CN102660559A - 一种结核分枝杆菌重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌重组蛋白的基因SocAB-murB及其表达的一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB，重组蛋白SocAB-murB具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，用本发明提供的结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB作为抗原，制备的检测结核分枝杆菌抗体IgG试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了TB感染临床诊断的需要。

Description

一种结核分枝杆菌重组蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法和应用。

背景技术

结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，TB )感染所致的人类疾病，是分支杆菌病的主要类型，主要通过呼吸道传播。自1882年德国科学家Rrobert Koch发现TB以来，全球约有两亿人死于TB，且疫情发展日趋严重。据WHO预计，全球现有TB病人2000万，如不控制今后10年还将有9000万人发病。我国现有3.3亿结核菌感染者，肺结核病人600多万，其中有严重传染性的病人150万，每年死于结核病的达25万人。因此，结核病的预防、早期诊断和及时治疗是高度关注的课题。MTB有H37RV与H37Ra两种标准菌株，前者为毒力株而后者为减毒突变株，它们均来源于1934年的人肺H37分离株。与一些临床分离株不同的是，H37RV对药物敏感、利于基因工程操作并在TB动物模型中保留了完整毒力，因而该菌株被广泛应用于TB相关的生物医药研究(MTb H37RV project at Sanger Institute, NCBI)。目前常用的结核病诊断方法有胸部X光透视和主要依靠患者痰液、胸水、支气管肺泡液的显微镜直接涂片检查（AFP）和培养法，以及分子生物学和血清学检查，这些方法多基于高特异性的抗原建立。

发明内容

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB和其编码的一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB。

一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种结核分枝杆菌蛋白SocAB-murB的表达载体pET-28b-SocAB-murB，其特征在于：在pET-28b中插入了其碱基序列如SEQ ID NO:1所示的基因。

一种表达结核分枝杆菌蛋白的工程菌株，其特征在于：它是转染了权利要求3所述的一种结核分枝杆菌蛋白的表达载体pET-28b-SocAB-murB的大肠杆菌BL21（DE3）。

本发明的另一个目的是一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB及其编码的重组蛋白的制备方法的制备方法。

一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB的制备方法，它包括以下步骤：

1）提取结核分支杆菌H37RV的基因组；以其为模板，用引物： 

F1：ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCA 

R1：TCCGTTTCATACCACCACCACCCGTAACGCCCTGA  

F2：ACGGGTGGTGGTGGTATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCT

R2：ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT 

进行第一轮扩增，获得基因片段SocAB 和murB；

2）以第一轮扩增获得的基因片段SocAB 和murB，为模板，用引物：

F1：ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCA

R2：ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT 

进行第二轮扩增，连接基因片段SocAB 和murB，获得目的融合基因SocAB-murB。

一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB的制备方法，它包括以下步骤：

1）将权利要求5所述的一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB的制备方法制得的融合基因SocAB-murB，插入表达载体pET-28b中，获得质粒pET-28b-SocAB-murB。

2）将质粒pET-28b-SocAB-murB，转染至大肠杆菌BL21（DE3）中，诱导表达、纯化。

本发明的又一个目的是，所述的结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB在制备结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒中作为检测抗原的应用。

本发明提供的一种结核分枝杆菌重组蛋白的基因SocAB-murB及其表达的一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB，重组蛋白SocAB-murB具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，用本发明提供的结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB作为抗原，制备的检测结核分枝杆菌抗体IgG试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了TB感染临床诊断的需要。

附图说明

图1 为第二轮PCR扩增产物SocAB-murB的凝胶电泳图；

图2是表达质粒pET-28b- SocAB-murB的构建流程图；

图3是诱导后菌体12％SDS－PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。

具体实施方式

实施例1  一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB的制备

重组蛋白基因SocAB-murB的融合

通过计算机分析TB H37RV 基因组全序列，筛选出结核分枝杆菌的强抗原表位SocAB蛋白（GenBank: HM222605.1）、murB（GenBank: EU840989.1）DNA序列，并设计扩增引物。

SocAB扩增引物： 

F1：ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCA  50.0%  Tm=66.71

R1：TCCGTTTCATACCACCACCACCCGTAACGCCCTGA  57.14%  Tm=64.59

murB扩增引物：

F2：ACGGGTGGTGGTGGTATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCT  60.47% Tm=67.79

R2：ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT  58.33%  Tm=65.07 

F1和R1用于扩增SocAB基因的片段，F2和R2用于扩增murB基因的片段；引物F1和R2分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物F2和R1顺序互补，并共同对应于murB基因片段的5’末端序列；

结核分支杆菌H37RV(购自中国药品生物制品检定所)的菌体，加100mL蛋白酶K（10mg/mL），置56℃水浴消化4小时，用常规酚/氯仿法纯化，获得结核分支杆菌H37RV基因组；

以结核分支杆菌H37RV基因组为模板，以引物F1和R1扩增SocAB基因的片段，以引物F2和R2扩增murB基因的片段；

50 mL扩增体系：ddH₂O  31.5 mL， 10×buffer  5.0 mL,   4×dNTP  4.0 mL,  上、下游引物混液 4.0 mL,  DNA  1.5 mL,  Taqplus   0.2 mL(1 U)；

进行第一轮扩增；产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后切割，将含DNA条带的胶块按DNA快速纯化试剂盒 (购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARA MiniBEST Plasmid purification)说明回收DNA；SocAB目的DNA片段和murB目的DNA片段

以第一轮PCR扩增得到的SocAB目的DNA片段和murB目的DNA片段为模板，加入引物F1和R2扩增SocAB-murB目的DNA片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示；

也就是以SocAB和murB基因片段为模板用连接PCR扩增SocAB、murB融合基因，中间以4个Gly（ggtggtggtggt）连接；得融合基因片段SocAB-murB目的DNA片段 

表达载体pET-28b-SocAB-murB的构建及鉴定

质粒DNA和SocAB-murB均经内切酶切，50 mL体系： 10 x buffer  5.0 mL,  DNA  12 mL ， XhoⅠ和NdeⅠ各15 U，ddH2O补至50 mL；37℃水浴6 h；50 mL酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切割DNA条带琼脂块，并用DNA快速纯化试剂盒回收DNA；

将融合基因片段克隆至pET-28b质粒（具有XhoⅠ和NdeⅠ酶切位点，购自华美生物公司），20 mL连接体系: ddH₂O15.0 mL,  10 x buffer  2.0 mL,  PET-28b  2.0 mL,  Pab  1.0 mL,  T₄DNA连接酶20 U；质粒自身连接对照, 20 mL连接反应体系：ddH₂ O 16.0 mL， 10 x buffer 2.0mL,  PET-28b  2.0 mL,  T4DNA连接酶  20 U；按上述加样后，混匀、稍离心，14℃-16℃连接过夜；转化E. coli涂平板（含有15微克/毫升卡那霉素的LB固体培养基）并挑克隆提质粒测序，确定序列正确的克隆，质粒构建图见附图2。

测序引物为：F1和R2及T7 promoter和T7 terminator的通用引物。所有扩增引物和测序引物的合成以及重组质粒序列pET-28b-SocAB-murB 的测定都由华大基因公司提供服务。测得目的融合基因SocAB-murB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2结核分枝杆菌重组蛋白的表达、纯化

将验证正确克隆的质粒（pET-28b- SocAB-murB），转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自华美生物公司）宿主菌，目的蛋白在包含体内进行表达：将含有pET-28b- SocAB-murB，的BL21（DE3）宿主菌培养到OD 0.6，用终浓度1mM IPTG诱导表达，4小时之后收集菌体、超声破碎、高速离心、收集沉淀。对收集的沉淀用Ni柱（Pharmcia 公司 chelating sephrose fast flow）进行纯化，用如下溶液洗脱：300mM咪唑，20mM Tris，500Mm NaCl，8M Urea。核分枝杆菌重组蛋白SocAB- murB融合基因表达的蛋白共477个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例3结核分枝杆菌重组蛋白鉴定

1、纯度和分子量的测定：经SDS－PAGE电泳检测（蛋白上样量10μg），为单一区带，薄层扫描鉴定纯度为95.8%。分子量约为51Kd，检测结果见附图3。

、浓度测定：经Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白作为标准参比品，抗原蛋白浓度为3.2±0.15mg/mL。

、活性测定：用间接ELISA方法测定。包被量2.0μg/孔，使用内部质控血清测定OD值。结果见表1。

表1结核分枝杆菌重组融合蛋白活性测定结果

抗原抗体反应：采用蛋白印记技术（Western Blot），以抗人结核IgG抗体阳性人血清测试TB融合蛋白抗原，可见阳性反应，SDS－PAGE并证实抗原的分子量为51KD。

、稳定性测定：

蛋白质浓度的稳定性测定，分三次测定保存的结核抗原溶液的蛋白质浓度的稳定性，结果见表2。

表2. 结核分枝杆菌重组融合蛋白抗原的浓度测定

测试结果显示，-85℃保存的结核抗原溶液的蛋白质浓度非常稳定。

实施例4 酶联免疫法（ELISA）检测结核分枝杆菌抗体IgG的建立

采用间接ELISA方法检测结核分枝杆菌抗体IgG，可用于TB抗原活性的鉴定和TB感染的辅助诊断。本实施例以实施例2制得的结核分枝杆菌重组融合蛋白SocAB-murB做抗原；为确定抗原包被量和酶标二抗工作浓度，以阳性和阴性参考品为测试样品，采用方阵滴定法选择最佳抗原包被量和相应的酶标二抗工作浓度，见下表3。

表3    最佳抗原包被量和相应的酶标二抗工作浓度的选择

根据测试结果，在抗原包被量为4.0μg/孔，酶标二抗使用浓度为4mg/ml时，检测结果最佳，故以TB重组抗原4.0μg/孔包被微孔板和4mg/ml酶标二抗IgG，建立结核分枝杆菌抗体IgG酶联免疫检测法（间接ELISA）。

实施例5 结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）的性能检定

将实施例1制得的重组TB蛋白包被微孔板，用ELISA法测定TB IgG抗体。

该试剂盒原理和组分如下：

1）试剂盒原理：本品系用基因工程重组TB抗原包被的微孔板，辣根过氧化物酶（HRP）标记抗人IgG为示踪物，TMB显色系统，应用间接法原理检测人血清或血浆中的抗TB IgG抗体。

2）试剂盒主要组成成分：

预包被板、酶结合物、阴性对照、阳性对照、浓缩洗液（20×）、底物液A 、底物液B 、中止液。

试剂盒性能检定

    特异性测定：按间接ELISA测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清（临床已确定），符合率为100％；检测30份类风湿因子阳性血清标本、30份抗核抗体阳性血清标本，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

灵敏度测定：按间接ELISA测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清（临床已确定），符合率为100％。

精密性测定：按间接ELISA测定方法，检测本试剂盒的精密性。使用本试剂盒对2份抗TB强阳性血清、1份阳性血清、1份阴性血清以及试剂盒的阳性对照、阴性对照进行每板双孔，共10板的检测，结果如表4，可见试剂盒的重复性良好，对不同血清检测的CV均低于15%。

表4 试剂盒的精密性

血清	平均OD	最大OD	最小OD	CV(%)
					强阳性1	3.768	4.022	3.035	3.1
强阳性2	3.089	3.576	2.365	4.2
					阳性1	2.158	2.794	1.802	6.9
阴性	0.019	0.103	0.003	5.8
					阳性对照	2.597	3.209	2.011	7.2
阴性对照	0.019	0.109	0.008	5.1

与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与郑州安图绿科生物工程有限公司试剂盒检测280份血清样本的比较实验结果如表4。

表5  与郑州安图 结核杆菌IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）的比较测试结果

 

    检测总符合率=（61+214）/280=98.21％，初步表明本试剂盒达到市场同类试剂盒的标准。

<110>  吉林大学

<120>  一种结核分枝杆菌重组蛋白及其制备方法

 

<160>  2

 

<210>  1

<211>  1431

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  1

 

tcgatacacc  atggggacat  ttgccctcca  tggcctcacc  catcgcctac  cgtcggcctc    60  

gttgcagacg  acggctgccc  gccacccgga  tgtgacgcaa  ttctcaatgc  ctgggcacta   120 

ccgataacgc  cgacctgccg  cagctcgcgc  atgtggacgc  tgaaagcccg  gaaggagcac   180

accggcatat  ccggcaagcc  caccgcacgg  accgatcgcc  atggctctac  tcggtccgga   240

gattctgagc  tacaagctag  tgcgcggcgt  ttttctcgat  tgccggatcg  ctgtggcgct   300

cagggcgtta  cgggtggtgg  tggtatgaaa  cggagcggtg  tcggttcgct  ctttgccggt   361

gcgcatattg  ccgaggcggt  cccgttggcg  ccgctgacca  ctttgcgtgt  gggcccgatc   420

gcccgacgtg  tcatcacttg  caccagcgcc  gaacaggtgg  tggctgcgct  gcggcacctg   480

gattcggcgg  ccaagaccgg  agctgaccgc  ccgctggtgt  ttgctggtgg  ctccaatttg   540

gtgatcgccg  agaacctgac  cgacctgacc  gtggtgcggt  tggccaatag  cggcatcacc   600

atcgacggta  acttggtgcg  ggccgaggcc  ggtgcggtct  tcgatgacgt  ggtggttagg   660

gccatcgaac  agggtctggg  cggactggaa  tgcctgtctg  gcatcccagg  atcggccggg   720

gcgacacccg  tgcagaacgt  gggggcgtat  ggcgcggagg  tgtctgacac  catcactcgg   780

gttcggcttt  tggatcggtg  cacgggtgag  gtgcgttggg  tatccgcgcg  cgacctgcgc   840

ttcggctatc  gcacgagcgt  gctcaaacac  gctgatgggc  ttgcggtgcc  caccgtggtc   900

ttggaggtgg  agtttgcgct  ggatccgtcg  ggccgcagcg  caccgctgcg  ctacggcgag   960

ctgatcgccg  cgctgaatgc  gaccagcggc  gagcgcgccg  acccgcaagc  ggtccgcgaa  1020

gcggtgctgg  ccctgcgggc  acgcaagggc  atggtgctgg  acccgaccga  ccatgacacc  1080 

tggagcgtgg  gatcgttctt  cacaaacccg  gtggtcaccc  aggatgttta  cgaacggctg  1140 

gccggtgacg  cggccaccag  aaaggacggt  ccggtcccgc  actatcccgc  gcccgacggc  1200 

gtcaagctgg  ccgccggctg  gctggtggaa  cgggccggct  tcggcaaggg  ctatccggat  1260 

gccggcgccg  ccccatgccg  gctttccacc  aaacatgcgc  tggcgctgac  aaatcgtggc  1320 

ggggccaccg  ccgaagatgt  ggtgacgctg  gcgcgcgccg  tgcgcgatgg  ggtccatgat  1380 

gtgtttggta  tcacactaaa  acccgaaccc  gtgctgatcg  gctgcatgtt  g           1431

 

 

<210>  2

<211>  477

<212>  PRT

<213>  人工

 

<400>  2

 

Ser Ile His His Gly Asp Ile Cys Pro Pro Trp Pro His Pro Ser Pro

1               5                   10                  15      

Thr Val Gly Leu Val Ala Asp Asp Gly Cys Pro Pro Pro Gly Cys Asp

            20                  25                  30         

Ala Ile Leu Asn Ala Trp Ala Leu Pro Ile Thr Pro Thr Cys Arg Ser

        35                  40                  45              

Ser Arg Met Trp Thr Leu Lys Ala Arg Lys Glu His Thr Gly Ile Ser

    50                  55                  60                 

Gly Lys Pro Thr Ala Arg Thr Asp Arg His Gly Ser Thr Arg Ser Gly

65                  70                  75                  80 

Asp Ser Glu Leu Gln Ala Ser Ala Arg Arg Phe Ser Arg Leu Pro Asp

                85                  90                  95     

Arg Cys Gly Ala Gln Gly Val Thr Gly Gly Gly Gly Met Lys Arg Ser

            100                 105                 110        

Gly Val Gly Ser Leu Phe Ala Gly Ala His Ile Ala Glu Ala Val Pro

        115                 120                 125            

Leu Ala Pro Leu Thr Thr Leu Arg Val Gly Pro Ile Ala Arg Arg Val

    130                 135                 140                

Ile Thr Cys Thr Ser Ala Glu Gln Val Val Ala Ala Leu Arg His Leu

145                 150                 155                 160

Asp Ser Ala Ala Lys Thr Gly Ala Asp Arg Pro Leu Val Phe Ala Gly

                165                 170                 175    

Gly Ser Asn Leu Val Ile Ala Glu Asn Leu Thr Asp Leu Thr Val Val

            180                 185                 190        

Arg Leu Ala Asn Ser Gly Ile Thr Ile Asp Gly Asn Leu Val Arg Ala

        195                 200                 205            

Glu Ala Gly Ala Val Phe Asp Asp Val Val Val Arg Ala Ile Glu Gln

    210                 215                 220                

Gly Leu Gly Gly Leu Glu Cys Leu Ser Gly Ile Pro Gly Ser Ala Gly

225                 230                 235                 240

Ala Thr Pro Val Gln Asn Val Gly Ala Tyr Gly Ala Glu Val Ser Asp

                245                 250                 255    

Thr Ile Thr Arg Val Arg Leu Leu Asp Arg Cys Thr Gly Glu Val Arg

            260                 265                 270        

Trp Val Ser Ala Arg Asp Leu Arg Phe Gly Tyr Arg Thr Ser Val Leu

        275                 280                 285            

Lys His Ala Asp Gly Leu Ala Val Pro Thr Val Val Leu Glu Val Glu

    290                 295                 300                

Phe Ala Leu Asp Pro Ser Gly Arg Ser Ala Pro Leu Arg Tyr Gly Glu

305                 310                 315                 320

Leu Ile Ala Ala Leu Asn Ala Thr Ser Gly Glu Arg Ala Asp Pro Gln

                325                 330                 335    

Ala Val Arg Glu Ala Val Leu Ala Leu Arg Ala Arg Lys Gly Met Val

            340                 345                 350        

Leu Asp Pro Thr Asp His Asp Thr Trp Ser Val Gly Ser Phe Phe Thr

        355                 360                 365            

Asn Pro Val Val Thr Gln Asp Val Tyr Glu Arg Leu Ala Gly Asp Ala

    370                 375                 380                

Ala Thr Arg Lys Asp Gly Pro Val Pro His Tyr Pro Ala Pro Asp Gly

385                 390                 395                 400

Val Lys Leu Ala Ala Gly Trp Leu Val Glu Arg Ala Gly Phe Gly Lys

                405                 410                 415     

Gly Tyr Pro Asp Ala Gly Ala Ala Pro Cys Arg Leu Ser Thr Lys His

            420                 425                 430        

Ala Leu Ala Leu Thr Asn Arg Gly Gly Ala Thr Ala Glu Asp Val Val

        435                 440                 445             

Thr Leu Ala Arg Ala Val Arg Asp Gly Val His Asp Val Phe Gly Ile

    450                 455                 460                

Thr Leu Lys Pro Glu Pro Val Leu Ile Gly Cys Met Leu   

465                 470                 475     477

Claims (7)

1.一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种结核分枝杆菌蛋白SocAB-murB的表达载体pET-28b-SocAB-murB，其特征在于：在pET-28b中插入了其碱基序列如SEQ ID NO:1所示的基因。

4.一种表达结核分枝杆菌蛋白的工程菌株，其特征在于：它是转染了权利要求3所述的一种结核分枝杆菌蛋白的表达载体pET-28b-SocAB-murB的大肠杆菌BL21（DE3）。

5.一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB的制备方法，它包括以下步骤：

1）提取结核分支杆菌H37RV的基因组；以其为模板，用引物： 

F1：ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCA 

R1：TCCGTTTCATACCACCACCACCCGTAACGCCCTGA  

F2：ACGGGTGGTGGTGGTATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCT

R2：ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT 

进行第一轮扩增，获得基因片段SocAB 和murB；

2）以第一轮扩增获得的基因片段SocAB 和murB，为模板，用引物：

F1：ATCGCATATG TCGATACACCATGGGGACATTTGCCCTCCA

R2：ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT 

进行第二轮扩增，连接基因片段SocAB 和murB，获得目的融合基因SocAB-murB。

6.一种结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB的制备方法，它包括以下步骤：

1）将权利要求5所述的一种结核分枝杆菌重组蛋白基因SocAB-murB的制备方法制得的融合基因SocAB-murB，插入表达载体pET-28b中，获得质粒pET-28b-SocAB-murB；

2）将质粒pET-28b-SocAB-murB，转染至大肠杆菌BL21（DE3）中，诱导表达、纯化。

7.权利要求2所述的结核分枝杆菌重组蛋白SocAB-murB在制备结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒中作为检测抗原的应用。

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