CN109321532B - 一种用于检测山羊副流感病毒3型的双抗体夹心elisa检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于检测山羊副流感病毒3型的双抗体夹心elisa检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测山羊副流感病毒3型（CPIV3）的双抗体夹心ELISA检测试剂盒及其应用。所述的试剂盒中含有由保藏编号为CCTCC NO.C201627和CCTCC NO.C2018151的杂交瘤细胞株分泌产生的抗CPIV3单克隆抗体2E6和1F8。本发明以纯化的1F8单抗为捕获抗体，以辣根过氧化物酶标记的2E6单抗为检测抗体，建立了检测CPIV3的双抗体夹心ELISA方法。本发明构建的试剂盒检测CPIV3病原快速、稳定、特异性好、灵敏度高，可快速检测样品中是否含有CPIV3病毒粒子；本发明适用于养殖场感染CPIV3的高通量检测。

Description

一种用于检测山羊副流感病毒3型的双抗体夹心ELISA检测试 剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒及其应用。
背景技术
山羊副流感病毒3型(Caprine parainfluenza virus type 3,CPIV3)属于副黏病毒科呼吸道病毒属，是有囊膜的单股负链RNA病毒，是引起羊呼吸道疾病的重要病原。本病毒于2013年底首次报道，是从江苏等地发生呼吸道疾病羊群中分离的新型副流感病毒3型，将其命名为山羊副流感病毒3型(CPIV3)。流行病学调查表明CPIV3在羊群较为普遍，可能造成发病引起较大损失。
本病毒感染羊后，以呼吸道症状为主的传染性疾病，发病率较高，药物治疗效果不佳。临床主要表现为流涕、咳嗽、精神沉郁、食欲减退、消瘦、伴有腹泻；剖检主要病变表现为肺炎、腹腔积液、肠系膜等出现白色结节、胰脏出血、肠道出血、淋巴结肿大等病理变化。本病感染率较高，可达30％以上，对养羊业造成了严重的经济损失。
此前对CPIV3病原的检测多用常规RT-PCR和qRT-PCR检测方法，需要进行病毒RNA提取等操作，操作繁杂、耗时长、成本较高，且不能高通量检测。单克隆抗体在动物病毒的诊断和防治中起重要作用。利用单克隆抗体建立的检测病原的双抗体夹心ELISA检测方法，在动物传染病的监测和预防方面发挥着越来越重要的作用。目前国内外尚无针对CPIV3病原的高通量检测方法。因此，需要提供一种简便、快速、敏感性高和特异性好的有效检测手段对大量样品进行CPIV3检测。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒，该试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，可快速、简便、高效的检测山羊副流感病毒3型，且成本低，适合样品的高通量检测。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种分泌CPIV 3阻断单克隆抗体的杂交瘤细胞1F8株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018151，保藏日期：2018年6月26日。
本发明提供一种分泌CPIV 3阻断单克隆抗体的杂交瘤细胞2E6株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201627，保藏日期：2016年2月1日。
在一些实施方式中，制备CPIV 3单克隆抗体的杂交瘤细胞1F8株时，分泌CPIV 3单克隆抗体的杂交瘤细胞1F8株的抗原为CPIV3病毒JS2013株。
在一些实施方式中，免疫小鼠所用抗原首先感染MDBK细胞，待出现细胞病变后收获病毒。
在一些实施方式中，出现细胞病变后收获的病毒需经处理以去除细胞碎片。
在一些实施方式中，去除细胞碎片通过离心进行。
在一些实施方式中，所述离心操作在至少10,000rpm进行。
在一些实施方式中，所述离心操作进行至少30min。
在一些实施方式中，所述离心后的沉淀用PBS溶解。
在一些实施方式中，所述离心后的沉淀用PBS过夜溶解。
在一些实施方式中，在细胞融合前，通过将超离病毒皮下多点注射免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。
在一些实施方式中，所述免疫分3次进行。
在一些实施方式中，每次免疫间隔2周。
在一些实施方式中，首免使用超离病毒与等量完全弗氏佐剂免疫。
在一些实施方式中，第二次免疫使用超离病毒与等量的不完全弗氏佐剂混合免疫。
在一些实施方式中，第三次免疫使用超离病毒与等量的不完全弗氏佐剂混合免疫。
在一些实施方式中，第三次免疫2周后采血，检测小鼠的免疫血清效价。
在一些实施方式中，细胞融合前超离病毒腹腔注射加强免疫一次。
在一些实施方式中，细胞融合前4天用超离纯化病毒腹腔注射免疫小鼠，加强免疫一次。
在一些实施方式中，细胞融合采用PEG细胞融合的方法。
在一些实施方式中，所述PEG为PEG2000。
在一些实施方式中，细胞融合包括将小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞充分混匀。
在一些实施方式中，细胞融合包括将小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞按1:3-1:5的比例充分混匀。
在一些实施方式中，将混匀后的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞进行离心。
在一些实施方式中，将混匀后的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞2 000rpm进行离心。
在一些实施方式中，将混匀后的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞2 000rpm，25℃进行离心。
在一些实施方式中，将混匀后的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞2 000rpm，25℃进行离心5min。
在一些实施方式中，加入PEG前，离心后的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞用无血清RPMI-1640培养基。
在一些实施方式中，细胞融合所用的PEG需要在水浴中预热。
在一些实施方式中，细胞融合所用的PEG需要在37℃水浴中预热。
在一些实施方式中，细胞融合所用的PEG需要边加边振荡。
在一些实施方式中，加入PEG后加入的RPMI-1640培养基需要预热。
在一些实施方式中，加入PEG后加入的RPMI-1640培养基需要预热至37℃。
在一些实施方式中，加入PEG前加入的RPMI-1640培养基不需要预热。
在一些实施方式中，加入PEG后，离心后的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞用加入含15％FBS和HAT的RPMI-1640培养基重悬。
在一些实施方式中，采用OD450nm的值对杂交瘤细胞株进行选择。
在一些实施方式中，检测孔的阴阳性的标准为阴性血清OD450nm值≤0.1且阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm的比值≥2.1。
在一些实施方式中，杂交瘤细胞株采用含15％FBS的RPMI-1640培养基进行稀释。
在一些实施方式中，杂交瘤细胞株生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，进行检测。
在一些实施方式中，杂交瘤细胞株进行间接ELISA方法检测。
在一些实施方式中，将交瘤细胞株注射入小鼠腹腔来制备小鼠腹水。
本发明提供一种单克隆抗体纯化方法，其特征在于：先制备含有单克隆抗体的腹水，并将腹水进行第一次离心，取上清。
在一些实施方式中，在搅拌条件下向腹水上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液。
在一些实施方式中，在搅拌条件下向腹水上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度达50％，然后继续搅拌至少30min，并进行第二次离心。
进一步地，第二次离心后，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液，在4℃、搅拌条件下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度为33％，并继续搅拌，然后进行第三次离心。
进一步地，第三次离心后，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，4℃透析过夜，得到单克隆抗体粗蛋白。
进一步地，对单克隆抗体粗蛋白进行柱纯化。
本发明还提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗山羊副流感病毒3型单克隆抗体1F8和2E6及其在制备检测山羊副流感病毒3型检测试剂盒方面的应用。
本发明还提供一种山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所述双抗体包括分泌CPIV 3单克隆抗体的杂交瘤细胞1F8株分泌的抗体和分泌CPIV 3单克隆抗体的杂交瘤细胞2E6株分泌的抗体。
本发明还提供一种山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒，包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板是采用抗山羊副流感病毒3型单克隆抗体1F8包被的酶标板，所述酶标记抗体是辣根过氧化物酶标记的抗山羊副流感病毒3型单克隆抗体2E6。
在一些实施方式中，所述酶标记抗体制备方法如下：
(1)取5mg辣根过氧化物酶溶于纯水，加入0.2ml、0.1M的NaIO4溶液，室温反应30分钟；
(2)将5mg纯化后的2E6单克隆抗体用偶联缓冲液(pH9.5、10mM的碳酸盐缓冲液)透析过夜；
(3)将步骤(1)所得溶液加入步骤(2)透析后所得抗体溶液中，室温反应2小时；
(4)加入硼氢化钠封闭反应位点；
(5)磷酸盐缓冲液透析过夜，得到酶标记抗体，加入等量甘油保存于-20℃。
在一些实施方式中，单克隆抗体1F8的包被量为10-80μg/mL，酶标2E6单克隆抗体的浓度为10.5-42μg/mL。
在一些实施方式中，包被缓冲液为0.1M、pH值为9.6的CB缓冲液。
在一些实施方式中，所述CB缓冲液由3.2克/L的碳酸钠和5.86克/L的碳酸氢钠组成。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括样品稀释液、显色剂、终止液和洗涤液。
在一些实施方式中，所述样品稀释液为含有1％牛血清白蛋白(BSA)和0.02％硫柳汞钠的0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液；
在一些实施方式中，所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.1％；
在一些实施方式中，所述显色液为TMB one solution试剂
在一些实施方式中，所述终止液为2M的硫酸水溶液。
本发明还提供一种山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒用于检测山羊副流感病毒3型的用途，其中阴性样品检测OD450值小于0.1。
进一步地，所述抗原孵育时间为60min。
进一步地，所述酶标HRP-2E6孵育时间为45min。
进一步地，所述抗原孵育时间为60min，酶标HRP-2E6孵育时间为45min。
进一步地，单抗包被稀释度为1:100-1:800。
进一步地，单克隆抗体1F8的包被量为10-80μg/mL。
进一步地，酶标二抗稀释度为1:200-1:800。
进一步地，酶标2E6单克隆抗体的浓度为10.5-42μg/mL。
进一步地，单克隆抗体1F8的包被量为10-80μg/mL且酶标2E6单克隆抗体的浓度为10.5-42μg/mL。
本发明还提供一种山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒的使用方法，其包括：
(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(2)加标准品/样本：在预包被酶标板的每孔中加入100μL样品稀释液(空白对照)、稀释后的样品或阴性标准品、阳性标准品，轻轻振荡混匀，37℃避光环境中作用60min；
(3)洗板：将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔充分洗涤3次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；
(4)加酶标记抗体工作液：加入酶标记抗体工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，37℃避光环境中反应45min，取出重复洗板步骤(3)；
(5)显色：每孔加入TMB 100μL，置于37℃避光环境中反应15min；
(6)测定：加入终止液100μL/孔，轻轻振荡混匀，在酶标仪中检测450nm波长处每孔的OD值，即得到OD450值。
进一步地，单克隆抗体1F8的包被量为10-80μg/mL。
进一步地，酶标2E6单克隆抗体的浓度为10.5-42μg/mL。
本发明的有益效果：
(1)特异性强：本发明试剂盒与临床病料中的CPIV3有较强的反应性，与羊其他病原无交叉反应。
(2)灵敏度高：本发明试剂盒最低可检测2.5×102TCID50的CPIV3。
(3)重复性：本发明试剂盒的批内和批间重复性较好。
(4)简便快速：本发明试剂盒需求技术难度低，不需要贵重仪器，操作简便、快速。
(5)高通量：本发明试剂盒可以用于大量样品检测。
因此，本发明试剂盒为CPIV3的高通量临床病原检测、灭活疫苗的质量控制以及相关基础研究提供技术手段，对CPIV3的防控具有重要意义。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明作进一步的说明，而非对本发明进行限制。
实施例1单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
1.抗原的制备：将CPIV3病毒JS2013株(本毒株保藏编号为：CCTCC NO：V201832。保藏日期为：2018年6月26日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心)感染MDBK细胞，接毒4d待细胞出现病变后收获病毒，10,000rpm离心30min，去细胞碎片；上清经40,000×g超速离心2h，弃上清，沉淀用适量PBS过夜溶解。
2.免疫Balb/c小鼠：将超离病毒皮下多点注射免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)，一共免疫3次，每次免疫间隔2周，首免使用100μl超离病毒与等量完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)免疫，后两次均使用100μl超离病毒与等量的不完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)混合免疫；第三次免疫2周后采血，检测小鼠的免疫血清效价，选取ELISA抗体效价>106的小鼠，细胞融合前4d加强免疫一次，100μl超离病毒腹腔注射。
3.细胞融合：细胞融合采取PEG细胞融合方法。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞按1:3-1:5的比例充分混匀，2 000rpm 25℃离心5min，弃上清，再加入适量的无血清RPMI-1640培养基重悬，2 000rpm 25℃离心5min以清洗细胞，弃上清，轻击管底，使细胞松散均匀，置37℃水浴预热，1min中加入0.8ml提前在37℃水浴中预热的PEG2000，边加边振荡。加完后继续振荡1min，然后在5min内按照1、2、3、3、3ml/min分别加入12ml预热至37℃的无血清RPMI-1640培养基，37℃静置10min，2 000rpm 25℃离心5min，弃上清，加入含15％FBS和HAT的RPMI-1640培养基重悬，分装到已铺有饲养细胞的96孔板中，于5％CO2培养箱培养。期间观察孔中细胞情况，待融合7d后，细胞生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，取上清进行抗体检测。
4.杂交瘤细胞的筛选：以0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液为包被液，以400倍稀释的超离病毒为包被抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜。PBST洗涤3次，拍干；将融合细胞上清，1:1 000稀释的Balb/c免疫小鼠阳性血清以及1:1 000稀释的小鼠阴性血清加入相应的孔内，100μl/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次，拍干；加入1:4 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自北京全式金生物技术有限公司)，100μl/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入底物TMB，100μl/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。酶标仪测定酶标板OD450nm值，P为各检测孔的OD450nm值，N为阴性血清的OD450nm值，当阴性血清OD450nm值≤0.1且阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm的比值≥2.1，即阴、阳性对照均成立的前提下，以P/N≥2.1判定为阳性孔的判定标准判定检测孔的阴阳性。隔2d后再检测一次，选择两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株进行亚克隆。
5.杂交瘤细胞的克隆化：将筛选出的阳性孔细胞株用台盼蓝染色，计数，用含15％FBS的RPMI-1640培养基稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释后的细胞悬液加入提前铺有饲养细胞的96孔板，每孔100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养，期间观察细胞株，待生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，按照之前建立的间接ELISA方法及时进行ELISA检测。记录单克隆细胞的阳性孔，并进行同样的亚克隆3次以上，直至克隆后所有的克隆细胞株上清检测均为阳性且各孔检测的OD450nm值较接近。将克隆化的CPIV3特异单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，冻存。
6.腹水的制备：将灭菌的液体石蜡腹腔注射10～12周龄的Balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，0.3mL/只，7d后，将杂交瘤细胞株2E6注射入小鼠腹腔，每只0.2mL(2×106～3×106个杂交瘤细胞)。7～10d后收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水，3 000rpm离心20min，收集上清，分装，标记并保存至-20℃备用。
7抗体特性分析：测定获得的2个单克隆抗体1F8和2E6的效价，结果见表1。
表1单克隆抗体腹水效价测定
细胞株 腹水效价
1F8 1:102400
2E6 1:204800
实施例2单克隆抗体的纯化和过氧化物酶标记
1.单克隆抗体纯化：将腹水在4000rpm、室温条件下离心15min，取上清。在4℃、搅拌条件下向腹水上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度达50％以沉淀免疫球蛋白，继续搅拌30min，然后在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，在4℃、搅拌条件下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度为33％，采用不同浓度硫酸铵分级沉淀免疫球蛋白，继续搅拌30min，在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，4℃透析过夜，得到单克隆抗体粗蛋白，测定抗体含量，-20℃冻存备用。将单克隆抗体粗蛋白采用Protein G预装柱(GE公司)进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml、浓度为0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续采用10ml、0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；采用5ml、0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体，在洗脱液中加入pH 8.0、1M的Tris-HCl中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。测定单克隆抗体腹水纯化后浓度与效价，结果见表2。
表2单克隆抗体腹水纯化后浓度与效价测定
单克隆细胞株 1F8 2E6
纯化后浓度(mg/mL) 8.0 8.4
纯化后腹水效价 1:409600 1:204800
2.酶标记多克隆抗体的制备
取纯化后的2E6单克隆抗体，与辣根过氧化物酶(HRP)偶联，得到酶标记抗体。具体方法如下：
(1)取5mg HRP溶于纯水，加入0.2ml、0.1M的NaIO4溶液，室温反应30分钟；
(2)将5mg纯化后的2E6单克隆抗体用偶联缓冲液(pH9.5、10mM的碳酸盐缓冲液)透析过夜；
(3)将步骤(1)所得溶液加入步骤(2)透析后所得抗体溶液中，室温反应2小时；
(4)加入硼氢化钠封闭反应位点；
(5)磷酸盐缓冲液透析过夜，得到酶标记抗体，加入等量甘油保存于-20℃。
将杂交瘤细胞株1F8和2E6送中国典型培养物保藏中心保藏。保藏信息如下：
分类命名为：杂交瘤细胞株1F8和2E6，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址：武汉大学，保藏编号分别为CCTCC NO：C2018151和CCTCC NO：C201627，保藏日期分别为2018年6月26日和2016年2月1日。
实施例3山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒的组装
选择杂交瘤细胞株1F8分泌的抗CPIV3单克隆抗体和过氧化物酶标记的2E6抗体制备试剂盒，检测不同的ELISA条件：包被抗体浓度、检测抗体使用浓度、反应时间等，最终确定试剂盒中成分及检测方法。
1.试剂盒组成
试剂盒：包括预包被酶标板、酶标记抗体工作液、样品稀释液、显色剂、终止液、洗涤液。
(1)试剂的配制
包被缓冲液(0.1M、pH值为9.6的CB缓冲液)：3.2克碳酸钠，5.86克碳酸氢钠，用纯水定容至1L。
样品稀释液：8g氯化钠，3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，10g牛血清白蛋白，0.02％(w/v)硫柳汞钠，用纯水定容至1L。
洗涤液：溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.1％。
封闭液：溶剂是0.1M、pH值为9.6的PBS缓冲液，溶质为BSA(牛血清白蛋白)，BSA在封闭液中的质量百分浓度为1％。
终止液：2M的硫酸水溶液。
显色液：商品化TMB one solution溶液(Promega公司，货号G7431)。
(2)双抗体夹心ELISA初步试验
将实施例2中纯化和标记的1F8单抗稀释至10μg/ml，每孔100μl包被ELISA板，每孔100μl，固定CPIV3抗原浓度(106TCID50)用标记的HRP-2E6，验证夹心ELISA效果。结果表明效果两种单抗检测阳性样品和阴性样品时出现明显差异，阴性样品检测值在0.11以下，阳性样品检测值在0.5以上，检测效果良好(表3)。因此选择1F8单抗作为包被单抗，HRP-2E6作为酶标二抗，建立双抗体夹心ELISA方法。
表3 1F8和HRP-2E6单抗夹心ELISA效果初步验证
Figure BDA0001821518720000121
(3)双抗体夹心ELISA条件优化
a.1F8抗体包被浓度和单克隆抗体HRP-2E6工作浓度的优化
用方阵滴定法确定最佳包被浓度及二抗浓度。将纯化的1F8单抗用包被缓冲液1:100倍稀释，然后连续稀释到1:1000，每孔加入100μl至ELISA板中，4℃过夜包被。然后甩去其中的液体，每孔200μl封闭液进行封闭，37℃封闭2h，洗涤液洗涤3次，拍干。向96孔酶标板中每孔加入100μl CPIV3病毒培养液及PBS对照，室温反应60min，洗涤液洗涤3次，拍干。再将HRP-2E6酶标二抗采用样品稀释液做1:200倍稀释，然后连续稀释至1:1500倍，每孔100μl，室温反应60min，洗涤液洗涤3次，拍干。加入TMB底物室温避光显色15min，然后每孔加入50μl终止液终止反应，读取OD450值，结果详见表4。
表4 1F8单抗包被浓度和HRP-2E6工作浓度的选择
Figure BDA0001821518720000131
由表4可知，阴性样品检测OD450值普遍小于0.1，阳性样品检测结果差异较大(0.387-1.22)。当1F8单抗包被稀释度在1:100-1:800范围内，HRP-2E6酶标二抗稀释度在1:200-1:800时，OD450检测值接近1.0，检测效果好。因此，单抗包被稀释度定为1:100-1:800，即10-80μg/ml，酶标二抗稀释度1:200-1:800，即10.5-42μg/ml，检测效果好。
b.抗原与二抗最佳反应时间优化
在步骤a的基础上进行CPIV3病原反应时间的优化。取包被好的ELISA(包被与封闭方法同步骤a)，加入接种CPIV3病毒的MDBK培养上清，分别室温静置孵育30min、60min、90min，然后洗涤3遍，拍干。再加入经1：400倍稀释的HRP-2E6二抗，分别室温静置孵育30min、45min、60min。洗涤3次，拍干。加入底物室温显色15min，然后每孔加入50μl终止液终止反应，读取OD450值(表5)。根据结果考虑方便性，选择OD450检测值接近1.0的作用时间为最佳反应时间，最终选择抗原孵育时间及酶标HRP-2E6孵育时间分别为60min、45min。
表5抗原与酶标单抗最佳反应时间优化
Figure BDA0001821518720000141
c.CPIV3双抗体夹心ELISA临界值的确定
用CPIV3双抗体夹心检测90份确定的CPIV3阴性临床样品，同时设标准阳性对照及阴性对照，经多次重复检测OD450值，最终确定本方法的阴阳性临界值判定标准如下：
实验成立条件：阳性对照平均OD值(PC)大于1.0；阴性对照平均OD值(NC)小于0.2；临界值计算方法：SP＝平均值(X)+3×标准差(SD)
经统计学分析，求出阴性样本OD450平均值X＝0.086，标准差SD＝0.006，则X+2SD＝0.098，X+3SD＝0.104。当OD450在0.104以上，则判断为阳性，即待检样品中含有山羊副流感病毒3型。当OD450在0.098-0.104之间，判断为疑似，需重新检测；当OD450nm低于0.098，判断为阴性，即待检样品中不含有山羊副流感病毒3型。
(4)预包被酶标板的制备
预包被酶标板的制备方法，包括如下步骤：
1)包被：采用包被缓冲液将纯化后的、由杂交瘤细胞株1F8制备的腹水中单克隆抗体(制备方法见实施例2)稀释至20μg/mL，得到包被工作液。将包被工作液按每孔100μL加入酶标板中，4℃静置12-18h。
2)封闭：将酶标板以洗板机吸干-洗涤二次，将板条在洁净的吸水纸上拍干；然后将封闭液按每孔150μL加入酶标板中，37℃孵育3小时。洗涤过程中采用洗涤液。
3)抽干密封：弃去孵育后的酶标板中的封闭液，拍干，放入真空冷冻干燥机中抽干3小时，真空热封。
(5)酶标记抗体工作液的配制
采用实施例2中方法制备酶标记单克隆抗体2E6，采用样品稀释液稀释至21μg/mL，得到酶标记抗体工作液，2～8℃避光保存。
2.试剂盒的具体使用方法
试剂盒的具体使用方法包括如下步骤：
(1)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
(2)加标准品/样本：在预包被酶标板的每孔中加入100μL样品稀释液(空白对照)、稀释后的样品或阴、阳性标准品，轻轻振荡混匀，37℃避光环境中作用60min。
(3)洗板：将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔充分洗涤3次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。
(4)加酶标记抗体工作液：加入酶标记抗体工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，37℃避光环境中反应45min，取出重复洗板步骤(3)。
(5)显色：每孔加入TMB 100μL，置于37℃避光环境中反应15min。
(6)测定：加入终止液100μL/孔，轻轻振荡混匀，在酶标仪中检测450nm波长处每孔的OD值，即得到OD450值。
3.试剂盒特性检验
(1)重复性实验
a.批内重复实验
使用同批制备的试剂盒在不同时间分别检测8份随机选择的临床样品，计算平均值X，标准差SD，变异系数CV。结果如表6，可见8份病料检测结果的变异系数在0.95％-17.7％之间，说明同批试剂盒在不同时间操作检测结果重复性良好。
表6批内重复实验结果
Figure BDA0001821518720000161
b.批间重复实验
使用三个不同批次制备的试剂盒在同时分别检测8份随机选择的临床样品，计算平均值X，标准差SD，变异系数CV。结果如表7，可见8份病料检测结果的变异系数在0.34％-5.76％之间，说明不同批试剂盒在同一时间操作检测结果重复性良好。
表7批间重复实验结果
Figure BDA0001821518720000162
(2)特异性实验
用本发明建立的方法对小反刍兽疫病毒(PPRV Nigeria75/1株，购自新疆天康生物科技有限公司)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV，本实验室保存)、边界病病毒(BDV，本实验保存)、蓝舌病病毒(BTV，本实验室保存)进行特异性试验，该方法只与CPIV3反应呈阳性，说明该方法具有很好的特异性。详细结果见表8。
表8特异性实验检测结果
CPIV3 PPRV BVDV BDV BTV
OD450值 1.247 0.046 0.057 0.031 0.048
(3)敏感性实验
对病毒含量为2.5×107TCID50/ml的CPIV3病毒液进行10倍比稀释，提取不同稀释度的病毒液中的蛋白，采用实施例4中试剂盒进行检测，结果如表9所示。从表9可见，该试剂盒最低可检测的病毒含量为2.5×102TCID50/ml。
表9敏感性实验检测结果
Figure BDA0001821518720000171
本发明建立的山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高，使用本发明只需采集鼻拭子、血清或其它含有CPIV3的样品，即可快速检测样品中是否含有CPIV3；本发明适合应用于养殖场是否感染CPIV3的大批量检测，也可用于灭活疫苗等含有CPIV3的样品检测。
以上详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒，包括预包被酶标板和酶标记抗体，其特征在于，所述预包被酶标板是采用分泌抗山羊副流感病毒3型单克隆抗体的杂交瘤细胞 1F8株分泌的抗山羊副流感病毒3型单克隆抗体包被的酶标板，所述酶标记抗体是辣根过氧化物酶标记的分泌抗山羊副流感病毒3型单克隆抗体的杂交瘤细胞 2E6株分泌的抗山羊副流感病毒3型单克隆抗体，所述分泌抗山羊副流感病毒3型单克隆抗体的杂交瘤细胞 2E6株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：C201627，所述分泌抗山羊副流感病毒3型单克隆抗体的杂交瘤细胞 1F8株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：C2018151。
2.根据权利要求1所述的山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体的包被量为10-80 μg/mL，酶标抗体的浓度为10.5-42 μg/mL。
3.根据权利要求1所述的山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括样品稀释液、显色剂、终止液和洗涤液；
所述样品稀释液为含有1%牛血清白蛋白（BSA）和0.02%硫柳汞钠的0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液；
所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.1%；
所述终止液为2M的硫酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的山羊副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测试剂盒在检测灭活疫苗中山羊副流感病毒3型的应用。
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