CN101509002A - 一种重组风疹病毒蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可用于风疹病毒感染临床诊断的风疹病毒蛋白，编码该蛋白的核苷酸序列，包括该核苷酸序列的质粒和原核宿主细胞，本发明还包括制备该蛋白的方法及其应用。

Description

一种重组风疹病毒蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种重组风疹病毒蛋白及其应用。

背景技术

风疹病毒是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，外形呈球形的风疹病毒(RUBELLA VIRUS，RUV)是风疹的病原体，人类是其唯一宿主。风疹是一种以发热、呼吸道卡痰和出疹为主要症状的急性呼吸道传染病。孕妇，特别是妊娠早期的孕妇感染风疹病毒可导致胎儿先天性风疹综合征(CONGENITAL RUBELLASYNDROME，CRS)。风疹及CRS在全世界均有发生，亚洲感染率高。孕妇患风疹后，特别是妊娠的前3～4个月内，风疹病毒可侵犯胎盘并传染给胎儿，引起先天性风疹高达30％～35％。孕妇除发生死胎、流产与早产外，可出现一种或多种畸形，如心血管畸形、眼部疾病、神经性耳聋、小头畸形、智力发育不全等，婴儿出生后病死率1岁内可达10％～20％(Miller E，Cradock2Watson J E，and Pollock T.M.Consequences of clnfirmed maternal rubella at successive stages of pregnancy〔J〕.Lancet 1982，8032：7812782)。建立RV感染的快速、准确检测方法是预防RV感染的关键所在。

目前风疹病毒感染的诊断方法有病毒分离(Grutadauria S，Cordoba P，Cuffini C，et al..Cell-fusion assay for the detection of rubella virus in Vero cells ClinDiagn Vir。1，1998；10)(1)：9-16)；血清学诊断(Tipples GA，Hamkar R，MohktariAzad T，et al..EvaLuation of ru-bella IgM enzyme immunoassays.J Clin Virol，2004；30(3)：233-238.)和分子生物学检测(Katow S.Rubella virus genome diagnosisduring pregnancy and mechanism of congenital rubella.Intervirology，1998；41：163-169)。免疫学方法由于操作简便，临床常用，适于RV感染的实验室诊断和大规模现场调查。目前大多检测试剂盒用的RV蛋白抗原来源于病毒培养物或是重组表达的单一蛋白片段，或者由于蛋白质抗原纯度低及特异性差，造成假阳性而降低检测特异性。尽管多种单一片段组合制备检测试剂可以避免上述问题，但必然要求多次进行提取纯化过程，而且小分子蛋白质或多肽的提纯技术要求更高。本发明提供了一种用基因工程方法生产的重组抗原，含有更多的高特异性、强免疫原性蛋白质序列，能够有效避免前述问题，可为风疹病毒感染的检测提供更为特异、准确的原料。

在全球范围内，目前缺乏有效治疗病毒感染药物的情况下，通过接种疫苗预防病毒感染成为一种重要的医学干预手段。同时，RV疫苗的研制也是进行RV研究的重要领域之一。

发明内容

发明内容

本发明的目的是提供一种重组风疹病毒蛋白，本发明的另一目的是提供该重组风疹病毒蛋白在制备检测试剂盒中的应用。

本发明的技术方案

本发明提供了一种编码风疹病毒蛋白的重组核酸，其核苷酸序列如序列1所示。同时提供了由该重组核酸表达的风疹病毒蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。

本发明还提供了一种风疹病毒蛋白的表达载体pET-28a-RV，它是将序列1所示所述的核苷酸序列插入到质粒pET-28a上得到的重组质粒，其质粒图谱如附图1所示。将表达载体pET-28a-RV导入大肠杆菌中，得到表达风疹病毒蛋白的工程菌株。

本发明利用序列1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备人风疹病毒蛋白可以通过如下步骤实现：

1)获得具有序列1所示的核苷酸序列；

2)将该核苷酸序列导入质粒，优选pET-28a质粒；

3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21(DE3)菌株中；

4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；

5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。

本发明还涉及包含本发明风疹病毒蛋白的组合物以及试剂盒。所述的组合物可作为检测风疹病毒感染的试剂。所述的组合物可作为检测风疹病毒感染的试剂盒。

本发明提供的RV蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，因此，本领域技术人员可以想到，本发明的风疹病毒蛋白可以用来制备RV疫苗，如亚单位疫苗等，同样，本发明所公开的如序列1所示的核苷酸序列也可用来制备DNA疫苗。因此本发明还涉及包含本发明风疹病毒蛋白或核酸的风疹病毒的疫苗。

发明的详述

本发明公开了一种编码风疹病毒蛋白的如序列1所示的核苷酸序列，利用该核苷酸序列制备风疹病毒蛋白的方法，由该方法制备的包含序列2所示氨基酸序列的风疹病毒蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测人风疹病毒感染的应用。另外，本发明的风疹病毒蛋白及本发明的核酸还可用于风疹病毒疫苗的制备。

本发明的一个实施方案涉及一种编码风疹病毒蛋白的如序列1所示的核苷酸序列。碱基的编号为常规的5’至3’顺序。

序列1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，优选根据目的片段的DNA序列，即RV的E1、E2和C上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计三对PCR引物(P1，P2)、(P3，P4)和(P5，P6)。p1和p2用于扩增E1第523位到第978位核苷酸，p3和p4用于扩增E2第28位到第204位核苷酸，p5和p6用于扩增C第13位到第309位核苷酸。引物p1和p6分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物p2和p3顺序互补，并共同对应于E1上述片段的3’末端和E2上述片段的5’末端序列，引物p4和p5顺序互补，并共同对应于E2上述片段的3’末端和C上述片段的5’末端序列。

以风疹病毒培养物为模板，以引物P1和P2扩增E1片段，以引物P3和P4扩增E2片段，以引物P5和P6扩增C片段；再以第一轮PCR扩增得到的E1片段和E2片段为模板，加入引物P1和P4，扩增E1E2片段；然后以第二轮PCR扩增得到的E1E2片段和第一轮PCR扩增得到的C片段为模板，加入引物P1和P6，扩增E1E2C，得到串联的目的基因重组片段：E1E2C。

本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。

本发明的一个实施方案涉及应用如序列1所示的核苷酸序列制备风疹病毒蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码风疹病毒蛋白的如序列1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。

编码本发明蛋白的核酸与pET-28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。

在本发明的一个实施方案中，如图2所示，制备含有序列1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-28a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21(DE3)，经IPTG诱导培养4～5小时后，收集菌体。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。

本发明的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化的风疹病毒蛋白，该蛋白具有序列2所示氨基酸序列。

本发明的一个实施方案涉及包含本发明风疹病毒蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测风疹病毒感染的试剂或试剂盒形式。

本发明的一个实施方案涉及包含本发明风疹病毒蛋白的风疹病毒感染试剂。在该产品中，本发明蛋白可以干燥粉末形式存在，在使用前稀释至所需浓度；也可以一定浓度的溶液形式存在。包含本发明风疹病毒蛋白的风疹病毒感染监测试剂可包括一个容器和位于该容器表面的或与该容器相关的标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器可内含检测风疹病毒感染的本发明蛋白的组合物。所述标签或包装插页说明所述包含本发明风疹病毒蛋白的组合物的使用方法和用途说明。

本发明的另一实施方案涉及含本发明的风疹病毒蛋白的风疹病毒感染监测试剂盒，在临床上用于方便、快速和准确的风疹病毒感染。

本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成风疹病毒感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断风疹病毒感染。本发明试剂盒可包括其它多个容器，其中可分别含有检测所用的标准品，抗体或经过标记的抗体、酶，底物或缓冲液等。在该试剂盒中，还包括标签和包装插页用以提供试剂盒的使用说明。还可包括符合用户需要的其它材料，如微量滴定板等。

在用于风疹病毒感染检测的试剂盒中，本发明的风疹病毒蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。

与上述标记物结合的方法是已知的。当标记物为酶时，其底物和显色剂可用于测定其活性。当使用过辣根过氧化物酶时，以3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺作为底物溶液，并使用TMB显色系统。当使用过氧化物酶时，以H₂O₂作为底物溶液，并以邻苯二胺、4-氨基氨替比林等作为显色剂。当使用碱性磷酸酶时，可用邻硝基苯磷酸、对硝基苯磷酸等作为底物。

本发明涉及风疹病毒感染检测方法，所述检测通过应用包含本发明风疹病毒蛋白的试剂或试剂盒，采用常规的血清学方法来实现，例如，可以使用包含本发明的风疹病毒蛋白的试剂或试剂盒检测血清等体液中的抗风疹病毒抗体。检测抗风疹病毒抗体的方法有间接试验，如将本发明风疹病毒蛋白抗原吸附于固相载体，然后加入待检血清，如有相应抗体存在，则与抗原在载体上形成抗原-抗体复合物，洗涤后加入酶标抗抗体或胶体金标记抗抗体，显色观察结果。所述的间接试验方法例如ELISA法、斑点金标免疫渗滤法等。

任何生物学样品，只要它们含有风疹病毒抗体，就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。

在上述风疹病毒感染检测中所用到的包含本发明风疹病毒蛋白的所有试剂或试剂盒都包括在本发明的范围内。

(三)有益效果

采用本发明提供的重组风疹病毒蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了风疹病毒感染临床诊断的需要。本发明提供的RV蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在RV疫苗研制领域具有实际应用价值。

附图说明

图1是表达质粒pET-28a-RV的构建流程图。

图2试剂盒组装示意图

图3是诱导后菌体12％SDS—PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1  重组风疹病毒蛋白的制备

1.1 风疹病毒蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆

通过计算机分析风疹病毒的全部氨基酸序列筛选出风疹病毒蛋白的强抗原表位，包括风疹病毒E1从N-末端175位到326位的152个氨基酸，E2从N-末端10位到68位的59个氨基酸和C从N-末端5位到103位的99个氨基酸。所述重组蛋白质的DNA序列如SEQ IDNo.1所示，其中，E1目的肽段DNA序列是E1第523位到第978位核苷酸，E2目的肽段DNA序列是E2第28位到第204位核苷酸，C目的肽段DNA序列是C第13位到第309位核苷酸。

根据目的片段的DNA序列，即RV的E1、E2和C上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计三对PCR引物(P1，P2)、(P3，P4)和(P5，P6)。p1和p2用于扩增E1第523位到第978位核苷酸，p3和p4用于扩增E2第28位到第204位核苷酸，p5和p6用于扩增C第13位到第309位核苷酸。引物p1和p6分别带有NdeI和XhoI的酶切位点，引物p2和p3顺序互补，并共同对应于E1上述片段的3’末端和E2上述片段的5’末端序列，引物p4和p5顺序互补，并共同对应于E2上述片段的3’末端和C上述片段的5’末端序列。

以风疹病毒培养物为模板，以引物P1和P2扩增E1片段，以引物P3和P4扩增E2片段，以引物P5和P6扩增C片段；再以第一轮PCR扩增得到的E1片段和E2片段为模板，加入引物P1和P4，扩增E1E2片段；然后以第二轮PCR扩增得到的E1E2片段和第一轮PCR扩增得到的C片段为模板，加入引物P1和P6，扩增E1E2C，得到串联的目的基因重组片段：E1E2C。

1.2 表达载体pET-28a-RV的构建及鉴定

pET-28a载体与PCR扩增产物E1E2C目的DNA片段经NdeI和XhoI双酶切，产物纯化后经T₄DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落进行PCR及DNA测序鉴定重组子。测序结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-28a-RV。

1.3 表达重组风疹病毒蛋白的工程菌的构建

将表达质粒pET-28a-RV用化学转化法转入表达大肠杆菌BL21(DE3)菌株，涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导菌体用12％SDS—PAGE分析，纯化见图3。确定表达风疹病毒蛋白的菌株即为所需的工程菌株，用甘油冷冻保存。

1.4 重组风疹病毒蛋白的制备和纯化

诱导培养已构建的表达风疹病毒蛋白的工程菌株，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1:10(W/V)加入菌体裂解液，加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌、组氨酸亲和柱和离子交换柱层析得到纯化的重组蛋白。

1.5 重组蛋白Western-blot验证

为验证重组RV蛋白质与抗RV抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为：10份用RV培养物免疫兔子收获的兔抗RV抗体阳性血清和30份人抗RV抗体阳性血清(本发明人收集并经ELISA法检测证实)。阴性血清为：10份对照正常兔血清和30份人抗RV抗体。结果如表1。

表1 重组蛋白Western-blot验证结果

 

血清样品	总例数	阳性例数	阴性例数	阳性检出率	阴性检出率
						兔抗RV抗体阳性血清	10	10	0	100％	0
对照正常兔血清	10	0	10	0	100％
						人抗RV抗体阳性血清	30	30	0	100％	0
人抗RV抗体阴性血清	30	0	30	0	100％

结果显示，用RV培养物免疫兔子所得的10份兔抗RV抗体阳性血清和30份人抗RV抗体阳性血清全部与表达抗原产生阳性反应，10份对照正常兔血清和30份人抗RV抗体阴性血清与表达抗原均产生阴性反应。结果提示重组目的基因获得表达，重组RV蛋白质与全RV蛋白质有明显的交叉反应性，并具有很强的特异性，具有实际应用意义。

实施例2  风疹病毒IgM抗体检测试剂盒的制备和性能检定

2.1 风疹病毒IgM抗体检测试剂盒的制备

将实施例1制得的重组RV蛋白用作试剂盒标记抗原，用胶体金法测定RV IgM抗体。

该试剂盒的研制和使用如下：

1)试剂盒原理：本品采用免疫捕获法原理，用抗人IgM(抗人μ链)抗体(北京百安天地医药科技有限公司)包被硝酸纤维素膜，胶体金标记基因工程重组风疹病毒(RV)抗原为示踪物。使用时加入待检血清，如样品中含有抗RV特异性IgM抗体，则可与膜表面的抗人IgM抗体结合形成复合物，该复合物与胶体金标记的RV抗原结合而呈现紫红色条带。

2)试剂盒组成：见图2。

3)试剂盒的制备

a、NC膜预切割→粘贴背板→包被鼠抗人IgM(抗人μ链)抗体(购自北京百安天地医药科技有限公司)和兔抗风疹病毒抗体(购自北京百安天地医药科技有限公司)划线包被于NC膜上→干燥。

b、合成胶体金→胶体金溶液检验→抗原标记胶体金→抗原胶体金复合物检验→抗原胶体金复合物的喷点包被→干燥→切割。

c、半成品(母卡)装配→切割成层析条→半成品检验→装配检测卡→密封包装检测卡。

d、组装成品盒→成品检验→保存。

4)试剂盒操作方法：

a.打开检测卡的铝箔袋包装，取出检测卡。

b.将检测卡倾斜成加样孔端低于另一端不少于1.0cm。

c.取100μl待检血清加入到圆形样品孔中，室温(15℃～30℃)放置25分钟。

检验结果判定：

a. 25分钟观察并记录结果。

b. 阳性：判读窗口出现两条紫红色线条带(C和T位置)；阴性：判读窗口仅出现一条紫红色线条带(C位置)。

c. 无效：判读窗口C位置无紫红色线条带。

2.2 试剂盒性能检测实验

特异性(准确性)测定：按前述实验确定的胶体金捕获测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％；检测50份类风湿因子阳性血清标本、50份丙型肝炎阳性血清标本、50份梅毒阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。

灵敏度(特异性)测定：按前述实验确定的胶体金捕获测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清(临床已确定)，符合率为100％。

序列表

<110>北京英诺特生物技术有限公司

<120>一种重组风疹病毒蛋白及其应用

<160>8

<210>1

<211>930

<212>DNA

<213>人工合成

<223>本发明所述编码风疹病毒蛋白的重组核酸的核苷酸序列。

<400>1

<210>2

<211>310

<212>PRT

<213>人工合成

<223>本发明所述重组风疹病毒蛋白的氨基酸序列。

<400>2

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<223>本发明用于扩增E1第523位到第978位核苷酸的引物P1：

<400>3

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<223>本发明用于扩增E1第523位到第978位核苷酸的引物P2：

<400>4

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<223>本发明用于扩增E2第28位到第204位核苷酸的引物P3：

<400>5

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<223>本发明用于扩增E2第28位到第204位核苷酸的引物P4：

<400>6

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<223>本发明用于扩增C第13位到第309位核苷酸的引物P5：

<400>7

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<223>本发明用于扩增C第13位到第309位核苷酸的引物P6：

<400>8

Claims (10)

1.序列1所示一种编码风疹病毒蛋白的核酸。

2.包含权利要求1所述核酸的载体。

3.权利要求2所述的载体，其为pET-28a-RV。

4.一种重组风疹病毒蛋白的制备方法，其特征在于应用权利要求1的核酸构建表达载体，并在该载体所适合的原核宿主细胞中表达权利要求1所述核酸编码的风疹病毒蛋白。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于所述的表达载体为原核生物表达载体。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于所述的表达载体为pET-28a-RV。

7.包含权利要求1的核酸的风疹病毒感染诊断试剂盒。

8.包含权利要求1的核酸的风疹病毒疫苗。

9.权利要求1所述的核酸在制备在制备风疹病毒感染检测试剂中的应用

10.权利要求1所述的核酸在制备风疹病毒疫苗中的应用。

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