KR20230087219A - 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체 및 이의 용도 - Google Patents
사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)를 효과적으로 검출 또는 진단하기 위해 사용되는 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)에 의해 발생하는 세계적 대유행이다. 대부분의 COVID-19 환자는 폐렴으로 발전하고 발열, 피로, 인후통, 설사, 기침 등의 증상과 함께 경증에서 중증에 이르는 호흡기 증후군을 나타낸다. COVID-19에 대한 다양한 새로운 RNA 및 DNA 백신이 개발되었지만 바이러스 돌연변이로 인해 인간에서 인간으로의 전파는 여전히 빠르고 높다. 역전사-정량 PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)은 SARS-CoV-2 진단을 위한 황금 표준으로 간주된다. 그러나 RT-qPCR에 의한 분자 진단은 노동 집약적이며 비용이 많이 들고 특정 실험실 기기와 숙련된 기술자가 필요하다. RT-qPCR에 의한 분자 진단 역시 의무적인 RNA 분리 단계로 복잡하고 시간이 많이 소요되는 절차이다.
SARS-CoV-2 게놈은 스파이크(spike, S), 엔벨로프(envelope), 매트릭스(matrix) 및 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein, NP)의 4가지 구조 단백질을 암호화하는 단일 양성 가닥 RNA 분자로 구성된다. S 단백질의 돌연변이는 특정 에피토프에서 아미노산 치환을 유발하며, 그 중 일부는 수용체 결합력을 증가시키고 단백질의 글리코실화 패턴을 변경한다. Rahman 등은 우한 참조주와 비교하여 돌연변주(49.15%, n = 30,221)에서 SARS-CoV-2 NP의 1034개의 고유한 뉴클레오티드 돌연변이가 보고되었다. 뉴클레오캡시드의 뉴클레오티드 서열에서 이러한 돌연변이는 표적 서열과 프라이머-프로브 세트 사이의 불일치를 유발할 수 있다. NP의 아미노산 서열에서 예상보다 더 많은 변이가 RNA-결합 N-말단 도메인, SR-풍부 영역 및 C-말단 이량체화 도메인에서 관찰되었다. NP(R203K/G204R)의 특정 돌연변이 쌍이 SARS-CoV-2의 감염성, 적합성 및 독성에 영향을 준다. SARS-CoV-2 NP의 이러한 아미노산 치환은 측면 유동 분석(lateral flow assay, LFA) 및 효소 결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)과 같은 면역 분석에 대한 민감도를 낮출 수 있다. 따라서 SARS-CoV-2 NP의 보존된 에피토프에 결합하는 보다 특이적 항체는 면역분석에 의한 보다 정확한 검출을 위해 필요하다.
한국공개특허 제2021-0076854호는 COVID-19, 바이러스, 항체 및 마커의 현장 진료, 신속, 현장 배포 가능 진단 검사를 위한 장치 및 방법 - 오토랩 20에 관한 내용을 개시하고 있고, 한국공개특허 제2021-0128252호는 코로나-19 바이러스 표적 인간 항체를 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2021-0113936호는 항-코로나바이러스 항체 및 사용방법을 개시하고 있으나, 본 발명의 특정 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 NP에 대한 항체는 개시된 바 없습니다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 SARS-CoV-2 NP의 보존된 에피토프를 확인하고 SARS-CoV-2 NP의 신속한 검출을 위한 항원으로 에피토프 펩티드에 결합하는 특정 단일클론 항체를 개발하였다. 항원성 펩타이드와 단일클론항체 간의 결합 친화도를 조사하였고, SARS-CoV-2 NP 검출을 위한 샌드위치 쌍을 조사하였다. 궁극적으로, 보존된 에피토프(NP1, NP1-1 및 NP4)에 결합하는 모노클로날 항체는 포획(75E12 및 79C12) 및 신속한 검출(54G6 및 54G10)을 위해 서로 쌍을 이루었다. 본 발명은 SARS-CoV-2의 재조합 NP와 RT-qPCR로 확인된 COVID-19 환자의 임상 샘플을 사용하여 신속 검출 방법의 민감도와 특이성을 테스트했다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 7, 13 및 19로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR1; 서열번호 2, 8, 14 및 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 3, 9, 15 및 21로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 4, 10, 16 및 22로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR1; 서열번호 5, 11, 17 및 23으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 6, 12, 18 및 24로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 경쇄 CDR1; 서열번호 2의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 3의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 4의 중쇄 CDR1; 서열번호 5의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 6의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 7의 경쇄 CDR1; 서열번호 8의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 9의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 10의 중쇄 CDR1; 서열번호 11의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 12의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 13의 경쇄 CDR1; 서열번호 14의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 15의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 16의 중쇄 CDR1; 서열번호 17의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 18의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 서열번호 19의 경쇄 CDR1; 서열번호 20의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 21의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 22의 중쇄 CDR1; 서열번호 23의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 24의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 경쇄 가변영역은 서열번호 25, 27, 29 및 31로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 중쇄 가변영역은 26, 28, 30 및 32로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1, 7, 13 및 19로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR1; 서열번호 2, 8, 14 및 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 3, 9, 15 및 21로 이루어진 군에서 선택된 하나의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과, 서열번호 4, 10, 16 및 22로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR1; 서열번호 5, 11, 17 및 23으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 6, 12, 18 및 24로 이루어진 군에서 선택된 하나의 중쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, 경쇄 가변영역은 서열번호 25, 27, 29 및 31로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 중쇄 가변영역은 26, 28, 30 및 32로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 본 발명은 상기 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, 본 발명은 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
상기 검출용 조성물의 시료는 비강 면봉, 비인두 세척액, 기관지폐포세척액, 흉수, 비강 도말, 비강 흡인액, 비인두도말, 비인두흡인액, 혈액, 혈액 구성성분, 체액, 타액, 가래 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 사스-코로나바이러스-2 감염증은 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에서, 본 발명은 상기 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 사용설명서를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 항원과 항체 반응으로 이루어진 것이고, 더욱 상세하게는 측면 유동 면역 분석(lateral flow immunoassay) 및 효소 결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에서, 본 발명은 상기 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 분리된 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 예에서, 본 발명은 상기 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 분리된 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단정보 제공방법을 제공한다.
본 발명은 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 사스-코로나바이러스-2를 조기에 신속하게 진단하여 대응하고 분류함으로써 추가 확산을 방지하여 궁극적으로 발병률을 낮추고 나아가 국민의 안전과 경제 손실을 줄일 수 있는 기반을 마련하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(NP) 특이적 항체 개발을 위한 항원성 펩타이드 선택을 나타낸 것이다. A) SARS-CoV-2 NP와 SARS-CoV NP 및 MERS-CoV NP의 서열 정렬을 통해 서열 특이성이 높은 5개의 짧은 펩타이드를 선택하였다. B) SARS-CoV-2의 4가지 주요 변이체에서 NP 항원의 돌연변이 축적. NP 1, NP 1-1 및 NP 4 펩티드는 돌연변이 축적에도 불구하고 고도로 보존된 서열을 공유한다.
도 2는 SARS-CoV-2 NP-특이적인 항체 생산의 전체적인 모식도를 나타낸 것이다. 선택된 5가지 펩타이드(NP 1, NP 1-1, NP 2, NP3, NP 4) 각각으로 마우스를 면역시킨 후 항체를 분비하는 형질세포를 분리하고 골수종과 융합하여 하이브리도마를 생성하였다. 하이브리도마 세포를 선택적으로 배양하고 ELISA(1차) 및 LFA(2차)로 스크리닝하였다. 선택된 하이브리도마 세포를 마우스 복강에 주입하였다. 14일 후, 생성된 항체를 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 7개의 모노클로날 항체(54F10, 54G6, 54G10, 54H2, 66E10, 79C12 및 75E12)가 최종적으로 수득되었다.
도 3은 측면 유동 면역 분석법(LFIA)을 사용한 SARS-CoV-2 NP 항원 검출을 나타낸 것이다. LFIA는 샘플 패드, 접합체 패드, 니트로셀룰로오스 멤브레인 및 흡수 패드로 구성된다. Conjugate pad는 CNB-conjugated SARS-CoV2 NP 특이적인 항체와 닭의 IgY 항체를 포함하고 있으며, 각각 테스트 라인과 컨트롤 라인의 신호 분자로 사용된다. 환자의 비인두 면봉에서 추출한 SARS-CoV-2 NP 항원을 LFIA에 로딩하고 샘플은 모세관력을 통해 LFIA를 통과한다. 샘플 로딩 15분 후 테스트 라인에서 SARS-CoV-2 NP가 감지되어 빨간색 라인이 표시된다. SARS-CoV-2 NP 항원의 검출은 육안 또는 반정량적으로 확인할 수 있다.
도 4는 SARS-CoV-2 바이러스 구성 요소의 개략도를 나타낸 것이다. NP(청록색)는 나선형 캡시드 구조의 단일 가닥 RNA(주황색)에 결합하여 바이러스 게놈을 패키징하는 데 중요한 역할을 한다.
도 5는 SARS-CoV-2 NP 항원과 SARS-CoV NP 및 MERS-CoV NP의 서열 정렬을 나타낸 것이다. SARS-CoV2 NP는 SARS-CoV(~90% 동일성) 및 MERS-CoV(~50% 동일성)의 NP와 높은 서열 상동성을 공유한다. 서열 특이성을 갖는 5개의 SARS-CoV-2-특이적 펩티드가 항원 결정기로 선택되었다.
도 6은 간접 LFIA를 사용한 2차 선별 결과를 보여주는 막대 그래프를 나타낸 것이다. SARS-CoV-2, SARS-CoV 및 MERS-CoV의 세 가지 다른 NP가 니트로셀룰로오스 막에 미리 고정되었습니다. 항체가 항원에 결합하는 능력은 특정 항체를 포함하는 하이브리도마로부터 미리 고정된 항원에 배양액을 흐르게 함으로써 평가하였다.
도 7은 SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 단클론 항체의 생물층 간섭계(BLI) 결과를 나타낸 것이다. BLI 기술을 사용하여 항체-NP 항원 결합 이벤트로 인한 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 실시간 바인딩 센서그램은 점선으로 표시되고 피팅 곡선은 실선으로 표시됩니다. i) 54F10(빨간색), ii) 54G6(파란색), iii) 54G10(녹색), iv) 54H2(주황색), v) 66E10(보라색), vi) 79C12(분홍색) 및 vii) 75E12(노란색). 54F10, 54G6, 54H2, 66E10, 79C12 및 75E12 단일클론항체는 항원성 결정인자로서 NP4 펩티드로부터 생성되었고, 54G10은 항원성 펩티드 NP1 또는 NP 1-1로부터 유래되었다. 결합 상수는 1:1 결합 모델을 기반으로 한 피팅 곡선에서 계산되었습니다.
도 8은 항원성 펩타이드에 대한 모노클로날 항체의 생물층 간섭계(BLI) 결과를 나타낸 것이다. A) 항체 결합에 기반한 BLI 측정 원리의 개략도. B-D) 단일클론 항체와 항원성 펩타이드 간의 결합 이벤트로 인한 결합 및 해리 곡선. 실시간 바인딩 센서그램은 점선으로 표시되고 피팅 곡선은 실선으로 표시된다. 결합 상수는 1:1 결합 모델을 기반으로 한 피팅 곡선에서 계산되었다.
도 9는 SARS-CoV-2 NP 항원 검출을 위한 최적의 샌드위치 쌍 발견 결과를 나타낸 것이다. A) 7가지 유형의 캡처 및 감지 프로브로 구성된 LFIA의 개략도. 7가지 유형의 단일클론항체로부터 얻은 총 42쌍을 평가하였다. B) 각 샌드위치 쌍 및 표적 항원에 대한 테스트 라인 강도를 보여주는 막대 그래프. 각 쌍은 SARS-CoV-2(빨간색), SARS-CoV(검정색) 및 MERS-CoV(주황색)의 50ng NP 항원으로 감지 민감도와 특이성을 평가했다. PC, 캡처 프로브; PD, 탐지 프로브. 막대 위의 빨간색 표시는 SARS-CoV-2 NP 검출을 위해 선택된 최적의 쌍을 나타낸다. C) 각 샌드위치 쌍에 대한 정규화된 라인 강도의 히트맵. 라인 강도는 표적 항원의 부재에 대해 정규화된다. SARS-CoV-2 NP 항원을 검출하기 위해 6개의 샌드위치 쌍(회색 상자에 표시)이 최종적으로 선택되었다. D) 6개의 선택된 쌍 각각에 대한 LFIA 결과의 대표적인 이미지.
도 10은 54G6과 54G10의 혼합 비율을 조정하여 검출 프로브의 최적화 결과를 나타낸 것이다. 검출 감도를 향상시키기 위해 선택된 검출 프로브(54G6 및 54G10)를 혼합하여 검출 프로브를 최적화했다. 50 ng의 재조합 SARS-CoV-2 항원과 2.8×104 TCID50의 비활성화된 바이러스 샘플을 사용하여 5가지 다른 혼합 비율을 평가했다. 2:8(v/v) 비율은 검출 프로브에 대한 최적의 혼합 비율로 확인되었다.
도 11은 최적의 샌드위치 쌍의 감도를 나타낸 것이다. A) 재조합 SARS-CoV-2 NP 항원과 선택된 쌍의 검출 감도. 세 쌍의 LFIA, <Pair 1> 75E12(PC)-54G6/54G10(PD), <Pair 2> 79C12(PC)-54G6/54G10(PD) 및 <Pair 3> 66E10(PC)-54G6/54G1(PD)는 연속 희석된 재조합 NP 항원을 사용하여 테스트되었다(농도 범위: 50 ng/반응 ~ 20 pg/반응). LFIA 스트립을 촬영하고 테스트 라인과 컨트롤 라인의 강도를 피크 히스토그램으로 변환했다. B) 쌍 1(빨간색), 쌍 2(파란색) 및 쌍 3(보라색)의 감도를 보여주는 막대 그래프. 삽입된 그림은 낮은 농도 범위(0.5 ng ~ 0.02 ng 항원, p-값 ns >0.05, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001)에서 검출 강도를 보여준다. C) 연속 희석된 바이러스 샘플을 사용한 선택된 쌍의 검출 감도에 대한 결과(농도 범위: 2.8 x 104 TCID50 ~ 1.4 x 103 TCID50). D) 바이러스 샘플의 검출 감도를 보여주는 막대 그래프. 삽입된 그림은 저농도 범위(SARS-CoV-2의 5.6 x 103 TCID50 ~ 1.4 x 103 TCID50, p-값 ns >0.05, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001)에서 검출 강도를 보여준다. 컷오프 값(cutoff value, C.O.V.)은 항원 부재 시 라인 강도의 평균값에 표준 편차의 3배를 더한 값으로 계산되었다.
도 12는 LIFA의 임상 평가 방법 및 결과를 나타낸 것이다. A) 새로 개발된 샌드위치 쌍이 있는 LFIA에 대한 실험실 확인 절차 계획. COVID-19 환자의 비인두 면봉을 UTM에 넣고 러닝 버퍼와 1:1(v/v) 비율로 혼합했다. 100 μL 부피의 혼합 용액을 LFIA에 로딩하고 15분 후 임상 시료 내 SARS-CoV-2 NP 항원의 존재를 육안 및 휴대용 라인 분석기로 확인하였다. B) COVID-19 환자의 임상검체에 대한 검출민감도 결과. 쌍 1의 LFIA는 COVID-19 환자의 10개 임상 표본에서 SARS-CoV-2 NP 항원을 검출했다. C) 쌍 1 및 쌍 2에 대한 임상 평가 결과의 도트 그래프. C.O.V. 건강한 기증자의 선 강도의 평균값에 표준편차의 3배를 더한 값으로 계산했다. D) 임상 샘플을 사용한 RT-qPCR과 비교한 쌍 1 기반 LFIA에 대한 실험실 확인 결과(위)와 COVID-19 환자 표본의 바이러스 부하(아래). COVID-19 환자(n = 10)와 건강한 기증자(n = 5)의 비인두 면봉 샘플을 LFIA 및 RT-qPCR로 테스트했다. RT-qPCR은 SARS-CoV-2 특이적 유전자(N-gene)를 검출하기 위한 특이적 프라이머-프로브 세트로 수행되었으며, 표준 SARS-CoV-2 RNA에서 얻은 N-유전자 앰플리콘 표준 곡선을 사용하여 임상 시료의 바이러스 부하를 조사했다. E) 인간 코로나바이러스(OC32 및 229E) 및 인간 파라인플루엔자 바이러스 1(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV-3), 인간 아데노바이러스 7a(아데노 7a), 인간 리노바이러스 1B와 같은 기타 호흡기 병원체를 사용한 특이성 분석 (리노바이러스 1b), 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 결핵균(MTB). 대조군 바이러스 샘플의 농도는 106 TCID50/반응(OC43의 경우 5 × 105 TCID50/반응)이었다.
도 13은 쌍 2 기반 LFIA의 감지 감도 결과를 나타낸 것이다. 코로나19 환자의 임상 검체 10개를 검사했다. 쌍 2 기반 LFIA는 8/10 환자 표본을 감지했지만 환자 번호 7 및 10의 표본은 감지하지 못했다.
도 14는 건강한 기증자의 음성 샘플을 사용하여 쌍 1 및 쌍 2 기반 LFIA 결과를 나타낸 것이다(n = 5). 쌍 1 및 쌍 2 기반 LFIA 모두에 대해 건강한 기증자의 표본에 대한 위양성 신호는 없었다.
도 15는 COVID-19 환자(n = 10)와 건강한 기증자(n = 5)의 비인두 면봉을 사용한 RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 것이다. RT-qPCR은 SARS-CoV-2의 특정 유전자(N-유전자)를 증폭하기 위해 특정 프라이머-프로브 세트로 수행되었다.
도 16은 쌍 1 및 쌍 2 기반 LFIA의 특이성 분석 결과를 나타낸 것이다. LFIA 특이성 검사 결과 대표 이미지. 인간 파라인플루엔자 바이러스 1(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV-3), 인간 아데노바이러스 7a(아데노 7a), 인간 리노바이러스 1B(리노바이러스 1b), 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 결핵균(MTB)을 포함한 두 개의 인간 코로나바이러스(OC43 및 229E) 및 기타 호흡기 병원체를 테스트했다. 대조 바이러스 샘플의 농도는 106 TCID50/반응(OC43의 경우 5 × 105 TCID50/반응)이었다.
도 2는 SARS-CoV-2 NP-특이적인 항체 생산의 전체적인 모식도를 나타낸 것이다. 선택된 5가지 펩타이드(NP 1, NP 1-1, NP 2, NP3, NP 4) 각각으로 마우스를 면역시킨 후 항체를 분비하는 형질세포를 분리하고 골수종과 융합하여 하이브리도마를 생성하였다. 하이브리도마 세포를 선택적으로 배양하고 ELISA(1차) 및 LFA(2차)로 스크리닝하였다. 선택된 하이브리도마 세포를 마우스 복강에 주입하였다. 14일 후, 생성된 항체를 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 7개의 모노클로날 항체(54F10, 54G6, 54G10, 54H2, 66E10, 79C12 및 75E12)가 최종적으로 수득되었다.
도 3은 측면 유동 면역 분석법(LFIA)을 사용한 SARS-CoV-2 NP 항원 검출을 나타낸 것이다. LFIA는 샘플 패드, 접합체 패드, 니트로셀룰로오스 멤브레인 및 흡수 패드로 구성된다. Conjugate pad는 CNB-conjugated SARS-CoV2 NP 특이적인 항체와 닭의 IgY 항체를 포함하고 있으며, 각각 테스트 라인과 컨트롤 라인의 신호 분자로 사용된다. 환자의 비인두 면봉에서 추출한 SARS-CoV-2 NP 항원을 LFIA에 로딩하고 샘플은 모세관력을 통해 LFIA를 통과한다. 샘플 로딩 15분 후 테스트 라인에서 SARS-CoV-2 NP가 감지되어 빨간색 라인이 표시된다. SARS-CoV-2 NP 항원의 검출은 육안 또는 반정량적으로 확인할 수 있다.
도 4는 SARS-CoV-2 바이러스 구성 요소의 개략도를 나타낸 것이다. NP(청록색)는 나선형 캡시드 구조의 단일 가닥 RNA(주황색)에 결합하여 바이러스 게놈을 패키징하는 데 중요한 역할을 한다.
도 5는 SARS-CoV-2 NP 항원과 SARS-CoV NP 및 MERS-CoV NP의 서열 정렬을 나타낸 것이다. SARS-CoV2 NP는 SARS-CoV(~90% 동일성) 및 MERS-CoV(~50% 동일성)의 NP와 높은 서열 상동성을 공유한다. 서열 특이성을 갖는 5개의 SARS-CoV-2-특이적 펩티드가 항원 결정기로 선택되었다.
도 6은 간접 LFIA를 사용한 2차 선별 결과를 보여주는 막대 그래프를 나타낸 것이다. SARS-CoV-2, SARS-CoV 및 MERS-CoV의 세 가지 다른 NP가 니트로셀룰로오스 막에 미리 고정되었습니다. 항체가 항원에 결합하는 능력은 특정 항체를 포함하는 하이브리도마로부터 미리 고정된 항원에 배양액을 흐르게 함으로써 평가하였다.
도 7은 SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 단클론 항체의 생물층 간섭계(BLI) 결과를 나타낸 것이다. BLI 기술을 사용하여 항체-NP 항원 결합 이벤트로 인한 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 실시간 바인딩 센서그램은 점선으로 표시되고 피팅 곡선은 실선으로 표시됩니다. i) 54F10(빨간색), ii) 54G6(파란색), iii) 54G10(녹색), iv) 54H2(주황색), v) 66E10(보라색), vi) 79C12(분홍색) 및 vii) 75E12(노란색). 54F10, 54G6, 54H2, 66E10, 79C12 및 75E12 단일클론항체는 항원성 결정인자로서 NP4 펩티드로부터 생성되었고, 54G10은 항원성 펩티드 NP1 또는 NP 1-1로부터 유래되었다. 결합 상수는 1:1 결합 모델을 기반으로 한 피팅 곡선에서 계산되었습니다.
도 8은 항원성 펩타이드에 대한 모노클로날 항체의 생물층 간섭계(BLI) 결과를 나타낸 것이다. A) 항체 결합에 기반한 BLI 측정 원리의 개략도. B-D) 단일클론 항체와 항원성 펩타이드 간의 결합 이벤트로 인한 결합 및 해리 곡선. 실시간 바인딩 센서그램은 점선으로 표시되고 피팅 곡선은 실선으로 표시된다. 결합 상수는 1:1 결합 모델을 기반으로 한 피팅 곡선에서 계산되었다.
도 9는 SARS-CoV-2 NP 항원 검출을 위한 최적의 샌드위치 쌍 발견 결과를 나타낸 것이다. A) 7가지 유형의 캡처 및 감지 프로브로 구성된 LFIA의 개략도. 7가지 유형의 단일클론항체로부터 얻은 총 42쌍을 평가하였다. B) 각 샌드위치 쌍 및 표적 항원에 대한 테스트 라인 강도를 보여주는 막대 그래프. 각 쌍은 SARS-CoV-2(빨간색), SARS-CoV(검정색) 및 MERS-CoV(주황색)의 50ng NP 항원으로 감지 민감도와 특이성을 평가했다. PC, 캡처 프로브; PD, 탐지 프로브. 막대 위의 빨간색 표시는 SARS-CoV-2 NP 검출을 위해 선택된 최적의 쌍을 나타낸다. C) 각 샌드위치 쌍에 대한 정규화된 라인 강도의 히트맵. 라인 강도는 표적 항원의 부재에 대해 정규화된다. SARS-CoV-2 NP 항원을 검출하기 위해 6개의 샌드위치 쌍(회색 상자에 표시)이 최종적으로 선택되었다. D) 6개의 선택된 쌍 각각에 대한 LFIA 결과의 대표적인 이미지.
도 10은 54G6과 54G10의 혼합 비율을 조정하여 검출 프로브의 최적화 결과를 나타낸 것이다. 검출 감도를 향상시키기 위해 선택된 검출 프로브(54G6 및 54G10)를 혼합하여 검출 프로브를 최적화했다. 50 ng의 재조합 SARS-CoV-2 항원과 2.8×104 TCID50의 비활성화된 바이러스 샘플을 사용하여 5가지 다른 혼합 비율을 평가했다. 2:8(v/v) 비율은 검출 프로브에 대한 최적의 혼합 비율로 확인되었다.
도 11은 최적의 샌드위치 쌍의 감도를 나타낸 것이다. A) 재조합 SARS-CoV-2 NP 항원과 선택된 쌍의 검출 감도. 세 쌍의 LFIA, <Pair 1> 75E12(PC)-54G6/54G10(PD), <Pair 2> 79C12(PC)-54G6/54G10(PD) 및 <Pair 3> 66E10(PC)-54G6/54G1(PD)는 연속 희석된 재조합 NP 항원을 사용하여 테스트되었다(농도 범위: 50 ng/반응 ~ 20 pg/반응). LFIA 스트립을 촬영하고 테스트 라인과 컨트롤 라인의 강도를 피크 히스토그램으로 변환했다. B) 쌍 1(빨간색), 쌍 2(파란색) 및 쌍 3(보라색)의 감도를 보여주는 막대 그래프. 삽입된 그림은 낮은 농도 범위(0.5 ng ~ 0.02 ng 항원, p-값 ns >0.05, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001)에서 검출 강도를 보여준다. C) 연속 희석된 바이러스 샘플을 사용한 선택된 쌍의 검출 감도에 대한 결과(농도 범위: 2.8 x 104 TCID50 ~ 1.4 x 103 TCID50). D) 바이러스 샘플의 검출 감도를 보여주는 막대 그래프. 삽입된 그림은 저농도 범위(SARS-CoV-2의 5.6 x 103 TCID50 ~ 1.4 x 103 TCID50, p-값 ns >0.05, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001)에서 검출 강도를 보여준다. 컷오프 값(cutoff value, C.O.V.)은 항원 부재 시 라인 강도의 평균값에 표준 편차의 3배를 더한 값으로 계산되었다.
도 12는 LIFA의 임상 평가 방법 및 결과를 나타낸 것이다. A) 새로 개발된 샌드위치 쌍이 있는 LFIA에 대한 실험실 확인 절차 계획. COVID-19 환자의 비인두 면봉을 UTM에 넣고 러닝 버퍼와 1:1(v/v) 비율로 혼합했다. 100 μL 부피의 혼합 용액을 LFIA에 로딩하고 15분 후 임상 시료 내 SARS-CoV-2 NP 항원의 존재를 육안 및 휴대용 라인 분석기로 확인하였다. B) COVID-19 환자의 임상검체에 대한 검출민감도 결과. 쌍 1의 LFIA는 COVID-19 환자의 10개 임상 표본에서 SARS-CoV-2 NP 항원을 검출했다. C) 쌍 1 및 쌍 2에 대한 임상 평가 결과의 도트 그래프. C.O.V. 건강한 기증자의 선 강도의 평균값에 표준편차의 3배를 더한 값으로 계산했다. D) 임상 샘플을 사용한 RT-qPCR과 비교한 쌍 1 기반 LFIA에 대한 실험실 확인 결과(위)와 COVID-19 환자 표본의 바이러스 부하(아래). COVID-19 환자(n = 10)와 건강한 기증자(n = 5)의 비인두 면봉 샘플을 LFIA 및 RT-qPCR로 테스트했다. RT-qPCR은 SARS-CoV-2 특이적 유전자(N-gene)를 검출하기 위한 특이적 프라이머-프로브 세트로 수행되었으며, 표준 SARS-CoV-2 RNA에서 얻은 N-유전자 앰플리콘 표준 곡선을 사용하여 임상 시료의 바이러스 부하를 조사했다. E) 인간 코로나바이러스(OC32 및 229E) 및 인간 파라인플루엔자 바이러스 1(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV-3), 인간 아데노바이러스 7a(아데노 7a), 인간 리노바이러스 1B와 같은 기타 호흡기 병원체를 사용한 특이성 분석 (리노바이러스 1b), 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 결핵균(MTB). 대조군 바이러스 샘플의 농도는 106 TCID50/반응(OC43의 경우 5 × 105 TCID50/반응)이었다.
도 13은 쌍 2 기반 LFIA의 감지 감도 결과를 나타낸 것이다. 코로나19 환자의 임상 검체 10개를 검사했다. 쌍 2 기반 LFIA는 8/10 환자 표본을 감지했지만 환자 번호 7 및 10의 표본은 감지하지 못했다.
도 14는 건강한 기증자의 음성 샘플을 사용하여 쌍 1 및 쌍 2 기반 LFIA 결과를 나타낸 것이다(n = 5). 쌍 1 및 쌍 2 기반 LFIA 모두에 대해 건강한 기증자의 표본에 대한 위양성 신호는 없었다.
도 15는 COVID-19 환자(n = 10)와 건강한 기증자(n = 5)의 비인두 면봉을 사용한 RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 것이다. RT-qPCR은 SARS-CoV-2의 특정 유전자(N-유전자)를 증폭하기 위해 특정 프라이머-프로브 세트로 수행되었다.
도 16은 쌍 1 및 쌍 2 기반 LFIA의 특이성 분석 결과를 나타낸 것이다. LFIA 특이성 검사 결과 대표 이미지. 인간 파라인플루엔자 바이러스 1(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV-3), 인간 아데노바이러스 7a(아데노 7a), 인간 리노바이러스 1B(리노바이러스 1b), 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 및 결핵균(MTB)을 포함한 두 개의 인간 코로나바이러스(OC43 및 229E) 및 기타 호흡기 병원체를 테스트했다. 대조 바이러스 샘플의 농도는 106 TCID50/반응(OC43의 경우 5 × 105 TCID50/반응)이었다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
실시예
1. 항원성 펩타이드의 디자인 및 합성
SARS-CoV-2 NP(UniProtKB/Swiss-Prot: P0DTC9), SARS-CoV NP(UniProtKB/Swiss-Prot: P59595) 및 MERS-CoV NP(UniProtKB/Swiss-Prot: K9N4V7)의 아미노산 서열을 UniProt 지식 베이스(https://www.uniprot.org/uniprot/)에서 다운로드했다. SARS-CoV-2 NP의 아미노산 서열은 상용 소프트웨어(UniProt UGENE, Novosibirsk, Russia)를 사용하여 SARS-CoV 및 MERS-CoV의 해당 아미노산 서열과 정렬되었다. SARS-CoV-2-특이 아미노산 서열을 포함하는 후보 항원 펩타이드는 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 리소스를 사용하여 친수성, 소수성, 베타 턴 구조 및 표면 접근성을 포함한 항원 특성에 대해 추가 평가되었다(National Institute of Allergy and Infectious Disease, MD, USA). 서열 특이성 및 펩티드 항원성에 기초하여 5개의 상이한 항원성 펩티드가 선택되었다: SARS-CoV-2 NP1, N-SDSTGSNQNGERSGARSKQR-C; SARS-CoV-2 NP1-1, N-NGERSGARSKQR-C; SARS-CoV-2 NP2, N-RMAGNGGDAA-C; SARS-CoV-2 NP3, N-KADETQALPQR-C; 및 SARS-CoV-2 NP4, N-LDDFSKQLQQSMSSA-C(도 1A, 그림 S2). 5개의 항원성 펩타이드는 Abclon(서울, 한국)에 의해 합성되었고 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법으로 분석되었다.
실시예
2. 면역화 및 항체 생산
합성 펩타이드 항원(100 ㎍)을 Freund's adjuvant(Sigma, Cat. No. F5506)와 혼합하여 BALB/c 마우스(DBL Co., Ltd., Korea)에 복강내 주사하였다. 2주 후 각 항원 100 ㎍을 PBS(phosphate-buffered saline)에 희석하여 다시 주사하고 3일 후 마우스 비장을 적출하여 림프구를 분리하였다. 분리된 림프구를 골수종 세포주 SP2/0-Ag14(ATCC, Cat. No. CRL-1581)와 5:1 비율로 혼합하였고 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-1500(Roche, Cat. No. 783641)을 사용하여 융합시켰다. 융합된 세포를 HAT 보충제(Sigma, Cat. No. H0262)가 포함된 배지에서 배양하고, 융합된 세포(하이브리도마)를 선택적으로 선별하여 배양하였다. 생성된 하이브리도마 세포를 ELISA로 검사하여 항원에 결합하는 항체를 생산하는지 여부를 결정하였다. 각각의 SARS-CoV-2 NP 펩타이드-Fc 또는 ChromPure 인간 IgG(hIgG, Jackson Immunoresearch Lab. Inc., Cat. No. 009-000-003)를 96웰 플레이트(Corning, Cat. 3590) 1 ㎍/mL의 농도에서 1시간 동안. 플레이트를 0.05% Triton X-100(TBS-T)으로 3회 세척하고 실온에서 300 mL의 2% 탈지유(TBS-T/SM)로 30분 동안 차단했다. 차단된 플레이트를 3회 세척하고 하이브리도마 배양액을 첨가하고 항체를 37℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 3회 세척한 후, 이차 항체 항-마우스 IgG-HRP(Pierce, Cat. No. 31439)를 1:5,000 비율로 TBS-T/SM에 희석하고 37℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 3회 세척 후 TMB(SurModics, Cat. No. TMBC-1000-01)를 첨가하고, 상온에서 5분간 발색하고, 1 M 황산(DukSan, Cat. No. 254)을 첨가하여 발색을 정지시켰다. 흡광도는 Victor X3 기기(PerkinElmer, Cat. No. 2030-0030)를 사용하여 450 nm에서 측정하였고, SARS-CoV-2 NP 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였다.
| ID (아미노산) | VL_CDR1 | VL_CDR2 | VL_CDR3 |
| 54G6 | KSSQSLLNSRTRKNHLA (서열번호 1) |
WASTKDS (서열번호 2) |
KQSYNLFT (서열번호 3) |
| 54G10 | KASQSVSNDVA (서열번호 7) |
SASNRYT (서열번호 8) |
QQDYSSPLT (서열번호 9) |
| 75E12 | KSSQSLLYSSNQKNYLA (서열번호 13) |
WASTRES (서열번호 14) |
QQYYTYPRT (서열번호 15) |
| 79C12 | KSSQSLLYSSNQKNYLA (서열번호 19) |
WASTRDS (서열번호 20) |
QQYYSYPRT (서열번호 21) |
| ID (아미노산) | VH_CDR1 | VH_CDR2 | VH_CDR3 |
| 54G6 | DYWMN (서열번호 4) |
EIRLKSNNYATHYAESVKG (서열번호 5) |
YAMDY (서열번호 6) |
| 54G10 | TSGMG (서열번호 10) |
HIWWDDVKRYNPALKS (서열번호 11) |
YYRYDVR (서열번호 12) |
| 75E12 | DYWMN (서열번호 16) |
EIRLKSNNYATHYAESVKG (서열번호 17) |
SAMDY (서열번호 18) |
| 79C12 | DYWMN (서열번호 22) |
EIRLKSNNYATHYAESVKG (서열번호 23) |
AAMDY (서열번호 24) |
| ID (아미노산) | VL | VH |
| 54G6 | GIVMTQSPSSLAVSPGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNHLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTKDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGSGTKLEIK (서열번호 25) |
EVQGVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVGEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSIHLQMNNLRAEDTGIYYCTRYAMDYWGQGTTVTVSS (서열번호 26) |
| 54G10 | DIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPTLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLELK (서열번호 27) |
EVTLKVCGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSSSQVFLKIASVDTADTATYYCARYYRYDVRWGQGTLVTVSA (서열번호 28) |
| 75E12 | DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMNCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLALYYCQQYYTYPRTFGGGTKLEIK (서열번호 29) |
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRSAMDYWGQGTSVTVSS (서열번호 30) |
| 79C12 | DIQMIQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPRTFGGGTKLELK (서열번호 31) |
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRAAMDYWGQGTSVTVSS (서열번호 32) |
| ID (핵산) | VL | VH |
| 54G6 | GGTATTGTAATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCACCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACCACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAAGGATTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA | GAGGTGCAGGGGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTCGGTGAAATCAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTATCCACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACTAGGTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA |
| 54G10 | GATATTGTGATGACCCAAACTCCCAAATTCCTGCTTGTATCAGCAGGAGACAGGGTTACCATAACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGAGTAATGATGTAGCTTGGTACCAACAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTGATATACTCTGCATCCAATCGCTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATATGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCACTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGGATTATAGCTCTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA | GAGGTTACTCTAAAAGTGTGTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCATCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGTCAAGCGCTATAACCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACTATCTCCAAGGATACCTCCAGCAGCCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGCTACTATAGGTACGACGTCCGCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA |
| 75E12 | GATATTGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAACTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAGCTGCTGATTTTCTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAATATTATACCTATCCTCGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAAATAAAA | GAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGAGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA |
| 75C12 | GATATTCAGATGATACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGACTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCTCGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA | GAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGGCGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA |
실시예
3. Biolayer interferometry (BLI)
SARS-CoV-2 NP 항원과 단클론항체(7개의 다른 단일클론항체: 54F10, 54G6, 54G10, 54H2, 66E10, 75E12, 및 79C12) 사이의 결합 친화도는 BLITz 기기(ForteBio, CA, USA)를 사용하여 BLI로 분석되었다. 폴리히스티딘 태그가 붙은 재조합 SARS-CoV-2 NP 항원(Cat. No. 40588-V08B)은 Sino Biological(Beijing, China)에서 구입했다. BLI는 10분 동안 니켈 코팅된 NTA 바이오센서(ForteBio, Part No. 18-5102)를 수화하여 시작되었다. 수화 후, BLI는 초기 기준선(20초), 항원 고정화(300초), 두 번째 기준선(120초), 항체 결합(300초) 및 해리(300초)의 5단계에 걸쳐 수행되었다. 기준선 및 해리 단계는 0.05% 아지드화 나트륨(pH 7.4)이 포함된 10 mM PBS에 0.02% Tween 20, 150 mM NaCl 및 1 mg/mL 소혈청 알부민(BSA)을 포함하는 샘플 희석 완충액을 사용하여 수행했다. 폴리히스티딘 태그가 붙은 SARS-CoV-2 NP 항원(100 ㎍/mL)을 먼저 항원 고정을 위해 NTA 바이오센서 표면에 로드했다. 두 번째 베이스라인 단계에서 잔류 항원을 제거한 후, 항체를 로딩하여 항원과 항체 간의 특이적 상호작용을 평가하였다. 4가지 다른 농축액(100 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 25 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL)의 항체를 사용하여 항체 농도가 결합-해리 패턴에 미치는 영향을 분석했다. 결합 상수는 1:1 결합 모델을 기반으로 생성된 4개의 결합-해리 곡선으로부터 계산되었다.
실시예
4. 측면 유동 면역 분석(lateral flow immunoassay, LFIA) 장치의 제작
LFIA 장치는 도 3과 같이 샘플 패드(Ahlstrom, Helsinki, Finland), 접합 패드(Ahlstrom), 니트로셀룰로오스 멤브레인(PALL Corporation, New York, USA) 및 흡수 패드(Ahlstrom)로 구성되었다. 포획항체(66E10, 75E12, 79C12)와 항닭 IgY 항체(보레다바이오텍, 성남, 한국, Cat. No. 23000)를 시험주와 대조군으로 각각 사용하였다. 포획 항체(0.5 mg/mL) 및 항-닭 IgY 항체(0.5 mg/mL)를 라인 디스펜서(BTM Inc., 의왕, 한국)를 사용하여 50 mm/s의 분배 속도 및 0.5 μL/cm의 분배율로 니트로셀룰로오스 막에서 이동시켰다. 진공오븐(FDU-1200, EYELA, Tokyo, Japan; JSVO-30T, JSR, Gongju, Korea)에서 37℃로 1시간 동안 건조시킨 후, 니트로셀룰로오스 막을 차단 용액(10mM 2-amino- 2-메틸-1-프로판올 pH 9.0, 0.5% BSA, 0.5% β-락토스, 0.05% Triton X-100, 0.05% 아지드화나트륨)에서 반응하였고, 진공 오븐(37°C)에서 추가로 인큐베이션했다. 인산나트륨 완충액(5mM, pH 7.5)으로 3회 세척한 후 니트로셀룰로오스 막을 37℃ 오븐에서 1시간 동안 건조시킨 후 데시케이터에 보관하였다.
접합체 패드에는 표적 검출을 위한 고유한 색상을 표시하는 신호 분자가 포함되어 있다. 두 가지 색상의 셀룰로오스 나노비드(CNB)를 Asahi Kasei Fibers Corporation(NanoAct, Miyazaki, Japan, Cat. No. RE2AA[red]/BL1AA[blue])에서 구입하여 신호 분자로 사용했다. CNB에 대한 항체 접합은 제조업체의 지침에 따라 CNB 접합 키트(DCN Diagnostics, CA, USA, Cat. No. CKNB-010)를 사용하여 수행되었다. 자세한 접합 방법은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상적인 방법(한국공개특허 제2021-0133846호 등)에서 제시되었다. 검출 항체 54G6 및 54G10은 NP 항원을 검출하고 테스트 라인에서 포획 항체와 샌드위치 복합체를 형성하기 위해 사용되었다. 탐지 성능을 향상시키기 위해 CNB로 라벨링된 54G10과 CNB로 라벨링된 54G6의 4:1(v/v) 혼합물을 사용했다. LFIA 스트립의 각 구성 요소는 정확하게 조립되고 38mm 너비로 절단된 다음 하우징에 통합되었다.
실시예
5. SARS-CoV-2 NP 항원을 검출하기 위한 샌드위치 쌍의 스크리닝
7개의 단일클론항체(54F10, 54G6, 54G10, 54H2, 66E10, 79C12 및 75E12)에서 얻은 42개의 샌드위치 쌍을 테스트하여 SARS-CoV-2 NP 항원을 검출하기 위한 최적의 쌍을 식별했다. 각각의 단일클론 항체는 포획(니트로셀룰로오스 막, PC에 고정) 및 검출(CNB, PD로 표지됨) 프로브에 적용되었다. SARS-CoV-2 NP(Cat. No. 40588-V08B), SARS-CoV NP(Cat. No. 40143-V08B) 및 MERS-CoV NP(Cat. No. 40068V08B)는 Sino Biological(Beijing, 중국)에서 구입하였다. SARS-CoV NP 및 MERS-CoV NP는 샌드위치 쌍의 특이성 평가를 위한 음성 대조군으로 사용되었다. 각 표적 항원(50 ng)을 샘플 실행 완충액(Borex, 5mM EDTA, 200mM urea, 1% Triton X-100, 0.5% Tween 20, 500mM NaCl, 1% PEG-200)에 스파이킹하였고, 항원을 포함하는 100 μL 샘플을 LFIA 장치에 로드했다. 시료 로딩 15분 후 테스트 라인을 스마트폰으로 촬영하였고 Light G 휴대용 라인 분석기(WellsBio, Seoul, Korea)로 강도를 측정하였다.
PD의 혼합 비율은 검출 감도를 향상시키기 위해 더욱 최적화되었다. 5가지 다른 혼합 비율로 54G6(10):54G10(0), 54G6(8):54G10(2), 54G6(5):54G10(5), 54G6(2):54G10(8) 및 54G6(0):54G10(10)이 테스트되었으며 54G6(2):54G10(8) 비율이 선택되었다. 최적화는 3가지 조건(완충액만, 50 ng SARS-CoV-2 NP 및 2.8×104 TCID50에서 비활성화된 SARS-CoV-2)으로 평가하였으며, PC로는 79C12 단클론항체를 사용하였다. 최상의 성능을 달성하는 세 가지 최적의 쌍이 최종적으로 선택되었다. 쌍 1, 75E12(PC)-54G6(2)/54G10(8)(PD); 쌍 2, 79C12(PC)-54G6(2)/54G10(8)(PD); 쌍 3, 66E10(PC)-54G6(2)/54G10(8)(PD).
실시예
6. 재조합 항원 및 바이러스 샘플을 사용한 LFIA 검출 한계(limit of detection, LOD) 결정
선택된 쌍을 기반으로 한 LFIA의 민감도를 분석하기 위해 연속 희석된 재조합 SARS-CoV-2 NP 항원과 γ-조사된 불활성화 SARS-CoV-2(BEI Resources, VA, USA, Cat. No. NR-52287)를 사용했다. 희석된 SARS-CoV-2 NP 항원과 비활성화된 SARS-CoV-2의 최종 농도는 각각 500 ng/mL ~ 200 pg/mL, 2.8X x 104 TCID50/반응 내지 1.4 x 103 TCID50/반응 범위였다. 희석된 샘플을 1:9(v/v)의 비율로 러닝 버퍼(Borex, 5 mM EDTA, 200 mM urea, 1% Triton X-100, 0.5% Tween 20, 500 mM NaCl, 1% PEG-200)로 혼합하였다. 다양한 농도의 표적을 포함하는 러닝 버퍼(100 μL)를 LFIA 장치에 추가했다. 15분 후 LFIA 스트립을 촬영하였고, Light G 라인 분석기로 테스트 라인의 강도를 측정하였다. 테스트 및 대조(control) 라인은 신호 정확도를 확인하기 위해 Sapphire Biomolecular imager(Azure Biosystems, CA, USA)로 추가 분석되었다.
실시예 7. 임상 시료를 사용하여 실험실 조건에서 확인
COVID-19 환자의 UTM(Universal Transport Media)에 들어 있는 비인두 면봉 샘플은 전북대학교 병원(한국)에서 친절하게 제공되었다. COVID-19 환자의 임상 검체는 전북대학교병원 기관심사위원회(IRB)가 승인한 등록 프로토콜에 따라 채취했다. 모든 환자는 서면 동의서를 제공했다(IRB 등록 번호: CUH2021-06-036-002). 건강한 기증자의 비인두 면봉을 LEE Biosolutions(MO, USA, Cat. No. 991-31-NC)에서 구입하여 UTM(Noble Bio, Korea, Cat. No. UTNFS-3B-1)에 현탁시켰다. COVID-19 환자 및 건강한 기증자에 대한 자세한 정보는 표 1에 나와 있다. 환자 및 기증자의 면봉 샘플을 LFIA 실행 완충액과 1:1(v/v) 비율로 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양한 후 혼합물 100 μL를 LFIA 장치의 임상 평가에 사용했다. 시료 로딩 15분 후 육안으로 COVID-19 감염 결과를 확인했으며, 휴대용 분석기로 테스트 라인의 강도를 추가로 분석했다. 또한 LFIA 장치와 진단 성능을 비교하기 위해 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 수행했다. 본 발명자의 이전 연구(ACS Infect Dis. 2020 Sep 11;6(9):2513-2523)에서 확인된 특정 프라이머-프로브 세트를 사용하여 SARS-CoV-2 특정 NP 유전자(N-gene)를 증폭하고 역전사(55°C에서 10분) 및 증폭하여 검출했다. 45 사이클(10초 동안 95°C, 30초 동안 60°C). RT-qPCR(Ct 값 및 실시간 증폭 곡선) 결과는 CFX 96 Touch Real-Time PCR System(Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 분석되었다. 임상 검체 내 바이러스 양의 정량은 한국표준과학연구원(KRISS, 대전, 한국, Cat. No. 111-10-506)에서 구입한 SARS-CoV-2 RNA 표준물질을 사용하여 수행하였다.
| Sample ID | Age | Gender | Matrix | Date of hospital admission | |
| COVID-19 Patient | P1 | 54 | Male | Nasopharyngeal swab | 2020.12.08 |
| P2 | 59 | Femmale | Nasopharyngeal swab | 2020.12.18 | |
| P3 | 33 | Femmale | Nasopharyngeal swab | 2020.12.19 | |
| P4 | 67 | Male | Nasopharyngeal swab | 2020.12.24 | |
| P5 | 61 | Femmale | Nasopharyngeal swab | 2020.12.24 | |
| P6 | 44 | Femmale | Nasopharyngeal swab | 2021.02.13 | |
| P7 | 83 | Male | Nasopharyngeal swab | 2021.02.16 | |
| P8 | 78/ | Femmale | Nasopharyngeal swab | 2021.02.16 | |
| P9 | 35 | Femmale | Nasopharyngeal swab | 2021.02.26 | |
| P10 | 30 | Femmale | Nasopharyngeal swab | 2021.02.28 | |
| Healthy controls | N1 | 59 | Femmale | Nasopharyngeal swab | - |
| N2 | 47 | Male | Nasopharyngeal swab | - | |
| N3 | 63 | Femmale | Nasopharyngeal swab | - | |
| N4 | 29 | Male | Nasopharyngeal swab | - | |
| N5 | 41 | Male | Nasopharyngeal swab | - |
또한, 인간 코로나바이러스 및 기타 호흡기 병원체를 사용하여 LFIA 장치의 특이성 분석을 수행했다. 인간 코로나바이러스 OC43(OC43, ATCC No. VR-1558), 인간 코로나바이러스 229E(229E, ATCC No. VR-740), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1(HPIV-1, ATCC No. VR-94), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3(HPIV-3, ATCC No. VR-93), 인간 아데노바이러스 7a(Adeno 7a, ATCC No. VR-848), 인간 리노바이러스 1B(Rhinovirus 1b, ATCC No. VR-1645), 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV, ATCC No. VR-1580) 및 Mycobacterium tuberculosis(MTB, ATCC No. 25177)는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. 사람 인플루엔자 A 바이러스 H1N1(인플루엔자 A, KBPV-VR-33) 및 사람 인플루엔자 B 바이러스(인플루엔자 B, KBPV-VR-34)는 한국병원성바이러스은행(서울, 한국)에서 구입했다. 대조군 바이러스 샘플은 러닝 버퍼에서 106 TCID50/반응으로 희석되었다(OC43은 5 × 105 TCID50/반응으로 희석). MTB 샘플을 런닝 버퍼로 2배 희석하고 특이성 테스트에 사용했다(MTB의 정확한 농도는 불명).
실험예
1. NP 항원의 짧은 보존 펩타이드에서 유래한 SARS-CoV-2 NP 특이적 단클론항체 개발
NP는 바이러스 게놈 RNA를 패키징하는 데 중요한 역할을 하는 바이러스 항원이다(도 4). SARS-CoV-2 NP는 바이러스 감염 동안 풍부하게 발현되며 면역원성이 높다. 따라서 SARS-CoV-2의 진단 항원에 대한 이상적인 표적으로 간주된다. 그러나 SARS-CoV-2 NP는 다른 코로나바이러스의 NP와 서열 상동성을 공유한다(SARS-CoV NP와 ~90% 동일성 및 MERS-CoV NP와 ~50% 동일성, 도 5). 서열 상동성은 다른 NP와의 교차 반응성 문제로 이어져 정확한 SARS-CoV-2 진단을 방해한다. 이러한 단점을 극복하기 위해 본 발명에서는 항체 생산의 항원 결정인자로서 SARS-CoV NP 및 MERS NP와 다른 서열을 갖는 SARS-CoV-2 NP의 특정 짧은 펩티드를 조사했다(도 1A): 아미노산(aa) 잔기 21-40을 포함하는 NP 1, NP 1-1(aa 29-40), NP 2(aa 209-218), NP 3(aa 375-385), NP 4(aa 399-416). 또한, 3개의 펩티드(NP 1, NP 1-1 및 NP 4)는 SARS-CoV-2 NP에 축적된 돌연변이와 함께 고도로 보존된 서열을 공유했다(도 1B).
도 2는 SARS-CoV-2 NP-특이적 항체 생산의 전체 도식을 나타낸다. 간단히 말해서, 각각의 선택된 펩타이드(NP 1, NP 1-1, NP 2, NP 3, NP4)로 마우스를 면역시킨 후, 혈청을 수집하고, 항체 역가를 ELISA로 확인하였다. 펩타이드 항원으로 면역시킨 마우스에서 비장 조직을 적출하고 B 림프구를 분리하여 골수종 세포 융합을 수행하였다. 생성된 하이브리도마 세포를 HAT 배지에서 2주 동안 선택적으로 배양하였다. 적절한 항체를 확인하기 위해 배양 배지를 이용한 ELISA에 의한 하이브리도마의 1차 스크리닝을 수행하였다. 또한, 특정 항체를 포함하는 배양 배지를 간접 LFIA에 의해 추가로 분석하였다. SARS-CoV-2, SARS-CoV 및 MERS-CoV의 3가지 다른 NP를 니트로셀룰로오스 막에 미리 고정화하고 생성된 항체에 대한 결합 친화도를 평가했다(도 6). SARS-CoV-2 NP에 대해 높은 친화성을 나타내고 다른 NP에 결합하지 않는 특정 클론(54F10, 54G6, 54G10, 54H2, 66E10 및 79C12)은 생체 내 항체 생산을 위해 선택되었다(75E12는 나중에 추가됨). 선택된 하이브리도마 세포를 마우스 복강에 주입하였다. 14일 후 복강에서 복수를 채취하고 친화성 크로마토그래피로 항체를 정제하였다. SARS-CoV-2 NP에 대한 민감도와 특이성이 높은 7개의 다른 단일클론항체(54F10, 54G6, 54G10, 54H2, 66E10, 79C12, 75E12)가 최종적으로 획득되었다.
실험예
2. SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 단클론항체의 결합 친화력 평가
개발된 단클론항체와 SARS-CoV-2 NP 항원 사이의 특이적 상호작용은 BLI를 사용하여 조사되었으며, 이는 결합 이벤트로 인한 간섭 패턴의 차이를 기반으로 생체분자 상호작용을 측정한다. 폴리히스티딘 태그가 붙은 SARS-CoV-2 NP 항원은 먼저 니켈과 히스티딘 잔기 사이의 특정 상호작용을 통해 NTA 바이오센서 팁에 고정되었다. 다음으로, 사전 고정된 SARS-CoV-2 NP 항원에 4가지 농도의 항체를 적용하고 항원-항체 결합 이벤트로 인한 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 대표적인 실시간 바인딩 센서그램(점선)과 피팅 곡선(실선)은 도 7에 나와 있다. 바인딩 상수는 1:1 바인딩 모델을 기반으로 한 피팅 곡선에서 계산되었다. SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 단클론 항체의 KD 값은 수십에서 수백 nM의 범위였다(mAb [NP에 대한 KD 값], 54F10 = 260 nM, 54G6 = 79.6 nM, 54G10 = 406 nM, 54H2 = 8 , 66E10 = 42.2 nM, 79C12 = 52.7 nM 및 75E12 = 29.8 nM), 이는 시판되는 항체와 유사한 KD 값을 나타낸다. 이는 나노몰 범위의 KD 값을 갖는 새로 개발된 항체가 SARS-CoV-2 특이 항원을 검출할 수 있음을 시사한다.
표적 항원에 대한 각 항체의 인식 부위는 항체를 생산하기 위해 면역화된 항원 에피토프에 따라 다르다. 본 발명에서는 짧은 항원성 펩타이드를 면역화하여 단클론항체를 생산하였기 때문에, 다른 코로나바이러스와 구별되는 특이성과 돌연변이 SARS-CoV-2에 대한 감수성을 갖도록 항체의 인식부위를 선별할 수 있었다. 각 항체의 인식 부위를 확인하기 위해 BLI로 항체와 항원성 펩타이드 간의 결합 친화도를 측정하였다. 도 8과 같이 비오틴화된 항원성 에피토프를 스트렙타비딘 코팅된 BLI 바이오센서 팁에 고정하고 각 단일클론 항체의 4가지 농도를 적용하여 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 모노클로날 항체 54G10은 항원성 에피토프 NP 1 또는 NP 1-1에서 유래되었다. 한편, NP 4 에피토프로부터 54F10, 54G6, 54H2, 66E10, 79C12 및 75E12가 생성되었다. NP 1 및 NP 1-1에 대한 54G10 항체의 KD 값은 각각 46 nM 및 26.2 nM이었고, 이는 54G10 항체가 NP 1(또는 NP 1-1) 서열에 높은 친화도로 결합함을 나타냅니다(도 8B 및 8C). 또한 NP 1-1에 대한 결합 친화도가 NP 1보다 약간 높기 때문에 54G10의 인식 부위가 주로 NP 1-1 쪽에 위치한다고 가정하였다. 대조적으로, 다른 항체(54F10, 54G6, 54H2, 66E10, 79C12 및 75E12)는 NP 4 펩타이드(54F10, 54G6, 54H2, 66E10, 79C12, 66E10, 79C12의 KD 값)에 대해 높은 친화도를 나타내었다. 4.22 nM, 19.5 nM, 32.1 nM 및 3.66 nM), 이는 이들 항체가 강하게 결합하는 NP 4의 짧은 서열을 인식했음을 의미한다(도 8D). 본 발명에서 개발된 7개의 단클론 항체는 SARS-CoV-2 NP 항원에 대한 특정 짧은 서열을 선택적으로 인식했다. 이러한 특정 서열은 다른 코로나바이러스의 NP와 차별화되었으며 보존된 서열은 돌연변이의 영향을 받지 않았다. SARS-CoV-2 변이체가 빠르게 확산된다면 전체 항원보다 특정 펩타이드 서열을 인식하는 항체를 개발하는 것이 COVID-19 진단에 더 효과적일 수 있다.
실험예
3. SARS-CoV-2 NP 항원 검출을 위한 최적의 샌드위치 쌍 식별
LFIA를 통한 표적 항원의 민감하고 선택적 검출을 위해서는 표적 항원의 다른 영역을 인식하는 특정 항체 쌍이 필요하다. 표적 항원에 대한 최적의 쌍의 선택은 LFIA의 진단 성능을 향상시키기 위한 전제 조건이다. SARS-CoV-2 NP 검출을 위한 최적의 쌍을 찾기 위해 7종의 단클론항체로부터 얻은 42쌍의 진단 성능을 평가하였다(도 9A). 각각의 단클론항체는 포획(니트로셀룰로오스 막, PC에 고정) 및 검출(CNB, PD로 표지됨) 프로브에 적용되었고, PD로 사용되지 않은 PC와 6개의 다른 PD가 쌍을 이루었다. SARS-CoV-2 NP(50 ng), SARS-CoV NP(50 ng) 및 MERS-CoV NP(50 ng)를 표적 항원으로 사용하여 이들 쌍의 민감도와 특이성을 평가했다. 도 9B에서 보는 바와 같이 SARS-CoV-2 나노입자는 많은 쌍에서 성공적으로 검출되었으며, PC로 75E12, 79C12, 66E10, 54H2(강도순)를 사용한 경우 전체적으로 선강도가 증가하였다. 또한 54G6 및 54G10이 PD로 사용하기에 가장 적합했다. 동일한 PC를 사용하는 경우 PD로 54G10이 모든 경우에서 가장 높은 라인 강도를 표시했다(54G6 다음). 위에서 언급했듯이 54G10은 다른 항체(NP 4)와 인식 부위(NP 1 또는 NP 1-1)가 다르다. 따라서 54G10은 다른 항체와 샌드위치 복합체를 보다 효율적으로 형성할 가능성이 있다. 또한, 54G6의 인식 부위는 동일한 항원성 에피토프(NP 4)를 사용하여 생산하더라도 PC로 사용되는 다른 항체와 중복되지 않는다.
한편, MERS-CoV 나노입자 검출 시 교차반응은 없었으나, SARS-CoV 나노입자 검출 시 약한 위양성 신호가 관찰되었다. 항원 결정인자로 항체 생산을 위해 짧고 특정한 펩타이드가 사용되었지만 두 바이러스 간의 상동성이 매우 높기(~90%) 때문에 SARS-CoV-2 NP와 SARS-CoV NP를 완전히 구별할 수 없었다. 현재 SARS-CoV가 유포되는 것으로 여겨지지 않기 때문에 약한 위양성 신호는 현시점에서 큰 문제가 되지 않는다. 본 발명의 말미에 SARS-CoV-2와 유사한 증상을 보이며 전파될 수 있는 다른 대조군 바이러스와의 교차 반응성 분석을 통해 LFIA의 특이성을 더욱 확인했다.
캡처 및 감지 프로브 간의 상호 작용이 위양성 신호로 이어질 수 있으므로 기준선 수준(대상 부재)의 라인 강도는 각 쌍에 대해 다르다. 따라서, 표적 항원의 부재에 대해 라인 강도를 정규화하여 쌍의 검출 감도를 정확하게 평가했다(도 9C). 6쌍, 즉 79C12(PC)-54G10(PD), 79C12(PC)-54G6(PD), 75E12(PC)-54G10(PD), 75E12(PC)-54G6(PD), 66E10(PC)-54G10 (PD) 및 66E10(PC)-54G6(PD)는 뛰어난 검출 감도를 보여 SARS-CoV-2 검출을 위한 샌드위치 쌍으로 선택되었다. 이 중 79C12(PC)-54G10(PD) 쌍이 가장 높은 선 강도를 보였고 75E12(PC)-54G10(PD)이 그 뒤를 이었다. 이는 79C12 및 75E12가 캡처 프로브로 가장 효과적인 반면 54G10이 검출 프로브로 가장 적합함을 시사한다. 6쌍 각각에 대한 LFIA 결과의 대표적인 이미지는 도 9D에 나와 있다.
실험예
4. LFIA 감도 분석
선택된 각 쌍에 대한 LFIA는 감지 감도를 높이고 위음성 신호를 줄이기 위해 더욱 최적화되었다. 위음성 신호는 버퍼 조성, 차단 용액 및 검출 프로브의 농도를 조정하여 감소되었다. 이것은 위음성 신호를 제거하고 라인 강도 값 <50을 제공했다(최종 최적화된 실험 조건은 상기 실시예에 설명되어 있음). 한편, 검출 감도를 향상시키기 위해 선택된 검출 프로브 54G6 및 54G10을 혼합하여 검출 프로브를 최적화하였다. 이 두 항체를 동시에 검출 프로브로 사용하면 항체의 인식 부위가 다르기 때문에 검출 신호를 높일 수 있다. 54G6과 54G10의 혼합비에 따른 검출 성능의 변화를 확인하였다. 검출 성능은 50 ng의 재조합 SARS-CoV-2 항원과 2.8 × 104 TCID50의 비활성화된 바이러스 샘플로 평가되었으며 5가지 다른 혼합 비율이 테스트되었다(그림 S5). 54G6과 54G10의 혼합비가 2:8(v/v)일 때, 라인 강도는 재조합 항원과 바이러스 샘플 모두에서 가장 높았다. 따라서 2:8(v/v) 비율의 54G6과 54G10의 혼합물을 후속 민감도 분석 및 임상 평가를 위한 검출 프로브로 사용했습니다.
선택된 쌍이 있는 LFIA의 민감도는 재조합 SARS-CoV-2 NP 항원 및 비활성화된 SARS-CoV-2 바이러스 샘플로 평가되었다. 세 쌍의 LFIA, <Pair 1> 75E12(PC)-54G6/54G10(PD), <Pair 2> 79C12(PC)-54G6/54G10(PD) 및 <Pair 3> 66E10(PC)-54G6/54G1(PD)는 연속 희석된 샘플을 사용하여 테스트되었다(재조합 항원의 농도 범위 = 50 ng/반응 ~ 20 pg/반응, 불활성화된 바이러스 샘플의 경우 = 2.8 x 104 TCID50 ~ 1.4 x 103 TCID50). LFIA 장치에 샘플을 로딩한 후 15분에 테스트 및 제어 라인을 스마트폰으로 촬영하고 휴대용 라인 분석기로 분석하여 라인 강도를 측정하고 이미지 분석기를 사용하여 라인 강도를 신호 피크로 변환했다(도 11). 희석 계수가 증가함에 따라 라인 강도가 점차 감소했다. 항원(또는 바이러스) 농도 감소; 항원(또는 바이러스)이 없는 경우 위양성 신호가 없었다. 도 11B 및 D의 LOD는 음성 대조군의 평균값에 표준 편차의 3배를 더한 값으로 계산되었다. 쌍 1의 경우 낮은 농도에서도 SARS-CoV-2 NP 항원과 불활성화된 바이러스 시료가 성공적으로 검출되었다(NP 항원 = 100 pg/반응; 바이러스 시료 = 1.4 x 103 TCID50/반응). 쌍 2는 항원 검출 및 바이러스 검출 모두에 대해 쌍 1과 유사한 민감성을 나타냈다. 그러나 쌍 3의 민감도는 쌍 1과 쌍 2보다 약간 낮았다. 쌍 3으로 구성된 LFIA는 최대 500 pg의 재조합 항원과 2.8 x 103 TCID50의 바이러스를 검출할 수 있었다. 따라서 쌍 1 또는 쌍 2로 구성된 두 가지 유형의 LFIA를 임상 평가 및 교차 반응성 테스트에 적용했다.
실험예
5. LFIA 임상 평가
도 12A는 새로 개발된 SARS-CoV-2 NP 특이적 단클론항체를 사용한 LFIA의 실험실 확인 절차를 보여준다. 기존에 선정된 <Pair 1> 75E12(PC)-54G6/54G10(PD)와 <Pair 2> 79C12(PC)-54G6/54G10(PD)을 LFIA에 적용하여 임상적 평가를 하였다. COVID-19 환자의 비인두 면봉을 UTM에 철저히 혼합하고 SARS-CoV-2 NP 항원을 포함하는 UTM을 LFIA에 로딩했다. 검체 로딩 15분 후 육안(정성) 및 휴대용 라인 분석기(반정량적)로 임상 검체에 SARS-CoV-2 NP 항원 존재(즉, SARS-CoV-2 감염 확인 가능)를 확인하였다. COVID-19 환자의 비인두 면봉 10개와 건강한 기증자의 비인두 면봉 5개를 LFIA 장치에 적용했다(표 1). 쌍 1로 구성된 LFIA는 COVID-19 환자의 10개 임상 샘플에서 SARS-CoV-2 NP 항원을 성공적으로 검출했다(도 12B 및 12C). 그러나 쌍 2 기반 LFIA는 8개의 임상 검체를 검출했지만 2개의 환자 검체(환자 7번과 10번, 도 13)는 검출하지 못했습니다. 또한 동일한 임상 표본에 대해 쌍 1 기반 LFIA가 쌍 2 기반 LFIA보다 더 높은 선 강도를 나타내어 쌍 1 기반 LFIA의 민감도가 더 높음을 나타내는 것이다. 대조적으로, 쌍 1 또는 쌍 2 기반 LFIA에 대한 건강한 기증자의 표본에 대한 위양성 신호는 없었다(도 14).
또한 COVID-19 환자의 비인두 면봉에 대해 RT-qPCR 분석을 수행하여 임상 표본의 바이러스 부하를 정확하게 측정했다. 표준 SARS-CoV-2 RNA에서 얻은 N-유전자 앰플리콘의 표준 곡선을 사용하여 임상 샘플의 바이러스 부하를 조사했다. 임상 표본의 바이러스 부하는 1.07 x 109 copies/mL에서 6.32 x 106 copies/mL 범위였으며 모든 건강한 기증자 샘플은 바이러스 음성으로 식별되었다(도 12D, 도 15). 구체적으로, 쌍 2 기반 LFIA에서 검출되지 않은 환자 검체 7 및 10의 바이러스 부하는 각각 6.32 x 106 copies/mL 및 1.22 x 107 copies/mL 였다. 이 두 표본은 모든 환자 표본 중에서 가장 낮은 바이러스 부하를 포함했다. 따라서 쌍 2 기반 LFIA의 검출한계는 약 3 x 107 copies/mL(환자 4번, 바이러스 양 = 2.92 x 107 copies/mL)이며, 쌍 1 기반 LFIA는 ~5 x 106 copies/mL의 낮은 수준의 바이러스 농도를 검출할 수 있음을 확인했다. LFIA에 사용된 단클론 항체는 SARS-CoV-2 변이체와 다른 SARS-CoV-2의 보존된 서열을 인식하고 다른 코로나바이러스와 다른 특정 서열을 인식했다. 비록 LFIA의 검출 한계가 RT-qPCR만큼 낮지는 않았지만, 본 발명의 LFIA는 SARS-CoV-2 변종 확산에 직면하여 COVID-19에 대한 신속한 현장 진단(예: 가정 테스트 및 자가 테스트)에 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 SARS-CoV-2와 유사한 임상 증상을 유발하는 인간 코로나바이러스 및 기타 호흡기 병원체와의 교차 반응성을 검증하기 위해 LFIA의 특이성 분석을 수행했다. 음성 대조군과 그 농도는 도 16에 나와 있다. 상대적으로 높은 농도(104 TCID50/반응, LFIA 장치의 검출 한계보다 10배 높음)를 사용했음에도 불구하고 10개의 음성 대조군(도 12E)과의 교차 반응성으로 인해 위양성 신호가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 SARS-CoV-2의 보존되고 특이적인 짧은 펩타이드에서 개발된 본 발명의 단클론 항체가 인간 코로나바이러스 및 기타 호흡기 병원체의 다른 구성요소로부터 SARS-CoV-2 스파이크 항원을 성공적으로 구별할 수 있음을 나타낸다.
<결론>
SARS-CoV-2는 유전자 및 단백질 수준의 돌연변이로 인해 빠르게 진화했다. 이러한 돌연변이는 전염성 및 항원성을 포함하여 바이러스의 다양한 특성에 영향을 미치고 SARS-CoV-2 항원 검출에 대한 낮은 민감도를 초래한다. 여기에서 본 발명은 특정 단클론 항체의 개발을 위한 SARS-CoV-2 NP의 보존된 에피토프를 확인했다. 빠른 바이오센서를 개발하기 위해 결합 친화도와 항체 쌍을 조사했다. 신속한 바이오센서의 민감도와 특이성은 재조합 NP, 배양 바이러스, 임상 표본 및 기타 병원체를 사용하여 평가되었다. 개발된 급속 바이오센서는 돌연변이 SARS-CoV-2 NP를 검출하는 데 도움이 될 수 있으며, 단클론항체 쌍은 SARS-CoV-2 변이체에 대한 다른 바이오센서를 개발하는 데 유용할 것이다.
이상의 설명은 본 발명의 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내의 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.
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20 25 30
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Lys Asp Ser Gly Val
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65 70 75 80
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
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65 70 75 80
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85 90 95
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Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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<220>
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115
Claims (14)
- 서열번호 1의 경쇄 CDR1; 서열번호 2의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 3의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 4의 중쇄 CDR1; 서열번호 5의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 6의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 7의 경쇄 CDR1; 서열번호 8의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 9의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 10의 중쇄 CDR1; 서열번호 11의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 12의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 13의 경쇄 CDR1; 서열번호 14의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 15의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 16의 중쇄 CDR1; 서열번호 17의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 18의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 - 서열번호 19의 경쇄 CDR1; 서열번호 20의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 21의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역과,
서열번호 22의 중쇄 CDR1; 서열번호 23의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 24의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 검출용 조성물
- 제5항에 있어서, 시료는 비강 면봉, 비인두 세척액, 기관지폐포세척액, 흉수, 비강 도말, 비강 흡인액, 비인두도말, 비인두흡인액, 혈액, 혈액 구성성분, 체액, 타액, 가래 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 사스-코로나바이러스-2 검출용 조성물
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단용 조성물
- 제7항에 있어서, 시료는 비강 면봉, 비인두 세척액, 기관지폐포세척액, 흉수, 비강 도말, 비강 흡인액, 비인두도말, 비인두흡인액, 혈액, 혈액 구성성분, 체액, 타액, 가래 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단용 조성물
- 제7항에 있어서, 상기 사스-코로나바이러스-2 감염증은 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단용 조성물
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 사용설명서를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단용 키트
- 제10항에 있어서, 상기 키트는 항원과 항체 반응으로 이루어진 것인, 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단용 키트
- 제10항에 있어서, 상기 키트는 측면 유동 면역 분석(lateral flow immunoassay) 및 효소 결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단용 키트
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 분리된 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 검출 방법
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 분리된 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 사스-코로나바이러스-2 감염증 진단정보 제공방법
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210175966A KR20230087219A (ko) | 2021-12-09 | 2021-12-09 | 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210175966A KR20230087219A (ko) | 2021-12-09 | 2021-12-09 | 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20230087219A true KR20230087219A (ko) | 2023-06-16 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210175966A KR20230087219A (ko) | 2021-12-09 | 2021-12-09 | 사스-코로나바이러스-2 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체 및 이의 용도 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230087219A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117143227A (zh) * | 2023-07-07 | 2023-12-01 | 广州海关技术中心 | 结合冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV核衣壳蛋白的特异性抗体及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210076854A1 (en) | 2019-09-18 | 2021-03-18 | Nouri Edward Hakim | No slip vessel |
| US20210128252A1 (en) | 2015-11-16 | 2021-05-06 | Think Surgical, Inc. | Method for confirming registration of tracked bones |
| KR20210113936A (ko) | 2020-03-09 | 2021-09-17 | 앱셀레라 바이올로직스 인크. | 항-코로나바이러스 항체 및 사용 방법 |
-
2021
- 2021-12-09 KR KR1020210175966A patent/KR20230087219A/ko unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US20210128252A1 (en) | 2015-11-16 | 2021-05-06 | Think Surgical, Inc. | Method for confirming registration of tracked bones |
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| KR20210113936A (ko) | 2020-03-09 | 2021-09-17 | 앱셀레라 바이올로직스 인크. | 항-코로나바이러스 항체 및 사용 방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117143227A (zh) * | 2023-07-07 | 2023-12-01 | 广州海关技术中心 | 结合冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV核衣壳蛋白的特异性抗体及其应用 |
| CN117143227B (zh) * | 2023-07-07 | 2024-03-12 | 广州海关技术中心 | 结合冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV核衣壳蛋白的特异性抗体及其应用 |
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