37℃大量表达，等OD600值达到0.6后，加入0.1mM的IPTG，诱导蛋白表达，20℃过夜。
使用发酵罐为上海保兴生物公司50L发酵罐，配制30L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟。第二天将5L种子液接入发酵罐，培养菌液浓度达到OD600大约10左右时将培养温度降至25℃，加入4gIPTG诱导培养12小时。终浓度大约为40左右(OD600)下罐，离心收集菌体大约2.5kg。
按照1g菌体对应10ml裂解液的比例重悬菌体，采用均质机以800bar压力破碎菌体4次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过15％SDS-PAGE电泳检测，此时上清中的四个串联表达的蛋白表达量在20％左右。采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。
通过磷钨酸负染及电镜观察可见口蹄疫蛋白形成了类病毒样颗粒，并且形成的类病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置4个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列按照四段表达制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的类病毒样颗粒。
实施例2
O型口蹄疫病毒Ⅰ病毒样颗粒(VP0、VP3、VP1)的制备
参照实施例1的方法，按照O型口蹄疫病毒Ⅰ结构蛋白VP0、VP3、VP1基因序列分别设计引物串联表达制备病毒样颗粒。将收集到的菌体按照1g菌体对应10ml裂解液的比例重悬，采用均质机以800bar压力破碎菌体4次。13500rpm，离心40min，留取上清，通过15％SDS-PAGE电泳检测，此时上清中的三个串联表达的蛋白表达量在20％左右。采用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白粗纯，随后进行色谱纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳，显示目的蛋白均得到了纯化和富集。
通过磷钨酸负染及电镜观察可见口蹄疫蛋白形成了类病毒样颗粒，并且形成的类病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置4个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列按照三段表达制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的类病毒样颗粒。
实施例3
亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒(VP0、VP3、VP1)的制备
将序列SEQ ID NO.21、22、23所示的亚洲1型口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1氨基酸序列所示基因按照实施例1的方法分别设计引物串联表达制备病毒样颗粒。
通过磷钨酸负染及电镜观察可见口蹄疫蛋白形成了类病毒样颗粒，并且形成的类病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置4个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列按照三段表达制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的类病毒样颗粒。
实施例4
亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒(VP4、VP2、VP3、VP1)的制备
参照实施例1的方法，按照亚洲1型口蹄疫病毒结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1基因序列分别设计引物串联表达制备病毒样颗粒。
通过磷钨酸负染及电镜观察可见口蹄疫蛋白形成了类病毒样颗粒，并且形成的类病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置4个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列按照四段表达制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的类病毒样颗粒。
实施例5
A型口蹄疫病毒样颗粒(VP0、VP3、VP1)的制备
将序列SEQ ID NO.24、25、26所示的A型口蹄疫病毒VP0、VP3、VP1氨基酸序列所示基因按照实施例1的方法分别设计引物串联表达制备病毒样颗粒。
通过磷钨酸负染及电镜观察可见口蹄疫蛋白形成了类病毒样颗粒，并且形成的类病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置4个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列按照三段表达制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的类病毒样颗粒。
实施例6
A型口蹄疫病毒样颗粒(VP4、VP2、VP3、VP1)的制备
参照实施例1的方法，按照A型口蹄疫病毒结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1基因序列分别设计引物串联表达制备病毒样颗粒。
通过磷钨酸负染及电镜观察可见口蹄疫蛋白形成了类病毒样颗粒，并且形成的类病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置4个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列按照四段表达制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的类病毒样颗粒。
实施例7
抗口蹄疫的疫苗组合物的制备
分别取实施例1、实施例2制备的O型口蹄疫病毒样颗粒、实施例3、实施例4制备的亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒、实施例5、实施例6制备的A型口蹄疫病毒样颗粒，缓缓加入到佐剂中，加的过程不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为抗口蹄疫的疫苗组合物。具体配比见表3，疫苗1为实施例1制备的O型口蹄疫病毒样颗粒、实施例4制备的亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒、实施例6制备的A型口蹄疫病毒样颗粒混合后加入佐剂制备而成，疫苗2为实施例2制备的O型口蹄疫病毒样颗粒、实施例3制备的亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒、实施例5制备的A型口蹄疫病毒样颗粒混合后加入佐剂制备而成，疫苗3、疫苗4、疫苗5为实施例1制备的O型口蹄疫病毒样颗粒、实施例3制备的亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒、实施例5制备的A型口蹄疫病毒样颗粒混合后加入佐剂制备而成。适用于本发明的佐剂可以为本领域技术人员公知的佐剂。在本实施例中，选用佐剂ISA 206(法国赛比克公司)。
表3抗口蹄疫的疫苗组合物成分配比
| 疫苗1 | 疫苗2 | 疫苗3 | 疫苗4 | 疫苗5 | |
| O型FMDVⅠ(μg/ml) | 100 | 100 | 100 | 50 | 150 |
| 亚洲1型FMDV(μg/ml) | 100 | 100 | 100 | 50 | 150 |
| A型FMDVⅠ(μg/ml) | 100 | 100 | 100 | 50 | 150 |
| 206佐剂(V/V％) | 50％ | 50％ | 50％ | 50％ | 50％ |
实施例8
抗口蹄疫的疫苗组合物的免疫原性试验
1.免疫程序
利用口蹄疫O型、亚洲1型、A型抗体ELISA检测试剂盒筛选抗体均为阴性的6月龄的健康黄牛18头，随机分为6组，每组3头。第1-5组分别为本发明实施例7制备的疫苗1-5免疫组，第6组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射1ml，PBS对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每周采血，连续采血至免疫后21日。
2.抗体水平检测
对采集的血清分别使用口蹄疫O型、亚洲1型、A型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后7天疫苗免疫的牛只O型、亚洲1型、A型抗体水平均开始上升，免疫后21天均能达到1：128以上。PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。具体结果见表4-6。
表4疫苗免疫牛只后O型口蹄疫ELISA抗体水平
表5疫苗免疫牛只后亚洲1型口蹄疫ELISA抗体水平
表6疫苗免疫牛只后A型口蹄疫ELISA抗体水平
证明本发明制备的抗口蹄疫的疫苗组合物与三种三段蛋白或三种四段蛋白表达的病毒样颗粒制备的疫苗组合物均能快速形成针对O型、亚洲1型、A型高水平的特异性抗体，解决了O型口蹄疫免疫原性较差的问题，尤其是CATHAY型变异株免疫原性较差的问题，能对机体起到很好的免疫保护作用，且以本发明制备的抗口蹄疫的疫苗组合物产生的抗体水平更高。
实施例9
抗口蹄疫的疫苗组合物的抗体水平维持试验
1.免疫程序
利用口蹄疫O型、亚洲1型、A型抗体ELISA检测试剂盒筛选抗体均为阴性的6月龄的健康黄牛12头，随机分为4组，每组3头。第1-3组分别为本发明实施例7制备的疫苗1-3免疫组，第4组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射1ml，PBS对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每月采血，连续采血至免疫后7个月。
2.抗体水平检测
对采集的血清分别使用口蹄疫O型、亚洲1型、A型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后7个月本发明的疫苗免疫的牛只O型、亚洲1型、A型抗体水平依然保持较高的抗体水平，PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。具体结果见表7-9。
表7疫苗免疫牛只后O型口蹄疫ELISA抗体维持情况
表8疫苗免疫牛只后亚洲1型口蹄疫ELISA抗体维持情况
表9疫苗免疫牛只后A型口蹄疫ELISA抗体维持情况
疫苗1和疫苗2免疫牛只后，抗体水平在4个月后逐渐下降，6个月后迅速降低，7个月时已无法提供免疫保护，而疫苗3在6个月后才逐渐降低，7个月依然具有较高的抗体水平，能够提供很好的免疫保护。证明本发明提供的疫苗组合物免疫原性较好，与三种三段蛋白或三种四段蛋白表达的病毒样颗粒制备的疫苗组合物相比，其免疫持续期更长。
实施例10
抗口蹄疫的疫苗组合物的稳定性试验
将实施例7制备的疫苗1、疫苗2和疫苗3分别置于50℃水浴中及pH6.0条件下处理，在电镜下观察。结果显示，随着处理时间的推移，无论是在热环境下还是在酸性条件下，疫苗3均比疫苗1和疫苗2稳定性好。
证明本发明提供的疫苗组合物比三种三段蛋白或三种四段蛋白表达的病毒样颗粒制备的疫苗组合物稳定性好，有利地保障了其免疫原性的稳定性和持久性，同时，有利于储存和运输，进一步说明本发明提供的疫苗组合物具有更长的免疫持续期。
实施例11
口蹄疫病毒样颗粒的制备
为了进一步验证本发明提供的疫苗组合物的稳定性和免疫效力的持久性是否具有普遍意义，将SEQ ID NO.5、6、7、8所示的O型口蹄疫病毒ⅡVP4、VP2、VP3、VP1氨基酸序列所示基因，SEQ ID NO.9、10、11、12所示的O型口蹄疫病毒ⅢVP4、VP2、VP3、VP1氨基酸序列所示基因，SEQ ID NO.13、14、15、16所示的O型口蹄疫病毒ⅣVP4、VP2、VP3、VP1氨基酸序列所示基因，SEQ ID NO.17、18、19、20所示的O型口蹄疫病毒ⅤVP4、VP2、VP3、VP1氨基酸序列所示基因，SEQ ID NO.27、28、29所示的A型口蹄疫病毒ⅡVP0、VP3、VP1氨基酸序列所示基因，SEQ ID NO.30、31、32所示的A型口蹄疫病毒ⅢVP0、VP3、VP1氨基酸序列所示基因按照实施例1的方法分别设计引物串联表达制备病毒样颗粒。
通过磷钨酸负染及电镜观察可见口蹄疫蛋白形成了类病毒样颗粒，并且形成的类病毒样颗粒饱满，组装效率高，没有聚集。通过将口蹄疫病毒样颗粒置于4℃下放置4个月，再通过磷钨酸负染及电镜观察可见病毒样颗粒依旧颗粒饱满，无聚集现象。说明本发明筛选的序列表达制备的口蹄疫蛋白形成了稳定的类病毒样颗粒。
实施例12
抗口蹄疫的疫苗组合物的制备
分别取实施例11和实施例3制备的病毒样颗粒，按照实施例7的方法制备抗口蹄疫的疫苗组合物。具体配比见表10。
表10抗口蹄疫的疫苗组合物成分配比
| 疫苗6 | 疫苗7 | 疫苗8 | 疫苗9 | |
| O型FMDVⅡ(μg/ml) | 100 | 0 | 0 | 0 |
| O型FMDVⅢ(μg/ml) | 0 | 100 | 0 | 0 |
| O型FMDVⅣ(μg/ml) | 0 | 0 | 100 | 0 |
| O型FMDVⅤ(μg/ml) | 0 | 0 | 0 | 100 |
| 亚洲1型FMDV(μg/ml) | 100 | 100 | 100 | 100 |
| A型FMDVⅡ(μg/ml) | 100 | 100 | 0 | 0 |
| A型FMDVⅢ(μg/ml) | 0 | 0 | 100 | 100 |
| 206佐剂(V/V％) | 50％ | 50％ | 50％ | 50％ |
实施例13
抗口蹄疫的疫苗组合物的抗体水平维持试验
1.免疫程序
利用口蹄疫O型、亚洲1型、A型抗体ELISA检测试剂盒筛选抗体均为阴性的6月龄的健康黄牛15头，随机分为5组，每组3头。第1-4组分别为本发明实施例12制备的疫苗6-9免疫组，第5组为PBS对照组。免疫组免疫途径为颈部肌肉注射1ml，PBS对照组免疫等量的PBS。疫苗免疫前每头牛采血，免疫后每月采血，连续采血至免疫后7个月。
2.抗体水平检测
对采集的血清分别使用口蹄疫O型、亚洲1型、A型抗体ELISA检测试剂盒进行相关抗体的检测。结果显示，疫苗免疫前所有牛只的抗体均为阴性，免疫后7个月本发明的疫苗免疫的牛只O型、亚洲1型、A型抗体水平依然保持较高的抗体水平，PBS对照组牛只抗体为阴性，无变化。具体结果见表11-13。
表11疫苗免疫牛只后O型口蹄疫ELISA抗体维持情况
表12疫苗免疫牛只后亚洲1型口蹄疫ELISA抗体维持情况
表13疫苗免疫牛只后A型口蹄疫ELISA抗体维持情况
疫苗6、疫苗7、疫苗8和疫苗9免疫牛只后，抗体在6个月后才逐渐降低，7个月依然具有较高的抗体水平，能提供很好的免疫保护。证明本发明提供的疫苗组合物免疫持续期显著增长，能维持更长时间的免疫保护，远高于三种三段蛋白或三种四段蛋白表达的病毒样颗粒制备的疫苗组合物；进一步证明了本发明提供的疫苗组合物免疫效力的持久性具有普遍意义。
同时，通过在50℃水浴中及pH6.0条件下处理，电镜结果显示，比三种三段蛋白或三种四段蛋白表达的病毒样颗粒制备的疫苗组合物稳定性好；进一步说明本发明制备的疫苗组合物具有良好的稳定性和免疫原性。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种抗口蹄疫的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含O型口蹄疫病毒样颗粒和亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒和A型口蹄疫病毒样颗粒和佐剂，其中，所述O型口蹄疫病毒样颗粒由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1构成，所述亚洲1型口蹄疫病毒样颗粒由亚洲1型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成，所述A型口蹄疫病毒样颗粒由A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1构成；其中，所述O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、2、3、4或SEQ ID NO.5、6、7、8或SEQ ID NO.9、10、11、12或SEQ ID NO.13、14、15、16或SEQ ID NO.17、18、19、20所示；所述亚洲1型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.21、22、23所示；所述A型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.24、25、26或SEQ IDNO.27、28、29或SEQ ID NO.30、31、32所示。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物中每种病毒样颗粒含量为50-150μg/ml。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物中每种病毒样颗粒含量为100μg/ml。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝，皂苷，阿夫立定，DDA或丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，或顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为ISA 206。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂的含量为10％-60％V/V。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂的含量为30％-50％V/V。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂的含量为50％V/V。
9.一种制备权利要求1-8任一项所述疫苗组合物的方法，其中，所述的制备方法包括：
1)制备口蹄疫病毒样颗粒的步骤；
2)加入佐剂，乳化的步骤。
10.权利要求1-8任一项所述的疫苗组合物在制备抗口蹄疫相关的药物中的应用。
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