KR101792860B1 - 인플루엔자 a 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 민감도가 증진된 신속 형광면역 진단키트 - Google Patents

인플루엔자 a 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 민감도가 증진된 신속 형광면역 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 A 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트에 관한 것으로, 본 발명에서는 인플루엔자 A 바이러스 NP 항원에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 하이브리도마 세포주를 제조하였으며, 상기 단클론항체를 활용한 형광면역키트를 통해 인플루엔자 A 바이러스를 신속하게 검출할 수 있으며, 특히 인간의 고병원성인 H5 아형에 대해 민감도가 높음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 단클론항체는 신속진단이 가능한 신속 키트에 사용될 수 있으며, 이런 항원-항체 진단키트는 국내 뿐 아니라 해외에서 인플루엔자가 발생하고 있거나 발생 가능성이 있는 국가에 보급함으로써 선두 주자로서의 시장 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인플루엔자 A 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 민감도가 증진된 신속 형광면역 진단키트{Monoclonal antibody specific to nucleoprotein of influenza A virus and rapid fluorescence-linked immunochromatographic diagnostic kit with enhanced sensitivity using the same}
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 민감도가 증진된 신속 형광면역 진단키트에 관한 것이다.
매년, 계절적 인플루엔자는 U.S. 단독에서 300,000 입원 및 36,000 사망의 원인이 된다. 인플루엔자(influenza)는 인플루엔자 바이러스에 의한 호흡기 질환이다. 원인병원체인 인플루엔자 바이러스는 구형(직경 80~120nm)의 바이러스로 오소믹소바이러스 패밀리(Orthomyxoviridae family)의 구성원이다. 인플루엔자 바이러스 입자는 하기의 단백질을 암호화하는, 부분으로 나누어진 네거티브-센스-RNA 유전체를 포함한다: 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA), 뉴라미니다제(neuraminidase, NA), 매트릭스(Matrix, M1), 양성자 이온-채널 단백질(M2), 뉴클레오단백질(NP), 폴리머라제 염기 단백질 1(PB1), 폴리머라제 염기 단백질 2(PB2), 폴리머라제 산성 단백질(PA) 및 비구조적 단백질 2(NS2). HA, NA, M1 및 M2는 멤브레인과 연관된 반면에, NP, PB1, PB2, PA 및 NS2는 뉴클레오캡시드와 연관된 단백질이다. M1 단백질은 인플루엔자 입자에서 가장 풍부한 단백질이다. HA 및 NA 단백질은 세포로 바이러스 입자의 바이러스 부착 및 침투에 대해 책임지고, 바이러스 중성화 및 면역을 보호하기 위한 주요 면역우성항원결정기의 원천인 외피(envelope) 당단백질이다. HA 및 NA 단백질 모두는 예방 인플루엔자를 위한 가장 중요한 구성요소로 고려된다.
인플루엔자 바이러스는 항원의 차이에 기초하여 A형, B형 및 C형으로 분류된다. 인플루엔자 A 바이러스는 사람뿐만 아니라 조류 및 돼지도 감염시킨다. C형 인플루엔자는 사람에서 경미한 질병만 일으킨다. 인플루엔자 A 바이러스는 서브타입 또는 타입, 지리적 기원, 균주 번호 및 단리 연도를 포함하는 명명법에 의하여, 예를 들면 A/베이징/353/89로 기술된다. 또한, 인플루엔자 A 바이러스는 표면항원인 헤마글루타닌(HA) 항원과 뉴라미다아제(NA) 항원에 의해 아형이 결정된다. HA 항원은 H1-H16까지 알려져 있으며, NA 항원은 N1-N9까지 알려져 있어, 이들의 조합에 의해 총 144종의 아형 발생이 이론적으로 가능하다. 인플루엔자 A 바이러스의 유전자는 8개의 유전자 조각으로 구성되어 있으며, 이러한 이유로 유전자 재조합이 일어날 수 있다. 모든 서브타입은 조류에서 발견되나, H1-H3 및 N1-N2는 인간, 돼지 및 말에서 발견되는 것으로 알려져 있다.
현재 인플루엔자 감염의 진단검사는 바이러스 검출과 바이러스에 대한 환자의 면역반응을 이용한 방법이 주를 이루고 있다. 이에 따라 진단검사는 인플루엔자 바이러스 분리(배양), 바이러스 항원의 검출(신속항원검사, 면역형광법), 바이러스 핵산의 입증(RT-PCR), 혈청학적 검사 등 4가지로 대별된다. 바이러스 배양방법은 2~10일의 시간 소요와 숙련된 전문가가 필요하며 위음성(false negative)이 나올 가능성이 높다는 단점이 있고, PCR법은 각 아형에 맞는 프라이머가 필요하다는 단점이 있다. 항체를 이용한 면역학적 방법은 높은 정확도로 질병의 진단이 가능하다. 그러나, 현재 사용되고 있는 인플루엔자백신 항원함량시험법인 SRID(Single Radial Immuno Diffusion; 단순평판면역확산법)는 노동력과 시간이 많이 소요되고, 세포에서 생산한 배양 상층액의 헤마글루티닌 측정을 위해 농축이 불가피하므로 민감도(sensitivity)가 낮으며, 한번에 측정할 수 있는 샘플수가 최대 10개를 넘지 못하고 소요시간(2일)이 긴 단점이 있다. 또한, 사용하는 표준항원 및 표준항체의 단가 때문에 진단 단가가 높으며, 정제하지 않은 샘플에서는 정확성이 높지 않은 문제점이 있다. 또한, 인플루엔자 바이러스의 감염을 막기 위해서 현장에서 신속한 면역진단을 통하여 감염의 전파차단을 일차적으로 막을 수 있는 고감도의 항원-항체 진단키트의 개발이 시급하다.
한편, 한국등록특허 제1628331호에서는 '인플루엔자 A 바이러스 특이적 단클론 항체 및 이를 이용한 인플루엔자 감염 치료 및 진단 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1625979호에서는 '항 Ｈ5 아형 Ａ형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 모노클로날 항체'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '인플루엔자 바이러스 진단용 단세포군 항체 및 면역크로마토그래피 진단키트'에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 인플루엔자 A 바이러스 NP 항원에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 하이브리도마 세포주를 제조하였다. 상기 단클론항체를 활용한 형광면역키트를 통해 인플루엔자 A 바이러스를 신속하게 검출할 수 있으며, 특히 인간의 고병원성인 H5 아형에 대해 민감도가 높음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오단백질(nucleoprotein)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 개발된 단클론항체는 신속진단이 가능한 신속 키트에 사용될 수 있으며, 이런 항원-항체 진단키트는 국내 뿐 아니라 해외에서 인플루엔자가 발생하고 있거나 발생 가능성이 있는 국가에 보급함으로써 선두 주자로서의 시장 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 인플루엔자 바이러스 NP 항원으로 면역된 마우스(M)의 혈청내 항체가(antibody titer)를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 음성대조군으로는 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 2는 세포융합 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 3AA2 클론으로부터 분비한 항체가를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 양성대조군(positive)으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 3은 제한개수희석법(limiting dilution)을 수행한 후 96-웰 플레이트와 75T 배양 플라스크에서 배양된 단클론세포주 3AA2-BD3(3D3)로부터 분비한 항체가 측정 결과이다. 양성대조군으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 4는 정제된 단클론항체(3D3)의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 양상을 SDS-PAGE(전기영동법)으로 확인한 결과이다. M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 단클론항체(3D3) 및 상용화 항체(7307)의 아형 바이러스(H1N1, H5N3, H7N1)에 대한 검출여부를 점 블롯(A) 및 웨스턴 블롯(B)을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 단클론항체의 아형 바이러스(H1N1, H5N3, H7N1)에 대한 검출여부를 샌드위치 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 항체를 이용한 인플루엔자 A 검출용 신속 형광면역진단시스템(형광면역크로마토그라피법 스트립 형태)의 구성 모식도를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 H5N3 바이러스에 대한 검출 한계를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 H7N1 바이러스에 대한 검출 한계를 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 H1N1 바이러스에 대한 검출 한계를 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 신속 형광면역진단시스템의 인플루엔자 B 바이러스에 대한 교차반응성을 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오단백질(nucleoprotein, NP)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
상기 단클론항체는 인플루엔자 A 바이러스의 NP에 특이적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 인플루엔자 A 바이러스의 NP에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '단클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단클론항체는 단세포군 항체라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 단클론항체는 인플루엔자 A 바이러스의 NP 항원을 사용하여 면역된 마우스 비장세포로부터 세포융합기술에 의해 획득한 하이브리도마 세포(기탁번호 KTCE 13069BP)로부터 생산되는 항체를 제작하였으며, 이를 3D3로 명명하였다.
본 발명에 따른 단클론항체는 IgG3-카파의 면역글로불린 아이소타입(isotype)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체(3D3)를 생산하는 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 단클론항체(3D3)는 한국생명공학연구원에 2016년 7월 22일자로 기탁된 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주로부터 제조된 것이다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 인플루엔자 A 바이러스 NP에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 포함하며, 상기 항체를 이용하여 인플루엔자 A 바이러스 NP 항원에 대해 형성된 항원-항체 복합체를 검출함으로써 인플루엔자 A 바이러스를 면역학적으로 검출할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 인플루엔자 A 바이러스 NP 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론 항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 양자점, 플루오레세인, Eu3 +, Eu3 + 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 또는 125I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단클론항체 또는 이의 절편은 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 인플루엔자 A 바이러스 NP에 특이적으로 결합하는 단클론항체가 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 NP에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체(3D3)가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 키트에서 형광체와 결합하여 형광체-항체 복합체를 형성하는 단클론항체는 인플루엔자 A 바이러스의 NP에 특이적으로 결합하는 항체이면 특별히 제한 없이 사용 가능하며, 예를 들면, 인플루엔자 A 바이러스의 NP에 특이적으로 결합하는 7307 SPTN-5 항체를 사용할 수 있다. 상기 7307 SPTN-5 항체(이하, 7307 항체로 명명함)는 Medix Biochemica사로부터 구입한 단클론항체(product name: Anti-influenza A 7307 SPTN-5, product code: 100083)이다.
상기 형광체-항체 복합체는 라텍스 비드에 친수성 화합물이 코팅된 양자점이 결합되고, 상기 라텍스 비드 표면에 항체가 결합된 양자점-라텍스 비드-항체 복합체일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 라텍스 비드는 양자점 및 항체가 결합할 수 있는 매개체로서 사용할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 양자점 및 항체가 결합할 수 있도록 다수의 반응성 아미노기가 존재하는 라텍스 비드인 것이 바람직하다. 상기 라텍스 비드의 직경은 10~2,000nm인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 50~1,000nm인 것이며, 더욱더 바람직하게는 100nm인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 라텍스 비드 및 친수성 화합물이 코팅된 양자점은 1:40~1,000의 몰비로 결합된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1:70~800의 몰비로 결합된 것이며, 더욱더 바람직하게는 1:90의 몰비로 결합한 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 라텍스 비드 및 인플루엔자 바이러스 항체는 1:50~500의 몰비로 결합된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1:100~470의 몰비로 결합된 것이고, 더욱더 바람직하게는 1:455의 몰비로 결합된 것이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 라텍스 비드와 친수성 화합물이 코팅된 양자점의 결합은 라텍스 비드 표면에 있는 아미노기와 양자점에 포함된 카르복실기 사이의 아마이드 결합인 것이 특징이며, 상기 라텍스 비드와 인플루엔자 바이러스 항체의 결합은 라텍스 비드 표면에 있는 카르복실기와 인플루엔자 바이러스 항체에 포함된 아미노기 사이의 아마이드 결합인 것이 특징이다.
상기 양자점은 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴설파이드(CdS), 카드뮴텔로리움(CdTe), 징크텔로리움(ZnTe), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크설파이드(ZnS), 징크옥사이드(ZnO), 인듐 인화물(InP), 인듐 비화물(InAs), 머큐리텔로리움(HgTe) 및 머큐리셀레나이드(HgSe) 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 양자점의 직경은 1~30nm인 것이 바람직하지만, 더 바람직하게는 2~20nm이지만, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 양자점의 발광파장은 450~700nm인 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 적용한 키트는 안정하여 장기간 보관하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 검출용 키트는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 시료를 투입할 수 있는 시료주입부가 구비되고, 상기 시료 주입부로부터 일정 간격을 유지하면서 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 A 바이러스 특이 항체 7307이 축합된 복합체가 건조된 축합 패드, 본 발명에 따른 인플루엔자 A 바이러스 NP 항원에 특이적으로 결합하는 항체(3D3)가 고정된 검사선 및 상기 축합 패드에 존재하는 단클론항체를 검출할 수 있는 이차 항체가 고정된 대조선이 순차적으로 구비된 면역스트립일 수 있다.
상기 인플루엔자 바이러스 검출용 키트에 인플루엔자 A 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 형광빛띠가 나타나면 인플루엔자 바이러스 감염을 양성으로 판정하고, 대조선에만 형광빛띠가 나타나면 인플루엔자 바이러스 감염을 음성으로 판정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 3D3를 점적한 스트립은 7307을 점적한 스트립보다 H5N3 바이러스의 형광값이 더 높았고 바이러스 검출한계에 대해 3D3가 4배 이상 높음을 확인하였다. 이에 본 발명의 단클론항체 3D3를 활용한 신속 형광면역키트는 인간의 고병원성인 H5 아형에 대해 특히 민감도가 증진된 키트로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 '민감도(sensitivity)'는 감별검사에서 실제로 양성 시료(인플루엔자 바이러스 감염된 시료) 중에서 검사결과가 양성으로 나올 확률로, 검사가 양성 시료를 얼마나 잘 골라내는지를 나타내는 지표이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인플루엔자 A 바이러스 NP 항원의 마우스 면역
인플루엔자 A 바이러스의 뉴클레오단백질(nucleoprotein, NP) 재조합단백질(Novus사, Cat#NBP2-24986; 서열번호 1)을 면역원으로 사용하였다. 인플루엔자 A 바이러스 NP 항원(50㎕ 및 25㎕)을 마우스에 2주 간격으로 3회 면역시켜 마우스 혈청 내에서 높은 항체가를 ELISA(면역효소검사법)로 확인하였다(도 1). 음성대조군으로는 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
실시예 2. 세포융합기술 시행 및 잡종세포 확보
면역된 마우스의 비장세포(splenocytes)를 얻은 다음, 암세포의 일종인 F/O 세포들과 세포융합기술(cell fusion technique)을 수행하여 여러 하이브리도마 세포(hybridoma cell) 중 3AA2 클론(clone)을 택하여 96-웰 플레이트로부터 75T 배양 플라스크로 점차 수를 늘려 배양하였고 항체를 분비하고 있음을 확인하였다(도 2). 양성 대조군으로는 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로는 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
실시예 3. 단클론항체를 분비하는 단클론세포주 확보
그 중 높은 항체를 분비하는 3AA2 세포를 택하여 각각 96-웰 플레이트에서 제한개수희석법(limiting dilution)을 수행하였으며, 각 웰에서 항체가가 가장 높은 단클론세포주인 3AA2-BD3(3D3로 명명)를 선택하였다(도 3).
단클론세포주(monoclone) 3D3를 75T 배양 플라스크에서 대량으로 배양한 후 항체를 분비함을 확인하였는데, 3D3 단클론세포주가 분비하는 단클론항체(monoclonal antibody)의 항체가(ELISA OD value)는 1.000이었다(도 3).
실시예 4. 단클론항체의 대량생산과 정제
단클론항체의 대량생산을 위해 3D3 단클론세포주를 마우스 복강내로 주입하여 복수가 생성되면 채취하였고, 단백질 A 컬럼(protein A column)을 이용하여 단클론항체를 정제하였다. SDS-PAGE 전기영동법으로 정제된 단클론항체 3D3의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)를 확인하였다(도 4).
단클론항체가 어떤 형태의 면역글로블린(Immunoglobulin; Ig)인지 알아보기 위해 isotyping kit를 이용하여 실험한 결과, 단클론항체 3D3의 아이소타입(isotype)은 IgG3 카파(kappa)였다.
실시예 5. 단클론항체의 바이러스 검출
본 발명의 단클론항체가 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는지 확인하기 위하여 웨스턴 블롯/점 블롯(Western blot/dot blot)을 수행하였다. 또 다른 인플루엔자 A 바이러스 NP 항원 특이 단클론항체 7307(Medix Biochemica, 핀란드)을 구매하여 같이 수행하였다. 1000HAU(hemagglutination units)/㎖의 각각의 아형 바이러스(H1N1, H5N3, H7N1)을 10㎕로 나이트로셀룰로스(nitrocellulose) 막에 떨어뜨리고, 3D3 및 7307를 1차 항체(1㎍/㎖)로 검출한 결과, 각 바이러스에 대하여 검출 가능성이 있음을 확인하였다(도 5). 점 블롯 상에서 3D3는 각 아형 바이러스에 대해 7307보다 더 높은 항원-항체 반응성이 있음을 확인하였다(도 5).
본 발명의 단클론항체의 바이러스 검출을 확인하기 위한 또 다른 방법으로, 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA) 방법을 수행하였다. 96 웰 플레이트에 3D3 항체(1㎍/웰) 및 7307 항체(1㎍/웰)를 13시간, 4℃에서 반응시킨 뒤, 5% BSA로 2시간 블로킹(blocking)을 수행하였다. 항원으로 5000HAU/mL의 각각의 아형 바이러스(H1N1, H5N3, H7N1)을 100㎕로 1시간 동안 37℃에서 반응시키고, PBS로 세척한 뒤, 5% 밀크로 희석된 검출용 항체(HRP 축합된 7307, 2㎍/웰)로 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 뒤, 세척하고, TMB 기질을 넣고 10분 후에 발색되면 OD450nm를 측정한 결과, 3 아형 바이러스를 모두 측정할 수 있음을 확인하였고, 두 조합의 성능은 상기 샌드위치 ELISA 방법에서는 유사하였다(도 6).
실시예 6. 인플루엔자 A 바이러스 검출용 신속 형광면역 진단키트 제작
6.1. 양자점-라텍스 비드-항체 복합체 제조
신속 형광면역 진단키드용 항체로는 바이러스의 NP 항원에 대한 특이 항체 2종, 3D3 및 7307 항체를 사용하였다. 형광체-항체 복합체에 결합하는 항체로는 7307을 사용하였고, 형광물질로는 최대발광 파장이 640nm인 양자점을 사용하였다.
먼저 양자점에 라텍스를 가하여, 양자점과 라텍스가 결합된 결합체를 제작하였다. 구체적으로, 약 100nm 크기의 0.044μM 아민 라텍스(amine latex, Life Technology사) 50㎕에 세척완충액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 0.1M Phosphate Buffered Saline, pH 8)을 가하여 1회 세척하였다. 이어, 0.1μM 양자점을 1:90의 몰비로 혼합하고, 라텍스와 양자점간의 아미드 결합을 만들기 위한 커플링 시약으로 0.01M EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 200㎕ 및 0.01M Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 300㎕을 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 원심분리(17000rpm, 5분)를 통해 결합하지 않은 양자점을 제거하고, 침전물을 상기 세척완충용액을 가하여 1회 세척하였다. 상기 양자점-라텍스 비드 복합체에서 양자점이 결합되지 않은 라텍스 비드 표면의 아미노기에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 결합하여 라텍스 비드 표면을 카르복실기로 치환하였다. 이 후 실온에서 1시간 반응시키고 1회 세척하였다.
상기 양자점-라텍스 비드 복합체에 200㎕의 0.1M 소듐 포스페이트용액(pH 8.0)을 첨가하고 0.01M EDC 100㎕ 및 0.01M Sulfo-NHS 150㎕을 넣어 소니케이션(sonication)한 후, 7307 항체(1㎎/㎖)를 150㎕를 첨가하고(최종적으로 라텍스에 대한 항체 비가 1:455 몰비가 되게 함) 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 원심분리하여 상징액을 제거하였다. 비특이반응을 제거하기 위해, 0.1%의 BSA, 1%의 자당(sucrose), 1%의 젤라틴(gelatin) 및 0.01%의 카제인(casein)을 포함하는 블로킹용액에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 원심분리(15,000rpm, 5분)를 통해 결합하지 않은 인플루엔자 바이러스 항체를 제거하고, 침전물을 상기 세척완충용액(pH7.4)을 가하여 1회 세척한 후, 다시 원심분리하여 상기 세척완충용액(pH7.4) 500㎕에 분산하여 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 A 바이러스 항체 7307 복합체를 제조하였다.
6.2. 바이러스 진단용 형광면역진단키드 제작
상기 실시예 6.1.에서 제조한 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 A 바이러스 항체 7307 복합체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 키트를 제작하였다(도 7). 이때 3D3 단클론항체는 검사선에 점적하는(coating) 항체이고, 7307 단클론항체는 양자점-라텍스 비드와 축합된 항체 복합체로서의 검출(detection)용으로 사용한 항체로써, 두 항체를 한 셋트로 만든 래피드 키트이다. 또한 상기 래피트 키트와의 비교를 위해 검사선에 7307 항체로 점적한 스트립을 제조하였다.
구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를 결합시켜서 비후강 검체 시료를 투입할 수 있는 시료 주입부를 구비시켰다. 상기 검체 패드와 일정 간격을 두고, 상기 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 A 바이러스 항체 7307 복합체 2㎕를 점적하고 건조시키고(축합 패드) 일정 간격을 두고 검사선(Test line; T)을 설정한 다음, 상기 검사선에 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항체 3D3 또는 7307 2.5㎍을 가하여 고정시켰다. 상기 검사선에 고정한 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항체는 인플루엔자 A 바이러스의 NP에 대한 항체이다.
상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선(Control line; C)을 설정한 다음, 상기 대조선에 인플루엔자 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차 항체(마우스 IgG에 대한 항체) 2㎍을 가하여 고정시켰다.
그 결과로서, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 형광체-항체 복합체, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광 검출 키트를 제작하였다.
실시예 7. 진단시스템의 인플루엔자 A 바이러스 검출 성능 확인
7.1. 인플루엔자 A 바이러스 바이러스 검출 확인
상기 실시예 6에서 제작한 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 사용하고, H5N3, H1N1 및 H7N1 인플루엔자 바이러스를 각각 시료로서 준비하였다.
상기 시료에 포함된 인플루엔자 바이러스의 양을 적게는 5 HAU/㎖ 많게는 640 HAU/㎖이 되도록 설정하여 인플루엔자 바이러스 검출용 키트의 검출한도를 측정하였다. 이 때, 대조군으로는 바이러스를 처리하지 않은 것을 사용하였다.
반응 후의 검출용 키트를 375nm 파장에서 여기시켜 검사선과 대조선의 형광세기를 형광리더기(aGcare TRF, Medisensor)로 측정하였다. 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 양자점의 발광파장은 640nm으로 하였다.
7.1.1. H5N3 바이러스 경우
3D3를 점적한 스트립은 7307을 점적한 스트립보다 바이러스의 형광값이 더 높았다(도 8). 이는 바이러스 검출시 검출한계가 개선됨을 보여준다. 현재 3D3를 사용한 경우 25 PFU/㎖까지로 검출되지만, 7307을 점적한 스트립의 경우 바이러스의 검출한계가 100 PFU/㎖로 3D3를 사용할 경우 바이러스 검출율이 개선될 수 있음을 알 수 있었다.
7.1.2. H7N1 바이러스 경우
3D3를 점적한 스트립과 7307을 점적한 스트립을 비교시 형광값이 유사하고 바이러스 검출한계가 모두 10 HAU/㎖로 유사하였다(도 9).
7.1.3. H1N1 바이러스 경우
3D3를 사용한 경우 10 HAU/㎖까지로 검출되지만, 7307을 점적한 스트립의 경우 바이러스의 검출한계가 40 HAU/㎖로 3D3를 사용할 경우 바이러스 검출율이 개선될 수 있음을 알 수 있었다(도 10).
7.2. 인플루엔자 B 바이러스와 교차 반응 확인
실시예 6에서 제작된 진단키트를 이용하여 rRT-PCR(real-time RT-PCR) 측정으로 양성인 인플루엔자 B 감염 환자 검체에 대하여 진단한 결과 rRT-PCR 결과와 같은 진단 결과가 나왔고, 7307을 점적한 키트와 3D3를 점적한 키트의 형광값은 같은 검체에 대해 유사하게 측정되었다(도 11).
상기 실시예 7을 통해 3D3를 점적한 스트립은 7307을 점적한 스트립보다 H5N3 바이러스의 형광값이 더 높았고 바이러스 검출한계에 대해 3D3가 4배 이상 높았다. 이에 반해 다른 바이러스의 반응력은 큰 차이가 없었다. 따라서 3D3는 인간의 고병원성인 H5 아형에 대해 특히 민감도가 높으므로, 사람에게 감염된 인플루엔자 A인지 B인지를 진단할 때뿐 만 아니라 특히 고병원성인 H5 아형에 대하여 신속하게 진단할 때 유용할 것으로 사료된다.
한국생명공학연구원 KCTC13069BP 20160722
<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Monoclonal antibody specific to nucleoprotein of influenza A virus and rapid fluorescence-linked immunochromatographic diagnostic kit with enhanced sensitivity using the same <130> PN16297 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NP <400> 1 Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met 20 25 30 Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys 35 40 45 Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu 50 55 60 Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile 85 90 95 Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp 100 105 110 Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160 Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 180 185 190 Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 195 200 205 Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp 225 230 235 240 Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu 245 250 255 Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270 Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly 275 280 285 Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe 290 295 300 Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu 305 310 315 320 Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala 325 330 335 Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Lys Gly Thr Lys Val 340 345 350 Leu Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn 355 360 365 Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg 370 375 380 Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg 385 390 395 400 Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg 405 410 415 Asn Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Ile Met Ala Ala Phe Asn Gly Asn 420 425 430 Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met 435 440 445 Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe 450 455 460 Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Ala Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp 465 470 475 480 Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr 485 490 495 Asp Asn

Claims (8)

  1. 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오단백질(nucleoprotein)에 특이적으로 결합하는 단클론항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단클론항체는 IgG3-카파의 면역글로불린 아이소타입(isotype)인 단클론항체.
  3. 제1항의 단클론항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주.
  4. 제1항의 단클론항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 조성물.
  5. 제1항의 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출방법.
  6. 제1항의 단클론항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오단백질(nucleoprotein)에 특이적으로 결합하는 단클론항체가 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 제1항의 단클론항체가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 형광체-항체 복합체는 라텍스 비드에 친수성 화합물이 코팅된 양자점이 결합되고, 상기 라텍스 비드 표면에 항체가 결합된 양자점-라텍스 비드-항체 복합체인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 키트.
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