KR102605065B1 - 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5n1에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트 - Google Patents

고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5n1에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 기탁번호가 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E2C1 또는 기탁번호가 KCTC 14653BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 5B1 및 이를 이용한 H5N1 신속 진단 키트에 관한 것이다.

Description

고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트{Monoclonal antibody specific to highly pathogenic avian influenza virus H5N1 and rapid diagnostic kit using the same}
본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트에 관한 것이다.
조류 인플루엔자(Avian Influenza)는 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 의하여 발생하는 조류의 급성 전염병으로 닭, 칠면조, 오리 등 가금류에서 피해가 심하게 나타난다. 바이러스의 병원성 정도에 따라 저병원성과 고병원성 조류 인플루엔자로 크게 구분된다. 이 중에서 고병원성 조류 인플루엔자(highly pathogenic avian influenza, HPAI)는 세계동물보건기구(OIE)에서도 위험도가 높아 관리대상 질병으로 지정하고 있으며, 발생시 OIE에 의무적으로 보고 하도록 되어있다. HPAI에 감염된 닭이나 칠면조는 급성의 호흡기 증상을 보이면서 100%에 가까운 폐사를 나타내는 것이 특징이다. 조류 인플루엔자 바이러스는 혈청아형(subtype)이 매우 많고 변이가 쉽게 일어나며, 자연생태계의 야생조류에 다양한 종류의 바이러스가 분포되어 있으면서도 이들에게는 감염되어도 뚜렷한 증상이 없이 경과될 수 있기 때문에 국가방역 측면에서 볼 때 가장 주의하여야 할 가축전염병중 하나이다.
고병원성 조류 인플루엔자 H5 아형은 헤마글루티닌(hemmaglutinin, HA)의 변이를 꾸준히 일으키고 있으며, 가금류, 야생 조류의 감염 및 조류로부터 사람으로의 치명적인 감염이 되고 있으므로, 조기에 발견하여 적절히 대응하는 것이 인플루엔자의 확산을 막는 데 있어서 매우 중요하다. 종래 연구에서 개발된 H5 아형 특이적 단클론항체의 경우 바이러스를 이용한 검출한계 검증에서는 우수한 감도를 나타내었으나, 분변 내에 존재하는 바이러스에 대한 검출능이 낮은 것으로 확인되어 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있는 단클론항체의 개발이 요구되고 있다.
한편, 한국공개특허 제2012-0010222호에는 '고병원성 조류 인플루엔자 H5N1 아형 바이러스의 검출 키트'가 개시되어 있으나 상기 검출 키트는 H5N1이 아닌 다른 종류의 HPAI 바이러스에 대한 교차 반응성 유무를 제시하고 있지 않으며, 한국공개특허 제2018-0013051호에는 'H5 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트'가 개시되어 있으나, 저병원성 조류 인플루엔자인 H5N3 및 다른 종류의 HPAI 바이러스(H5N6 및 H5N8)에는 결합하지 않는 단클론항체를 이용한 본 발명의 '고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 역유전자법(reverse genetics method)으로 최근 5년사이에 동남아시아에서 동물과 사람에게 동시 유행한 고병원성 조류 인플루엔자 H5N1의 HA(2.3.2.1c) delete polybasic cleavage site(서열번호 2)를 이용하여 만든 인플루엔자 바이러스 H5N1-PR8을 불활화하고 상기 불활화한 바이러스를 면역원으로 하여 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 H5N1에만 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 2종을 제조하였다. 또한, 상기 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단클론항체를 활용하여 제조한 면역진단키트를 테스트한 결과, 바이러스 시료에서는 1.68x103 PFU/㎖까지, 닭 분변 시료에서는 26.3x103 PFU/㎖까지 H5N1를 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 14653BP인 하이브리도마 세포주 또는 기탁번호가 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 단클론항체는 고병원성 조류 인플루엔자(highly pathogenic avian influenza, HPAI)인 H5N1 바이러스에만 특이적으로 결합하고 다른 HPAI인 H5N6 또는 H5N8 바이러스에는 특이성이 없으므로, 신속진단키트에 적용시 H5N1 바이러스를 다른 고병원성 조류 인플루엔자 H5 아형 바이러스와 쉽게 구별할 수 있을 것이다.
도 1은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적으로 결합하는 단클론항체 생산 과정의 모식도이다.
도 2는 다양한 조류 인플루엔자 아형 바이러스에 대한 E2C1 및 5B1 단클론항체의 반응성을 간접(indirect) ELISA로 확인한 결과이다. 모든 조류 인플루엔자 바이러스는 8.4x105 PFU/㎖ (100㎕/well)의 농도로 사용하였으며, POS는 양성 대조군으로 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 Anti-influenza A NP 단클론항체를 나타낸다.
도 3은 열로 불활화한 다양한 조류 인플루엔자 아형 바이러스에 대한 E2C1 및 5B1 단클론항체의 반응성을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. 모든 조류 인플루엔자 바이러스는 6.6x105 PFU/lane의 농도로 사용하였으며, P.C.는 양성 대조군으로 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 Anti-influenza A NP 단클론항체를 의미한다.
도 4A는 단클론항체 E2C1 및 5B1를 순수 분리정제하여 SDS-PAGE를 통해 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)를 확인한 결과이고, 도 4B는 IsoStrip™ Mouse Monoclonal Antibody Isotyping 키트로 단클론항체 E2C1 및 5B1의 아이소타입(isotype)을 확인한 결과이다.
도 5는 단클론항체 E2C1 및 5B1를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 모식도이다. 항체 E2C1은 형광체와 축합체로 활용되고, 5B1 항체는 검사선(Test Line: TL)에 고정되어 바이러스를 인식하게 된다. 니트로셀룰로오스 멤브레인상 대조군(CL)에는 항마우스 혈청이 코팅되어, 검사선에서 다 반응하지 못한 축합체는 대조선에서 검출되어 형광빛을 나타낸다. 20분만에 측정하기 위해 샘플을 용해 완충액과 혼합하고 스트립을 20분 동안 담가 결과를 확인한다. 시료에 바이러스가 존재할 경우 바이러스는 E2C1 항체에 반응하고 검사선과 대조선에서 각각 형광 신호를 갖게 된다.
도 6은 단클론항체 E2C1 및 5B1를 도입한 신속 형광 면역진단시스템을 이용하여 다양한 조류 인플루엔자 아형 바이러스를 검사한 결과로, 원시 결과(raw data) 및 형광값을 정량화한 그래프이다. 'Ratio of TL/CL'은 검사선(TL) 및 대조선(CL)에서 각각 측정한 유로피움 형광체 파장의 RFU(relative fluorescence units)의 비를 의미한다.
도 7A 및 7B는 H5N1 바이러스 검체를 대상으로 단클론항체 E2C1 및 5B1를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 검출 한계를 분석한 결과이고, 도 7C는 상업적으로 판매되고 있는 키트를 이용한 검출 한계 분석 결과이다.
도 8은 H5N1 바이러스를 혼합한 분변 검체를 대상으로 단클론항체 E2C1 및 5B1를 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 검출 한계를 분석한 결과이다.
도 9는 H5N1 바이러스를 혼합한 분변 검체를 대상으로 시판중인 키트를 이용한 검출 한계 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 14653BP인 하이브리도마 세포주 또는 기탁번호가 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
본 발명에서 용어 '단클론항체(monoclonal antibody)'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단클론항체는 '단세포군 항체' 또는 '단일클론항체'라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체(polyclonal antibody)와는 다르게, 단클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마(hybridoma) 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascite fluid)으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 단클론항체는 한국생명공학연구원에 2021년 08월 06일자로 기탁된, 기탁번호가 KCTC 14653BP인 하이브리도마 세포주(5B1-IgG2a kappa light chain)에 의하여 생산되는 단클론항체 5B1 또는 한국생명공학연구원에 2021년 08월 12일자로 기탁된, 기탁번호가 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주(E2C1-IgG2a kappa light chain)에 의하여 생산되는 단클론항체 E2C1인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상기 단클론항체 5B1 및 E2C1은 선형 에피토프를 인식하고, 다른 아형(H1N1, H7N7), 저병원성 H5 아형(H5N3), 및 고병원성 H5 아형(H5N6, H5N8) 바이러스에는 결합하지 않는 특성을 가지고 있다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 하이브리도마 세포주는 기탁번호가 KCTC 14653BP 또는 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 하이브리도마 세포주는 포르말린으로 불활화한 H5N1-PR8 (HA-A/Vietnam/14011801/2014) 바이러스를 사용하여 면역된 마우스 비장세포로부터 세포융합기술에 의해 획득한 하이브리도마 세포이다. 본 발명에서 면역원으로 사용된 상기 바이러스는 최근 5년사이에 동남아시아에서 동물과 사람에게 동시 유행한 고병원성 조류 인플루엔자 H5N1의 HA(2.3.2.1c) delete polybasic cleavage site를 이용하여 역유전자법(reverse genetics method)으로 만든 재조합 인플루엔자 바이러스이다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 기탁번호가 KCTC 14653BP인 하이브리도마 세포주 또는 기탁번호가 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 포함하며, 상기 항체를 이용하여 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 항원에 대해 형성된 항원-항체 복합체를 검출함으로써 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1을 면역학적으로 검출할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 H5N1 바이러스 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단클론항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 양자점, 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 또는 125I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단클론항체 또는 이의 절편은 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 단클론항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 포함되는 단클론항체는 기탁번호가 KCTC 14653BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 5B1 또는/및 기탁번호가 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E2C1일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출용 키트는 본 발명의 단클론항체와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하여 목적하는 항원을 면역검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 스트립 형태의 FICT(fluorescent immunochromatographic test) 키트가 될 수 있다.
본 발명에 따른 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출용 키트는, 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E2C1이 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC 14653BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 5B1이 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트에 사용될 수 있는 형광체는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에서, 본 발명의 단클론항체는 유로피움(europium)으로 표지될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 '시료'는 검출 대상체로 샘플 또는 검체와 동일한 의미로 혼용되어 사용되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 재조합 바이러스 H5N1-PR8의 준비
인플루엔자 A(H5N1) clades 2.3.2.1c (A/Vietnam/14011801/2014)의 헤마글루티닌(HA; 서열번호 2)의 코돈 최적화된 서열(서열번호 1)을 Integrated DNA Technologies, Inc.에 의뢰하여 합성하였다. 상기 서열을 포함하는 플라스미드를 정방향 프라이머[Bm-HA-1: 5'-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3' (서열번호 3)] 및 역방향 프라이머[Bm-NS-890R: 5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3' (서열번호 4)]를 이용한 HA (H5N1) 표적 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 증폭된 산물은 단백질 발현을 위한 pHW2000 벡터 내로 클로닝하기 위해 Bsm-BI 제한효소로 절단하였다. 그 외 백본 바이러스인 (A)H1N1/PR8로부터 유래된 바이러스의 7개 내부 유전자 단편 플라스미드는 홍콩 대학의 Dr. Chris MOK으로부터 제공받았다. 재조합 H5N1-PR8 인플루엔자 바이러스를 얻기 위해, 8개의 유전자 단편 플라스미드 모두를 LT1 transfection reagent (Mirus Bio Corp, cat. no: MIR 2304)를 이용하여 293T 및 MDCK 세포의 혼합물에 형질전환시켰다. 세포변성효과(cytopathic effect)를 확인하며 세포 배양액을 회수하여 헤마글루티닌 검정(Hemagglutinin assay)을 통해 바이러스 역가를 측정하였다.
제조예 2. 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적인 단클론항체의 제조
상기 제조예 1에서 제조한 재조합 바이러스 H5N1-PR8 (HA-A/Vietnam/14011801/2014) 바이러스(원광대 인수공통감염병연구센터 보유) 8.4x105 PFU/㎖을 최종 농도 0.02%의 포르말린(in PBS)과 혼합하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, PBS를 이용하여 투석하여 포르말린을 제거하였다. 상기 포르말린으로 불활화한 바이러스를 면역원으로 하여 마우스의 복강에 2주 간격으로 총 4회 면역시켰다(도 1A). 면역된 마우스의 비장세포(splenocytes)를 얻은 다음, 골수종 세포(myeloma cells)와 세포융합기술(cell fusion technique)을 시행하고, HAT (hypoxanthine/aminopterin/thymidine) 배지에서 생존한 융합세포(하이브리도마) 클론의 세포 배양 상징액(supernatant)을 이용하여 ELISA 실험을 통해 H5N1 바이러스에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 선별하였다(도 1B). 단클론항체의 대량생산은 최종적으로 선별된 하이브리도마 클론 각각을 마우스 복강 내로 주입하여 복수가 생성되면 채취하였고, 단백질 A 칼럼(protein A column)을 이용하여 단클론항체를 정제하였다.
제조예 3. 단일클론 항체 E2C1 및 5B1을 이용한 신속 진단 키트 제작
3-1. 형광체-항체 복합체 제조
단세포군 항체 E2C1을 PS-COOH 유로피움 나노파티클(이하, Eu NP) 비드(0.1 μm)에 결합시켜 Eu NP-항체 복합체를 만들었다. 간단하게, 20㎕의 Eu NP를 754㎕의 0.05M MES 버퍼(pH 6.1, Sigma-Aldrich)에 첨가하고, Eu NP 표면의 -COOH기를 활성화하기 위해 26㎕의 5mM EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride)와 200㎕의 50mM sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt) 존재하에, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 후, 과량의 EDC와 sulfo-NHS는 27,237xg에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다. 활성화된 Eu NP는 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 8.0) 940㎕ 및 60㎕의 1 ㎎/㎖ 농도의 E2C1 항체와 혼합한 후 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 27,237xg에서 5분 동안 원심분리하여 침전물을 수거하고, 세척한 후, 0.1% 소혈청알부민을 포함하고 있는 400㎕의 2mM Borax 버퍼(pH 8.0)에 현탁시켜, 4℃ 암실에서 보관하였다.
3-2. 신속 형광 면역진단키트용 스트립 제조
상기 제조한 유로피움-항체(E2C1) 복합체를 포함하는 H5N1 검출용 키트를 제작하였다. 이때 5B1 단클론항체는 검사선(test line)에 점적하는(coating) 항체이고, E2C1 단클론항체는 유로피움과 축합된 항체 복합체로서 시료 내 H5N1 바이러스 검출(detection)용으로 사용되었다.
구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를 결합시켜서 검체 시료를 투입할 수 있는 시료 주입부를 구비시켰다. 상기 검체 패드와 일정 간격을 두고, 상기 유로피움-항체(E2C1) 복합체 6 ㎕를 가한 다음 일정 간격을 두고, 검사선(T)을 설정한 다음, 상기 검사선에 인플루엔자 바이러스에 대한 항체(5B1)를 3 ㎎/㎖을 가하여 고정시켰다. 상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선(control line; C)을 설정한 다음, 상기 대조선에 인플루엔자 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차항체(마우스 IgG에 대한 항체) 0.5 ㎎/㎖을 가하여 고정시켰다. 최종적으로, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광 검출 키트를 제작하였다(도 5). 스트립에 시료(검체)를 적용한 후 20분 안에 소형 형광측정장비로 형광을 측정할 수 있고, 유로피움 형광체의 파장은 하기와 같다: Excitation: 355 nm, Emission: 612 nm.
실시예 1. 단일클론항체 E2C1 및 5B1의 특성
상기 제조예 2를 통해 다수의 하이브리도마 클론을 확보하였고, 이들의 배양 상징액을 이용하여 H5N1 바이러스에 대한 반응성을 ELISA로 검증하여 H5N1 바이러스에 대한 반응성이 우수한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 E2C1 및 5B1 클론을 선택하였고, 각 클론 유래 단클론항체(이하, 각각 E2C1 및 5B1)의 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 결합 특성을 간접(indirect) ELISA 및 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
본 발명에 사용된 바이러스
H1N1 A/H1N1/2009/CA
RG-H5N1 (HA-2.3.2.1c)/PR8 A/Vietnam/14011801/2014
H5N3 A/spot-billed duck/Korea/KNU SYG06/2006
RG-H5N6(HA-2.3.4.4c)/PR8 A/Duck/Foshan/41/2019
RG-H5N8 (HA-2.3.4.4b)/PR8　 Korea/W612/2017
H7N7 A/mallard/Korea/KNU GPH12/2011
간접 ELISA는 열로 불활화한 H1N1, H5N1, H5N3, H5N6 및 H5N8 바이러스를 8.4x105 PFU/㎖ (100㎕/well)의 농도로 웰에 넣고 37℃에서 2시간 동안 코팅한 뒤 5% BSA (bovine serum albumin)로 블로킹한 뒤 1:200의 희석배율로 희석한 각 하이브리도마 클론 배양 상징액을 처리하여 반응성을 확인하였다. 양성 대조군으로는 기탁번호가 KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 Anti-influenza A NP 단클론항체를 사용하였다. 그 결과, E2C1 및 5B1 단클론항체가 H5N1에 특이적으로 결합하는 특성이 있음을 알 수 있었다(도 2).
웨스턴 블랏은 열로 불활화한 H1N1, H5N1, H5N3, H5N6 및 H5N8 바이러스를 6.6x105 PFU/lane으로 겔에 로딩시킨 이후 1차 항체로 E2C1 및 5B1을 각각 1 ㎍/㎖로 반응시킨 결과, 두 항체 모두 H5N1 바이러스에만 특이적으로 반응하고, 다른 아형의 조류 인플루엔자 바이러스에는 반응하지 않음을 확인할 수 있었다(도 3). 상기 결과를 통해 E2C1 및 5B1 모두 선형의(linear) 에피토프를 인식함을 알 수 있었다.
또한, 상기 E2C1 및 5B1 단클론항체를 순수 분리정제하고, IsoStrip™ Mouse Monoclonal Antibody Isotyping 키트로 면역글로불린의 이소타입을 분석한 결과, 두 항체 모두 IgG2a 중쇄 및 Kappa 경쇄로 구성되어 있음을 알 수 있었다(도 4).
실시예 2. E2C1 및 5B1 단클론항체가 이용된 진단 키트를 활용한 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출능
본 발명자는 제조예 3에서 제조한 신속 형광 면역진단키트(도 5)를 이용하여 H5N1 바이러스를 비롯한 다양한 조류 인플루엔자 바이러스를 테스트하였으나, 본 발명의 단클론항체 및 이를 이용한 진단키트는 H5N1에만 반응성이 확인되어, 특이성이 매우 높음을 알 수 있었다(도 6).
또한, 본 발명자는 본 발명의 신속 형광 면역진단키트를 이용하여 H5N1 바이러스의 검출한계를 분석하였다. 현재, 상용화된 H5 특이 신속 진단키트는 존재하지 않아, 인플루엔자 A 신속 진단키트를 비교 대조군으로 사용하였다.
먼저, H5N1 바이러스를 26.3x103, 13.16x103, 6.58x103, 3.29x103, 1.68x103, 0.84x103 PFU/㎖로 단계희석해서 신속 형광 면역진단키트용 스트립에 테스트한 결과, 본 발명의 단클론항체를 이용하여 제조한 스트립의 경우 1.68x103 PFU/㎖의 검출한계를 확인할 수 있었다(도 7A 및 7B). 반면, 시판중인 인플루엔자 A 신속 진단키트는 26.3x103 PFU/㎖의 검출한계를 나타냄을 알 수 있었다(도 7C).
또한, 210x103, 105x103, 52.5x103, 26.3x103, 13.16x103 PFU/㎖의 H5N1 바이러스를 닭의 분변과 혼합한 후, 상기 바이러스와 분변의 혼합 시료를 신속 형광 면역진단키트용 스트립에 테스트하였다. 간단하게 닭 분변과 바이러스 용액을 1:1의 비율(w:v)로 혼합한 후 15초 동안 볼텍싱하고, 원심분리(10,000 rpm, 1분)를 통해 상층액을 취하여 새로운 튜브에 옮긴 후 스트립을 담궈 반응시켰다. 그 결과, 본 발명의 단클론항체를 이용하여 제조한 스트립의 경우 26.3x103 PFU/㎖의 검출한계를 나타내었다(도 8). 동일한 시료를 시판중인 키트에 적용한 경우 105x103 PFU/㎖의 검출한계를 나타내어, 본 발명에서 제조한 스트립보다 검출 민감도가 낮은 것을 알 수 있었다(도 9).
이상의 결과를 통해, 본 발명에서 개발된 신규한 단클론항체(E2C1 및 5B1)는 고병원성 조류 인플루엔자인 H5N1을 다른 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스로부터 구별할 수 있으며, 분변 등의 시료에서도 정확하게 H5N1 바이러스를 검출할 수 있으므로, 현장 검사에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC14653BP 20210806 한국생명공학연구원 KCTC14657BP 20210812
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Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Lys Gly Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Glu Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Ile Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Ile Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Thr Ile His 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Thr Gly Asp Ser Thr Ile Met Arg Ser Glu Val Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Arg Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 370 375 380 Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile 385 390 395 400 Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn 405 410 415 Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 420 425 430 Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu 435 440 445 Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr 450 455 460 Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Lys Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser 485 490 495 Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg 500 505 510 Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Ile 515 520 525 Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu 530 535 540 Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser 545 550 555 560 Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tattcgtctc agggagcaaa agcagggg 28 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gtttt 35

Claims (6)

  1. 기탁번호가 KCTC 14653BP인 하이브리도마 세포주 또는 기탁번호가 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1에 특이적으로 결합하는 단클론항체.
  2. 기탁번호가 KCTC 14653BP 또는 기탁번호가 KCTC 14657BP인, 제1항의 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
  3. 제1항의 단클론항체를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출용 조성물.
  4. 제1항의 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출방법.
  5. 제1항의 단클론항체를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N1 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC 14657BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E2C1이 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC 14653BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 5B1이 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 키트.
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