CN113215106B - 杂交瘤细胞、抗SARS-CoV-2的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞、抗SARS‑CoV‑2的单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞的保藏编号为GDMCC NO.61643，上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对SARS‑CoV‑2的中和效价高，应用于检测SARS‑CoV‑2中和抗体的试剂盒时，可以使该检测试剂盒的灵敏度高，特异性好，且检测周期短，安全性高。

Description

杂交瘤细胞、抗SARS-CoV-2的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种杂交瘤细胞、抗SARS-CoV-2的单克隆抗体及其应用。

背景技术

新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)为单股正链RNA病毒，其表面覆盖有包膜和刺状蛋白，直径为75nm～160nm。SARS-CoV-2可以通过呼吸道飞沫传播和接触传播，具有较强的人群传播能力(基本传染数R0值为2.3左右)。在2019年11月份首次发现后，SARS-CoV-2已经引起全球大流行。至2021年5月10日，全球已有1亿5千多万人感染SARS-CoV-2病毒，病毒的感染和传播是当前全球公共卫生面临的最主要威胁。

目前，针对SARS-CoV-2病毒没有特效的药物，建立机体的免疫屏障是个体预防、治疗病毒感染及从群体角度控制疫情扩散的主要途径，及时准确的监测体内针对SARS-CoV-2特异的中和抗体水平十分重要。一方面，个体病毒感染后，中和抗体而非总抗体产生的水平和时间是评估可能导致疾病严重程度的重要指标；另一方面，中和抗体水平也是反映疫苗免疫保护效果的重要指标，是疫苗评估和质控的重要依据。因此，开发灵敏、准确的SARS-CoV-2中和抗体检测方法有助于对感染病例的预后评估。更为重要的，当前我国已有3亿多人接种完SARS-CoV-2疫苗，建立高通量的中和抗体检测方法对全面、科学地评估我国人群的中和抗体水平动态变化具有重要意义。

目前，检测SARS-CoV-2中和抗体的方法主要有包被病毒主要结构蛋白S(Spike)蛋白的间接酶联免疫吸附试验、微量中和试验和假病毒中和抗体检测等。然而，间接酶联免疫吸附试验的灵敏度和特异性较低；微量中和实验是测定SARS-CoV-2中和抗体的金标准，但由于方法是建立在体外细胞感染活病毒的基础上，需要在BSL-3级实验室内完成，并且检测周期偏长，不适合临床的评估和大人群范围的抗体水平监测。假病毒中和抗体检测虽然使用安全性较高的假病毒替代活病毒，不需要在BSL-3级实验室完成，但检测周期也较长(2～4天)不能满足临床检测和群体监测的需求。

发明内容

基于此，本发明提供一种杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞产生的单克隆抗体对早期毒株及近期出现的抗原变异的毒株都具有中和作用，且效价高；应用在基于竞争法ELISA检测SARS-CoV-2中和抗体时，检测灵敏度高、特异性好，同时检测周期短、安全性高，不需要在BSL-3级实验室完成。

此外，本发明还提供一种该杂交瘤细胞产生的抗SARS-CoV-2的单克隆抗体和包括该单克隆抗体的试剂盒。

一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏编号为GDMCC NO.61643。

一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌。

一种试剂盒，包括保藏编号为GDMCC NO.61643的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。

在其中一个实施例中，所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2中和抗体，所述试剂盒包括固相载体、抗原和标记有标记物的竞争物，所述抗原能与SARS-CoV-2中和抗体特异性结合，所述竞争物为保藏编号为GDMCC NO.61643的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。

在其中一个实施例中，所述抗原选自灭活的SARS-CoV-2毒株2020XN4276。

在其中一个实施例中，所述固相载体选自多孔板、微量反应板凹孔、磁珠、纤维素膜和尼龙膜中的一种。

在其中一个实施例中，所述标记物选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金及产生可检测信号的酶中的任一种或多种。

在其中一个实施例中，所述标记物为辣根过氧化物酶。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括SARS-COV-2中和抗体阳性标准品、阴性标准品、稀释用缓冲液、洗脱液及发光底物中的至少一种。

附图说明

图1为竞争抑制法测定血清中SARS-CoV-2中和抗体的示意图；

图2为实施例1的灭活病毒2020XN4276的电镜图；

图3为SARS-CoV-2自2019年暴发以来进化出多个分支，试剂盒所用包被抗原对应的病毒在系统进化树的位置以及近期出现的抗原变异株所在进化分支；

图4为实施例1中，单克隆抗体库针对SARS-CoV-2早期流行株及近期出现的南非变异株的中和抗体滴度；

图5为实施例3中以mAb7D5单克隆抗体为竞争物，以2020XN4276为包被抗原，通过竞争ELISA法测定血清标准品中和效价的标准曲线；

图6为实施例3中阳性血清中和抗体滴度分布图；

图7～图9为实施例3中以mAb7D5单克隆抗体为竞争物，以2020XN4276为包被抗原通过竞争ELISA法测定血清阻断率与微量中和试验检测结果的相关性分析、交互散点图和ROC曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明一实施方式提供了一种杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞为小鼠杂交瘤细胞7D5，该杂交瘤细胞于2021年5月11日保藏于在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)并于2021年5月14日由该保藏中心鉴定为存活，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，该杂交瘤细胞的保藏号为GDMCC NO.61643，分类命名：小鼠杂交瘤细胞。保藏号为GDMCC NO.61643的杂交瘤细胞能分泌与SARS-COV-2特异性结合的单克隆抗体，该单克隆抗体记为mAb7D5。mAb7D5对SARS-COV-2不同基因型病毒株均有较高的中和效果，可以应用于制备检测SARS-COV-2或检测SARS-COV-2中和抗体的产品中。

本发明一实施方式提供了一种抗SARS-COV-2的单克隆抗体，该单克隆抗体由上述杂交瘤细胞分泌，为SARS-COV-2的中和抗体。上述抗SARS-COV-2的单克隆抗体对SARS-COV-2的特异性好，中和效价高，可以应用于制备检测SARS-COV-2或检测SARS-COV-2中和抗体的产品中。

本发明一实施方式提供了一种保藏编号为GDMCC NO.61643的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体(mAb7D5)在检测SARS-COV-2中和抗体的产品中的应用。例如检测SARS-COV-2中和抗体的检测试剂或检测试剂盒。

本发明一实施方式提供了一种试剂盒，该试剂盒包括保藏编号为GDMCC NO.61643的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体(mAb7D5)。

可选地，上述试剂盒主要用于但不限于检测人群接种当前SARS-CoV-2疫苗后获得的特异中和抗体水平。具体地，该试剂盒利用竞争ELISA法检测SARS-CoV-2中和抗体。更具体地，上述检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒包括固相载体、抗原和标记有标记物的竞争物，其中，标记有标记物的竞争物为标记有标记物的保藏编号为GDMCC NO.61643的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体(mAb7D5)，抗原为灭活的SARS-COV-2毒株。通过竞争抑制法检测血清中中和抗体水平的示意图如图1所示，携带有标记物的抗SARS-CoV-2的单克隆抗体与包被的灭活的SARS-CoV-2结合，产生信号；血清抗SARS-CoV-2中和抗体阻断了抗SARS-CoV-2的单克隆抗体与预先包被在固相载体(例如ELISA平板)上的灭活的SARS-CoV-2病毒结合，信号减弱。

固相载体用于固定抗原。可选地，固相载体选多孔板、微量反应板凹孔、磁珠、纤维素膜和尼龙膜中的一种。当然，在其他实施例中，固相载体不限于上述，还可以是其他能够固定抗原的物质。

抗原能与SARS-CoV-2中和抗体特异性结合。在使用时，抗原固定在固相载体上。在本实施方式中，抗原为灭活的SARS-CoV-2。灭活的SARS-CoV-2在电镜下展现完整的病毒形态，包括冠状突起(具体见图2)，以此作为抗原可以保证包被抗原反应对应病毒的抗原性，提高上述试剂盒的特异性，减少假阳性。

在一个具体示例中，抗原为灭活的SARS-CoV-2毒株2020XN4276(简称“2020XN4276”)。本示例所用的2020XN4276位于进化分支19B上，与当前全球疫苗使用的SARS-CoV-2毒株位于同一进化分支上(详见图3，图3中不同进化分支上的SARS-CoV-2以不同颜色标识；2020XN4276代表本申请使用的毒株，其进化分支为19B；20SF530代表南非变异株，其进化分支为501Y.V2，是当前全球主要流行的免疫逃逸病毒毒株)经细胞微量中和实验证实，本发明所用的抗体(mAb7D5)对免疫逃逸毒株南非变异株也具有相同滴度的中和作用，确保了该抗体的通用性。同时，几乎所有(灵敏度98.5％)SARS-CoV-2阳性血清对mAb7D5都具有显著的拮抗作用(图9)，表明该单克隆抗体识别表位为SARS-CoV-2阳性血清所能共同识别的表位。因此，未来如有需要，也可以通过包被灭活南非变异株病毒来评估血清中针对该变异毒株的中和抗体水平，用于评估人群接种疫苗后感染不同SARS-CoV-2变异株的风险。

标记物标记在单克隆抗体(mAb7D5)上，通过检测标记物的信号或其与底物反应后产生的信号来反应与竞争物结合的抗原的量。可选地，标记物选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金及产生可检测信号的酶中的任一种或多种。在本实施方式中，标记物为辣根过氧化物酶。当然，在其他实施例中，标记物不限于上述，还可以是其他可用于检测的标记物。

可选地，上述检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒还包括阳性标准品、阴性标准品、稀释用缓冲液、封闭液、洗脱液及发光底物中的至少一种。阳性标准品可用于作为定性检测时的阳性对照，也可以用于定量分析时制备标准曲线。可选地，标准品为中和抗体阳性血清，经稀释用缓存液梯度稀释后使用。可选地，阳性标准品为SARS-CoV-2疫苗免疫后获得的人群血清或SARS-CoV-2抗原免疫动物获得的血清。阳性标准品通过微量中和实验确认中和抗体滴度，用于求取阻断率与中和抗体滴度的标准曲线，进而计算待测样本中的中和抗体滴度(详见下文上述试剂盒的使用方法的步骤说明)。

在其中一个实施例中，稀释用缓冲液包括小牛血清和PBS缓冲液。可选地，稀释用缓冲液包括小牛血清和0.01M PBS缓冲液。

在其中一个实施例中，洗脱液包括NaH₂PO₄·2H₂O₂、Na₂HPO₄·12H₂O、阳离子和表面活性剂。可选地，洗脱液包括NaH₂PO₄·2H₂O₂、Na₂HPO₄·12H₂O、NaCl和Tween-20。

基于本发明建立的竞争抑制法判定样本中和抗体的标准说明如下：1)判定抗体阳性的临界值(cut-off值)，设定为阻断率43.80％，即当测定的血清样本阻断率大于该临界值时，可判定血清中含SARS-CoV-2的中和抗体；2)依据微量中和实验结果，将体外中和试验滴度的倒数定义为人SARS-CoV-2中和抗体标准品的效价，单位为Unit/50μL。例如，体外中和试验的滴度为1∶256，则其SARS-CoV-2中和抗体标准品效价为256Unit/50μL。中和抗体滴度>4Unit/50μL是微量中和实验判断血清中和抗体阳性的标准。因此，判定中和抗体对应阻断率的灰区值在35.28％～43.80％，对应阳性标准品与临界值在中和滴度2Unit/50μL时对应的阻断率。如待测样本测定的阻断率在灰区范围内，则需要重复试验一次；如重复值大于临界值则判阳，如重复值落于灰区和阴性区间，则判定为阴性；3)开展的实验质控需确保阳性标准品经稀释在滴度4Unit/50μL时，阻断率大于该临界值(43.80％)。需要说的是，上述试剂盒含有的阴性对照血清指无SARS-CoV-2感染史及免疫史的人或动物血清，阴性标准品对应的阻断率应低于灰区值下限对应的阻断率(35.28％)。

上述检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒可以应用于定性检测，也可以用于定量检测。上述检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒应用于定性检测时的使用方法包括以下步骤a～步骤h：

步骤a：将灭活SARS-CoV-2包被到固相载体上；

步骤b：封闭包被后再用5％BSA(牛血清白蛋白)封闭一次；

步骤c：将SARS-CoV-2中和抗体标准品用稀释液进行梯度稀释，得到稀释后的SARS-CoV-2中和抗体标准品，同时准备被测试的样本、阴性对照标准品和空白对照；

步骤d：将稀释后的SARS-CoV-2中和抗体标准品、被测试的样本、阴性对照标准品及空白对照分别与包被有灭活SARS-CoV-2病毒的固相载体混合，然后加入标记有标记物的竞争物混合均匀，并孵育。

步骤e：孵育结束后弃去反应液，然后进行显色反应和测定；

步骤f：以空白对照(PBS)的阻断率为0，计算SARS-CoV-2中和抗体标准品及被检测样本的阻断率。即：SARS-CoV-2中和抗体标准品或者被检测样本的阻断率等于阴性对照的吸光度值减去SARS-CoV-2中和抗体标准品或者被检测样本的吸光度值除以阴性对照的吸光度值，再乘以100％。

步骤g：根据提供的阴性血清和阳性血清值确认实验的有效性。依据前期研究结果，确认阴性血清标准品(n＝136)的阻断率低于35.28％，而阳性血清标准品稀释后中和抗体滴度在1：4时，其阻断率应大于43.80％，则实验操作流程可靠。如阴性或阳性血清未能达到标准表明实验过程出现问题，需要重新更换试剂及重复实验。

步骤h：根据43.80％的cutoff值，判断血清样本的中和抗体是否阳性。

步骤i：将阻断率35.28％～43.80％定义为灰值，若结果阻断率在灰值范围内，则需要重复实验，进一步判断样本的阳性或阴性结果。

上述检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒可以应用于定量检测时的使用方法的步骤大致与定性方法的步骤相同，其不同在于，在定量检测时，在测定结束后，包括以下步骤：中和抗体标准品经2倍梯度稀释后，根据不同中和抗体滴度的标准品对应的阻断率。绘制抗体滴度(以2为底的log值)和阻断率的标准曲线，根据线性回归模型获取其线性公式。而对被测试的样本的定量则根据其阻断率和上述线性公式推算被测样本的中和抗体滴度。

具体地，在一些实施例中，绘制SARS-CoV-2中和抗体的含量与信号值之间的标准曲线及将被测样本的信号值代入该标准曲线计算待测样本中SARS-CoV-2中和抗体的含量的步骤包括S1～S2：

步骤S1：以空白对照(PBS)的阻断率为0，计算SARS-CoV-2中和抗体标准品及被检测样本的阻断率。

步骤S2：中和抗体阳性标准品经2倍梯度稀释后，测定不同中和抗体滴度的标准品对应的阻断率。绘制抗体滴度(以2为底的log值)和阻断率的标准曲线，根据线性回归模型获取其线性公式。然后将被测样本的阻断率代入该标准标准曲线，得到被测样本中SARS-CoV-2中和抗体的含量。

上述检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒采用竞争法的原理设计，待测样本中SARS-CoV-2中和抗体与上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体竞争结合灭活的SARS-COV-2(原理如图1所示)。以血清微量中和实验结果作为标准对上述试剂盒进行验证，通过大量临床样本验证，证明该试剂盒用于测定SARS-CoV-2中和抗体的特异性好(97.8％)，灵敏度高(98.5％)。并且，通过梯度稀释阳性标准品及测定不同血清样本，证明上述试剂盒测定的血清抗体阻断率与微量中和实验测定的中和抗体水平具有较好的相关性(图5、7)。因此，通过上述试剂盒测定SARS-CoV-2中和抗体的阳性率、阻断率，可以提供一种便捷、灵敏以及特异性高的方法，该方法可以快速判定血清样本中SARS-CoV-2中和抗体水平。此外，采用上述试剂盒检测SARS-CoV-2中和抗体的检测周期短，安全性高，不需要在BSL-3级实验室完成。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)包被抗原的制备

将2020XN4276(文献(陆靖等.Genomic Epidemiology of SARS-CoV-2inGuangdong Province,China[J].Cell,2020,181(5).)中已报道,GISAID NO.EPI_ISL_403934，基因进化分支属于19B)以MOI 0.01感染滴度接种Vero-E6细胞工厂，在不含血清的MEM培养基中培养72小时后，观察细胞出现～80％细胞病变(CPE,Cytopathic Effects)，收获培养上清液。病毒上清液按1：4000加入β-丙内酯，混匀后置于4℃16小时灭活病毒。病毒灭活后置于37度2小时水解β-丙内酯，最后得到灭活后的2020XN4276病毒。灭活后，通过超速离心纯化后制得2020XN4276纯化液。然后采用BCA试剂盒(BCA Protein Assay Kit，PIERCE)检测上述两种病毒纯化液中蛋白浓度。通过电镜可以观察到完整的病毒颗粒及其表明刺突蛋白，结果如图2所示。由图2可知，表明通过此方法制备的灭活的病毒颗粒形态完整，能够代表对应病毒的抗原性。

(2)抗SARS-CoV-2单克隆抗体的制备、纯化与鉴定

克隆并表达2020XN4276的Spike蛋白(S蛋白)。三次免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA法评估小鼠血清中S蛋白的效价水平，选取效价最高的BALB/c小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按比例融合，并于HAT培养液上培养融合杂交的瘤细胞。进行三次亚克隆，每次亚克隆时，通过间接法检测各细胞孔细胞上清的效价。对于OD值均大于0.4的孔进行克隆化，从而获得了共22株单克隆抗体。将上述杂交瘤细胞分别进行扩大培养，并将扩大培养后的细胞注射BALB/c小鼠腹腔，约7～14天后，待小鼠腹部明显膨大时，穿刺采集腹水，制备含抗SARS-CoV-2单克隆抗体的腹水。腹水分别采用葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化。对纯化抗体采用BCA试剂盒检测蛋白浓度；制得22株可用于酶标试验的、高纯度的抗SARS-COV-2的单克隆抗体库。

(3)微量中和实验测定单克隆抗体针对不同SARS-COV-2毒株的中和抗体滴度：为筛选出对不同进化分支的SARS-COV-2具有广谱中和活性的单克隆抗体，我们对22株单克隆抗体分别开展针对早期毒株(2020XN4276)以及南非变异株(20SF530)的体外微量中和实验，测定制备的单克隆抗体的中和抗体滴度。

具体地，22株单克隆抗体纯化后，采用BCA试剂盒测定单抗浓度。将上述单克隆抗体分别自20μg/mL开始做4倍梯度稀释(20μg/mL、5μg/mL、1.25μg/mL、0.313μg/mL、0.078μg/mL、0.0195μg/mL，分别对应稀释倍数1倍、4倍、16倍、6倍4、256倍、1024倍)。取50μL稀释好的单克隆抗体与50μL 100TCID50的病毒液共同37℃孵育1小时后，感染Vero-E6细胞，每个浓度梯度平行开展1个复孔。细胞感染后于37℃下培养7天，分别于第4天和第7天观察并记录细胞病变情况。试验设立正常细胞对照并设立100TCID50T、10TCID50、1TCID50和0.1TCID50组开展病毒回滴。镜下观察病变结果确定不同单抗对病毒的中和作用，结果如图4所示(第7天的结果)。

当前用于临床治疗性的单抗有效中和浓度在0.4μg/mL～10μg/mL(Baum et al.,Science 369,1014–1018(2020))。微量中和结果表明22株单克隆抗体有19株对早期SARS-COV-2毒株(2020XN4276)具有中和抗体活性：16倍稀释浓度下即单克隆抗体浓度在1.25μg/mL浓度下能抑制早期SARS-COV-2毒株感染细胞，其中单克隆抗体7D5在75ng/mL浓度下依然对细胞有完整的保护作用，同效于甚至优于当前临床治疗性单克隆抗体。对于南非变异株(20SF530)，22株单克隆抗体中有15株在1.25μg/mL(16倍稀释)浓度下具有中和活性，其中有三株单克隆抗体mAb2C3、mAb4D12和mAb 4D11(对应于图4中的2C3、4D12和4D11)对早期毒株具有中和作用而对南非变异株失去中和作用，而mAb5B11对南非变异株的中和效价相较于早期毒株下降16倍。mAb7D5对南非变异株具有与早期株相类似的中和效价水平。将分泌mAb7D5的小鼠杂交瘤细胞命名为“小鼠杂交瘤细胞7D5”，并已于2021年5月11日保藏于在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)且2021年5月14日该保藏中心鉴定为存活，保藏中心地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，小鼠杂交瘤细胞7D5的保藏号为GDMCCNO.61643，分类命名：小鼠杂交瘤细胞。

以上结果表明，南非变异株的序列改变影响部分单抗的结合位点。依据上述微量中和结果，筛选出mAb7D5作为进行酶标竞争法检测中和抗体的标记竞争物。该抗体对早期毒株及南非变异株都具有较高的中和活性，能够作为通用的单克隆抗体配合包被不同灭活毒株作为抗原检测对应的中和抗体。

实施例2

应用mAb7D5单克隆抗体及SARS-CoV-2灭活病毒2020XN4276作为抗原用于检测特异中和抗体的试剂盒，该试剂盒包括酶标抗体、SARS-CoV-2中和抗体标准品、阴性血清标准品、抗原酶标板、稀释用缓冲液、浓缩洗液、显色液和终止液，其中，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的mAb7D5，抗原酶标板上包被的抗原为灭活后纯化的2020XN4276病毒。

试剂盒的制备方法包括但不限于如下步骤：

(1)酶标记抗体的制备

将实施例1获得的纯化后的mAb7D5，采用改良的过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。标记完成后在酶标记抗体(HRP-mAb7D5)中加入50％终浓度(体积/体积)的甘油，-20℃保存。

(2)SARS-COV-2中和抗体标准品的制备

SARS-COV-2中和抗体标准品为已通过微量中和实验测定效价的中和抗体阳性血清。将SARS-COV-2中和抗体标准品稀释至256Unit/50μL，无菌分装血清-20℃保存。实验时将其稀释成64Unit/50μL、32Unit/50μL、16Unit/50μL、8Unit/50μL、4Unit/50μL、2Unit/50μL、1Unit/50μ0使用，用于制作中和效价的标准曲线。

(3)SARS-COV-2抗原酶标板的制备

1)包被抗原、酶标记抗体最适工作浓度的选择

以方阵滴定法对本实施例的试剂盒中抗原抗体最适工作浓度进行选择。

具体地，将包被抗原稀释(100倍、200倍和400倍)后加入酶标板的不同孔中，4℃过夜，然后将包被酶标板用PBST(0.05％Tween20)洗涤3遍，每孔加入150μL的封闭液(含10％小牛血清及10％蔗糖PBS)，37℃封闭1小时；弃去封闭液，拍干，室温风干包被酶标板，制得包被有不同抗原浓度的酶标板，然后与不同稀释度的HRP标记的单克隆抗体进行方阵滴定，以酶标仪读取各孔的OD450值，选取无阻断时OD450为1.5～2.0左右的抗原包被浓度与酶标记抗体的使用浓度为工作浓度。本实施案例中，HRP标记的单克隆抗体的工作浓度为1∶2000，相应的包被抗原浓度为1：100倍稀释的灭活病毒2020XN4276。

2)制备SARS-CoV-2抗原酶标板：依据上述实验结果，包被灭活抗原2020XN4276制备试剂盒的抗原酶标板。

(4)稀释用缓冲液：小牛血清100mL和0.01M PBS 900mL。

(5)终止液：浓硫酸(98％)112mL和蒸馏水888mL。

(6)PBST洗脱液：5×PBS 200mL、10％Tween20 5mL和蒸馏水800mL。

(7)TMB显色液：2mg/mL TMB 0.5mL、0.2M Na₂HPO₄ 10mL和0.75％H₂O₂32μL。

上述试剂盒的使用方法包括但不限于以下步骤：

(1)配液：将50mL浓缩洗脱液(10％PBST)用蒸馏水或去离子水稀释至500mL备用。

(2)加样：在抗原酶标板的孔中加入50μl稀释用缓冲液，再加入50μL经梯度稀释的阳性标准品或待测样品。轻拍混匀，37℃避光温育60分钟。

(3)洗板：将酶标板孔内液体甩干，用浓缩洗脱液300μL/孔充分洗涤5遍，扣干。

(3)反应：每孔加入酶标记的单克隆抗体7D5 100μL，轻拍混匀，并置37℃下避光温育30分钟。

(4)显色：将酶标板孔内液体甩干，用洗脱液300μL/孔充分洗涤5遍，扣干。然后，每孔加TMB显色液100μL，轻拍混匀，37℃避光温育15分钟。

(5)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪于450nm处检测，测定每孔的OD值。

(6)结果判定：结果判定分为定性判定和定量判定(注意吸光值与其所含的SARS-COV-2中和抗体的含量成负相关)。

定性分析：根据待测样品的吸光度值，计算阻断率，SARS-COV-2中和抗体标准品或者被检测样本的阻断率等于阴性对照的平均吸光度值减去SARS-COV-2中和抗体标准品或者被检测样本的平均吸光度值除以SARS-COV-2阴性对照的平均吸光度，再乘以100％。依据43.80％的cutoff值判定血清样本中是否存在特异针对SARS-CoV-2的中和抗体。

定量分析：通过梯度稀释标准品绘制标准曲线，进而计算出样品中和抗体含量(Unite/50μL)。标准曲线的绘制与计算：以SARS-COV-2中和抗体标准品的阻断率(inhibition，阻断率(％)＝(阴性对照OD-样品OD)/阴性对照OD×100)为纵坐标，以SARS-COV-2中和抗体标准品的中和抗体滴度的对数值为横坐标，绘制半对数标准曲线图，结果见图5。

实施例3

灵敏度和特异性分析

实施例2的检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒对479份人血清(343份阳性血清，136份阴性血清样本)的检测结果与中和试验法的检测结果进行对比(GraphPad Prism进行线性回归分析和绘制ROC曲线进行AUC评价)，其中阳性血清中和抗体滴度为1：4～1：1024(图6)，得到实施例2的试剂盒的灵敏度和特异度，并得到同时满足灵敏度和特异度相对最优时的最佳截断值(cut-off值)。ROC曲线与对角线构成的曲面面积(AUC)可反映检测方法的真实性，AUC越接近于1.0，检测方法的真实性越高。结果如图7～图9所示。图7纵轴为阻断率(inhibition，％)。

由图7～图9可知，采用实施例2的试剂盒(2020XN4276作为包被抗原、酶标抗体为HRP标记的mAb7D5)对479个血清样本中SARS-COV-2中和抗体进行检测时，其特异度为97.8％，灵敏度为98.5％。由ROC曲线可得最佳截断值为43.8％，AUC为0.9852。

实施例4

使用血清样本对竞争ELISA法、磁微粒化学发光法(北京博奥赛斯)和微量病毒中和抗体试验等血清学方法进行评价，比较3种试验方法检测结果的差异。分别采用实施例2中的试剂盒(竞争ELISA法)、新型冠状病毒IgM/IgG试剂盒(磁微粒化学发光法)和微量病毒中和抗体试验检测血清样本的抗体水平，结果如表1所示。

表1竞争ELISA法、磁微粒化学发光法与微量病毒中和抗体试验的比较

以微量病毒中和抗体试验结果作为本次方法比较的诊断金标准，结果显示，竞争ELISA法及磁微粒化学发光法检测灵敏度分别为98.5％(n＝343)和100％(n＝67)，两者Kappa值分别为0.959(≥0.75，一致性极好)和0.721(0.4～0.75，中、高度一致)；竞争ELISA法特异度大于磁微粒化学发光法(97.8％vs 64％)，详见表1。中和抗体检测方法的特异性尤为重要，化学发光法的特异性较低(64％)意味着潜在有36％的通过化学发光法判定为阳性的血清其中和抗体为阴性，这样无论对病症严重程度预判还是对疫苗效果及免疫后感染风险的评估都存在重要技术缺陷。因此，通过大量临床样本验证，以微量病毒中和抗体试验结果为金标准时，应用本发明的竞争ELISA法特异度、Kappa值均高于当前市场的磁微粒化学发光法，Kappa值提示和金标准的一致性好。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏编号为GDMCC NO.61643。

2.一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括保藏编号为GDMCC NO.61643的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2中和抗体，所述试剂盒包括固相载体、抗原和标记有标记物的竞争物，所述抗原能与SARS-CoV-2中和抗体特异性结合，所述竞争物为保藏编号为GDMCC NO.61643的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原为灭活的SARS-CoV-2。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原选自灭活的SARS-CoV-2毒株2020XN4276。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体选自多孔板、微量反应板凹孔、磁珠、纤维素膜和尼龙膜中的一种。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金及产生可检测信号的酶中的任一种或多种。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。

10.根据权利要求3～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括SARS-COV-2中和抗体阳性标准品、阴性标准品、稀释用缓冲液、洗脱液及发光底物中的至少一种。

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