CN110426517B - 一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用。重组抗原蛋白的制备包括：筛选检测靶标编码基因，然后将编码基因连接到原核表达载体中，构建得到重组表达载体；转化入宿主细胞中，诱导表达，得到重组抗原蛋白DENV‑Ag2。所述重组抗原蛋白为登革2型病毒特异性抗原，经原核表达、纯化而成。本发明的重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与登革2型病毒抗体具有很高亲和力，而与其它型别登革病毒及相近虫媒病毒无血清学交叉反应。本发明提供的试剂盒具有操作简单方便、灵敏度高、特异性强等优点，能够快速、准确地鉴别诊断登革2型病毒抗体，从而诊断登革病毒的感染情况，为之后的治疗提供有利依托。

Description

一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用。

背景技术

登革病毒(Dengμe virμs，DENV)隶属黄病毒科，包括1-4个血清型，据世界卫生组织统计，目前全世界超过100个国家的25亿人正受登革病毒威胁，每年感染人口多达5000万-1亿，其中有25-50万人属于严重的登革出血热，平均死亡率为5％，是仅次于疟疾的重要热带病。我国南方各省为登革热高发区，监测表明，1990-2010年间我国每年都有登革热流行，种种迹象表明我国已成为登革病毒的疫源地。因此，登革病毒的预防与控制日益紧迫。而该类病毒防制的关键在于及时发现，并尽早隔离，故而对登革病毒及时、有效地检测对于该病的检疫和防止具有非常重要的意义。目前国内外关于登革病毒检测方法一般采取病毒分离、核酸检测及免疫学检测。其中病毒分离及核酸杂交法操作都较繁琐，对仪器要求较高，而且其周期都较长，且病毒分离还受标本抽取时间、临床用药等因素的影响，达不到早期快速诊治的目的，很难在实践中得到应用；建立在PCR基础上的快检方法近年进展较快，但对设备及操作人员的要求较高，容易产生假阳性、假阴性结果。免疫学检测主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)及胶体金等方法，速度快，对实验要求不高，不需要无菌操作，可以自动化、高通量的检测大量样品，同时也比较灵敏、可靠，并且已经在不同的病原检测中得到广泛应用，其操作已被广大基层卫生防疫人员熟练掌握，有其他方法无法代替的优势。

从现有技术中公开的登革病毒血清学诊断方面的资料来看，主要存在以下方面的问题：(1)登革病毒二次异型感染可导致严重的登革出血热 (DHF)和登革休克综合征(DSS)，随着感染人口基数的增加，出现二次异型感染病例的几率日渐增加，已对全球国家造成严重威胁。但目前仍缺乏登革病毒免疫学分型诊断产品，因此研制该类分型试剂盒，对登革病毒感染的鉴别诊断、人群及患者免疫状态评估、登革重症患者预警、临床治疗方案制订及流行病学调查均具有重要意义。(2)登革各型病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种登革病毒血清型流行的区域，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难，对诊断用抗原提出了更高的质量要求。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种检测登革2 型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用。

本发明的另一个目的在于提供一种登革2型病毒抗体分型的重组抗原蛋白的制备方法，该重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与登革2型病毒抗体具有很高亲和力，而与其它型别登革病毒及相近虫媒病毒无血清学交叉反应。

本发明的再一个目的在于提供一种登革2型病毒抗体分型的检测试剂盒，利用所制备的重组抗原蛋白，建立登革2型病毒抗体的ELISA快速检测试剂盒。

本发明提供一种登革2型病毒抗体分型的重组抗原蛋白及其制备方法，以及以该抗原蛋白作为包被抗原应用在登革2型病毒抗体分型试剂盒中。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供一种所述检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白 DENV-Ag2的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述重组抗原蛋白(DENV-Ag2)是通过选择登革2型病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，并将相应的目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表达而制备得到，而目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。

本发明提供的一种重组表达载体，插入了权利要求2中所述SEQ ID NO.1所述核苷酸序列。

进一步地，所述重组表达载体，包括原核表达载体；所述原核表达载体为pMAL c2x原核表达载体。

优选地，表达宿主细胞为大肠杆菌。

本发明提供的能够检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2 的编码基因及重组表达载体能够应用在重组抗原蛋白DENV-Ag2的生产中。

进一步地，所述的应用(重组抗原蛋白制备方法)，包括以下步骤：

(1)筛选检测登革2型病毒特异性编码基因片段；

(2)设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增编码基因(目的基因片段)；

(3)通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建得到重组表达载体(含有所述目的基因片段的重组表达质粒)；

(4)将所述重组表达载体转化至表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白(DENV-Ag2)，并通过纯化得到所述检测登革 2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2。

进一步地，步骤(1)所述检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白 DENV-Ag2的编码基因，该目的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白及柔性臂的延伸区段(如SEQ ID NO.1)，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。

进一步地，步骤(2)所述设计PCR扩增引物，设计得到的正向引物为CGGGATCCACCATTGTGGTAACACCTCA(如SEQ ID NO.3所示)；设计得到的反向引物为ACGCAAGCTTttaTGTCAATTCTGCTTCTGTGA (如SEQ ID NO.4所示)。

进一步地，步骤(4)所述检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白 DENV-Ag2具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。

本发明提供的所述检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2 能够应用在诊断登革热疾病中。

优选地，能够将所述检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2 制备成ELISA试剂盒，检测登革2型病毒感染情况，能够将所述检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2制备成ELISA试剂盒，检测登革热疾病；所述试剂盒包括抗体检测板、ELISA反应液、封板胶纸、说明书及自封袋；所述ELISA反应液包括酶结合物工作液、DENV阳性对照液、DENV阴性对照液、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色剂A、显色剂B及终止液；其中，DENV阳性对照为登革2型病毒抗体标准品(可以用登革2 型病毒患者血清制成)，DENV阴性对照为登革2型病毒抗体阴性血清，所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG溶液。

进一步地，所述样品稀释液(pH值为7.4)包含浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液、质量百分比浓度为1％的BSA、体积百分比浓度为0.05％的 Tween-20和浓度为1mg/L庆大霉素；所述浓缩洗涤液(pH值为7.4)包含浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液及体积百分比浓度为1％的Tween-20；所述显色液A包括质量百分比浓度为0.02％的H₂O₂溶液；显色液B包括质量百分比浓度为0.4‰的TMB-HCl溶液；终止液为浓度2M的H₂SO₄溶液。

进一步地，所述抗体检测板上包被有检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白(DENV-Ag2)。

进一步地，所述抗体检测板的制备，包括如下的步骤：将重组抗原蛋白(DENV-Ag2)纯化，然后以梯级浓度包被在酶联板上，每孔50-100μl， 4-8℃包被16-18小时，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤1-2分钟；将其拍干后，用质量百分比浓度为4-8％牛血清白蛋白溶液于37℃封闭4-8小时，晾干后即得到所述抗体检测板。

本发明提供的重组抗原蛋白(DENV-Ag2)，其具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与登革2型病毒抗体具有很高亲和力。在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，验证了本发明的重组抗原蛋白具有极高的特异性，并获取了能高效表达登革2型病毒特异性重组抗原的基因工程菌株，同时结合采用了该重组抗原蛋白的登革2 型病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验和对具体临床标本的测试试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白在用于检测登革2型病毒时表现出的高灵敏度、高特异性的优势。

本发明提供的重组抗原蛋白制备方法，由于其选择了登革2型病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，而目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠，同时结合上述方案中涉及的专用引物，有效地获取了该目的基因，同时结合该方法中采用的原核表达载体和表达宿主菌，使重组抗原蛋白具备高效的表达效果。

另外，本发明还提供了一种登革2型病毒的分型试剂盒(检测登革2 型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2的其中一种应用)，其包括抗体检测板和ELISA反应液，所述抗体检测板上包被有检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白，而所述重组抗原蛋白即为本发明上述方案中揭示的重组抗原蛋白。

结合本发明的优选实施例中揭示的实验内容可以看出，实验中在保证反应原性的基础上，尽量缩短了抗原片段长度，确保所筛选的原核表达抗原具备良好的特异性，与所测试的登革1型、登革3型、登革4型、流行性乙型脑炎、黄热、西尼罗河、墨累山谷脑炎、寨卡、基孔肯雅、辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、鹭山及盖塔病毒多抗均无交叉反应。

同时，所建立的制备方法及登革2型病毒的分型试剂盒均具备较高灵敏度及检出范围，以登革2型病毒小鼠免疫血清进行的实验表明，在血清 1:40-1:20480倍稀释范围内，均可获得阳性结果，而且无非特异性结果。以登革2型病毒患者血清进行的实验表明，在血清1:50-1:400倍稀释范围内，均可获得阳性结果，检测OD值在0.32以上，S/N比值在15以上。

另外，还需要说明的是，结合本发明的重组抗原蛋白用于登革2型病毒的检测试剂盒的具体实施方式，充分说明了本发明的重组抗原蛋白在制备诊断登革2型病毒抗体分型试剂盒中的运用，并能够保证登革2型病毒诊断过程中的灵敏度和特异性。相对于全病毒抗原，重组抗原蛋白纯度高、特异性强，便于质量控制，可以去掉不与抗体结合的无关区段，将使得检测灵敏度和特异性增加，并且成本也较低，在病毒检测中具有较大优势。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供的检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2 具备良好的特异性，与所测试的登革1型、登革3型、登革4型、流行性乙型脑炎、黄热、西尼罗河、墨累山谷脑炎、寨卡、基孔肯雅、辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、鹭山及盖塔病毒多抗均无交叉反应。

(2)本发明提供的检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2 能够应用在诊断登革热疾病的试剂盒中，具备较高灵敏度及检出范围，以登革2型病毒小鼠免疫血清进行的实验表明，在血清1:40-1:20480倍稀释范围内，均可获得阳性结果，而且无非特异性结果；以登革2型病毒患者血清进行的实验表明，在血清1:50-1:400倍稀释范围内，均可获得阳性结果，检测OD值在0.32以上，S/N比值在15以上。

(3)本发明提供的检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2 应用在诊断登革热疾病的试剂盒中，所述试剂盒仅需病人少量的血清即可够快速、准确及低成本地诊断出病人登革病毒的感染情况。

附图说明

图1是本发明实施例1中登革1-4型病毒、黄热病毒、流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体与原核表达抗原的western blot杂交结果图；其中，A为 SDS PAGE电泳图；B为登革1型病毒多克隆抗体Western blot结果；C为登革2型病毒多克隆抗体Western blot结果；D为登革3型病毒多克隆抗体Wester blot结果；E为登革4型病毒多克隆抗体Western blot结果；F为流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体Western blot结果；G为西尼罗病毒多克隆抗体Westernblot结果；H为黄热病毒多克隆抗体Western blot结果；1为 DENV-Ag2；2为pMAL c2x空载体诱导；M为蛋白分子量Marker(分子量由上至下分别为180、140、100、75、60、45、35kDa)。

图2是实施例5对本发明提供的ELISA试剂盒敏感性检测评估的结果图；其中，横坐标代表抗体稀释倍数，单位(倍)；纵坐标代表吸光度值 (A450)。

图3是实施例2中对本发明提供的DENV-Ag2重组抗原包被浓度评估结果图；其中，横坐标代表DENV-Ag2重组抗原包被浓度，单位(μg/mL)，纵坐标代表吸光度值(A450)。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。

本发明的下列实施例中，选用的登革病毒为登革1型病毒(DV1) GD03/91株(GenBank:FJ196845)、GD01/97株(GenBank:FJ196847)、 GD01/2006株(GenBank:FJ196843)，登革2型病毒(DV2)：GD01/93株 (GenBank:FJ196853)、GD08/98株(GenBank:FJ196851)、GD01/2001 (GenBank:FJ196852)，登革3型病毒(DV3，2013年云南株)，登革4型病毒(DV4，GenBank:GD07/78)，鹭山病毒M1株(M1)，流行性乙型脑炎病毒(JEV，中山株)、黄热病毒(YFV，17D株)，上述毒株均来源于中国人民解放军南部战区疾病预防控制中心；而实验中用的内切酶、连接酶、T 载体购自大连TaKaRa公司。凝胶纯化回收及质粒快速提取试剂盒购自 OMEGA公司。Trizol及反转录试剂购自Invitrogen公司。pMAL-C2x表达载体购自NewEngland Biolabs公司，Amylose Resin亲和层析试剂购自NEB 公司，表达宿主菌为Rosetta(DE3)。

实施例1、检测登革2型病毒抗体重组抗原蛋白(DENV-Ag2)的制备

按照如下步骤制备检测登革2型病毒抗体重组抗原蛋白：

步骤一、选择登革2型病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。其中，目的基因片段DENV-Ag2的编码基因序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

步骤二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增目的基因片段。其中，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下：

正向引物：CGGGATCCACCATTGTGGTAACACCTCA(如SEQ ID NO.3所示)；

反向引物：ACGCAAGCTTttaTGTCAATTCTGCTTCTGTGA(如SEQ ID NO.4所示)。

步骤三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒。

步骤四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白。

具体实现时，上述步骤一中，参考登革病毒登革2型病毒GD08/98株基因组序列，利用DNAstar及ANTHEPROT软件对其编码蛋白疏水性、抗原性、可及性及可塑性进行详细分析，并参考Genbank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，初步筛选可能的抗原性片段5段。

步骤二中，根据步骤一中所选的抗原性片段，并结合多肽结构中需要的延伸区段，并通过优化设计与各区段对应的引物，通过PCR扩增相应的目的基因片段，从而使由延伸区段编码柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。为此，在本步骤的优选过程中，设计PCR扩增引物5对，如表1(表1为抗原片段克隆所用引物序列信息表)所示：

表1

其中，引物设计过程为根据抗原性分析结果设计表1中所述的引物5 对，并分别于引物5’末端及3’末端导入BamHⅠ及HindⅢ酶切位点。

作为获取目的基因片度的预先步骤，还需反转录登革病毒的基因组，该反转录过程为：登革2型病毒GD08/98株经C6/36细胞培养传代培养，采用Invitrogen的Trizol试剂提取病毒RNA，然后进行反转录获得其cDNA。

而后按如下条件进行PCR：取cDNA 2μl，10×PCR缓冲液5μl，正向引物、反向引物各2μl、dNTP 8μl、Taq 2Μ，补水至总体积50μl进行PCR 扩增。反应参数为：95℃5min，然后94℃30s，55℃40s，72℃60s，共32 次循环，最后一次循环后72℃延伸7min，扩增片段经纯化、回收后，于-20℃条件下保存备用。

步骤三中、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有目的基因片段的重组表达质粒。在本发明实施例中，所述原核表达载体为pMAL c2x原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。本步骤具体如下：

酶切：各取10μl经纯化的扩增产物(60ng/ul)，分别加入Bμffer K 3μl， BamHⅠ及HindⅢ各1μl(10Μ)，灭菌去离子水15μl，37℃酶切16小时。另取pMAL c2x表达载体质粒2μg，加入Bμffer K 3μl，BamHⅠ及HindⅢ各1μl(10Μ)，灭菌去离子水补至30μl，37℃酶切16小时。酶切产物分别用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒纯化回收。

连接：取2μl经以上处理的pMAL c2x载体(130ng)，5μl酶切目的片段(40ng)，45℃加热5min，以使退火的粘端解链，立即冰浴10sec，加入 T₄DNA连接酶1μl，连接酶Bμffer 1μl，用灭菌四馏水补至10μl，16℃连接 16小时。取重组质粒5μl转化感受态菌DH5a，加入无抗生素的LB液体培养基300μl，37℃复苏45min后，取100μl涂氨苄青霉素(100μg/ml)平皿， 37℃培养18h。

重组子鉴定：挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定，PCR反应体：10×PCR 缓冲液2μl，正向引物、反向引物各1μl、dNTP 0.4μl、Taq 1μL，补水至总体积20μl进行PCR扩增。PCR反应条件同步骤二，阳性克隆送生物工程 (上海)有限公司测序确认。经测序确认，得到正确重组表达质粒5组，并提取质粒，并于-20℃条件下保存备用。

步骤四中、将重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养表达宿主细胞，并检测其重组蛋白表达情况，在本实施例中本步骤具体为：挑经转化重组表达载体的表达宿主菌单菌落分别接种于LB液体培养基中， 37℃震荡培养4h，当OD值达0.6时，吸取未诱导对照菌1mL，并向剩余菌中加入诱导物IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，于37℃振荡培养4h，冰浴5min后，4℃、12000g离心2min收菌，并进行SDS-PAGE检测，参照分子克隆实验指南，配制好反应液体，积层胶质量百分比浓度为4％，分离胶质量百分比浓度为12％，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后，考马斯亮蓝染色，验证重组蛋白表达情况。经本步实验，所构建的5个重组表达载体均获高效表达。

而后、对所获重组表达抗原进行western blot分析，以验证其免疫反应原性及免疫学反应的特异性，在本实施例中本步骤具体为：SDS-PAGE电泳同步骤四，电泳完毕后，电转硝酸纤维素膜，登革1型病毒、登革2型病毒、登革3型病毒、登革4型病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体1：5000稀释，进行蛋白质印迹(western-blot)，验证表达抗原的反应特异性，分析结果表明由上游引物DV2Ag-F2、下游引物DV2Ag-R2构建的原核表达抗原DENV-Ag2具备良好的登革2型病毒抗体反应原性，结果如图1所示，其余4组表达抗原效果不佳，未用于试剂盒研制。

另外，通过此高效表达菌株进行上述重组抗原蛋白的表达纯化实验，获取适合用于ELISA实验的重组抗原蛋白，本实施例中本步骤具体为：表达菌(表达宿主细胞)37℃16小时培养物10mL接种体积为1L的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃振荡培养2小时，待OD值达0.6时，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续37℃振荡培养4小时后，离心收获细菌，并用PBS缓冲液洗涤两次，50mL PBS缓冲液重悬，超声波破碎细菌后，采用NEB公司AmyloseResin亲和层析柱纯化纯化重组蛋白，核酸蛋白分析仪测定其浓度为3821μg/ml。

如图1所示，进行SDS-PAGE实验和蛋白质印迹，参照分子克隆实验指南，配制好反应液体，积层胶质量百分比浓度为4％，分离胶质量百分比浓度为12％，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后，电转硝酸纤维素膜，然后将登革1型病毒、登革2型病毒、登革3型病毒、登革4型病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体 1：5000稀释，进行蛋白质印迹(western-blot)，验证表达抗原的反应特异性，并获得能高效表达登革2型病毒特异性重组抗原的基因工程菌株。而后通过此高效表达菌株进行上述重组抗原蛋白的表达纯化实验，获取适合用于ELISA实验的重组抗原蛋白。

实施例2、重组抗原蛋白的包被实验

在本实施例中需要对本发明提供的重组抗原蛋白DENV-Ag2的包被条件和浓度进行优化；为了达到此目的还需要先对试剂盒中ELISA反应液成分进行说明：

酶结合物工作液:辣根过氧化物酶标记的抗人IgG多克隆抗体溶液 (200ng/mL)；

阳性对照：登革2型病毒患者血清；

阴性对照：登革病毒抗体阴性人血清；

样品稀释液：包含10mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.4)、质量百分比浓度为1％的BSA、体积百分比浓度为0.05％Tween-20和浓度为1mg/L 庆大霉素；

浓缩洗涤液：包含0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.4)、体积百分比浓度为1％Tween-20和浓度为20mg/L庆大霉素；

显色液A：质量百分比为0.02％H₂O₂溶液(用0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液调节pH为4.5-5.0)。

显色液B：质量百分比为0.4‰TMB-HCl溶液(用50mM柠檬酸钠溶液，滴加浓HCl调节pH为2.8)。

终止液：2M H₂SO₄溶液；

将上述实施例1中获取的纯化重组抗原蛋白DENV-Ag2分别以20、10、 5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml浓度包被酶联板，每孔用量100μl，4℃包被16小时，用含10mmol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液、体积百分比浓度为 0.05％Tween-20的PBST缓冲液洗涤3分钟，拍干，于质量百分比浓度为 5％BSA溶液中37℃封闭2小时，鼠抗登革病毒多克隆抗体1:5000倍稀释后取100μl加入反应孔，37℃反应1小时，PBST缓冲液(10mmol/L pH7.4 的磷酸盐缓冲液、体积百分比浓度为0.05％Tween-20)洗涤4次，每次1 分钟，拍干，HRP标记抗鼠二抗1:10000倍稀释后，每孔加入100μl，37℃反应40分钟，PBST缓冲液(10mmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液、体积百分比浓度为0.05％Tween-20)洗涤4次，每次1分钟，拍干，每孔加入TMB 底物溶液100μl，37℃反应15分钟，加入50μl 2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，如表2所示，结果如图3所示，在包被浓度1.25-10μg/ml范围内，实验OD值无明显差别，最终选择抗原包被浓度为2μg/ml。

实施例3、ELISA反应条件优化

对抗原包被条件及ELISA反应条件进行系统优化，最终确定最佳ELISA反应条件为：重组抗原100μl(浓度为10μg/ml)4℃包被16小时， PBST缓冲液(其pH值为7.4，包含浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液及体积百分比浓度为0.05％Tween-20)洗涤3分钟，拍干，于质量百分比浓度为5％BSA溶液中37℃封闭2小时，待检血清1:100倍稀释后取100μl加入反应孔，37℃反应1小时，PBST缓冲液(其pH值为7.4，包含浓度为 10mmol/L的磷酸盐缓冲液、体积百分比浓度为0.05％Tween-20)洗涤4次，每次1分钟，拍干，HRP标记二抗1:10000倍稀释后，每孔加入100μl， 37℃反应40分钟，PBST缓冲液(其pH值为7.4，包含浓度为10mmol/L 的磷酸盐缓冲液、体积百分比浓度为0.05％Tween-20)洗涤4次，每次1 分钟，拍干，每孔加入显色液A、显色液B各50μl，37℃反应15分钟，加入50μL 2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定OD值。

实施例4、试剂盒的特异性实验

采用实施例3中的优化条件进行ELISA实验，选择含有辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、鹭山、盖塔、基孔肯雅病毒、流行性乙型脑炎、黄热及西尼罗河病毒的样品作为特异性实验参考样品，如表2(表2为登革病毒ELISA检测方法特异性实验信息表)所示，本发明的登革病毒的检测试剂盒及其采用的重组抗原蛋白具有良好的特异性，与上述参考样品均无交叉反应。其中，DV1：登革1型病毒多克隆抗体；DV2：登革1型病毒多克隆抗体；DV3：登革1型病毒多克隆抗体；DV4：登革1型病毒多克隆抗体；WNV：西尼罗病毒多克隆抗体；YFV：黄热病毒多克隆抗体； MVEV：墨累山谷脑炎病毒多克隆抗体；KFDV：科萨努尔森林病毒多克隆抗体；JEV：流行性乙型脑炎病毒多克隆抗体；LANV：兰革特病毒多克隆抗体；POWV：西尼罗病毒多克隆抗体；TBEV：森林脑炎病毒多克隆抗体； CHIKV：基孔肯雅病毒多克隆抗体；SINDV：辛德毕斯病毒多克隆抗体； SFV：西门利克病毒多克隆抗体；MAYV：马雅罗病毒多克隆抗体；RRV：罗斯河病毒多克隆抗体；GATV：盖塔病毒多克隆抗体；SAGV：鹭山病毒多克隆抗体；M1：M1病毒多克隆抗体；BATV：巴泰病毒多克隆抗体； A450：对应多抗与试剂盒反应的吸光度值。

表2

实施例5、试剂盒的灵敏度实验

将实施例1中获取的纯化重组抗原蛋白以2μg/ml包被酶联板，通过正交法对鼠抗登革2型病毒多克隆抗体进行稀释，采用实施例3中的优化条件进行ELISA实验，结果如图2所示，测定其检出下限为1:20480。

实施例6、试剂盒的临床应用

利用本发明实施例2和3中公开的试剂盒及实验方法进行ELISA实验，对33例各型登革热实验室确诊患者、30例健康体检人群血清标本进行检测，31份登革热实验室确诊患者包括：广东省2014年登革1型病毒感染患者血清15例，12例广东省2001年、2例2013年云南登革2型病毒感染患者血清，2013年云南登革3型病毒感染患者血清4例。检测结果显示，所建立方法与登革1、3型病毒感染患者血清无交叉反应，其A450值均在 0.1以下，12例登革2型病毒感染患者血清中，11例检测阳性A450值介于 0.53-1.97之间，其中一例93年登革2型病毒感染患者血清检测A450值相对较低，为0.32。30例健康体检人群标本中1例检测阳性，A450值为0.535，其余标本均程阴性结果，A450值介于0.05-0.12之间，与进一步采用免疫荧光及商品化试剂盒的复核结果一致。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 中国人民解放军南部战区疾病预防控制中心

<120> 一种检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> DNA/RNA

<213> 登革2型病毒(Dengue virus type 2 )

<400> 1

accattgtgg taacacctca ctcaggggaa gagcatgcga tcggaaatga cacaggaaaa 60

catggcaagg aaatcaaagt aacaccacag agttccgtca cagaagcaga attgaca 117

<210> 2

<211> 39

<212> PRT

<213> 登革2型病毒(Dengue virus type 2 )

<400> 2

Thr Ile Val Val Thr Pro His Ser Gly Glu Glu His Ala Ile Gly Asn

1 5 10 15

Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile Lys Val Thr Pro Gln Ser Ser

20 25 30

Val Thr Glu Ala Glu Leu Thr

35

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 3

cgggatccac cattgtggta acacctca 28

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 4

acgcaagctt ttatgtcaat tctgcttctg tga 33

Claims (3)

1.一种诊断登革病毒感染的ELISA试剂盒，其特征在于，包括检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2；其包括抗体检测板和ELISA反应液，所述抗体检测板上包被有检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白；检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白DENV-Ag2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，包括抗体检测板、ELISA反应液、封板胶纸、说明书及自封袋；所述ELISA反应液包括酶结合物工作液、DENV阳性对照液、DENV阴性对照液、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色剂A、显色剂B及终止液；其中，DENV阳性对照液为登革2型病毒抗体标准品，DENV阴性对照液为登革2型病毒抗体阴性血清，所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG溶液；所述样品稀释液包含浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液、质量百分比浓度为1％的BSA、体积百分比浓度为0.05％的Tween-20和浓度为1mg/L庆大霉素；所述浓缩洗涤液包含浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液及体积百分比浓度为1%的Tween-20；所述显色剂A包括质量百分比浓度为0.02%的H₂O₂溶液；显色剂B包括质量百分比浓度为0.4‰的TMB-HCl溶液；终止液为浓度2M的 H₂SO₄溶液。

3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述抗体检测板的制备，包括如下步骤：将所述重组抗原蛋白DENV-Ag2纯化，然后以梯级浓度包被在酶联板上，每孔50-100μl，4-8℃包被16-18小时，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤1-2分钟；将其拍干后，用质量百分比浓度为4-8%牛血清白蛋白溶液于37℃封闭4-8小时，晾干后即得到所述抗体检测板。

Images