CN116376977A - 风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途 - Google Patents

风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116376977A
CN116376977A CN202310293425.5A CN202310293425A CN116376977A CN 116376977 A CN116376977 A CN 116376977A CN 202310293425 A CN202310293425 A CN 202310293425A CN 116376977 A CN116376977 A CN 116376977A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
expression vector
recombinant
rubella
rubella virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310293425.5A
Other languages
English (en)
Inventor
魏威
郭健夫
魏丙卓
姜飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Barui Medical Equipment Co ltd
Original Assignee
Beijing Barui Medical Equipment Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Barui Medical Equipment Co ltd filed Critical Beijing Barui Medical Equipment Co ltd
Priority to CN202310293425.5A priority Critical patent/CN116376977A/zh
Publication of CN116376977A publication Critical patent/CN116376977A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36211—Rubivirus, e.g. rubella virus
    • C12N2770/36223—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36211—Rubivirus, e.g. rubella virus
    • C12N2770/36234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36211—Rubivirus, e.g. rubella virus
    • C12N2770/36251—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/36252—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/19—Rubella virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途。本发明提供的表达载体表达的风疹病毒重组病毒样颗粒是一种新型的风疹病毒重组蛋白，该重组蛋白可以应用于风疹病毒感染检测试剂盒的应用，本发明还公开了此风疹病毒重组病毒样颗粒的氨基酸序列，及制备该颗粒的方法。

Description

风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途。
背景技术
风疹病毒是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，外形呈球形的风疹病毒(Rubellavirus，RV)是风疹的病原体，人类是其唯一宿主。风疹是一种以发热、呼吸道炎症和出疹为主要症状的急性呼吸道传染病。孕妇，特别是妊娠早期的孕妇感染风疹病毒可导致胎儿先天性风疹综合征(Congenital rubellasyndrome，CRS)。风疹及CRS在全世界均有发生，亚洲感染率高。孕妇感染风疹病毒后，特别是妊娠的前3-4个月内，风疹病毒可侵犯胎盘并传染给胎儿，引起先天性风疹病毒感染高达30-35％。胎儿除发生死胎、流产与早产外，还可出现一种或多种畸形，如心血管畸形、眼部疾病、神经性耳聋、小头症、智力发育不全等，婴儿出生至1年内，病死率可达10-20％。
风疹病毒(RV)在遗传进化树上分为2个分支(Clade 1和Clade 2)。目前在2个分支内共划分为13个基因型，其中12个为正式基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B、2C)，另外一个为临时基因型(1a)。亚株共计8个分型(BRDⅠ、BRDⅡ、Cendehill、M33、RN-UK86、Therien、TO-336、RA27/3)。
目前风疹病毒感染的诊断方法有病毒分离、血清学诊断和分子生物学检测。由于病毒分离培养周期长、风险高，分子生物学检测对样本要求高等缺陷。
免疫学方法由于操作简便，临床常用，适于风疹病毒感染的实验室诊断和大规模现场调查。目前大多检测试剂盒使用的抗原为灭活天然风疹病毒或重组表达的风疹病毒单一或多组合蛋白片段。灭活天然风疹病毒虽然灵敏度比重组蛋白较好，但由于制备工艺问题，抗原纯度低造成特异性差,造成假阳性而降低检测特异性。而重组表达的风疹病毒单一或多组合蛋白片段，由于空间结构与天然病毒差异较大，特异性较好，但灵敏度较灭活天然风疹病毒差，存在较多的假阴性而降低检测特异性。总之，市面上现有抗原性能均不能兼顾灵敏度和特异性。
因此，亟需开发一种兼顾灵敏度和特异性的风疹病毒抗原。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明的一个目的在于提供一种表达载体，所述表达载体的核苷酸序列包括编码Therien亚型风疹病毒衣壳蛋白和包膜蛋白的核苷酸，所述衣壳蛋白为蛋白C，所述包膜蛋白为蛋白E1、蛋白E2。
本发明提供的风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体表达的风疹病毒重组蛋白，涵盖了风疹病毒所有的结构蛋白(C、E1、E2)，并且表达后的重组蛋白以病毒样颗粒形式存在。制备工艺简单、抗原纯度高、检测灵敏度和特异性优于灭活天然风疹病毒和重组表达的风疹病毒单一或多组合蛋白片段，能够有效避免上述问题,可为风疹病毒感染的检测提供更为特异、准确的原料。
根据本发明的一些实施方案，所述表达载体的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列。
根据本发明的一些实施方案，所述表达载体为哺乳动物细胞表达载体。
根据本发明的一些实施方案，所述表达载体选自pCDNA3.1质粒、pCDNA3.4质粒、pBD质粒、pCMV质粒、pFLAG质粒、pEF1α质粒中的任意一种。
根据本发明的一些实施方案，所述表达载体为pCDNA3.1质粒，其中，所述pCDNA3.1质粒上的新霉素抗性基因被谷氨酰胺合成酶基因取代。
根据本发明的一些实施方案，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明另一方面提供一种重组细胞，所述重组细胞包括上述的表达载体。
根据本发明的一些实施方案，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述重组细胞选自M14、HeLa、HepG2、THP-1、MCF-7、CHO-S、293S细胞中的任意一种。
根据本发明的一些实施方案，所述重组细胞为CHO-S细胞。
本发明又一方面提供一种风疹病毒重组病毒样颗粒，所述风疹病毒重组病毒样颗粒通过上述的重组细胞表达获得。
根据本发明的一些实施方案，所述风疹病毒重组病毒样颗粒的直径为100-150nm。
根据本发明的一些实施方案，所述风疹病毒重组病毒样颗粒不含有风疹病毒的遗传物质。
本发明再一方面提供一种制备风疹病毒重组病毒样颗粒的方法，包括：利用上述的表达载体转染上述的重组细胞，培养所述重组细胞，表达所述风疹病毒重组病毒样颗粒。
本发明又再一方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述的表达载体、重组细胞、风疹病毒重组病毒样颗粒中的至少之一。
本发明另一方面提供上述的表达载体、重组细胞、风疹病毒重组病毒样颗粒在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测风疹病毒。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒为酶免检测试剂盒或或胶体金检测试剂盒或化学发光检测试剂盒。
本发明又另一方面提供一种组合物，所述组合物包含上述的表达载体、重组细胞、风疹病毒重组病毒样颗粒中的至少之一。
本发明再又一方面提供一种疫苗，所述疫苗包含上述的表达载体、重组细胞、风疹病毒重组病毒样颗粒中的至少之一。
本发明又一方面提供上述的表达载体、重组细胞、风疹病毒重组病毒样颗粒在制备药物中的用途，所述药物用于预防风疹病毒介导的相关疾病。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明实施例1中8种不同亚型风疹病毒识别不同人血清中特异性IgG抗体的能力，其中Negative表示未感染风疹病毒人血清样品，Positive表示感染风疹病毒人血清样品；
图2显示了本发明实施例2中pCG3.1质粒图谱；
图3显示了本发明实施例3中重组质粒pCG3.1-Rubella(VLPs)质粒图谱；
图4显示了本发明实施例4中比较不同哺乳动物细胞瞬时表达风疹病毒重组病毒样颗粒的活性柱状图；
图5显示了本发明实施例6中克隆号180H2的稳转细胞株细胞密度的检测情况折线图；
图6显示了本发明实施例6中克隆号180H2的稳转细胞株细胞存活率的检测情况折线图；
图7显示了本发明实施例7中最优培养基和CDCHO培养基培养180H2的细胞株生长曲线；
图8显示了本发明实施例8中Rubella(VLPs)在检测血清中特异性IgG和IgM抗体的灵敏度及特异性的鉴定结果柱状图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“病毒样颗粒”(virus like particles，VLPs)是不含病毒核酸的空壳结构，许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。由于VLPs不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性，其中有些已经作为疫苗成功应用于临床。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面。此外，多数病毒VLPs还具有包裹核酸或其他小分子的能力。
在本文中，术语“衣壳蛋白”是病毒基因产物，具有病毒特异的抗原性，可刺激机体产生抗原病毒免疫应答。
在本文中，术语“包膜蛋白”是指构成病毒包膜结构的蛋白质，包括包膜糖蛋白和基质蛋白两类。
在文本中，术语“新霉素抗性基因”是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶的基因。即指构建表达性质粒时所插入、对新霉素有抗性的基因，可用于筛选表达性重组质粒。
在本文中，术语“谷氨酰胺合成酶”(Cricetulus，GS)，是一种控制氮代谢的酶。谷氨酰胺这种氨基酸，不仅被细胞用来合成蛋白质，也是用来运输氮的。哺乳细胞的生长离不开谷氨酰胺，CHO细胞内源的谷氨酰胺合成酶活性比较低，无法表达足够的谷氨酰胺维持细胞快速生长，必须在培养基中添加外源的谷氨酰胺。
在本文中，术语“蛋氨酸亚氨基代砜”(Methionine Sulphoximine，MSX)，GS抑制剂，可用于抑制内源性GS活性，用含目的基因和GS基因标记的表达载体，转染宿主CHO细胞，通过MSX加压筛选，促使GS基因和目的蛋白基因扩增，只有转染了额外GS基因的细胞才可以在不含有L-glutamine的培养基中生长，从而筛选获得重组表达细胞株。
在本文中，术语“抗体”也称为免疫球蛋白，是四聚体糖蛋白。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻”(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，紧接着是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。
在本文中，术语“免疫原性”是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。抗原的免疫原性，首先决定于其自身的化学特性，但同一种抗原，对不同种动物或同种动物不同个体间其免疫原性强弱，可表现很大差异，因此一种抗原的免疫原性是由其化学性质和宿主因素决定的，具有免疫原性的物质称为免疫原(immunogen)。
在本文中，术语“风疹病毒介导的相关疾病”包括风疹引起的关节炎、耳部感染和脑炎、感染风疹的孕妇导致的患有先天性风疹综合征(生长迟缓、白内障、耳聋、先天性心脏缺陷和智力低下)的婴儿在内的任何由风疹病毒直接或间接引起的相关疾病。
本发明的技术难点在于一方面风疹病毒基因型众多，核苷酸序列差异较大，使得表达基因的选择较为关键。另一方面风疹病毒样颗粒的表达宿主和纯化工艺也对风疹病毒样颗粒的活性有所影响。
根据本发明的具体实施方案，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体序列可以与参比序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量，本发明提供的风疹病毒重组病毒样颗粒的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
SEQ ID NO.5：
Figure BDA0004148383950000021
Figure BDA0004148383950000031
根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的风疹病毒重组病毒样颗粒是不含病毒核酸的空壳结构，经特异性转染后的哺乳动物细胞表达的病毒结构蛋白(C、E1、E2)具有自动组装成VLPs(virus like particles；病毒样颗粒)的能力，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性，由于VLPs不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性。
根据本发明的具体实施方案，本发明所提供的风疹病毒重组病毒样颗粒核苷酸序列，或者本发明提供的重组质粒的核苷酸序列，行内人士可以通过合成基因在异源细胞中的表达(即重组蛋白表达)的方法制备与本发明一样的或类似的病毒样颗粒蛋白(或其类似物)。
根据本发明的具体实施方案，本发明所提供的风疹病毒重组病毒样颗粒核苷酸序列，或者本发明提供的重组质粒的核苷酸序列，由于核酸密码子的简并性，本领域技术人员可以适应性改变部分碱基来制备与本发明一样的或类似的病毒样颗粒蛋白(或其类似物)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的风疹病毒重组病毒样颗粒可以用于检测人血清或体液中的特异性识别风疹病毒的IgG和IgM抗体，检测的原理主要是基于本发明的风疹病毒重组病毒样颗粒与特异性识别风疹病毒的IgG和IgM抗体的识别和结合，并利用化学标记技术(如标记抗体，或标记的特异性二抗)或物理检测技术(如光散射技术，等离子体共振技术等)进行检测。
根据本发明的具体实施方案，本发明提供一种风疹疫苗，所述风疹疫苗在受体内能形成本发明提供的风疹病毒重组病毒样颗粒，所述疫苗具有风疹病毒免疫原性，能在体内引起免疫细胞的免疫应答反应，并储存一定量的记忆B细胞，当注射疫苗的受体再次受到风疹病毒的侵入时，储存的记忆B细胞能快速做出反应，产生更多量特异性抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的主要利用基因工程方法制备风疹病毒重组病毒样颗粒，并以此作为抗原制备酶免试剂盒和胶体金试剂盒，用以检测人血清中特异性识别风疹病毒IgG和IgM抗体，对人血清中特异性识别风疹病毒IgG和IgM抗体的检测结果可以作为风疹病毒感染的辅助诊断。
根据本发明的具体实施方案，本发明通过对多种灭活的天然风疹病毒利用ELISA实验检测人血清中IgG、IgM抗体的比较，选择灵敏度和特异性最好的风疹病毒亚株(Therien)作为表达的基因型。将Therien亚株的结构蛋白(C、E1、E2)的编码序列插入哺乳动物细胞表达载体中，表达风疹病毒重组病毒样颗粒，其中，插入序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
Figure BDA0004148383950000032
Figure BDA0004148383950000041
根据本发明的优选实施方案，本发明优化并改进了转染质粒。利用pCDNA3.1质粒中的通过限制性酶切位点SmaI和BstBI将NEO抗性基因替换为谷氨酰胺合成酶(CricetulusGS)基因，降低了后期生产成本。GS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。优化后的质粒命名为pCG3.1，全长核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.2：
Figure BDA0004148383950000042
SEQ ID NO.3：
Figure BDA0004148383950000043
Figure BDA0004148383950000051
Figure BDA0004148383950000061
根据本发明的具体实施方案，本发明利用ELISA实验检测使用不同哺乳动物细胞(M14、HeLa、HepG2、THP-1、MCF-7、CHO-S、293S)表达的风疹病毒重组病毒样颗粒的灵敏度和特异性，经比较CHO-S细胞表达的风疹病毒重组病毒样颗粒性能在其余几种哺乳动物细胞中最佳，但不代表本领域技术人员通过类似的方法不能筛选出比CHO-S细胞表达风疹病毒重组病毒样颗粒性能更加的细胞。
根据本发明的具体实施方案，本领域技术人员可以通过本领域已知的方法筛选得到能表达风疹病毒重组病毒样颗粒的细胞，包括以蛋氨酸亚氨基代砜筛选压力进行筛选。
根据本发明的一个优选方案，本发明逐步提高蛋氨酸亚氨基代砜终浓度进行稳定株的筛选，缩短了筛选周期，提高了风疹病毒重组病毒样颗粒的细胞单位产量。
根据本发明的具体实施方案，本领域技术人员可以通过本领域已知的任何纯化病毒样颗粒的方法纯化风疹病毒重组病毒样颗粒，包括超速离心法。
根据本发明的一个优选方案，本发明通过细胞上清液切向流预浓缩再利用超速离心的方法进行纯化，简化了纯化工艺，并提高了风疹病毒重组病毒样颗粒的产量。
根据本发明的具体实施方案，本领域技术人员可以通过任何能培养病毒样颗粒的培养基来培养风疹病毒重组病毒样颗粒。
根据本发明的具体实施方案，本发明通过细胞密度和风疹病毒重组病毒样颗粒的产量比较，优选培养基配方为：NaHCO32.4g；HEPES(1.5M)10.0mL；硒酸10.0mg；纤粘连蛋白100μg；胰岛素1000.0mg；转铁蛋白5000.0mg；DMEM/F121:1混合后溶解上述溶质，最终定容到1000mL。
根据本发明的具体实施方案，风疹病毒重组病毒样颗粒的标记方法包括但不限于过氧化物酶(HRP)标记，作为本发明的一种优选技术方案，使用HRP标记后的风疹病毒重组病毒样颗粒制备的酶免检测试剂盒的应用。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1不同亚型风疹病毒识别人血清中特异性IgG抗体能力的鉴定
利用ELISA间接法，用CB缓冲液(Na2CO31.59 g；NaHCO32.94 g；1L，PH9.51)将灭活的不同亚型风疹病毒(BRDⅠ、BRDⅡ、Cendehill、M33、RN-UK86、Therien、TO-336、RA27/3)稀释至2μg/ml，100μl/孔包被于96孔酶标板中，4℃，过夜。用PBST(NaCl，8g；Na2PO4·12H2O，3.63g；KCl，0.2g；KH2PO4，0.24g；1L，PH 7.4)洗板2次，300μL/孔。然后加封闭液PTB(PBST，1％BSA)，200μL/孔，37℃，封闭2小时。人血清样本用PTB 200倍稀释后加入到96孔ELISA板，100μL/孔，37℃，1小时。用洗板机洗板3次，300μL/孔。拍干后加入用PTB 10000倍稀释的HRP标记鼠抗人二抗(Invitrogen，Cat#31420)，100μL/孔，37℃，孵育1.5小时。洗板3次，300μL/孔。加TMB显色液(Pierce，Cat#34021)100μL/孔，室温，显色10分钟。1M HCl，50μL/孔终止反应，使用酶标仪(Thermo Scientific Varioskan Flash)OD450读值。
实验共设置3个未感染风疹病毒人血清样品(Negative1、Negative2、Negative13)，5感染风疹病毒人血清样品(Positive1、Positive2、Positive3、Positive4、Positive5)，通过数据比较8个亚型风疹病毒(BRDⅠ、BRDⅡ、Cendehill、M33、RN-UK86、Therien、TO-336、RA27/3)来识别人血清中特异性IgG抗体能力，结果如图1所示，显示Therien识别人血清中IgG抗体的特异性最高。
实施例2 pCG3.1质粒的构建
首先，参考GenBank核苷酸序列X03495.1(Chinese hamster mRNAfor glutaminesynthetase)，序列参见SEQ ID NO.2。在5’和3’端分别插入SmaI和BstBI限制性酶切位点，后由基因公司进行序列合成。合成后的基因和pCDNA3.1(Thermo，货号：V79020)使用限制性内切酶SmaI和BstBI分别进行双酶切，胶回收后的基因片段通过T4连接酶16℃过夜连接。连接产物转化入TOP10感受态细胞，提取质粒。获得的pCG3.1质粒全长核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，质粒图谱参见图2。
实施例3重组质粒pCG3.1-Rubella(VLPs)的构建
序列参见SEQ ID NO.1。在5’和3’端分别插入EcoRI和XbaI限制性酶切位点后由基因公司进行序列合成。合成后的基因和pCG3.1使用限制性内切酶EcoRI和XbaI分别进行双酶切，胶回收后的基因片段通过T4连接酶16℃过夜连接。连接产物转化入TOP10感受态细胞，提取质粒。获得的pCG3.1-Rubella(VLPs)质粒全长核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，质粒图谱参见图3。
SEQ ID NO.4：
Figure BDA0004148383950000071
/>
Figure BDA0004148383950000081
/>
Figure BDA0004148383950000091
实施例4比较不同哺乳动物细胞瞬时表达风疹病毒重组病毒样颗粒的活性
(1)细胞转染
利用DNA提取酚试剂(索莱宝，Cat#T0250)抽提后的pCG3.1-Rubella(VLPs)质粒，无菌条件下取25μg抽提后质粒与25μL LipofectamineTM3000转染试剂(Invitrogen，Cat#L3000015)预混合10分钟后，分别转染哺乳动物细胞(M14、HeLa、HepG2、THP-1、MCF-7、CHO-S、293S)，其中转染的贴壁细胞为M14、HeLa、HepG2、THP-1、MCF-7，悬浮细胞为CHO-S、293S。细胞培养体积30ml，细胞密度为1×106个/ml。置于37℃，5％CO2培养箱中静置或130rpm悬浮培养。培养48小时后，取各细胞培养上清200×g离心10分钟，收集上清液。
(2)ELISA夹心法对风疹病毒重组病毒样颗粒[Rubella(VLPs)]的活性检测
羊抗风疹病毒多抗(Virostat，Cat#1701)用CB缓冲液稀释至1μg/mL，100μL/孔包被于96孔酶标板中，4℃，过夜。用PBST洗板2次，300μL/孔。然后加封闭液PTB，37℃，封闭2小时。将上述各转染后细胞上清加入到96孔ELISA板，100μL/孔，37℃，1小时。用洗板机洗板3次，300μL/孔。拍干后加入用PTB 500倍稀释的HRP标记的羊抗风疹病毒多抗(Virostat，Cat#1701)，100μL/孔，37℃，孵育1小时。洗板3次，300μL/孔。加TMB显色液显色10分钟。1MHCl，50uL/孔终止反应，使用酶标仪OD450读值。通过数据比较不同哺乳动物细胞(M14、HeLa、HepG2、THP-1、MCF-7、CHO-S、293S)瞬时表达风疹病毒重组病毒样颗粒的活性，结果见图4，表明相比其他细胞类型，细胞CHO-S瞬时表达风疹病毒重组病毒样颗粒的活性更高。
实施例5表达Rubella(VLPs)的CHO-S稳转细胞株的筛选
复苏并通过2-3次传代后的CHO-S细胞，通过细胞计数、细胞浓度为1.3×106个细胞/mL。将摇瓶摇匀后，用无菌移液管(Corning，#4488)吸取23mL细胞液加入到新的125mL摇瓶中，并用CD-CHO培养基(Thermo，货号：10743029)补齐至30mL。使细胞浓度保证在1×106个细胞/mL，将摇瓶暂时置于培养箱中。将质粒pCG3.1-Rubella(VLPs)37.5μg溶解于0.6mL的SFM培养基中，轻轻混匀。并将37.5μL的free style MAX溶于562.5μL SFM培养基中，至总体积0.6mL左右(孵育5分钟，精确计时)。DNA与MAX溶液混合，室温反应25分钟。将反应后的混合液(缓慢加入)全部加到如上所述的CHO-S细胞中。将摇瓶放入CO2培养箱(37℃，5％CO2)内的摇床(130rpm)中培养48小时。
对转染并培养48小时后的细胞进行96孔细胞培养板铺板，使用CDCHO培养基(Gibco，Cat#10743029)，培养基中加入不同浓度的蛋氨酸亚氨基代砜(methioninesulfoximine,MSX)，浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100μM，每个MSX浓度下以不同细胞密度进行铺板，细胞密度分别为10个/孔、100个/孔、1000个/孔，每个条件各铺5板。于37℃、5％CO2培养箱中静置培养。20-30天后，细胞团落在500个细胞左右时，取其细胞上清利用双抗夹心ELISA检测上清中Rubella(VLPs)的表达情况。
首先，羊抗风疹病毒多抗(Virostat，Cat#1701)用CB缓冲液稀释至1μg/mL，100μL/孔包被于96孔酶标板中，4℃，过夜。用PBST洗板2次，300μL/孔。然后加封闭液PTB，37℃，封闭2小时。将上述各转染后细胞上清加入到96孔ELISA板，100μL/孔，37℃，1小时。用洗板机洗板3次，300μL/孔。拍干后加入用PTB 500倍稀释的HRP标记的羊抗风疹病毒多抗，100μL/孔，37℃，孵育1小时。洗板3次，300μL/孔。加TMB显色液显色10分钟。1M HCl，50ul/孔终止反应，使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。以阴性对照OD值的2.1倍以上为阳性(以空白对照孔调零后计算)。挑选出阳性孔细胞保持MSX浓度，按照上述方法重复筛选1次。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。每个克隆应尽快冻存，最终选定克隆号180H2的细胞株用于Rubella(VLPs)生产。
实施例6 Rubella(VLPs)的大量制备及活性测定
(1)Rubella(VLPs)的大量制备
克隆号180H2的稳转细胞株于37℃水浴中1-2分钟内解冻。将15mL离心管中加入9mL CD-CHO培养基再加入解冻后的细胞悬液，200×g离心5分钟后，细胞转入125mL摇瓶中，加入12.5μM MSX，并定容至30mL，放入CO2培养箱(37℃，5％CO2)内的摇床(130rpm)中培养2天。之后培养体积逐级放大，保持细胞传代的初始密度在0.2-0.5×106个/mL，直至培养体积放大到5L，每天对细胞密度进行检测，结果参见图5，当培养时间在7天之前，细胞密度快速升高，7天之后，细胞密度缓慢降低，同时，每天对细胞活率进行检测，结果参见图6，细胞活率在细胞密度达到顶峰后，开始呈明显下降趋势，直至细胞活率低于80％时(约细胞培养13天左右)，200×g离心收集细胞上清(体积约5L)。
收集的细胞上清使用切向流系统(Sartorius，viva flow 200PES-100K，有效过滤面积0.02m2)，具体方法如下：用1L纯净水(0.22uM滤过)清洗TFF膜包系统，蠕动泵泵速100rpm。滤过液流速100mL/分钟。将膜包的进样管和回流管放入装有细胞上清的PP烧杯中，泵速150rpm，进样压力1.2bar，初始流速30mL/分钟，最后流速20mL/分钟。直至溶液浓缩至500ml(即5L浓缩至500ml，浓缩10倍)。收集浓缩液和滤过液4℃保存。用10％、20％、40％、60％蔗糖继续做不连续密度梯度离心处理(100000×g，离心1小时)，收获Rubella(VLPs)所在带区并透析浓缩至5ml。最后将浓缩后的Rubella(VLPs)溶液1mL/管分装于离心管中，-80℃中保存。利用BCA试剂盒(索莱宝，PC0020)测定抗体浓度，测定纯化后的Rubella(VLPs)总浓度为7.2mg/mL。
(2)Rubella(VLPs)的活性测定
双抗夹心ELISA检测上清中Rubella(VLPs)的活性。Rubella(VLPs)和羊抗风疹病毒多抗(Virostat，Cat#1701)用CB缓冲液稀释至1μg/mL，100μL/孔包被于96孔酶标板中，4℃，过夜。用PBST洗板2次，300μL/孔。然后加封闭液PTB，37℃，封闭2小时。使用PTB稀释Rubella(VLPs)、RubelaVirus K1SAntigen(Microbix，Cat#EL-05-10，天然灭活病毒)至不同浓度到96孔ELISA板，100μL/孔，37℃，1小时。用洗板机洗板3次，300μL/孔。拍干后加入PTB 500倍稀释的HRP标记的羊抗风疹病毒多抗，100μL/孔，37℃，孵育1小时。洗板3次，300μL/孔。加TMB显色液显色10分钟。1M HCl，50μL/孔终止反应，使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。结果参见表1，表明本发明提供的重组质粒表达的重组蛋白颗粒VLPs与天然灭活病毒的活性类似。
表1
Figure BDA0004148383950000101
实施例7用于180H2的细胞株Rubella(VLPs)生产的无血清培养基的优化
为达到最佳的蛋白表达水平，降低生产成本，需要一种用于180H2的细胞株Rubella(VLPs)生产的无血清培养基。以DMEM/F121:1混合后，分别加入不同浓度的NaHCO3(1.2、2.4、3.6g/L)；HEPES(15mM、30mM、45mM)；硒酸(50、75、100μg/L)；纤粘连蛋白(100、150、200μg/L)；胰岛素(1、1.5、2g/L)；转铁蛋白(2.5、3.5、5g/L)。经0.22μM过滤除菌后，用以上培养基30mL分别在125mL摇瓶中培养180H2细胞株，并以CDCHO培养基作为对照。每天对细胞进行计数，比较不同培养天数的细胞密度，通过比较，最终筛选到的优化培养基配方如下：NaHCO32.4g；HEPES(1.5M)10.0ml；硒酸10.0mg；纤粘连蛋白100μg；胰岛素1000.0mg；转铁蛋白5000.0mg；DMEM/F121:1混合后溶解上述溶质，最终定容到1000mL，比较优化培养基和CDCHO培养基培养180H2的细胞株生长曲线，结果参见图7，由图可知，180H2的细胞株在优化培养基中所能达到的细胞密度峰值高于CDCHO培养基，达到细胞密度峰值时间早于CDCHO培养基，且密度峰值后期细胞密度变化率也低于CDCHO培养基。可见优化后的培养基较CDCHO培养基更适应180H2细胞株的培养。
实施例8 Rubella(VLPs)在检测血清中特异性IgG和IgM抗体的灵敏度及特异性的鉴定
Rubella(VLPs)在检测血清中特异性IgG和IgM抗体的灵敏度的能力用间接法ELISA进行了评估。在这个实验里，Rubella(VLPs)、Rubella E1(E1，原核表达风疹病毒E1重组蛋白)和RubelaVirus K1SAntigen(Microbix，Cat#EL-05-10，天然灭活病毒)作为抗原用CB缓冲液稀释，并被包被于96孔酶标板中，包被浓度1μg/mL，体积100μL/孔。在4℃过夜包被后，酶标板用PBST溶液清洗2次，每次清洗300μL/孔。清洗后拍干，酶标板用含1％BSA的PBS溶液封闭，200μL/孔，室温2小时。拍干，用PTB100倍稀释血清样本，之后加入到上述封闭后酶标板中，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。拍干，PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，酶标板内加入PTB稀释5000倍的HRP标记的鼠抗人IgG抗体(Thermo，货号：31430)或IgM抗体(Thermo，货号：62-6820)，37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，300μL/孔。拍干，酶标板内加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温10分钟，然后加入100μL/孔的1M H2SO4，终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。实验结果如图8所示，可见Rubella(VLPs)在检测血清中特异性IgG和IgM抗体的灵敏度及特异性优于Rubella E1和RubelaVirus K1SAntigen。
实施例9利用Rubella(VLPs)制备的酶免试剂盒在检测人血清中风疹病毒抗体的应用
(1)Rubella(VLPs)抗原的辣根过氧化物酶(HRP)标记及标记产物的鉴定
取0.5mLRubella(VLPs)抗原(2mg)加入到透析袋(10KDa，宽度1cm)中，在2L 10mMPBS溶液(PH 7.4)中4℃过夜透析。次日将含有抗体溶液的透析袋放入1L 10mM碳酸盐缓冲液(PH 9.5)中室温搅拌透析2小时，准备与活化好的HRP进行偶联。
与此同时，使用分析天平精确称取1mg HRP，加入0.2mL超纯水溶解，使HRP浓度为5mg/mL。向上述HRP溶液中加入40μl 0.1M NaIO4，放置在水平摇床上，室温避光反应(活化)20分钟。将活化后的HRP溶液加入到透析袋(10KDa，宽度1cm)中，在2L 1mM醋酸钠缓冲液(PH4.4)中4℃过夜透析。将透析后的HRP溶液小心吸出并转入新的1.5mL离心管中，加入1/10体积的0.2M碳酸盐缓冲液，使活化后的HRP溶液PH升高至9.0-9.5。
将上述抗体和HRP混合(进行偶联反应)，放置在水平摇床上，室温避光反应4小时。偶联反应结束后，加入10μL(用预冷的超纯水)新鲜配制的NaBH4，4℃避光过夜终止反应。将偶联反应终止后的抗体溶液移至透析袋(10KDa，宽度1cm)中，室温搅拌透析2小时。最后将溶液转移至棕色的离心管中，4℃保存。
HRP标记后的Rubella(VLPs)抗原检测风疹病毒抗体的最佳稀释倍数用捕获法ELISA评估。在实验中，鼠抗人IgM用CB缓冲液稀释到1μg/mL，然后100μL/孔包被于96孔酶标板中(4℃过夜)。用300μL/孔PBST洗板2次。拍干，用含1％BSA的PBS溶液封闭酶标板，200μL/孔，室温2小时。拍干，加入PTB100倍稀释的人风疹病毒IgM阳性血清，并在37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，加入不同比例稀释的HRP标记Rubella(VLPs)抗原(用PTB稀释)溶液，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温反应10分钟。然后加入100μL/孔的1M H2SO4终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。结果表2所示，标记后的Rubella(VLPs)抗原的最佳稀释倍数为400倍稀释。
表2
HRP标记VLPs稀释倍数 OD450
50 0.786
100 1.052
200 1.242
400 1.255
800 0.963
1600 0.835
3200 0.435
6400 0.214
本底 0.089
(2)利用Rubella(VLPs)抗原制备的酶免试剂盒在检测人血清中风疹病毒抗体
鼠抗人IgM用CB缓冲液稀释到1μg/mL，然后100μL/孔包被于96孔酶标板中(4℃过夜)。用300μL/孔PBST洗板2次。拍干，用含1％BSA的PBS溶液封闭酶标板，200μL/孔，室温2小时。拍干，加入PTB100倍稀释的人风疹病毒IgM阳性血清，并在37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，加入400倍稀释的HRP标记Rubella(VLPs)抗原(用PTB稀释)溶液，100μL/孔，并在37℃恒温箱中反应1小时。PBST洗板3次，每次300μL/孔。拍干，加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温反应10分钟。然后加入100μL/孔的1M H2SO4终止反应。使用酶标仪在450nm测定吸光值(A450)。以阴性对照OD值的2.1倍以上为阳性(以空白对照孔调零后计算)。结果参见表3，表明利用本发明的Rubella(VLPs)抗原制备的酶免试剂盒用于人血清中风疹病毒抗体的检测，检测准确度较高。
表3
样本 阴性样本1 阴性样本2 阴性样本3 阳性样本1 阳性样本2 阳性样本3
OD450 0.132 0.098 0.115 1.532 1.241 0.996
阴阳性判定 阴性 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性
本发明提供的风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体表达的风疹病毒重组蛋白，涵盖了风疹病毒所有的结构蛋白(C、E1、E2)，并且表达后的重组蛋白以病毒样颗粒形式存在。制备工艺简单、抗原纯度高、检测灵敏度和特异性优于灭活天然风疹病毒和重组表达的风疹病毒单一或多组合蛋白片段，能够有效避免上述问题,可为风疹病毒感染的检测提供更为特异、准确的原料。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (17)

1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列包括编码Therien亚型风疹病毒衣壳蛋白和包膜蛋白的核苷酸，所述衣壳蛋白为蛋白C，所述包膜蛋白为蛋白E1、蛋白E2。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列包括SEQID NO.1所示序列。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为哺乳动物细胞表达载体。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自pCDNA3.1质粒、pCDNA3.4质粒、pBD质粒、pCMV质粒、pFLAG质粒、pEF1α质粒中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pCDNA3.1质粒，其中，所述pCDNA3.1质粒上的新霉素抗性基因被谷氨酰胺合成酶基因取代。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求1-6中任一项所述的表达载体。
8.根据权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为哺乳动物细胞，
任选地，所述重组细胞选自M14、HeLa、HepG2、THP-1、MCF-7、CHO-S、293S细胞中的任意一种；
任选地，所述重组细胞为CHO-S细胞。
9.风疹病毒重组病毒样颗粒，其特征在于，通过权利要求7或8所述的重组细胞表达获得。
10.根据权利要求9所述的风疹病毒重组病毒样颗粒，其特征在于，所述风疹病毒重组病毒样颗粒的直径为100-150nm；
任选地，所述风疹病毒重组病毒样颗粒不含有风疹病毒的遗传物质。
11.一种制备风疹病毒重组病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括：
利用权利要求1-6中任一项所述的表达载体转染哺乳动物细胞，获得重组细胞，培养所述重组细胞，表达所述风疹病毒重组病毒样颗粒。
12.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-6中任一项所述的表达载体、权利要求7或8所述的重组细胞、权利要求9或10所述的风疹病毒重组病毒样颗粒中的至少之一。
13.权利要求1-6中任一项所述的表达载体、权利要求7或8所述的重组细胞、权利要求9或10所述的风疹病毒重组病毒样颗粒在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于检测风疹病毒。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述试剂盒为酶免检测试剂盒或胶体金检测试剂盒或化学发光检测试剂盒。
15.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-6中任一项所述的表达载体、权利要求7或8所述的重组细胞、权利要求9或10所述的风疹病毒重组病毒样颗粒中的至少之一。
16.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1-6中任一项所述的表达载体、权利要求7或8所述的重组细胞、权利要求9或10所述的风疹病毒重组病毒样颗粒中的至少之一。
17.权利要求1-6中任一项所述的表达载体、权利要求7或8所述的重组细胞、权利要求9或10所述的风疹病毒重组病毒样颗粒在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于预防风疹病毒介导的相关疾病。
CN202310293425.5A 2023-03-23 2023-03-23 风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途 Pending CN116376977A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310293425.5A CN116376977A (zh) 2023-03-23 2023-03-23 风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310293425.5A CN116376977A (zh) 2023-03-23 2023-03-23 风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116376977A true CN116376977A (zh) 2023-07-04

Family

ID=86970493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310293425.5A Pending CN116376977A (zh) 2023-03-23 2023-03-23 风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116376977A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101509002A (zh) * 2009-03-25 2009-08-19 北京英诺特生物技术有限公司 一种重组风疹病毒蛋白及其应用
CN108610398A (zh) * 2018-01-15 2018-10-02 武汉海特生物制药股份有限公司 一段功能序列及在分泌蛋白表达中的应用
US20210261624A1 (en) * 2019-07-10 2021-08-26 Institut Virion \ Serion GmbH Rubella virus spike construct

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101509002A (zh) * 2009-03-25 2009-08-19 北京英诺特生物技术有限公司 一种重组风疹病毒蛋白及其应用
CN108610398A (zh) * 2018-01-15 2018-10-02 武汉海特生物制药股份有限公司 一段功能序列及在分泌蛋白表达中的应用
US20210261624A1 (en) * 2019-07-10 2021-08-26 Institut Virion \ Serion GmbH Rubella virus spike construct

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Rubella virus capsid protein, E1 and E2 envelope proteins, complete cds", GENBANK, 3 August 1993 (1993-08-03), pages 30776 *
ZHIYONG QIU等: "Expression and Characterization of Virus-Like Particles Containing Rubella Virus Structural Proteins", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 68, no. 6, 30 June 1994 (1994-06-30), pages 4086 - 4091 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111234036B (zh) 非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用
JPH04502857A (ja) パルボウイルスキャプシド
CN109536461B (zh) 一种o型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用
CN110041411B (zh) 稳定的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白及其疫苗和制备方法和应用
WO2019174127A1 (zh) 一种多重液相芯片检测方法及试剂盒
CN111978377B (zh) Covid-19抗原、制备方法和应用
CN108210921A (zh) 一种寨卡病毒疫苗及其制备方法
CN112142827B (zh) 一种猪伪狂犬病毒的gB亚单位重组蛋白及其制备方法和应用
CN112852840A (zh) 一种牛纽布病毒重组vp1基因、重组蛋白及其应用
CN116376977A (zh) 风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途
Wilhelm et al. Synthesis in vitro of type 5 adenovirus capsid proteins
CA2537429A1 (en) Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
Knowles et al. Comparison of cell culture-grown JC virus (primary human fetal glial cells and the JCI cell line) and recombinant JCV VP1 as antigen for the detection of anti-JCV antibody by haemagglutination inhibition
CN113325176A (zh) 一种检测禽白血病p27的双抗夹心直接elisa方法
CN106397546A (zh) 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用
CN113061167A (zh) 兔出血症病毒重组抗原及其应用
CN113999293B (zh) 一种特异性结合新型冠状病毒s蛋白的抗体及其应用
CN112941031B (zh) 一种gE-HEK293细胞的构建方法及其应用
CN112430273A (zh) 一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白mG及其制备方法和应用
CN115197961B (zh) 一种非洲猪瘟病毒b602l重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用
CN112175912B (zh) 杂交瘤细胞株3g4 1d6、抗gii.4型诺如病毒p蛋白单克隆抗体和应用
Galula et al. Production and Purification of Dengue Virus-like Particles from COS-1 Cells
CA2550264C (en) Method and device for detecting feline immunodeficiency virus
CN117736278A (zh) 一种用于检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒及检测方法
CN114106158B (zh) 一种靶向猪伪狂犬病毒gD蛋白的纳米抗体、制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination