发明内容:
本发明的目的是提供一种用基因工程方法生产,与常用的病毒提取抗原组分相比,可为风疹病毒感染IgM抗体的检测提供更为特异、准确的抗原原料,即重组风疹病毒E1蛋白。
本发明的第二目的是提供一种重组风疹病毒E1蛋白在检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒中应用。
本发明的第三目的是提供该重组风疹病毒E1蛋白在制备单抗、多抗及蛋白芯片中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种编码风疹病毒E1蛋白的重组DNA,其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的重组风疹病毒E1蛋白,其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
一种重组风疹病毒E1蛋白的表达载体,它是将如SEQID NO:1所示的重组DNA序列插入到质粒pET-32a上得到的重组质粒pET-32a-E1,其质粒图谱如附图1所示。将表达载体pET-32a-E1导入大肠杆菌中,得到表达重组风疹病毒E1蛋白的工程菌株。
一种检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒,该试剂盒中含有SEQID NO:2所示的重组风疹病毒E1蛋白。
所述的检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒,该试剂盒组成如下:
1)反应板:用抗人IgM抗体包被液包被空白板,40ng/100μl/孔,4℃静置16~24小时,洗涤扣干后,加入封闭液,200μl/孔,37℃静置2小时,弃液、干燥后封装;
其中,优选,包被抗人IgM抗体的浓度是40ng/孔;
2)酶结合物:将重组风疹病毒E1蛋白与酶标抗原稀释液混合均匀;
其中,优选,重组风疹病毒E1蛋白的浓度为4mg/mL。
3)浓缩洗液:pH7.4,0.2M PBS,2%吐温-20;
4)底物液A:pH4.5,0.1M柠檬酸-醋酸盐缓冲液,0.05%过氧化氢;
5)底物液B:50%甲醇,0.05%3,3,5,5—四甲基联苯胺(TMB);
6)终止液:1M硫酸。
检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒,其组分中的抗原是所述的重组风疹病毒E1蛋白。用于标记重组风疹病毒E1蛋白的标记物选自酶、荧光物质、胶体金中的一种或多种,标记物的制备采用本领域技术人员所熟知的常规方法。所述试剂盒还包括固定抗体的固相,固相可以是本领域技术人员所熟知的常用固相,例如聚苯乙烯、微量滴定板、免疫层析用滤纸等。
优选地,本发明所述的试剂盒采用酶标抗原,其中,包被抗人IgM抗体的浓度是40ng/孔,包被液由0.05mol/L的碳酸盐缓冲组成,pH=9.6;封闭液由0.01mol/L PBS、0.2%酪蛋白和0.1%硫柳汞钠组成,pH=8.0;酶标抗原稀释液由0.01mol/L PBS、0.5%酪蛋白和0.1%硫柳汞钠组成,pH=7.2。
所述的重组风疹病毒E1蛋白在制备单抗、多抗及蛋白芯片中的应用。
本发明的有益效果是:
采用本发明提供的重组风疹病毒E1蛋白制备的诊断试剂盒,与市场上的同类试剂盒相比,具有特异性强、灵敏度高等优点,很好的满足了风疹病毒感染临床诊断的需要。
具体实施方式:
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1 重组风疹病毒E1蛋白的制备
重组风疹病毒E1蛋白的氨基酸序列是根据RV包膜糖蛋白E1(glycoprotein E1)的氨基酸序列设计的,该序列为RV包膜糖蛋白E1(glycoprotein E1)的氨基酸序列的203-295位氨基酸。
1.1风疹病毒E1蛋白的重组DNA的合成
通过计算机分析RV包膜糖蛋白E1(glycoprotein E1)的氨基酸序列,并结合已经证实的抗原表位,选取其中抗原性很强部分序列。
RV包膜糖蛋白E1(glycoprotein E1)氨基酸全序列如下:EEAFTYLCTAPGCATQAPVPVRLAGVRFESKIVDGGCFAPWDLEATGACICEIPTDVSCEGLGAWVPAAPCARIWNGTQRACTFWAVNAYSSGGYAQLASYFNPGGSYYKQYHPTACEVEPAFGHSDAACWGFPTDTVMSVFALASYVQHPHKTVRVKFHTETRTVWQLSVAGVSCNVTTEHPFCNTPHGQLEVQVPPDPGDLVEYIMNYTGNQQSRWGLGSPNCHGPDWASPVCQRHSPDCSRLVGATPERPRLRLVDADDPL LRTAPGPGEVWVTPVIGSQARKCGLHIRAGPYGHATVEMPEWIHAHTTSDPWHPPGPLGLKFKTVRPVALPRTLAPPRNVRVTGCYQCGTPALVEGLAPGGGNCHLTVNGEDLGAVPPGKFVTAALLNTPPP YQVSCGGESDRATARVIDPAAQSFTGVVYGTHTTAVSETRQTWAEWAAAHWWQLTLGAICALPLAG LLACCAKCLYYLRGAIAPR
其中带下划线的序列为表位序列。根据分布情况,选择了含有强表位比较集中的203-295位氨基酸用于合成。选择的表位区的氨基酸序列如下:
LVEYIMNYTGNQQSRWGLGSPNCHGPDWASPVCQRHSPDCSRLVGATPERPRLRLVDADDPL LRTAPGPGEVWVTPVIGSQARKCGLHIRAGP
其中带下划线的序列为抗原表位所在的区域。
根据氨基酸的序列,用大肠杆菌的密码子,翻译成核甘酸序列,在核甘酸序列两侧分别添加BamHI和SalI酶切位点。得到的核甘酸序列如下:
GGATCCCTGGTTGAATACATCATGAACTACACCGGTAACCAGCAGTCTCGTTGGGGTCTGGGTTCTCCGAACTGCCACGGTCCGGACTGGGCTTCTCCGGTTTGCCAGCGTCACTCTCCGGACTGCTCTCGTCTGGTTGGTGCTACCCCGGAACGTCCGCGTCTGCGTCTGGTTGACGCTGACGACCCGCTGCTGCGTACCGCTCCGGGTCCGGGTGAAGTTTGGGTTACCCCGGTTATCGGTTCTCAGGCTCGTAAATGCGGTCTGCACATCCGTGCTGGTCCGGTCGAC
其中下划线序列为酶切位点的序列。
将以上设计的DNA序列送专业的生物工程公司进行基因合成,在本发明中送上海生工生物工程技术有限公司进行基因合成。合成产物克隆到pUC19质粒中,得到pUC19-E1。
1.2表达载体pET-32a-E1的构建及鉴定
表达载体pET-32a质粒(购自华美生物技术有限公司)具有卡拉霉素抗性,并携带BamHI、SalI酶切位点。将pET-32a质粒转化JM109感受态细胞(购自华美生物技术有限公司),挑单菌落培养,并用碱裂解法抽提质粒(具体操作参见《分子克隆》第三版,科学出版社,2002年8月出版)。
表达质粒构建过程如附图2所示。
将pET-32a质粒和pUC19-E1质粒分别用BamHI和SalI酶进行双酶切,酶切体系为(50μl):
10×buffer 5.0μl
酶切底物(pET-32a质粒或克隆的目的基因) 12μl
BamHI 15U
SalI 15U
ddH2O 补足50μl。
37℃水浴6h后取出,用1%的琼脂糖凝胶电泳分离,分别切胶回收pET-32a线性质粒和大小约为300bp的E1目的基因。切取含目的DNA条带的胶块,用DNA快速纯化试剂盒(购自北京天根公司,胶回收试剂盒,货号为DP209-02)回收目的DNA,操作按产品说明书进行。
然后进行连接反应,连接体系(20μl)为:
ddH2O 15.0μl
10×buffer 2.0μl
pET-32a质粒酶切产物 2.0μl
E1酶切产物 1.0μl
T4DNA连接酶 20U。
按上述比例加样后混匀、离心,14-16℃连接过夜。
从液氮罐中取1管JM109感受态细胞(购自华美生物技术有限公司)融化后置于冰水浴中10min。取10μl上述连接产物加入于100μl大肠杆菌JM109感受态细胞中,混匀,依次进行如下处理:0℃30min,42℃2min,0℃2min。然后加入400μl LB培养基,混匀,在37℃轻摇45min;离心,弃去400μl上清,将沉淀悬浮、混匀,铺LB琼脂平板(含50μg/ml卡那霉素),将平板上的液体吸干后倒置,于37℃培养过夜。取1μl未酶切的质粒做对照,进行转化。结果连接产物转化感受态细胞后形成83个菌落,从中随机挑选8个菌落培养过夜,碱裂解法抽提质粒。选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增,并进行琼脂糖凝胶电泳,对有扩增产物的重组子质粒经BamHI和SalI双酶切鉴定,其中有3个重组质粒的双酶切产物可见一条约300bpDNA条带,则这3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个送奥科公司测序,测序结果表明该质粒上确实插入了目的基因,且插入方向正确,将此重组质粒命名为表达质粒pET-32a-E1。
1.3表达重组E1蛋白的工程菌的构建
将表达质粒pET-32a-E1转化大肠杆菌BL21感受态细胞(购自华美生物技术有限公司),铺LB琼脂平板(含50μg/ml卡拉霉素),于37℃培养过夜。然后挑单菌落于LB液体培养基(含50μg/ml卡拉霉素),37℃培养过夜。再按体积比1%的接种量接种于新鲜LB液体培养基(含50μg/ml卡拉霉素),37℃培养至对数生长期,加0.4mmol/L IPTG诱导4h。诱导菌体用15%SDS—PAGE分析,结果如附图3所示,表达E1蛋白的菌株即为所需的工程菌株,用甘油冷冻保存。
1.4重组风疹病毒E1蛋白的制备和纯化
1.4.1重组风疹病毒E1蛋白的诱导及表达条件优化
取保存的工程菌种,融化,接种环取菌液划线接种LB琼脂平板(含50μg/ml卡那霉素),37℃培养过夜。挑单菌落于5ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素),37℃培养过夜,按体积比1%的接种量接种于5ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素),37℃培养至对数生长期,不同培养试管加不同IPTG浓度诱导,诱导浓度分别是0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L。37℃继续培养3h,离心收集菌体,用15%SDS—PAGE分析菌体蛋白。结果用0.4mmol/L IPTG和1.0mmol/L IPTG诱导表达E1的表达量最大,确定IPTG诱导浓度为0.4mmol/L。
将上述单菌落过夜培养的菌液按体积比1%的接种量接种于20ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素),37℃培养至对数生长期,加IPTG0.4mmol/L,37℃培养,分别于0h、1h、2h、3h、4h、5h取1.5ml菌液,离心收集菌体,用15%SDS—PAGE分析菌体蛋白。结果显示诱导4h效果最好。用0.4mmol/L IPTG诱导4h,表达的E1的量占全菌体蛋白的20—25%。
重组风疹病毒E1蛋白表达:按上述方法诱导培养100ml工程菌,诱导条件为上述确定的条件。5000rpm离心5min,每g菌湿重加3ml裂解缓冲液[Tris.Cl(pH8.0)50mmol/L,EDTA1mmol/L,NaCl100mmol/L],加溶菌酶至0.3mg/ml,PMSF至0.1mmol/L,其间搅拌20min;超声波破碎菌体,功率50W,超声1min,间隙1min,共超声10次;4℃12000rpm离心15min,上清为可溶部分,沉淀为包涵体。用2ml包涵体溶解液[8M尿素、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]溶解包涵体。分别取超声上清和包涵体溶解液上清各0.1ml,加0.1ml2×SDS加样缓冲液,混匀,沸水浴3min,用15%SDS-PAGE分析。蛋白凝胶电泳显示包涵体和包涵体溶解上清液中有大量E1。
1.4.2重组风疹病毒E1蛋白的纯化
摇床振荡培养2L菌液可获得约13.6g菌体,用于纯化预实验,经过实验确定E1制备工艺为:诱导菌液在5000rpm离心5min,每g菌湿重加3ml裂解缓冲液[Tris.Cl(pH8.0)50mmol/L,EDTA1mmol/L,NaCl10Ommol/L],加溶菌酶至0.3mg/ml,PMSF至0.1mmol/L,其间不断搅拌20min;超声波破碎菌体,功率300W,超声20sec,间隙20sec,共超声80次;4℃12000rpm离心15min,弃上清,沉淀分别用含1%Triton-X100、2%Triton-X100、2%Triton-X100的裂解缓冲液各洗涤包涵体1次。20mmol/LTris.Cl/8M尿素(pH8.0)溶解包涵体,置4℃至大部分包涵体溶解,然后在4℃下12,000rpm离心15min,收集上清。
20mmol/L Tris.Cl/8M尿素(pH8.0)DEAE-52平衡离子交换柱,将包涵体溶解液上清上样于DEAE-52离子交换柱;上样完毕,用20mmol/L Tris.Cl/8M尿素(pH8.0)充分洗去未结合的蛋白,然后用0.1M-0.3M NaCl梯度洗脱,同时收集蛋白。SDS—PAGE电泳检测洗脱峰对应收集管的溶液,含目的蛋白的收集管合并,透析脱盐后,再上PEI离子柱,用0.1M-0.5M NaCl梯度洗脱,15%SDS—PAGE检测洗脱峰,含目的蛋白较多且较纯的收集管合并,透析除盐复性。
1.5重组风疹病毒E1蛋白的性质检定
Lowry法测蛋白浓度:工程菌发酵培养,13L培养液可获得359.97g菌体湿重,经纯化可获得447.5mg纯度在90%以上的重组风疹病毒E1蛋白。
重组风疹病毒E1蛋白纯度:20μl E1纯化产品加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液[Tris.Cl(pH6.8)100mM,DTT200mM,SDS4%,溴酚蓝0.2%,甘油20%],沸水浴3min。浓缩胶5%,分离胶12%;恒电流20mA电泳。加样量≥10μg,凝胶经考马斯亮蓝染色和甲醇-冰乙酸脱色呈一条蛋白带;经扫描,不同批纯化E1占总蛋白的比例分别是96.2%、97.14%、95.8%。
高效液相测蛋白纯度:所用仪器—色谱泵:Waters600Pump;检测器:PDA966;色谱柱:Protein-pak300SW;色谱工作站:Millnnium2010。检测条件—检测波长:280nm;流速:0.5ml/min;上样量:20μl;流动相:0.05M磷酸缓冲液;灵敏度:0.005AUFS。三批纯化E1的其主峰的面积占总面积分别是97.5%、97.3%、97.1%;主峰≥总面积的95%。
ELISA法检测重组风疹病毒E1蛋白特异性:意大利进口试剂盒的风疹感染病人血清IgM抗体检测总敏感性分别为69.0%、75.2%,而本发明得到的重组风疹病毒E1蛋白检测血清特异性分别为97.1%、94.3%。
实施例2检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒的制备和性能检定
2.1检测风疹病毒IgM抗体感染的试剂盒的制备
将实施例1制得的重组风疹病毒E1蛋白用作试剂盒酶标抗原制备的底物,用ELISA法测定RVIgM抗体。
该试剂盒的研制和使用如下:
1)试剂盒原理:本品系用抗人IgM(μ链)包被的微孔板,辣根过氧化物酶(HRP)标记重组风疹病毒E1为示踪物,TMB显色系统,应用捕获法原理检测人血清或血浆中的抗风疹病毒IgM抗体。
2)试剂盒主要组成成分:
a)预包被板:
b)包被液:0.05mol/l,pH9.6的碳酸盐缓冲系统
c)封闭液:由0.01mol/L PBS、0.2%酪蛋白和0.1%硫柳汞钠组成,pH=8.0;
d)酶标抗原稀释液:由0.01mol/L PBS、0.5%酪蛋白和0.1%硫柳汞钠组成,pH=7.2。
e)重组风疹病毒E1
f)浓缩洗液:pH7.40.2M PBS,2%吐温-20
g)底物液A:pH4.50.1M柠檬酸-醋酸盐缓冲液,0.05%过氧化氢
h)底物液B:50%甲醇,0.05%3,3,5,5—四甲基联苯胺(TMB)
i)终止液:1M硫酸
3)试剂盒性能优化:
按照最大结合,运用ELISA方法,确定试剂盒中的包被抗人IgM抗体和重组风疹病毒E1的最佳浓度,结果如表1、2。
表1最佳抗人IgM抗体包被浓度的选择
表2重组风疹病毒E1浓度的选择
由上述结果可看出,包被抗人IgM(μ链)抗体的最佳浓度为40ng/孔,重组风疹病毒E1最佳工作浓度4mg/ml。
根据三种不同包被系统灵敏度、特异性及均一性比较的结果,选择抗体包被缓冲系统,结果见表3。
表3不同包被系统各项性能指标比较
由表3结果可见,pH值9.6,0.05mol/l碳酸盐缓冲液包被系统综合指标较其它两种包被系统更好一些,因此本发明确定包被系统是:0.05mol/l,pH9.6的碳酸盐缓冲系统。
根据三种不同封闭系统灵敏度、特异性及均一性比较的结果,选择抗体封闭缓冲系统,结果见表4。
表4不同封闭系统各项性能指标比较
由表4结果可见,含酪蛋白的缓冲液封闭系统综合指标较其它两种包被系统更好一些,因此本发明确定封闭系统是:由0.01mol/L PBS、0.2%酪蛋白和0.1%硫柳汞钠组成,pH=8.0的封闭液。
根据三种不同酶标抗原稀释液灵敏度、特异性、变异性及对酶标抗原热稳定性比较结果,选择抗体封闭缓冲系统,结果见表5。
表5不同酶标抗原稀释系统各项性能指标比较
由表5结果可见,含0.5%酪蛋白的酶标缓冲液系统对酶标抗原的热稳定性保护作用较好,综合指标较其它两种包被系统更好一些,因此本发明确定酶标抗原稀释液是:由0.01mol/L PBS、0.5%酪蛋白和0.1%硫柳汞钠组成,pH=7.2的酶标抗原稀释液。
4)试剂盒的制备
反应板的制备:用抗人IgM(μ链)抗体包被液(包被液浓度40ng/孔,0.05mol/l,pH9.6碳酸盐缓冲系统)包被空白板,100μl/孔,4℃静置16~24小时。洗涤扣干后,加入封闭液(0.01mol/l PBS,0.2%酪蛋白,0.1%硫柳汞钠)200μl/孔,37℃静置2小时。弃液、干燥后封装。
酶结合物的制备:将重组风疹病毒E1蛋白与酶标抗原稀释液(由0.01mol/LPBS、0.5%酪蛋白和0.1%硫柳汞钠组成,pH=7.2)混合均匀;重组风疹病毒E1蛋白的浓度为4mg/mL。
5)试剂盒操作方法:
平衡:将试剂盒从冷藏环境中取出,置室温平衡30分钟后使用。
配液:将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用。
设定:每次试验应预设空白对照1孔(暂不加任何液体),阴性对照3孔,阳性对照2孔。
加样:按顺序在各反应孔中分别加入20μl待检标本和阴、阳性对照。
加酶:依次向每孔加入100μl酶结合物(空白对照孔不加),振荡混匀。
温育:在反应板上加盖封板膜,置37℃温箱或水浴锅中,反应60分钟。
洗板:将孔内液体甩干,在各反应孔加入稀释后的洗涤液300μl,静置15秒钟,甩弃洗涤液;如此洗涤5遍,最后一次扣干反应板。
显色:每孔依次加入底物A、B液各50μl(包括空白对照孔),加盖封板膜,振荡混匀,37℃避光显色15分钟。
终止:每孔加入终止液各50μl(包括空白对照孔),振荡混匀终止反应。
测定:用空白对照孔调零,并尽快用酶标仪单波长450nm测定各孔0D值。
也可用双波长450nm/630-690nm测定各孔OD值。
试验结果判定:
临界值(cut-off值)计算:
临界值=0.10+阴性对照OD平均值(阴性对照OD平均值≤0.05按0.05计算)。
结果判定:测定标本OD值≥临界值时为抗RV抗体阳性。
测定标本OD值<临界值时为抗RV抗体阴性。
2.2试剂盒性能检测实验
特异性(准确性)测定:按前述实验确定的捕获ELISA测定方法,检测几种其他血清物质,观察反应特异性。结果显示,使用本发明试剂盒检测10份阴性血清(临床已确定),符合率为100%;检测类风湿因子阳性血清标本、丙型肝炎阳性血清标本、梅毒阳性血清标本和其他病原感染标本,以及内源性干扰物标本,合计800份,无一阳性,表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性,特异性很好。
灵敏度(特异性)测定:按前述实验确定的捕获ELISA测定方法,检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测10份阳性血清(临床已确定),符合率为100%。
精密性测定:用1份抗RV-IgM中阳性血清进行CV检测,方法如下:在40块板中,每10块中随机抽取一块,每块取24孔。合并一块,进行实验。结果:平均值X=0.799,标准差S=0.042,精密性CV=5.2%,可见试剂盒的重复性良好。
与国内外同类产品的比较试验:本发明试剂盒与意大利SORIN试剂盒检测9810份血清样本的比较实验结果如表6。
表6与意大利SORIN抗体检测试剂盒的比较检测结果
真实性和预示值计算分析:灵敏度92.8%,特异性99.9%,假阳性率0.5%,假阴性率0.6%,粗一致性99.8%。表明本试剂盒的灵敏度及特异性均达到甚至优于进口试剂盒的标准。