CN112300252A - 2019-nCoV冠状病毒核衣壳蛋白抗原表位多肽的预测及其在检测中的应用 - Google Patents

2019-nCoV冠状病毒核衣壳蛋白抗原表位多肽的预测及其在检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种病毒预测方法。具体而言，涉及2019‑nCoV冠状病毒核衣壳蛋白（N蛋白）抗原表位多肽的预测。所述多肽具有2019新冠病毒N蛋白表位肽活性；并且所述的多肽的序列包含与SEQ ID NO 2‑SEQ ID NO 11中任意一条所示的序列；或者与SEQ ID NO 2‑SEQ ID NO 11中任意一条所示的序列具有70%以上的同源度。本发明还包括该预测方法病毒检测中的应用。本发明的抗原表位肽作为一种冠状病毒的检测标志物，特异性和灵敏度高，本发明的检测方法简便、快速、准确，为冠状病毒的防治提供强有力的支持。

Description

2019-nCoV冠状病毒核衣壳蛋白抗原表位多肽的预测及其在 检测中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种病毒预测方法。具体而言，涉及2019 -nCoV冠状病毒核衣壳蛋白（N蛋白）抗原表位多肽的预测。本发明还包括该预测方法病毒检测中的应用。
背景技术
目前确诊新冠肺炎的主要检测方法有核酸检测方法和基于蛋白检测检测方法；核酸检测方法主要为荧光RT-PCR技术，抗体蛋白的检测方法分为病毒抗体检测和病毒抗原的检测。抗体检测试剂是检测血清中由病毒进入人体后刺激人体产生的IgM或IgG抗体，IgM抗体出现较早，IgG抗体出现较晚。病毒抗原检测主要是检测病毒表面的一些蛋白质如spike。如何找到特异性的抗原表位肽对于检测开发基于抗体的新冠检测方法至关重要。
2019 -nCoV（SARS-2）冠状病毒的结构基因组29883bp，基因组中包括了14个ORF框，较大的蛋白分子包括以下蛋白的区域， N：核衣壳蛋白；S：Spike蛋白；M：膜蛋白；HE：血凝素酯酶；E：包膜蛋白。感染细胞的主要是通过在S蛋白与细胞表明的ACE2结合进入细胞。冠状病毒中所占比例最大，较为保守的蛋白是N蛋白，在病毒的结构蛋白中，N蛋白与病毒基因组ＲＮＡ相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。在感染早期机体就能产生抗Ｎ蛋白的高水平抗体，可以利用N蛋白建立快速检测2019-nCoV血清抗体方法，也可以进一步制备单抗或开展解析该蛋白结构等研究。
发明内容
本发明目的在于：提供2019-nCoV的特异性表位肽。
本发明另一目的是：将上述表位肽作为一种检测标志物，用于2019新冠病毒的检测和药物应用。
本发明目的通过下述方案实现：
通过序列比对发现：SARS-CoV和2019-nCoV的N蛋白序列相当的保守，序列一致性高达94%。已有的文献报道表明，在病人感染SARS-CoV的第二天即可在病人血浆中检测到N蛋白的抗体，其抗体在感染7天后即可在30%以上病人血中检出。考虑到两种N蛋白的高同源性，因此推测N蛋白可作为2019-nCoV早期筛查的一个重要指标。鉴于SARS的N蛋白和2019-nCoV的N蛋白高度相似性，采用生物信息学的方法预测和以往SARS患者中已经验证过的N蛋白表位肽，综合比较后获得了2019-nCoV N蛋白的表位，可以将此表位肽作为原料用于新冠检测试剂盒的开发。本发明在上述基础上完成。
本发明提供了一种多肽，所述多肽具有2019新冠病毒N蛋白表位肽活性；并且
所述的多肽的序列包含与SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 11中任意一条所示的序列；
或者与SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 11中任意一条所示的序列具有70%以上的同源度。
较好的，所述多肽的序列如SEQ ID NO 1所示。
进一步的，所述的多肽为SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 4中任一种涉及的N1/N2/N3蛋白表位肽。
另一方面，本发明提供了上述多肽的应用，即所述的多肽可以作为新冠病毒的检测标志物。
本发明还提供了所述的多肽在制备诊断或者治疗新冠病毒药剂中的应用。
进一步的，所述的应用包括如下步骤：
分离待测样本；和/或
提取待测样本中的蛋白；
使用识别上述多肽的物质与待测样本中的蛋白或者多肽孵育；
确定待测样本中是否存在上述多肽。
较好的，所述的识别上述多肽的物质是抗体；或者识别所述多肽的抗体与医药中常用偶联剂偶联所得的产物。
较好的，所述的多肽用于筛选诊断或者治疗新冠病毒的药剂；
包括以下步骤：
（1）将诊断或者治疗新冠病毒的药剂与上述的多肽孵育；
（2）将识别上述的多肽的物质加入（1）所得的混合物；
（3）检测（2）所得的混合物中上述的多肽的活性。
本发明的一个优选实施例中，所述的新冠病毒是2019年底开始爆发传染的冠状病毒，亦称为2019-nCoV。
在本发明的另一个优选实施例中，所述的多肽用于检测2019新冠病毒的感染。
本发明具体提供一种检测冠状病毒N蛋白的试纸，所述的试纸含有上述SEQ ID NO2-SEQ ID NO 11的多肽。
进一步的，所述的试纸用于冠状病毒的检测。
本发明的有益效果在于：通过生物信息学的方法比对了SARS-CoV和2019-nCoV的N蛋白序列，以及结合以往SARS患者中已经验证过的N蛋白表位肽，综合比较后获得了2019-nCoV N蛋白的表位，同时通过临床样本确定了本发明所述的N蛋白表位肽的特异性，这些特异性表位肽可以为新冠检测试剂盒的开发提供原料。本发明的抗原表位肽作为一种冠状病毒的检测标志物，特异性和灵敏度高，本发明的检测方法简便、快速、准确。获得的N蛋白表位肽可以为新冠检测试剂盒的开发提供原料，为冠状病毒的防治提供强有力的支持。
附图说明
图1 N蛋白结构区域；
图2 不同的生物信息学方法对N蛋白表位肽预测的分析得分情况及结果；
图3 2019-nCoV与SARS N蛋白同源比对；
图4 N蛋白表位肽ELISA检测结果；
图5 N蛋白表位肽用于磁性纳米显色材料标记的新冠试纸条的检测结果。
具体实施方式
实施例1
2019-nCoV N蛋白的表位分析
本发明通过生物信息学的方法对SARS-CoV和2019-nCoV的N蛋白序列比对后发现二者N蛋白相当的保守，序列一致性高达94%。文献表明，在病人感染SARS-CoV的第二天即可在病人血浆中检测到N蛋白的抗体，其抗体在感染7天后即可在30%以上病人血中检出。考虑到两种N蛋白的高同源性，因此推测N蛋白可作为2019-nCoV早期筛查的一个重要指标。
鉴于SARS的N蛋白和2019-nCoV的N蛋白高度相似性，本发明采用生物信息学的方法预测和以往SARS患者中已经验证过的N蛋白表位肽，综合比较后获得了2019-nCoV N蛋白的表位，具体分析如图1所示，N蛋白全长422个氨基酸，结构区包括RNA结合区，SR富集区和自折叠区，其中GK62EE，KEL105,S177，S207PAR，373NLS,390区域高度保守。
其中，N蛋白全长序列为：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA（SEQ ID NO 1）
即提出了具体的多肽的序列为SEQ ID NO 1。
本实施例中，分别采用目前已知的抗原表位肽预测的在线工具对N蛋白表位进行序列的比较和分析：
A）https://www.novoprolabs.com/tools/peptide-antigen-design；
B）http://tools.iedb.org/bcell/；
C）https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html；
D）http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl。
各不同的生物信息学方法对N蛋白表位肽预测的分析得分情况见图2,图2 中具体比对的方法如下：将N蛋白的全长氨基酸序列利用以下4个在线的生物信息学分析软件进行序列分析，上面的图2A、2B、2C、2D是多肽预测后的图谱展示形式，折线图的峰值代表的就是得分高低的情况；针对该4幅图的图2A1、2B1、2C1、2D1是具体的氨基酸序列，表格是量化的数值。
分别采用目前已知的抗原表位肽预测的在线工具对N蛋白表位进行序列的比较和分析，才有了4种方法对N蛋白进行生物信息学预测，选取得分较高的N蛋白预测表位肽；
进一步的，本发明人检索了2003年以来发表的关于SARS N蛋白表位肽的序列，利用软件https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/与2019-nCoV的N蛋白做了一个同源比对。2019-nCoV与SARS N蛋白同源比对结果如图3所示，2019-nCoV的N蛋白与SARS病毒的N蛋白的相似度90%左右。综合生物信息预测的表位和SARS N蛋白表位肽相似序列，综合比较后预测到以下10条2019-nCoV N蛋白的表位肽。
预测序列如下：
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE001
本实施例提出的一种多肽，具有冠状病毒N蛋白表位肽活性；并且，
所述的多肽的序列包含SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 11中任意一条所示的序列；
或者与SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 11中任意一条所示的序列具有70%以上的同源度。
实施例2
表位肽的确定：
通过化学合成的方法获得了SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 11共10条多肽，采用ELISA的方法确定这10个多肽的特异性。
N蛋白的酶联免疫反应（ELISA）试验：将N1//2/3/4/5/6/7/8/9/10作为抗原包被在ELISA板上，采用双夹心酶联免疫的方法检测抗原和N蛋白抗体特异性结合能力。
使用包被稀释液（0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠buffer, pH 9.6）稀释合成的N蛋白表位多肽和N蛋白到1ug/ml（3个复孔），每孔100ul，4℃包被过夜，次日封闭液(5%小牛血清/PBS溶液)37 ℃封闭1hour(h)，使用PBST洗剂5次，加入山羊抗N蛋白的多克隆抗体（1:2000）37℃孵育2h，使用PBST洗剂5次，加入HRP标记的兔抗山羊IgG(1:5000),37℃孵育30min,PBST洗剂5次后加入TMB显色液，显色5分钟，加入2M硫酸终止反应，450nm检测吸光度。
N蛋白表位肽ELISA检测结果如图4所示，结果显示：表位肽N1/N2/N3与N抗体均具有很好的亲和力，与全长的N蛋白结合能力相似，因此，确定N1/N2/N3表位肽可以作为后续产品开发的表位。
实施例3
磁性材料纸条检测血清的灵敏性试验：
试纸条样品垫及结合垫，按如下方法处理：
（1)将玻璃纤维裁剪为25mm×5mm大小，为了优化试纸条的性能，在构建之前，需对样品垫进行预处理，将裁剪好的玻璃纤维浸泡于PBST中浸泡半小时，再将浸泡后的样品垫放于37℃烘箱中烘烤2小时后取出，制成样品垫，备用；
（2）将玻璃纤维裁剪成 5mm×5mm 大小，用结合垫处理液将裁剪好的玻璃纤维先浸泡30分钟，将稀释后的偶联过抗体的磁性纳米显色材料溶液超声5 分钟，用移液枪吸取 15ul超声后的稀释抗体的磁性纳米显色材料溶液，均匀点于结合垫上，置于37℃烘箱1小时，制成结合垫；
（3）最后，将处理好的样品垫、结合垫和商品化试纸条中已经点好T线（Sars-CoV-2Nucleocapsid 完整抗原和分析获得的N蛋白表位多肽）和C线（Rabbit anti-goat igG HL）的NC膜进行贴膜组装，组装后的试纸条用切割机切成5mm宽的试纸条。
选择确定滴度的含有抗新冠IgM /IgG抗体的标准品，按照说明书要求比例进行稀释，按照采用标准品确定最低检测限浓度水平进行验证，检测结果如下：N1和N3表位肽与N蛋白完整抗原作为T线均可以正常显色，可以作为检测的原料使用。
如图5所示，将预测获得的N蛋白多肽作为抗原用于于磁性纳米显色材料标记的新冠试纸条的开发，N蛋白抗原作为检测线，N1/2/3检测的效果均可以达到N蛋白全长的效果。综合比较分析，N1和N3表位肽均可以用于检测试剂盒中的原料。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120> 2019-nCoV冠状病毒核衣壳蛋白抗原表位多肽的预测及其在检测中的应用
<130> DL20176
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 419
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<220>
<223> 人工序列
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
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Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
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Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
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His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
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Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
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370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
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Lys Asp Lys Lys Lys Lys
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Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg
1 5 10 15
Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys
20

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，具有冠状病毒N蛋白表位肽活性；并且，
所述的多肽的序列包含SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 11中任意一条所示的序列；
或者与SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 11中任意一条所示的序列具有70%以上的同源度。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的序列为SEQ ID NO 1所示。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽为SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 4中任一种涉及的N1/N2/N3蛋白表位肽。
4.一种权利要求1至3任一项所述的多肽的应用，其特征在于，所述的多肽作为新冠病毒的检测标志物，所述的新冠病毒是2019-nCoV。
5.根据权利要求4所述的多肽的应用，其特征在于，所述的多肽在制备诊断或者治疗新冠病毒药剂中的产品中的应用。
6.权利要求4或5所述的多肽的应用，其特征在于，所述的多肽用于捕获识别冠状病毒N蛋白的物质，包括：
使用识别权利要求1或者2所述的多肽的物质与待测样本孵育；和/或，
确定样本中是否含有权利要求1或者2所述的多肽，或者识别权利要求1或者2所述的多肽的物质。
7.根据权利要求6所述的多肽的应用，其特征在于，所述识别权利要求1或者2所述的多肽的物质是识别所述多肽的抗体；
或者识别所述多肽的抗体与药剂中常用载体偶联所得的产物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的多肽用于筛选诊断产品或者治疗新冠病毒的药剂，包括以下步骤：
（1）将诊断或者治疗新冠病毒的药剂与权利要求1或者2所述的多肽孵育，得混合物；
（2）将识别权利要求1或者2所述的多肽的物质加入（1）所得的混合物；
（3）检测（2）所得的混合物中权利要求1或者2所述的多肽的含量或者活性。
9.一种检测冠状病毒N蛋白的试纸，其特征在于，所述的试纸含有权利要求1所述的多肽。
10.权利要求9所述的试纸的应用，其特征在于，所述的试纸用于冠状病毒的检测。
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