JP2010526880A - H5トリインフルエンザの診断および監視に有用なh5亜型特異的結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
b)脳の凍結切片。RPMI 1640をmAb 6B8に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
d)肝臓のパラフィン切片。RPMI 1640をmAb 7H10に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
f)肺のパラフィン切片。RPMI 1640をmAb 7H10に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
h)肺のパラフィン切片。RPMI 1640をmAb 7H10に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
j)腎臓のパラフィン切片。RPMI 1640をmAb 7H10に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
l)肝臓のパラフィン切片。RPMI 1640をmAb 7H10に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
b)アカガシラサギ(Pond Heron)の肺組織。
c)アオサギ(Grey Heron)の脳組織。
mAbまたは関連する結合タンパク質の”免疫学的結合特性”という用語は、その文法形式の全てにおいて、mAbまたは関連する結合タンパク質のその抗原に対する特異性、親和性および交叉反応性を指す。
用語”結合タンパク質”は本発明のmAbまたは本発明のmAbの免疫学的結合特性を有するmAbの抗原結合部位を含むタンパク質を指し、下記で記述するそれらを含む。
ハイブリドーマの作製
H5N1/PR8と名づけられたウイルスを、疾病対策センター(米国)から得た。それは非病原性組み換えH5N1インフルエンザウイルスであり、それはベトナムでヒトに感染したAIV H5N1ウイルスのHAおよびNA遺伝子を含む(A/ベトナム/1203/2004)。別のAIV亜型、H5N3(A/ニワトリ/シンガポール/97)を、シンガポールの農産食品&家畜管理局(AVA)から得た。これらの2種類のウイルスストックを用いて9〜11日齢の発育鶏卵(Chew’s Poultry Farm,シンガポール)に感染させ、2世代複製させた。次いで発育鶏卵から尿膜腔液を吸出し、血球凝集アッセイ(HA)を用いてウイルスの力価を測定した。これらのH5N1およびH5N3ウイルスの精製を、ウイルスを含む尿膜腔液を10,000rpmで30分間遠心分離して破片を除去し、続いて上清を40,000rpmで3時間超遠心することにより実施した。ウイルスのペレットをPBS中で再懸濁した。
ハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマの培養上清を、下記のように血球凝集阻害(HI)試験および免疫蛍光アッセイ(IFA)によりスクリーニングした。
H5亜型モノクローナル抗体の特性づけ
mAb類の安定性。血球凝集阻害試験を、異なる期間(7、30、45、60、70、および90日目)において得たそれぞれのハイブリドーマの上清について実施し、細胞株の安定性を評価した。希釈を行ってエンドポイントを算出した。mAb 6B8のハイブリドーマの上清は、HI力価29を有していた。その力価は90日目においてさえも安定なままであった(図1参照)。このように、H5抗原に対するmAbを分泌するハイブリドーマクローンは、長期間の間高い力価の値を維持することができた。
mouse mAb isotyping kit(Amersham Bioscience,イギリス)を用いてアイソタイプ同定を実施した。(データは示していない。)6B8、8F10および2D10のアイソタイプはIgMであると決定され、7H10はIgG1であると決定された。
mAb類のウイルス中和。MDCK細胞および10日齢の胚を、それぞれ50%組織培養感染量(TCID50)および50%胚感染量(EID50)の測定のために用いた。MDCK細胞(2x104/ml)を、70%〜90%コンフルエンスまで増殖させた。それぞれのウイルスに感染した尿膜腔液を、10−1から10−8までの一連の希釈比を用いて、それらの対数期(ウイルス感染への感受性が最も高い)におけるMDCK細胞および10日齢のニワトリ胚の両方に感染させることで、TCID50およびEID50に関して試験した。感染していないMDCK細胞および尿膜腔液を陰性対照として用いた。細胞を35℃で培養し、CPEを観察した。ReedおよびMuenchの数学的技法(9)を用いて、感染価をTCID50/100μlおよび1000EID50/200μlとして表し、それぞれのウイルスを、それぞれ50μlおよび100μl中に100TCID50および500EID50を有するようにそれぞれ希釈した。系列希釈したmAb 6B8は、感染したMDCK細胞および胚中で終濃度100TCID50および500EID50のウイルスを中和することができた。表2参照。表2に示したデータは、mAb 6B8がH5N1ウイルスを中和する活性を生み出すことができたことも示している。表2における数は、感染したMDCK細胞および胚中でウイルスの終濃度100TCID50および500EID50において、mAb類がウイルスをなお検出および中和することができた最も高いH5N1ウイルスの希釈率を表している。
mAb 7H10の線状エピトープのマッピング
H5亜型AIVのHA1遺伝子をPCRにより3種類の重なり合う断片に切り分け、ヒスチジン融合タンパク質として発現させた。mAb 7H10を用いたウェスタンブロットによる分析は、そのエピトープが主に断片BおよびCの重なり合う領域(アミノ酸201〜266)中に見出されることを明らかにした。このエピトープのC末端の位置を決定するため、8種類の切り詰めた断片を設計し、mAb 7H10を用いてウェスタンブロットによりスクリーニングした(図7aおよびb)。HA1上のアミノ酸251が7H10に関するエピトープのC末端のアミノ酸であることが分かった。このエピトープのN末端の位置を決定するため、8種類の変異導入した断片を設計し、mAb 7H10を用いてスクリーニングした。8種類の変異体の間で、HA1上のアミノ酸240〜247を特定のプライマーにより個別にアラニンへと変更した。ウェスタンブロットの結果によると、エピトープ中のN末端のアミノ酸はHA1上のアミノ酸244である(図7cおよびd)。これらの結果は、Mab 7H10により標的とされる線状エピトープがH5亜型AIVのヘマグルチニン上のアミノ酸244〜251(244および251を含む)に位置していることを示した。
免疫組織化学
2002〜2006年からの30個のH5N1に感染した組織標本を試験した。それらは様々なタイプの組織、器官、例えば脳、腎臓、肝臓、肺および膵臓を含んでいた。それらはパラフィン切片にされた標本または凍結切片のどちらかの形であった。商業的に入手できる免疫ペルオキシダーゼ染色系(Dako Cytomation EnVision + System−HRP (AEC))を、これらの標本に用いた。染色技法は、二次抗体とコンジュゲートしたホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ポリマーに基づいた、結合した抗体(20)を認識するための2個の工程を含んでいる(16)。このキットはアビジンまたはビオチンを含んでいないため、非特異的内因性アビジン−ビオチン活性はかなり軽減される。
AC−ELISAの発展
モノクローナル抗体7H10および6B8を、次のようなELISAの手順で評価した:6B8(IgM)を半対数増加(half−log increments)で系列希釈し、96ウェル平底マイクロタイタープレート(Nunc, Demark)をコートするのに用いた。捕捉抗体を50μlの炭酸緩衝液(73mM炭酸水素ナトリウムおよび30mM炭酸ナトリウム)に懸濁した。次いでマイクロタイタープレートを37℃で1時間、または4℃で一夜保温した。全ての続く保温工程の間にプレートを0.05%Tween20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(PBS−T)で3回洗浄し、全ての希釈液は1%脱脂乳を含むPBST中で作った。プレートを50μlのブロッキング溶液(PBS−T中5%脱脂乳)と共に37℃で1時間保温してブロッキングし、すすいで50μlの精製した組み換えH5N1組み換えHA1(100ng)またはH5 AIVと共に37℃で1時間保温した。すすいだ後、50μlのモルモット単一特異性抗体IgG(1:480で希釈)を添加し、37℃で1時間保温し、洗浄し、50μlの1:1000に希釈したHRPコンジュゲートウサギ抗モルモット免疫グロブリンと共に保温した。50μlの新しく調製した基質溶液(o−フェニレンジアミン(OPD))の添加により色を現し、ELISAリーダー(Tecan,スイス)で490nmの吸光度を読み取った。mAb類および単一特異性抗体の最適な実用希釈度は、交差力価測定により決定した。H5 AIV(H5N1、H5N2、H5N3)および非H5 AIV(H7N1およびH9N2)の反応を比較することにより最適化の条件を決定し、このアッセイに関する最も高いシグナル対ノイズ比を得た。シグナル対ノイズ比は対応抗原の吸光度を異種抗原の吸光度で割ることにより算出される。
Claims (48)
- トリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質の線状エピトープに特異的に結合する結合タンパク質であって、実質的にモノクローナル抗体7H10の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質。
- 請求項1に記載の結合タンパク質であって、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体またはヒト化抗体である結合タンパク質。
- 請求項1に記載の結合タンパク質であって、モノクローナル抗体である結合タンパク質。
- アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号PTA−8243で寄託されたハイブリドーマ7H10により産生されるモノクローナル抗体7H10。
- トリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質の三次元エピトープに特異的に結合する結合タンパク質であって、実質的にモノクローナル抗体6B8、8F10または2D10の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質。
- 請求項5に記載の結合タンパク質であって、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体またはヒト化抗体である結合タンパク質。
- 請求項5に記載の結合タンパク質であって、モノクローナル抗体である結合タンパク質。
- アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号PTA−8246で寄託されたハイブリドーマ6B8により産生されるモノクローナル抗体6B8。
- アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号PTA−8245で寄託されたハイブリドーマ8F10により産生されるモノクローナル抗体8F10。
- アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号PTA−8248で寄託されたハイブリドーマ2D10により産生されるモノクローナル抗体2D10。
- 生物学的標本においてH5亜型トリインフルエンザウイルスを検出するための方法であって、標本を、トリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質の線状エピトープに特異的に結合する、実質的にモノクローナル抗体7H10の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質と接触させることを含む方法。
- 請求項11に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体またはヒト化抗体である方法。
- 請求項11に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体である方法。
- 請求項13に記載の方法であって、モノクローナル抗体がアメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号PTA−8243で寄託されたハイブリドーマ7H10により産生される抗体7H10である方法。
- 生物学的標本においてH5亜型トリインフルエンザウイルスを検出するための方法であって、標本を、トリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質の三次元エピトープに特異的に結合する、実質的にモノクローナル抗体6B8、8F10または2D10の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質と接触させることを含む方法。
- 請求項15に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体またはヒト化抗体である方法。
- 請求項15に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体である方法。
- 請求項17に記載の方法であって、モノクローナル抗体がアメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号PTA−8246で寄託されたハイブリドーマ6B8により産生される抗体6B8である方法。
- 請求項17に記載の方法であって、モノクローナル抗体がアメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号PTA−8245で寄託されたハイブリドーマ8F10により産生される抗体8F10である方法。
- 請求項17に記載の方法であって、モノクローナル抗体がアメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号PTA−8248で寄託されたハイブリドーマ2D10により産生される抗体2D10である方法。
- 請求項15に記載の方法であって、標本をトリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合する第2の結合タンパク質と接触させることを含み、第1の結合タンパク質が捕捉結合タンパク質であり、第2の結合タンパク質が、検出可能な要素を含む、またはそれにコンジュゲートした検出結合タンパク質である方法。
- 請求項21に記載の方法であって、第1および第2結合タンパク質の少なくとも一方がモノクローナル抗体である方法。
- 請求項21に記載の方法であって、第1および第2結合タンパク質がモノクローナル抗体である方法。
- 請求項21に記載の方法であって、第1結合タンパク質が固体表面に固定される方法。
- 請求項21に記載の方法であって、第2結合タンパク質が放射性原子を含む、蛍光性の分子にコンジュゲートしている、または酵素にコンジュゲートしている方法。
- 生物学的標本においてH5亜型トリインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、トリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質の線状エピトープに特異的に結合する、実質的にモノクローナル抗体7H10の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を、その結合タンパク質のそのエンベロープ糖タンパク質への結合を検出するための試薬と共に含むキット。
- 生物学的標本においてH5亜型トリインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、トリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質の三次元エピトープに特異的に結合する、実質的にモノクローナル抗体6B8、8F10または2D10の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を、その結合タンパク質のそのエンベロープ糖タンパク質への結合を検出するための試薬と共に含むキット。
- 請求項26または27のキットであって、トリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合する第2の結合タンパク質を含み、第1の結合タンパク質が捕捉結合タンパク質であり、第2の結合タンパク質が、検出可能な要素を含む、またはそれにコンジュゲートした検出結合タンパク質であるキット。
- 請求項28に記載のキットであって、第1および第2結合タンパク質の少なくとも一方がモノクローナル抗体であるキット。
- 請求項28に記載のキットであって、第1および第2結合タンパク質がモノクローナル抗体であるキット。
- 請求項28に記載のキットであって、第1結合タンパク質が固体表面に固定されるキット。
- 請求項28に記載のキットであって、第2結合タンパク質が放射性原子を含む、蛍光性の分子にコンジュゲートしている、または酵素にコンジュゲートしているキット。
- H5亜型トリインフルエンザウイルスに感染した固定された組織標本を、有効量の結合タンパク質で処理する方法であって、それがトリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質の線状エピトープに特異的に結合し、実質的にモノクローナル抗体7H10の免疫学的結合特性を有する方法。
- 請求項36に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体またはヒト化抗体である方法。
- 請求項36に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体である方法。
- 請求項36に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体7H10である方法。
- H5亜型トリインフルエンザウイルスに感染した対象を処理する方法であって、その対照に有効量の、トリインフルエンザウイルスのH5亜型のエンベロープ糖タンパク質の三次元エピトープに特異的に結合し、実質的にモノクローナル抗体6B8、8F10または2D10の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を投与することを含む方法。
- 請求項40に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体またはヒト化抗体である方法。
- 請求項40に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体である方法。
- 請求項40に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体6B8である方法。
- 請求項40に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体8F10である方法。
- 請求項40に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体2D10である方法。
- トリインフルエンザウイルスH5N3株の中和回避変異体であって、モノクローナル抗体6B8により認識されるその株のHA配列のエピトープの内部に、変異ウイルスをその抗体により中和できなくなるような変異を含む中和回避変異体。
- 請求項43の中和回避変異体であって、その変異がアミノ酸205におけるものである中和回避変異体。
- トリインフルエンザウイルスH5N1(PR8)株の中和回避変異体であって、モノクローナル抗体8F10により認識されるその株のHA配列のエピトープの内部に、変異ウイルスをその抗体により中和できなくなるような変異を含む中和回避変異体。
- 請求項45の中和回避変異体であって、その変異がアミノ酸210におけるものである中和回避変異体。
- トリインフルエンザウイルスH5N1(PR8)株の中和回避変異体であって、モノクローナル抗体2D10により認識されるその株のHA配列のエピトープの内部に、変異ウイルスをその抗体により中和できなくなるような変異を含む中和回避変異体。
- 請求項47の中和回避変異体であって、その変異がアミノ酸175におけるものである中和回避変異体。
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