CN102899334A - 一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种结核分枝杆菌重组蛋白及其制备方法，还提供了该重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。采用本发明提供的重组蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了结核分枝杆菌感染临床诊断的需要。

Description

一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及基因工程技术和诊断试剂、疫苗研制领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌重组蛋白质及其制备方法。

【背景技术】

结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)感染所致的人类疾病，是一种严重危害人民健康的慢性传染病，是分支杆菌病的主要类型，主要通过呼吸道传播。目前全球有约20亿人被感染，每年新出现结核病患者约800-1000万，每年因结核病死亡人数约为200-300万。目前我国结核病年发病人数约为130万，因结核病死亡人数每年达13万，超过其它传染病死亡人数的总和。

我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。我国结核病患病人数居世界第二位，仅次于印度。结核病是我国重点控制的重大疾病之一。

目前常用的结核病诊断方法有胸部X光透视和主要依靠患者痰液、胸水、支气管肺泡液的显微镜直接涂片检查（AFP）以及培养法。X光常用作肺结核初步诊断，但特异性差，同时对感染有艾滋病病毒（HIV）的结核病人及肺外结核病人不适用。AFB涂片法灵敏度差（仅为20~30％），用固体培养基培养结核菌，虽然可以显著改善检测结果，但结核菌生长缓慢，一般得6－8周才能出检验报告，况且AFB涂片和培养法只能在检测方法只能在体液中存在细菌时方能检出，而对于不排菌的结核患者就检测不出，故认为上述检测方法已经不能适应临床诊断治疗及传染病控制的要求。为此，人们就企图利用血清学方法以快速诊断结核病。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌重组蛋白，本发明的另一目的是提供该结核分枝杆菌重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。

本发明提供了一种编码结核蛋白的重组核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种结核分枝杆菌蛋白的的表达载体pET-28b-ricR-murB，它是将SEQ ID NO:1所示所述的核苷酸序列插入到质粒pET-28b上得到的重组质粒，其质粒图谱如附图2所示。将表达载体pET-28b-ricR-murB导入大肠杆菌中，得到表达结核蛋白的工程菌株。

本发明利用SEQ ID NO:1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备结核蛋白可以通过如下步骤实现：

1）获得具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

2）将该核苷酸序列导入质粒，优选pET-28b质粒；

3）将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21（DE3）菌株中；

4）在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；

5）回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。

本发明还涉及包含本发明结核蛋白的组合物以及试剂盒。所述的组合物可作为检测结核感染的试剂。所述的组合物可作为检测结核感染的试剂盒。优选地，所述试剂盒的抗原包被量为2.0μg/孔，酶标二抗使用浓度为4mg/ml。

本发明提供的结核蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，因此，本发明的结核蛋白可以用来制备结核疫苗，如亚单位疫苗等，同样，本发明所公开的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列也可用来制备DNA疫苗。因此本发明还涉及包含本发明结核蛋白或核酸的结核的疫苗。

采用本发明提供的结核分枝杆菌蛋白制备的检测试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了结核感染临床诊断的需要。

【附图说明】

图1PCR扩增产物的凝胶电泳图；

图2是表达质粒pET-28b-ricR-murB的构建流程图；

图3是诱导后菌体12％SDS－PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。

【具体实施方式】

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1结核重组蛋白的制备

1.1结核蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆

通过计算机分析TB H37RV基因组全序列，筛选出结核分枝杆菌的强抗原表位，所述的重组蛋白质从N-末端到C-末端依次含有ricR蛋白（GenBank:GU726749.1）、murB（GenBank:EU840989.1）DNA序列为模板，设计扩增引物为：

ricR扩增引物：

F1：ATCGCATATGATGACAGCAGCACACGGCTACACGCAGCA  53.85%  Tm=66.34

R1：ACCGCTCCGTTTCATACCACCACCACCGGAACGAACC    59.46%  Tm=65.53

murB扩增引物：

F2：ATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCTTTGCCGGT  58.33%  Tm=65.07

R2：ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT  56.76%  Tm=65.52

结核分支杆菌H37RV的菌体，加100mL蛋白酶K（10mg/mL），置56℃水浴消化4小时，用常规酚/氯仿法纯化，用上述引物进行PCR扩增；

50ul扩增体系：ddH₂O 35.5ul，10×buffer 5.0ul，4×dNTP 4.0ul，上、下游引物混液4.0ul，DNA 1.5ul，Taqplus 0.2ul(1U)；

F1和R1用于扩增ricR基因的片段，F2和R2用于扩增murB基因的片段；引物F1和R2分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物F2和R1顺序互补，并共同对应于murB基因片段的5’末端序列；

以结核分支杆菌H37RV(购自中国药品生物制品检定所)基因组为模板，以引物F1和R1扩增ricR基因的片段，以引物F2和R2扩增murB基因的片段；

产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后切割，将含DNA条带的胶块按DNA快速纯化试剂盒（购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARA MiniBEST Plasmidpurification）说明回收DNA；

然后再以ricR和murB基因片段为模板用连接PCR扩增ricR、murB融合基因，中间以4个Gly（ggtggtggtggt）连接；即以第一轮PCR扩增得到的ricR目的DNA片段和murB目的DNA片段为模板，加入引物F1和R2，扩增ricR-murB目的DNA片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。

1.2表达载体pET-28b-ricR-murB的构建及鉴定

质粒DNA和ricR-murB均经内切酶切，50ul体系：10x buffer 5.0ul,DNA 12ul，XhoⅠ和NdeⅠ各15U，ddH2O补至50ul；37℃水浴6h。50mL酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切割DNA条带琼脂块，并按DNA快速纯化试剂盒说明回收DNA；

将融合基因片段克隆至pET-28b质粒（具有XhoⅠ和NdeⅠ酶切位点，购自华美生物公司），20ul连接体系：ddH₂O15.0ul，10x buffer 2.0ul，PET-28b 2.0ul，质粒1.0ul,T4DNA连接酶20U；质粒自身连接对照；按上述加样后，混匀、稍离心，14℃-16℃连接过夜；转化E.coli涂平板（含有15微克/毫升卡那霉素的LB固体培养基）并挑克隆提质粒测序，确定序列正确的克隆，质粒构建图见附图2。

1.3表达结核分枝杆菌重组融合蛋白的工程菌的构建

将表达质粒pET-28b-ricR-murB用化学转化法（(美)J萨姆布鲁克(JosephSambrook),(美)D.W.拉塞尔(DavidW.Russell)著,黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社,2002.）转入大肠埃希氏菌BL21（DE3）菌株（购自华美生物技术有限公司），涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导后的菌体用12％SDS－PAGE分析（同上文献），结果如附图3所示，确定表达结核分枝杆菌蛋白的菌株即为所需的工程菌株，用甘油冷冻保存。

1.4结核分枝杆菌重组融合蛋白的表达、纯化

诱导培养已构建好的表达结核分枝杆菌蛋白的大肠埃希氏菌，用终浓度1mMIPTG诱导表达，5小时之后收集菌体。超声破碎、高速离心、收集沉淀。氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。以1:10（W/V）加入菌体裂解液（50mmpH 8.0Tris-Cl,50mm NaCl,50%甘油），加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌（冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80次）、组氨酸亲和柱（300ml 200mm的NiCl₂过柱，流速5ml/min；500ml PBS缓冲液洗注，流速10ml/min；超声离心后的上清液用200ml PBS稀释后上样，流速3ml/min；500ml PBS缓冲液洗注，流速5ml/min；用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的PBS缓冲液洗脱，紫外检测仪280nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS－PAGE电泳检测纯化组分）得到纯化的重组蛋白。

1.5结核分枝杆菌重组融合蛋白鉴定

1.5.1纯度和分子量的测定：经SDS－PAGE电泳检测（蛋白上样量10μg），为单一区带，薄层扫描鉴定纯度为95.8%。分子量约为50Kd，检测结果见附图3。

1.5.2浓度测定：经Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白作为标准参比品，抗原蛋白浓度为5.0±0.15mg/mL。

1.5.3重组蛋白Western-blot验证：

为验证重组TB蛋白质与抗TB抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为：10份兔抗TB抗体阳性血清（购自北京百安天地医药科技有限公司）和30份人抗TB抗体阳性血清（经ELISA法检测证实）。阴性血清为：10份对照正常兔血清和30份人抗TB抗体阴性血清（经ELISA法检测证实）。结果如表1。

表1重组蛋白Western-blot验证结果

血清样品	总例数	阳性例数	阴性例数	阳性检出率	阴性检出率
						兔抗TB抗体阳性血清	10	10	0	100%	0
对照正常兔血清	10	0	10	0	100%
						人抗TB抗体阳性血清	30	30	0	100%	0
人抗TB抗体阴性血清	30	0	30	0	100%

结果显示，用TB菌体培养物免疫兔子所得的10份兔抗TB抗体阳性血清和30份人抗TB抗体阳性血清全部与表达抗原产生阳性反应，10份对照正常兔血清和30份人抗TB抗体阴性血清与表达抗原均产生阴性反应。结果提示重组目的基因获得表达，重组TB蛋白质与全病毒蛋白质有明显的交叉反应性，并具有很强的特异性，具有实际应用意义。

实施例2酶联免疫法（ELISA）检测结核分枝杆菌抗体IgG的建立

采用间接ELISA方法检测结核分枝杆菌抗体IgG，可用于TB抗原活性的鉴定和TB感染的辅助诊断。本实施例以实施例1制得的结核分枝杆菌重组融合蛋白做抗原；为确定抗原包被量和酶标二抗工作浓度，以阳性和阴性参考品为测试样品，采用方阵滴定法选择最佳抗原包被量和相应的酶标二抗工作浓度，见下表2。

表2最佳抗原包被量和相应的酶标二抗工作浓度的选择

根据测试结果，在抗原包被量为4.0μg/孔，酶标二抗使用浓度为4mg/ml时，检测结果最佳，故以TB重组抗原4.0μg/孔包被微孔板和4mg/ml酶标二抗IgG，建立结核分枝杆菌抗体IgG酶联免疫检测法（间接ELISA）。

实施例3结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）的性能检定

将实施例1制得的重组TB蛋白包被微孔板，用ELISA法测定TB IgG抗体。

3.1该试剂盒原理和组分如下：

（1）试剂盒原理：本品系用基因工程重组TB抗原包被的微孔板，辣根过氧化物酶（HRP）标记抗人IgG为示踪物，TMB显色系统，应用间接法原理检测人血清或血浆中的抗TB IgG抗体。

（2）试剂盒主要组成成分：

1）预包被板：系用本发明的重组TB抗原包被的微孔板，1块（9×12孔）；

2）酶结合物：辣根过氧化物酶（HRP）标记抗人IgG为示踪物。0.2M PB(pH 7.4±0.2)缓冲液100.0ml，NaCl 8.775g，酪蛋白1.0g，20%Tween-200.25ml，正常初生牛血清200.0ml，去离子水700.0ml。1瓶，12ml。

3）阴性对照：0.2M PB(pH7.4±0.2)缓冲液100.0ml，蔗糖50.0g，人TB IgG阴性血清200.0ml，去离子水00.0ml。1瓶，0.4ml。

4）阳性对照：0.2M PB(pH 7.4±0.2)缓冲液100.0ml，蔗糖50.0g，人TB IgG阳性血清0.5ml，小牛血清200.0ml，去离子水700.0ml。1瓶，0.4ml。

5）浓缩洗液（20×）：十二水磷酸氢二钠58.0g，二水磷酸二氢钠5.93g，氯化钠175.5g，吐温-20 10.0ml，简它素0.035g，去离子水加至1000.0ml。1瓶，50ml。

6）底物液A：三水醋酸钠4.76g，冰醋酸0.9ml，过氧化脲0.5g，去离子水加至1000.0ml。1瓶，6ml。

7）底物液B：一水柠檬酸1.0g，乙二胺四乙酸0.1g，TMB 0.32g，DMF 2.0ml，浓硫酸0.1ml，甲醇50.0ml，4% PVA2.0ml，4%硫代硫酸钠0.05ml，去离子水加至950.0ml。1瓶，6ml。

8）终止液：浓硫酸56.25ml，去离子水944.0ml。1瓶，6ml。

3.2试剂盒性能检定

特异性测定：按间接ELISA测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清（临床已确定），符合率为100％；检测30份类风湿因子阳性血清标本、30份抗核抗体阳性血清标本，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

灵敏度测定：按间接ELISA测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清（临床已确定），符合率为100％。

精密性测定：按间接ELISA测定方法，检测本试剂盒的精密性。使用本试剂盒对2份抗TB强阳性血清、1份阳性血清、1份阴性血清以及试剂盒的阳性对照、阴性对照进行每板双孔，共10板的检测，结果如表4，可见试剂盒的重复性良好，对不同血清检测的CV均低于15%。

表3试剂盒的精密性

与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与郑州安图绿科生物工程有限公司试剂盒检测250份血清样本的比较实验结果如表4。

表4与郑州安图结核杆菌IgG抗体检测试剂盒（酶联免疫法）的比较测试结果

检测总符合率=（48+199）/250=98.8％，初步表明本试剂盒达到市场同类试剂盒的标准。

Claims (9)

1.一种编码结核分枝杆菌蛋白的重组DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 

2.一种结核分枝杆菌蛋白，其特征在于它由权利要求1所述的重组DNA序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 

3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌蛋白，其特征在于用于扩增的引物序列为： 

ricR扩增引物： 

F1：ATCGCATATG ATGACAGCAGCACACGGCTACACGCAGCA 

R1：ACCGCTCCGTTTCATACCACCACCACCGGAACGAACC 

murB扩增引物： 

F2：ATGAAACGGAGCGGTGTCGGTTCGCTCTTTGCCGGT 

R2：ATCGCTCGAG CAACATGCAGCCGATCAGCACGGGTT。 

4.一种结核分枝杆菌蛋白的表达载体pET-28b-ricR-murB，其特征在于它是将权利要求1所述的重组DNA序列插入到质粒pET-28b上得到的重组质粒。 

5.一种表达结核分枝杆菌蛋白的工程菌株，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体pET-28b-ricR-murB，宿主菌为大肠杆菌。 

6.根据权利要求5所述的工程菌株，其特征在于所述宿主菌为BL21（DE3）菌株。 

7.一种检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，其特征在于其组分中的抗原是根据权利要求2所述的重组结核蛋白。 

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于抗原包被量为2.0μg/孔，酶标二抗使用浓度为4mg/ml。 

9.权利要求2所述的结核分枝杆菌蛋白或权利要求4所述的表达载体pET-28b-ricR-murB或权利要求5所述的工程菌株在制备用于检测结核分支杆菌的剂试盒中的用途。 

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