KR101844949B1 - 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 및 자성 입자를 이용하는 표적 물질의 검출방법 - Google Patents

양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 및 자성 입자를 이용하는 표적 물질의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 및 자성 입자를 이용한 표적 물질 검출방법에 관한 것으로, 검출하고자 하는 표적물질을 특이적으로 인식하는 타겟 모이어티(moiety)를 각각 결합시킨 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 이용하여, 시료에 존재할 수 있는 표적 물질을 신속하고 간편하게 검출할 수 있다.
또한, 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 이용함으로써, 양자점 나노입자 단독에 비해 형광측정 민감도가 증진되어 시료에 표적물질이 매우 적은 수로 존재하더라도 용이하게 검출할 수 있다.

Description

양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 및 자성 입자를 이용하는 표적 물질의 검출방법{Method for detection of target material using quantum dot-latex bead complex and magnetic particle}
본 발명은 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 및 자성 입자를 이용하는 표적 물질의 검출방법에 관한 것이다.
식품, 의료 및 환경분야에서 매질 속에 포함된 위해(危害)미생물 또는 바이러스를 검출하기 위하여, 그 매질 속에 포함된 미생물 또는 바이러스만을 선택적으로 분리한 후, 극미량 미생물 또는 바이러스 농도에 따른 검출신호 증가를 위해 일정한 미생물 또는 바이러스의 배양과정을 거쳐 검출한다. 일반적으로 미생물 배양시간은 장출혈성 대장균인 경우 12시간 정도이며, 인플루엔자 바이러스의 경우 2~10일정도의 시간이 소요된다. 이에 검출시간을 단축시키기 위해, 시료 속 미생물 또는 바이러스를 신속히 분리하고 검출할 수 있는 기술이 면역자성법을 기반으로 발전하고 있는 추세이다.
면역자성법은 자성을 가지는 나노 또는 마이크로 크기의 입자 표면에 미생물 또는 바이러스와 선택적으로 반응하는 항체를 고정시켜 항원-항체 반응을 통해 시료 속 미생물 또는 바이러스와 선택적으로 반응하게끔 유도한 후 자석으로 미생물만 분리하는 기술이다. 종래의 면역자성법은 시료기질 속 미생물을 선택적으로 분리하고 검출하는 기술로서 분리된 미생물 또는 바이러스를 확인하기 위해서는 또다른 검출방법(평판도말, 비색법, 실시간-PCR, SPR 및 ELISA 등)을 이용하였다.
따라서, 복잡하고 시간소모적인 상기 종래 방법들을 개선하기 위해 미생물 또는 바이러스의 분리 및 검출을 손쉽게 수행할 수 있는 새로운 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.
한편, 한국공개특허 제2010-0126758호에는 균질성 플라스틱-부착성 앱타머-자기 비드-형광단 제조 방법 및 다른 샌드위치 분석법을 개시하고 있으나, 본 발명의 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 및 자성 나노입자를 이용한 표적물질 검출방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 검출하고자 하는 표적물질을 특이적으로 인식하는 타겟 모이어티(moiety)를 각각 결합시킨 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체와 표적 물질이 포함된 것으로 예상되는 시료를 혼합하여, 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 형성을 유도한 후에, 상기 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체의 자성입자를 이용하여 시료 내의 표적물질을 분리하고, 상기 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체의 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체의 형광량을 측정하여, 표적물질을 간단하고 신속하게 분리 및 검출함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 각각에, 검출하고자 하는 표적물질을 특이적으로 인식하는 타겟 모이어티(moiety)를 결합시키는 단계;
(b) 상기 타겟 모이어티가 각각 결합된 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체;와 표적 물질이 포함된 것으로 예상되는 시료;를 혼합하여, 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 형성시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b) 이후에, 자성을 이용하여, 상기 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 시료로부터 분리시키는 단계;
(d) 상기 단계 (c)에서 분리한, 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 물 또는 완충용액으로 세척하는 단계; 및
(e) 상기 세척된 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체의 형광량을 측정하는 단계;를 포함하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 자성입자; 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체; 각각에, 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체를 결합시키는 단계;
(b) 상기 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체가 각각 결합된 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체와 인플루엔자 바이러스가 포함된 것으로 예상되는 시료를 혼합하여, 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 형성시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b) 이후에, 자성을 이용하여, 상기 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 시료로부터 분리시키는 단계;
(d) 상기 단계 (c)에서 분리한, 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 물 또는 완충용액으로 세척하는 단계; 및
(e) 상기 세척된 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체의 형광량을 측정하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 및 자성 입자를 이용한 표적 물질의 검출방법에 관한 것으로, 검출하고자 하는 표적물질을 특이적으로 인식하는 타겟 모이어티(moiety)를 각각 결합시킨 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 이용하여, 시료에 존재할 수 있는 표적 물질을 신속하고 간편하게 검출할 수 있다.
또한, 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 이용함으로써, 양자점 나노입자 단독에 비해 형광측정 민감도가 증진되어 시료에 표적물질이 매우 적은 수로 존재하더라도 용이하게 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체가 결합된 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체의 제작원리를 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른, 실험용 튜브에서 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체가 결합된 자성 입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른, 실험용 튜브에서 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체가 결합된 자성 입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 이용하여 검출된 인플루엔자 바이러스를 UV로 측정한 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른, 96 웰플레이트에서 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체가 결합된 자성 입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 나타낸 개략도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른, 96 웰플레이트에서 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체가 결합된 자성 입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 이용하여 검출된 인플루엔자 바이러스를 UV로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 (a) 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 각각에, 검출하고자 하는 표적물질을 특이적으로 인식하는 타겟 모이어티(moiety)를 결합시키는 단계;
(b) 상기 타겟 모이어티가 각각 결합된 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체;와 표적 물질이 포함된 것으로 예상되는 시료;를 혼합하여, 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 형성시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b) 이후에, 자성을 이용하여, 상기 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 시료로부터 분리시키는 단계;
(d) 상기 단계 (c)에서 분리한, 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 물 또는 완충용액으로 세척하는 단계; 및
(e) 상기 세척된 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체의 형광량을 측정하는 단계;를 포함하는 표적물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 타겟 모이어티(moiety)는 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 앱타머 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 항체일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 용어 항체란 당해 기술 분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로블린이다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 재조합 항체 모두를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다.
상기 표적물질은 검출하고자 하는 바이러스, 원핵세포(세균 등), 진핵세포(진균 등)이거나 또는 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포 내에 존재하는 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 항원 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 표적물질이 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포 내에 존재하는 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 항원 또는 항체인 경우에는 분리하고자 하는 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포에 외부에너지를 가하여 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포의 세포막 및 막을 제거하여 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 항원 또는 항체를 노출시킨 후에, 타겟 모이어티와 반응시켜 표적물질-타겟 모이어티 결합체의 생성을 유도할 수 있다. 바이러스, 원핵세포 또는 진핵세포의 세포막 및 막을 제거하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면 효소처리(예컨데, lysosyme 등), 열처리, 화학약품(예컨대, SDS, NaOH 등) 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체는 친수성 화합물이 코팅된 양자점 나노입자가 라텍스 비드에 결합된 것이지만, 이에 한정하지는 않는다.
상기 친수성 화합물은 시스테아민(cysteamine), 머캅토숙신산(mercaptosuccinic acid), 머캅토프로피온산(mercaptopropionic acid), 글루타티온(glutathion), 시스테인(cysteine), 티올-함유 실란 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 라텍스 비드는 바람직하게는 양자점 및 항체가 결합할 수 있도록 다수의 반응성 아미노기가 존재하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지는 않는다.
상기 라텍스 비드의 직경은 10~2,000nm인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 50~1,000nm인 것이며, 더욱더 바람직하게는 100nm인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 라텍스 비드 및 친수성 화합물이 코팅된 양자점은 1:50~1,000의 몰비로 결합된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1:70~800의 몰비로 결합된 것이며, 더욱더 바람직하게는 1:90의 몰비로 결합한 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 라텍스 비드 및 양자점의 몰비가 1:50 미만인 경우, 양자점이 충분하지 않으므로, 방출하는 형광량이 낮은 문제점이 있고, 1:1000을 초과하는 몰비에서는 형광노이즈가 심할 뿐만 아니라, 라텍스 비드에 대한 인플루엔자 바이러스 항체의 결합 비율이 낮아지는 문제가 있다.
상기 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체와 타겟 모이어티는 1:50~500의 몰비로 결합된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1:100~470의 몰비로 결합된 것이고, 더욱더 바람직하게는 1:455의 몰비로 결합된 것이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 양자점 나노입자는 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴설파이드(CdS), 카드뮴텔로리움(CdTe), 징크텔로리움(ZnTe), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크설파이드(ZnS), 징크옥사이드(ZnO), 인듐 인화물(InP), 인듐 비화물(InAs), 머큐리텔로리움(HgTe) 및 머큐리셀레나이드(HgSe) 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 양자점의 직경은 1~30nm인 것이 바람직하지만, 더 바람직하게는 2~20nm이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 양자점의 발광파장은 450~700nm인 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 자성입자의 직경은 30~500㎚인 것이 바람직하지만, 더 바람직하게는 50~400㎚이며, 보다 더 바람직하게는 100~300㎚이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 자성입자 100중량부에 대하여 타겟 모이어티 1.0~30.0중량부로 결합하는 것이 바람직하지만, 더 바람직하게는 상기 자성입자 100중량부에 대하여 타겟 모이어티 3.0~15.0중량부로 결합하는 것이며, 보다 더 바람직하게는 상기 자성입자 100중량부에 대하여 타겟 모이어티 5.0~9.0중량부로 결합하는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 자성입자는 단백질 A(Protein A) 또는 단백질 G(Protein G)가 결합된 것일 수 있으며, 예를 들면 단백질 A 또는 단백질 G를 통해 자성입자에 항체를 결합시킬 수 있다.
본 발명은 (a) 자성입자; 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체; 각각에, 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체를 결합시키는 단계;
(b) 상기 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체가 결합된 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체와 인플루엔자 바이러스가 포함된 것으로 예상되는 시료를 혼합하여, 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 형성시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b) 이후에, 자성을 이용하여, 상기 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 시료로부터 분리시키는 단계;
(d) 상기 단계 (c)에서 분리한, 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 물 또는 완충용액으로 세척하는 단계; 및
(e) 상기 세척된 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체의 형광량을 측정하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1형, H5N3형, H7N7형, H9N2형 및 H5N1형 인플루엔자 바이러스 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체는 H1N1형, H5N3형, H7N7형 또는 H9N2형의 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오단백질(NP) 또는 H5N1형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)을 특이적으로 인식하는 것이 바람직하지만, 특별히 이에 제한하는 것은 아니며, 타겟 바이러스 특이적인 항체는 어느 것이든 무방하게 적용할 수 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1: 타겟 모이어티가 결합된 자성입자의 제작
표적물질을 검출하기 위하여 상기 자성 입자 표면상에 타겟 모이어티로서 항체를 결합시켜야 한다. 표적물질은 인플루엔자 바이러스로 하였으며, 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 상기 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 표면에 결합시키기 위해 다음과 같은 방법으로 개질하였다. 특히 인플루엔자 바이러스에 대한 항체는 인플루엔자 바이러스 H5 아형의 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체를 사용하였다.
300㎍의 자성 입자(Dynabeads® Protein A, invitrogen)에 0.5㎖의 완충용액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH 8)을 가하여 1회 세척후에, 자석을 이용하여 상층액을 제거하였다.
상기 세척된 300㎍의 자성 입자(Dynabeads® Protein A, invitrogen)를 90㎕의 완충용액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH8)에 분산시켰다.
상기 자성 입자가 분산된 완충용액에 25㎍의 인플루엔자 바이러스 H5 아형 특이적 항체를 첨가하여 실온에서 20분 동안 반응시킨 후에, 자석을 부착한 상태로 세척하고, 상층액을 제거한 후에, 비특이반응을 제거하기 위해 항체가 결합된 자성 입자를 1% BSA가 포함된 100㎕의 완충용액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH8)에 분산시켜 냉장보관하였다.
제조예 2: 타겟 모이어티가 결합된 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체의 제작
(1) 친수성 화합물이 코팅된 양자점 및 라텍스 비드가 결합된 복합체의 제조
친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체를 하기에 기재된 방법에 의해 준비하였다(도 1).
구체적으로 약 100nm 크기의 0.044μM 아미노 라텍스(amine latex, life technology사) 50㎕에 완충용액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH8)을 가하여 1회 세척하고, 친수성 화합물로 코팅된 0.1μM 양자점을 1:90의 몰비로 혼합하고, 0.01M 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 200㎕ 및 0.01M N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS) 300㎕을 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다(도 1). 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 원심분리(17000rpm, 5분)를 통해 결합하지 않은 양자점을 제거하고, 침전물을 상기 세척완충용액을 가하여 1회 세척한 후, 다시 원심분리하여 상기 세척 완충용액 200㎕에 분산하여 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체를 제조하였다.
(2) 타겟 모이어티가 결합된 상기 양자점 -라텍스 비드 복합체 제조
표적물질을 검출하기 위하여 상기 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 표면상에 타겟 모이어티로서 항체를 결합시켜야 한다. 표적물질은 인플루엔자 바이러스로 하였으며, 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 상기 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 표면에 결합시키기 위해 다음과 같은 방법으로 개질하였다.
상기 양자점-라텍스 비드 복합체에서 양자점이 결합되지 않은 라텍스 비드 표면의 아미노기에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 결합하여 라텍스 비드 표면을 카르복실기로 치환하였다.
상기 양자점-라텍스 비드 복합체에서 양자점이 결합되지 않은 라텍스 비드의 카르복실기와 인플루엔자 바이러스 H5 아형의 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체(1㎎/㎖)를 1:455의 몰비로 혼합하고, 0.01M 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 100㎕ 및 0.01M N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS) 150㎕을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 비특이반응을 제거하기 위해, 0.1%의 BSA, 1%의 자당(sucrose), 1%의 젤라틴(gelatin) 및 0.01%의 카제인(casein)을 포함하는 블로킹용액에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 원심분리(15,000rpm, 5분)를 통해 결합하지 않은 인플루엔자 바이러스 항체를 제거하고, 침전물을 상기 세척완충용액(pH7.4)을 가하여 1회 세척한 후, 다시 원심분리하여 상기 세척완충용액(pH7.4) 500㎕에 분산하여 양자점-라텍스 비드-인플루엔자 바이러스 항체 복합체를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제조하였다.
실시예 1: 실험용 튜브에서 수행하는 시료 중의 표적물질 검출
H5N3형 인플루엔자 바이러스를 시료로서 준비하였다. 상기 H5N3형 인플루엔자 바이러스의 함량은 5.0×103 HAU/㎖가 되도록 설정하였고, 대조군은 바이러스를 처리하지 않은 것을 사용하였다.
실험용 튜브에 상기 제조예 1에서 제작한 인플루엔자 바이러스 H5 아형에 대한 항체가 결합된 자성 입자를 넣은 후에, 자석을 이용하여 상층액을 제거하였다.
상층액을 제거한 상기 자성 입자에 300㎕의 H5N3형 인플루엔자 바이러스 시료를 가하고, 이어 10㎕의 상기 제조예 2에서 제작한 인플루엔자 바이러스 H5 아형에 대한 항체 결합된 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 가한 다음, 실온에서 10분 동안 반응시켜, 자성입자-H5N3형 인플루엔자 바이러스-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체가 형성될 수 있도록 유도하였다.
상기 반응 후에, 실험용 튜브에 자석을 부착하고, 상층액을 제거한 다음, 완충용액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH8)으로 세척하고, 100㎕의 완충용액을 넣은 후에 UV를 이용하여 형광세기를 측정하였다(도 2).
인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 양자점의 발광파장은 640nm으로 하였다.
시료 내에 H5N3형 인플루엔자 바이러스 존재하는 실험용 튜브에서만 형광이 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 2: 96 웰플레이트에서 수행하는 시료 중의 표적물질 검출
H5N3형 인플루엔자 바이러스를 시료로서 준비하였다. 상기 H5N3형 인플루엔자 바이러스의 함량은 5.0×103 HAU/㎖가 되도록 설정하였고, 대조군은 바이러스를 처리하지 않은 것을 사용하였다.
96 웰플레이트에 상기 제조예 1에서 제작한 인플루엔자 바이러스 H5형 아형에 대한 항체가 결합된 자성 입자를 넣은 후에, 자석을 이용하여 상층액을 제거하였다.
상층액을 제거한 상기 자성 입자에 200㎕의 H5N3형 인플루엔자 바이러스 시료를 가하고, 이어 10㎕의 상기 제조예 2에서 제작한 인플루엔자 바이러스 H5형 아형에 대한 항체 결합된 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체를 가한 다음, 실온에서 10분 동안 반응시켜, 자성입자-H5N3형 인플루엔자 바이러스-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체가 형성될 수 있도록 유도하였다.
상기 반응 후에, 실험용 튜브에 자석을 부착하고, 상층액을 제거한 다음, 완충용액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH8)으로 세척하고, 100㎕의 완충용액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH8)을 넣은 후에 UV를 이용하여 형광세기를 측정하였다(도 4).
인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 양자점의 발광파장은 640nm으로 하였다.
시료 내에 H5N3형 인플루엔자 바이러스 존재하는 96 웰플레이트에서만 형광이 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도 5).

Claims (7)

  1. (a) 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체 각각에, 검출하고자 하는 표적물질을 특이적으로 인식하는 타겟 모이어티(moiety)를 결합시키는 단계;
    (b) 상기 타겟 모이어티가 각각 결합된 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체;와 표적 물질이 포함된 것으로 예상되는 시료;를 혼합하여, 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 형성시키는 단계;
    (c) 상기 단계 (b) 이후에, 자성을 이용하여, 상기 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 시료로부터 분리시키는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)에서 분리한, 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 물 또는 완충용액으로 세척하는 단계; 및
    (e) 상기 세척된 자성입자-[표적물질]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체의 형광량을 측정하는 단계;를 포함하는 표적물질을 검출하는 방법으로서,
    상기 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체는 시스테아민(cysteamine), 머캅토숙신산(mercaptosuccinic acid), 머캅토프로피온산(mercaptopropionic acid), 글루타티온(glutathion), 시스테인(cysteine), 티올-함유 실란 중에서 선택된 어느 하나의 친수성 화합물이 코팅된 양자점 나노입자가 라텍스 비드에 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 타겟 모이어티(moiety)는 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 앱타머 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표적물질을 검출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적물질은 바이러스, 원핵세포, 진핵세포, DNA, RNA, 펩타이드, 단백질, 항원 및 항체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표적물질을 검출하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체의 양자점 나노입자는 카드뮴셀레나이드(CdSe), 카드뮴설파이드(CdS), 카드뮴텔로리움(CdTe), 징크텔로리움(ZnTe), 징크셀레나이드(ZnSe), 징크설파이드(ZnS), 징크옥사이드(ZnO), 인듐 인화물(InP), 인듐 비화물(InAs), 머큐리텔로리움(HgTe) 및 머큐리셀레나이드(HgSe) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 표적물질을 검출하는 방법.
  6. (a) 자성입자; 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체; 각각에, 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체를 결합시키는 단계;
    (b) 상기 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 인식하는 항체가 각각 결합된 자성입자 및 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체와 인플루엔자 바이러스가 포함된 것으로 예상되는 시료를 혼합하여, 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 형성시키는 단계;
    (c) 상기 단계 (b) 이후에, 자성을 이용하여, 상기 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 시료로부터 분리시키는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)에서 분리한, 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체를 물 또는 완충용액으로 세척하는 단계; 및
    (e) 상기 세척된 자성입자-[인플루엔자 바이러스]-양자점 나노입자-라텍스 비드 결합체의 형광량을 측정하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법으로서,
    상기 양자점 나노입자-라텍스 비드 복합체는 시스테아민(cysteamine), 머캅토숙신산(mercaptosuccinic acid), 머캅토프로피온산(mercaptopropionic acid), 글루타티온(glutathion), 시스테인(cysteine), 티올-함유 실란 중에서 선택된 어느 하나의 친수성 화합물이 코팅된 양자점 나노입자가 라텍스 비드에 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1형, H5N3형, H7N7형, H9N2형 및 H5N1형 인플루엔자 바이러스 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법.
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