CN101235090A - 一种应用于结核病快速诊断的特异性融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明属于临床免疫学诊断技术领域，具体为一种应用于结核病快速诊断的特异性融合蛋白及其构建方法。本发明将38KD、Mtb81、MPT32蛋白抗原的表位依次连接而构建了多表位融合蛋白(38KD－Mtb81－MPT32)。研究结果表明，与单一的38KD、Mtb81、MPT32蛋白抗原相比，本发明所构建的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在对结核病诊断的敏感性方面有明显提高。通过对抗原包被，并组装成ELISA诊断试剂盒，实现了对3种特异性抗原同步检测。本发明克服了传统结核病免疫学诊断检测技术敏感性较低，及特异性不足等缺点，在结核病快速诊断领域有着广泛的应用前景。

Description

一种应用于结核病快速诊断的特异性融合蛋白

技术领域

本发明属于临床免疫学诊断技术领域，具体涉及应用基因工程技术构建的一个结核杆菌特异性的多表位融合蛋白，并建立了相应的制备工艺。

背景技术

结核病(TB)目前仍是当今全球范围对人类最具威胁性的感染性疾病之一。我国目前现有肺结核病人约450万，其中传染性肺结核病人约150万。每年约有145万新发病例，每年因结核病死亡人数达13万，大大超过其他传染病死亡人数的总和，并且仍有继续上升的势头。加强对结核病的研究，建立一套有效的结核病诊断、治疗和预防措施，控制结核病的发生和传播，已成为我国提高人口健康素质的重要而紧迫的任务。

早期发现和早期诊断结核病病人，给予有效的治疗，是降低结核病发病率，减少传播机会、控制结核病疫情的关键环节。现有结核病的实验室诊断方法很多，但效果不一，都存在局限性。目前痰涂片细菌学检查简便、快速，但检出率低，并且不能鉴别结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)和非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，对于肺外结核病也存在难于取材的问题；MTB培养时间太长，一般1-2个月，难以满足临床需要；Bactec技术虽缩短了培养时间，但需昂贵仪器，试剂成本也较高，难于推广。由于血清学诊断技术有其固有的优势：如操作简便、快速，实验条件相对宽松，试剂成本低廉，无需特殊精密仪器，便于推广，而且近年来又有迅速发展成为自动化的趋势。因此结核病的快速诊断在一定的程度上也期待通过血清免疫学诊断技术的发展来实现。结核病患者的免疫规律为：细胞免疫随病情加重而减弱，体液免疫随病情加重而增强，因而抗体产生多。因此，从上世纪70年代建立了酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)后，应用ELISA方法和其后发展的胶体金标记技术检测患者血清中结核特异性抗体IgG，已成为目前结核病快速诊断常用的辅助手段之一。

虽然血清免疫学诊断技术在结核病高发国家和地区已得到较广泛的应用，但迄今为止，其在临床应用和结果评判方面仍存在相当多的问题和争议：①抗原不特异。结核菌抗原存在着与属内其他分枝杆菌和属外的棒状杆菌属、奴卡氏菌属、甚至与人体组织和肿瘤抗原等的交叉抗原，现有商业化试剂所用抗原很难将由于BCG接种和环境中NTM感染与结核病进行鉴别。这是造成抗结核抗体假阳性的原因。②检测敏感性不够。不同结核病患者体内抗体水平差异大；同样的病人在疾病的不同阶段对不同的抗原免疫反应也不同，因而现有的商业化试剂盒所用抗原检测结核抗体的敏感性不够，是造成抗结核抗体假阴性的原因。③缺乏对实验条件和试剂进行统一和规范化的临床评估。由于人群中感染结核分枝杆菌十分普遍，健康人体内也会携带低度水平的抗结核分支杆菌抗体。这就要求试剂的灵敏度既不能太高，也不能太低。灵敏度太高，能检出任何水平的抗体，就会增加假阳性率；反之，灵敏度过低，某些较低水平抗体的结核病患者就有可能被漏诊。因此，目前关于结核抗体的研究结果，各家检测结果差异较大，临床应用价值评价不一。针对上述现存的问题，建立一种针对结核抗体水平的结核病快速诊断的技术关键是寻找具有种的特异性及强的免疫原性的结核抗原；并构建一系列特异性抗原的科学、合理的组合或含有关键表位的融合蛋白，这将为建立一种更为快速、简便、准确的结核病筛查和诊断技术奠定基础。

发明内容

本发明的目的是为克服现有结核病诊断技术的不足之处，提供一种敏感性和特异性高的用于结核病快速诊断的新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白——多表位38KD-Mtb81-MPT32融合蛋白及其构建方法。

本发明是基于临床研究和生物信息学分析，选择38KD、Mtb81和MPT32三种蛋白抗原的关键表位，并将其进行依次连接，从而提供一种用于结核病快速诊断的新型结核分枝杆菌特异性的38KD-Mtb81-MPT32融合蛋白。38KD蛋白抗原是定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合群中表达，BCG合成38KD蛋白的量仅为结核杆菌的1/10。其有两个B细胞抗原决定簇，在涂片阳性的患者血清中其阳性率最高，是迄今为止公认的应用于结核抗体检测的首选抗原。Mtb81蛋白抗原是一种结核分支杆菌外分泌蛋白，其序列与苹果酸合成酶同源。目前研究发现其适用于HIV合并MTB感染，且对38KD抗原阴性的患者可以达到很高的阳性率。MPT32抗原是一种糖基化纤连蛋白，属于早期分泌蛋白，其对结核病的早期诊断具有较高的阳性检出率。将三种结核分枝杆菌蛋白抗原的关键表位依次连接，并删去与其它生物同源较高的非表位区域，从而实现对结核分枝杆菌感染检测的高敏感性和高特异性。

本发明提供的38KD-Mtb81-MPT32融合蛋白的构建步骤如下：

(1)、多表位融合蛋白的设计：通过多种生物软件将38KD、Mtb81和MPT32的基因序列和蛋白质结构进行分析，确定融合蛋白抗原表位的区域、组合和顺序。顺次将38KD蛋白抗原、Mtb81蛋白抗原和MTP32蛋白抗原连接而形成融合蛋白。38KD抗原的表位置于融合蛋白的氨基端，MPT32蛋白抗原的表位置于融合蛋白的羧基端；

(2)、多表位融合蛋白的分子克隆：依据基因工程技术，采用重叠引物法，设计连接肽GGGGS序列，以此序列首先将38KD抗原表位编码基因与Mtb81抗原表位基因扩增并连接成38KD-Mtb81融合蛋白基因，其中38KD抗原上游扩增引物添加Xba I酶切位点，Mtb81抗原下游扩增引物添加BamH I酶切位点；双酶切，构建pET32a的融合基因表达载体；然后扩增、克隆MPT32抗原表位基因，在上游扩增引物添加BamH I酶切位点，下游扩增引物添加EcoR I酶切位点；将含有38KD-Mtb81融合基因的重组质粒用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行酶切，然后与经同样酶切的MPT32抗原表位基因进行连接，最终形成38KD-Mtb81-MPT32融合蛋白基因，并使38KD抗原与Mtb81抗原之间以及Mtb81抗原与MPT32抗原之间通过连接肽相联接。

(3)多表位融合蛋白的鉴定：对构建的多表位融合蛋白38KD-Mtb81-MPT32基因进行酶切和测序，表明已成功构建具有多表位融合蛋白基因的重组表达载体。经过诱导、表达、纯化，并进行SDS-PAGE电泳和鉴定，表明获得的多表位融合蛋白与实际设计的大小相符。

以“鸡尾酒”方式将上述38KD、Mtb81和MPT32蛋白抗原混合包被进行结核抗体检测也可以提高检测的敏感性，但需要将三种抗原分别进行表达和纯化，不仅工作量大，检测成本高，也常常存在三种抗原配比不均而降低检测敏感性的问题。通过预测、分析上述抗原的B细胞抗原表位，选择合适的工艺方法将相应的抗原表位组合、构建而成新型的多表位38KD-Mtb81-MPT32融合蛋白，并使38KD抗原与Mtb81抗原之间以及Mtb81抗原与MPT32抗原之间通过连接肽相联接，有利于融和蛋白抗原较好地保持结合能力和特异性。因而便于后期免疫诊断试剂盒的开发，为进一步提高了结核病诊断的敏感性和特异性奠定了基础。

具体实施方式

【实施例】本发明结核病快速诊断的特异性融合蛋白的制备

1)从Genbank下载结核分枝杆菌38KD、Mtb81和MPT32蛋白抗原的编码全基因序列，应用DNAstar和Insight II等生物软件将它们的基因序列和蛋白质结构进行分析，预测蛋白抗原表位，进行融合蛋白分子的模型构建工作，包括对融合蛋白的柔性、抗原性、亲水性、等电点及表位等生物学特性的分析，最终选择融合蛋白抗原表位的优化、组合。融合蛋白中38KD、Mtb81和MPT32抗原表位分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的DNA序列所决定。

2)依据SEQ ID NO：1设计扩增38KD抗原表位的一对扩增引物，包括38KD-F：TGCTCTAGAATGGCGACTACCCCCGCGTCGTC(SEQ ID NO：4)：和38KD-R：TGAACCGCCTCCACCGGCCTGAATGCTTTGCG(SEQ ID NO：5)，38KD抗原上游扩增引物添加Xba I酶切位点。依据SEQ ID NO：2设计扩增Mtb81抗原表位的一对扩增引物，包括：Mtb81-F：GGTGGAGGCGGTTCATCGTCGGGTTCCTTTG(SEQ ID NO：6)；和Mtb81-R：CTCGGATCCACCTCCTCCGGCATCCATGATGCC(SEQ ID NO：7)，Mtb81抗原下游扩增引物添加BamH I酶切位点。并且采用重叠引物法，设计连接肽GGGGS，将融合基因中间引入编码5个疏水性氨基酸的序列的DNA序列，以此将38KD抗原与Mtb81抗原连接。其后，将38KD-Mtb81融合基因的PCR产物进行胶回收，用限制性内切酶Xba I和BamH I分别对融合基因和表达载体pET32a进行酶切，连接，转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)受体菌中。经过质粒提取，重组子酶切和测序鉴定，获得含有38KD-Mtb81融合基因的重组表达载体。

(3)、依据SEQ ID NO：3设计MPT32抗原片断的一对扩增引物，包括：MPT32-F：GCTGGATCCCCACCCGCACCGGCGACAC，SEQ ID NO：8；和MPT32-R：GCTGAATTCCTACGACGCGCTTCCAGACACC，SEQ ID NO：9，在上游扩增引物添加BamH I酶切位点，下游扩增引物添加EcoR I酶切位点，PCR扩增，胶回收、纯化后，获得MPT32抗原表位扩增产物。

(4)、将含有38KD-Mtb81融合基因的重组表达载体用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行酶切，然后与经同样酶切的MPT32抗原表位进行连接、转化和表达。经过质粒提取，重组子酶切和测序鉴定，表明成功获得含有38KD-Mtb81-MPT32融合基因的重组表达载体。

对本发明构建的多表位融合蛋白(38KD-Mtb81-MPT32)及前期克隆、纯化的3种单一重组蛋白抗原(38KD、Mtb81和MPT32)进行SDS-PAGE电泳，检测结果见附图1。

【试验例】本发明所构建的新型38KD-Mtb81-MPT32融合蛋白的诊断效果试验

将本发明实施例所构建的融合蛋白经纯化，结合蛋白包被技术，标记技术，检测技术，可以应用于多种结核病临床免疫诊断。我们以其作为做为ELISA技术的诊断抗原，应用于临床标本的试验，达到了预期的诊断效果，相比于单一抗原检测，较大地提高结核病诊断的敏感性。ELISA检测程序如下所示：

1.试验标本

本研究共选择68例血清或血浆标本，分为两组：

1)实验组活动性结核病35例，其中男22例，女13例，年龄3-75岁，所有患者均经影像学、实验室检查及抗结核治疗动态观察而确诊。

2)对照组非结核病患者共33例，其中，男17例，女16例，年龄9-68岁。包括肺炎、慢性支气管肺炎、哮喘、肺癌。非结核病患者均依各种检查方法检查和临床治疗的效果而确诊。正常健康人30例，血清来自志愿献血健康人群。

2.试验仪器和试剂

仪器：酶标仪为Labsystems公司产品。

试剂：多表位融合蛋白(38KD-Mtb81-MPT32)、3种结核分枝杆菌重组蛋白抗原(包括38KD、Mtb81和MPT32重组蛋白，本实验室保存)、包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠buffer，pH 9.6)、封闭液(2％小牛血清/PBS溶液)、洗涤液(PBS T，pH 7.4)、样本稀释液(PBS，pH 7.4)、HPR酶标第二抗体(羊抗人IgG)、底物液(TMB-过氧化氢溶液)、终止液(2mol/L H₂SO₄溶液)

3.试验方法

参照间接ELISA诊断技术标准进行。

1)包被过程：

将多表位融合蛋白(38KD-Mtb81-MPT32)和3种结核分枝杆菌重组蛋白抗原(38KD、Mtb81和MPT32重组蛋白)分别用包被稀释液稀释到适当浓度，包被量为每孔100μg，每孔抗原加入100μl，4℃过夜；次日弃去孔中液体。

2)封闭酶标反应孔：

2％小牛血清置37℃封闭1h，用洗涤液洗涤3遍，每次3min。

3)加入待检测样品(建立合适的浓度梯度)：

将血清采用1∶100的稀释度，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品加双孔，每孔100μl，置于37℃，1h；甩掉液体，洗涤液洗3遍，每次3min。

4)加入酶标抗体：

加HPR酶标第二抗体(羊抗人IgG)50ul/孔，37℃，1h；甩掉液体，洗涤液洗涤同前。

5)加入底物液：

加底物50ul/孔，避光放置10min，加入终止液显色。

6)终止反应：

每孔加入终止液50μl终止反应，于15min内测定实验结果。

7)结果判断：

显色后采用450nm波长测定标本孔、阴性对照孔OD值。OD值≥临界(Cut off)值判定为阳性，OD值＜临界(Cut off)值判定为阴性。

4.结果

试验结果见附表1。

对活动性肺结核，38KD-Mtb81-MPT32特异性融合蛋白检测敏感性为80.0％(28/35)。38KD-Mtb81-MPT32检测敏感性均高于目前已知的单一抗原检测方法。对于非结核病对照组38KD-Mtb81-MPT32特异性融合蛋白具有相当于单一蛋白抗原具有的特异性(90.9％)。

对于健康对照组38KD-Mtb81-MPT32融和蛋白和单一蛋白抗原均具有的100％的特异性。

结果表明：与单一的38KD、Mtb81、MPT32蛋白抗原相比，本发明所构建的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在对结核病诊断的敏感性方面有明显提高；而在非结核病患者及健康人群的阴性检出率方面又有很高的一致性。因而是一个适用于结核病诊断的新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在结核病快速诊断领域有着广泛的应用前景。

表1

检测方法	阳性例数(实验组35例)	敏感性(％)	阴性例数(非TB对照33例)	特异性(％)	阴性例数(正常健康人30)	特异性(％)
							38KD	20	57.1	31	93.9	30	100
Mtb81	12	34.3	31	93.9	30	100
							MPT32	13	37.1	32	97.0	30	100
38KD-Mtb81-MPT32	28	80.0	30	90.9	30	100

                    DNA Sequence Listing

SEQ ID NO：1

GCGACTACCCCCGCGTCGTCGCCGGTGACGTTGGCGGAGACCGGTAGCACGCTGCTC

TACCCGCTGTTCAACCTGTGGGGTCCGGCCTTTCACGAGAGGTATCCGAACGTCACG

ATCACCGCTCAGGGCACCGGTTCTGGTGCCGGGATCGCGCAGGCCGCCGCCGGGAC

GGTCAACATTGGGGCCTCCGACGCCTATCTGTCGGAAGGTGATATGGCCGCGCACAA

GGGGCTGATGAACATCGCGCTAGCCATCTCCGCTCAGCAGGTCAACTACAACCTGCC

CGGAGTGAGCGAGCACCTCAAGCTGAACGGAAAAGTCCTGGCGGCCATGTACCAGG

GCACCATCAAAACCTGGGACGACCCGCAGATCGCTGCGCTCAACCCCGGCGTGAAC

CTGCCCGGCACCGCGGTAGTTCCGCTGCACCGCTCCGACGGGTCCGGTGACACCTTC

TTGTTCACCCAGTACCTGTCCAAGCAAGATCCCGAGGGCTGGGGCAAGTCGCCCGGC

TTCGGCACCACCGTCGACTTCCCGGCGGTGCCGGGTGCGCTGGGTGAGAACGGCAA

CGGCGGCATGGTGACCGGTTGCGCCGAGACACCGGGCTGCGTGGCCTATATCGGCAT

CAGCTTCCTCGACCAGGCCAGTCAACGGGGACTCGGCGAGGCCCAACTAGGCAATA

GCTCTGGCAATTTCTTGTTGCCCGACGCGCAAAGCATTCAGGCC

SEQ ID NO：2

TCGTCGGGTTCCTTTGGCGACGCCACCGGTTTCACAGTGCAGGATGGCCAGCTCGTG

GTTGCCTTGCCGGATAAGTCCACCGGCCTGGCCAACCCCGGCCAGTTCGCCGGCTAC

ACCGGCGCAGCCGAGTCGCCGACATCGGTGCTGCTAATCAATCACGGTTTGCACATC

GAGATCCTGATCGATCCGGAGTCGCAGGTCGGCACCACCGACCGGGCCGGCGTCAA

GGACGTGATCCTGGAATCCGCGATCACCACGATCATGGACTTCGAGGACTCGGTGGC

CGCCGTGGACGCCGCCGACAAGGTGCTGGGTTATCGGAACTGGCTCGGCCTGAACA

AGGGCGACCTGGCAGCAGCGGTAGACAAGGACGGCACCGCTTTCCTGCGGGTGCTC

AATAGGGACCGGAACTACACCGCACCCGGCGGTGGCCAGTTCACGCTGCCTGGACG

CAGCCTCATGTTCGTCCGCAACGTCGGTCACTTGATGACGAATGACGCCATCGTCGAC

ACTGACGGCAGCGAGGTGTTCGAAGGCATCATGGATGCC

SEQ ID NO：3

CCACCCGCACCGGCGACACCTGTTGCCCCCCCACCACCGGCCGCCGCCAACACGCC

GAATGCCCAGCCGGGCGATCCCAACGCAGCACCTCCGCCGGCCGACCCGAACGCAC

CGCCGCCACCTGTCATTGCCCCAAACGCACCCCAACCTGTCCGGATCGACAACCCGG

TTGGAGGATTCAGCTTCGCGCTGCCTGCTGGCTGGGTGGAGTCTGACGCCGCCCACT

TCGACTACGGTTCAGCACTCCTCAGCAAAACCACCGGGGACCCGCCATTTCCCGGAC

AGCCGCCGCCGGTGGCCAATGACACCCGTATCGTGCTCGGCCGGCTAGACCAAAAGC

TTTACGCCAGCGCCGAAGCCACCGACTCCAAGGCCGCGGCCCGGTTGGGCTCGGAC

ATGGGTGAGTTCTATATGCCCTACCCGGGCACCCGGATCAACCAGGAAACCGTCTCGC

TCGACGCCAACGGGGTGTCTGGAAGCGCGTCG

SEQ ID NO：4

TGCTCTAGAATGGCGACTACCCCCGCGTCGTC

SEQ ID NO：5

TGAACCGCCTCCACCGGCCTGAATGCTTTGCG

SEQ ID NO：6

GGTGGAGGCGGTTCATCGTCGGGTTCCTTTG

SEQ ID NO：7

CTCGGATCCACCTCCTCCGGCATCCATGATGCC

SEQ ID NO：8

GCTGGATCCCCACCCGCACCGGCGACAC

SEQ ID NO：9

GCTGAATTCCTACGACGCGCTTCCAGACACC。

图1是本发明构建的多表位融合蛋白及前期克隆，纯化的3种单一重组蛋白抗原的SDS-PAGE电泳。其中，1、蛋白质分子量标准，2、38KD蛋白，3、Mtb81蛋白（88KD），4、MPT32（45KD），5、多表位融合蛋白。

Claims (2)

1、一种应用于结核病快速诊断的特异性融合蛋白，其特征在于由38KD、Mtb81和MPT32三种蛋白抗原的关键表位依次连接构成，记为38KD-Mtb81-MPT32；38KD蛋白抗原表位由序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列所决定；Mtb81蛋白抗原表位由SEQ ID NO：2所示的DNA序列所决定；MTB32蛋白抗原表位由SEQ ID NO：3所示的DNA序列所决定。

2、一种如权利要求1所述的特异性融合蛋白的构建方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)、多表位融合蛋白的设计：通过多种生物软件将38KD、Mtb81和MPT32的基因序列和蛋白质结构进行分析，确定融合蛋白抗原表位的区域、组合和顺序；顺次将38KD蛋白抗原、Mtb81蛋白抗原和MTP32蛋白抗原连接而形成融合蛋白；38KD抗原的表位置于融合蛋白的氨基端，MPT32蛋白抗原的表位置于融合蛋白的羧基端；

(2)、多表位融合蛋白的分子克隆：依据基因工程技术，采用重叠引物法，设计连接肽GGGGS序列，以此序列首先将38KD抗原表位编码基因与Mtb81抗原表位基因扩增并连接成38KD-Mtb81融合蛋白基因，其中38KD抗原上游扩增引物添加Xba I酶切位点，Mtb81抗原下游扩增引物添加BamH I酶切位点；双酶切，构建pET32a的融合基因表达载体；然后扩增、克隆MPT32抗原表位基因，在上游扩增引物添加BamH I酶切位点，下游扩增引物添加EcoR I酶切位点；将含有38KD-Mtb81融合基因的重组质粒用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行酶切，然后与经同样酶切的MPT32抗原表位基因进行连接，最终形成38KD-Mtb81-MPT32融合蛋白基因，并使38KD抗原与Mtb81抗原之间以及Mtb81抗原与MPT32抗原之间通过连接肽相联接。

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