CN111285933A - 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111285933A
CN111285933A CN202010156803.1A CN202010156803A CN111285933A CN 111285933 A CN111285933 A CN 111285933A CN 202010156803 A CN202010156803 A CN 202010156803A CN 111285933 A CN111285933 A CN 111285933A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sars
cov2
spike protein
antibody
protein antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010156803.1A
Other languages
English (en)
Inventor
杨正林
串俊兰
龚波
石毅
蒋黎
黄璐琳
龙腾镶
刘东泽
徐雨
干盈盈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MACCURA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Original Assignee
Sichuan Provincial Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Provincial Peoples Hospital filed Critical Sichuan Provincial Peoples Hospital
Priority to CN202010156803.1A priority Critical patent/CN111285933A/zh
Publication of CN111285933A publication Critical patent/CN111285933A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种SARS‑COV2纤突蛋白抗体，为SARS‑COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。SARS‑COV2纤突蛋白抗体的制备方法，是基于SARS‑COV2的S1蛋白Gln14‑Arg685区域的基因，进行表达和纯化，获得融合蛋白，然后将融合蛋白制备配对抗体。上述的SARS‑COV2纤突蛋白抗体用于制备新型冠状病毒检测试剂盒，本发明提供了一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒，包括上述的一种SARS‑COV2纤突蛋白抗体。本发明提供的SARS‑COV2胶体金诊断试剂盒，该试剂盒操作简单，能够快速诊断出患者是否感染SARS‑COV2，利于疫情的有效控制。

Description

一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及新型冠状肺炎检测药物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-2019)，2020年1月12日被世界卫生组织命名。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。
人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。因此对于疾病的预防和早期诊断对于控制新型冠状病毒疫情蔓延尤为重要。
纤突蛋白(spike protein，S)是冠状病毒的表面结构蛋白，研究表明，新型冠状病毒的S 蛋白和SARS冠状病毒S蛋白拥有相同功能的宿主细胞受体，即血管紧张素转换酶2(ACE2， angiotensin converting enzyme2)，ACE2与新型冠状病毒S蛋白胞外域结构之间结合的亲和力为15nM(平衡解离常数)，其是ACE2与SARS冠状病毒S蛋白胞外域结构之间结合亲和力的10-20倍。
新型冠状病毒和SARS病毒的纤突蛋白同源性较低，两种病毒纤突蛋白的氨基酸序列相似度只有76.47％。但是两种病毒RBD结构域的有一些基因区域与SARS有高度的同源性。其中SARS感染的5个关键位点中，有1个被新型冠状病毒保留，其余4个有氨基酸的替换和变化。
特异性针对SARS-CoV纤突蛋白受体结合结构域(RBD)的多克隆抗体不能与2019-nCoV 结合，两种病毒的抗体具有限制性。如研究表明，公开研究测试了目前发表的3种针对SARS-CoV RBD区域的多克隆抗体，尽管两种病毒有很高的同源性，但是这三种与SARS-CoVRBD区域能紧密结合的多克隆抗体，在新冠病毒中完全没有结合力。这一结果暗示着，SARS-CoV研究中的抗体或许对2019-nCoV并没有作用，需要针对新冠病毒的特异性来重新设计新抗体。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了解决上述问题的检测SARS-COV2的S蛋白的快速检测试剂盒，用于检测患者是否患有感染SARS-COV2。
本发明通过下述技术方案实现：
一种SARS-COV2纤突蛋白抗体，为SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。
一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，基于SARS-COV2的S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，进行表达和纯化，获得融合蛋白；
步骤2，基于步骤1制备的融合蛋白制备配对抗体。
进一步地，所述步骤1具体操作包括以下步骤：
步骤1-1，全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，将S1基因克隆至真核表达载体，构成S1-mFc融合基因。
步骤1-2，将S1-mFc表达质粒电转到感受态大肠杆菌，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；
步骤1-3，使用转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培养；
步骤1-4，收集细胞培养基，离心获得上清，分离纯化S1-mFc融合蛋白。
进一步地，步骤1-1中，所述真核表达载体为pMFcIg，S1基因克隆到真核表达载体的 IL2分泌信号肽和小鼠Fc标签基因之间，构成S1-mFc融合基因。
进一步地，步骤1-1中，克隆所采用的正向引物的核苷酸序列为：CAGTGTGTTAATCTTACAACC，反向引物的核苷酸序列为ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT。
进一步地，所述步骤2具体操作包括以下步骤：
步骤2-1，建立天然人源单链可变区噬菌体展示库；
步骤2-2，将融合蛋白与天然人源单链可变区噬菌体展示库生物筛选；
步骤2-3，生物筛选后阳性噬菌体的重链可变区和轻链可变区分别克隆至表达载体中，转入宿主细胞中进行表达和纯化，得到SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。
进一步地，所述步骤2-3中，重链可变区的表达载体为pFUSEss-CHIg-hG1，轻链可变区的表达载体pFUSEss-CLIg-hK。
上述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体、以及上述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法制备的SARS-COV2纤突蛋白抗体在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。
一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒，包括上述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体、以及上述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法制备的SARS-COV2纤突蛋白抗体。
一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒的制备方法，用于制备权利要求9所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒，包括以下步骤：
步骤1，以氯金酸溶液、柠檬酸三钠水溶液为原料制备胶体金溶液；
步骤2，将SARS-COV2纤突蛋白抗体溶液分离纯化；
步骤3，将分离纯化后的SARS-COV2纤突的蛋白抗体加入等体积的胶体金溶液中，经分离、沉淀、再溶解获得SARS-COV2胶体金。
进一步地，步骤2中，将SARS-COV2纤突蛋白抗体溶液分离纯化的透析方法为：将SARS-COV2纤突蛋白抗体溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2℃～8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
本发明具有如下的优点和有益效果：
尽管现在研究表明新型冠状病毒(2019-nCoV)和SARS(SARS-CoV)病毒两者RBD结构域的有一些基因区域具有较高的同源性，但是特异性针对SARS-CoV纤突蛋白受体结合结构域 (RBD)的多克隆抗体不能与2019-nCoV结合，两种病毒的抗体具有限制性，这一结果表明， SARS-CoV研究中的抗体或许对2019-nCoV并没有作用，需要针对新冠病毒的特异性来重新设计新抗体。
本发明提供了针对2019-nCoV的特异2019-nCoV性纤突蛋白S1区的配对抗体，能够与 2019-nCoV进行特异性结合，采用该抗体制备的胶体金诊断试剂盒，测试操作简单快捷，能够快速、准确诊断出患者是否感染SARS-COV2，利于疫情地有效控制，进一步地防控研究提供一定参考价值。
纤突蛋白(S)蛋白是伸出囊膜的球-杆形的病毒融合性糖蛋白，是冠状病毒感染细胞的关键蛋白，是惟一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；决定病毒感染的种属特异性和组织亲嗜性，是病毒毒力的主要决定部分。因S蛋白与机体直接接触，若能检测到S蛋白将对疾病的诊断提供重要依据。另外，与其他检测患者体内的SARS-COV2抗体的检测方法相比，检测抗体的方法只能表明人体免疫系统产生了针对SARS-COV2的抗体，不能反映病毒在患者体内的携带情况，本发明通过直接检测SARS-COV2的S蛋白，能直接反映患者体内的病毒携带情况，更有利于疫情的控制。因此本发明通过发明一对抗体 (SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体)，通过双抗体夹心法检测S蛋白。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明实施例3样本测试显色图；
图2为本发明实施例3样本OD值；
图3为本发明实施例3样本OD值统计图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提供了一种SARS-COV2纤突蛋白抗体，为SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体，通过以下方法制备获得：
1、SARS-COV2纤突蛋白的表达和纯化
(1)全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因；
(2)将S1基因克隆到真核表达载体pMFcIg(ABLINK biotech)的IL2分泌信号肽和小鼠Fc(mFc，包括hinge-CH2-CH3)标签基因之间，构成S1-mFc融合基因，克隆所采用的正向引物为：CAGTGTGTTAATCTTACAACC，反向引物为：ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT；
(3)将S1-mFc表达质粒电转到感受态细胞Rosseta，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；
(4)使用293Fectin(thermofisher)转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培养5天，收集细胞培养基，离心获得上清，使用protein Aresin(GE) 分离纯化S1-mFc融合蛋白。
2、纯化S蛋白的验证：用抗S蛋白的双抗体夹心法进行ELISA验证，如表1所示。
表1 S蛋白双抗夹心法验证
OD450
PBS 0.041
0.1μg/mL S蛋白 0.105
0.5μg/mL S蛋白 0.426
1.0μg/mL S蛋白 0.848
5.0μg/mL S蛋白 2.102
3.制备SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体
(1)建立天然人源单链可变区噬菌体展示库；
(2)将纯化得到的S1-mFc融合蛋白与天然人源单链可变区噬菌体展示库生物筛选；
(3)生物筛选后阳性噬菌体的重链可变区和轻链可变区分别克隆至表达载体中，转入宿主细胞中进行表达和纯化，得到SARS-COV2纤突蛋白的一对抗体，即SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。
进一步的，SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体的表达纯化方法为：生物筛选后阳性噬菌体的重链可变区和轻链可变区分别克隆至pFUSEss-CHIg-hG1和pFUSEss-CLIg-hK载体，转染293Fs细胞后，在无血清培养基中继续培养并收集细胞培养基，离心获得上清，分离纯化得到SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。
4、SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体的验证：用S蛋白进行ELISA验证，表2所示。
表2 ELISA验证SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体
项目 OD450
PBS 0.081
0.1μg/mL S蛋白 0.232
0.5μg/mL S蛋白 0.786
1.0μg/mL S蛋白 1.641
5.0μg/mL S蛋白 1.931
实施例2
本实施例提供了一种SARS-COV2纤突蛋白抗体胶体金诊断试剂盒，包括实施例1制备的SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体，通过以下方法制备获得：
(1)取质量浓度为0.01％氯金酸水溶液并加热至沸腾，滴加体积浓度为1％柠檬酸三钠溶液并不断搅拌，在氯金酸水溶液由金黄色变为紫红色后继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复至原体积，2℃～8℃保存待用；
(2)将SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体溶液浓缩至1mg/mL后转入透析袋中， 2℃～8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜；
(3)之后在透析处理之后的SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体中加入等体积的胶体金中，2℃～8℃静置并使SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体与胶体金充分结合，然后按每10mL胶体金加2mL质量浓度为5％BSA溶液比例加入BSA溶液，充分混匀后离心0.5h～1.5h，弃上清液，胶体金沉淀用保护液再溶解，即制得SARS-COV2纤突蛋白抗体胶体金。
实施例3
对实施例2方法制备的SARS-COV2纤突蛋白抗体胶体金进行临床验证。
取新型冠状病毒肺炎的临床确诊病例7例、疑似样本10例和阴性样本10例进行验证，验证方法为：
将SARS-COV2纤突蛋白抗体胶体金加入96孔板中，分别加入上述不同类型的标本100μL，37℃孵育1h后，洗板，加入针对另一个S抗原表位的一抗，37度孵育1h后，洗板，再加入抗人IgG Fc段的酶标二抗，显色剂显色，显色结果如图1，利用酶标仪测定OD值，结果如表3、以及图2和图3所示；其中，表3给出的是图1的加样顺序、以及对应的检测结果图2给出的OD值，图1和图2第一列加样及检测数据与本申请无关，可以忽略。
分析了临床确诊阳性(8例)、疑似样本(10例)和阴性标本(10例)，阳性患者的血清抗S蛋白抗体全部为阳性，疑似标本和阴性标本的吸光度(OD值)显著低于阳性患者，与临床诊断吻合。
表3 ELISA加样顺序及OD450值
Figure RE-GDA0002467656440000061
虽然SARS病毒的N蛋白与SARS-CoV2的N蛋白同源性高达91.2％，SARS病毒的S 蛋白与SARS-CoV2的S蛋白同源性为77.5％，但在开发SARS-CoV2抗体检测试剂盒的过程中发现，SARS蛋白的抗体并不能100％的识别SARS-CoV2的抗原蛋白，而SARS蛋白的抗原也并不能直接用于检测患者体内SARS-CoV2的抗体。另外，在抗原蛋白的表达过程中，即使只有几个氨基酸的差异，采用相同的表达方法所制备的抗原特异性也会有差异。因此本发明通过真核细胞表达了SARS-CoV2的S抗原蛋白，利用S抗原蛋白基于噬菌体展示技术，发明了一对抗体(SARS-CoV2纤突蛋白S1区的配对抗体)，通过双抗体夹心法检测S蛋白，并且临床样本验证其可以有效地检测出SARS-CoV2抗原。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种SARS-COV2纤突蛋白抗体，其特征在于，为SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。
2.基于权利要求1提供的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，基于SARS-COV2的S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，进行表达和纯化，获得融合蛋白；
步骤2，基于步骤1制备的融合蛋白制备配对抗体。
3.根据权利要求2所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体操作包括以下步骤：
步骤1-1，全合成编码S1蛋白Gln14-Arg685区域的基因，将S1基因克隆至真核表达载体，构成S1-mFc融合基因。
步骤1-2，将S1-mFc表达质粒电转到感受态大肠杆菌，挑取阳性单克隆，扩增后提取质粒；
步骤1-3，使用转染试剂将S1-mFc表达质粒转染到293F细胞中，在无血清培养基中继续培养；
步骤1-4，收集细胞培养基，离心获得上清，分离纯化S1-mFc融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤1-1中，所述真核表达载体为pMFcIg，S1基因克隆到真核表达载体的IL2分泌信号肽和小鼠Fc标签基因之间，构成S1-mFc融合基因。
5.根据权利要求3所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤1-1中，克隆所采用的正向引物的核苷酸序列为：CAGTGTGTTAATCTTACAACC，反向引物的核苷酸序列为ACGTGCCCGCCGAGGAGAATT。
6.根据权利要求2至5任一项所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体操作包括以下步骤：
步骤2-1，建立天然人源单链可变区噬菌体展示库；
步骤2-2，将融合蛋白与天然人源单链可变区噬菌体展示库生物筛选；
步骤2-3，生物筛选后阳性噬菌体的重链可变区和轻链可变区分别克隆至表达载体中，转入宿主细胞中进行表达和纯化，得到SARS-COV2纤突蛋白S1区的配对抗体。
7.根据权利要求6所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤2-3中，重链可变区的表达载体为pFUSEss-CHIg-hG1，轻链可变区的表达载体pFUSEss-CLIg-hK。
8.权利要求1所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体、以及权利要求2至7任一项所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法制备的SARS-COV2纤突蛋白抗体在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。
9.一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体、以及权利要求2至7任一项所述的一种SARS-COV2纤突蛋白抗体的制备方法制备的SARS-COV2纤突蛋白抗体。
10.一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，用于制备权利要求9所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒，包括以下步骤：
步骤1，以氯金酸溶液、柠檬酸三钠水溶液为原料制备胶体金溶液；
步骤2，将SARS-COV2纤突蛋白抗体溶液分离纯化；
步骤3，将分离纯化后的SARS-COV2纤突的蛋白抗体加入等体积的胶体金溶液中，经分离、沉淀、再溶解获得SARS-COV2胶体金。
11.根据权利要求10所述的一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤2中，将SARS-COV2纤突蛋白抗体溶液分离纯化的透析方法为：将SARS-COV2纤突蛋白抗体溶液浓度稀释至1mg/mL后转入透析袋中，2℃～8℃下用浓度为20mmol/L、pH值为7.0的Tris缓冲液透析过夜。
CN202010156803.1A 2020-03-09 2020-03-09 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒 Pending CN111285933A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010156803.1A CN111285933A (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010156803.1A CN111285933A (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111285933A true CN111285933A (zh) 2020-06-16

Family

ID=71019176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010156803.1A Pending CN111285933A (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111285933A (zh)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690060A (zh) * 2020-07-06 2020-09-22 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 能够特异性识别RBD蛋白的IgA抗体以及试剂盒
CN112028975A (zh) * 2020-08-05 2020-12-04 上海裕隆生物科技有限公司 2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法
CN112028993A (zh) * 2020-10-15 2020-12-04 武汉华美生物工程有限公司 一种抗sars-cov-2病毒n蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用
CN112028976A (zh) * 2020-08-05 2020-12-04 上海裕隆生物科技有限公司 2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白及应用
CN112098660A (zh) * 2020-11-03 2020-12-18 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒
CN112326962A (zh) * 2020-11-03 2021-02-05 山西康健恩生物科技有限公司 一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法
CN113588941A (zh) * 2021-07-18 2021-11-02 杭州迈尔德生物科技有限公司 一种基于间接胶体金法的新型冠状病毒中和抗体的检测方法及试剂盒
WO2022038501A1 (en) * 2020-08-17 2022-02-24 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Fusion proteins comprising sars-cov-2 receptor binding domain
WO2022060900A1 (en) * 2020-09-15 2022-03-24 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Shark-derived binding molecules for sars-cov-2 coronavirus and uses thereof
WO2022056712A1 (en) * 2020-09-16 2022-03-24 The Third People's Hospital Of Shenzhen Anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof
IT202200003620A1 (it) * 2022-02-25 2022-05-25 Craniomed Group S R L Metodo per il rilevamento di patogeni virali con comportamento batteriofagico attraverso l’utilizzo della microscopia a fluorescenza
US11365239B2 (en) 2020-03-20 2022-06-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-SARS-COV-2 antibodies and uses thereof
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
US11999777B2 (en) 2020-06-03 2024-06-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1914226A (zh) * 2003-11-25 2007-02-14 达纳-法伯癌症研究院有限公司 SARS－CoV抗体及其使用方法
CN102015767A (zh) * 2008-01-17 2011-04-13 胡马斯有限公司 针对SARS-CoV的交叉中和人单克隆抗体及其使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1914226A (zh) * 2003-11-25 2007-02-14 达纳-法伯癌症研究院有限公司 SARS－CoV抗体及其使用方法
CN102015767A (zh) * 2008-01-17 2011-04-13 胡马斯有限公司 针对SARS-CoV的交叉中和人单克隆抗体及其使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COUTARD B.等: "The spike glycoprotein of the new coronavirus 2019-nCoV contains a furinlike", 《ANTIVIRAL RESEARCH》 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11365239B2 (en) 2020-03-20 2022-06-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-SARS-COV-2 antibodies and uses thereof
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
US11999777B2 (en) 2020-06-03 2024-06-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies
CN111690060A (zh) * 2020-07-06 2020-09-22 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 能够特异性识别RBD蛋白的IgA抗体以及试剂盒
CN112028975A (zh) * 2020-08-05 2020-12-04 上海裕隆生物科技有限公司 2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法
CN112028976A (zh) * 2020-08-05 2020-12-04 上海裕隆生物科技有限公司 2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白及应用
WO2022038501A1 (en) * 2020-08-17 2022-02-24 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Fusion proteins comprising sars-cov-2 receptor binding domain
WO2022060900A1 (en) * 2020-09-15 2022-03-24 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Shark-derived binding molecules for sars-cov-2 coronavirus and uses thereof
WO2022056712A1 (en) * 2020-09-16 2022-03-24 The Third People's Hospital Of Shenzhen Anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof
CN112028993A (zh) * 2020-10-15 2020-12-04 武汉华美生物工程有限公司 一种抗sars-cov-2病毒n蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用
CN112326962B (zh) * 2020-11-03 2021-10-12 山西康健恩生物科技有限公司 一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法
CN112098660B (zh) * 2020-11-03 2021-02-09 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒
CN112326962A (zh) * 2020-11-03 2021-02-05 山西康健恩生物科技有限公司 一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法
CN112098660A (zh) * 2020-11-03 2020-12-18 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒
CN113588941A (zh) * 2021-07-18 2021-11-02 杭州迈尔德生物科技有限公司 一种基于间接胶体金法的新型冠状病毒中和抗体的检测方法及试剂盒
CN113588941B (zh) * 2021-07-18 2024-07-02 杭州迈尔德生物科技有限公司 一种基于间接胶体金法的新型冠状病毒中和抗体的检测方法及试剂盒
IT202200003620A1 (it) * 2022-02-25 2022-05-25 Craniomed Group S R L Metodo per il rilevamento di patogeni virali con comportamento batteriofagico attraverso l’utilizzo della microscopia a fluorescenza

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111285933A (zh) 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒
CN111239394B (zh) 一种基于混合抗原快速检测新型冠状病毒抗体试剂盒
CN111217920B (zh) 新冠病毒n-s优势表位融合蛋白、制备方法、应用，及表达蛋白、微生物、应用，试剂盒
CN111398581B (zh) 一种covid-19快速诊断试剂盒及其制备方法
CN112920278B (zh) 一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用
CN104650195B (zh) Ev71病毒vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用
CN111978377B (zh) Covid-19抗原、制备方法和应用
KR102671155B1 (ko) Ns1 단백질의 결합 단백질
CN113121678B (zh) 一种抗hiv-1 p24的重组抗体
CN111647055B (zh) 一种用于新型冠状病毒检测的n蛋白及其制备与应用
CN109307772A (zh) 一种伪狂犬病毒gE和gB IgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法
CN104215761A (zh) 检测血清中抗gp73抗体的试剂盒
CN107304231B (zh) 一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用
CN112500494B (zh) 用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法
CN104845981B (zh) 田鼠巴贝虫Bm1524抗原及其应用
JP5712513B2 (ja) ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法
CA3108832A1 (en) Synthetic peptide for detecting hiv-1
CN110066343A (zh) 一种用于检测hiv新发感染的重组抗原及其应用
CN109679970A (zh) 猫疱疹i型病毒快速检测的制备方法
Zhang et al. Efficient capture and detection of Zika virion by polyclonal antibody against prokaryotic recombinant envelope protein
CN110426517B (zh) 一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用
EP4139491A2 (en) Specificity enhancing reagents for covid-19 antibody testing
CN102827292B (zh) 一种融合蛋白TgMEP及其制备方法和应用
CN113698474A (zh) 一种非洲猪瘟多克隆抗体及非洲猪瘟抗原检测试纸条
Bel-Ochi et al. Design and characterization of a recombinant colorimetric SAG1–alkaline phosphatase conjugate to detect specific antibody responses against Toxoplasma gondii

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210701

Address after: 610000 Chengdu 16 high tech Zone, Sichuan

Applicant after: MACCURA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: No.32, Section 2, West 1st ring road, Chengdu, Sichuan 610000

Applicant before: SICHUAN PROVINCIAL PEOPLE'S Hospital