CN111172117B - 一种具有广谱性识别n9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有广谱性识别N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体及其应用。所述的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.18899的杂交瘤细胞株1C4分泌产生。本发明公开的单克隆抗体1C4除了可以与H7N9反应外，还可以与H1N9和H11N9等位于不同进化分支的N9亚型禽流感病毒发生特异性反应，具有良好的广谱性，同时对N9血清也具有良好的阻断效果。本发明还公开了利用单克隆抗体1C4制备的用于检测N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体的阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒具有良好的特异性和敏感性，适用于大规模临床血清样品中N9抗体的检测，具有良好的应用前景。

Description

一种具有广谱性识别N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单 克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种可分泌具有广谱性识别N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，同时涉及该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体及其应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

禽流感(AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的禽类急性传染病，被世界动物卫生组织列为A类烈性传染病。禽流感病毒(AIV)是一种单股负链分节段的RNA病毒，亚型众多，可根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原差异分为16种不同的HA亚型和9种不同的NA亚型，此外，还在蝙蝠体内分离到H17N10和H18N11亚型流感病毒。

NA是由片段6编码的一种II型糖蛋白，NA蛋白在结构上形成一个异源四聚体，每个NA蛋白单体都是由一段氨基端短的胞质区，疏水的跨膜区，茎部区和球状的头部区组成。NA蛋白具有神经氨酸酶活性，在病毒感染的后期，可以切割宿主细胞表面以及新生病毒粒子表面的唾液酸，进而促进新形成病毒粒子的释放和扩散，阻止新生病毒粒子在细胞表面的聚积。

H7N9亚型禽流感病毒不仅危害家禽生产，而且还对人类健康构成严重威胁。2013年3月，我国上海报道全球第一例人感染H7N9病例，随后该疫情迅速蔓延至全国各地，截止至2019年5月10日，已有1568人感染H7N9，其中615人死亡。因此，加强对N9亚型禽流感病毒的监测具有重要的公共卫生学意义。目前，国家流感中心的周剑芳研究员已成功研制出能够识别H7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体，然而，国家禽流感参考实验室监测数据显示，当前国内流行的N9亚型禽流感病毒除了H7N9外，还包括H1N9和H11N9等其他亚型组合，并且不同病毒之间的N9基因进化关系差异显著，给N9亚型禽流感病毒的监测增加了难度，因此，急需开发一种能够广谱性识别不同类型N9亚型禽流感病毒的诊断方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能够稳定分泌具有广谱性识别N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的具有广谱性识别N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体。

本发明的目的之三是将上述单克隆抗体应用于N9亚型禽流感的诊断和治疗。

本发明达到上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明首先选取3株位于不同进化分支的N9亚型禽流感病毒，将灭活后病毒依次间隔14天免疫6周龄BALB/c雌性小鼠，取免疫后小鼠脾脏与SP2/0细胞融合。利用间接免疫荧光方法筛选到1株能够稳定分泌具有广谱性抗N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为1C4，分类命名为杂交瘤细胞，该细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18899，保藏时间为2019年12月4日。

进一步的，本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的具有广谱性识别N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体1C4。经鉴定该抗体重链亚类为IgG2a，轻链亚类为κ链。杂交瘤细胞1C4上清ELISA效价为1:3200，小鼠腹水ELISA效价为1:204800。选择10株位于不同进化分支的N9亚型AIV作为包被抗原进行间接ELISA检测，结果1C4均能够与这10株病毒结合，表明1C4具有良好的广谱性。将N1-N9亚型AIV及新城疫病毒作为包被抗原进行间接ELISA检测，结果表明1C4只能与N9亚型AIV结合，表明1C4具有良好的特异性。

更进一步的，本发明还提出了所述的单克隆抗体在制备检测N9亚型禽流感病毒试剂中的用途。以及所述的单克隆抗体在制备治疗N9亚型禽流感药物中的应用。

更进一步的，本发明利用1C4较好的广谱性及特异性建立了一种检测N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体的阻断ELISA检测试剂盒及其检测方法。

所述的一种用于检测N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其中含有本发明所述的单克隆抗体。

其中，优选的，所述的试剂盒中还含有灭活抗原DK/FJ/S4170/2014(H7N9)、酶标板、包被液、PBST溶液、HRP标记的羊抗鼠二抗、TMB显色液以及终止液。

其中，优选的，所述的试剂盒用于检测N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体时，按照以下步骤进行：

(1)将HA效价为2⁸的灭活抗原DK/FJ/S4170/2014(H7N9)用包被液以1:80倍稀释后包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜；

(2)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入5％的脱脂乳溶液进行封闭，每孔200μL，37℃孵育1h；

(3)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入待测血清、阴性血清和阳性血清，每孔100μL，37℃孵育1h；

(4)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入1:6400倍稀释的本发明所述的单克隆抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；

(5)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入1:3000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育1h。

(6)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后避光加入TMB显色液，每孔100μL，显色15min，加入50μL的2M硫酸进行终止显色，并在酶标仪上读取OD450nm值。

实验证明，该方法敏感性高，重复性好，可以用于临床血清样品中N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体水平的检测，具有良好的开发前景。

附图说明

图1为N9基因进化树；

图2为N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体1C4的间接免疫荧光检测；

其中，A：1C4；B：阴性对照

图3为N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体1C4的Western Blot检测；

其中，M：蛋白Marker；1:1C4；2：阴性对照。

具体实施方式

为了能够更清楚的解释本发明，下面会结合具体的实施例对本发明进行详细说明，但本发明不仅局限于以下实施例。

实施例1N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

1.1免疫原的制备及动物免疫

根据进化关系，可以将近年来国内分离的N9亚型禽流感病毒的NA基因分为4个不同的进化分支(图1)，选择3株处于不同进化分支的N9亚型禽流感病毒(DK/FJ/S4170/2014(H7N9)，简称FJ4170；DK/CQ/S3180/2015(H11N9)，简称CQ3180；DK/HuN/S11670/2015(H11N9)，简称HuN11670)作为免疫原，其中FJ4170与CQ3180之间氨基酸同源性为92.6％；FJ4170与HuN11670之间的氨基酸同源性为94％；CQ3180与HuN11670之间的氨基酸同源性为94.6％。首先将病毒FJ4170、CQ3180和HuN11670进行10倍倍比稀释，并接种9-11日龄SPF鸡胚，置于37℃孵化箱内培养48h，收取尿囊液，按照1:2000的比例加入β-丙内酯灭活病毒，鸡胚接种后检测病毒灭活是否充分，并经无菌检验后置于-70℃保存备用。

选取8只6周龄雌性BALB/c小鼠，依次用灭活的FJ4170、CQ3180和HuN11670进行免疫，在融合前3天，利用FJ4170进行加强免疫，具体免疫程序如下(表1)：

表1制备N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体的免疫程序

1.2杂交瘤细胞株的制备

无菌采集小鼠脾脏，用2.5mL注射器的活塞研磨脾脏，使脾细胞均匀散开，然后移至无菌的50mL离心管中。用无血清的DMEM将SP2/0细胞吹下放置于含有脾细胞的离心管中，轻轻混合，800rpm离心10min，弃去上清。然后将离心管置于37℃水浴中，在45s内缓慢滴加1mL预热的PEG，同时晃动离心管，使其均匀混合。静置1min后，缓慢滴加无血清的DMEM至40mL，800rpm离心10min，弃掉上清。用含有37℃预热的含有1％HAT及20％FBS的DMEM将融合后的细胞重悬分装至96孔板中，每孔100μL，随后放置于含有5％CO₂的37℃细胞培养箱中培养。

1.3阳性杂交瘤细胞的筛选

待细胞孔内的杂交瘤细胞生长到一半左右时，吸取细胞上清进行IFA检测，确定阳性孔。筛选前一天用真核表达质粒pCAGGS-N9(FJ4170)转染293T细胞，培养24h后弃去细胞上清，并用PBST溶液清洗3次，然后加入福尔马林固定液，每孔100μL，室温固定30min。固定后用PBST溶液清洗3次，然后加入5％脱脂乳溶液进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h或者4℃过夜，封闭后同上洗涤3次。吸取融合后的杂交瘤细胞上清100μL至293T细胞板中，1:400稀释的小鼠阴阳性血清作为阴阳性对照，37℃孵育1h，同上洗涤3次。然后每孔加入100μL的1:1000倍稀释的FITC标记的羊抗鼠荧光二抗，37℃孵育1h，同上洗涤3次，该过程在避光环境下进行。然后利用荧光显微镜观察结果，最终筛选到1株可识别N9蛋白的杂交瘤细胞，命名为1C4。该细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18899，保藏时间为2019年12月4日。

1.4阳性杂交瘤细胞1C4的亚克隆

首先将阳性杂交瘤细胞1C4孔内细胞轻轻吹打混匀后进行细胞计数，并将细胞用含20％FBS的DMEM稀释至10mL中含有大约100个细胞，混合均匀后加至96孔板中，每孔100μL，然后每孔再补加100μL含20％FBS的DMEM培养液，置于含5％CO₂的37℃细胞培养箱内培养。每日观察细胞情况直至出现细胞集落，并标记好单细胞孔，待细胞长至一半左右时进行阳性杂交瘤细胞筛选。如此重复亚克隆3次。

1.5单克隆抗体1C4的制备

小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，每只注射0.5mL。注射3d后，将细胞状态良好的杂交瘤细胞1C4吹下，800rpm离心10min，弃去上清，用无菌PBS重悬细胞，再次进行离心，弃上清。加入无菌PBS重悬细胞，并进行细胞计数，将细胞稀释至每500μL中含有5×10⁵个细胞。均匀混合细胞稀释液，然后注射到小鼠腹腔，每只注射500μL。细胞注射后7-10d内，每日观察小鼠状态，待小鼠腹部肿胀时，用注射器吸取小鼠腹水，4℃过夜后，4500rpm离心10min，收集腹水上清，并置于-70℃冰箱备用。

1.6单克隆抗体1C4的亚类鉴定

用无血清培养基培养1C4杂交瘤细胞，并收集细胞上清，根据抗体亚类鉴定试剂盒说明书对1C4的亚类进行鉴定。确定其重链亚类为IgG2a，轻链亚类为κ链。

1.7单克隆抗体1C4的效价测定

将N9亚型AIV配制成8单位抗原并包被酶标板，4℃过夜。用PBST洗涤3次后加入200μL的5％脱脂乳溶液进行封闭，37℃孵育1h。将1C4杂交瘤细胞上清或者腹水进行梯度稀释作为一抗，37℃孵育1h。洗涤后加入1:3000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育1h。洗涤后加入TMB显色液进行避光显色，每孔100μL，显色15min后每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止显色，并在酶标仪上读取OD₄₅₀nm值。最终确定杂交瘤细胞上清ELISA效价为1:3200，腹水ELISA效价为1:204800。

1.8单克隆抗体1C4的IFA检测

利用1.3中的方法对1C4细胞上清进行IFA检测，其中转染用质粒为构建好的pCAGGS-NA(CQ3180)真核表达重组质粒。一抗为细胞上清，二抗为1:1000倍稀释的FITC标记的羊抗鼠荧光二抗，并在荧光显微镜下记录结果。结果发现1C4能够与CQ3180的N9蛋白反应发出绿色荧光(图2)。

1.9单克隆抗体1C4的Western Blot检测

将全病毒FJ4170与5×SDS-PAGE上样Buffer混合加热变性后进行电泳，转膜。转膜结束后，用5％脱脂乳溶液进行封闭，37℃孵育2h。用PBST溶液洗涤，每次5min。将1C4细胞上清作为一抗，置于37℃摇床1h，同上方法洗膜后加入1:1000倍稀释的红外标记抗鼠二抗，37℃的避光孵育1h。同上方法洗膜后置于红外扫膜仪上扫描结果。结果发现1C4能够与FJ4170的N9蛋白发生特异性反应(图3)。

1.10单克隆抗体1C4的特异性检测

选择N1-N9亚型AIV及新城疫病毒作为抗原，并将这些病毒配制成8单位抗原包被酶标板，4℃过夜。用PBST洗涤3次后加入200μL的5％脱脂乳溶液进行封闭，37℃孵育1h。以1C4细胞上清作为一抗，37℃孵育1h。洗涤后加入1:3000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二色15min后每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止显色，并在酶标仪上读取OD₄₅₀nm值。结果显示1C4只能与N9亚型AIV结合(表2)，表明1C4具有良好的特异性。

表2 N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体1C4的特异性检测

1.11单克隆抗体1C4的广谱性检测

选择10株处于不同进化分支N9亚型AIV作为包被抗原，并将这些病毒配制成8单位抗原包被酶标板，4℃过夜。用PBST洗涤3次后加入200μL的5％脱脂乳溶液进行封闭，37℃孵育1h。以1C4细胞上清作为一抗，37℃孵育1h。洗涤后加入1:3000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二色15min后每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止显色，并在酶标仪上读取OD₄₅₀nm值。结果显示1C4均能与10株处于不同进化分支的N9亚型AIV反应(表3)，表明1C4具有良好的广谱性。

表3 N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白单克隆抗体1C4广谱性检测

实施例2 N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断ELISA检测方法的建立

2.1N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶抗体阻断ELISA操作方法

(1)将HA效价为2⁸的灭活抗原DK/FJ/S4170/2014(H7N9)用包被液(50mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6))以1:80倍稀释后包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜。

(2)弃去上清，用PBST溶液(含0.05％Tween-20的50mmol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液)清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入含5％w/w脱脂乳的PBST溶液进行封闭，每孔200μL，37℃孵育1h。

(3)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入待测血清、阴性血清和阳性血清，每孔100μL，37℃孵育1h。

(4)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入1:6400倍稀释的单抗腹水1C4，每孔100μL，37℃孵育1h。

(5)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后加入1:3000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育1h。

(6)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔200μl，洗涤3次后避光加入TMB显色液，每孔100μL，显色15min，加入50μL的2M硫酸进行终止显色，并在酶标仪上读取OD₄₅₀nm值。

2.2临界值的确定

选择60份阴性血清做1:160倍稀释，并将SPF鸡血清作为阴性对照，利用建立好的阻断ELISA方法测定这60份血清抑制率(表4)，并求得平均抑制率为4.51％，标准偏差为3.18％。根据临界值判定标准计算出阳性临界值为16.52％，阴性临界值为12.90％。处于两者中间的判定为疑似，重新测定后若依然小于阳性临界值，则判定为阴性。

表4 N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断ELISA检测方法临界值的测定

2.3阻断ELISA方法的特异性检测

选择N1-N9亚型AIV血清以及新城疫病毒血清进行阻断ELISA方法检测，将SPF鸡血清作为阴性对照，抑制率结果显示除N9亚型血清以外其余血清的抑制率均小于阴性临界值(表5)，表明此方法具有较好的特异性。

表5 N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断ELISA检测方法的特异性检测

2.4阻断ELISA方法的重复性检测

选择5份血清样本分别在一块酶标板上重复4次以及四块酶标板上进行重复，求得平均抑制率X及标准偏差SD，变异系数CV(％)＝SD×100％/X。计算出板内变异系数在1.33％-5.92％之间；板间变异系数在1.97％-7.69％之间(表6)，均小于10％，表明此方法具有良好的重复性。

表6N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断ELISA检测方法的重复性检测

2.5阻断ELISA方法的敏感性检测

选择30份背景清楚的阳性血清进行阻断ELISA方法检测，并计算出抑制率在27.83％-75.31％之间(表7)，符合率100％，表明此方法具有良好的敏感性。

表7N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体阻断ELISA检测方法的敏感性检测

以上结果表明本发明建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、重复性及敏感性，能够用来检测临床血清样品中N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体水平。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一株能够稳定分泌具有广谱性抗N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为1C4，该细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.18899，保藏时间为2019年12月4日。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的具有广谱性抗N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测N9亚型禽流感病毒试剂中的用途。

4.一种检测N9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求2所述的单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有灭活抗原DK/FJ/S4170/2014 (H7N9)、酶标板、包被液、PBST溶液、HRP标记的羊抗鼠二抗、TMB显色液以及终止液。

6.一种药物组合，其特征在于，包含权利要求2所述的单克隆抗体。

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