CN114921418B - 一株o型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3及试剂盒和检测方法 - Google Patents

一株o型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3及试剂盒和检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114921418B
CN114921418B CN202210718354.4A CN202210718354A CN114921418B CN 114921418 B CN114921418 B CN 114921418B CN 202210718354 A CN202210718354 A CN 202210718354A CN 114921418 B CN114921418 B CN 114921418B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouth disease
disease virus
sample
type foot
hybridoma cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210718354.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114921418A (zh
Inventor
李雪峰
康斌
董鹏
赵炳武
武玉梅
张金龙
张满新
王家福
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Uben Animal Vaccine Co ltd
Jinhe Uben Biological Products Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Uben Animal Vaccine Co ltd
Jinhe Uben Biological Products Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Uben Animal Vaccine Co ltd, Jinhe Uben Biological Products Co ltd filed Critical Hangzhou Uben Animal Vaccine Co ltd
Priority to CN202210718354.4A priority Critical patent/CN114921418B/zh
Publication of CN114921418A publication Critical patent/CN114921418A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114921418B publication Critical patent/CN114921418B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1009—Picornaviridae, e.g. hepatitis A virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • G01N2333/09—Foot-and-mouth disease virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Abstract

本发明提供了一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3及试剂盒和检测方法，涉及免疫检测技术领域。本发明提供了一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3，并基于该杂交瘤细胞株1D3产生的单克隆抗体构建了O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗血清抗体竞争性ELISA检测试剂盒和检测方法，只能检测出O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗免疫血清抗体，用于区分O型口蹄疫野毒、全病毒灭活疫苗和类病毒颗粒疫苗免疫血清，准确性高。

Description

一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3及 试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3及试剂盒和检测方法。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染的动物疫病。该病感染对象是猪、牛、羊及其他家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。该病具有感染动物种类多、传播速度快、传染性极强、引起的经济损失巨大等特点，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病。
口蹄疫病毒存在多种血清型，如O型、亚洲I型、A型、A型变异毒株以及C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型等，O型呈地方性流行，亚洲I型持续多年无疫，A型零星散发，因此控制口蹄疫传入，控制和消灭口蹄疫的工作仍将面临不少困难和挑战，任重道远；目前已有多种可检测不同血清型口蹄疫的试剂盒和方法，尤其是对于O型口蹄疫的鉴定种类较多，但是还只能简单区分野毒和灭活疫苗血清抗体。还未有将口蹄疫类病毒颗粒与野毒或灭活疫苗血清抗体加以区分的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3及试剂盒和检测方法，可对O型口蹄疫野毒、全病毒灭活疫苗和类病毒颗粒疫苗免疫血清进行区分，灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3，所述杂交瘤细胞株1D3的保藏编号为CCTCC NO：C2022156。
本发明还提供了上述杂交瘤细胞株1D3在制备检测O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗血清抗体试剂中的应用。
优选的，所述试剂包括竞争性ELISA检测试剂。
本发明还提供了一种O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗血清抗体竞争性ELISA检测试剂盒，包括上述杂交瘤细胞株1D3产生的单克隆抗体。
优选的，所述竞争性ELISA检测试剂盒中还包括洗涤液、封闭液、稀释液、底物液和终止液。
优选的，所述洗涤液为含Tween-20的0.01mol/L PBST缓冲液，pH值为7.4；所述PBST缓冲液中Tween-20的质量分数为0.05％；
所述封闭液为含BSA和Tween-20的PBS缓冲液，pH值为7.4；所述PBS缓冲液中BSA的质量分数为3％，Tween-20的质量分数为0.05％；
所述稀释液为含马血清和Tween-20的PBS缓冲液，pH值为7.4；所述PBS缓冲液中马血清的质量分数为5％，Tween-20的质量分数为0.05％；
所述底物液为可溶性TMB；
所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
本发明还提供了一种O型口蹄疫类病毒颗粒血清抗体的检测方法，包括以下步骤：利用上述竞争性ELISA检测试剂盒进行竞争性ELISA检测后，分别检测阳性对照、阴性对照和样本的OD450，并计算阻断率；
所述阳性对照为利用O型口蹄疫类病毒颗粒免疫动物后的血清，进行竞争性ELISA检测后的阻断率＞50％；
所述阴性对照为利用O型口蹄疫灭活病毒疫苗或O型口蹄疫野毒免疫动物后的血清，进行竞争性ELISA检测后的OD450≥0.5；
当被检样本的阻断率≥40％，证明有O型口蹄疫类病毒颗粒抗体存在。
优选的，当被检样本的阻断率≤32％，证明没有O型口蹄疫类病毒颗粒抗体存在；当被检样本的阻断率在(32％，40％)区间内，需重新检测。
优选的，以N为阴性对照OD450的平均值，P为阳性对照OD450的平均值，S为被检样本OD450的平均值；
以B为阻断率，阳性对照的阻断率
被检样本的阻断率
优选的，利用所述竞争性ELISA检测试剂盒进行竞争性ELISA检测前，还包括对杂交瘤细胞株1D3产生的单克隆抗体进行酶标记，得到酶结合物；所述酶标记包括辣根过氧化物酶标记。
有益效果：本发明提供了一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3，并基于该杂交瘤细胞株1D3产生的单克隆抗体构建了O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗血清抗体竞争性ELISA检测试剂盒和检测方法，只能检测出O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗免疫血清抗体，用于区分O型口蹄疫野毒、全病毒灭活疫苗和类病毒颗粒疫苗免疫血清。在本发明实施例中，分别利用现有的经商品化O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒和本发明所述试剂盒，对已知背景样品进行检测，商品化O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测全为阳性；利用本发明提供的试剂盒进行检测，检测结果与背景资料相符，准确性高。
生物保藏信息
杂交瘤细胞株1D3，已于2022年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，具体地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022156。
附图说明
图1为1D3四参数拟合曲线，y＝(A-D)/[1+(x/C)B]+D，其中A＝2.22406，B＝7.56580，C＝9.73977，D＝0.05189，r2＝0.99926；
图2为3B8四参数拟合曲线，y＝(A-D)/[1+(x/C)B]+D，其中A＝2.65852，B＝26.86142，C＝12.27902，D＝0.87078，r2＝0.93687；
图3为6G3四参数拟合曲线，y＝(A-D)/[1+(x/C)B]+D，其中A＝3.68741，B＝6.47626，C＝7.05766，D＝0.07416，r2＝0.99898。
具体实施方式
本发明提供了一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3，所述杂交瘤细胞株1D3的保藏编号为CCTCC NO：C2022156。
本发明所述杂交瘤细胞株1D3的筛选方法，包括将O型口蹄疫类病毒颗粒对动物进行免疫、细胞融合、抗体检测和筛选，而后筛选只结合O型口蹄疫类病毒颗粒的单克隆抗体，并结合四参数拟合曲线筛选得到最终的杂交瘤细胞株1D3。本发明所述杂交瘤细胞株1D3的四参数拟合曲线，以单抗梯度稀释的对数值为横坐标，OD值为纵座标，随样品稀释度的增大，OD值呈减小趋势，且整体呈现S形，有明显的平台期。本发明对所述O型口蹄疫类病毒颗粒的来源或制备方法并没有特殊限定，优选包括中国专利CN113956335A、CN201910620895.1或CN202010707213.3。
本发明还提供了上述杂交瘤细胞株1D3在制备检测O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗血清抗体试剂中的应用。
本发明所述试剂优选包括竞争性ELISA检测试剂，且所述检测试剂中优选包含上述杂交瘤细胞株1D3产生的单克隆抗体。本发明对所述单克隆抗体的制备方法并没有特殊限定，优选包括制备腹水后纯化。本发明对所述腹水的制备方法以及纯化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
本发明还提供了一种O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗血清抗体竞争性ELISA检测试剂盒，包括上述杂交瘤细胞株1D3产生的单克隆抗体。
本发明所述竞争性ELISA检测试剂盒中优选还包括洗涤液、封闭液、稀释液、底物液和终止液。本发明所述洗涤液优选为含Tween-20的0.01mol/LPBST缓冲液，pH值为7.4；所述PBST缓冲液中Tween-20的质量分数为0.05％。本发明所述封闭液优选为含BSA和Tween-20的PBS缓冲液，pH值为7.4；且所述PBS缓冲液中BSA的质量分数优选为3％，Tween-20的质量分数优选为0.05％。本发明所述稀释液优选为含马血清和Tween-20的PBS缓冲液，pH值为7.4；所述PBS缓冲液中马血清的质量分数优选为5％，Tween-20的质量分数优选为0.05％。本发明所述底物液优选为可溶性TMB。本发明所述终止液优选为1mol/L H2SO4溶液。本发明所述试剂盒中优选还包括包被液，包被液优选为0.01mol/LPBS缓冲液，pH值为7.4。
本发明还提供了一种O型口蹄疫类病毒颗粒血清抗体的检测方法，包括以下步骤：利用上述竞争性ELISA检测试剂盒进行竞争性ELISA检测后，分别检测阳性对照、阴性对照和样本的OD450，并计算阻断率；
所述阳性对照为利用O型口蹄疫类病毒颗粒免疫动物后的血清，进行竞争性ELISA检测后的阻断率＞50％；
所述阴性对照为利用O型口蹄疫灭活病毒疫苗或O型口蹄疫野毒免疫动物后的血清，进行竞争性ELISA检测后的OD450≥0.5；
当被检样本的阻断率≥40％，证明有O型口蹄疫类病毒颗粒抗体存在。
本发明对所述竞争性ELISA检测的方法并没有特殊限定，优选包括对杂交瘤细胞株1D3产生的单克隆抗体进行酶标记，得到酶结合物；所述酶标记包括辣根过氧化物酶标记。本发明优选利用梯度稀释的方法确定所述酶结合物的效价，并将OD值最接近1.0的稀释度作为酶结合物效价。在本发明实施例中，利用上述效价的酶结合物进行竞争性ELISA检测时，优选包括：包被液将O型口蹄疫类病毒颗粒稀释至0.2μg/ml包被酶联反应板；包被结束后，弃去孔中液体，每孔加入洗涤液漂洗1次；每孔加入新鲜配制的封闭液封闭2h；封闭结束后，弃去孔中液体，每孔加入洗涤液漂洗1次，于吸水滤纸上拍干；用稀释液将酶结合物稀释后，在抗原包被板加入酶结合物稀释液，再分别在不同的孔中加入待检血清、阳性对照及阴性对照，孵育；弃去孔中液体，每孔加入洗涤液漂洗3次；向每孔中加入用稀释液将羊抗鼠HRP二抗，孵育1h；弃去孔中液体，每孔加入洗涤液漂洗3次；将TMB加入抗原包被板，避光显色后每孔加入终止液，酶标仪上读取450nm吸光值。
在本发明中，所述检测包括成立条件，只有当标准阴性对照血清OD450≥0.5，标准阳性对照的阻断率大于50％，该检验结果成立；若试验不成立，应进行重复检测。且在检测时，当被检样本的阻断率≤32％，证明没有O型口蹄疫类病毒颗粒抗体存在；当被检样本的阻断率在(32％，40％)区间内，需重新检测。
本发明以N为阴性对照OD450的平均值，P为阳性对照OD450的平均值，S为被检样本OD450的平均值；
以B为阻断率，阳性对照的阻断率
被检样本的阻断率
下面结合实施例对本发明提供的一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3及试剂盒和检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
O型口蹄疫类病毒颗粒的单克隆抗体的制备
1.免疫BALB/c小鼠
首免：将O型口蹄疫类病毒颗粒与弗氏完全佐剂等量混合，腹腔注射，100μg/只；
二免：4～6周后，将O型口蹄疫类病毒颗粒与弗氏不完全佐剂等量混合，腹腔注射，50μg/只；
三免：方法同二免；
四免：三免2周后，取20μg O型口蹄疫类病毒颗粒直接尾静脉注射小鼠。3天后进行细胞融合。
2.细胞融合
无菌摘取免疫小鼠脾脏，磨碎后，70μm尼龙网细胞筛，将收集的细胞用1000r/min离心5min。弃上清，沉淀用无血清IMDM重悬，进行细胞计数。将培养好SP2/0细胞从细胞培养瓶中轻轻吹下，用无血清IMDM培养液重悬，进行细胞计数。将制备的脾细胞和SP2/0细胞按照5:1～8:1的比例混合，1000r/min离心10min，弃上清。吸取1ml 50％聚乙二醇1500溶液，缓慢加入(60s内)至细胞中。然后立即在5min内滴加25ml无血清IMDM。1000r/min离心10min，弃上清，加入30ml HAT培养液重悬，分装于96孔细胞培养板中，置含7.5％二氧化碳的37℃培养箱中培养7天。
3.抗体检测及筛选
用包被液将O型口蹄疫类病毒颗粒稀释至0.2μg/ml包被酶联反应板，100μl/孔，4℃包被16h。包被结束后，弃去孔中液体，每孔加入洗液300μl，漂洗1次。每孔加入新鲜配制的封闭液300μl，37℃封闭2h。封闭结束后，弃去孔中液体，每孔加入洗液300μl，漂洗1次，于吸水滤纸上拍干，-20℃冻存备用。
定期观察融合后细胞，待细胞培养基上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取100μl细胞上清至抗原包被板，37℃孵育1h。弃去孔中液体，每孔加入洗液300μl，漂洗3次。用稀释液将羊抗鼠HRP二抗稀释10000倍，每孔加入100μl，37℃孵育1h。弃去孔中液体，每孔加入洗液300μl，漂洗3次。将TMB加入抗原包被板，每孔100μl，避光显色10min。每孔加入50μl终止液，酶标仪上读取450nm吸光值。
采用有限稀释法对阳性克隆孔进行亚克隆，所有操作采用HT培养液进行。置含7.5％二氧化碳的37℃培养箱中培养，定期观察，采用相同上清检测方法检测抗体。亚克隆过程应进行3～4次。
实施例2
O型口蹄疫类病毒颗粒的单克隆抗体的筛选
实施例1获得多株单克隆抗体，用O型口蹄疫病毒灭活疫苗破乳液包被酶联反应板，检测步骤同O型口蹄疫类病毒颗粒包被酶联反应板检测抗体方法。检测OD值小于0.1的单克隆抗体，即为只能结合O型口蹄疫类病毒颗粒的单克隆抗体(表1)。
表1两种包被抗原检测单克隆抗体的间接ELISA结果
O型口蹄疫病毒灭活疫苗 O型口蹄疫类病毒颗粒
1D3 0.099 1.745
1D4 2.254 2.704
2B7 2.208 2.856
2D2 2.007 2.208
3B8 0.053 2.960
3C6 0.934 1.761
3D2 1.236 2.434
4B5 1.098 1.921
5G8 2.200 2.992
6B11 0.134 2.698
6G3 0.087 1.928
在O型口蹄疫类病毒颗粒包被酶联反应板，将以1：100～1：12800梯度稀释的1D3、3B8和6G3。以单抗梯度稀释的对数值为横坐标，OD值为纵座标，绘制四参数拟合曲线(表2，图1～3)。随样品稀释度的增大，OD值呈减小趋势。典型的剂量反应曲线成S形，有两个平台期：样品浓度较高时，由于包被抗原有限，会有一个平台；样品稀释到一定程度，由于显色的本底，也会有一个平台。结果显示1D3的四参数拟合曲线为S形，有明显的平台期，为最优选的目的单克隆抗体。
表2单抗梯度稀释后的OD值
稀释比 1D3 3B8 6G3
1：100 2.109 2.317 2.235
1：200 1.925 2.601 1.399
1：400 1.607 2.695 0.881
1：800 1.151 2.888 0.493
1：1600 0.824 2.795 0.286
1：3200 0.480 2.253 0.191
1：6400 0.307 1.458 0.154
1：12800 0.219 0.958 0.151
实施例3
O型口蹄疫类病毒颗粒血清抗体竞争ELISA检测方法的建立
1.单克隆抗体腹水的制备和纯化
将筛选的杂交瘤细胞1D3扩大培养后，收集细胞，进行计数，将细胞浓度调整至1×106细胞/ml～2×106细胞/ml，每只小鼠腹腔接种0.5ml。定期观察，待小鼠腹部膨大且有波动感时，用注射器吸取腹水。将采集的腹水于5000r/min离心10min，取上清，用0.01mol/mlpH7.2的磷酸盐缓冲液将腹水稀释10倍，用Protein G亲和层析柱进行纯化。
2.酶结合物的制备和效价的确定
将纯化后的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记试剂盒进行标记，操作步骤按照说明书进行。将酶结合物进行100倍稀释后，再进行2倍梯度稀释。用抗原包被板进行酶结合物效价测定，将OD值最接近1.0的稀释度作为酶结合物效价。调整酶结合物浓度至终效价的100倍，-20℃分装备用。
3.阳性对照和阴性对照血清
阳性对照血清为O型类病毒颗粒免疫动物血清。阴性对照血清为O型口蹄疫灭活病毒疫苗免疫动物血清。阳性对照血清和阴性对照血清经商品化口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测，均为阳性，说明商品化试剂盒无法区分O型口蹄疫类病毒颗粒和灭活病毒疫苗免疫血清。
4.O型口蹄疫类病毒颗粒血清抗体竞争ELISA
包被液将O型口蹄疫类病毒颗粒稀释至0.2μg/ml包被酶联反应板，100μl/孔，4℃包被16h。包被结束后，弃去孔中液体，每孔加入洗液300μl，漂洗1次。每孔加入新鲜配制的封闭液300μl，37℃封闭2h。封闭结束后，弃去孔中液体，每孔加入洗液300μl，漂洗1次，于吸水滤纸上拍干。用稀释液将酶结合物稀释50倍，在抗原包被板加入50μl酶结合物稀释液，再加入待检血清，阳性对照及阴性对照各50μl，37℃孵育1h。弃去孔中液体，每孔加入洗液300μl，漂洗3次。将TMB加入抗原包被板，每孔100μl，避光显色10min。每孔加入50μl终止液，酶标仪上读取450nm吸光值。
结果计算：
N＝(N1+N2)/2
式中：
N——阴性对照孔平均值
N1——阴性对照孔1的OD值
N2——阴性对照孔2的OD值
P＝(P1+P2)/2
式中：
P——阳性对照孔平均值
P1——阳性对照孔1的OD值
P2——阳性对照孔2的OD值
B＝((N-S)/N)*100％
式中：
B——阻断率
N——阴性对照孔平均值
S——样本OD值。
试验成立条件：标准阴性对照血清OD450≥0.5，标准阳性对照的阻断率大于50％，该检验结果成立。若试验不成立，应进行重复检测。
结果判定：如果被检样本的阻断率≥40％，则该样本可以判为阳性，即有O型类病毒颗粒抗体存在；如被检样本的阻断率≤32％，则该样本可以判为阴性，即无O型类病毒颗粒抗体存在；如果该样本的阻断率在(32％，40％)区间内，则应在14d后对动物进行重新检测。
表3样品OD450结果
样品1 0.245 样品5 0.841 样品9 0.622
样品1复孔 0.248 样品5复孔 0.827 样品9复孔 0.693
样品2 0.279 样品6 0.545 样品10 0.780
样品2复孔 0.282 样品6复孔 0.590 样品10复孔 0.773
样品3 0.282 样品7 0.761 阳性对照 0.404
样品3复孔 0.279 样品7复孔 0.753 阳性对照复孔 0.385
样品4 0.303 样品8 0.899 阴性对照 1.045
样品4复孔 0.332 样品8复孔 0.912 阴性对照复孔 1.038
表4样品OD450平均值结果
样品1平均值 0.247 样品5平均值 0.834 样品9平均值 0.658
样品2平均值 0.281 样品6平均值 0.568 样品10平均值 0.777
样品3平均值 0.281 样品7平均值 0.757 阳性对照平均值 0.395
样品4平均值 0.318 样品8平均值 0.906 阴性对照平均值 1.042
表5样品阻断率结果
样品1阻断率 76％ 样品5阻断率 20％ 样品9阻断率 37％
样品2阻断率 73％ 样品6阻断率 45％ 样品10阻断率 25％
样品3阻断率 73％ 样品7阻断率 27％ 阳性对照阻断率 62％
样品4阻断率 69％ 样品8阻断率 13％ 阴性对照阻断率 0％
表6商品化O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒阻断率结果
样品1阻断率 82％ 样品5阻断率 72％ 样品9阻断率 39％
样品2阻断率 77％ 样品6阻断率 66％ 样品10阻断率 55％
样品3阻断率 84％ 样品7阻断率 56％ 阳性对照阻断率 71％
样品4阻断率 69％ 样品8阻断率 46％ 阴性对照阻断率 62％
1～10号样品为背景已知样品，经商品化O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测全为阳性。样品1、2、3、4、6、9为O型类病毒颗粒免疫血清，样品5、7、8、10为O型口蹄疫病毒灭活疫苗免疫血清。检测结果，样品1、2、3、4、6、9为阳性，样品5、7、8、10为阴性，与背景资料相符。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3，其特征在于，所述杂交瘤细胞株1D3的保藏编号为CCTCC NO：C2022156。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株1D3在制备检测O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗血清抗体试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述试剂包括竞争性ELISA检测试剂。
4.一种O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗血清抗体竞争性ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述杂交瘤细胞株1D3产生的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述竞争性ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述竞争性ELISA检测试剂盒中还包括洗涤液、封闭液、稀释液、底物液和终止液。
6.根据权利要求5所述竞争性ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含Tween-20的0.01mol/L PBST缓冲液，pH值为7.4；所述PBST缓冲液中Tween-20的质量分数为0.05%；
所述封闭液为含BSA和Tween-20的PBS缓冲液，pH值为7.4；所述PBS缓冲液中BSA的质量分数为3%，Tween-20的质量分数为0.05%；
所述稀释液为含马血清和Tween-20的PBS缓冲液，pH值为7.4；所述PBS缓冲液中马血清的质量分数为5%，Tween-20的质量分数为0.05%；
所述底物液为可溶性TMB；
所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
CN202210718354.4A 2022-06-23 2022-06-23 一株o型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3及试剂盒和检测方法 Active CN114921418B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210718354.4A CN114921418B (zh) 2022-06-23 2022-06-23 一株o型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3及试剂盒和检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210718354.4A CN114921418B (zh) 2022-06-23 2022-06-23 一株o型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3及试剂盒和检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114921418A CN114921418A (zh) 2022-08-19
CN114921418B true CN114921418B (zh) 2023-08-18

Family

ID=82815388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210718354.4A Active CN114921418B (zh) 2022-06-23 2022-06-23 一株o型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3及试剂盒和检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114921418B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007143701A2 (en) * 2006-06-06 2007-12-13 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies that potently neutralize hepatitis c virus (hcv) of diverse genotypes
CN113521271A (zh) * 2021-05-27 2021-10-22 杭州佑本动物疫苗有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗及制备方法
CN114316037A (zh) * 2022-01-05 2022-04-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体m19、制备方法及应用
CN114316036A (zh) * 2022-01-05 2022-04-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒结构蛋白vp1广谱中和抗体、制备方法及其应用
CN114578047A (zh) * 2020-11-30 2022-06-03 洛阳中科生物芯片技术有限公司 一种口蹄疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5653215B2 (ja) * 2007-09-12 2015-01-14 ノバルティス アーゲー Ｇａｓ５７変異体抗原およびｇａｓ５７抗体
GB0718843D0 (en) * 2007-09-26 2007-11-07 Cancer Rec Tech Ltd Materials and methods relating to modifying the binding of antibodies
US20220096620A1 (en) * 2019-01-15 2022-03-31 Pulike Biological Engineering, Inc. Foot-and-mouth disease virus-like particle antigen, and vaccine composition, preparation method, and application thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007143701A2 (en) * 2006-06-06 2007-12-13 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies that potently neutralize hepatitis c virus (hcv) of diverse genotypes
CN114578047A (zh) * 2020-11-30 2022-06-03 洛阳中科生物芯片技术有限公司 一种口蹄疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用
CN113521271A (zh) * 2021-05-27 2021-10-22 杭州佑本动物疫苗有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征二价灭活疫苗及制备方法
CN114316037A (zh) * 2022-01-05 2022-04-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体m19、制备方法及应用
CN114316036A (zh) * 2022-01-05 2022-04-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒结构蛋白vp1广谱中和抗体、制备方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于单克隆抗体的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争 ELISA 检测方法的建立;许智强等;《中国预防兽医学报》;第42卷(第2期);145-149 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114921418A (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107475203B (zh) 一种h7禽流感病毒单克隆抗体及应用
CN103257231A (zh) 一种用于检测禽白血病p27的酶联免疫反应载体及试剂盒
CN101672849A (zh) 鹿流行性出血病竞争酶联免疫吸附试验试剂盒及其制备方法和用途
CN110361542A (zh) 猪德尔塔冠状病毒n蛋白的双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒
CN109321532B (zh) 一种用于检测山羊副流感病毒3型的双抗体夹心elisa检测试剂盒及其应用
CN109580942B (zh) Qx型ibv的细胞适应株mj在制备全病毒抗原elisa检测试剂盒中的应用及试剂盒
CN114921418B (zh) 一株o型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3及试剂盒和检测方法
CN109799351A (zh) 猪圆环病毒2型双抗体夹心elisa试剂盒及其应用
CN107557344A (zh) 一株表达猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系csfv‑3h3g6及抗体与试剂盒
CN116836938A (zh) 一株产生抗iii型鸭甲型肝炎病毒vp1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN114316037B (zh) 一种O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体m19、制备方法及应用
CN114656552B (zh) 抗马立克氏病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒应用
CN113683685B (zh) 抗ⅰ群4型禽腺病毒单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及检测试剂盒的应用
CN113801854B (zh) 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用
CN100503831C (zh) 鸡传染性法氏囊病毒vp3基因、所表达的重组蛋白及应用
CN102633878A (zh) 一种甲型h1亚型流感病毒双抗体夹心elisa试剂盒及应用
Smitsaart et al. Detection of foot-and-mouth disease virus by competitive ELISA using a monoclonal antibody specific for the 12S protein subunit from six of the seven serotypes
CN109613249A (zh) 一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法
CN114578047A (zh) 一种口蹄疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用
CN107121552B (zh) 一株分泌3,4－亚甲基二氧甲基苯丙胺单抗的杂交瘤细胞株zy-2g5-3及其应用
CN112898419B (zh) 用于检测高致病性prrsv的单克隆抗体及应用
CN104745604A (zh) 猪细小病毒液相芯片检测试剂盒
CN111117970A (zh) 一种识别n6亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体及其应用
CN110452883A (zh) 禽白血病p27蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
CN115925894B (zh) 一种冠状病毒单克隆抗体及其制备的检测试剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant