KR101835682B1 - H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트 - Google Patents
H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트에 관한 것으로, 본 발명에서는 2종의 H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 항원에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 하이브리도마 세포주를 제조하였으며 상기 단클론항체를 활용한 형광면역키트를 통해 H7 아형 인플루엔자 바이러스를 신속하게 검출할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 단클론항체는 신속진단이 가능한 신속 키트에 사용될 수 있으며, 이런 항원-항체 진단키트는 국내뿐 아니라 해외에서 인플루엔자가 발생하고 있거나 발생 가능성이 있는 국가에 보급함으로써 선두 주자로서의 시장 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트에 관한 것이다.
조류에서 발생한 인플루엔자는 수용체의 특이성 때문에 종 간 장벽(species barrier)을 거슬려 사람에게 쉽게 감염되지 않았으나, 두 가지 아형인 H5N1과 H7N9은 그 수용체의 특이성을 전환시켜 사람에게 감염되어 심각한 호흡기 질환을 유발하는 고병원성 바이러스 병원체이다. 2013~2014년 중국으로부터 확산되었던 H7형 인플루엔자 바이러스는 379명의 환자와 135명의 사망자를 발생하였다.
인플루엔자 바이러스의 감염의 전파를 막기 위해서는 현장에서 신속한 면역진단을 통하여 감염의 전파차단을 일차적으로 막을 수 있는 고감도의 항원-항체 진단키트의 개발이 시급한 실정이다.
인체 항원-항체 진단키트 개발은 현재 진행 중에 있으며, 본 발명에서 인플루엔자 H7N9 헤마글루티닌(HA, Haemagglutinin) 항원에 특이성이 있는 단클론항체(Monoclonal antibody)를 개발하였다.
인간에 대한 H7 아형을 특이적으로 진단하는 조류 인플루엔자 진단법은 가장 민감한 방법으로 바이러스 분리 및 배양법이 있으나 2~3주 걸리고, 혹은 유전자 진단법으로 RNA 분리 후 rRT-PCR를 수행하게 되지만, RNA의 불안정성, 고가의 장비 필요, 숙련공이 필요하여 현장에서 진단을 신속하게 수행하기에 단점이 있다.
조류인플루엔자 신속 진단법은 현재 약 80% 민감도밖에 되지 않으므로, 바이러스 검출율이 높고, 고병원성 H7 아형을 특이적으로 진단할 수 있는 고민감한 항체 및 이를 활용한 신속진단시스템 개발이 필요하다.
한편, 한국등록특허 제1421460호에서는 'H5 조류 인플루엔자 진단 및 감시를 위해 유용한 H5 서브타입-특이적 결합 단백질'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1211593호에서는 '신속 면역크로마토그라피법에 의한 Ｈ9형 조류인플루엔자 바이러스 진단 키트 및 이를 이용하여 Ｈ9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 'H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속형광면역 진단키트'에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 2종의 인플루엔자 H7 아형 바이러스 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 하이브리도마 세포주를 제조하였다. 상기 단클론항체를 활용한 형광면역키트를 통해 H7 아형 인플루엔자 바이러스를 신속하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 개발된 단클론항체는 H7 아형 인플루엔자 바이러스를 신속하게 진단할 수 있는 신속 키트에 사용될 수 있으며, 이런 항원-항체 진단키트는 국내 뿐 아니라 해외에서 인플루엔자가 발생하고 있거나 발생 가능성이 있는 국가에 보급함으로써 선두 주자로서의 시장 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 H7N9형 인플루엔자 바이러스의 HA 재조합항원으로 면역된 마우스(M6)의 혈청내 항체가를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 음성대조군으로는 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 2는 세포융합 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 하이브리도마 세포(hybridoma cell)(6CH7)로부터 분비한 항체가를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 양성대조군(positive)으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 3은 제한개수희석법(limiting dilution)을 수행한 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 단클론세포주(6CH7-CD7)로부터 분비한 항체가 측정 결과이다. 양성대조군으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 4는 본 발명에 따른 단클론항체 6D7의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 양상을 SDS-PAGE(전기영동법)으로 확인한 결과이다. M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 5는 H7N9형 인플루엔자 바이러스의 HA 재조합항원으로 면역된 마우스(M)의 혈청내 항체가를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 음성대조군으로는 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 6은 세포융합 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 하이브리도마 세포(hybridoma cell)(2DC7)로부터 분비한 항체가를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 양성대조군(positive)으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 7은 제한개수희석법(limiting dilution)을 수행한 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 단클론세포주(2DC7-AF4)로부터 분비한 항체가 측정 결과이다. 양성대조군으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 8은 본 발명에 따른 단클론항체 2F4의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 양상을 SDS-PAGE(전기영동법)으로 확인한 결과이다. M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 단클론항체 6D7의 각 아형 바이러스로 감염된 배양세포에서의 반응성을 면역화학염색법으로 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 단클론항체 2F4의 각 아형 바이러스로 감염된 배양세포에서의 반응성을 면역화학염색법으로 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 단클론항체 2F4 및 6D7의 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다. M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 12는 본 발명에 따른 단클론항체 2F4 및 6D7의 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 indirect ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 단클론항체 2F4 및 6D7를 이용한 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 신속 형광면역진단시스템(형광면역크로마토그라피법 스트립 형태)의 구성 모식도를 나타낸다.
도 14는 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 인플루엔자 바이러스에 대한 검출 성능을 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 서로 다른 아형(H5N3, H1N1, H7N7, H7N1) 바이러스에 대한 검출 성능을 확인한 결과이다.
도 16는 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 H7N7형 인플루엔자 바이러스에 대한 검출 성능을 확인한 결과이다.
도 17은 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 H7N1형 인플루엔자 바이러스에 대한 검출 성능을 확인한 결과이다.
도 2는 세포융합 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 하이브리도마 세포(hybridoma cell)(6CH7)로부터 분비한 항체가를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 양성대조군(positive)으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 3은 제한개수희석법(limiting dilution)을 수행한 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 단클론세포주(6CH7-CD7)로부터 분비한 항체가 측정 결과이다. 양성대조군으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 4는 본 발명에 따른 단클론항체 6D7의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 양상을 SDS-PAGE(전기영동법)으로 확인한 결과이다. M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 5는 H7N9형 인플루엔자 바이러스의 HA 재조합항원으로 면역된 마우스(M)의 혈청내 항체가를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 음성대조군으로는 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 6은 세포융합 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 하이브리도마 세포(hybridoma cell)(2DC7)로부터 분비한 항체가를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 양성대조군(positive)으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 7은 제한개수희석법(limiting dilution)을 수행한 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 단클론세포주(2DC7-AF4)로부터 분비한 항체가 측정 결과이다. 양성대조군으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 8은 본 발명에 따른 단클론항체 2F4의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 양상을 SDS-PAGE(전기영동법)으로 확인한 결과이다. M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 단클론항체 6D7의 각 아형 바이러스로 감염된 배양세포에서의 반응성을 면역화학염색법으로 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 단클론항체 2F4의 각 아형 바이러스로 감염된 배양세포에서의 반응성을 면역화학염색법으로 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 단클론항체 2F4 및 6D7의 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다. M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 12는 본 발명에 따른 단클론항체 2F4 및 6D7의 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 indirect ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 단클론항체 2F4 및 6D7를 이용한 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 신속 형광면역진단시스템(형광면역크로마토그라피법 스트립 형태)의 구성 모식도를 나타낸다.
도 14는 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 인플루엔자 바이러스에 대한 검출 성능을 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 서로 다른 아형(H5N3, H1N1, H7N7, H7N1) 바이러스에 대한 검출 성능을 확인한 결과이다.
도 16는 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 H7N7형 인플루엔자 바이러스에 대한 검출 성능을 확인한 결과이다.
도 17은 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 H7N1형 인플루엔자 바이러스에 대한 검출 성능을 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)은 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 항원성 당단백질이다. HA는 인플루엔자 바이러스 표면에 있는 주요 단백질로 3개의 단량체로 구성된 삼량체 형태이다. 각 단량체는 이황화결합으로 연결된 HA1과 HA2의 두 개의 도메인으로 구성되어 있으며, 구조적으로 둥근 머리 부분과 줄기 부분으로 나누어 볼 수 있다. HA1은 시알릭산(sialic acid)을 포함하는 수용체와 결합하여 숙주 세포를 인식하고, HA2는 수용체를 포함하는 숙주세포 막과 HA1을 포함하는 바이러스 막의 융합을 일으켜 숙주 세포에 바이러스 게놈을 삽입하는 역할을 수행한다.
본 발명에서 용어 '단클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단클론항체는 단세포군 항체 또는 단일클론항체라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 단클론항체는 한국생명공학연구원에 2016년 10월 28일자로 기탁된, 기탁번호가 KCTC 13141BP인 하이브리도마 세포주(H7N9-HA-2F4)에 의하여 생산되는 단클론항체 2F4 또는 기탁번호가 KCTC 13142BP인 하이브리도마 세포주(H7N9-HA-6D7)에 의하여 생산되는 단클론항체 6D7인 것을 특징으로 한다.
상기 단클론항체는 H7 아형 인플루엔자 바이러스의 HA에 특이적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게는 H7N1, H7N7 및 H7N9 바이러스의 HA에 특이적으로 결합할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 단클론항체는 인플루엔자 A H7N9 A/Anhui/2013 바이러스의 HA1 subunit 항원을 사용하여 면역된 마우스 비장세포로부터 세포융합기술에 의해 획득한 하이브리도마 세포로부터 생산되는 항체 2종을 제작하였으며, 이를 각각 2F4, 6D7로 명명하였다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 하이브리도마 세포주는 기탁번호가 KCTC 13141BP 또는 KCTC 13142BP인 하이브리도마 세포주이다.
본 발명의 단클론항체 2F4는 한국생명공학연구원에 2016년 10월 28일자로 기탁된 KCTC 13141BP인 하이브리도마 세포주로부터 제조된 것이며, 또 다른 단클론 항체 6D7는 한국생명공학연구원에 2016년 10월 28일자로 기탁된 KCTC 13142BP인 하이브리도마 세포주로부터 제조된 것이다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 포함하며, 바람직하게는 기탁번호가 KCTC 13141BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 2F4 또는 기탁번호가 KCTC 13142BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 6D7를 포함하며, 상기 항체를 이용하여 H7 아형 인플루엔자 바이러스의 HA 항원에 대해 형성된 항원-항체 복합체를 검출함으로써 H7 아형 인플루엔자 바이러스를 면역학적으로 검출할 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 H7 아형 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있으며, 바람직하게는 H7N1, H7N7 및 H7N9 바이러스를 검출할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 H7 아형 인플루엔자 바이러스 HA 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론 항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 양자점, 플루오레세인, Eu3 +, Eu3 + 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 또는 125I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단클론항체 또는 이의 절편은 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 포함되는 단클론항체는 기탁번호가 KCTC 13141BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 2F4 또는/및 기탁번호가 KCTC 13142BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 6D7일 수 있으며, 바람직하게는 단클론항체 2F4 및 6D7일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC 13141BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 2F4가 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC 13142BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 6D7이 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 형광체-항체 복합체는 라텍스 비드에 친수성 화합물이 코팅된 양자점이 결합되고, 상기 라텍스 비드 표면에 항체가 결합된 양자점-라텍스 비드-항체 복합체일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 라텍스 비드는 양자점 및 항체가 결합할 수 있는 매개체로서 사용할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 양자점 및 항체가 결합할 수 있도록 다수의 반응성 아미노기가 존재하는 라텍스 비드인 것이 바람직하다. 상기 라텍스 비드의 직경은 10~2,000nm인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 50~1,000nm인 것이며, 더욱더 바람직하게는 100nm인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 라텍스 비드 및 친수성 화합물이 코팅된 양자점은 1:40~1,000의 몰비로 결합된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1:70~800의 몰비로 결합된 것이며, 더욱더 바람직하게는 1:90의 몰비로 결합한 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 라텍스 비드 및 인플루엔자 바이러스 항체는 1:50~500의 몰비로 결합된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1:100~470의 몰비로 결합된 것이고, 더욱더 바람직하게는 1:455의 몰비로 결합된 것이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 라텍스 비드와 친수성 화합물이 코팅된 양자점의 결합은 라텍스 비드 표면에 있는 아미노기와 양자점에 포함된 카르복실기 사이의 아마이드 결합인 것이 특징이며, 상기 라텍스 비드와 인플루엔자 바이러스 항체의 결합은 라텍스 비드 표면에 있는 카르복실기와 인플루엔자 바이러스 항체에 포함된 아미노기 사이의 아마이드 결합인 것이 특징이다.
상기 양자점은 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴설파이드(CdS), 카드뮴텔로리움(CdTe), 징크텔로리움(ZnTe), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크설파이드(ZnS), 징크옥사이드(ZnO), 인듐 인화물(InP), 인듐 비화물(InAs), 머큐리텔로리움(HgTe) 및 머큐리셀레나이드(HgSe) 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 양자점의 직경은 1~30nm인 것이 바람직하지만, 더 바람직하게는 2~20nm이지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 양자점의 발광파장은 450~700nm인 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 적용한 키트는 안정하여 장기간 보관하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 검출용 키트는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 시료를 투입할 수 있는 시료주입부가 구비되고, 상기 시료 주입부로부터 일정 간격을 유지하면서 양자점-라텍스 비드-H7 아형 인플루엔자 바이러스 특이 항체 2F4가 축합된 복합체가 건조된 축합 패드, H7 아형 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 다른 항체 6D7이 고정된 검사선 및 상기 축합 패드에 존재하는 단클론항체를 검출할 수 있는 이차 항체가 고정된 대조선이 순차적으로 구비된 면역스트립일 수 있다.
상기 인플루엔자 바이러스 검출용 키트에 H7 아형 인플루엔자 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 형광빛띠가 나타나면 H7 아형 인플루엔자 바이러스 감염을 양성으로 판정하고, 대조선에만 형광빛띠가 나타나면 H7 아형 인플루엔자 바이러스 감염을 음성으로 판정할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 키트는 H7N7 및 H7N1 바이러스에 대하여 각각 10HAU/㎖ 및 20HAU/㎖에서도 반응성을 나타내었으며, 그에 반해 H1N1 또는 H5N3 바이러스에 대해서는 1000HAU/㎖에서도 반응하지 않음을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 키트가 H7 아형 바이러스를 신속하게 진단할 수 있는 키트임을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인플루엔자 H7N9 HA 항원 특이 단클론항체 6D7
1) 인플루엔자 H7N9 HA 항원의 마우스 면역
인플루엔자 HA(H7N9 A/Anhui/2013, HA1 subunit) 재조합항원(50㎕ 및 25㎕)을 마우스에 2주 간격으로 3회 면역시켜 마우스 혈청 내에서 높은 항체가를 ELISA(면역효소검사법)로 확인하였다(도 1).
2) 세포융합기술 시행 및 잡종세포 확보
면역된 마우스의 비장세포(splenocytes)들을 얻은 다음, 암세포의 일종인 F/O 세포들과 세포융합기술(cell fusion technique)을 시행하여 여러 잡종세포(hybridoma cell) 중 6CH7 클론(clone)을 택하여, 96-웰 플레이트로부터 75T 배양 플라스크로 점차 수를 늘려 배양하였고 항체를 분비하고 있음을 확인하였다(도 2).
3) 단클론항체를 분비하는 단클론세포주 확보
높은 항체를 분비하는 1개의 클론 즉, 6CH7 세포를 택하여 96-웰 플레이트에서 제한개수희석법(limiting dilution)을 시행하였으며, 각각 웰에서 항체가가 가장 높은 단클론세포주인 6CH7-CD7(6D7으로 명명)를 선택하였다(도 3). 단클론세포주(monoclone) 6D7을 75T 배양 플라스크에서 대량으로 배양한 후 항체를 분비함을 확인하였는데, 6D7 단클론세포주가 분비하는 단클론항체(monoclonal antibody)의 항체가(ELISA O.D value)는 0.975 이였다(도 3).
4) 단클론항체의 대량생산과 정제
단클론항체의 대량생산을 위해 6D7 단클론세포주를 마우스 복강 내로 주입하여 복수가 생성되면 채취하였고, 단백질 A 칼럼(protein A column)을 이용하여 단클론항체를 정제하였다(도 4).
실시예
2. 인플루엔자 H7N9 HA 항원 특이 단클론항체 2F4
1) 인플루엔자 H7N9 HA 항원의 마우스 면역
인플루엔자 HA(H7N9 A/Anhui/2013, HA1 subunit) 재조합항원(50㎕ 및 25㎕)을 마우스에 2주 간격으로 3회 면역시켜 마우스 혈청 내에서 높은 항체가를 ELISA(면역효소검사법)로 확인하였다(도 5).
2) 세포융합기술 시행 및 잡종세포 확보
면역된 마우스의 비장세포(splenocytes)들을 얻은 다음, 암세포의 일종인 F/O 세포들과 세포융합기술(cell fusion technique)을 시행하여 여러 잡종세포(hybridoma cell)중 2DC7 클론(clone)을 택하여, 96-웰 플레이트로부터 75T 배양 플라스크로 점차 수를 늘려 배양하였고 항체를 분비하고 있음을 확인하였다(도 6).
3) 단클론항체를 분비하는 단클론세포주 확보
높은 항체를 분비하는 1개의 클론 즉, 2DC7 세포를 택하여 96-웰 플레이트에서 제한개수희석법(limiting dilution)을 시행하였으며, 각각 웰에서 항체가가 가장 높은 단클론세포주인 2DC7-AF4(2F4로 명명)를 선택하였다(도 7). 단클론세포주(monoclone) 2F4을 75T 배양 플라스크에서 대량으로 배양한 후 항체를 분비함을 확인하였는데, 2F4 단클론세포주가 분비하는 단클론항체(monoclonal antibody)의 항체가(ELISA O.D value)는 1.168 였다(도 7).
4) 단클론항체의 대량생산과 정제
단클론항체의 대량생산을 위해 2F4 단클론세포주를 마우스 복강내로 주입하여 복수가 생성되면 채취하였고, 단백질 A 칼럼을 이용하여 단클론항체를 정제하였다(도 8).
실시예
3. 항체의 특이성 조사(Immunofluorescent microscopy)
MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포를 커버슬립에 배양한 뒤 각 아형 바이러스로 MOI=0.5로 감염시킨 뒤 12시간 뒤에, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였다. 고정 후 PBST로 3번 세척후 0.1% Triton×100으로 20분동안 처리하였다. PBS로 세척후 5% BSA로 2시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)하였다. PBS로 세척후 1st 항체(6D7, 2F4)을 각각 1:5000로 블로킹 버퍼(blocking buffer)에 희석하여 1시간동안 반응시켰다. PBS로 세척 후 염소 항 마우스 IgG-FITC 항체(Goat pAb to Ms IgG FITC, ab6758)를 1:3000로 희석하여 1시간동안 암실에서 반응시키고 PBS로 세척하였다. DAPI-mounting medium으로 표면을 마운팅하고 형광현미경으로 관찰하였다.
상기 실험 결과 두 항체는 H7N1과 H7N7 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 항체임을 확인하였다(도 9 및 10).
실시예 4. 항체의 에피토프(Epitope) 조사
(1) 웨스턴 블롯(Western blot)
각 바이러스를 1000 HAU/lane 으로 웨스턴 블롯용으로 겔에 로딩시킨 이후 1차 항체로 2F4 및 6D7를 각각 5㎍/㎖로 반응시킨 결과, 2F4는 선형 에피토프(linear epitope)를 인식하고 HA1과 HA0에 모두 반응할 수 있음을 확인하였다(도 11).
(2) Indirect ELISA
각 바이러스를 1000 HAU/㎖로부터 75㎕를 96-웰 플레이트에 37도에서 2시간동안 코팅한 뒤 5% BSA로 블로킹하였다. 이후 1차 항체로 2F4와 6D7을 각각 10㎍/㎖로 넣은 뒤에 37도에서 약 한시간 동안 반응시킨 뒤 3회 PBS-T로 세척하였다. 이후 항-마우스 IgG HRP(anti-mouse IgG HRP)로 37도에서 45분 동안 반응시켜 세척하고 TMB를 넣어 발색을 측정하였다. 그 결과 두 항체 모두 H7 아형(subtype) 바이러스에 대해 다른 아형 바이러스보다 강한 결합력을 보임을 확인하였다(도 12).
실시예
5. 6
D7
(
strip
점적용
)+ 2F4(
축합
항체)를 활용한
진단키트
제작
(1) 형광체-항체 복합체 제조
먼저, 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체를 하기에 기재된 방법에 의해 준비하였다. 구체적으로 약 100nm 크기의 0.044μM 아미노 라텍스(amine latex, life technology사) 50㎕에 세척완충액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH8)을 가하여 1회 세척하고, 친수성 화합물로 코팅된 0.1μM 양자점을 1:90의 몰비로 혼합하고, 0.01M 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 200㎕ 및 0.01M N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS) 300㎕을 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 원심분리(17000rpm, 5분)를 통해 결합하지 않은 양자점을 제거하고, 침전물을 상기 세척완충용액을 가하여 1회 세척한 후, 다시 원심분리하여 상기 세척 완충용액 200㎕에 분산하여 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체를 제조하였다. 상기 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체의 발광파장은 640nm를 나타낸다.
상기 양자점-라텍스 비드 복합체에서 양자점이 결합되지 않은 라텍스 비드 표면의 아미노기에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 결합하여 라텍스 비드 표면을 카르복실기로 치환하였다.
상기 양자점-라텍스 비드 복합체에서 양자점이 결합되지 않은 라텍스 비드의 카르복실기와 6D7 항체(1㎎/㎖)를 1:455의 몰비로 혼합하고, 0.01M 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 100㎕ 및 0.01M N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS) 150㎕을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 비특이반응을 제거하기 위해, 0.1%의 BSA, 1%의 자당(sucrose), 1%의 젤라틴(gelatin) 및 0.01%의 카제인(casein)을 포함하는 블로킹용액에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 원심분리(15,000rpm, 5분)를 통해 결합하지 않은 인플루엔자 바이러스 항체를 제거하고, 침전물을 상기 세척완충용액(pH7.4)을 가하여 1회 세척한 후, 다시 원심분리하여 상기 세척완충용액(pH7.4) 500㎕에 분산하여 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 제조하였다. 다시 말해, QD640를 형광체를 사용하여 형광-항체(2F4) 축합체를 제조하였다.
(2) 진단스트립 키트 제작
상기 제조한 양자점-라텍스 비드-항체(2F4) 복합체를 포함하는 H7 아형 특이 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제작하였다. 이때 6D7 단클론항체는 검사선에 점적하는(coating) 항체이고, 2F4 단클론항체는 양자점-라텍스 비드와 축합된 항체 복합체로서의 검출(detection)용으로 사용한 항체로써, 두 항체를 한 셋트로 만든 래피드 키트이다.
구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를 결합시켜서 비후강검체 시료를 투입할 수 있는 시료 주입부를 구비시켰다. 상기 검체 패드와 일정 간격을 두고, 상기 0.88nM 형광-항체(2F4) 축합체 2㎕를 가한 다음 일정 간격을 두고, 검사선(Test line; T)을 설정한 다음, 상기 검사선에 인플루엔자 바이러스에 대한 항체(6D7)를 2.5㎍을 가하여 고정시켰다. 상기 검사선에 고정한 인플루엔자 바이러스에 대한 항체는 6D7 단클론항체이다.
상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선(Control line; C)을 설정한 다음, 상기 대조선에 인플루엔자 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차항체(마우스 IgG에 대한 항체) 2㎍을 가하여 고정시켰다.
그 결과로서, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광 검출 키트를 제작하였다(도 13).
실시예
6. 6
D7
(
strip
점적용
)+ 2F4(
축합
항체)를
진단키트에
활용한
H7
아형 특이 인플루엔자 바이러스
검출력
검증
양성 대조군 HA1(H7N9)을 Sino biological에서 구매(Cat# 40103-V08H1)하여 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 수행하여 검출한계는 31ng/㎖까지 검출할 수 있음을 확인하였다(도 14).
서로 다른 아형(H5N3, H1N1, H7N7, H7N1) 바이러스를 검사한 결과 높은 역가(1000 HAU/㎖)에서 H7 아형에만 반응하고 H1N1나 H5N3에 대해서는 반응하지 않음을 확인하였다(도 15).
H7 아형 바이러스(H7N7, H7N1)의 검출한계를 측정한 결과 H7N7 바이러스에 대해 10HAU/㎖로 계산되었고, H7N1 바이러스에 대해서는 20HAU/㎖로 계산되었다(도 16 및 17).
Claims (11)
- H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단클론항체로서,
상기 단클론항체는 기탁번호가 KCTC 13141BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 2F4 또는 기탁번호가 KCTC 13142BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 6D7인 것을 특징으로 하는 단클론항체. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 H7 아형 바이러스는 H7N1, H7N7 또는 H7N9 바이러스인 것을 특징으로 하는 단클론항체.
- 기탁번호가 KCTC 13141BP 또는 KCTC 13142BP인, 제1항의 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
- 삭제
- 제1항의 단클론항체를 포함하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.
- 제1항의 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출방법.
- 제1항의 단클론항체를 포함하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 단클론항체는 기탁번호가 KCTC 13141BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 2F4 및 기탁번호가 KCTC 13142BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 6D7인 것을 특징으로 하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.
- 제9항에 있어서, 상기 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC 13141BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 2F4가 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC 13142BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 6D7이 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.
- 제10항에 있어서, 상기 형광체-항체 복합체는 라텍스 비드에 친수성 화합물이 코팅된 양자점이 결합되고, 상기 라텍스 비드 표면에 항체가 결합된 양자점-라텍스 비드-항체 복합체인 것을 특징으로 하는 H7 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160153871A KR101835682B1 (ko) | 2016-11-18 | 2016-11-18 | H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160153871A KR101835682B1 (ko) | 2016-11-18 | 2016-11-18 | H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101835682B1 true KR101835682B1 (ko) | 2018-03-07 |
Family
ID=61688567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160153871A KR101835682B1 (ko) | 2016-11-18 | 2016-11-18 | H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101835682B1 (ko) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108051592A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-05-18 | 清华大学深圳研究生院 | A型h7亚型流感病毒的检测试剂盒及其应用 |
| CN111172117A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-05-19 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一种具有广谱性识别n9亚型禽流感病毒神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体及其应用 |
| CN111551745A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-08-18 | 安徽中起生物科技有限公司 | 禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法 |
| KR102196159B1 (ko) * | 2019-09-18 | 2020-12-29 | 충북대학교 산학협력단 | 조류 인플루엔자 바이러스 h7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 |
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2016
- 2016-11-18 KR KR1020160153871A patent/KR101835682B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PLoS One. 2015,10(1):e0117108.* |
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