KR20060054333A - 항-인플루엔자 ｂ형 바이러스 모노클로날 항체 및 상기항체를 사용하는 면역 측정 기구 - Google Patents

항-인플루엔자 ｂ형 바이러스 모노클로날 항체 및 상기항체를 사용하는 면역 측정 기구 Download PDF

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다까시 야마다
도모에 혼다
노부유끼 후지이
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후지레비오 가부시끼가이샤
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Abstract

특이성이 높은 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체 및 그것을 사용한, 인플루엔자 B형 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 면역 측정 기구가 개시되어 있다. 본 발명의 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체는, 인플루엔자 B형 바이러스의 분자량 60 내지 75 kD의 핵 단백질과 항원 항체 반응하고, 인플루엔자 A형 바이러스와는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다.
항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체, 면역 측정 기구, 핵 단백질, 항원 항체 반응

Description

항-인플루엔자 Ｂ형 바이러스 모노클로날 항체 및 상기 항체를 사용하는 면역 측정 기구 {MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST INFLUENZA B VIRUS AND IMMUNOASSAY INSTRUMENT USING THE ANTIBODY}
본 발명은 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체 및 상기 항체를 사용하는 면역 측정 기구에 관한 것이다.
인플루엔자는 옛부터 세계적인 유행을 주기적으로 반복하고, 그 때마다 많은 사망자를 내었지만, 1931년에 원인 바이러스가 검출되어 원인 해명에의 길이 열렸다. 인플루엔자 병원체의 바이러스는 바이러스 내부에 있는 가용성의 핵 단백질(nucleoprotein; NP)의 항원성에 의해서 A형, B형 또는 C형의 3종의 유형으로 분류되고 있다. 인플루엔자 A형은, 또한 바이러스 표면에 존재하는 적혈구 응집소(헤마글루티닌(hemagglutinin); HA)와 뉴라미니다제(neuraminidasc: NA)라는 2개의 외막 단백질의 항원성에 의해서 아형으로 분류되어 있다.
1972년부터 인플루엔자의 예방에는, 에테르 처리 후 포르말린으로 불활성화한 백신이 사용되어 왔다. 근래, 예방에 사용되는 백신 이외에 치료약으로서 항-인플루엔자 약이 발견되어 널리 사용되었다. 이들 치료약으로서는, 인플루엔자 A형 바이러스에 적응하는 염산 아만타딘이나, 인플루엔자 A형 바이러스와 B형에 적 응하는 자나빌, 인산 오셀타미빌 등이다.
이들 치료약을 선택하는 데에 있어서는, 검체 중의 인플루엔자 바이러스를 검출하고, 감염이 인플루엔자 바이러스에 의한 것이며 바이러스의 유형이 A형 또는 B형인 가를 특정하는 것이 중요하다. 또한, 인플루엔자 A형 바이러스는, 인플루엔자 바이러스 B형에 비해 감염력이 강하여 중증의 증상을 야기하기 때문에, 조기 치료에는 감염 바이러스의 특정이 더욱 중요하다.
종래, 인플루엔자 바이러스를 항-인플루엔자 바이러스 항체에 의해서 검출하는 것이 행해져 왔다. 지금까지 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 항체로서는, 유행이 예상되는 바이러스의 아형을 판별하여 백신 제조에 사용하기 때문에, 바이러스의 HA나 NA를 특이적으로 인식하고, 바이러스의 아형을 식별하기 위한 항체가 알려져 있었다(예를 들면, 특허 문헌 1 및 특허 문헌 2 참조).
또한, 인플루엔자 바이러스를 검출하는 장치로서는, 예를 들면 인플루엔자 바이러스 항원을 결합할 수 있는 고상(固相)을 준비하고, 검체 중의 인플루엔자 바이러스를 반응시킨 후, 또한 제1 효소가 결합되어 있는 인플루엔자 A형 바이러스 항체 및 제2 효소가 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 B형 항체를 상기 고상과 반응시키고, 기질을 첨가하여 반응을 행하며, 고상 상의 발색을 육안으로 관찰하는 플로우ㆍ스루(flow-through)형 장치가 알려져 있었다(특허 문헌 3 참조). 이 장치는, 시약 중의 항체에는 인플루엔자 바이러스의 핵 단백질에 대한 항체를 사용하지만, 측정 감도가 낮고, 측정 조작이 번잡하여 간편한 측정 장치는 아니었다. 또한, 인플루엔자 바이러스 핵 단백질에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역 측정 기구(이하 「면역 크로마토 기구」라 함)가 알려져 있다(비특허 문헌 1 참조).
한편, 수액(輸液) 가능한 벨트상의 매트릭스를 사용하는 면역 측정 기구(이하 「면역 크로마토 기구」라 함)가 개발되어, 소정의 부분에 검체를 점착시킴으로써, 특별한 검출 장치 및 숙련된 측정 기술을 필요로 하지 않고 단시간에 간편하게 검체 중의 항원 또는 항체의 측정을 할 수 있게 되었다. 면역 크로마토 기구에는, 그 측정 대상 물질에 따라서, 예를 들면 검출 존(zone)에 복수개의 매독 트레포네마 항원(TP 항원)을 결합하고, 검체 중의 복수개의 항 TP 항체를 따로따로 검출 존에서 검출할 수 있는 면역 크로마토 기구가 개발되어 있다(특허 문헌 4 참조). 이 기구의 검출 존에는, 다른 TP 항원을 결합시킨 복수개의 존을 가지고, 다른 항 TP 항체를 따로따로 검출하여 감염 시기를 특정하며, 치료약의 선택 등에 이용되고 있다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (평)6-100594호
특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (평)7-304799호
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 2001-124775호
특허 문헌 4: 일본 특허 공개 (평)9-229938호
비특허 문헌 1: 감염증지 2001; 75; 792-799
<발명의 개시>
<발명이 이루고자 하는 기술적 과제>
종래의 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체는, 그의 대부분이 바이러스의 표면 항원 HA나 NA를 인식하는 것이고, 특이성 및 반응성이 낮으며, 고감도의 면역 측정에는 만족할 수 있는 것이 아니었다. 또한, 플로우 스루형의 장치에서는, 시약 중의 항체에는 인플루엔자 바이러스의 핵 단백질에 대한 항체를 사용하지만, 측정 조작이 번잡하여 간편한 측정 장치가 아니며, 인플루엔자 B형 바이러스의 검출에서는 위양성(僞陽性)의 출현의 비율이 높았다(문헌[J. Clin. Microbiol, 40, 675-1680, 2002] 참조)
한편, 치료약을 선택하기 위해서 인플루엔자 A형 바이러스와는 반응하지 않지만, 인플루엔자 바이러스의 변이주를 포함하는 인플루엔자 B형 바이러스와는 반응하는 항체, 및 이러한 항체를 사용하여 인플루엔자 A형 바이러스 또는 B형 바이러스의 판별을 특별한 진단 기기 설비나 측정 장치를 필요로 하지 않고 단시간에 측정 결과가 얻어지며, 1회의 조작으로 A형 또는 B형을 판별할 수 있는 장치가 요구되었다.
따라서, 본 발명의 목적은, 특이성이 높은 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 B형 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 면역 측정 기구를 제공하는 것이다.
<발명의 구성 및 작용>
본원 발명자들은 예의 연구한 결과, 인플루엔자 B형 바이러스의 핵 단백질을 항원으로 하고, 인플루엔자 B형 바이러스와 특이적으로 반응하는 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체를 작용시키는 데에 성공하여, 본 발명을 완성하였다. 이 인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체를 사용함으로써, 인플루엔자 B형 바이러스를 인플루엔자 A형 바이러스와 식별하여 검출하는 것이 가능한 면역 측정 기구를 제공할 수 있는 것에 이르렀다.
즉, 본 발명은 인플루엔자 B형 바이러스의 분자량 60 내지 75 kD의 핵 단백질과 항원 항체 반응하고, 인플루엔자 A형 바이러스와는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는, 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 이동 가능한 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 갖는 표지 시약 존, 검체 점착 존, 전개액 공급 존, 전개액 흡수 존, 및 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 매트릭스에 부동화시킨 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존을 매트릭스에 설치한 기구이며, 상기 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 및 검출 존에 부동화된 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 중 하나 이상의 항체가 상기 본 발명의 모노클로날 항체인 면역 측정 기구를 제공한다.
<발명의 효과>
본 발명에 의해, 인플루엔자 B형 바이러스와 면역 반응하지만, 인플루엔자 A형 바이러스와는 반응하지 않는, 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체가 제공되었다. 본 발명의 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체를 사용하는 면역 측정에 의해, 인플루엔자 B형 바이러스를 인플루엔자 A형 바이러스와 식별하여 검출 또는 정량할 수 있다. 본 발명에 의해, 또한 상기 본 발명의 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체를 사용한 면역 측정 기구가 제공되었다. 본 발명의 면역 측정 기구를 사용함으로써, 인플루엔자 B형 바이러스를 간편하게, 또한 인플루엔자 A형 바이러스와 식별하여 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인플루엔자의 진단 및 치료에 크게 공헌할 것으로 기대된다.
도 1은 웨스턴 블롯법에 의해서 분획한 항원에 대하여 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시킨 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 측정 기구 양태의 일례를 모식적으로 나타내는 단면도이다.
도 3은 본 발명의 측정 기구를 카세트에 셋팅하였을 때의 일례를 나타내는 평면도이다.
도 4는 도 3의 A-A'의 단면도이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
상기와 같이, 인플루엔자 B형 바이러스의 분자량 60 내지 75 kD의 핵 단백질과 항원 항체 반응하는 것이다. 인플루엔자 B형 바이러스의 분자량 60 내지 75 kD의 핵 단백질과 항원 항체 반응하는 것은, 인플루엔자 B형 바이러스를 시료로 하고, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 조합한 웨스턴 블롯법에 의해 확인할 수 있다. 웨스턴 블롯법(하기 실시예 참조)을 행하면, 본 발명의 모노클로날 항체는 분자량 60 내지 75 kD의 핵 단백질을 인식한다.
상기와 같이, 본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자 A형 바이러스와는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다. 여기서, 「실질적으로 항원 항체 반응 하지 않는다」란, 검출 가능한 수준에서 항원 항체 반응하지 않거나 또는 항원 항체 반응을 일으키더라도 그의 반응 정도가 인플루엔자 B형 바이러스와의 항원 항체 반응 보다 분명히 약하고, 인플루엔자 B형 바이러스와 항원 항체 반응하지 않은 것이 당업자에 있어서 명료한 정도로밖에 반응하지 않는 것을 의미한다. 또한, 여기서 「인플루엔자 A형 바이러스와는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다」란, 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질을 비롯하여, 상기 바이러스의 각 구성 요소의 단백질과 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다는 의미이다. 바람직한 형태로서는, 본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자 C형 바이러스와도 실질적으로 반응하지 않는다.
바람직한 형태에서는, 본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자 B형 바이러스의 각 아형의 핵 단백질과 항원 항체 반응한다. 즉, 인플루엔자 B형 바이러스는 그 바이러스 입자 표면에 헤마글루티닌(H)과 뉴라미니다제(N)를 갖지만, 이들 H 및 N의 구조의 차이에 의해 다양한 아형으로 분류되어 있다. 본 발명의 모노클로날 항체는, 바람직하게는 적어도 상기 실시예에 기재된 아형(표 3 참조)의 핵 단백질과 항원 항체 반응하는 것이고, 더욱 바람직하게는 공지된 모든 인플루엔자 B형 바이러스의 아형의 핵 단백질과 항원 항체 반응한다.
또한, 바람직한 형태에서는, 본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자와 증상이 적어도 부분적으로 유사한 다른 감염증의 병원체와도 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다. 예를 들면 아데노 바이러스(1 내지 7형), 코쿠사키 바이러스(A16, B1 내지 B6형), 단순 헤르페스 바이러스 1형, 에코 바이러스(3형, 4형, 7형, 22형, 30형), 엔테로 바이러스(71형), 문프스 바이러스, 폴리오 바이러스(1 내지 3형), RS 바이러스(서브그룹 A, 서브그룹 B), 파라인플루엔자 바이러스(1 내지 3형 ), 대장균, 폐렴간균, 녹농균, 영균, 표피 포도 구균, 변형균, 황색 포도 구균, 코리네 박테리아, 디프테리아, 칸디다ㆍ알비칸스, 화농 연쇄 구균, 스트렙토코커스속(그룹 B, C, G, F), 폐렴 연쇄 구균, 헤모필루스속 인플루엔자, 리스테리아ㆍ모노사이토게네스, 폐렴 마이코플라즈마, 클라미디아ㆍ트라코마티스, 클라미디아ㆍ뉴모니에와 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는다.
또한, 주지된 바와 같이, 항체를 파파인 분해나 펩신으로 분해함으로써, Fab 단편이나 F(ab')2 단편과 같은, 대응 항원과의 결합성을 갖는 항체 단편(본 발명 명세서에 있어서 「항원 결합성 단편」이라 함)이 얻어지는 것이 알려져 있으며, 본 발명의 모노클로날 항체의 항원 결합성 단편도 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하게 사용할 수 있고, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자 B형 바이러스의 핵 단백질을 면역원으로 하여 통상법인 하이브리도마법에 의해 제조할 수 있다. 면역원로서 사용되는 인플루엔자 B형의 핵 단백질로서는, 핵 단백질이 다량으로 존재하고, 그 면역원의 작용을 발휘할 수 있으면, 배양 바이러스액, 인플루엔자 HA 백신, HI용 HA 항원, 재조합 항원 모두가 사용 가능하다. 항원에 포함되는 면역원성이 높은 HA나 NA의 작용을 억제하기 위해서, 초원심에 의한 핵 단백질 정제(예를 들면 문헌[J. Biochem.; 102: 1241-1249, 1987] 참조)나 프로테아제 처리(예를 들면 문헌[J. Immunol. Methods; 180: 107-116, 1995] 참조)를 한 항원을 사용할 수 있다.
상기 모노클로날 항체는, 상기 인플루엔자 B형 바이러스의 핵 단백질을 포함 하는 항원을 면역원으로서 사용하여 동물을 면역시키고, 그 인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체 생산 세포와 종양 세포를 세포 융합시킴으로써 얻어지는 하이브리도마에 의해 생산할 수 있다.
상기 하이브리도마는 하기의 방법으로 얻을 수 있다. 즉, 상술한 바와 같이 하여 얻은 상기 항원의 인플루엔자 B형 바이러스 핵 단백질을 프로인트의 완전 보조제와 함께 수회로 나누어 마우스 등의 동물에게, 2 내지 3 주의 간격으로 복강 내 또는 정맥 투여함으로써 면역시킨다. 계속해서, 비장 등에서 유래하는 항체 생산 세포와, 골수종 라인에서의 세포(미엘로마 세포) 등의 시험관 내에서 증식 가능한 종양 세포를 융합시킨다.
상기 융합 방법으로서는, 케러와 밀슈타인의 통상법(문헌[네이쳐(Nature), 256권, 495 페이지, 1975년])에 따라서 폴리에틸렌글리콜에 의해 행하거나, 또는 센다이 바이러스에 의해 행할 수 있다.
상기 융합한 세포로부터, 인플루엔자 B형 바이러스 핵 단백질을 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로서는, 예를 들면 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 즉, 상기 융합한 세포로부터, 한계 희석법에 의해서 HAT 배지 및(또는) HT 배지 중에서 생존하고 있는 세포를 하이브리도마로서 선택할 수 있다. 계속해서, 상기 하이브리도마의 배양 배지를, 고순도로 정제한 인플루엔자 B형 바이러스 핵 단백질을 고정화한 분석 플레이트 상에서 반응시킨 후, 항 마우스 면역 글로불린(Ig) 등과 더욱 반응시키는 EIA법 등에 의해서, 인플루엔자 B형 바이러스 핵 단백질을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선 택할 수 있다.
하기 실시예에서, 본 발명의 바람직한 모노클로날 항체가 복수개 얻어지고, 그 중의 3종을 각각 하이브리도마 FrB1-03, 하이브리도마 FrB1-07 및 하이브리도마 FVB2-16이라고 명명하였다. 이들 하이브리도마는, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1, 주오우 다이6)에, 하이브리도마 FrB1-03은 식별 표시 FrB1-03, 수탁 번호 FERM BP-10070(수탁일; 2003년 7월 18일, 2004년 7월 14일에 국내 기탁 FERM P-19441로부터 국제 기탁으로 이관)으로서, 하이브리도마 FrB1-07은 식별 표시 FrB1-07, 수탁 번호 FERM BP-10071(수탁일; 2003년 7월 18일, 2004년 7월 14일에 국내 기탁 FERM P-19442로부터 국제 기탁으로 이관)로서, 및 하이브리도마 FVB2-16은 식별 표시 FVB2-16, 수탁 번호 FERM BP-10069(수탁일; 2003년 7월 18일, 2004년 7월 14일에 국내 기탁 FERM P-19440으로부터 국제 기탁으로 이관)로서 각각 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있다.
상기 각 하이브리도마는 통상 세포 배양에 사용되는 배지에서 배양하여 배양 상청으로부터 모노클로날 항체를 회수할 수 있다. 또한, 하이브리도마가 유래하는 동물에게 투여함으로써, 복수(復水)를 저류(貯留)시켜 이 복수로부터 회수할 수도 있다.
상기 모노클로날 항체의 회수 방법으로서는, 통상 행해지는 정제 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 단백질 A에 의한 친화성 크로마토그래피 등을 예로 들 수 있다.
상기 방법에 따라서 제조된 모노클로날 항체는 인플루엔자 B형 바이러스의 핵 단백질과 반응하고, 인플루엔자 B형 바이러스의 각종 바이러스주와 반응하는 것이 확인되었다. 현재 보존되어 입수 가능한 인플루엔자 B형 바이러스 보존주(이하의 표 3을 참조)와는 반응하고, 본 발명의 모노클로날 항체로 검출 가능하였다. 한편, 교차 반응성을 생각할 수 있는 미생물로서, 예를 들면 아데노 바이러스(1 내지 7형), 코쿠사키 바이러스(A16, B1 내지 B6형), 단순 헤르페스 바이러스 1형, 에코 바이러스(3형, 4형, 7형, 22형, 30형), 엔테로 바이러스(71형), 문프스 바이러스, 폴리오 바이러스(1 내지 3형), RS 바이러스(서브그룹 A, 서브그룹 B), 파라인플루엔자 바이러스(1 내지 3형), 대장균, 폐렴간균, 녹농균, 영균, 표피 포도 구균, 변형균, 황색 포도 구균, 코리네 박테리아, 디프테리아, 칸디다ㆍ알비칸스, 화농 연쇄 구균, 스트렙토코커스속(그룹 B, C, G, F), 폐렴 연쇄 구균, 헤모필루스속 인플루엔자, 리스테리아ㆍ모노사이토게네스, 폐렴 마이코플라즈마, 클라미디아ㆍ트라코마티스, 클라미디아ㆍ뉴모니에 등과의 반응성을 확인하였지만, 반응은 확인되지 않았다.
본 발명의 모노클로날 항체는 인플루엔자 B형 바이러스의 검출 또는 정량을 위한 면역 측정에 사용할 수 있다. 면역 측정 방법 자체는 주지되어 있고, 주지된 어느 면역 측정 방법도 채용할 수 있다. 즉, 측정 형식으로 분류하면, 샌드위치법, 경합법, 응집법, 웨스턴 블롯법 등이 있고, 사용되는 표지로 분류하면, 형광법, 효소법, 방사법, 비오틴법 등이 있으며, 이들 모두 사용할 수 있다. 또한, 면역 조직 염색에 의해서 진단할 수도 있다. 면역 측정 방법에 표지 항체를 사용하 는 경우, 항체의 표지 방법 자체는 주지되어 있고, 주지된 어느 방법도 채용할 수 있다. 또한, 주지된 바와 같이, 항체를 파파인 분해나 펩신으로 분해함으로써, Fab 단편이나 F(ab')2 단편과 같은, 대응 항원과의 결합성을 갖는 항체 단편(본 발명 명세서에 있어서 「항원 결합성 단편」이라 함)이 얻어지는 것이 알려져 있으며, 본 발명의 모노클로날 항체의 항원 결합성 단편도 본 발명의 항체와 동일하게 사용할 수 있다.
또한, 이들 면역 측정법 자체는 주지되어 있고, 본 명세서에서 설명할 필요는 없지만, 간단하게 기재하면, 예를 들면 샌드위치법에서는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 제1 항체로서 고상에 부동화하여, 검체와 반응시키고, 세정 후, 본 발명의 효소와 항원 항체 반응하는 제2 항체를 반응시키며, 세정 후, 고상에 결합된 제2 항체를 측정한다. 제2 항체를 효소, 형광 물질, 방사성 물질, 비오틴 등으로 표지해 둠으로써 고상에 결합된 제2 항체를 측정할 수 있다. 예정된 농도의 복수개의 표준 시료에 대하여 상기 방법에 의해 측정하고, 측정된 표지량과 표준 시료 중의 본 발명의 효소의 관계에 기초하여 검량선을 작성하며, 미지 농도의 피검 시료에 대한 측정 결과를 이 검량선에 적용시킴으로써, 피검 시료 중의 본 발명의 효소를 정량할 수 있다. 또한, 제1 항체와 제2 항체를 상기한 설명으로 대체할 수도 있다. 또한, 응집법에서는, 라텍스 등의 입자에 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 부동화하고, 검체와 반응시켜 흡광도를 측정한다. 예정된 농도의 복수개의 표준 시료에 대하여 상기 방법에 의해 측정하고, 측정된 표지 량과 표준 시료 중의 본 발명의 효소의 관계에 기초하여 검량선을 작성하며, 미지 농도의 피검 시료에 대한 측정 결과를 이 검량선에 적용시킴으로써, 피검 시료 중의 본 발명의 효소를 정량할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 모노클로날 항체를 사용하여, 인플루엔자 B형 바이러스를 간편하게, 또한 인플루엔자 A형 바이러스와 식별하여 검출할 수 있는 면역 측정 기구도 제공한다.
본 발명의 면역 측정 기구는, 이동 가능한 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 갖는 표지 시약 존, 검체 점착 존, 전개액 공급 존, 전개액 흡수 존, 및 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 매트릭스에 부동화시킨 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존을 매트릭스에 설치한 기구이며, 상기 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 및 검출 존에 부동화된 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 중 하나 이상의 항체가 상기 본 발명의 모노클로날 항체인 면역 측정 기구이다. 검체 점착 존에 점착된 검체는 표지 시약 존에 함유되는 표지 항체와 항원 항체 반응하여, 표지된 항원 항체 복합물이 형성된다. 상기 항원 항체 복합물은 전개액 공급 존에서 공급된 전개액에 의해 흘러, 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존에 이른다. 여기서, 매트릭스에 부동화된 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체와, 상기 표지 항원 항체 복합물이 항원 항체 반응하여, 상기 표지 항원 항체 복합물이 매트릭스에 부동화된다. 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존에 표지 항원 항체 복합물이 부동화되었는가 아닌가는, 표지의 유무에 의해 판정된다. 또한, 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존을 통과한 전개액은 전개액 흡수 존에 흡수된다. 또한, 검체 점착 존과 표지 시약 존은 동일할 수도 있다(이 경우, 검체는 표지 시약 존에 점착됨). 본 발명의 면역 측정 기구에서는, 표지 항체 또는 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존에 부동화된 항체 중 어느 하나 이상이 본 발명의 모노클로날 항체이다. 또한, 하나의 항체는 폴리클로날 항체일 수도 있다. 또한, 인플루엔자 B형 바이러스의 핵 단백질은 통상, 복수개의 분자가 회합 내지 부착되어 있기 때문에, 표지 항체 또는 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존에 부동화된 항체의 양자(兩者)가 동일한 모노클로날 항체라도 인플루엔자 B형 바이러스를 검출할 수 있다.
이하, 본 발명의 면역 측정 기구의 각 구성 요건에 대하여 나누어 설명한다.
매트릭스
본 발명의 면역 측정 기구에 있어서의 벨트상의 매트릭스는 모세관 작용에 의해서 액체를 수액 가능한 흡수성 재료로 구성된다. 이 흡수성 재료로서는, 예를 들면 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 등의 셀룰로오스 또는 그의 유도체, 유리 섬유 등을 단독 또는 혼합하여 제조한 여과지, 막, 다공성 재료이다. 이 매트릭스의 크기에 제한은 없지만, 폭 3 mm 내지 10 mm 정도, 길이 30 mm 내지 100 mm 정도의 스트립상의 것이 취급이 용이하여 바람직하다. 매트릭스의 두께는 100 ㎛ 내지 1 mm인 것을 사용할 수 있다. 또한, 매트릭스는 그의 일부 또는 전체를 측정시에 검체 유래의 단백질의 매트릭스에의 비특이 반응에 의한 흡착을 방지하기 위해서, 예를 들면 소혈청 알부민(BSA) 등의 동물 혈청, 카제인, 수크로오스 등으로 블로킹하여 사용할 수 있다.
검출 존
검출 존에는, 상기 매트릭스 상에 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 부동화한 인플루엔자 B형 바이러스 검출부를 설치할 수 있다. 이 검출부에 부동화되는 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체는, 후술하는 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체와 함께, 하나 이상이 본 발명의 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체이고, 양방(兩方)의 항체가 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 검출부의 상기 인플루엔자 B형 바이러스 항체는 매트릭스 상에 있고, 매트릭스를 전개하는 액체의 수액 방향(매트릭스의 길이 방향)에 직교하는 방향으로 라인상으로 설치하는 것이 양호한 감도로 측정하기 위해서는 바람직하다. 항-인플루엔자 B형 바이러스 폴리클로날 항체로서는, 시판되며 쉽게 입수 가능한 폴리클로날 항체로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
이 검출 존의 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체는 상기한 항체이고, 모노클로날 항체를 단독 또는 혼합하여 사용할 수도 있다. 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체는 IgG 항체, IgM 항체, 또한 이들 항체의 항원 결합성 단편인 Fab, F(ab')2 등일 수도 있다.
검출부에 부동화되는 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체는 직접 매트릭스의 검출 존에 물리 흡착시킬 수도 있지만, 공유 결합 등의 화학 결합에 의해서 고정함으로써 설치할 수도 있다. 또한, 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 수불용성의 담체에 결합시키고, 이것을 매트릭스 내에 함유시킬 수도 있다. 이 불용성의 담체로서는, 젤라틴, 아라비아 고무 및 헥사 메타인산나트륨을 포함하는 혼합물을 불용 화하여 얻어지는 입자(일본 특허 공고 (소)63-29223), 폴리스티렌 라텍스 입자, 유리 섬유 등을 들 수 있다. 불용성의 담체와 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체를 결합시키기 위해서는, 상기 화학 결합 또는 물리 흡착에 의해 결합시킬 수 있다.
검출 존에는, 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체에 의한 인플루엔자 B형 바이러스 검출부 이외에, 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체에 의한 인플루엔자 A형 바이러스 검출부를 설치할 수 있다. 이 인플루엔자 A형 바이러스 검출부는, 상기 인플루엔자 B형 바이러스 검출부의 근방이면, 전개액의 수액 방향에서 상기 인플루엔자 B형 바이러스 검출부 상류측 또는 하류측 중 어느 것일 수도 있다. 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존에 부동화되는 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있으며, 상기 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체와 동일하게 화학 결합 또는 물리 흡착에 의해서 매트릭스에 부동화될 수 있다.
상기한 바와 같이, 매트릭스 상의 검출 존에는, 적어도 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체에 의한 인플루엔자 B형 바이러스의 검출부를 설치하고, 또한 인플루엔자 A형 바이러스의 검출부를 설치하는 것이, 인플루엔자 B형 바이러스 및 인플루엔자 A형 바이러스를 동시에 측정하는 데에 바람직하다. 이들 검출부는, 매트릭스의 수액 방향에서, 효소 표지 시약 존, 검체 점착 존 및 전개액 공급 존의 하류측이며, 첨가액 흡수 존의 상류측이다. 검출부는, 매트릭스에 폭 0.5 mm 내지 5 mm 정도의 라인상으로 근접하여 복수개의 라인을 설치할 수 있다. 폭 5 mm 정도의 매트릭스이면, 상기 항체 및 항원을 통상 각각 0.1 ㎍ 내지 10 ㎍ 정도 점착하여, 건 조시킴으로써 검출부를 제조할 수 있다.
표지 시약 존
표지 시약 존은, 매트릭스 상에 설치된 존에 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 이동 가능하게 점착하여 설치할 수 있다. 이 존은 전개액 공급 존에서의 전개액의 수액 방향에서 상기 검출 존의 상류측에 설치할 수 있다. 이 존은, 매트릭스에 효소 표지 시약을 점착하는 방법, 효소 표지 시약을 포함하는 흡수성 패드를 매트릭스 상에 적층하는 방법, 또는 패드와 밀착하는 매트릭스 부분의 일부 또는 전부에 패드와 함께 효소 표지 시약을 함유시킴으로써 구성된다. 흡수성 패드로서는, 후술하는 검체 점착 존의 패드를 사용할 수 있다.
표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체의 항체로서는, 상기 검출 존에 설치되는 항체와 함께, 적어도 하나가 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체이고, 양방의 항체가 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체의 항체로서는, 상기 검출 존의 항체와 동일하게 그의 단편을 사용할 수도 있다.
상기 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체는 상기 항체와 표지물을 결합시켜 제조할 수 있다. 표지물로서는, 효소, 금속 콜로이드 입자, 착색 라텍스 입자, 발광 물질, 형광 물질 등을 들 수 있다. 효소로서는 효소 면역 측정법(EIA)에 사용되는 각종 효소이고, 그 효소로서는 예를 들면 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제, β-D-갈락토시다아제 등을 들 수 있다. 또한, 금속 콜로이드 입자로서는, 예를 들면 금 콜로이드 입자, 셀레늄 콜로이드 입자 등을 사용할 수 있다.
또한, 표지물과 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체와의 결합 방법은 공지된 공유 결합 또는 비공유 결합을 만드는 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 결합 방법에는, 예를 들면 글루타르알데히드법, 과요오드산법, 말레이미드법, 피리딜ㆍ디술피드법, 각종 가교제를 사용하는 방법 등을 들 수 있다(예를 들면 문헌[「단백질 핵산 효소」 별책 31호, 37 내지 45 페이지(1985)] 참조). 가교제를 사용하는 결합 방법으로서는, 가교제로서, 예를 들면 N-숙신이미딜-4-말레이미드부티르산(GMBS), N-숙신이미딜-6-말레이미드헥산산, N-숙신이미딜-4-(N-말레이미드메틸)시클로헥산-1-카르복실산 등을 사용할 수 있다. 공유 결합에 의한 방법에서는, 항체에 존재하는 관능기를 사용할 수 있을 뿐 아니라, 예를 들면 티올기, 아미노기, 카르복실기, 수산기 등의 관능기를 통상법에 의해 도입한 후, 상기 결합법에 의해 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 제조할 수 있다. 또한, 비공유 결합에 의한 방법으로서는 물리 흡착법 등을 들 수 있다.
상기와 같이 인플루엔자 B형 바이러스를 검출하는 것 이외에, 동시에 인플루엔자 B형 바이러스를 검출하는 경우에는, 표지 시약 존에 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 첨가하여 기구를 제조한다. 표지 시약 존에 함유되는 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 및 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체는, 매트릭스 또는 흡수성 패드의 어느 한쪽에 함유시키는 방법, 또는 매트릭스와 흡수성 패드의 양방에 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 및 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 함유시킬 수 있다. 인플루엔자 B형 바이러스 및 인플루엔자 A형 바이러스의 동시 측정을 행하는 경우에는, 표지 시약을 많이 사용하기 때문에, 매트 릭스와 패드의 양방에 효소 표지 시약을 단독 또는 혼합하여 함유시키는 것이 고감도 측정을 행하는 데에 유리하다. 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 및 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체량은, 통상 검사 대상물의 예측되는 양에 따라서 적절하게 변경할 수 있지만, 통상 건조 중량으로 0.01 ㎍ 내지 5 ㎍ 정도이다. 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 및 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체는, 효소 표지존에 함유시키는 경우에 시약의 안정화제, 용해 조절제 등과 함께 도포할 수 있다.
검체 점착 존
검체 점착 존은, 전개액 공급 존의 전개액의 수액 방향의 하류측에서 검출 존의 상류측의 매트릭스에 특별히 시약 등을 포함하지 않고 설치할 수 있다. 또한, 검체 점착 존은, 1) 전개액존의 전개액 수액 방향의 하류측에서 효소 표지 시약 존의 상류측의 소정 부분, 2) 표지 시약 존의 하류측에서 검출 존의 상류측의 소정 부분, 3) 표지 시약 존 상의 소정 부분 등에 설치할 수 있다. 또한, 상기 효소 표지 시약 존에 검체 점착 존을 설치한 장치에서는, 상기한 바와 같이 효소 표지를 함유하는 흡수성 패드를 부설하는 것이 효율적으로 분석을 하는 데에 바람직하다. 이 패드를 부가하는 장치에서는, 다량의 검체액을 점착할 수 있기 때문에, 검체 중의 미량 성분을 양호한 검출 감도로 측정을 행할 수 있다. 이 흡수성 패드로서는, 표지 시약이나 검체 중의 인플루엔자 바이러스를 흡착하는 것이 적은 재료로부터 선택되고, 예를 들면 폴리비닐알코올(PVA), 부직포, 셀룰로오스 등의 다공질의 합성 또는 천연 고분자 화합물을 포함하는 재료를 단독 또는 조합하여 구성할 수 있다. 이 패드의 크기, 두께, 밀도 등은 한정되지 않지만, 통상 세로와 가로가 3 mm 내지 10 mm 정도이며 두께가 0.5 mm 내지 4 mm 정도인 패드를 사용하는 것이 효율적으로 측정을 행하기 위해서는 바람직하다.
전개액 공급 존
전개액 공급 존은, 매트릭스의 길이 방향의 일단에 설치되어 전개액이 공급되는 존이다. 측정을 개시하기 위해서는, 이 존을 적어도 전개액 흡수 존에 도달하는 양의 전개액 포함 용기에 침지하여 행할 수 있다. 또한, 전개액의 공급에는 전개액존에 전개액 포함 액조(液槽)를 부가하고, 이 액조의 커버를 부수어 전개액과 매트릭스를 접촉시킴으로써 측정을 개시할 수도 있다. 전개액에는, 계면활성제, 완충제, 안정화제, 항균제 등을 적절하게 함유할 수 있다. 또한, 표지물로서 효소도 사용하는 경우에는, 후술하는 기질 시약 존과 함께 전개액에 기질을 첨가할 수도 있다. 완충제를 포함하는 완충액으로서는, 예를 들면 아세트산 완충액, 붕산 완충액, 트리스-염산 완충액, 디에탄올아민 완충액 등을 들 수 있다. 또한, 전개액 공급 존에는 전개액의 매트릭스에의 공급을 안정적이며 연속적으로 실시하기 위해서 전개액 패드를 부설할 수 있다. 전개액 패드로서는, 예를 들면 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 유도체 등의 여과지를 사용할 수 있다.
전개액 흡수 존
전개액 흡수 존은, 매트릭스의 일단에 설치된 상기 전개액존에 대하여 다른 말단에 설치된다. 이 존은 매트릭스에 공급되는 전개액을 흡수하여 분석을 원활하게 행하기 위해서 설치된다. 전개액 흡수 존은 매트릭스를 길게 형성하여 이 존을 확보할 수도 있다. 또한, 매트릭스에 흡수성 재료를 부설하여 전개를 촉진할 수도 있다. 이 흡수성 재료에는, 천연 고분자 화합물, 합성 고분자 화합물 등으로 제조되는, 보수성이 높은 여과지, 스폰지 등을 사용할 수 있다. 전개액 흡수 존은 전개액을 전부 흡수하는 용적을 갖은 패드상의 흡수성 재료이지만, 흡수성 재료를 매트릭스 위 또는 아래에 적층함으로써, 소형화된 면역 측정 기구를 제조할 수 있다.
기질 시약 존
또한, 표지 시약 존의 표지물로서 효소를 사용하는 경우에는, 상기한 대로 전개액에 기질을 함유시키거나, 기질 시약 존을 매트릭스의 상기 전개액 공급 존 근방에 설치할 수 있다. 기질 시약 존은, 전개액 공급 존에 부설한 상기 전개액 패드에 함유시켜 설치하는 것이 기질량을 많게 하여 고감도 측정을 행하는 데에 바람직하다.
기질로서는 표지 시약의 효소에 대응하여 이하에 나타내는 각종 발색 기질, 형광 기질, 발광 기질 등을 사용할 수 있다.
(a) 발색 기질 퍼옥시다제용: 과산화수소와 조합한 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), 디아미노벤지딘(DAB) 알칼리 포스파타제용: 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴인산(BCIP)
(b) 형광 기질 알칼리 포스파타제용: 4-메틸움벨리페릴-포스페이트(4MUP) β-D-갈락토시다제용: 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시드(4MUG)
(c) 발광 기질 알칼리 포스파타제용: 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3''-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄ㆍ2나트륨염(AMPPD) β-D-갈락토시다제용: 3- (2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3''-β-D-갈락토피라노실)페닐-1,2-디옥세탄(AMGPD) 퍼옥시다제용: 과산화수소와 조합한 루미놀, 이소루미놀
상기 기질을 기질존으로서 설치하는 경우에는, 통상 상기 기질을 수용액에 용해시켜 전개액 패드에 라인상으로 도포한 후, 건조시킴으로써 형성할 수 있고, 목적에 따라서 기질의 시그널 증강제, 안정화제, 용해 조절제 등을 첨가할 수도 있다. 기질존은, 매트릭스의 단부에 부설한 전개액 패드 내라면, 특별히 한정되지 않는다. 전개액 및 전개액 패드에 첨가하는 기질량은, 측정 조건에 의해 결정할 수 있지만, 1개의 기구당 통상 5 내지 500 ㎍ 정도를 사용할 수 있다.
각 존의 배치
본 발명의 면역 측정 기구의 바람직한 일례를 도 2 내지 도 4에 모식적으로 나타낸다. 도 2 중, 참조 번호 2가 매트릭스, 4가 표지 시약 존, 8이 검체 점착 존, 3이 전개액 공급 존, 5가 전개액 흡수 존, 6a가 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존, 7이 기질 시약 존, 9가 검체이다. 이 예에서는, 검체 점착 존 (8)과 표지 시약 존 (4)가 동일하다. 또한, 참조 번호 6b는 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존, 10은 전개액 확인 존, 11은 전개액조이다(하기 실시예 4 참조).
측정 기구의 사용 방법
본 발명의 측정 기구에 의해 각종 검체 시료 중의 인플루엔자 B형 바이러스의 측정을 행할 수 있다. 측정은, 우선 검체를 본 발명의 측정 기구의 검체 점착 존에 공급한 후, 전개액을 전개액 패드에 공급하고, 매트릭스로 전개하여 행한다. 또한, 검체의 희석액으로서, 시료 희석액으로서, 계면활성제를 포함하는 완충액을 사용할 수 있다. 전개액은 모세관 작용에 의해 매트릭스를 이동하여 전개액 흡수 존에 도달하고, 검출 존에 결합되지 않은 검체 중의 성분, 효소 표지 시약 등이 흡수되어 전개가 완료된다. 소정 시간(통상 10 분 내지 20 분) 경과 후, 검출 존을 관찰하여, 검체액 중의 인플루엔자 B형 바이러스에 의해 검출부에 고정화된 표지물을 측정함으로써, 인플루엔자 B형 바이러스의 측정을 행할 수 있다. 이 검출은 표지물 또는 표지물로 사용되는 효소에 따라서 각각 대응하는 육안 또는 비색계, 형광 광도계, 포톤 카운터, 감광 필름 등의 측정 장치를 사용하여 실시할 수 있다. 측정에서는, 예를 들면 검출 존의 발색을 육안으로 측정하는 방법이 간편하다. 또한, 이 방법에서는 인플루엔자 B형 바이러스의 농도에 대응한 색표(컬러 차트)를 사용함으로써 반정량적인 분석이 가능해진다. 또한, 비색계 등에 의해 검출 존의 발색을 수치화하여 정량을 행할 수도 있다.
도 2 내지 도 4에 나타내는 본 발명의 면역 측정 기구의 바람직한 일례를 예로서 측정 원리를 더욱 설명한다. 검체 (9)를 검체 점착 존 (8)에 점착함과 동시에, 전개액조 (11) 내의 전개액을 전개액 공급 존 (3)에 공급한다. 전개액은 모세관 현상에 의해 매트릭스 (2) 내를 횡 방향의 흰색 화살표의 방향으로 이동해간다. 기질 시약 존 (7)에 함유된 기질이 전개액에 용해되어, 전개액와 함께 이동해간다. 한편, 검체 (9)는 표지 시약 존 (4) 내의 표지 항체와 반응하여, 표지 항원 항체 복합물이 형성된다. 여기에 전개액이 도착하면, 표지 항원 항체 복합물은 전개액 중의 기질과 반응하면서 매트릭스 (2)를 이동하고, 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존 (6b)에 도달하면, 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존 (6b)에 부동화되어 있는 항 -인플루엔자 B형 바이러스 항체와 반응하여, 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존 (6b)에 부동화된다. 검체 중에 인플루엔자 B형 바이러스가 포함되어 있는 경우에는, 표지 효소와 기질과의 반응에 의해 발색이 일어난다. 한편, 검체 중에 인플루엔자 B형 바이러스가 포함되어 있지 않은 경우에는, 표지 항체는 항원 항체 반응할 수 없고, 표지가 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존 (6b)에 부동화되지 않기 때문에 발색이 일어나지 않는다. 따라서, 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존 (6b)가 발색하는가 하지 않는가로 검체 중에 인플루엔자 B형 바이러스 포함 여부를 알 수 있다. 전개액 확인 존 (10)에는, 전개액 중의 시약과 반응하여 발색하는 효소가 부동화되어 있고, 전개액 확인 존 (10)이 발색하면, 거기까지 전개액이 도달되었음을 알 수 있다. 또는, 전개액 확인 존 (10)에는, 표지 효소에 대한 항체가 부동화되어 있고, 전개액 확인 존 (10)에 도달한 표지 시약이 상기 항체에 포획되며, 또한 전개액이 도달하면, 포획된 표지와 전개액 중의 기질이 반응하여 발색하도록 할 수도 있다(하기 실시예에서는 항 알칼리 포스파타제 항체를 부동화). 또한, 표지 시약 존 (4) 내에, 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 포함해 두고, 한편 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 부동화한 항-인플루엔자 A형 바이러스 검출 존 (6a)를 설치해 두면, 인플루엔자 A형 바이러스의 검출도 동시에 할 수 있으며, 인플루엔자 바이러스가 B형인가 A형인가를 단일의 측정 조작으로 조사할 수 있다.
또한, 상기 매트릭스는 플라스틱, 금속, 종이 등의 지지 부재 상에 적층하여 고정하여 사용할 수도 있다. 상기 매트릭스는 플라스틱 등의 케이스에 고정하고, 전개액을 포함하는 액조를 전개액 공급 존에 부설하여 상기 각 존 부분에 구멍이 개방된 케이스로 커버링함으로써 취급이 용이한 기구를 구성할 수 있다. 본 발명의 면역 측정 기구에 사용되는 검체로서는, 인간, 동물 등으로부터 채취한 인플루엔자가 포함된다고 생각되는 검체이고, 각종 체액, 예를 들면 비강 추출액(비강 스와브), 비강 흡인액, 인두 추출액(인두 스와브) 등의 체액 추출액을 들 수 있다.
이하 참고예, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 발명을 본 실시예로 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체의 제조
면역원으로는 인플루엔자 핵 단백질 항원을 함유하는 인플루엔자 HA 백신(B/야마나시/166/98주) 또는 인플루엔자 B형 재조합 핵 단백질(B/야마나시/166/98 유래(r-NP/B); DDBJ/진뱅크(GeneBank) 데이타베이스)을 사용하였다.
면역원에 등량의 프로인트 완전 보조제(야토론사 제조)를 첨가하여 완전히 혼합한 후, Balb/c 마우스에게 2 주 간격으로 총 4회 면역시켰다. 세포 융합 3 일 전에 마우스 복강 내에 면역원을 주사하고, PEG를 사용하여 마우스 비장 세포와 미엘로마 세포(P3U1)를 융합하였다. 배양액에는 HAT 선택 배지를 사용하고, 약 2 주 후에 배양 상청을 채취하여 스크리닝에 사용하였다. 1차 스크리닝에는, 인플루엔자 HA 백신, 인플루엔자 B형 재조합 핵 단백질(r-NP/B)을 고상화한 효소 결합 면역흡착 분석법 (Enzyme Linked Immunosobent Assay; ELISA법)을 사용하였다. 즉, 인플루엔자 HA 백신은 0.1 M 탄산 완충액 pH 9.6으로 300배 희석하고, 동일하게 B형 재조합 핵 단백질 항원은 1 ㎍/㎖의 농도로 희석하여, 마이크로플레이트 모듈(Nunc 사 제조)의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 4 ℃에서 밤새 배양하여 고상화하였다. 다음에, 0.1 ％의 Tween 20(상품명)을 포함하는 PBS(PBS-Tween)로 각 웰을 세정 후, PBS로 희석한 1 ％의 소혈청 알부민(BSA) 300 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 밤새 블로킹을 행하였다. 블로킹액을 제거한 후, 배양 상청을 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 0.2 ％ BSA, 0.2 ％ 에멀겐 985, 1 ％ 수크로오스, 1 ％ KCl을 포함하는 0.05 M 인산 완충액 pH 7.5(반응 용액)로 2000배 희석한 효소 표지 항 마우스 Igs 항체(DAKO사 제조)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, PBS-Tween으로 충분히 세정하고, 2.2'-아지노-비스-3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산(ABTS)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여, 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 주파장 415 nm, 부파장 490 nm에서 발색 수준을 측정하였다.
양성이라고 판정된 배양 상청에 대해서는, 인플루엔자 A형 재조합 핵 단백질 항원(A/뉴 칼레도니아/20/99 유래(r-NP/H1N1), A/키따큐슈/159/93 유래(r-NP/H3N2); DDBJ/진뱅크 데이타베이스)을 항원으로 한 ELlSA로 2차 스크리닝을 행하고, 최종적으로 인플루엔자 B형 핵 단백질 항원에 반응하며, 인플루엔자 A형 핵 단백질 항원과는 반응하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마 3 주(하이브리도마 FrB1-03, 하이브리도마 FrB1-07, 하이브리도마 FVB2-16)를 얻었다. 상기 하이브리도마 3주로부터 얻어진 모노클로날 항체의 서브클래스는 전부 IgG1이었다. 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112006004598725-PCT00001
실시예 2: 모노클로날 항체의 웨스턴 블롯팅법에 있어서의 반응성
재조합 항원, 인플루엔자 HA 백신(핵 단백질 항원 함유)을 사용하여 웨스턴 블롯팅법에 의해 반응성을 확인하였다. 각 시료를, 0.001 M EDTA, 1 ％ SDS, 5 ％ 2ME(2-머캅토에탄올), 10 ％ 글리세롤, 0.005 ％ BPB(Bromophenol Blue)를 포함하는 0.01 M Tris-HCl(pH 8.0)에 용해시키고, 100 ℃로 가열 처리한 후, 전기 영동에 사용하였다. 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)은, e-파젤 10 ％ 겔 농도(아트사 제조)를 사용하여 통상법에 따랐다. 영동 후 PVDF막(아트사 제조)에 전사하고, 블록에이스(다이닛본 세이야꾸 제조)로써 4 ℃에서 밤새 블로킹을 행하였다. 블로킹액을 제거하고, PBS-Tween으로 세정 후, 10 ㎍/㎖의 농도로 조정한 모노클로날 항체를 첨가하여 실온에서 45 분간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 반응 용액으로 4000배 희석한 효소 표지 항 마우스 IgG 항체(Cappel사 제조)를 실온에서 45 분간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정 후, ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(아머샴 바이오사이언스사 제조)을 사용하여 X선 필름(코닥사 제조)에 1 분간 노광시켜 시그널을 검출하였다.
모노클로날 항체 FrB1-03, FrB1-07에서는, 60 내지 75 kD 부근에 밴드가 확인되었다. 이 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 3: 모노클로날 항체를 사용한 ELlSA에서의 항원 측정
3종의 정제 모노클로날 항체를 0.1 M 인산 완충액 pH 7.5에서 2 ㎍/㎖의 농도로 마이크로플레이트 모듈(Nunc사 제조)의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여, 4 ℃에서 밤새 배양하여 고상화하였다. 다음에, 0.1 ％의 Tween 20(상품명)을 포함하는 PBS(PBS-Tween)로 각 웰을 세정 후, PBS로 희석한 1 ％의 BSA 300 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 밤새 블로킹을 행하였다. 반응 용액으로 희석한 인플루엔자 B형 바이러스액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 반응 용액으로 희석 조정한 3종의 알칼리 포스파타제 표지 모노클로날 항체를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후 PBS-Tween으로 충분히 세정하고, 4-니트로페닐포스페이트(4-NPP)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 주파장 415 nm, 부파장 490 nm에서 발색 수준을 측정하였다. 양성은 완충액 블랭크의 발색 수준의 2.1배 이상으로 하고, 양성이 되는 최종 희석 배율로 반응성의 강도를 나타내었다.
취득한 3종의 모노클로날 항체에 의한 조합 총 9 종류에 있어서, 시판 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체에 대하여 동등 내지 4배 높은 반응성을 나타내었다. 이 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112006004598725-PCT00002
참고예 1: 알칼리 포스파타제 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체의 제조
상기 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체(FrB1-03)를 펩신 처리하여 Fc 영역을 절단하여 F(ab')2를 얻고, 다음에 2MEA(2-머캅토에틸아민 염산염, 나카라이테스크사 제조)를 사용하여 디술피드 결합을 절단하고, 유리 티올기를 노출시킨 F(ab')를 얻었다. 다음에, 말레이미드기를 도입한 알칼리 포스파타제와 F(ab')를 커플링하고, 겔 여과로 정제 알칼리 포스파타제 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 얻었다.
참고예 2: 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체의 제조
면역원으로는 인플루엔자 핵 단백질 항원을 함유하는 인플루엔자 HA 백신(카케쯔겐 제조:A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1)(IVR-116)주, A/파나마/2007/99(H3N2)(NIB-41)주, B/야마나시/166/98주)을 사용하였다.
면역원에 등량의 프로인트 완전 보조제(야토론사 제조)를 첨가하여 완전히 혼합한 후, Balb/c 마우스에서 2 주 간격으로 총 4회 면역시켰다. 세포 융합 3 일 전에 마우스 복강 내에 면역원을 주사하고, PEG를 사용하여 마우스 비장 세포와 미엘로마 세포(P3U1)를 융합하였다. 배양액에는 HAT 선택 배지를 사용하고, 약 2 주 후에 배양 상청을 채취하여 스크리닝에 사용하였다. 1차 스크리닝에는, 인플루엔자 HA 백신, 인플루엔자 A형 재조합 핵 단백질 항원(A/뉴 칼레도니아/20/99 유래(r-NP/H1N1), A/키따큐슈/159/93 유래(r-NP/H3N2))을 고상화한 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA 법)을 사용하였다. 즉, 인플루엔자 HA 백신은 0.1 M 탄산 완충액 pH 9.6으로 300배 희석하고, 동일하게 A형 재조합 핵 단백질 항원은 1 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 마이크로플레이트 모듈(Nunc사 제조)의 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 4 ℃에서 밤새 배양하여 고상화하였다. 다음에, 0.1 ％의 Tween 20(상품명)을 포함하는 PBS(PBS-Tween)로 각 웰을 세정 후, PBS로 희석한 1 ％의 소혈청 알부민(BSA) 300 ㎕를 첨가하여 4 ℃에서 밤새 블로킹을 행하였다. 블로킹액을 제거한 후, 배양 상청을 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 0.2 ％ BSA, 0.2 ％ 에멀겐 985, 1 ％ 수크로오스, 1 ％ KCl을 포함하는 0.05 M 인산 완충액 pH 7.5(반응 용액)로 2000배 희석한 효소 표지 항 마우스 Igs 항체(DAKO사 제조)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-Tween으로 충분히 세정하고, 2,2'-아지노-비스-3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산(ABTS)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 주파장 415 nm, 부파장 490 nm에서 발색 수준을 측정하였다.
양성이라고 판정된 배양 상청에 대해서는, 인플루엔자 B형 재조합 핵 단백질 항원(B/야마나시/166/98(r-NP/B))을 항원으로 한 ELlSA로 2차 스크리닝을 행하고, 최종적으로 인플루엔자 A형 핵 단백질 항원에 반응하며, 인플루엔자 B형 핵 단백질 항원과는 반응하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마 3 주(하이브리도마 FVA2-3, 하이브리도마 FVA2-6 및 하이브리도마 FVA2-11)를 얻었다. 상기 각 하이브리도마는 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 부다페이트 조약에 기초하여, 하이브리도마 FVA2-3, 기탁 번호 FERM BP-10066, 하이브리도마 FVA2-6, 기탁 번호 FERM BP-10067, 하이브리도마 FVA2-11, 기탁 번호 FERM BP-10068로서 기탁되어 있다.
참고예 3: 알칼리 포스파타제 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체의 제조
상기 참고예 2에서 제조한 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체(FVA2-11)를 사용하여, 상기 참고예 1과 동일한 처리를 반복함으로써 알칼리 포스파타제 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 얻었다.
실시예 3: 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구
도 2에 나타낸 바와 같이, 폭 5 mm, 길이 50 mm의 니트로셀룰로오스 막(밀리포어사 제조)의 매트릭스 (2)의 전개액 흡수 존 (5)측의 말단으로부터 16 mm와 13.5 mm의 위치에 참고예 2에서 제조한 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체(FVA2-11)와 실시예 2에서 제조한 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체(FrB1-03)를 포함하는 수용액 0.7 ㎕를 니트로셀룰로오스 막에 각각 점착하여 건조시켜 검출 존 (6a) 및 (6b)를 제조하였다. 또한, 매트릭스 (2)의 전개액 흡수 존 (5)측의 말단으로부터 11 mm의 위치에 항 알칼리 포스파타제 항체(다코사 제조)를 점착하여 건조시켜 전개액 확인부 (10)을 제조하였다. 다음으로, 매트릭스에 참고예 3에서 제조한 알칼리 포스파타제 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체(5 ㎍/㎖)와 참고예 1에서 제조한 알칼리 포스파타제 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체(7.5 ㎍/㎖)와의 혼합 수용액 5 ㎕를 점착하여 건조시켜, 효소 표지 시약 패드 (4)를 포함하는 표지 시약 존을 제조하였다.
전개액 패드 (3)은, 폭 5 mm, 길이 20 mm의 여과지(밀리포어사 제조) 상에, 기질로서 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴인산(BCIP) 100 ㎍을 폭 6.1 mm의 라인상으로 점착하여 건조시켜 제조하였다. 상기 매트릭스 (2), 전개액 패드 (3), 효소 표지 시약 패드 (4) 및 전개액 흡수 패드 (5)(폭 10 mm, 길이 20 mm, 두께 1 mm의 여과지(와트만사 제조))를, 전개액조 (11)을 갖는 플라스틱 케이스에 고정하여, 도 3 및 4에 나타내는 인플루엔자 A형 바이러스 및 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구 (1)을 제조하였다.
참고예 4: 인플루엔자 A형 바이러스 및 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구(종래 측정 기구)
실시예 3에서 제조한 제조한 인플루엔자 A형 바이러스 및 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구 (1)의 검출 존 (6d) 및 (6b), 알칼리 포스파타제 표지 항-인플루엔자 바이러스 항체에 대하여, 각각 구입한 항-인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체 및 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체를 사용하여, 인플루엔자 A형 바이러스 및 B형 바이러스 동시 면역 측정 기구(에스플라인 인플루엔자 A&B(후지레비오사 제조); 종래 측정 기구)를 제조하였다.
실시예 4: 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스의 측정
상기 실시예 3에서 제조한 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스 동시 측정 기구 (1)(본 발명 측정 기구)의 검체 점착 존 (8)에 표 3에 기재된인플루엔자 B형 바이러스의 아형 시료(시료 희석액으로서, 계면활성제를 포함하는 트리스 완충액(pH 8.0)을 사용) 각 30 ㎕를 점착시킨 후, 변형 부재에 설치한 압입부 (12)를 아래쪽으로 가압하여 변형시키고, 변형 부재에 부설된 돌기부 (13)에 의해서 전개액 패드 (3)을 전개액조 (11)에 삽입하여 전개액을 전개액 패드 (3)에 공급하여 측정을 개시하였다. 측정 개시 15 분 후, 대상 시약 존 (10)의 발색에 의해서 전개액의 전개를 확인한 후, 검출 존 (6a) 및 (6b)의 발색을 육안으로 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112006004598725-PCT00003
또한, 대조로서, 참고예 4에서 제조한 종래 측정 기구에 의해서 표 3에 기재된 상기 시료 30 ㎕에 대하여 동일하게 바이러스의 검출을 행하였다. 그 측정 결과를 표 3에 나타내었다.
결과로부터 종래 측정 기구에서는 검출할 수 없었던 인플루엔자 B형 바이러스의 각종 검체에 대하여, 본 발명 측정 기구에서는 모두 검출 가능하였다.
실시예 5
상기 실시예 3에서 제조한 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스 동시 측정 기구 (1)(본 발명 측정 기구)를 사용하고, 실시예 4와 동일하게 하여 아데노 바이러스(1 내지 7형), 코쿠사키 바이러스(A16, B1 내지 B6형), 단순 헤르페스 바이러스 1형, 에코 바이러스(3형, 4형, 7형, 22형, 30형), 엔테로 바이러스(71형), 문프스 바이러스, 폴리오 바이러스(1 내지 3형), RS 바이러스(서브그룹 A, 서브그룹 B), 파라인플루엔자 바이러스(1 내지 3형), 대장균, 폐렴간균, 녹농균, 영균, 표피 포도 구균, 변형균, 황색 포도 구균, 코리네 박테리아, 디프테리아, 칸디다ㆍ알비칸스, 화농 연쇄 구균, 스트렙토코커스속(그룹 B, C, G, F), 폐렴 연쇄 구균, 헤모필루스속 인플루엔자, 리스테리아ㆍ모노사이토게네스, 폐렴 마이코플라즈마, 클라미디아ㆍ트라코마티스, 클라미디아ㆍ뉴모니에와의 교차 반응성을 조사하였다. 그 결과, 이들 어느 바이러스 또는 균과도 반응하지 않았다.

Claims (5)

  1. 인플루엔자 B형 바이러스의 분자량 60 내지 75 kD의 핵 단백질과 항원 항체 반응하고, 인플루엔자 A형 바이러스와는 실질적으로 항원 항체 반응하지 않는, 항-인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  2. 제1항에 있어서, 부다페스트 조약에 기초하여, 수탁 번호 FERM BP-10070으로 국제 기탁된 하이브리도마 FrB1-03, 수탁 번호 FERM BP-10071로 국제 기탁된 하이브리도마 FrB1-07 또는 수탁 번호 FERM BP-10069로 국제 기탁된 하이브리도마 FVB2-16에 의해 생산되는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  3. 이동 가능한 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 갖는 표지 시약 존(zone), 검체 점착 존, 전개액 공급 존, 전개액 흡수 존, 및 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체를 매트릭스에 부동화시킨 인플루엔자 B형 바이러스 검출 존을 매트릭스에 설치한 기구이며, 상기 표지 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 및 검출 존에 부동화된 항-인플루엔자 B형 바이러스 항체 중 하나 이상의 항체가 제1항 또는 제2항에 기재된 모노클로날 항체인 면역 측정 기구.
  4. 제3항에 있어서, 표지 시약 존에 표지 항-인플루엔자 A형 바이러스 항체를 추가로 포함하고, 인플루엔자 B형 바이러스 모노클로날 항체를 부동화시킨 인플루 엔자 B형 바이러스 검출 존 근방에 인플루엔자 A형 바이러스 모노클로날 항체를 부동화시킨 인플루엔자 A형 바이러스 검출 존을 추가로 갖는 면역 측정 기구.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 표지물이 효소이고, 전개액 중 및(또는) 전개액 공급 존 근방에 효소에 대한 기질을 함유하는 면역 측정 기구.
KR1020067001431A 2003-07-23 2004-07-23 항-인플루엔자 ｂ형 바이러스 모노클로날 항체 및 상기항체를 사용하는 면역 측정 기구 KR20060054333A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2009148150A1 (ja) * 2008-06-06 2011-11-04 国立大学法人富山大学 インフルエンザウィルス検出用デバイス
EP2418488B1 (en) 2009-04-09 2015-08-12 ARKRAY, Inc. Sample analyzing tool, method of manufacturing sample analyzing tool, and method of minimizing drop in solution permeability of deployment member
JP2010261912A (ja) * 2009-05-11 2010-11-18 Bl:Kk ヒトインフルエンザウイルスｈ３亜型の免疫学的検出法
JP5567932B2 (ja) * 2010-08-03 2014-08-06 田中貴金属工業株式会社 イムノクロマトグラフィー用試薬組成物およびそれを用いた測定方法
RU2491338C2 (ru) * 2011-06-30 2013-08-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский Институт гриппа" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "НИИ гриппа" Минздравсоцразвития России) Применение моноклональных антител для идентификации ямагатской или викторианской эволюционных линий вируса гриппа типа в, штамм гибридомы 4н7 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в ямагатской ветви, штамм гибридомы в/4н1 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в викторианской ветви
TW201346040A (zh) 2012-03-30 2013-11-16 Tanaka Precious Metal Ind 流行性感冒ａ型病毒檢驗用套組
JP6182027B2 (ja) * 2013-09-10 2017-08-16 デンカ生研株式会社 Ｂ型インフルエンザウイルスの測定方法
JP6262969B2 (ja) 2013-09-10 2018-01-17 デンカ生研株式会社 Ａ型インフルエンザウイルスの測定方法
US20160377616A1 (en) * 2013-11-29 2016-12-29 Sekisui Medical Co., Ltd. Immunochromatographic detection method
JP6985572B2 (ja) * 2015-11-09 2021-12-22 国立大学法人京都工芸繊維大学 単鎖抗体のスクリーニング方法及び単鎖抗体
JP7065338B2 (ja) * 2017-09-12 2022-05-12 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 インフルエンザウイルス核内蛋白質に結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法
CN114276440B (zh) * 2020-09-27 2022-12-27 东莞市朋志生物科技有限公司 针对乙型流感病毒的抗体和检测试剂盒
CN114276441B (zh) * 2020-09-27 2022-12-27 东莞市朋志生物科技有限公司 抗乙型流感病毒的抗体及其制备方法和检测试剂盒
CN117384279A (zh) * 2022-07-05 2024-01-12 东莞市朋志生物科技有限公司 抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2518607B2 (ja) * 1985-08-29 1996-07-24 雪印乳業株式会社 インフルエンザａ型ウイルスｈａ抗原に対するモノクロ―ナル抗体およびその作成方法
JP3334558B2 (ja) * 1997-04-23 2002-10-15 富士レビオ株式会社 酵素免疫測定方法及び試験片

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